JP4472795B2

JP4472795B2 - 蛍光イオノホア化合物

Info

Publication number: JP4472795B2
Application number: JP08914798A
Authority: JP
Inventors: ジー．ベンセンジェイムス; ジェイ．ハルバーソンクルト; ヒュンチョシ; イー．トレンドジョン; エム．クロスエリサ; エーキプケクレイ; ヤフソマサオ; エル．パティサンジャ
Original assignee: テルモカーディオバスキュラーシステムズコーポレイション
Priority date: 1997-02-27
Filing date: 1998-02-27
Publication date: 2010-06-02
Anticipated expiration: 2018-02-27
Also published as: DE69824985T2; EP0861843B1; DE69824985D1; JPH10316683A; US5958782A; EP0861843A3; EP0861843A2

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、カチオン、特にアルカリ金属カチオンの検出に使用することができる蛍光イオノホア化合物及びそれらの使用方法に関する。本発明は、これらの化合物を含み、かつ、連続検出用途に有用なカチオン検出用複合構造物にも関する。
【０００２】
【従来の技術】
種々の流体中のイオン成分の濃度測定はますます普及している方法である。環境試験方法は、１種以上の金属イオン、特に重金属イオンの濃度を頻繁に、そして時には連続的に決定することを伴う場合がある。同様に、医療診断方法及び治療方法は、患者の１種以上の体液中に含まれる１種以上のイオンの濃度を頻繁に又は連続的に決定することを伴う場合がある。
【０００３】
より良い連続試験方法に対する要求は拡大している。医療処置に関し、特に血液及び他の体液中の血清カリウムイオンレベルの連続同時監視が、特に心臓バイパス外科手術中に、非常に望ましい。
【０００４】
金属イオン濃度の測定に関して幾つかの方法がこれまで報告されている。例としては、イオン交換膜に基づく検出；試薬の存在を伴う分光光度技術及び蛍光分析技術；湿式電極；及びイオノホアに基づく検出法がある。
【０００５】
しかしながら、上記方法のうちの幾つかはアルカリ金属イオン濃度を決定するのに有効ではない。これらの方法のうちアルカリ金属イオン濃度を決定するために通常使用されている方法は、そのようなイオン（又はそれらの錯体）を含む溶液の種々の光学的特性を監視する方法である。これらのうち蛍光を測定する技術は、励起（プローブ）及び発光（シグナル）波長の本質的分離に基づく感度及び操作上の利点を有するために、他の分光学的観測に基づくものよりも好ましい。生体外カチオン濃度決定に有用な化合物は、例えば米国特許第４，８０８，５３９号明細書及びAnthony Czarnick編集のFluorescent Chemosensors for Ion and Molecule Recognition に記載されている。これらのカチオンには、アルカリ金属のみならずＡｇ⁺、Ｐｂ²⁺、Ｍｎ²⁺、Ｚｎ²⁺、Ｈｇ²⁺、Ｔｉ⁺、及びＣｄ²⁺も含まれる。
【０００６】
生体内システムを製造するためにファイバーオプチック化学センサーを使用することも開示されている。例としては、化学センサーが被検体と相互作用して光学的変化を検出するようにファイバーオプチック導波管に化学センサーを導入すること；ファイバーオプチック導波管内の化学センサーとして蛍光エネルギー転移指示体の束縛対（tethered pair)の使用；共鳴エネルギー転移が起こり得るほど吸収体物質に十分に近接している基材に固定化された蛍光体（substrate-immobilized fluorescer) により発生するシグナルを監視するためのファイバーオプチックスの使用；光吸収性配位子及び光吸収性錯体と組み合わされた発蛍光物質を含む系における蛍光を検出するためのファイバーオプチックスの使用；並びに特定のアルカリ金属イオンに対して選択性のある可動イオノホアと半透膜を通して接触している重合体カチオン物質と蛍光アニオン物質とを含む溶液を含む系におけるファイバーオプチックスによる蛍光の検出がある。
【０００７】
生体内／生体外での使用に適合させることができる可能性のある幾つかの蛍光分析法が開示されている。例えば、発蛍光団としてのローダミンエステル及びメロシアニン540 とイオノホアとしてのバリノマイシンからなる蛍光プローブが既知である。最近、２，２−ビス［３，４−（１５−クラウン−５）−２−ニトロフェニルカルバモキシメチル］テトラデカノール−１４と、発蛍光団として錯体カリウムイオンに選択的に結合したローダミンＢを使用するファイバーオプチックセンサーが開示された。この後者の装置は生体内用途に適するように特別に設計されている。
【０００８】
前述の方法の幾つかは、生理的濃度での、特に生理的pHの水性媒体中でのアルカリ金属イオンに対する感度及び選択性の不足に悩まされてきた。選択性の問題の幾つかを解消する方法であって、クリプタンドを選択的にカリウムと錯化させる方法が開示されている。この方法の感度は乏しい。また、この方法は有機塩基の存在下で有機溶剤中で実施されねばならないため、連続的な血液又は流体の測定には向かない。
【０００９】
種々のクリプタンドに結合した４−メチル−クマリン部分に基づく一群の蛍光を発するイオノホアも開示されている（米国特許第５，１６２，５２５号、Masilamani等）。カリウムイオンに対して選択性のある［２．２．２］クリプタンド誘導体：
【００１０】
【化３】

【００１１】
は、前述の選択性の制限をうけず、蛍光によるカリウムイオン濃度決定を可能にする。しかしながら、その最大励起は３３０nm付近にあり、慣用的なガラス光学部材との併用には問題がある。
【００１２】
関連出願
本願は、米国特許出願第０８／１４０，２５７号（現在は米国特許第５，４７４，７４３号）の分割出願である米国特許出願明細書第０８／５２１，８６９号の一部係属出願である。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明は、イオンを結合するための錯化部分及び発蛍光部分を含む蛍光イオノホア化合物（「イオノホア」）を提供する。この化合物の吸収極大波長は少なくとも約３５０nmである。これらの化合物を含むセンサーも開示する。
【００１４】
適切な発蛍光部分は好ましくは近接しているｎπ^*及びππ^*励起状態を含む。適切な発蛍光部分は、適切な錯化部分に結合した場合に、好ましくはイオン依存性のある面外パッカリング（out-of plane puckering) をすることができるものである。また、適切な発蛍光部分のππ^*状態は、好ましくはイオン依存性のある混成が基底状態への無放射カップリングを支配するほど十分にエネルギーが高い。特に好ましい発蛍光部分にはクマリン部分が包含されるが、他の芳香族カルボニル若しくはニトロ芳香族又はＮ−複素環式部分が使用されてもよい。
【００１５】
適切なイオン錯化部分にはイオンを捕捉することができる環状「ケージ（cage）」部分が包含される。このケージはイオンを選択的に捕捉することができるものであることが好ましい。好ましいイオン錯化部分にはクリプタンド及びクラウンエーテル部分が包含され、クリプタンド部分が特に好ましい。
【００１６】
本発明の化合物を使用して検出することができるイオンには、例えば、Ａｇ⁺、Ｂａ⁺²、Ｃａ⁺²、Ｃｅ⁺、Ｃｄ²⁺、Ｆｒ⁺、Ｈｇ²⁺、Ｋ⁺、Ｌｉ⁺、Ｍｇ⁺²、Ｍｎ²⁺、Ｎａ⁺、Ｐｂ⁺²、Ｒｕ⁺、Ｓｒ⁺²、Ｔｉ⁺及びＺｎ²⁺が包含される。所望であれば、この化合物はイオン選択膜と共に使用される。
【００１７】
一態様において、本発明は、下記一般式（式「Ａ」）：
【化４】

により表される蛍光イオノホア化合物を提供する。
ここで、Ｔは、ＴがＯである場合にｑが０であり、かつ、ｎが０〜２であること並びにＴがＮである場合にｑが１であり、かつ、ｎが独立に０又は１であることを条件として、Ｏ又はＮであり；
各Ｒ²は独立に、水素、ハロゲン、ヒドロカルビル含有基、複素非環式基、又は式：（ＣＨ₂Ｘ）_aＥ（式中、ＸはＯ、ＮＨ若しくは単結合であり、Ｅは活性水素を含有する官能基であり、ａは１〜１００の整数である）により表される基のような部分を包含する立体障害作用のない基であり、好ましくは各Ｒ²基は水素、ハロゲン、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルコキシ、Ｃ₂〜Ｃ₁₈アルケニル、Ｃ₁〜Ｃ₂₀ヒドロカルビルアミノ、Ｃ₂〜Ｃ₂₀ジ（ヒドロカルビル）アミノ及び式：（ＣＨ₂Ｘ）_aＥ（式中、Ｘ及びＥは上記定義の通りのものであり、ａは１〜２５の整数である）により表される基からなる群から独立に選ばれ、より好ましくは各Ｒ²基は水素、ハロゲン、Ｃ₁〜Ｃ₁₀アルキル、Ｃ₁〜Ｃ₁₀アルコキシ、Ｃ₂〜Ｃ₁₀アルケニル、Ｃ₁〜Ｃ₁₀アルキルアミノ、Ｃ₁〜Ｃ₁₀ジアルキルアミノ及び式：（ＣＨ₂Ｘ）_aＥ（式中、Ｘ及びＥは上記定義の通りのものであり、ａは１〜１０の整数である）により表される基からなる群から独立に選ばれ、最も好ましくは各Ｒ²基は水素、メチル、エチル、プロピル、ブチル、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、Ｃ₂〜Ｃ₁₀アルケニル、Ｃ₁〜Ｃ₁₀ジアルキルアミノ、塩素、臭素、又は式：（ＣＨ₂Ｘ）_aＥ（式中、Ｘ及びＥは上記定義の通りのものであり、ａは１〜３の整数である）により表される基からなる群から独立に選ばれ；
Ｒ³は、適切な電子吸引性基及び非電子吸引性基から選ばれる。適切なＲ³基には、水素、ヒドロカルビル含有基、複素非環式基、複素環式基、又は式：（ＣＨ₂Ｘ）_bＥ（式中、Ｘ及びＥは上記定義の通りのものであり、ｂは０〜１００の整数である）により表される基のような電子吸引性基及び非電子吸引性部分が包含され、好ましくは各Ｒ³基は水素、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル、Ｃ₃〜Ｃ₁₈シクロアルキル、Ｃ₆〜Ｃ₁₈アリール、Ｃ₆〜Ｃ₁₈アリールオキシ、Ｃ₆〜Ｃ₁₈ヒドロキシアリール、Ｃ₆〜Ｃ₁₈アリールカルボキシ、Ｃ₆〜Ｃ₁₈カルボキシアリール、Ｃ₂〜Ｃ₁₈アルケニル及び式：（ＣＨ₂Ｘ）_bＥ（式中、Ｘ及びＥは上記定義の通りのものであり、ｂは０〜２５の整数である）により表される基からなる群から独立に選ばれる非電子吸引性基であり、より好ましくは各Ｒ³基は水素、Ｃ₁〜Ｃ₁₀アルキル、Ｃ₅〜Ｃ₈シクロアルキル、Ｃ₆〜Ｃ₁₀アリール、少なくとも１個のＯ、Ｎ又はＳ原子を含む複素環式基、Ｃ₂〜Ｃ₁₀アルケニル及び式：（ＣＨ₂Ｘ）_bＥ（式中、Ｘ及びＥは上記定義の通りのものであり、ｂは０〜１０の整数である）により表される基からなる群から独立に選ばれ、最も好ましくは各Ｒ³基は水素、メチル、エチル、プロピル、ブチル、Ｃ₅〜Ｃ₈シクロアルキル、Ｃ₆〜Ｃ₁₀アリール、Ｃ₂〜Ｃ₁₀アルケニル、Ｃ₁〜Ｃ₁₀ジアルキルアミノ又は式：（ＣＨ₂Ｘ）_bＥ（式中、Ｘ及びＥは上記定義の通りのものであり、ｂは０〜３の整数である）により表される基からなる群から独立に選ばれ；
Ｒ¹は、カルボキシル、カルボキサミド、スルホニルアリール、エステル、ケト−アルキルエステル、複素環式部分及び芳香族基（好ましくは１箇所以上の位置で置換されたもの）のような部分を包含する適切な電子吸引性基及び分極性基から選ばれ、好ましくはＲ¹基はエステル（より好ましくはエチルエステル）、ケトーアルキルエステル（より好ましくは−（ＣＯ）ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂（ＣＯ）ＯＣＨ₂ＣＨ₃）、並びに置換されたフェニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル及びベンゾチアゾリルのような置換芳香族基を包含し、最も好ましくはＲ¹基は一般式（式「Ｃ」）：
【００１８】
【化５】

【００１９】
（上式中、Ｙ及びＹ’は、それらの少なくとも一方がＯ、Ｓ又はＮＨ_xであることを条件として独立にＯ、Ｓ、ＮＨ_x又はＣＨ_y（式中、ｘは０又は１であり、ｙは１又は２である）であり、各Ｒ⁴基は水素、ハロゲン、ヒドロカルビル含有基、複素非環式基、複素環式基若しくは式：（ＣＨ₂Ｘ）_cＥ（式中、Ｘ及びＥは上記定義の通りのものであり、ｃは０〜１００の整数である）により表される基からなる群から独立に選ばれるものであるか、又は両方のＲ⁴基がそれらが結合している炭素原子と共に５員若しくは６員環を形成し、この５員若しくは６員環に任意に１個以上のさらなるＲ⁴基が結合していてもよく、好ましくは各Ｒ⁴基は水素、ハロゲン、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルコキシ、Ｃ₃〜Ｃ₁₈シクロアルキル、Ｃ₆〜Ｃ₁₈アリール、Ｃ₆〜Ｃ₁₈アリールオキシ、Ｃ₆〜Ｃ₁₈ヒドロキシアリール、Ｃ₆〜Ｃ₁₈アリールカルボキシ、Ｃ₆〜Ｃ₁₈カルボキシアリール、Ｃ₂〜Ｃ₁₈アルケニル、Ｃ₁〜Ｃ₂₀ヒドロカルビルアミノ、Ｃ₆〜Ｃ₁₈アリールアミノ、Ｃ₆〜Ｃ₁₈アミノアリール、Ｃ₂〜Ｃ₂₀ジ（ヒドロカルビル）アミノ、少なくとも３個の環原子を有する複素環式基、カルボキサミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＲ¹Ｒ²）若しくは式：（ＣＨ₂Ｘ）_cＥ（式中、Ｘ及びＥは上記定義の通りのものであり、ｃは０〜２５の整数である）により表される基からなる群から独立に選ばれるものであるか、又は両方のＲ⁴基がそれらが結合している炭素原子と共に５員若しくは６員環を形成し、この５員若しくは６員環に任意に１個以上のさらなるＲ⁴基が結合していてもよく、より好ましくは各Ｒ⁴基は水素、ハロゲン、Ｃ₁〜Ｃ₁₀アルキル、Ｃ₁〜Ｃ₁₀アルコキシ、Ｃ₅〜Ｃ₈シクロアルキル、Ｃ₆〜Ｃ₁₀アリール、少なくとも１個のＯ、Ｎ若しくはＳ原子を含む複素環式基、Ｃ₂〜Ｃ₁₀アルケニル、Ｃ₁〜Ｃ₁₀アルキルアミノ、Ｃ₁〜Ｃ₁₀ジアルキルアミノ若しくは式：（ＣＨ₂Ｘ）_cＥ（式中、Ｘ及びＥは上記定義の通りのものであり、ｃは０〜１０の整数である）により表される基からなる群から独立に選ばれるものであるか、又は両方のＲ⁴基がそれらが結合している炭素原子と共に５員若しくは６員環を形成し、この５員若しくは６員環に任意に１個以上のさらなるＲ⁴基が結合していてもよく、最も好ましくは各Ｒ⁴基は水素、メチル、エチル、プロピル、ブチル、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、Ｃ₅〜Ｃ₈シクロアルキル、少なくとも１個のＯ、Ｎ若しくはＳ原子を含む５員若しくは６員複素環式基、Ｃ₆〜Ｃ₁₀アリール、Ｃ₂〜Ｃ₁₀アルケニル、Ｃ₁〜Ｃ₁₀ジアルキルアミノ、塩素、臭素若しくは式：（ＣＨ₂Ｘ）_cＥ（式中、Ｘ及びＥは上記定義の通りのものであり、ｃは０〜３の整数である）により表される基からなる群から独立に選ばれるものであるか、又は両方のＲ⁴基がそれらが結合している炭素原子と共に５員若しくは６員環を形成し、この５員若しくは６員環に任意に１個以上のさらなるＲ⁴基が結合していてもよい）
により表される置換複素環式部分を包含し；並びに
ＺはＯ又はＮＲ⁵（式中、Ｒ⁵は水素又はヒドロカルビル含有基であり、より好ましくはＲ⁵はＨ又はＣ₁〜Ｃ₄アルキル基であり、最も好ましくはＲ⁵はＨである）である。
【００２０】
青色光源と共に使用する特に好ましい態様において、本発明は、一般式（「Ｂ」）：
【００２１】
【化６】

【００２２】
（式中：
ｍ及びｎは独立に０又は１であり、
ＺはＯ又はＮＲ⁵（式中、Ｒ⁵はＨ又はアルキル基であり、より好ましくはＲ⁵はＨ又はＣ１〜Ｃ４アルキル基であり、最も好ましくはＲ⁵はＨである）であり；
Ｙ及びＹ’は、それらの少なくとも一方がＯ、Ｓ又はＮＨ_xであることを条件として独立にＯ、Ｓ、ＮＨ_x又はＣＨ_y（式中、ｘは０又は１、ｙは１又は２である）であり；
Ｒ²、Ｒ³及びＲ⁴は式Ａに関して既に定義した通りである）
により表される蛍光イオノホア化合物を提供する。このイオノホアは基材に共有結合される場合には、Ｒ²、Ｒ³又はＲ⁴の少なくとも１つはＨ以外のものでなくてはならない。
【００２３】
概して、式Ａにより表される化合物の励起波長は少なくとも約３５０nmであり、発光波長は好ましくは約５００nm以下である。式Ｂにより表される化合物の励起波長は少なくとも約３８０nm、好ましくは少なくとも約３９０nmであり、そして発光波長は約５００nm以下、好ましくは約４８０nm以下である。これらの化合物の励起波長と発光波長とは好ましくは少なくとも約１０nm離れており、このことによってこれらの化合物は蛍光に基礎を置くカチオン濃度測定技術において有用なものとなることができる。
【００２４】
一態様において、本発明はある種のクマロクリプタンドを教示する。クマロ［２．２．２］クリプタンドイオノホアは、Ｐｂ⁺²又はＢａ⁺²の不在下では、Ｋ⁺に対して非常に選択性が高いが、クリプタンドケージの大きさが異なるクマロクリプタンドは他の一価及び二価カチオンに対して非常に選択性が高い。例えば、クマロ［２．２．１］クリプタンドは臨床上適切なレベルのＫ⁺及びＣａ²⁺を含む水溶液中のＮａ⁺に対して非常に選択性が高い。都合良いことに、本発明の［２．２．２］クマロクリプタンドは、水性媒体中で使用された場合に、Ｋ⁺に対する高い選択性を保つ（すなわち、Ｋ⁺／Ｎａ⁺錯化比は少なくとも２０：１である）。本発明のイオノホアのクリプタンド部分がカチオンと錯化する場合に、蛍光分析により個々の試料におけるカチオン濃度を決定することができるようにこのイオノホアの光学的特性は変化する。特に好ましい態様において、本発明のイオノホアの励起（すなわち、吸収）極大波長が３８０nmを超える波長に集中するように、クマリン環上の置換基及びそれらの位置が選択される。このことによって、本発明のイオノホアは、例えば青色ＬＥＤ及びレーザーのような固体光源と共に使用できるものとなる。置換基及びそれらの位置も、５００nm未満の発光波長を保つように好ましくは選ばれ、それによりイオノホアの応答はこの種の指示体に適するものに保たれる。結局、置換基及びそれらの位置は、基材への共有結合に任意性を提供するために選ばれることが好ましい。好ましくは、指示体が結合される基材は、均一かつ再現性のあるイオノホアの応答を維持するように及びイオノホアの応答に及ぼす生理的pH変化の影響を最低限に抑えるように選ばれる。
【００２５】
さらなる観点において、本発明は、基材と式Ａ又はＢにより表される蛍光イオノホア化合物とを含むカチオン検出用複合構造物を提供する。好ましくは、このイオノホア化合物は少なくとも１個のＥ基を含み、そしてこのイオノホア化合物は結合（すなわち、Ｅが基材上の共反応性基と直接に反応する）又はＥと当該イオノホアが結合すべき基材上の官能基との両方と反応することができる別の「連結基」化合物により基材に（例えば１個以上のＲ基を介して）共有結合する。連結基が使用される場合には、連結基が両末端に官能基を含み、その片方の末端に位置する官能基がＥに対して相補的であり、かつ、もう一方の末端に位置する官能基が基材上の官能基に対して相補的であることが好ましい。共有結合に適するカップリング剤は米国特許第５，０５３，５２０号明細書に記載されている。ホモ二官能性及び／又はヘテロ二官能性カップリング剤は国際特許出願明細書第ＷＯ９６／０７２６８号及び第ＷＯ９６／１０７４７号に記載されている。
【００２６】
さらなる観点において、本発明は、（ａ）前記検出用複合構造物を、イオン輸送可能なカチオン含有媒体に接触させ、カチオンを前記検出用複合構造物に拡散させるか又はカチオンを前記検出用複合構造物に拡散させる手段を提供し、当該検出用複合構造物の蛍光イオノホア化合物との平衡錯体を形成させる工程であって、前記イオノホア化合物錯体が、λ₁を中心とする波長範囲の光に暴露された場合にλ₂を中心とする波長範囲の光を放射することができるものであり、ここでλ₂はλ₁よりも少なくとも１０nm大きく、λ₁は少なくとも約３５０nmであり、より好ましくは少なくとも約３８０nmであり、λ₂は好ましくは約５００nm以下である工程；並びに（ｂ）前記錯体にλ₁を中心とする波長範囲の光を、集光されて検出される波長λ₂の可視光を前記錯体が放射するのに十分な時間当てる工程を含むカチオンの存在を検知する方法を提供する。適切なアルゴリズムによって、カチオン含有媒体中のカチオンの濃度と発光量とを相関させることができる。
【００２７】
定義
特に断らない限り、本明細書において以下の定義を適用する：
「基」若しくは「化合物」又は「部分」とは、所望の生成物を阻害しない一般的な置換基により置換することができる化学種を意味し；
「ＬＥＤ」とは発光ダイオードを意味し；
「クマロクリプタンド」とは、クマリンの典型的には６及び７位にオルト縮合したクリプタンド部分を有するクマリン部分を意味し；
「アルキル」とは、最も長い鎖中に１〜３０個の炭素原子を有する直鎖又は分枝有機基を意味し；
「芳香族」とはその１つの環又は複数の環中に５〜１５個の炭素原子又はヘテロ原子を有し、環電子が非局在化している環又は縮合環系を意味し；
「カルボキシル」とは、例えば、酸ハロゲン化物、アジド、アミド、イミダゾールアミド、エステル及びニトリルを包含するカルボン酸基又はそれらの誘導体を意味し；
「呼びかけ（interrogate)」とは、励起放射線源に暴露し、放射線の変化を監視することを意味し；
「非電子吸引性基」とは、ハメットσ_p値が０．２以下である任意の化学基（例えば、J.E. Leffler及びE. Grunwald のRates and Equilibria of Organic Reactions, 第172 頁(John Wiley and Sons, NY) に記載されているハメット置換定数を参照、引用によりその教示をここに含めることにする）を意味し；
「立体障害作用のない基」とは、ケージの機能を立体的に妨害しない任意の化学基を意味し；
「近接している」ｎπ^*及びππ^*励起状態とは、ｎπ^*励起状態とππ^*励起状態の間の１電子ボルト（ｅＶ）未満のエネルギー差を意味し；
ππ^*状態に関して「エネルギーが高い」とは、イオン依存性のある混成が基底状態への無放射カップリングを支配するのに十分に発蛍光部分のエネルギーが高いことを意味し；
６，７−ジオキソ置換クマリンに関して「面外パッカリング」とは、２個の環内酸素原子（１及び２位）に対する２個の環外酸素原子（６及び７位）の非対称運動を伴う分子振動を意味し；
「蛍光量子収率」とは、励起過程のうち蛍光放出をもたらすものの割合を意味し；
「ストークスシフト（Stokes shift）」とは、蛍光分子に関する発光極大波長と吸収極大波長の波長差を意味し；
「レッドシフト（red shift ）」とは、指示体の吸収波長がより長波長側に移動するように指示体を化学修飾することを意味し；そして
「活性水素」とは、穏やかな条件下で化学的に反応性であるようにヘテロ原子に結合している水素原子を意味する。
【００２８】
【発明の実施の形態】
本発明の蛍光イオノホア化合物は、（ｉ）イオンの結合用の錯化部分と（ii）発蛍光部分を含む。この化合物の吸収極大波長は少なくとも約３５０nmである。
【００２９】
ある態様において、本発明の蛍光イオノホアは上記一般式Ａにより表される。現在のところ好ましいある態様において、本発明の蛍光イオノホアは上記一般式Ｂにより表される。クマリン環上の３位（すなわち、式ＡのＲ¹）に電子吸引性又は分極性基を配置することによって、本発明のイオノホアの励起波長は、慣用的なガラスオプチックスを使用する系で使用できる点までレッドシフトし得る。
【００３０】
このイオノホアは、青色光源を使用する系で使用することができる点までレッドシフトすることがより好ましい。結合部位に対してαの位置（すなわち、α位）の片方又は両方の位置にヘテロ原子を有する５員複素芳香環をクマリン環上の３位に配置することによって、本発明のイオノホアの励起波長は、青色光源を使用する系で使用することができる点までレッドシフトし得る。励起波長は少なくとも３８０nmであることが好ましく、少なくとも約３９０nmであることがより好ましく、少なくとも約４００nmであることが最も好ましい。
【００３１】
励起波長が実質的にレッドシフトすることが好ましいと同時に、発光波長は約５００nm以下であることが好ましく、約４８０nm以下であることがより好ましく、約４７０nm以下であることが最も好ましい。この特定の種類の化合物に関し、当該イオノホアの応答は、吸収波長に依存せずに発光波長の増大とともに減衰するようである。５００nmを超える発光波長に関し、Ｋ⁺に対するイオノホアの応答は微々たるものである。これとは対照的に、血液パラメーターの監視に対しては、発光波長が約４７０nm未満である場合が最適であるようである。
【００３２】
本発明のイオノホアは２種の単位（例えば、クリプタンドとクマリン、又はクラウンエーテルとクマリン）を含み、この２種の単位は一緒になって特定のカチオンを選択的に検出することを可能にする。
【００３３】
錯化部分（例えば、クリプタンド又はクラウンエーテル部分）は分析すべきカチオンと相互作用する。当業者はどのクリプタンド及びクラウンエーテル部分が特定のカチオンを錯化するのに有用なものであるのかを認識することができるが、この論題についてのさらなる情報に関して、参考文献としてLehn及びSauvage の“[2]-Cryptates: Stability and Selectivity of Alkali and Alkaline-Earth Macrobicyclic Complexes,”J. Am. Chem. Soc. 第97巻, 第6700〜6707頁（1975）を挙げることができる。
【００３４】
クリプタンドケージに関し、酸素及び窒素原子により規定される［２．２．２］ケージ（例えば、上記式Ｂにおいてｍ及びｎが双方とも１である場合）によりこの単位は同様な直径を有するカチオン（例えば、Ｋ⁺、Ｐｂ⁺²、Ｓｒ⁺²及びＢａ⁺²）に対して相当に選択性の高いものとなり；［２．２．１］ケージ（すなわち、ｍ及びｎのうちの一方が１であり、他方が０である場合）によりこの単位は同様な直径を有するカチオン（例えば、Ｎａ⁺及びＣａ⁺²）に対して相当に選択性の高いものとなり；［２．１．１］ケージ（すなわち、ｍ及びｎの双方が０である場合）によりこの単位は同様な直径を有するＬｉ⁺及びＭｇ⁺²のようなカチオンに対して非常に選択性の高いものとなる。このサイズ選択性は、例えばＫ⁺に加えてＫ⁺以外のイオンを含有する生理的試料について［Ｋ⁺］を分析する場合に重要である。Ｋ⁺、Ｎａ⁺又はＬｉ⁺の生理的濃度を測定する系にこれらのクリプタンドを導入する場合に、より重い金属がこれらのイオンのうちの１つの分析を妨害する濃度で存在し難いことは都合良い。クリプタンド基は、被検体のpHに依存してモノプロトン化又はジプロトン化された形態で存在することができる。架橋窒素で起こるプロトン化は、生理的pH範囲にわたって（他の金属イオン以上に）Ｋ⁺に対する当該クリプタンドの選択性に実質的な影響を及ぼさないが、クリプタンド種の合計蛍光強度に影響を及ぼしうる。
【００３５】
クラウンエーテル部分に関し、酸素原子により規定される１５−クラウン−５ケージ（例えば、式Ａにおいてｑが０であり、ｎが０である場合）の大きさによりこの単位はＮａ⁺に対する選択性が適切であるものとなり；１８−クラウン−６ケージ（例えば、式Ａにおいてｑが０であり、ｎが１である場合）の大きさによりこの単位はＫ⁺に対する選択性が適切であるものとなり；２１−クラウン−７ケージ（例えば、式Ａにおいてｑが０であり、ｎが２である場合）の大きさによりこの単位はＫ⁺に対する選択性が相当に高く、かつ、Ｎａ⁺に対する選択性がないものとなる。
【００３６】
本発明のイオノホアの第２の特殊な単位は発蛍光部分である。この発蛍光部分は「情報伝達」単位と見なすことができる。例として生理的試験を用いると、錯化部分ケージ内にプロトン、Ｎａ⁺又は幾つかの他のカチオンが存在する場合に、発蛍光部分（例えばクマリン単位）は特徴的な蛍光強度対波長プロットを示す。錯化部分ケージの酸素及び／又は窒素原子とＫ⁺が錯化する場合に、蛍光強度の増加が観測される。換言すれば、カリウム錯体の形成によって、発蛍光部分の蛍光量子収率が増加する。特定の錯化部分に選択的な他のカチオンについてもこれと同様な機構があてはまる。適切な発蛍光部分にはクマリン部分が包含されるが、他の芳香族カルボニル又はニトロ芳香族若しくはＮ−複素環式部分が使用されてもよい。好ましい発蛍光部分には３位で置換されたクマリンが包含される。
【００３７】
クマリン単位は２位にカルボニル官能基を有する（すなわち、ＺがＯである）ことが好ましいが、このカルボニル官能基の代わりに当該イオノホアの性能に著しい影響を及ぼすことなくイミン官能基（例えば、ＺがＮＨ）を使用することができる。しかしながら、本発明のイオノホアが水性酸性環境中で使用される場合には、イミン官能基はカルボニル基に加水分解し得る。
【００３８】
本発明の蛍光イオノホアにおいて、クマリン単位の３位は電子吸引性基又は分極性基（例えば、式ＡのＲ¹）により置換されていてもよい。３位に置換基を配置することによって、本発明のイオノホアはMasilimani等により説明されているもののように４位で置換されたクマリンよりも幾分高い（例えば２０％以下高い）量子収率を有する。このことは、低い励起強度を用いることができ、それによって光分解の起こりやすさを減少させることが可能であり、またより低強度の光源を使用することができることを意味する。有用な電子吸引性基又は分極性基には、カルボキシル基、カルボキサミド基、スルホニルアリール基、エステル基、ケト−アルキルエステル基及び芳香族基（好ましくは１箇所以上の位置で置換されたもの）が包含される。好ましいＲ¹基には、エステル、ケト−アルキルエステル、複素環式部分及び置換芳香族基、例えば置換されたフェニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル及びベンゾチアゾリルが包含される。エステルのうちでエチルエステルが特に好ましく、ケト−アルキルエステルのうちで−（ＣＯ）ＣＨ₂ＣＨ₂ＣＨ₂（ＣＯ）ＯＣＨ₂ＣＨ₃が特に好ましい。好ましい芳香族の基置換基には、アミン、カルボン酸及びスルホン酸が包含される。これらのクマロクリプタンドの励起波長は概して及び好ましくは少なくとも３５０nmである。例えば、６，７−Ｏ，Ｏ−［２．２．２］−クリプタンド−３−カルボエトキシクマリンの励起波長は約３５４nmである。
【００３９】
クマリン単位の３位は、クマロクリプタンドへの結合位置に隣接する位置（すなわち、α位）の片方又は両方の位置にヘテロ原子を有する複素芳香族基により置換されることがより好ましい。適切な複素芳香族基には、一般式（式Ｃ）：
【００４０】
【化７】

【００４１】
（上式中、Ｙ及びＹ’は、それらの少なくとも一方がＯ，Ｓ又はＮＨ_xであることを条件として独立にＯ、Ｓ、ＮＨ_x又はＣＨ_y（式中、ｘは０又は１であり、ｙは１又は２である）であり、各Ｒ⁴基は、水素、ハロゲン、ヒドロカルビル含有基、複素非環式基、複素環式基、若しくは式：（ＣＨ₂Ｘ）_cＥ（式中、Ｘ及びＥは上記定義の通りであり、ｃは０〜１００の整数である）により表される基であるか、又は両方のＲ⁴基がそれらが結合している炭素原子と共に５員若しくは６員環を形成し、この５員若しくは６員環に任意に１個以上のさらなるＲ⁴基が結合していてもよい）
により表される５員基が包含される。
【００４２】
好ましくは、各Ｒ⁴基は、水素、ハロゲン、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルコキシ、Ｃ₃〜Ｃ₁₈シクロアルキル、Ｃ₆〜Ｃ₁₈アリール、Ｃ₆〜Ｃ₁₈アリールオキシ、Ｃ₆〜Ｃ₁₈ヒドロキシアリール、Ｃ₆〜Ｃ₁₈アリールカルボキシ、Ｃ₆〜Ｃ₁₈カルボキシアリール、Ｃ₂〜Ｃ₁₈アルケニル、Ｃ₁〜Ｃ₂₀ヒドロカルビルアミノ、Ｃ₆〜Ｃ₁₈アリールアミノ、Ｃ₆〜Ｃ₁₈アミノアリール、Ｃ₂〜Ｃ₂₀ジ（ヒドロカルビル）アミノ、少なくとも３個の環原子を有する複素環式基、カルボキサミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＲ¹Ｒ²）若しくは式：（ＣＨ₂Ｘ）_cＥ（式中、Ｘ及びＥは上記定義の通りのものであり、ｃは０〜２５の整数である）により表される基からなる群から独立に選ばれるものであるか、又は両方のＲ⁴基がそれらが結合している炭素原子と共に５員若しくは６員環を形成し、この５員若しくは６員環に任意に１個以上のさらなるＲ⁴基が結合していてもよい。より好ましくは、各Ｒ⁴基は、水素、ハロゲン、Ｃ₁〜Ｃ₁₀アルキル、Ｃ₁〜Ｃ₁₀アルコキシ、Ｃ₅〜Ｃ₈シクロアルキル、Ｃ₆〜Ｃ₁₀アリール、少なくとも１個のＯ、Ｎ若しくはＳ原子を含む複素環式基、Ｃ₂〜Ｃ₁₀アルケニル、Ｃ₁〜Ｃ₁₀アルキルアミノ、Ｃ₁〜Ｃ₁₀ジアルキルアミノ若しくは式：（ＣＨ₂Ｘ）_cＥ（式中、Ｘ及びＥは上記定義の通りのものであり、ｃは０〜１０の整数である）により表される基からなる群から独立に選ばれるものであるか、又は両方のＲ⁴基がそれらが結合している炭素原子と共に５員若しくは６員環を形成し、この５員若しくは６員環に１個以上のさらなるＲ⁴基が結合していてもよい。最も好ましくは、各Ｒ⁴基は、水素、メチル、エチル、プロピル、ブチル、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、Ｃ₅〜Ｃ₈シクロアルキル、少なくとも１個のＯ、Ｎ若しくはＳ原子を含む５員若しくは６員複素環式基、Ｃ₆〜Ｃ₁₀アリール、Ｃ₂〜Ｃ₁₀アルケニル、Ｃ₁〜Ｃ₁₀ジアルキルアミノ、塩素、臭素若しくは式：（ＣＨ₂Ｘ）_cＥ（式中、Ｘ及びＥは上記定義の通りのものであり、ｃは０〜３の整数である）により表される基からなる群から独立に選ばれるものであるか、又は両方のＲ⁴基がそれらが結合している炭素原子と共に５員若しくは６員環を形成し、この５員若しくは６員環に１個以上のさらなるＲ⁴基が結合していてもよい。
【００４３】
クマリン単位の３位に置換基を限定することによって、特定の５員複素芳香族環式基が、青色光源と共に使用することが可能になるほど十分に（すなわち、少なくとも３８０nmより上に）レッドシフトした励起極大波長を有するイオノホアを提供することが見出された。
【００４４】
ＧａＮ発光ダイオードのような固体光源は、吸収極大波長が少なくとも約３８０nm、好ましくは少なくとも約３９０nm、より好ましくは少なくとも約４００nmであるイオノホアの使用を必要とする。従来の化合物により提供されるものを上回る吸収極大波長のレッドシフトが必要である。しかしながら、レッドシフトした後の励起最大波長が３５０を超えるクマロクリプタンドの全てが有用であるとは限らない。例えば、６，７−Ｏ，Ｏ−［２．２．２］−クリプタンド−４−シアノ−３−カルボエトキシクマリンは吸収極大波長が約４２５nmであるが、Ｋ⁺の存在下でも殆ど又は全く応答を示さない。
【００４５】
特定の理論に束縛されるわけではないが、励起状態の「近接効果」は、カチオンに対するクマロクリプタンドの蛍光応答に一役を果たすと考えられる。特に、クリプタンドケージが適切な大きさのカチオン（すなわち、「標的カチオン」）と錯化していない場合に、分子の面外パッカリング振動は放射性ππ^*状態とその近傍の無放射性ｎπ^*状態との混成を誘発し、その結果、当該イオノホアの蛍光を弱くする。このパッカリングは、２つの環外クマリン酸素原子の逆位相面外振動と調和するクマリン部分の６位及び７位にある２つの環外酸素の逆位相（反対称）面外振動を伴う。標的カチオンがクリプタンドケージ内で錯化すると、このパッカリングは禁止され、蛍光が増加する。しかしながら、ππ^*状態のエネルギーが低すぎる（すなわち、発光波長が長すぎる）と、面内振動がππ^*状態と基底状態の直接混成を誘発し、標的カチオンの応答は低下するか又は失われ得る。このもう１つのエネルギー散逸過程は、６，７−Ｏ，Ｏ−［２．２．２］−クリプタンド−４−シアノ−３−カルボエトキシクマリン及び特定の他のレッドシフトしたクマロクリプタンドが標的カチオンの存在下で不適切な応答を示す理由であると考えられる。
【００４６】
上記記載に基づき、有用なイオノホアを設計することに関して次の３つの指針を導き出すことができる：（１）ππ^*及びｎπ^*状態はそれらの混成が可能になるほどエネルギー的に近接していることが好ましい；（２）ππ^*状態は、基底状態への無放射カップリングが優勢にならないか又は基底状態への無放射カップリングがｎπ^*状態とππ^*状態の標的カチオン依存性のある混成と非常に強く競合しないように十分にエネルギーが高いことが好ましい；並びに（３）クマロクリプタンドをレッドシフトさせるために使用されるいかなるクマリン置換基も当該クマロクリプタンドの面外パッカリング振動を妨害しないことが好ましい。
【００４７】
上記指針のうちの最初の指針は、吸収極大波長がレッドシフトされる一方で、それに対応して発光波長が増加するのを妨げなければならないこと、すなわちストークスシフトを比較的小さく保たねばならないことを意味する。（当然のことながら、蛍光の検出が可能であるように特定の最低限のストークスシフトを保つ必要がある。典型的には、このシフトは少なくとも約１０nm、好ましくは少なくとも約２０nm、より好ましくは少なくとも約２５nm、最も好ましくは少なくとも約３０nmである。）前記の第２番目の指針は、発光波長が約５００nm以下、好ましくは約４８０nm以下、より好ましくは約４７０nm以下であることを示す。前記の第３番目の指針は、吸収極大波長をレッドシフトするために使用することができる置換基の種類を限定する。特に、当該イオノホアのクマリン部分は、概して当該クマリン部分に縮合した環系を有することができず、このクマリン置換基は少なくとも３５０nmに（より好ましくは少なくとも３８０nmに）吸収極大波長をレッドシフトさせなくてはならないが、５００nmを超えるほどまで吸収極大波長をレッドシフトさせてはならない。
【００４８】
これらの指針に基づいて、可能性のあるクマリン及びクマロクリプタンド候補分子を調査した。この調査には３種のモデル化合物：６，７−エチレンジオキシクマリン（ＥＤＯ）、６，７−メチレンジオキシクマリン（ＭＤＯ）及び６，７−ジメトキシクマリン（ＤＭＯ）を使用した。ＥＤＯ型化合物は、それらがクマロクリプタンドにおける優れた標的イオン応答に必要とされる面外パッカリング振動モードと同様な面外パッカリング振動モードを維持することが示されたことから、未錯化クマロクリプタンドに対して好ましいモデルであることが見出された。前記ＤＭＯ及びＭＤＯ型化合物は、それらが平面構造を維持することから、錯化クマロクリプタンドに好ましいモデルであることが見出された。予想されるように、ＤＭＯ及びＭＤＯ型化合物の蛍光量子収率は、対応するＥＤＯ型化合物のそれよりも大きい。表１６ｅに示されるように、ＤＭＯ／ＥＤＯ及びＭＤＯ／ＥＤＯ量子収率比は、対応するクマロクリプタンドイオノホア応答の優れた予測者である。これらの相関によって、種々のレッドシフト性置換基に対して対応するクマロクリプタンドのＫ⁺応答を予測するために、ＥＤＯ型及びＤＭＯ型化合物に関する分子起軌道計算を使用することが可能となる。多数のＥＤＯ型モデル化合物に関する分子軌道計算（下記表１６ｃ参照）によって、少なくとも１個のヘテロ原子がα位に位置する複素芳香環により３位で置換されたクマリンは、約３９０nmの望ましい範囲内にあるレッドシフトした吸収波長に８０nmの範囲内にあるストークスシフトを与える能力を有することが示された。
【００４９】
本発明のクマロクリプタンドイオノホアの調製法は、引用によりここに含めることにする米国特許第５，４７４，７４３号明細書に詳細に記載されている一般スキームに基づく。典型的な反応スキームが便宜上示されている。以下の議論の中で、ビス−クロロエトキシ種を「基本中間体」と表示するが、任意の脱離基を末端基とするビス−エトキシ−２−ヒドロキシベンズアルデヒドを使用することができる。
【００５０】
このビス−クロロエトキシ基本中間体の調製は、Landini 及びMontanari によるSynthesis, 第223 〜225 頁（1978）に記載されている方法により調製することができる１，２−ビス−（２’−ヒドロキシエトキシ）ベンゼンを用いて開始することができる。過剰の塩化チオニルとの反応によりこの出発物質を１，２−ビス−（２’−クロロエトキシ）ベンゼン（Ｉ）に転化させることができる。化合物Ｉを塩化チタンの存在下で１，１−ジクロロメチルメチルエーテルと反応させ、加水分解させると１，２−ビス（２’−クロロエトキシ）ベンズアルデヒド（II）が生成する。化合物IIと過酸化水素及び硫酸との反応によって、３，４−ビス−（２’−クロロエトキシ）フェノール(III) が生成する。塩化チタンの存在下で化合物III を１，１−ジクロロメチルメチルエーテルにより処理し、加水分解させると、上記ビス−クロロエトキシ基本中間体種が生成する。
【００５１】
この基本中間体をシアノ置換５員芳香環化合物（Ｙ及びＹ’は上記定義の通り）により処理し、続いてＨＣｌと反応させると、３−（複素芳香族）−６，７−ビス（２’−クロロエトキシ）クマリン（IV）が生成する。塩素をヨウ素により置換して化合物Ｖとした後、アセトニトリルのような溶剤中での４，１３−ジアザ−１８−クラウン−６との反応によって、この化合物を６，７−［２．２．２］−クリプタンド−３−（複素芳香族）−クマリン（VI）に直接転化させることができる。所望であれば、化合物VII が提供されるように酸加水分解によりエステル基をカルボン酸基に転化させることができる。
【００５２】
これらの反応を以下のスキームにまとめた。
【００５３】
【化８】

【００５４】
当業者は、前記［２．２．２］種以外のクマロクリプタンドは、４，１３−ジアザ−１８−クラウン−６以外のジアザクラウンエーテルを使用することにより調製できることを認識するであろう。例えば、［２．２．１］クマロクリプタンドが望ましい場合には、１，４，１０−トリオキサ−７，１３−ジアザシクロペンタデカンを使用することができる。さらに詳細な点については下記実施例１８及び２０を参照されたい。
【００５５】
α位のうちの少なくとも１箇所にヘテロ原子を有する好ましい５員芳香環はフラン（例えば、ＹがＯであり、Ｙ’がＣＨである）である。他の有用な５員芳香環基には、限定するわけではないが、
【００５６】
【化９】

【００５７】
が含まれる。
【００５８】
電子状態に関する指針の上記議論に基づき、当業者は、式Ａの化合物に関してＲ¹、Ｒ²及びＲ³基の選択が重要であることを認識することができる。
【００５９】
当該化合物のレッドシフトに対するその寄与が特に重要であるＲ¹は既に述べた。
適切なＲ²基には、立体障害作用のない任意の基が含まれる。適切な基には、水素、ハロゲン、ヒドロカルビル含有基、複素非環式、又は式：（ＣＨ₂Ｘ）_aＥ（式中、Ｘ及びＥは上記定義の通りであり、ａは１〜１００の整数である）により表される基のような部分が包含される。好ましくは、各Ｒ²基は、水素、ハロゲン、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルコキシ、Ｃ₂〜Ｃ₁₈アルケニル、Ｃ₁〜Ｃ₂₀ヒドロカルビルアミノ、Ｃ₂〜Ｃ₂₀ジ（ヒドロカルビル）アミノ、又は式：（ＣＨ₂Ｘ）_aＥ（式中、Ｘ及びＥは上記定義の通りのものであり、ａは１〜２５の整数である）により表される基からなる群から独立に選ばれる。より好ましくは各Ｒ²基は、水素、ハロゲン、Ｃ₁〜Ｃ₁₀アルキル、Ｃ₁〜Ｃ₁₀アルコキシ、Ｃ₂〜Ｃ₁₀アルケニル及びＣ₁〜Ｃ₁₀アルキルアミノ、Ｃ₁〜Ｃ₁₀ジアルキルアミノ、又は式：（ＣＨ₂Ｘ）_aＥ（式中、Ｘ及びＥは上記定義の通りのものであり、ａは１〜１０の整数である）により表される基からなる群から独立に選ばれる。最も好ましくは各Ｒ²基は、水素、メチル、エチル、プロピル、ブチル、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、Ｃ₂〜Ｃ₁₀アルケニル、Ｃ₁〜Ｃ₁₀ジアルキルアミノ、塩素、臭素、又は式：（ＣＨ₂Ｘ）_aＥ（式中、Ｘ及びＥは上記定義の通りのものであり、ａは１〜３の整数である）により表される基からなる群から独立に選ばれる。
【００６０】
Ｒ³に対して多くの種々の基が選択されてよい。好ましいＲ³基には任意の非電子吸引性基が包含される。適切な基には、水素、ヒドロカルビル含有基、複素非環式基、複素環式基、又は式：（ＣＨ₂Ｘ）_bＥ（式中、Ｘ及びＥは上記定義の通りのものであり、ｂは０〜１００の整数である）により表される基のような非電子吸引性部分が包含される。好ましくは各Ｒ³基は、水素、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル、Ｃ₃〜Ｃ₁₈シクロアルキル、Ｃ₆〜Ｃ₁₈アリール、Ｃ₆〜Ｃ₁₈アリールオキシ、Ｃ₆〜Ｃ₁₈ヒドロキシアリール、Ｃ₆〜Ｃ₁₈アリールカルボキシ、Ｃ₆〜Ｃ₁₈カルボキシアリール、Ｃ₂〜Ｃ₁₈アルケニル、又は式：（ＣＨ₂Ｘ）_bＥ（式中、Ｘ及びＥは上記定義の通りのものであり、ｂは０〜２５の整数である）により表される基からなる群から独立に選ばれる。より好ましくは各Ｒ³基は、水素、Ｃ₁〜Ｃ₁₀アルキル、Ｃ₅〜Ｃ₈シクロアルキル、Ｃ₆〜Ｃ₁₀アリール、少なくとも１個のＯ、Ｎ又はＳ原子を含む複素環式基、Ｃ₂〜Ｃ₁₀アルケニル、又は式：（ＣＨ₂Ｘ）_bＥ（式中、Ｘ及びＥは上記定義の通りのものであり、ｂは０〜１０の整数である）により表される基からなる群から独立に選ばれる。最も好ましくは各Ｒ³基は、水素、メチル、エチル、プロピル、ブチル、Ｃ₅〜Ｃ₈シクロアルキル、Ｃ₆〜Ｃ₁₀アリール、Ｃ₂〜Ｃ₁₀アルケニル、Ｃ₁〜Ｃ₁₀ジアルキルアミノ、又は式：（ＣＨ₂Ｘ）_bＥ（式中、Ｘ及びＥは上記定義の通りのものであり、ｂは０〜３の整数である）により表される基からなる群から独立に選ばれる。
【００６１】
本発明のイオノホア化合物を基材に結合させるべき場合には、少なくとも１個のＲ基は、活性水素を有する官能基（すなわち、Ｅ基）を含まなくてはならない。そのような基の導入によって、共有結合を形成するような共反応性官能基との反応が可能となる。
【００６２】
各Ｒ²及びＲ³が水素であり、Ｒ¹が一般式（式「Ｃ」）：
【００６３】
【化１０】

【００６４】
（上式中、Ｙ及びＹ’はそれらの少なくとも一方がＯ、Ｓ又はＮＨ_xであることを条件として独立にＯ、Ｓ、ＮＨ_x又はＣＨ_y（式中、ｘは０又は１であり、ｙは１又は２である）であり、一方のＲ⁴は水素であり、もう一方のＲ⁴はカルボン酸基である）
により表される置換芳香族部分であることが好ましい。
【００６５】
Ｋ⁺の検出に特に好ましい本発明のイオノホアは式：
【００６６】
【化１１】

【００６７】
（上式中、ＹはＯ、Ｓ又はＮＨであり、特にＹはＯである）
により表される。
【００６８】
Ｒ¹、Ｒ²及びＲ³のうちの少なくとも１つ又は少なくとも１つのＲ⁴基が活性水素を含む基である場合には、本発明の蛍光イオノホアは、他の分子及び／又は基材への都合の良い共有結合手段を有する。本発明のイオノホアは、直接又は分子テザー（molecular tether）（すなわち、連結基）を通じて基材に結合して検出用組成物を形成することができるものであり、連続検出装置又はフロースルー（flow-through）装置にこの検出用組成物を導入することができる。
【００６９】
本発明のイオノホアをそのような連結基を通じて基材に結合させるべき場合に、その最も長い連続鎖は好ましくは５〜１２５個の炭素原子及び／又は酸素、窒素、硫黄等のようなヘテロ原子、より好ましくは１０〜７０個の炭素原子及び／又はヘテロ原子、最も好ましくは５〜１５個の炭素原子及び／又はヘテロ原子を含み、その少なくとも１つの末端に官能基はない。これらの連結基は、当該イオノホアとの金属イオンの相互作用能を阻害しないように親水性であることが好ましい。しかしながら、当該系の種々の物理的特性にこの連結基が寄与することが望ましい場合又は基材が十分に親水性である場合には、その繰返し単位及び末端基の官能性をそれに応じて変性させることができる。
【００７０】
当該クマロクリプタンドのＲ基のうちの１つと選択的に反応するようにこれらの連結基の官能基を選択することができる。可能な官能基には、アミン類、アミド類、エステル類、オキシラン類、オレフィン類、尿素類、イソシアネート類、チオイソシアネート類、カルバメート類、スルホン酸、スルホンアミド類、塩化スルホニル類、カルボン酸類、カルボキシル類、シラノール類、クロロトリアジン類、ヒドラジン類、ヒドラジド類及びアルデヒド類（又は当該クマロクリプタンドのＲ基のうちの１つと反応することによって、アミン類、アミド類、エステル類、エーテル類、尿素類、ウレタン類、スルホンアミド類、シラン類及びヒドラジド類を形成する基）が包含される。
【００７１】
この連結基は、好ましいことに当該イオノホアとの反応前に基材に結合することができる。これは２通りの態様のうちの一方で行われる。第１の態様では、当該イオノホアを結合させる前に、連結基を基材と反応させることができる。この選択肢を選ぶ場合には、各連結基は二反応性である（すなわち、各テザーの各端に同種又は異種の官能基を有する）ことが好ましく、基材はテザーの官能基のうちの１つの官能基と反応することができる相補的官能基を有することが好ましい。第２の態様では、予め結合した連結基を用いて基材を形成することができる。このことは、例えば、連結基が前もって結合するように基材ポリマーを選択することを伴う。
【００７２】
検出用複合構造物を形成するために本発明のイオノホアを基材上に固定化（すなわち、直接又は連結基を通じて）すべき場合に、種々の形態の基材を使用することができる。当該検出用複合体を連続監視装置に導入すべき場合には、単に当該装置の寸法及び形態のために、平面状基材がおそらく好ましいであろう。
【００７３】
平面状基材又は平面状に容易に作製可能な基材の例には、膜又はフィルムの形態にある自己支持性ポリマー、及びコーティング可能なポリマー（すなわち、基材上にコーティングすることができるポリマー）が包含される。自己支持性膜は、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニリデン、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリスルホン、セルロース、官能化セルロース及びナイロン、並びにシリカキセロゲル若しくは多孔質ガラスのようなシリカを包含する種々のポリマーから形成される。（ある種のナイロン膜は、不十分な可逆複合材料、すなわち金属イオン濃度の変化に伴う強度変化を徐々に示さなくなる前に、高カチオン濃度と低カチオン濃度の間で僅かに数サイクルだけしか使用することができない複合材料を提供する。）有用な基材は好ましくはイオン透過性であり、場合に応じて、Ｒ基の官能基と相補的な、Ｒ基の官能基と反応する基により官能化されたものであるか、又はそのような基を本質的に有するように処理（例えば、空気酸化）されたものである。
【００７４】
イオノホアを基材表面に結合させるべき場合にイオノホアの濃度をできる限り高くするために、多孔質基材又は膜を使用すること、又は当該イオノホアを結合させる前に、膜、特にシリカを含む膜の表面を粗くすることが望ましいであろう。
【００７５】
水不溶性のコーティング可能なポリマーが好ましい基材である。そのようなポリマーには、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、塩化ビニルのコポリマー及びターポリマー、スチレンとマレイン酸及び無水マレイン酸のうちの少なくとも１種とのコポリマー、アルキルビニルエーテルとマレイン酸及び無水マレイン酸のうちの少なくとも１種とのコポリマー、ビニルジメチルアズラクトンのポリマー及びコポリマー、並びにアクリレートエステル及びメタクリレートエステル（又はアクリルアミド及びメタクリルアミド）のうちの１種とアクリル酸及びメタクリル酸のうちの１種とのコポリマーが包含される。本発明のイオノホアがいったんこれらのポリマーのうちの１種に（直接又は連結基を通じて）共有結合したならば、場合に応じてポリマー−イオノホア複合体を上記の膜のうちの１つの上に塗布することができる。代わりに、（場合に応じて連結基と反応した）コーティング可能なポリマーにより膜をコーティングし、次に本発明のイオノホアの溶液中で反応させてもよい。どちらが行われても、基材は当該イオノホアを有するコーティング可能なポリマーを加えた膜となる。
【００７６】
特に好ましい複合構造物は、本発明の３位置換クマロクリプタンドと（直接又はテザーを通じて）反応したポリマーによって場合に応じてコーティングされた前記基材である。有効な予備形成されたポリマー基材のうちで好ましい例には、ＰＣＴ特許出願明細書第ＷＯ９２／０７８９９号に記載されているようなＰＶＣでオーバーコートされた親水性多孔質ポリプロピレン（ＨＰＰＰ）が包含される。カーボンブラックでオーバーコートされたヘキサンジアミン（ＨＤＡ）官能セルロースも好ましい。
【００７７】
当業者は、プロトン（又はヒドロニウムイオン）を選択的に透過し得る基材又は膜を選択することによって、種々の濃度の金属イオンの存在下でpHセンサーとして機能する複合構造物を調製できることを認識するであろう。一定濃度の金属イオンが保たれる場合には、そのような選択性膜が必要でないこともありうる。
【００７８】
フロースルー装置を使用する場合には、例えば、固体複合構造物を粉末に粉砕するか（又はクマロクリプタンド化合物を市販入手可能な粉末若しくはビーズに結合させてもよい）、又はヒドロゲル、アクリルアミド若しくはアクリレート型ゲルのようなイオン透過性マトリックス内に封入することができる。当該複合構造物が粉末であるならば（又は粉末に粉砕されるならば）、所望であれば平面状の基材に当該複合構造物を付着させることができる。
【００７９】
連続検出が望ましい場合に、基材は当該基材付近に存在するカチオンと相互作用しないか又は当該基材付近に存在するカチオンとの可逆的相互作用を可能にしないため、特定の基材形態に関わらず、カチオンは、結合しているイオノホアと可逆的錯体を容易に形成することができる。カチオン／イオノホア平衡の阻害を最低限に抑えるために、この相互作用の可逆性がカチオン濃度が変化したときに著しく変わらないような態様で、選択された基材材料がカチオンと相互作用することが好ましい。基材自体は、好ましくはカチオンと不可逆的に反応せず、かつ、カチオンを不可逆的に吸着せず、負の実効電荷を有し、親水性である。選択された基材が本質的にこれらの好ましい特性を持たないならば、選択された基材が本質的にこれらの好ましい特性を持つように基材を変性させることができる。例えば、この組成物に全負電荷を与え、その親水性を高めるために、前記連結基と共にスルホネート基又はホスフェート基を結合させることができる。
【００８０】
結合したイオノホアにカチオンが達するにはカチオンが基材中を拡散しなくてはならない装置に当該検出用組成物を使用すべき場合には、基材が少なくとも幾分イオン透過性であるか又は微孔質であることが必要である。さらに、光の呼びかけビームが使用されるかどうか（及びどのように光の呼びかけビームを使用するか）に依存して、半透明又は透明基材と不透明の反射性又は光吸収性オーバーコートを提供することが望ましいであろう。典型的なオーバーコートには、ポリマーのようなキャリア又は適切な溶媒中にカーボンブラック又は他の顔料を含む分散液が包含される。
【００８１】
被検体溶液中のカチオンの濃度を定量的に決定すべき場合には、平衡イオン−イオノホア錯体濃度を測定することができる分析技術が好ましい。分光分析法が特に有用であることが見出された。蛍光分析法が特に好ましい。そのような方法を任意に改良して励起光及び放射光の伝送にファイバーオプチックスを使用してもよい。例えば、励起波長λ₁を中心とする波長範囲の呼びかけ光を導入するため及び発光波長λ₂を中心とする波長範囲の放射光を検出器に送信するために、１本以上の光学繊維を使用することができる。
【００８２】
光源を使用するシステムは産業上の有用性があることが証明されているが、固体ＬＥＤ及びレーザーダイオード光源が好ましい。これらの固体光源は、概して、光電子システムの信頼度を高め、コストを抑え、サイズを小さくし、ノイズ／ドリフト特性を改良する。日本国のニチア化学工業により販売されているＧａＮ青色ＬＥＤは、多芳香族炭化水素系蛍光指示体系のための実際的なＬＥＤ型電子光学システムの開発を可能にしてきた。特に、ＧａＮ発光ダイオードの発光（３９０〜４２０nm）は、本明細書に開示するレッドシフトしたイオノホアの吸収極大波長に一致させることができる。さらに、新しいＧａＮレーザーダイオードは４０５nmの光を発するものであって、位相変調型イオノホア検出を持続させるのに十分な周波数で変調させることができるものである。
【００８３】
本発明の蛍光イオノホア化合物は、特定のカチオンの濃度の決定が望まれる種々の用途に使用することができる。Ｋ⁺又はＮａ⁺に対して選択性があるイオノホアは、これらのイオンの濃度を決定する際に、特に生物学的系において特に有用である。これらのイオノホアは、現存する試験用キットに組み込まれても、種々の基材上にコーティングされても、ファイバーオプチック型分析装置に組み込まれてもよい。Ｐｂ⁺²に対して選択性があるイオノホアは、環境試験で、あるいは生物学的試験でも有用であり得る。シリコーンゴム又は同様な気体透過性膜の内側（又はことによると後方）の適切に緩衝化された水が充填された区画内に、pH近傍のpK_a、好ましくはジプロトン化種のpK_aを有するクマロクリプタンドイオノホアを限定することによって、［ＣＯ₂］を決定することも可能となる（すなわち、イオノホアは、Ｈ₂ＣＯ₃へのＣＯ₂の水和により発生する酸性種と相互作用し得る）。これらのイオノホアを使用する他の検出及び濃度決定用途は当業者に明らかであろう。
【００８４】
本発明の複合構造物の顕著な利点は、pHがそれらの蛍光強度に影響を及ぼさないことである。例えば、約４mMの生理学的Ｋ⁺濃度で生理学的pH範囲（７．３〜７．５）を包含する約６．９８〜約７．８のpH範囲にわたってのそのような検出用複合構造物の蛍光強度の変化は、全蛍光強度の僅かに約６％であった（図４ｂ参照）。対照的に、米国特許第５，４７４，７４３号明細書に記載されている先行技術のクマロクリプタンドは同様なpH範囲にわたって約３３％の蛍光強度の変化を示した（図４ａ参照）。
【００８５】
特に好ましい態様において、当該イオノホアは、血液のような流体の１種以上のパラメーターを測定するためのシステムの一部であるカセットであって、米国特許第４，６４０，８２０号及び第４，７８６，４７４号明細書、並びに同時係続出願である米国特許出願番号第０８／８１０，９５４号に記載されているようなカセットを包含するカセットに組み込まれる。当該イオノホアを、多層集成体にさらに組み込まれる膜であって、前記多層集成体がカセットに接着させることができるものである膜に共有結合させることが好ましい。そのような多層集成体は、感圧接着剤層であって、その片面に貼り付けられた剥離ライナー（例えば、ポリエチレンテレフタレート、接着剤業界でＰＥＴとして知られているもの）と、その対向面に薄い可撓性膜、例えばＰＶＣ又はポリカーボネートとを有する感圧接着剤層を含み得る。本発明の検出用イオノホアが共有結合した又は本発明の検出用イオノホアによりコーティングされた好ましくはＨＰＰＰ又は変性セルロースのようなキャリア基材を含むこの検出用基材は、可撓性膜に接着剤により接着されるか又は可撓性膜に貼り合わされる。この多層集成体の最外面（例えば、当該検出用基材の露出面）で、不透明コーティングが当該検出用基材を被覆していることが好ましい。個々の層については前述の通りである。
【００８６】
既に述べたもののような流体パラメーター測定システムに有用なカセットには、フロースルー型又はシャント型の少なくとも２種類がある。フロースルーカセットは、動脈又は静脈路内での検出に有用であることができ、一方、シャントカセットは、例えば開胸外科手術でのシャント路内での検出に有用であることができる。シャント路は、患者からの血液を主心肺循環回路に接続されているが主心肺循環回路から分かれている回路に流す手段を包含する。以下で述べる一体型カセット集成体は、それが典型的にはより小さな流体チャンバーを有し、当該システムから容易に取り外し、慣用的なオートクレーブ法により殺菌することができるものであるため、シャント路で使用されることが好ましい。都合良いことに、本発明のクマロクリプタンドイオノホアを含む多層検出用集成体は、オートクレーブ殺菌（約１２０℃）の前後で実質的に同じイオン応答及びスペクトル特性を示す。
【００８７】
フロースルーカセットによって、動脈及び静脈路に沿う流体の通過を、監視前に妨害されずに保つことが可能となる。フロースルーカセットは、典型的には、血液流を制限しないようにより直径が大きい入口と出口を有する。半透膜が使用される場合に、半透膜は、本明細書に記載するような１つ以上の較正された検出用膜が組み込まれた本体に封着されるフロースルーケーシングの上部開口部をシールする。この検出用本体は、以下で詳しく説明する図１１の装置２００のような測定装置に接続されることが好ましい。いったん流体パラメーターを測定したならば、このカセットは装置２００から取り外され、廃棄される。フロースルーカセットは、通常オートクレーブ処理されることを予定されていない。
【００８８】
血液のような流体の１種以上の特性又はパラメーターを測定するためのシステム１０を図１１に示す。システム１０は概してカセット１２内の流体のパラメーターを測定するための測定装置１４に加えて流体を受容するカセット１２を具備する。
【００８９】
カセット１２を図１２により詳細に示す。このカセット１２は、ケーシング１６の軸線に沿って延びる細長い内部フロースル流体チャンバー１８を画定する壁部分を有する細長いケーシング１６を具備する。流体チャンバー１８は、チャンバー１８に流体を入れるための第１口又は「入口」を有する第１部分２０と、流体が流体チャンバー１８から流出させるための第２口又は「出口」を有する第２部分２２と、部分２０と２２の間に位置する中央部分とを具備する。（この記載は、第１部分２０を通ってチャンバー１８に流入し、第２部分２２を通ってチャンバー１８から排出される流体を示すものであるが、所望であれば流体が第２口を通ってチャンバー１８に入り、そして第１口を通って出るように、流体がチャンバー１８を通って逆方向で流れてもよいことが理解されるべきである。）
【００９０】
ケーシング１６の外側は、概して長円形の窪み２６を有する中央部分を具備する。チャンバー１８内の流体の１種以上のパラメーターを決定するための少なくとも１つのセンサーが、ケーシング１６に搭載される。図示されている態様において、一連の４つのセンサーは窪み２６と流体チャンバー１８の中間部分２４との間に配置されており、これらのセンサーは、ケーシング１６の軸線に沿って整列して互いに離間した関係で設けられた４つのキャビティ内に配置されている。図４に示されているように、これらのセンサーは、キャビティ２７、２９、３１、３３のそれぞれの中に収容されているカリウムセンサー２８、pHセンサー３０、二酸化炭素センサー３２及び酸素センサー３４を包含する。
【００９１】
ケーシング１６内の穴は、pHセンサー３０と二酸化炭素センサー３２の間に設けられている。熱電対収容用縦穴３６はケーシング１６に取り付けられており、前記穴に延びている。縦穴３６は、流体チャンバー１８の中央部分に面するケーシング１６の壁部分に接着剤により接着されたリムを有する帽子型の形態を有する。適切な接着剤は、Loctite Corporation 製の商標「UV Cure 」の接着剤のようなアクリルウレタン系接着剤である。縦穴３６は金属のような伝熱性を有する耐蝕性材料、例えば厚さ０．００４インチ（０．１mm）のチタンから作製されたものであることが好ましい。縦穴３６は、流体チャンバー１８内の流体との本質的な熱的接触を提供するように、流体チャンバー１８の中央部分２４中に突き出ている。
【００９２】
ケーシング１６は、窪み２６を画定し、そしてケーシング１６の軸線から離れる方向に外側に向かって延びる概して長円形のリム４０も具備する。図１２を参照すると分かるように、長円形の窪み２６と周囲のリム４０の主軸は一致しており、センサー２８、３０、３２、３４及び縦穴３６の中心を横切って延びており、またケーシング１６及び流体チャンバー１８の軸線と平行である。
【００９３】
半円筒形の整合キー４２はリム４０の内壁に一体的に連結されている。また、ケーシング１６の軸線に垂直であり且つセンサー３２とセンサー３４の間に等距離に延びる基準面が整合キー４２の直径面に沿って整合キー４２を二等分するように整合キー４２が配向されることが好ましい。
【００９４】
カセット１２は、測定装置１４にケーシング１６を着脱可能に連結するための第１雄カップリングを具備する。カップリング４４は、ケーシング１６の軸線に垂直な方向に、凸状の概してＵ字形の形状を有する。カップリング４４は、ケーシング１６の前述の中央部分と、リム４０の外延方向とは反対側にケーシング１６から外側に延びる対向脚部４６とを具備する。各脚部４６は、各脚部４６の外面と平行である同一平面上の平らな外面４７を有する支持部分の対を具備する。好ましくは、対向脚部４６の外面４７は、ケーシング１６に収束し、約２８度〜約３２度の範囲内の角度で互いに向かい合う各基準面に沿って延びている。より好ましくは、外面４７は、約３０度の角度で互いに向かい合う各基準面に沿って延びている。
【００９５】
フランジ４８は、各脚部４６の外端に一体的に連結されている。フランジ４８は、ケーシング４８の軸線と平行な共通基準面内にある。脚部４６は、幾分可撓性であり、指圧の作用下でもう一方の方向に若干移動することができるが、いったん指圧を解放すると、それらの原形に即座に且つ繰返し戻るのに十分な記憶も有する。
【００９６】
各脚部４６の外側の中央端領域は、前記支持部分の間に存在するくさび形タブ５０に一体的に連結されている。タブ５０は、一方に対して約８０度の角度で配向している各基準面に沿って各脚部４６から外側に向かって互いに反対側に延びている。さらに各タブ５０の末端は、フランジ４８の延長方向に対して２５度の角度で配向している基準面内で延びている。タブ５０の最外端は、各脚部４６の隣接する領域に対して外側に間隔をおいて拡がっており、且つ、ケーシング１６の軸線とフランジ４８を含む上記基準面との間の共通基準面内に存在する。
【００９７】
好ましくは、ケーシング１６は、医療用ポリカーボネートのような比較的透明のプラスチック材料から作製されたものであって、射出成形に続いて互いに接合された２個以上の元々は別々の部品から構成されたものである。適切な２個構成構造の例を図１３に示す。図１３において、ケーシング１６の一部品は窪み２６及びリム４０を具備してセンサー２８、３０、３２及び３４を搭載し、そして第２の部品は図示されているような脚部４７、入口及び出口並びに他の要素を具備する。これらの部品は、超音波溶接、溶着又は接着により互いに連結される。当然のことながら、他の構造（一体的な１個構成構造又は３個構成構造）も可能である。
【００９８】
図１１〜１３に例示されているように、ケーシング１６は第１部分２０の入口を取り囲む第１おねじ付き部分を有する。この第１おねじ付き部分は、カセット１２がチャンバー１８を流れる流体のパラメーターを測定するために使用される場合に、めねじ付きLuer型コネクタに係合的に連結するような構造に作られたものであることが好ましい。コネクタ５２はチャンバー１８の方に流体を向けるフレキシブルチューブの部分に締り嵌め継手を提供するためのリブ付き部分を有する。
【００９９】
第２ねじ付き部分は第２流体チャンバー部分２２の出口を取り囲む。図１１に示されているように、取付部品５６は、第２ねじ付き部分を係合的に受容するめねじ付き部分を場合に応じて有する。取付部品５６は、放射状に内側に延びるリブを有する後方に延びるつばを具備する。ケーシング１６は、取付部品５６がケーシング１６から部分的に抜けたときには常に標準環境下での取付部品５６の脱離を防止するために、限界を画する外側に放射状に延びるリブであって、止め具として機能し、且つ、当該リブに物理的障害を提供する第２ねじ付き部分に隣接するリブ６０を有する。
【０１００】
測定装置１４は、２部品型の細長いハウジング２００を具備する。この２個の部品は、（スナップ合わせ集成体用の）内側にかえしのあるコネクタにより又はねじにより結合させることができる。ハウジング２００は、ポリカーボネートとアクリロニトリル−ブタジエン−スチレン（ＡＢＳ）ポリマーの混合物のような耐衝撃性プラスチック材料から作製されたものであって、殺菌を容易にするために滑らかな外面を有する。場合に応じて、ハウジング２００の内面は電磁適合性のある材料によりコーティングされる。
【０１０１】
測定装置１４は、陽極酸化されたアルミニウムのような金属材料から任意に作製された第２雌カップリング２０２を具備する。カップリング２０２は、ハウジング２００の軸線に垂直な方向に概してＵ字形の凹形窪みを有する。この窪みは、中央湾曲部２０６により相互連結される２つの平らな対向側壁部２０４を具備する。好ましくは、対向側壁部２０４は、湾曲部２０６に収束し、約２８度〜約３２度の範囲内の角度で互いに向かい合う各基準面に沿って延びている。より好ましくは、外面４７は、約３０度の角度で互いに向かい合う各基準面に沿って延びている。各側壁部２０４の外端部は、ハウジング２００の軸線に平行な方向に延びる細長い溝２０８を有する。
【０１０２】
本発明の理解を助けるために次の実施例を示すが、この実施例が本発明の範囲を限定するものであると理解されるべきではない。特に断らない限り、全ての部及び百分率は重量で表されている。
【０１０３】
【実施例】
実施例１〜６及び１８〜２１は、フリル置換クマロクリプタンド（ＦＣＣＣ）の調製法を説明する。実施例７〜１１はチオフェン置換クマロクリプタンド（ＴＣＣＣ）の調製法を説明する。
実施例１２〜１６は、ＦＣＣＣの誘導体を含むセンサーの作製法を説明する。実施例１７は、このセンサーについて実施した試験結果を説明する。
実施例２６〜３６は、６，７−［２．２．２］−クリプタンド−３−カルボエトキシ−クマリン(VII) の調製法における種々の工程を説明する。実施例３７は、この化合物のエステル部分の加水分解を説明する。
【０１０４】
実施例１
エチル−（５−ブロモエチル）−２−フロエート
Ａ．ルート１
Bull. Chem. Soc. Japan, 第60巻、第1907〜1912頁（1987）に記載されているTsuboi等の手順を用いて二酸化セレンによりエチルソルベートを酸化させ、エチル−ｔ−メチル−２−フロエート及びエチル−５−メチル−２−セレノフェノカルボキシレートの混合物とした。
１８ｇのエチルソルベート、２６ｇのＳｅＯ₂及び７５mlのキシレンの混合物を還流下で約２時間加熱した。濾過後、蒸留により溶剤を除去した。
残留油をシリカゲル上で２種の生成物にクロマトグラフ分離（ヘプタン−酢酸エチル４：１を使用）した。エチル−５−メチル−２−フロエートの収量は５．１２ｇであった。
H¹ NMR(CDCl₃): d 1.38 (t, 3H, CH₃); d 2.40 (s, 3H, CH₃); d 4.38 (q, 2H, CH₂); d 6.11 (d, 1H, Ar-H); d 7.07 (d, 1H, Ar-H).
【０１０５】
Textbook of Practical Organic Chemistry, B. Furniss 等（編集者）、第４版、Longman, London （1978）の第402 頁にVogel により記載されている手順に従って、１５０mlのクロロホルムに、１６．４ｇのＮ−ブロモスクシンイミド及び０．５ｇの過酸化ベンゾイルと共に１４．２ｇの上記生成物を加えた。この混合物を窒素下で約２時間還流させ、次に一晩冷却した。
沈殿したスクシンイミドを濾過し、回転減圧蒸発器によりＣＨＣｌ₃を除去した。エチル−（５−ブロモエチル）−２−フロエートの収量は１５．５ｇであった。
H¹ NMR(CDCl₃): d 1.38 (t, 3H, CH₃); d 4.36 (t, 2H, CH₂); d 4.50 (s, 1H, CH₂Br); d 6.50 (d, 1H, Ar-H); d 7.12 (d, 1H, Ar-H).
【０１０６】
Ｂ．ルート２
OPPI Briefs, 第17巻、第203 頁（1985）に記載されているMoore 等の手順を用いてスルファミン酸及び亜塩素酸ナトリウムにより５−メチル−２−フルフラルアルデヒドを酸化させた。
２リットルの水に５０ｇの５−メチル−２−フルフラルアルデヒド及び４４ｇのスルファミン酸を溶解させた。別の５００mlの水に４１ｇの亜塩素酸ナトリウムを溶解させ、この第２溶液を前記第１溶液に加えた。組み合わせた溶液を一晩攪拌し、１００mlの酢酸エチルを用いて３回抽出し、次に濃縮すると油となり、この油は放置すると結晶化した。５−メチル−２−フロ酸の収量は２７．５ｇであった。
H¹ NMR(CDCl₃): d 2.35 (s, 3H, CH₃); d 6.09 (d, 1H, Ar-H); d 7.08 (d, 1H, Ar-H).
【０１０７】
この手順から得た生成物２２ｇと触媒量のＨ₂ＳＯ₄を５００mlのエタノールに加えた。２日間還流後、溶液を１リットルの水に注ぎ入れ、酢酸エチルを用いて抽出した。回転減圧蒸発器を使用して酢酸エチルを除去（すなわち、濃縮）した。残留物を２０mlのヘプタンに溶解させ、フラスコの底部で形成されていた少量の褐色固形物からデカントした。
【０１０８】
このヘプタン溶液を濃縮し、１４．６ｇの褐色液体を得た。この反応の収率は、少量の２，６−ジ−ｔ−ブチル−４−メチルフェノールを酸化防止剤として加えることにより向上した。ＮＭＲスペクトルは、エチルソルベートのＳｅＯ₂酸化から得られた生成物（すなわち、エチル−５−メチル−２−フロエート）に一致した。
前述のようなＮ−ブロモスクシンイミドによる臭素化によって、エチル−（５−ブロモメチル）−２−フロエートが生成した。
【０１０９】
実施例２
エチル−（５−シアノメチル）−２−フロエート
Ａ．ルート１
２０mlのエタノールに、１５．５ｇのエチル−（５−ブロモメチル）−２−フロエート（実施例１から）を加え、これに１０mlの水に２．７ｇのＮａＣＮを含む溶液を加えた。組み合わせたものを約１時間還流させ、次に冷却し、水に注ぎ入れ、生成物を酢酸エチル中に抽出させた。
この溶液を濃縮し、純度約５０％の褐色液体１０．８ｇを得た。
H¹ NMR: d 1.15 (t, 3H, CH₃); d 4.24 (q, 2H, CH₂); d 4.30 (s, 2H, CH₂CN); d 6.60 (d, 1H, Ar-H); d 7.26 (d, 1H, Ar-H).
【０１１０】
Ｂ．ルート２
代わりに、市販入手可能なエチル（５−クロロメチル）−２−フロエート（ワイオミング州ミルウォーキー所在のAldrich Chemical Co.製）から以下のようにエチル−（５−シアノメチル）−２−フロエートを調製した：
２５．８９ｇのＫＣＮ、５００mlのＤＭＳＯ及び２００mlのＴＨＦを含む機械攪拌機が装着された５リットル３口丸底フラスコに、５００mlのＴＨＦ中の５０ｇのエチル−（５−シアノメチル）−２−フロエートを４分間にわたって滴下添加した。混合物を２３℃で一晩攪拌し、次に２リットルの５℃の水及び１リットルのクロロホルムと共に１０分間攪拌した。水性相を分離し、５００mlのクロロホルムで２回抽出した。組み合わせたクロロホルム相を１リットルの飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、２７０ｇの硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、回転減圧蒸発器で蒸発させた。残留物をシリカゲルカラム上でフラッシュ濾過し、酢酸エチル：石油エーテル１５：８５混合物を使用して所望の生成物を溶出させた。収量は１３．７７ｇであり、特性評価は上記のようにＮＭＲにより行った。
【０１１１】
実施例３
６，７−ビス−（２’−クロロエトキシ）−３−［２''−５''−カルボエトキシ）−フリル］クマリン
１００mlのエタノールに、１０．８３ｇの粗製エチル−（５−シアノメチル）−２−フロエート（実施例２から、純度約５０％）、１６．９ｇの４，５−ビス−（２’−クロロエトキシ）−２−ヒドロキシ−ベンズアルデヒド（米国特許第５，４７４，７４３号明細書の実施例４に記載されている手順に従って調製したもの）及び触媒量のピペリジンを組み合わせた。混合物を約１時間還流させ、冷却し、次いで２０mlの濃ＨＣｌにより処理した。数分後、沈殿物が形成された。スラリーを冷却し、４．８ｇの固形物を採集した。
H¹ NMR(d₆DMSO): d 1.31 (t, 3H, CH₃); d 3.98 (m, 4H, CH₂Cl); d 4.32 (m, 4H, CH₂); d 4.42 (t, 2H, CH₂); d 7.22 (d+s, 2H, Ar-H); d 7.40 (d, 1H, Ar-H); d 7.65 (s, 1H, Ar-H); d 8.43 (s, 1H, Ar-H).
【０１１２】
実施例４
６，７−ビス−（２’−ヨードエトキシ）−３−［２''−（５''−カルボエトキシ）−フリル］クマリン
４．３ｇの６，７−ビス−（２’−クロロエトキシ）−３−［２''−５''−カルボエトキシ）−フリル］クマリン（実施例３から）及び４．１ｇのＮａＩを１００mlのメチルエチルケトン中で３日間還流させた。溶液を冷却し、４．３ｇの沈殿物を採集した。この沈殿物は対応するヨウ素化クマリンであることが示された。
H¹ NMR(d₆DMSO): d 1.31 (t, 3H, CH₃); d 3.50 (m, 4H, CH₂I); d 4.32 (m, 4H, CH₂); d 4.40 (t, 2H, CH₂); d 7.08 (s, 1H, Ar-H); d 7.18 (d, 1H, Ar-H); d 7.34 (d, 1H, Ar-H); d 7.58 (s, 1H, Ar-H); d 8.38 (s, 1H, Ar-H).
【０１１３】
実施例５
ＦＣＣＣ−エステル
（６，７−［２．２．２］−クリプタンド−３−［２''−（５''−カルボエトキシ）フリル］クマリン）
４．３ｇの６，７−ビス−（２’−ヨードエトキシ）−３−［２''−（５''−カルボエトキシ）フリル］クマリン（実施例４から）、２．１２ｇの１，４，１０，１３−テトラオキサ−７，１６−ジアザシクロオクタデカン、及び４．３ｇのＮａ₂ＣＯ₃を４００mlの乾燥アセトニトリル中で３日間還流させた。その後、所望の生成物の量のさらなる増加はＨＰＬＣにより検出できなかった。
溶液を濃縮させ、残留物を不活性中性アルミナ上でクロマトグラフ分離した。ジヨード出発物質をまずＣＨ₂Ｃｌ₂により溶出させた。次に、生成物をＣＨ₂Ｃｌ₂中の５％エタノールにより溶出させた。最終的に、エタノール中の５％酢酸を使用し、カラム上の任意のＦＣＣＣ−酸を除去した。代わりに、熱メタノール中に溶解させ、シクロヘキサンと酢酸エチルの５：１混合物を加えることにより粗製ＦＣＣＣ−エステルを結晶化させ、固体ＦＣＣＣ−エステルを得ることができる。この手順において、カラムクロマトグラフィーは必要ではない。
５％エタノール画分を組み合わせ、回転減圧蒸発器により濃縮した。ＦＣＣＣ−エステルの収量は３．４ｇであった。
H¹ NMR(d₆DMSO): d 1.31 (t, 3H, CH₃); d 3.50〜4.0 (m, 24H,クリプタンドのCH₂); d 4.32 (q, 2H, OCH₂); d 4.50 (t, 2H, CH₂); d 4.60 (t, 2H, CH₂); d 7.16 (d, 1H, Ar-H); d 7.30 (s, 1H, Ar-H); d 7.42 (d, 1H, Ar-H); d 7.75(s, 1H, Ar-H); d 8.50(s, 1H, Ar-H).
【０１１４】
実施例６
ＦＣＣＣ−酸
（６，７−［２．２．２］−クリプタンド−３−［２''−（５''−カルボキシ）フリル］クマリン）
ＦＣＣＣ−エステル（実施例５から）を２ＮのＨＣｌ水溶液中で約１時間還流させることにより加水分解させた。反応の進行をＨＰＬＣにより追跡した。エステル出発物質の１１．８５分間の保持時間に対し、酸生成物は１０．４２分間の保持時間を示した。加水分解時間がより長くなると、第３成分（すなわち、エステル又は酸以外のもの）が生成した。未反応エステルを溶出させるためにエタノール（「ＥｔＯＨ」）を、そして酸生成物を溶出させるためにＥｔＯＨ／５％酢酸を使用し、不活性中性アルミナ上でのカラムクロマトグラフィーにより酸を精製した。ＥｔＯＨ／５％酢酸画分を組み合わせ、回転減圧蒸発器に続いて減圧ポンプを使用して濃縮した。カボチャ色の固形物が得られた。
４．３ｇのＦＣＣＣ−エステルの加水分解を幾つかのバッチで行った。例えば、０．９５ｇのエステルは、クロマトグラフ分離後に０．５ｇの純粋なＦＣＣＣ−酸を与えた。
【０１１５】
代法として、以下の手順に従って、エステルの加水分解を行った。９０mlのＴＨＦ中に５．６ｇのＦＣＣＣ−エステル（実施例５から）を含む混合物を２９mlのメタノールと共に攪拌及び混合した。この混合物に５６mlの水の中に３．７ｇの水酸化リチウム一水和物を含む溶液を加えた。得られた混合物を２３℃で３０分間攪拌し、次に８４mlの６ＮのＨＣｌにより稀釈し、続いてさらに１時間攪拌した。回転減圧蒸発器を使用し、２０分間を要して３８℃で溶剤を除去し、残留物を１２０mlのメタノール（「ＭｅＯＨ」）及び１２０mlのＴＨＦの溶液中に溶解させ、次に溶剤のストリッピングを継続した。ＭｅＯＨ／ＴＨＦストリッピングを数回繰り返すと、残留水の殆どが除去され、黄色固形分が得られた。０．０１mmHgで一晩乾燥させると、９．７ｇのＦＣＣＣ−酸が得られた。
【０１１６】
実施例７
エチル−（５−ブロモメチル）−２−チオフェンカルボキシレート
実施例１Ｂにおけるように５−メチル−２−チオフェンカルボン酸の２５ｇの試料をエステル化し、２９．９ｇのエチル−５−ブロモメチル−２−チオフェンカルボキシレートを得た。
H¹ NMR(CDCl₃): d 1.35 (t, 3H, CH₃); d 2.36 (s, 3H, CH₃); d 4.33 (q, 2H, CH₂); d 6.02 (d, 1H, Ar-H); d 7.00 (d, 1H, Ar-H).
２７．５６ｇのＮ−ブロモスクシンイミドを用いてこの生成物を実施例１Ａにおけるように臭素化すると、３６．２３ｇのエチル−（５−ブロモメチル）−２−チオフェンカルボキシレートを橙色液体として得た。
H¹ NMR(CDCl₃): d 1.35 (t, 3H, CH₃); d 4.30 (t, 2H, CH₂); d 4.40 (s, 1H, CH₂Br); d 7.19 (d, 1H, Ar-H); d 7.70 (d, 1H, Ar-H).
【０１１７】
実施例８
エチル−（５−シアノメチル）−２−チオフェンカルボキシレート
３６．２３ｇのエチル−（５−ブロモメチル）−２−チオフェネカルボキシレート（実施例７から）を実施例２に記載したようにＮａＣＮと反応させ、２６ｇのエチル−（５−シアノメチル）−２−チオフェンカルボキシレートを褐色液体として得た。
H¹ NMR: d 1.23 (t, 3H, CH₃); d 3.93 (s, 1H, CH₂Br); d 4.24 (q, 2H, CH₂); d 6.98 (d, 1H, Ar-H); d 7.60 (d, 1H, Ar-H).
【０１１８】
実施例９
６，７−ビス−（２’−クロロエトキシ）−３−［２''−（５''−カルボエトキシ）−チオフェン］クマリン
エタノール中に４．８ｇのエチル−（５−シアノメチル）−２−チオフェンカルボキシレート（実施例８から）を含む溶液を６．５ｇの４，５−ビス−（２’−クロロエトキシ）−２−ヒドロキシベンスアルデヒドにより実施例３に記載したように処理し、所望のクマリンに対応する黄色固形物４．８ｇを得た。
H¹ NMR (d₆ DMSO): d 1.29 (t, 3H, CH₃); d 3.98 (m, 4H, CH₂Cl); d 4.30 (m, 4H, CH₂); d 4.40 (t, 2H, CH₂); d 7.20 (s, 1H, Ar-H); d 7.39 (s, 1H, Ar-H); d 7.78 (s+d, 2H, Ar-H); d 8.68 (s, 1H, Ar-H).
【０１１９】
実施例１０
６，７−ビス−（２’−ヨードエトキシ）３−［２''−（５''−カルボエトキシ）−チオフェン］クマリン
６，７−ビス−（２’−クロロエトキシ）−３−［２''−（５''−カルボエトキシ）−チオフェン］クマリン（実施例９から）の２．４４ｇの試料を実施例４に記載したようにＮａＩと反応させ、所望のヨードクマリンに対応する黄色固形物２．０ｇを得た。
H¹ NMR (d₆ DMSO): d 1.31 (t, 3H, CH₃); d 3.58 (m, 4H, CH₂); d 4.30 (t, 2H, CH₂); d 7.23 (s, 1H, Ar-H); d 7.40 (s, 1H, Ar-H); d 7.81 (s+d, 2H, Ar-H); d 8.73 (s, 1H, Ar-H).
【０１２０】
実施例１１
ＴＣＣＣ−エステル
（６，７−［２．２．２］−クリプタンド−３−［２''−（５''−カルボエトキシ）チオフェニル］クマリン）
実施例１０のヨードクマリンの全てを実施例５に記載したように１，４，１０，１３−テトラオキサ−７，１６−ジアザシクロオクタデカンと共に加熱した。得られた混合物のＨＰＬＣにより多くの生成物が示され、幅の広いピークに取り囲まれた鋭いピークは所望の生成物と一致した。
不活性アルミナ上でのカラムクロマトグラフィーによる粗生成物の精製（ＣＨ₂Ｃｌ₂中に７％のエタノールを含むものを使用して溶出）によって、前記鋭いピークにほぼ対応する１つの画分を得た。この画分を濃縮し、０．１７ｇの所望のＴＣＣＣ−エステルを得た。
H¹ NMR (d₆ DMSO): d 1.31 (t, 3H, CH₃); d 3.5〜4.0 (m, 24H, クリプタンドのCH₂); d 4.35 (q, 2H, OCOCH₂); d 4.39 (t, 2H, CH₂); d 4.50 (t, 2H, CH₂); d 7.39 (d, 1H, Ar-H); d 7.60 (s83 (d, 1H, Ar-H); d 8.81 (s, 1H, Ar-H).
【０１２１】
実施例１２
アズラクトン官能ＨＰＰＥ上に固定化されたＦＣＣＣ
Ａ．アミン官能ＨＰＰＥ膜
寸法が７．６cm×７．６cmの親水性アズラクトン官能多孔質ポリエチレン（ＨＰＰＥ）膜（引用によりここに含めることにする米国特許第５，３３４，７０１号明細書の開示に従って作製）を、６．５ｇの Jeffamine^TM ED900（ニューヨーク州ロンコンコマ（Ronkonkoma）所在のFluka Chemical Corp 製のビス（２−アミノプロピル）ポリエチレングリコール８００）と１５滴の１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エンとを含む４０mlのＣＨＣｌ₂中に入れ、約１８時間攪拌した。膜を取り出し、ＣＨＣｌ₂により４回洗浄し、次に風乾させた。
【０１２２】
Ｂ．膜への染料のカップリング
広口ジャー内の約３０mlのジメチルホルムアミド中に約２００mgのＦＣＣＣ−酸（実施例６から）を溶解させた。これに２mlの１，３−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）及び約２００mgのヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ）を加えた。混合物を回転混合機で約１０分間攪拌した。その後、１mlのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）及び寸法が各々７．６cm×７．６cmである全段落に記載のアミン官能膜４枚を加えた。
上記混合物を回転混合機で一晩攪拌し、その後、膜を取り出し、風乾させる前にジメチルホルムアミドで４回及びＣＨ₂Ｃｌ₂で４回洗浄した。
【０１２３】
代法として、１０mlのＤＩＣ、４８０mgのＨＯＢｔ及び１mlのＤＩＥＡを含む５０mlの塩化メチレンに部分加水分解したアズラクトン官能ＨＰＰＥ膜を加えた。フラスコを回転混合機で約６時間穏やかに攪拌し、その後、膜を取り出し、塩化メチレンによりしっかり洗浄した。アズラクトン官能基の再現は、赤外スペクトルでの１８２３cm^-1のピークの存在により確認された。
場合に応じて、残留アミンを除去するための追加のアセチル化工程を、１０mlの無水酢酸及び１mlのＤＩＥＡを含む１０mlのＣＨ₂Ｃｌ₂溶液中に膜を入れることにより行ってもよい。しかしながら、生成物のアセチル化の後においてセンサーの性能の向上を認めることはできなかった。
【０１２４】
実施例１３
ＨＰＰＰ上にコーティングされた固定化ＦＣＣＣ
米国特許第５，４７４，７４３号明細書に記載の実施例１７〜１９の方法を使用し、ＦＣＣＣ染料にカップリングしたポリマーによりコーティングされたＨＰＰＰ膜を作製した。
カルボキシル化ＰＶＣ（「ＰＶＣ−ＣＯＯＨ」、Aldrich ）をJeffamine ED-900^TMによりエステル化し、得られたアミン官能ポリマーをＦＣＣＣ−酸（実施例６から）と反応させた。染料がカップリングしたＰＶＣ−ＣＯＯＨをＨＰＰＰ上に溶液塗布した。乾燥された被覆ＨＰＰＰウェブを使用して本発明のカリウムセンサーを作製した。
【０１２５】
実施例１４
アミン官能 Cuprophan^TM膜上に固定化されたＦＣＣＣ
合計８枚の各々３０．５cm×３０．５cm×０．０１mmのグリセロールがしみ込んだ Cuprophan^TMセルロースのシート（イリノイ州シカゴ（Chicago ）所在のAkzo Nobel Chemicals製）を５００mlの脱イオン水中で２回洗浄（１０分間）し、グリセロールを除去した。各シートを２３．５cm×２６cmのガラスプレート上に延ばし、室温（約２１℃）で乾燥させた。
【０１２６】
Ａ．オーバーコート
４．５ｇのデキストラン（MW 2,000,000）及び２２５mlの脱イオン水を広口５００mlボトルに加えることによりオーバーコート溶液を調製した。混合物をオーブン内で５０℃に加熱し、デキストランを溶解させた。次に、２．２５ｇの Marasperse DBOS-4^TM分散剤（ワイオミング州ロスチャイルド（Rothschild）所在Diashowa Chemicals, Inc.製）を加え、混合物を振盪した。その後、４．５ｇの Monarch-700^TMカーボンブラック（マサチューセッツ州ウォールサム（Waltham ）所在のCabot Corp. 製）を攪拌しながら加えた。氷水浴中で、各サイクルの間に振盪しながら、Model W-385 音波処理機（ニューヨーク州ファーミングデール（Farmingdale ）所在のMisonix Inc.製）により５回（３分間のサイクル時間で）音波処理した。カーボンブラックの均一な水性分散液を得た。この分散液に４．５ｇの５０％ＮａＯＨ溶液（水溶液）を加え、そして分散液をさらに１分間振盪した。その後、脱イオン水中に６．７５ｇの５０％エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＧＥ）を含む溶液を加え、続いて１分間振盪した。振盪せずに室温で１０分間エージングした後、得られたオーバーコート溶液を Cuprophan^TM膜の各シート上に均一に吹き付けた。Model 8452A UV分光光度計（カリフォルニア州パロアルト（Palo Alto ）所在のHewlett-Packard Instruments Corp. 製）を使用し、４６４nmでのシートの不透明度を監視した（ほぼ３の吸収単位）。シートをガラス板上で１時間乾燥させた。
【０１２７】
Ｂ．架橋
１リットルビーカー内で、３５４mlの脱イオン水中に３．１ｇの５０％ＮａＯＨ溶液を含む溶液を調製した。これに混合しながら８６ｇのＤＭＳＯを加えた。その後、４４３ｇの５０％ＥＧＤＧＥ水溶液を加え、混合した。
架橋溶液をシート上に流延し、シート上に保つことができるように、８枚の板の全ての上に枠を載せ、クランプで締めた。溶液（約１００ml）を各板の上に流延し、５０〜６０分間を要して架橋させた。新しい溶液が Cuprophan^TMシートと接触するようにこの時間の間に静かに板を回転させた。その後、枠に沿って Cuprophan^TM膜を切断し、２０００mlの脱イオン水で３回濯いだ。
【０１２８】
Ｃ．ＨＤＡ（１，６−ヘキサンジアミン）反応
４リットルビーカー内の２．０リットルの脱イオン水中に１２０ｇの７０％ＨＤＡを含む溶液に、室温で、架橋した Cuprophan^TM膜を１０５分間浸漬した。ガラス棒を用いてシートに渦を巻かせることによりトラップされた気泡を注意深く除去した。ビーカーからシートを取り出し、２０００mlの脱イオン水により５回濯ぎ、過剰のＨＤＡを洗い落とし、次に脱イオン水に浸漬した。（この段階で、次の工程にシートを即座に使用することができる。代わりに、シートを脱イオン水／酸浴（２リットルの脱イオン水中に１mlの１２ＮのＨＣｌを含む）中で一晩貯蔵してもよい。）
【０１２９】
Ｄ．ＦＣＣＣカップリング反応
３０mlのＤＭＦを含む直径１５．２cmのペトリ皿内で３０mgのＦＣＣＣ（実施例６から得たもの）を１０〜１５分間攪拌することにより溶解させることによって、染料溶液を調製した。その後、０．８mlのＤＩＣ及び１９０mgのＨＯＢｔを加え、１５分間攪拌し、その後に、０．４mlのＤＩＥＡを加え、攪拌を約５分間継続した。ＨＤＡ官能化 Cuprophan^TMシートを脱イオン水から取り出し、１０．２cm×１０．２cm試験片に切断し、紙タオル上に載せて過剰の水を吸い取った。そのような２枚の試験片を一度に染浴中に（平坦に保ったまま）２４時間浸漬し、その後、試験片を取り出し、２５０mlのＤＭＦによる洗浄を２回行い、５００mlの希ＨＣｌ水溶液（pH 2〜3.5 ）で２回洗浄した。各洗浄に約３分間を要した。
【０１３０】
代法として、ＨＤＡ官能膜を２．５％Ｎａ₂ＣＯ₃中で３０分間洗浄し、続いて水中で３回及びアセトン中で１回洗浄した。３５mlのアセトンに１００mgのＦＣＣＣ（実施例６から得たもの）を溶解させ、続いて１mlのＤＩＣ、５０mgのＨＯＢｔ及び１mlのＤＩＥＡを添加した。この溶液を回転混合機で１５分間混合し、その後、洗浄した膜を加えた。３日後、膜を取り出し、アセトンで１回及び水で３回洗浄した。次に、洗浄した膜を、１０mlの無水酢酸及び１mlのＤＩＥＡを含む２０mlのアセトン溶液に加え、２０分間回転混合した。溶液から膜を取り出し、アセトンで１回及び水で３回洗浄した。
【０１３１】
この塊状材料について、１６ビットＡ／Ｄコンバーター及びLab VIEW^TMソフトウェア（テキサス州オースチン（Austin）所在のNational Instruments製）により変更された S400 モニター（CDI/3M Health Care）により、pH 7.34 のＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（ミズーリー州セントルイス（St. Louis ）所在のSigma Chemical Corp.製）中８mMのＫ⁺で強度を測定することができる。標準ゲイン構成に基づき、計数１．３×１０⁵〜１．５×１０⁵の優れた強度を得た。
【０１３２】
実施例１５
センサー−カセット集成体
Flexobond^TM 430（カリフォルニア州アービン（Irvine）所在のBacon Industries, Inc.製）のような２液型ポリウレタン接着剤を使用し、薄い（０．１７５mm）ポリカーボネートシート（ドイツ国レーヴァークーゼン（Leverkusen）所在のBayer AG製）に、染料がカップリングした Cuprophan^TMシート（実施例１４から得たもの）を貼り合わせた。ポリカーボネート側に、CW14^TM感圧接着シート（ウィスコンシン州ラシーン（Racine）所在のRSW Inc., Specialty Tape Div. 製）を取り付け、剥離ライナーを剥がした。穿穴機を使用して積層体からディスクを打ち抜き、このディスクをS400カセット（カリフォルニア州タスティン（Tustin）所在のCDI/3M Health Care製）のpHチャンネル及びＡＯ₂チャンネル上に配置した。前記変更されたS400モニターに対し、カリウム検出チャンネルとして適切なオプチックスと共にこれらの２つのチャンネルを使用した。
【０１３３】
実施例１６ａ
ＬＥＤテストベッド
図１０は、本発明のレッドシフトしたＫ⁺センサーを試験するために使用したＬＥＤに基づく位相変調ブレッドボードの概略図１００を示すものである。このブレッドボードは、血液ガスを検出するための振幅及び位相変調法の両方を評価するように設計されたものである。
【０１３４】
カリウムセンサー試験に関し、日本国徳島県所在のニチア化学工業製又はトヨダ合成株式会社製（商品名Ledtronics^TMで製造されているもの）のGaN LED １１０を、３０ｋＨｚの搬送周波数、０．２秒間のバースト持続時間、５秒間の繰返し時間及び２．５ｍＷの平均出力で振幅変調させた。光を集束させ、バンドパス励起フィルター１１２（３９０nm±２５nm；％Ｔ＝５２％；帯域外ブロッキング（out-of-band blocking）＝０．００１％Ｔ；マサチューセッツ州ウォバーン（Woburn）所在のSpectroFilm から入手可能）に通し、ファイバーオプチックケーブル１１４に再集束させた。このケーブルの末端にはCDI S400オプチカルヘッド１１６があった。ランダム化ファイバー束１１８により戻された変調蛍光は、SpectrumFilmから入手可能なもののような帯域発光フィルター１２０（４７５±３５nm；％Ｔ＝６４％；帯域外ブロッキング＝０．００１％Ｔ）に戻る。次に、ろ波された光学信号をOPTO-8^TM光電子増倍管検出器１２２又はS1337-33-BR ^TMフォトダイオード検出器（双方ともニュージャージー州ブリッジウォーター（Bridgewater)所在のHamamatsu Corp. から入手可能）の活性領域上に集束させた。励起ファイバー１２４のほんの一部を検出器集成体に直接送り、ニュートラル密度フィルター１２６により減衰させ、ＬＥＤからの基準光学信号を提供した。
【０１３５】
計算機により制御される光シャッター１２８を使用すると、光検出器は励起信号と蛍光戻り信号とを交互にサンプリングする。これによって、ＬＥＤ出力振幅の揺らぎを補正する光学的標準が提供される。さらに、検出器の光電流と発振器１３２からの３０ｋＨｚの電気的基準信号とを交互にサンプリングするために電子スイッチ１３０を使用した。検出器の出力は、フォトダイオード検出器からの光電流を電圧に変換する３段階電子回路に送った。減衰及びスイッチ段階１３０を使用し、ＬＥＤ駆動発振器１３２からの基準電気信号を減衰させ、この減衰された基準信号と未減衰光信号とを切り換えた。トランスインピーダンスプレアンプ段階１３４で、OPA627演算増幅回路を使用して光電流又は基準電気信号を電圧に変換した。次段階１３６は２基のOPA627演算増幅器を使用する２段階Delyiannisスタイル帯域フィルターであった。この段階は、ノイズのパワーを帯域限定する一方で、信号をさらに増幅する。３段階回路のゲインは７．３×１０⁸Ｖ／Ａ（１７７dB）であって、約３０kHz を中心周波数として４００Hzに帯域限定されたものであった。
【０１３６】
増幅された光信号又は基準電気信号は、位相、振幅及び信号対ノイズ比（ＳＮＲ）の最小二乗推定法を使用する LabVIEW^TMバーチャル・インスツルメント・ソフトウェア（virtual instrument software ）を使用し、１００kHz 毎にディジタル方式でサンプリング及び加工した。これらのサンプリング条件下で、ノイズのパワーを１Hz未満に帯域限定し、ＳＮＲをさらに増加させた。
動作時に、 LabVIEW^TMソフトウェアは、光学センサーの信号、光学的基準信号及び電気的基準信号を交互にサンプリングした。ＬＥＤ揺らぎのために集められた光学的基準信号及び電子ドリフトのために集められた電気的基準信号は、温度、湿度及び無線周波数（ＲＦ）整流との相関がある。
【０１３７】
実施例１６ｂ
ＦＣＣＣ及びＦＣＣＣに基づくセンサーに関するスペクトル調査
図１ａ及び１ｂは、溶液中でのＦＣＣＣ（実施例６）と６，７−［２．２．２］−クリプタンドクマリン−３−カルボン酸（「ＣＣＣ」、米国特許第５，４７４，７４３号明細書の実施例１１）のカリウム応答を比較するものである。等モル濃度の溶液（０．０８ＡＵＦＳ）をpH 7.3の１００mMＨＥＰＥＳ緩衝液中で調製した。発光スペクトルを、図１ａ及び１ｂにぞれぞれ示されているように３９２nm及び３５４nmで、０．０、１．０、２．０、３．９、７．７及び１５mMのカリウム濃度でそれぞれ測定し、図１ａ及び１ｂの双方においてそれぞれＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦと標識付けした。図１ｃは、３９２nmの励起波長を使用した場合の、０mM（Ａ）及び１５mM（Ｂ）のカリウムイオン濃度でのＦＣＣＣの応答を、０mM（Ｃ）及び１５mM（Ｄ）のカリウムイオン濃度でのＣＣＣの応答に対して比較するものである。図１ａ〜１ｃは、既に調製されているイオノホア（ＣＣＣ）に対し、本発明のイオノホアの広いカリウムイオン濃度域に対する応答が著しく改良されたこと及び好ましい波長（３９２nm）での励起に対する応答が非常に増強されたことを示すものである。
【０１３８】
ＦＣＣＣ及びＣＣＣが、それらの各吸収極大波長（３９２対３５４nm）で励起される場合には、ＦＣＣＣはレッドシフトした吸収極大波長（４６０nm対４４０nm）に一致する僅かに減少したカリウム応答（８mMのＫ⁺に対する呼びかけではＣＣＣの２９％対４８％）を示した。百分率で表される「カリウム応答」は、カリウムイオンの不在下での発光強度に対する所定のカリウムイオン濃度での発光強度の増加百分率を意味する。図１ｃが、ＧａＮ青色ＬＥＤ又はフラッシュラップのろ波された出力に似せるために両方の試料が３９２nmで励起した場合に、ＦＣＣＣ蛍光戻りはＣＣＣの蛍光戻りの１４倍であったこと（すなわち、曲線「Ｂ」対曲線「Ｄ」）を示すものであることは重要である。ＦＣＣＣのレッドシフト及び増加した効率は、ランプ型カリウム検出系の性能を実質的に改良した。ＦＣＣＣは、パルスＧａＮ青色ＬＥＤ及びフォトダイオード検出器によるカリウム検出を促進するほど十分な追加の信号を提供するが、ＣＣＣはそうではなかった。ＦＣＣＣ及びＣＣＣの蛍光寿命が位相変調に基づくＫ⁺検出を可能にするカリウム濃度の関数であることが示されたことは重要である。
【０１３９】
図２は、ＨＤＡ官能Cuprophan （実施例１４ｄ）上のＦＣＣＣ指示体のカリウム応答を表すものである。図２において、曲線Ａは初期の０mM K⁺濃度を表し、曲線Ｂは８mMカリウムイオン濃度で３９０nmの励起光を２分間露光した後の放射強度を表し、そして曲線Ｃは曲線Ｂに関して露光した直後の０mMカリウムイオン濃度に対する応答を表している。ＦＣＣＣ−ＨＤＡ−Cuprophan センサーは、カリウムイオンに対して強く（３１％）、速く（＜２分）、可逆的な応答を示した。溶液中で観測されるカリウム応答は、固定化により完全に一定のまま保たれる。ポリマー支持体の選択は非常に重要である。ＦＣＣＣ−ＥＤ９００−ＰＶＣセンサー（実施例１３）は、非常に弱いカリウム応答（６％）を示す。ＦＣＣＣ−アズラクトン−ＨＰＰＥ系センサー（実施例１２）は速く（＜１分）、可逆的な応答を示すが、溶液（２９％）に対して低下したカリウム応答（１５％）を示す。
【０１４０】
ＦＣＣＣ系センサーの光分解は、ＦＣＣＣ−アズラクトン／ＨＰＰＥセンサー（実施例１２）に関して図３に示されているように、遅く且つ単原子的であった。照射する前に、０mM（曲線Ａ）及び１６mM（曲線Ｂ）のカリウムイオン濃度で３９０nmの励起光での応答が示された。センサー膜をＨＥＰＥＳ緩衝液中に浸漬し、次いで、１mmの励起スリット幅を使用し、SPEX Fluorolog^TMシリーズ分光蛍光計（ニュージャージー州エジソン（Edison）所在のSPEX industries, Inc. 製）内で３９０nmで１時間連続照射した。照射後においても、０mM（曲線Ｃ）及び１６mM（曲線Ｄ）のカリウムイオン濃度で３９０nmの励起光での応答が示された。繰返し測定することにより分解速度が予測可能なものであることが観測された。
【０１４１】
ＦＣＣＣセンサーは、pH 7.4のＨＥＰＥＳ緩衝液中で１２０℃で２時間オートクレーブ殺菌された後でもそれらのカリウム応答及びスペクトル特性を失わない。
【０１４２】
図４ａ及び４ｂは、両方とも上記実施例１２に記載した方法に従って作製したＣＣＣ−アズラクトン／ＨＰＰＥセンサー（図４ａ）及びＦＣＣＣ−アズラクトン／ＨＰＰＥセンサー（図４ｂ）のpH依存性のある応答を比較するものである。Type924 トランスファーテープ接着剤（3M Company）を使用してこれらのセンサーをS400フロースルーカセット（CDI/3M Health Care）に取り付け、一晩水和させた。ＨＥＰＥＳ緩衝液（１００mM、０mMカリウム）の溶液を、ＨＣｌ（１Ｍ）を使用してpH 3.76 まで滴定し、蠕動ポンプを使用してセンサーに循環させた。次に、ＮａＯＨ（１Ｍ）を使用して溶液を各連続pHに対して滴定し、３７０nm（ＣＣＣセンサー）又は３９０nm（ＦＣＣＣセンサー）で照射した。図４ａ及び４ｂにおいて、pHを表す曲線を次のように区別した：Ａ＝pH 6.98 ；Ｂ＝pH 7.18 ；Ｃ＝pH 7.4；Ｄ＝pH 7.62 ；及びＥ＝pH 7.83 。各pHで平衡化（３分間）後、発光スペクトルを記録した。両センサーともpKa ＝5.8 を示した。しかしながら、発光強度のpH依存性、すなわち最低から最高までの強度変化は、おおよそ７．０〜７．８の生理的pH範囲にわたってＣＣＣセンサー（３３％）に対してＦＣＣＣセンサーはかなり小さい（６％）。
【０１４３】
図５は、S400フロースルーカセットに組み込まれたＦＣＣＣ−アズラクトン／ＨＰＰＥ膜から得たデータであって、図１０に概略的に示した位相変調ＬＥＤブレッドボードにより測定されたデータである。カセットを一晩水和させ、その後、センサーをＨＥＰＥＳ緩衝液（100mM 、pH 7.4）中で０mM K⁺と１６mM K⁺の間で周期的に循環させた。センサーを、光学的濾過された（３９０nm）ＬＥＤ（ニチア化学工業）からの３０kHz の振幅変調光の０．２秒間のバーストに露光した。応答曲線のうちの「Ａ」の部分は０mMカリウムイオン濃度に対応し、一方、「Ｂ」の部分のカリウムイオン濃度は１６mMであった。約４００mVの振幅の違い及び出力電圧の急激な（約０．０２５秒間の）変化によって、波長がより短い光源を利用するように変更された市販入手可能なセンサーに使用される本発明のイオノホアを用いると有効なカリウムイオン検出が可能であることが示された。
【０１４４】
光度測定によって、検出器で集められた蛍光戻りが２０nWよりも多いことが示された。２０nWは、パルス集積法と組み合わされた場合に高い信号対ノイズ比を維持するのに十分な光学的戻りであった。帯域幅が１０kHz （フィードバック１０Mohm及びキャパシタ１．４pF）及びゲインが５μW であるOPA-627 オペアンプを使用すると、２０nWの蛍光戻りは、パルス当たり１００μV のノイズフロア（noise floor ）で１００mVの電気的信号を提供した。これによって、パルス当たり０．１％のノイズフロアが与えられた。多重パルスを平均化することによりさらなる改良が得られた。コンパクトなガラスファイバーGaN LED オプチックスモジュールの設計にこの方法を使用した。固体光源及び検出器をコンパクトモジュールに取り付けた。オンボードＡ／Ｄコンバーターは、任意のホストモニターに向けることができるデジタル化された出力信号を提供した。前記モジュールは、例えば図１１におけるようにフロースルーカセットセンサーと直接接続させた。
【０１４５】
実施例１６ｃ
レッドシフト性置換基に関する調査
式Ａにより表される化合物がレッドシフト式Ｋ⁺検出を支えるであろうという結論を支持するために８０種以上のクマロクリプタンド誘導体を調製した。
我々は、Ｋ⁺依存性のある電荷移動機構が作用した場合に予測されるであろうＫ⁺依存性のあるスペクトルシフトに関する証拠を得られなかった。その代わりに、我々は、カリウム依存性のある振電カップリング機構に関する証拠を得た。
【０１４６】
種々のＥＤＯ型、ＭＤＯ型及びＤＭＯ型クマリン誘導体に関する実験データを表１６ｄに示す。Photochemical Research Associates （ＰＲＡ）System 3000 蛍光寿命測定装置を使用し、脱酸素化されたメチルアルコール中で、ジメトキシ（ＤＭＯ）、メチレンジオキシ（ＭＤＯ）及びエチレンジオキシ（ＥＤＯ）クマリンモデル化合物に関する蛍光寿命データを得た。標準散乱溶液を対照とする時間相関信号フォトン計数技術を使用して蛍光減衰を測定し、グローバル最小法（global minimization)により分析した。
【０１４７】
【表１】

【０１４８】
前記表中、Φは量子収率；τは緩和時間；ｋ_fは蛍光減衰の速度定数；及びｋ_nrは無放射減衰の速度定数である。前記速度定数は、式（４）及び（５）：
【０１４９】
【数１】

【０１５０】
を解くことにより導かれる。
６，７−エチレンジオキシ（ＥＤＯ）クマリンモデル化合物の蛍光量子収率は、対応する６，７−メチレンジオキシ（ＭＤＯ）誘導体又は６，７−ジメトキシ（ＤＭＯ）誘導体の蛍光量子収率よりも常に小さかった。ＥＤＯ型化合物が、面外パッカリング振動を維持することができ、一方、この振動はＭＤＯ型及びＤＭＯ型化合物では抑制されることは重要である。表１６ｄに示した蛍光寿命の調査は、化合物１、２及び３におけるそのような面外パッカリングが無放射速度定数ｋ_nrを増大させ、放射又は蛍光速度定数ｋ_fを実質的に変化させないことを表す。このパッカリングは、近接しているｎπ^*状態とππ^*状態の混成に寄与し得る。発光極大波長が５３５nmである比較用化合物４Ｃは、おそらくはππ^*状態と基底状態の直接混成のために全ての類似体で大きなｋ_nrを示す。
【０１５１】
表１６ｅに示すデータは、ＤＭＯ型及びＭＤＯ型モデル化合物の両方が、本発明のクマロクリプタンドのカリウムイオンに対する応答（例えば、面外パッカリングの抑制）を予測するのに有用であり得るという観測結果を追認するものである。特に、図６ａ及び６ｂに示されるように、幾つかのクマロクリプタンド誘導体のカリウム応答と対応するモデル化合物のＭＤＯ／ＥＤＯ量子収率比との間に強い相関が存在する。「Ｋ⁺応答」は、カリウムオンの不在下での発光強度に対する所定のカリウムイオン濃度（８mM）での発光強度の増加百分率を意味する。図６ａ及び６ｂにおいて、「１」、「３」、「５」及び「１２」と標識付けしたデータ点は、表１６ｃに記載のＭＤＯ型化合物（図６ａ）及びＤＭＯ型化合物（図６ｂ）の１、３、５及び１０の測定された量子収率の対応するＥＤＯ型化合物の測定された量子収率に対する比にそれぞれ対応するものであって、同様に置換されたクマロクリプタンドのカリウムイオンの不在下で８mMカリウムイオン濃度での応答に対してプロットしたものである。
【０１５２】
これは、ＭＤＯ型及びＤＭＯ型化合物が面外パッカリング振動を抑制するのと同様に、クリプタンド酸素へのＫ⁺の結合が無放射減衰の原因である面外パッカリング振動を抑制することを示唆するものである。放射緩和の速度（ｋ_f）及び無放射緩和の速度（ｋ_nr）は、作動するカリウムセンサーが得られるように拮抗するものでなくてはならない。発色団が剛性であり過ぎると、ｋ_nrは非常に小さくなり、量子収率Φは大きいままとなる。ｋ_nrが大き過ぎると、Ｋ⁺依存性のある変調がかき消され、蛍光量子収率は小さいままとなる。実験的研究及び理論的研究によって、本発明のレッドシフトしたクマロクリプタンド誘導体はカリウム検出のための優れた候補であることが示された。表１６ｄに掲載されているデータは、振幅及び寿命測定の両方が、例えばカリウムイオンの定量的測定に使用できるものであることを示している。
【０１５３】
【表２】

【０１５４】
理論に束縛されるわけではないが、クマリン類の無放射緩和に関して提案する機構を使用することができる。提案する機構において、クマリンは、最初にＳ₀基底状態からＳ₁（ππ^*）励起状態に光励起される。π電子密度の変化によって、全ての核の位置がその基底状態配置から少しエネルギー的に励起した状態にある核配置に変化する。クマリン類のような平面状の芳香族化合物に対し、Ｓ₁（ππ^*）励起状態は、芳香環系の平面に主として閉じ込められる分子歪みを通じて緩和する。
【０１５５】
Ｓ₁（ππ^*）励起状態が緩和すると、Ｓ₁（ππ^*）励起状態は直交するＳ₂（ｎπ^*）励起状態とほぼ等エネルギー的になる。面外振動はこれらの２つの状態を混成させ、それらのポテンシャルエネルギー面を変化させ、そして適切な条件下では、Ｓ₁（ππ^*）状態から基底Ｓ₀状態への無放射遷移を促進する。
【０１５６】
そのような励起状態過程に関する軌道エネルギーは図７に示されている。図７の中で図７Ａは、弱いカップリングを表し、図７Ｂは強いカップリングを表し、そして図７Ｃは非常に強いカップリングを表している。ここで「カップリング」とは、Ｓ₁（ππ^*）（曲線２）状態とＳ₂（ｎπ^*）（曲線１）状態の全体的に非対称な振電的カップリングを意味する。非混成状態は点線で示されており、振電カップリングした状態は実線で示されている。無放射遷移に対する障壁幅は、矢印Ａ、Ｂ及びＣでそれぞれ示されている。Ｓ₂（ｎπ^*）軌道のほうがかなりエネルギーが高い場合には、明らかに振電カップリングは好ましくない（スキームＡ）。この場合には、蛍光量子収率は大きいままであり、カリウム応答は観測されない。Ｓ₂（ｎπ^*）及びＳ₁（ππ^*）が非常に強くカップリングする場合（スキームＣ）には、無放射減衰が支配的である。この場合には蛍光量子収率は非常に小さく、Ｋ⁺結合に依存しない。これらの２種の極端な振電カップリングの間で、適度な無放射減衰速度がＫ⁺感度（スキームＢ）のあるものとなる。
【０１５７】
結局、初期Ｓ₁（ππ^*）と無放射遷移の最終Ｓ₀状態との間のエネルギーギャップが減少するにつれて面外パッカリングモードのエネルギー受容能が減少する。また、面内モードは、近くにＳ₂（ｎπ^*）状態を必要とすることなく、Ｓ₁（ππ^*）状態とＳ₀状態とをより有効に直接カップリングさせる。従って、Ｓ₁（ππ^*）−Ｓ₀間のエネルギーギャップが減少するほど、すなわち蛍光波長が増加するほど、Ｋ⁺応答がはっきり現れなくなる。
【０１５８】
このことは、図８に本発明のクマロクリプタンドに対して実験的に示されている。表８で、データ点の数字は表１６ｃ中に示したクマリン置換パターンに対応する。データ点「１」は、ＤＭＯ型クマリン化合物及びＥＤＯ型クマリン化合物に関して実験的に得られた相対量子収率Φに対応する。この相対量子収率は、本発明の対応する置換クマロクリプタンドの実験的に得られた蛍光発光極大波長に対してプロットしたものである。蛍光発光極大波長が増加するにつれて、（Φ_DMO／Φ_EDO比から分かるように）カリウム応答は減少する。蛍光波長が４７０nmを超えると、カリウム応答は市販用型センサーにおいて有効でなくなるほど非常に小さくなる。
【０１５９】
適切なセンサーを選別するために分子モデリングを用いた。当該イオノホアが、（１）芳香族カルボニル、ニトロ芳香族及びＮ−置換複素環式系において見出されるような近接しているＳ₂（ｎπ^*）及びＳ₁（ππ^*）励起状態；（２）クリプタンドのヘテロ原子と複素環のヘテロ原子とを連結させることを伴うフレキシブルな面外振動モード；並びに（３）４８０nm未満での蛍光極大、を示す。
【０１６０】
吸収波長を予測するために基底状態分子軌道計算を、そして蛍光波長を予測するために励起状態分子軌道計算を使用し、可能性のある候補を選別することができる。レッドシフトしたクマリン誘導体の大部分が上記基準を満足せず、優れたカリウム指示体とならないことは重要である。
【０１６１】
種々の置換パターンを有するＥＤＯ型クマリン誘導体に関して計算された発光波長及び吸収波長、ストークスシフト及びＫ⁺応答（上記定義の通り）を表１６ｃに示す。表中、ｙ₁及びｙ₂は、下記式（１）及び（２）に従って計算された値からそれぞれ導かれた予測された吸収波長及びストークスシフトに対応する。図６ｂ及び８から、観測された「Ｋ⁺応答」をクマリン化合物の観測された発光波長λ_emと相関させるために単純な実験式：
【０１６２】
【数２】

【０１６３】
を導入することができる。この式（３）を使用して表１６ｃに示す通りのクマリン誘導体のＫ⁺応答を計算した。
【０１６４】
【表３】

【０１６５】
【表４】

【０１６６】
【表５】

【０１６７】
【表６】

【０１６８】
【表７】

【０１６９】
【表８】

【０１７０】
【表９】

【０１７１】
【表１０】

【０１７２】
【表１１】

【０１７３】
初期分子構造は、市販の分子構築ソフトウウェアＥＤＩＴＯＲ（オレゴン州ビーバートン（Beaverton ）所在のCAChe Scientific製）を使用することにより構築した。Ｓ₀基底状態のコンホメーションは、２種のソフトウェアパッケージ：ＭＭ２（CAChe Scientific製）及びＭＯＰＡＣ６．０（ＰＭ３パラメーターを使用）を使用することにより決定した。Ｓ₁（ππ^*）励起状態のコンホメーションは、制限つきハートリー−フォック（restrict Hartree-Fock ）（ＲＨＦ）開殻配置間相互作用計算（ＣＩ）によるＭＯＰＡＣ６．０（ＰＭ３パラメーターを使用）を使用することにより決定した。幾何配置最適化の部分として、２種のＣＩ計算：（ａ）ＨＯＭＯ及びＬＵＭＯのみを用いる小規模ＣＩ計算（ＣＩ＝２）（ＭＯＰＡＣパラメータＭＩＣＲＯＳは４（又は３））と、（ｂ）０．０５よりも大きなＳ₁（ππ^*）状態でのＣＩ拡張係数を有する全てのマイクロステート（Microstate）を用いる大規模ＣＩ計算（１０＞ＣＩ＞２）（全てのマイクロステートが含まれるようにＭＯＰＡＣパラメーターＭＩＣＲＯＳは５〜２５）を行った。
【０１７４】
種々の分子に関する吸収極大波長及び蛍光波長は、入力幾何配置として基底状態及び励起状態の分子コンホメーションをそれぞれ用いるＺＩＮＤＯ、ＭＯＰＡＣ６．０（ＰＭ３パラメーターを使用）又はＬＡＮＬＰＡＣを使用することにより決定した。ＺＩＮＤＯからの全ての結果は、２６の配置間相互作用（ＣＩ）ウィンドウ（占有軌道数１３及び非占有軌道数１３）を使用することにより得た。ＭＯＰＡＣ計算において、種々の励起状態のエネルギーは、５１個の制止用波動関数（determental wavefunctions ）を用いるＣＩ計算を使用して決定した。これらの波動関数は、１つの基底状態配置と５０個の（５つの最高占有分子軌道から５つの最低非占有分軌道への）単一励起を含んでいた。これらの計算から各分子に関するストークスシフトを決定することができる。
【０１７５】
調査した分子種に関する実験的に測定された波長に、計算された吸収波長及び蛍光波長を較正することが必要であった。典型的には、計算された波長と実験的に測定された波長との間に線形相関が存在した。これらの既定された相関及びモデリングの結果から、幾つかの新規誘導体に関する吸収波長、ストークスシフト、蛍光波長及びＫ⁺応答を予測することができる。
【０１７６】
モデリング手段の３つの組み合わせを使用して吸収極大波長：λ_abs（ＰＭ３，ＺＩＮＤＯ）、λ_abs（ＰＭ３，ＬＡＮＬＰＡＣ）及びλ_abs（ＭＭ２，ＺＩＮＤＯ）を計算した。これらの３通りの方法から得られた結果のうち、λ_abs（ＭＭ２，ＺＩＮＤＯ）は、表９ａに示されるように実験データと最も高い線形相関を与えた。
【０１７７】
ＥＤＯ型化合物に対してこの方法により計算された吸収波長を、同じ置換パターンを有する本発明のクマロクリプタンドに対して８mMカリウムイオンの存在下で実験的に得られた吸収波長に対してプロットした。図９ａ中のデータ点は、表１６ｃに示した化学構造及び置換パターンに対応する。理論吸収波長ｘ₁を算出したならば、式（１）：
【０１７８】
【数３】

【０１７９】
に従って、表１６ｃに記載した予測される吸収波長に理論吸収波長ｘ₁を変換する。
【０１８０】
モデリング手段の３つの組み合わせを使用して発光極大波長：λ_em（ＰＭ３，ＣＩ＝２，ＺＩＮＤＯ）、λ_em（ＰＭ３，ＣＩ＝２，ＬＡＮＬＰＡＣ）及びλ_em（ＭＭ２，ＣＩ＞２，ＬＡＮＬＰＡＣ）を計算した。これらの３通りの方法から得られた結果のうち、λ_em（ＰＭ２，ＣＩ＞２，ＬＡＮＬＰＡＣ）は、実験データと最も高い線形相関を与えた。
【０１８１】
ＥＤＯ型モデル化合物の理論的ストークスシフト｛Δλ＝λ_em（ＰＭ３，ＣＩ＞２，ＬＡＮＬＰＡＣ）−λ_abs（ＰＭ３，ＬＡＮＬＰＡＣ）｝と本発明の同様に置換されたクマロクリプタンドイオノホアの実験的的ストークスシフトとの間に線形相関が存在した。ストークスシフトの計算された値ｘ₂を式（２）：
【０１８２】
【数４】

【０１８３】
に従って予測される値ｙ₂に変換し、この予測される値を表１６ｃに記載した。
図９ａ及び９ｂに関し、ＦＣＣＣ−エステル（データ点１１）が、カリウム応答が実質的に残るようにレッドシフトした吸収と小さなストークスシフトの独特の組み合わせを提供することは明らかである。
【０１８４】
図９ａ及び９ｂ並びに式（１）、（２）及び（３）に従って確立される相関に基づいて、可能性のある指示体の候補を選別することが可能である。表１６ｃは、我々がモデル化し、指示体の理論（計算される）吸収極大波長と発光極大波長を示した幾つかのＥＤＯ型クマリン誘導体の構造を表すものである。
【０１８５】
表１６ｃのデータから幾つかの結論を導き出すことができる：
（１）ヘテロ原子に対してα位で結合しているクマリン環の３位に存在する５員複素環は、望ましいレッドシフトを提供すると同時にＫ⁺応答を維持する。ヘテロ原子に対してβ位で結合しているモデル化した５員複素環はそうではないこと；
（２）３−置換クマリン類の４位に存在する電子吸引性置換基は、それらの未置換類似体又は４位に電子供与性置換基を有する３−置換クマリン類に対し、Ｋ⁺応答を著しく低下させること；並びに
（３）３−置換クマリン類の５又は８位に存在する電子吸引性置換基は、４位に存在する電子吸引性置換基よりもかなり小さい影響をＫ⁺応答に及ぼすこと。
同様な方法を使用すると、イオノホアに基づく検出を支持するのに必要な近接するｎπ^*及びππ^*励起状態を有する他の種類の芳香族カルボニル、ニトロ芳香族及びＮ−複素環系を確認することが可能である。
【０１８６】
実施例１７
カリウムサンサーの臨床試験
カリウムセンサー膜を実施例１５に記載した通りのセンサーカセットに取り付け、このカセットを心臓外科患者の血液中の［Ｋ⁺］を測定するのに使用されるCDI/3M Health Care Model S400^TM臨床モニターに取り付けた。前記膜は、取り付け前にpH 7.32 のＨＥＰＥＳ緩衝液中で１１カ月間エージングさせたものであった。フラッシュランプを使用してセンサーを照らし、 LabVIEW^TMソフトウェアを使用し、１６ビットＡ／Ｄコンバーターを通じて結果を得た。
【０１８７】
これらの実験的試験において、２点ＨＥＰＥＳ緩衝液シリンジ較正又は１標準［Ｋ⁺］緩衝液及び１血液点較正のいずれかを使用し、Model 865 臨床血液ガス分析計（ＢＧＡ）（マサチューセッツ州メドフィールド（Medfield）所在のCiba Corning Diagnostics Corp.製）に関し、６回の心臓バイパス外科手術で［Ｋ⁺］を監視した。S400^TM臨床モニターのチャンネル１及び２でカリウムイオンを監視した。全ての場合において、Ｋ⁺濃度−１．８mMの一定オフセットを観測した。
【０１８８】
各手術に対して５又は６つのデータ点を測定した。表１７ａにおいて、データ点はＭ−Ｎで示されており、ここでＭは手術であり、Ｎはデータ点である。
【０１８９】
表示した通りの３及び８mMの［Ｋ⁺］、１３９mMの［Ｎａ⁺］濃度及び血液温度で２点ＨＥＰＥＳ緩衝液シリンジ較正を実施した。この方法に関して表１７ａに示されているデータは、−１．８mMのオフセットで調整されたものではない。シリンジと血液較正のデータに関し、シリンジ緩衝液点は９．８mM（１．８mMのオフセットを調整）で一定であり、血液点は臨床試験に依存して３．６〜４．４mM K⁺の間であった。表１７ａに示されているこの方法に関するデータは、−１．８mMのオフセットを調整したものである。
【０１９０】
【表１２】

【０１９１】
表１７ａのデータから、２点ＨＥＰＥＳ緩衝液を使用して測定されたカリウム濃度に関し、６４のカリウム試料測定値のうちの６つが（ＢＧＡ測定値に関する）±０．５mMの誤差範囲の外にあり、１４の試料が±０．３mM K⁺濃度の範囲外にあることが示される。１シリンジ緩衝液点及び１血液点を使用して測定されたカリウム濃度に関しては、６４のカリウム試料測定値のうちの１０が±０．５mMの誤差範囲の外にあり、２１の試料が±０．３mM［Ｋ⁺］の範囲外にある。
【０１９２】
表１７ａ中のデータは、本発明のカリウムセンサーが、pH 7.32 で２３℃で１１カ月間貯蔵された後、７．２〜７．５の血液pH範囲、１８〜３６℃の温度範囲及び２．３〜６．０mMの［Ｋ⁺］範囲にわたって適切な強度及び傾きを示したことを表している。
【０１９３】
実施例１８
６，７−［２．２．１］−クリプタンド−３−［２''−（５''−カルボエトキシ）フリル］クマリン（２．２．１−ＦＣＣＣ−エステル）
１６０mlアセトニトリル中に１．２ｇの６，７−ビス（２−ヨードエトキシ）−３−［２''−（５''−カルボエトキシ）フリル］クマリン、０．４１９７ｇの１，４，１０−トリオキサ−７，１３−ジアザシクロペンタデカン及び１．０１９ｇのＮａ₂ＣＯ₃を含む溶液を攪拌し、窒素下で３６日間還流させた。冷えた混合物を濾過し、溶剤を減圧除去し、残留物を３部の１００ml熱ヘキサン、３部の１００ml熱酢酸エチルを用いて粉砕し、次に１００mlのクロロホルム中に溶解させ、濾過した。溶剤を除去すると固形物が得られ、この固形物を１５mlのメタノールと７mlのシクロヘキサン／酢酸エチルの８５：１５(v/v) 溶液との混合物から再結晶化させた。得られた固形物を０．１mmHgで乾燥させると、０．４９ｇの所望のクリプタンドが得られた。
【０１９４】
実施例１９
６，７−［２．２．１］−クリプタンド−３−［２''−（５''−カルボキシ）フリル］クマリン（２．２．１−ＦＣＣＣ−酸）
実施例１８のＦＣＣＣ−エステルを、２．７mlのメタノールが加えられた７．８mlのＴＨＦと共に攪拌した。この混合物に５．４mlの水中に０．３６ｇの水酸化リチウム一水和物を含む溶液を加えた。２３℃で３０分間攪拌後、８．１mlの６ＮのＨＣｌ水溶液を加え、６０分間攪拌を続けた。回転減圧蒸発器により３８℃で２０分間を要して溶剤を除去し、残留物を２５mlのメタノール及び２５mlのＴＨＦ中に繰返し溶解させてストリッピングし、水を除去した。残留物を０．２mmHgで数日間乾燥させると、０．９７ｇの所望の酸（Ｈ¹ＮＭＲにより８４．４相対重量％）が得られた。
【０１９５】
実施例２０
６，７−［２．１．１］−クリプタンド−３−［２''−（５''−カルボエトキシ）フリル］クマリン（２．１．１−ＦＣＣＣ−エステル）
１６０mlアセトニトリル中に１．２ｇの６，７−ビス（２−ヨードエトキシ）−３−［２''−（５''−カルボエトキシ）フリル］クマリン（実施例４から）、０．３３５０ｇの１，７−ジアザ−１２−クラウン−４（ペンシルヴェニア州ピッツバーグ（Pittsburgh）所在のAcros Organics製）及び１．０１９ｇのＮａ₂ＣＯ₃を含む溶液を攪拌し、窒素下で３６日間還流させた。冷えた混合物を濾過し、溶剤を減圧除去し、残留物を３部の１００ml熱ヘキサン、３部の１００ml熱酢酸エチルを用いて粉砕し、次に１００mlのクロロホルム中に溶解させ、濾過した。溶剤を除去すると固形物が得られ、この固形物を１５mlのメチルアルコールと７mlのシクロヘキサン／酢酸エチルの８５：１５(v/v) 溶液との混合物から再結晶化させた。得られた固形物を０．１mmHgで乾燥させると、０．４３ｇの所望のクリプタンドが得られた。
【０１９６】
実施例２１
６，７−［２．１．１］−クリプタンド−３−［２''−（５''−カルボキシ）フリル］クマリン（２．１．１−ＦＣＣＣ−酸）
実施例２０のＦＣＣＣ−エステルを、２．５mlのメチルアルコールが加えられた６．９mlのＴＨＦと共に攪拌した。この混合物に５．０mlの水中に０．３４２ｇの水酸化リチウム一水和物を含む溶液を加えた。２３℃で３０分間攪拌後、７．７mlの６ＮのＨＣｌ水溶液を加え、６０分間攪拌を続けた。回転減圧蒸発器により３８℃で２０分間を要して溶剤を除去し、残留物を２５mlのメチルアルコール及び２５mlのＴＨＦ中に繰返し溶解させてストリッピングし、水を除去した。残留物を０．２mmHgで数日間乾燥させると、０．９７ｇの所望の酸（Ｈ¹ＮＭＲにより６４．５相対重量％）が得られた。
【０１９７】
２−フルフリルローダミン
３４０mlの氷酢酸中に６８．４ｇのローダミン、１２８．３５ｇの酢酸ナトリウム、及び４３ml（４９．８ｇ）の２−フルアルデヒドを含む溶液を加熱し、時々攪拌しながら３０分間沸騰させた。溶液を少し冷却し、２．６リットルの水中に注いだ。その結果生成した固形物を採集し、１．４リットルの水、５００mlのエチルアルコール及び２００mlのジエチルエーテルにより連続的に濯いだ。アセトンからの再結晶化によって、９７．４ｇの２−フルフリルローダミンが得られた。
【０１９８】
実施例２３
３−α−フリル−３−チオケトプロパン酸
１５０mlの１５（重量）％ＮａＯＨ水溶液中に３４．０ｇの２−フルフリルローダミン（実施例２２）を含む溶液を３０分間沸騰させ、次に２３℃に冷却し、濾過した。濾液を氷の上で冷却し、２００mlの１０（重量）％ＨＣｌ水溶液により酸性にした。その結果として生成した黄色結晶を濾過により捕集し、メチルアルコールから再結晶化させた。所望の生成物の構造をＮＭＲにより決定した。
【０１９９】
実施例２４
３−α−フリル−３−オキシイミノプロパン酸
１６mlの水中に１８．０ｇのヒドロキシルアミン塩酸塩を含む溶液を全ての固形物が溶解するまで加熱することにより調製し、その後、１８７mlのエチルアルコール中に２２．０ｇのナトリウムエトキシドを含む溶液を加えた。その結果として生成した塩沈殿物を濾過により除去し、そして濾液に２０．０ｇの３−α−フリル−３−チオケトプロパン酸（実施例２３）を加えた。得られた溶液を熱水浴上で３０分間沸騰させ、次に氷の上で冷却し、６０mlの５（重量）％水酸化ナトリウム水溶液と混合した。混合物を濾過し、冷却し、次いで５６mlの１０（重量）％ＨＣｌ水溶液により酸性にした。生成物をジエチルエーテル（５×１０ml）中に抽出させ、溶液を硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶剤の蒸発によって、橙色固形物として所望のオキシムが得られた。
【０２００】
実施例２５
２−フルフリルアセトニトリル
無水酢酸中に３−α−フリル−３−オキシイミノプロパン酸（実施例２４）を含む混合物（それぞれ１ｇ：４．８３mlの比で混合）を熱水上で還流下３０分間加熱した。得られた混合物の蒸気蒸留によって、９０〜１００℃で所望のニトリルと水の共沸混合物が得られた。黄色共沸混合物をジエチルエーテルにより抽出し、残留水性相を飽和炭酸ナトリウム水溶液により中和し、次に再びジエチルエーテルにより抽出した。組み合わせたエーテル溶液を硫酸マグネシウム上で乾燥させた。エーテルの除去後、残留物の減圧蒸留によって、１０５〜１１５℃で所望のニトリルが得られた。
【０２０１】
実施例２６
１，２−ビス−（２’−クロロエトキシ）ベンゼン
４００mlのトルエンと６mlのピリジン中に６ｇ（０．０３mol ）の１，２−ビス−（２’−ヒドロキシエトキシ）ベンゼン（Landini 及びMontanari の手法に従って調製）を含む溶液を窒素下で４０℃に加熱した。過剰の塩化チオニル（９．２ml、０．１３mol ）を攪拌しながら２５分間にわたって加えた。反応混合物を沸点（約１１０℃）に加熱し、還流を３時間保った。デカントする前に溶液を室温に冷却し、保存した。残留物を粉砕し、水に溶解させ、トルエンにより抽出した。トルエン溶液を組み合わせ、まず２ＮのＨＣｌにより洗浄し、次に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液により洗浄した。乾燥させた溶液を減圧蒸発させると４．５ｇ（６４％）の粗生成物が得られ、これをクーゲルロア（Kugelrohr ）によりアスピレーター圧力で蒸留すると、融点が５５〜５６．５℃である分析的に純粋な試料４．４３ｇが得られた。分光分析によって、この生成物は１，２−ビス−（２’−クロロエトキシ）ベンゼンであることが確認された。
【０２０２】
実施例２７
１，２−ビス−（２’−クロロエトキシ）ベンズアルデヒド
この手法は、Org. Synth. Coll.,第Ｖ巻、第49〜51頁（1973）及びChem. Ber., 第96巻、第308 〜313 頁（1963）に記載されているようなメシトアルデヒドの合成に使用される方法に変更を加えたものである。
６０mlの塩化メチレン中に２５ｇ（０．１１mol ）の実施例６の生成物を含む溶液を０℃に冷却した。この溶液を０℃の反応温度に保ちながら、全部で２０ml（０．１８mol ）の四塩化チタン（ワイオミング州ミルウォーキ所在のAldrich Chem. Corp. 製）を窒素下３０分間にわたって攪拌しながらシリンジにより加えた。１０mlの塩化メチレン中に１３．５ｇ（０．１１７mol ）の１、１−ジクロロメチルメチルエーテル（Aldrich ）を０℃で１５分間にわたって加えた。０℃での攪拌を５分間続けた。この溶液が室温に達するまで水槽上でこの溶液を２０分間温めた。次に、溶液を１５分間還流させた。溶液を冷却した後、溶液を粉砕された氷の上に注いだ。分液漏斗内で混合物を振盪した後、塩化メチレン層を分離し、水性層を２部の１００mlのクロロホルムにより抽出した。クロロカーボン溶液を組み合わせ、まず水で、次に塩化ナトリウム水溶液で徹底的に洗浄した。有機層を乾燥させ、減圧蒸発させると、沸点が４９〜５１℃の刺激性の臭気があるサフラン黄色固形物として２４．５ｇの前記アルデヒド（８７％）が得られた。分光分析によって、この生成物は１，２−ビス−（２’−クロロエトキシ）ベンズアルデヒドであることが確認された。
【０２０３】
実施例２８
３，４−ビス−（２’−クロロエトキシ）フェノール
この化合物を、まず３−クロロペルオキシ安息香酸又はモノペルオキシフタル酸マグネシウムを使用して実施例２７から得たベンズアルデヒドをギ酸エステルにバイヤー−ビリガー（Baeyer-Villiger ）酸化し、続いて酸触媒加水分解することにより調製した。しかしながら、この方法は、スケールアップすると、分解により生成物の大きな損失を引き起こす。従って、バイヤー−ビリガ−法の代替方法を使用した。オーバーヘッッド攪拌機及び冷却浴を備えた２リットルフラスコ内に、実施例２７の生成物１６２ｇ（０．６１６mol ）及び冷（１０℃の）メタノール１．５リットルを入れた。この溶液に予冷された３３（重量）％硫酸溶液４８ｇを加えた。
【０２０４】
１２５mlのメタノールに９４ｇ（０．８３mol ）の３０（重量）％過酸化水素溶液を加え、攪拌及び冷却しながら５分間にわたってこの混合物を上記溶液に加えた。この結果として得られた溶液は濁ったが、２時間攪拌した後に透明になった。
【０２０５】
反応フラスコの底部で形成された褐色油（１１ｇ、廃棄した）からこの溶液をデカントした。デカントした溶液を室温で一晩攪拌した。粗生成物の４００mlのクロロホルム及び１００mlの水を加える前に、反応混合物からメタノールをストッリピングした。この混合物を攪拌した。
【０２０６】
各層を分離した後、水性層をクロロホルムでさらに抽出した。クロロホルム層を組み合わせ、中性pHになるまで水で洗浄した。有機層を、４００mlの水中に３０ｇ（０．７５mol ）のＮａＯＨを含む溶液で抽出し、次に同様に調製された第２のＮａＯＨ溶液２００mlにより抽出した。水性抽出液を組み合わせ、２００mlの６ＮのＨＣｌにより酸性にし、次いで４００mlの新しいクロロホルムにより抽出した。クロロホルム層を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、シリカの５cm×５cmプラグに通した。溶剤を除去すると、８４ｇ（５４％）の僅かに褐色の固形物が得られた。プロトンＮＭＲによって、生成物の構造を確認した。
【０２０７】
実施例２９
４，５−ビス−（２’−クロロエトキシ）−２−ヒドロキシベンズアルデヒド
この基本中間体は、実施例２７において１，２−ビス−（２’−クロロエトキシ）ベンゼンにアルデヒド官能基を導入するために使用した方法によって調製した。
６０mlの塩化メチレン中で、実施例２８から得た粗生成物１２．４ｇ（４９．４mmol）を１６．３ml（１４８mmol）の四塩化チタンで処理し、続いて４．５ml（５０mmol）の１，１−ジクロロメチルメチルエーテルにより処理し、５．２ｇ（３７％）の基本中間体を得た。この生成物をオイルポンプ減圧で昇華させ、沸点が１０２〜１０２．５℃の乳白色結晶４．３５ｇを得た。分光分析によって、この生成物が前記基本中間体であることを確認した。
【０２０８】
実施例３０
６，７−ビス−（２’−クロロエトキシ）−３−カルボエトキシクマリン（第１方法）
この方法は、実施例２９の２−ヒドロキシベンズアルデヒドに対する標準的なクネーフェナーゲル（Knoevenagel ）縮合であり、Balaiah 等のProc. Indian Acad. Sci., 第16A 巻、第68〜82頁（1942）（Chem. Abs., 第37巻、第1429頁（1943））；Borsche 等のChem. Ber., 第85巻、第198 〜202 頁（1952）；Fukui 等のBull. Chem. Soc. Japan, 第35巻、第1321〜1323頁（1962）に記載されている方法に基づくものである。
【０２０９】
６．０３ｇ（３７．６mmol）のジエチルマロネート（Aldrich ）に実施例２９の生成物１０ｇ（３６mmol）を加え、完全に混合した。この混合物を窒素下、蒸気浴上で加熱した。溶解後、２滴のピペリジンを加えた。加熱を３０分間続けた。次に溶液を冷却し、スラリーが得られるまでエタノールにより溶液を稀釈した。濾過及び風乾後、１１．５（８５％）の黄褐色粉末が得られた。この粉末は、融点が１０２〜１０３．５℃であった。そのプロトンＮＭＲスペクトルは、実施例３１の生成物から得られたものに一致した。
【０２１０】
実施例３１
６，７−ビス−（２’−クロロエトキシ）−３−カルボエトキシクマリン（第２方法）
BisselのSunthesis,第846 〜848 頁（1982）に基づくこの方法は、一貫性がなく、うまく行ったとしても収率が低い。その１つの利点は、この方法が実施例２８のフェノールから化合物Ｖを直接提供するため、工程が１つ減ることである。
実施例２８から得たフェノールの０．９ｇ（４mmol）を０．９ml（５mmol）のジエチルエトキシメチレンマロネート（Aldrich ）と混合した。この溶液に、４０mlの塩化メチレンと共に１ＭのＺｎＣｌ₂溶液（Aldrich ）５mlを加えた。この溶液を窒素下で２４時間還流させ、回転減圧蒸発器でアスピレーター圧力で減圧蒸留することにより溶剤を除去し、水で失活させた。この混合物をクロロホルムにより抽出した。溶出溶剤として塩化メチレンを使用するアルミナ短カラムによるクロマトグラフ分離によって、０．３３ｇ（２４％）の生成物を得た。プロトンＮＭＲによって、この生成物が６，７−ビス−（２’−クロロエトキシ）−３−カルボエトキシクマリンであることが示された。
【０２１１】
実施例３２
６，７−ビス−（２’−ヨードエトキシ）−３−カルボエトキシクマリン（第１方法）
この実施例は、米国特許第５，１６２，５２５号明細書の対応する４−メチル誘導体に関する実施例３に記載されている方法に従うものである。
実施例３０から得たビス−クロロエトキシクマリン０．７５（２．０mmol）とヨウ化ナトリウム０．９ｇ（６mmol）を２５mlのアセトン中に溶解させた。この溶液を窒素下で２日間還流させた。その後、追加の０．４５ｇのヨウ化ナトリウムを加えた。この溶液をさらに２４時間還流させた。（アセトンの代わりにメチルエチルケトンを使用すると、総反応時間が約２４時間に短縮されることをその後発見した。）最後の０．４５ｇのヨウ化ナトリウムを加えた。還流をさらに６時間続けた。元の反応容積を維持するために必要に応じてアセトンを加えた。溶液を冷却し、減圧蒸発させた。塩化メチレンとクロロホルムの混合物により残留物を抽出した。生成物を含むクロロカーボン溶液を１０％チオ硫酸ナトリウム（形成されたヨウ化物をヨウ素に還元するため）で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させ、回転減圧蒸発器で乾燥するまで蒸発させた。残留物をエタノールから結晶化させると、沸点が１６４〜１６６℃である淡黄色粉末０．９２ｇ（８２％）が得られた。生成物のプロトンＮＭＲスペクトルは、実施例３４の生成物のものと一致した。
【０２１２】
実施例３３
４，５−ビス−（２’−ヨードエトキシ）−２−ヒドロキシベンズアルデヒド
この実施例は、実施例３４のビス−ヨードエトキシクマリン誘導体（IV）に対する２通りの代替方法のうちの１つを提供する。
２０mlのアセトンに２．２１ｇ（１４．７mmol）のヨウ化ナトリウム及び実施例２９の生成物１．３７ｇ（４．９１mmol）を溶解させた。この溶液を４日間還流させた。その後、１０mlのアセトン及び第２のヨウ化ナトリウム（０．７３ｇ，２．６mmol）を溶解させ、溶液をさらに２４時間還流させた。この溶液を冷却し、濾過した。回転減圧蒸発器で溶剤を除去し、残留物をクロロホルムに溶解させた。クロロホルム溶液を水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた後、溶剤を除去すると、２．０５ｇ（８９％）の生成物が得られた。プロトンＮＭＲによって、この生成物の構造を確認した。
【０２１３】
実施例３４
６，７−ビス−（２’−ヨードエトキシ）−３−カルボエトキシクマリン（第２方法）
実施例３３から得たビス−ヨードエトキシ−ヒドロキシベンズアルデヒド１．７３ｇ（１０．８mmol）に、ジエチルマロネート２．１ｇ（４．６mmol）を加え、この混合物を蒸気浴上で加熱した。混合物が均質になった時に、２滴のピペリジンを加えた。混合物を冷却した後、沈殿物が形成された。この溶液を数ミリリットルのエタノールで稀釈し、蒸気浴上で沸騰するまで再加熱した。溶液を冷却した後、溶液を濾過すると沈殿生成物が残った。この生成物は、沸点が１６２〜１６５℃である固体であった。プロトンＮＭＲによって、この生成物の構造を確認した。
【０２１４】
実施例３５
６，７−［２．２．２］−クリプタンド−３−カルボエトキシクマリン
米国特許第５，１６２，５２５号明細書の対応する４−メチル誘導体に関する実施例４に記載されている方法を使用してこのクマロクリプタンドを調製した。
ビス−ヨードエトキシ−クマリン（実施例３２又は実施例３４から）の１．０ｇ（１．８mmol）の試料及び０．４７ｇ（１．８mmol）の１，４，１０，１３−テトラオキサ−７，１６−ジアザシクロオクタデカン（すなわち、４，１３−ジアザ−１８−クラウン−６）を別々に５０mlの乾燥アセトニトリルに溶解させた。混合溶液（合計１００ml）を５当量（０．９４ｇ）の無水炭酸ナトリウムの存在下、窒素下で６日間還流させた。この反応の間、粒子の粗い炭酸ナトリウムは非常に細かい微粉末になった。冷却した反応混合物を濾過し、溶液を乾燥するまで減圧蒸発させた。残留物を塩化メチレンに溶解させ、溶液を濾過した。回転減圧蒸発器を使用してアスピレーター圧力で、続いてオイルポンプ圧力で塩化メチレンを蒸発させると、黄色気泡体（計算した収率の１００％を超える）が得られた。未反応出発物質の溶出に塩化メチレンを使用し、続いて生成物の溶出に１〜５％エタノール／塩化メチレン混合物を使用し、粗生成物を不活性中性アルミナ上でのクロマトグラフィーにより精製した。本質的に所望の生成物(VII) からなる生成物を理論量の約５０％回収した。Ｃ₂₈Ｈ₄₀Ｎ₂Ｏ₁₀に対するLRMS FAB（トリエタノールアミン）理論ｍ／ｅは５６４．２７であるが、実測ｍ／ｅは５８７であった。［VIII(Na)］⁺；遊離 [VII]⁺は観測されなかった。ＵＶ（ホスフェートにより緩衝された塩化ナトリウム水溶液）ｌ_max＝３７４nm、３１２nmであった。蛍光（ホスフェートにより緩衝された塩化ナトリウム水溶液）はｌ_ex＝３７１nm及びｌ_em＝４５３nmであった。
さらにクロマトグラフィーにより精製した同様に調製した試料の構造をプロトンＮＭＲによって確認した。
【０２１５】
実施例３６
実施例３５のクマロクリプタンドの加水分解
実施例３５の０．２５ｇの試料を２５mlの２ＮのＨＣｌに溶解させ、蒸気浴上で３０分間加熱した。溶解を促進するために必要に応じて少量のメタノールを加えた。反応の揮発性成分（すなわち、水、過剰のＨＣｌ、アルコール類）をまず回転減圧蒸発器でアスピレーター圧力で蒸発させ、次にオイルポンプ減圧で穏やかに蒸発させると、３−カルボキシクリプタンドクマリン塩酸塩がカボチャ黄色固形物として得られた。プロトンＮＭＲによって所望の生成物であることを確認した。
実施例３７〜３９は、他のクマロクリプタンドの調製法を説明するものである。
【０２１６】
実施例３７
６，７−ビス−（２’−クロロエトキシ）−３−（１’−オキソ−４’−カルボエトキシブチル）クマリン
実施例３０に記載の方法を使用し、１００mlのエタノール中に２．１２ｇ（７．６０mmol）の実施例２９の生成物及び１．７６ｇ（７．６４mmol）のジエチル３−オキソ−ピメレート（Aldrich ）を含む溶液を蒸気浴上で加熱した。約２０滴のピペリジンを加えた。混合物を３０分間還流させ、次いで室温に冷却した。形成された沈殿物を濾過により単離し、乾燥させると収量３．５３ｇ（９６％）の生成物が得られた。生成物の構造をプロトンＮＭＲにより確認した。
【０２１７】
実施例３８
６，７−ビス（２’−ヨードエトキシ）−３−（１’−オキソ−４’−カルボエトキシブチル）クマリン
３００mlのメチルエチルケトン中に３．５ｇ（７．５mmol）の実施例１２の生成物及び３．４ｇ（２３mmol）の無水ヨウ化ナトリウムを含む溶液を窒素下で加熱して４８時間還流させた。混合物を室温に冷却し、次いで回転減圧蒸発器により溶剤を減圧除去した。残留物を約２０mlの水により処理した。残った固形物を濾過により単離し、トルエン中に溶解させた。トルエンを回転減圧蒸発器により減圧除去し、残留水を除去した。生成物を高真空下で乾燥させ、４．５ｇ（９５％）の生成物を得た。プロトンＮＭＲを使用して生成物の構造を確認した。
【０２１８】
実施例３９
６，７−［２．２．２］−クリプタンド−３−（１’−オキソ−４’−カルボエトキシブチル）クマリン
実施例３５に記載の方法を次のように変更した：磁気攪拌機、還流冷却器及び窒素パージ源を備えた２５０mlフラスコ内で０．７９ｇ（１．３mmol）の実施例３８の生成物を乾燥アセトニトリル（４５ml、シリカゲル及び０．４nm分子篩上で乾燥させ、水素化カルシウムから蒸留したもの）に溶解させた。１当量（０．３３ｇ）の４，１３−ジアザ−１８−クラウン−６を第２（２０ml）の乾燥アセトニトリルに溶解させ、この溶液を前記第１溶液に加えた。０．６２ｇ（５．８mmol）の炭酸ナトリウムを加える前に、反応混合物を７０℃に加熱した。窒素下で溶液を７日間還流させた。その後、６０mlのクロロホルムを加え、溶液を濾過した。
【０２１９】
溶剤をストリッピングした後、約１ｇの黄色粘着性油が得られた。この油に６０mlのクロロホルムと２０mlの塩化ナトリウム水溶液を加え、この組み合わせたものを混合した。有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶剤をストリッピングすることによって、０．８５ｇの油状生成物を得た。これを、まず酸化アルミニウム粉末の２cm×６cmカラムに通すフラッシュクロマトグラフィー（溶出溶剤として７０mlの塩化メチレンを使用）により精製すると、０．６５ｇの生成物が残った。次に、この物質を塩化メチレン／ヘキサンの１：２混合物を使用して酸化アルミニウムの第２のカラムに慎重に通すと、３７０mg（４６％）の黄色粘着性粉末である本質的に純粋な生成物が得られた。
プロトンＮＭＲ及びＩＲ分光分析法によって生成物の構造を確認した。ＵＶ分光分析（ホスフェートにより緩衝された塩化ナトリウム水溶液）結果：ｌ_max＝３８２nm、３１７nm。
【０２２０】
実施例４０
クマリン誘導体の光安定性の比較
次のモデル化合物を使用し、クマリン類の３位及び４位に存在する官能基の変化が相対的光安定性に及ぼす影響を評価した。
エタノール中に化合物VIII、IX、Ｘ及びXIを含み、吸光度が０．０５≦Ａ_max≦０．１の範囲内にある溶液を調製し、各溶液を、最大光源スリット幅（バンドパス３０nm）でｌ_maxでSPEX Fluorog 2^TMシリーズ分光蛍光計（ニュージャージー州エジソン所在のSPEX Industries, Inc. 製）で１時間連続照射した。試料位置で測定された励起光源の測定された輝度は３０〜５０mW/cm²に及んだ。照射中にそれぞれに対して発光極大で蛍光強度を監視した。
【０２２１】
Ｘに対して規格化したデータを表４０ａに示す。（化合物VIII、IX及びＸの光安定度は１回の実験で測定したものであり、化合物XIの光安定度はそうではないが、比較しやすいためにそれらの結果を１つの表にした。）
【０２２２】
時間０での強度の違いは、誘導体の相対的な蛍光効率を反映している。３−カルボエトキシ誘導体(VIII)は、優れた光安定性と４−メチル誘導体（IX）又はカルボキシメチル誘導体（XI）よりも僅かに改良された蛍光効率とを併せ持つ。
【０２２３】
【化１２】

【０２２４】
【表１３】

【０２２５】
【表１４】

【０２２６】
実施例４１
生理的濃度の［Ｋ⁺］の変化に対する実施例３５のクマロクリプタンドの応答
リン酸ナトリウムのみで緩衝された塩化ナトリウム水溶液（２０℃、pH＝7.36、［Ｎａ⁺］＝１３４mM、［Ｋ⁺］＝０mM、［Ｃｌ^-］＝６４mM）を用いて、実施例３５の生成物（Ａ_372nm＝０．１）の約１０^-5Ｍ溶液を調製した。［Ｋ⁺］＝０．２Ｍのホスフェートにより緩衝された塩化ナトリウム水溶液のアリコート（３６μl ）をキュベット内の３mlの溶液に加え、０から１２mMまで段階的に２．４mMごとに［Ｋ⁺］を変化させた。各段階で、蛍光発光強度を２７０nmの励起波長で４００nmから６００nmまで測定した。
【０２２７】
［Ｋ⁺］＝０mM及びｌ＝４４５nmでの強度に対してデータを規格化した。表４１ａに示す規格化したデータは、［Ｋ⁺］の増加とともに蛍光強度が単調増加することを示している。［Ｎａ⁺］を１４５mMまで増加させると、蛍光がほんの僅か減少した。実施例３９の生成物について同様な結果を得た。
【０２２８】
【表１５】

【０２２９】
実施例４２
分子テザーによるコーティング可能なポリマーの官能化
室温の１リットルのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に２０ｇのポリ（塩化ビニル）カルボキシル化（ＰＶＣ−ＣＯＯＨ）ポリマー（ＣＯＯＨ１．８％）（Aldrich ）を溶解させた。これに、ＴＨＦ中に４．９ｇ（３当量）のジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（Aldrich ）を含む溶液７５mlを加えた。室温で蓋付きフラスコ内で混合物を３０〜６０分間攪拌した後、７２ｇ（１０当量）のJeffamine ED-900^TMビス（２−アミノプロピル）ポリエチレングリコール800 （ニューヨーク州ロンコンコマ所在のFluka Chemical Corp.製）を活性ポリマー溶液に素早く加えると、濁った溶液／懸濁液となった。これを室温で１８時間攪拌した。回転減圧蒸発器（６０℃）で溶液を約３００mlに濃縮し、急速攪拌している容器に水（約１８リットル）を素早く加えた。（小さな粒子の発生を防止するため及び容易に濾過及び精製することができるポリマー沈殿物を提供するためには、水の低剪断流動、すなわち渦を巻かせることが必要である。）
【０２３０】
水からポリマーを取り出し、プラスチックのメッシュシートを使用して濾過し、次に約５００mlのメタノール中に懸濁させ、再び濾過した。ポリマーを減圧乾燥させる前に、残留水を減少させ、そして反応副生成物を除去するために、さらに２回、ポリマーをメタノール中に懸濁させ、濾過した。
【０２３１】
ポリマーを約１リットルの室温のＴＨＦ中に再溶解させ、そしてまずポリプロピレンフィルター布に通し、次にポリ（プロピレン）フィルター布上にCelite^TM 545（ペンシルヴェニア州ピッツバーグ所在のFisher Scientific 製）珪藻土の厚い（３〜４cmの）パッドを具備するポリエチレンブフナー漏斗（３５０〜６００ml）に通すことにより濾過した。透明濾液を集め、回転減圧蒸発器で６０℃で２００mlに濃縮した。
【０２３２】
上記のように水中でのポリマー溶液の沈殿及びポリマーの濾過を実施した。減圧乾燥前に、最終工程として水中でのポリマーの微細断（ブレンダーを使用）を実施した。
【０２３３】
官能化ポリマーフィルムの赤外スペクトルを捕捉し、反応（ＣＯＯＨ基の吸収特性１７２０cm^-1の消失）を確認した。ポリマーのゲル透過クロマトグラフィーによって、分子量がＰＶＣ−ＣＯＯＨ出発物質の分子量（すなわち、ＰＶＣ−ＣＯＯＨロットに依存して160,000 〜220,000 ）から本質的に変化していないことが示された。
【０２３４】
Anal. Biochem., 第117 巻、第147 頁（1981）のSarin 等の方法を次のように変更した：試験管内の乾燥ポリマー試料２０mgに、（ａ）フェノール及びＫＣＮのピリジン溶液０．４０ml、及び（ｂ）ニンヒドリンのエタノール溶液０．１０mlを加えた（両方とも前記引例に記載されているように調製した）。試験ブランクを同様に調製した。両方の試験管を１００℃で約１０分間加熱した。それぞれの試験管に２mlのテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を加える前に、冷水中で両方の試験管を冷却した。試験管の内容物を分離用２５mlメスフラスコに移し入れた後、それらを２５mlのＴＨＦで稀釈した。吸光係数が１．２×１０^-4Ｍ^-1cm^-1であるＵＶ分光分析（ｌ_abs＝６０４nm）を使用してニンヒドリン濃度を決定した。このことから。有効なアミンの濃度はポリマーの０．２mmol/gであることが決定された。
【０２３５】
実施例４３
コーティング可能なポリマーへの化合物VII の結合
実施例４２から得たＰＶＣ／ビス（２−アミノプロピル）−ポリ（エチレングリコール）の２００mgの試料を１０mlのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させた。２mlのＤＭＦ中に５０mgの加水分解したVII を含む第２の溶液も調製した。第２の溶液に４２ml（０．２７mmol）のジイソプロピルカルボジイミド（Aldrich ）及び４０mg（０．２７mmol）のヒドロキシベンジルチアゾール（Aldrich ）を加え、この混合物を第１の溶液に加える前に約２０分間攪拌した。（第２の溶液を含んでいたフラスコを１mlのＤＭＦで洗浄して完全に移した。）
組み合わせた混合物に５０ml（０．２７mmol）のジイソプロピルエチルアミン（Aldrich ）を加えた。これを窒素雰囲気下、暗室内で一晩攪拌した。
【０２３６】
回転減圧蒸発器により４０℃で溶剤の容積を減少させた。濃縮された溶液を攪拌しながら２００mlの水に徐々に加えた。水性分散液を８０メッシュスクリーン上に注ぐことにより綿状の沈殿物を集めた。沈殿物を水で４回洗浄し、メタノールで３回洗浄した。沈殿物を安全剃刀の刃でより微細な細片に細断した後、細片をメタノール中で３回洗浄した。官能化ポリマーを減圧乾燥させた。
【０２３７】
試薬としてニンヒドリンを使用するAnal. Biochem., 第34巻、第595 頁（1970）のKaiserの方法によると、テザー化したビス（２−アミノプロピル）ポリ（エチレングリコール）のアミン基のうちの９５％を超えるアミン基が、恐らくはVII とのカップリングを通じて消費されたことが示された。
【０２３８】
実施例４４
多孔質膜上への官能化ポリマーのコーティング
ＴＨＦ及び水の９０／１０(v/v) 混合物中に実施例４３の官能化ポリマーを含む２％(w/w) 溶液を、幅６インチのスロット供給ナイフダイを使用し、親水性多孔質ポリプロピレン（ＷＯ９２／０７８９９参照）のロール（幅２７．９cm、厚さ７９mm）上に押出塗布した。（ＨＰＰＰウェブは、最大孔径が１．３mmであり、多孔度が７７％であった。）ウェブ速度は３ｍ／分であり、溶液送出量は６７ml／分であった。
コーティングされたウェブを送風オーブン（１５．６℃）に通して溶剤を蒸発させた。得られた乾燥皮膜重量は約２．５g/m²であった。
【０２３９】
０〜８mMのＫ⁺溶液への浸漬及び応答百分率の計算によって、ダイと接触した膜の側面に加えられた物質の殆どが存在するＨＰＰＰウェブの内部細孔表面中に非対称官能ポリマーコーティングが分布することが示された。
【０２４０】
実施例４５
コーティングされた膜の試験
実施例４４のＨＰＰＰ膜から円形ディスクを打ち抜いた。これらを使用し、当該検出用複合材料の可逆性、pH依存性及び安定性（緩衝液中及び血液中の両方）を試験した。
【０２４１】
可逆性
カリウムイオン濃度の変化に対する当該センサーの可逆性を、３９５nmの励起光源を具備し、４４０nm以上の波長の蛍光を検出する CDI^TM S400 モニター（カリフォルニア州タスティン所在のCDI/3M Health Care製）を使用してセンサーの蛍光強度を測定することにより決定した。約１３８mMのＮａＣｌを含み、［Ｋ⁺］濃度が２、４、６又は８mMとなるのに十分なＫＣｌを加えた５０mMのＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（エタンスルホン酸）緩衝液（ミズーリー州セントルイス所在のSigma Chemical Corp.製）（以下、ＨＥＰＥＳと表す）を急速循環させることによりカリウムイオン濃度を変化させた。（被検体のＫ⁺濃度の変化に対する）実際のセンサーの応答時間は短い（すなわち、約６０〜１２０秒）かったが、平衡の８分後に蛍光強度を測定した。これらの測定結果を表４５ａに示す。
【０２４２】
【表１６】

【０２４３】
表４５ａは、実施例４４におけるように作製されたセンサーがバイパス手術の間に通常観測されるカリウムイオン濃度変化（すなわち、３〜６mM）よりも大きいカリウムイオン濃度変化に関して可逆性であることを示している。
【０２４４】
pH 依存性
Ｋ⁺濃度２、４及び６mMで上記ＨＥＰＥＳ緩衝液のpHの関数としてセンサーの蛍光強度の変化を CDI^TM S400 モニターにより測定した。これらの測定結果を表４５ｂに示す。
【０２４５】
【表１７】

【０２４６】
表４５ｂは、実施例４４におけるように作製されたセンサーが、特に生理的pH範囲で、変化するpHでの（変化する［Ｋ⁺］に対して）応答の変化が小さいことを示している。より詳細には、生理的pH（すなわち、７．３〜７．５）及び生理的カリウムイオン濃度（すなわち、約４mM）でのセンサーの蛍光強度の変化は、pH＝7.07からpH＝7.90までに観測された全蛍光変化の約２％であった。これは、非ＰＶＣマトリックスに結合した同じクマロクリプタンドの約６％以上のpH依存性及び同様なpH範囲の水性緩衝液中にある固定化されていないクマロクリプタンドのより大きな依存性に匹敵する。
【０２４７】
安定性
検出用複合材料の安定性を緩衝液中及び血液中の両方で測定した。
Ａ．緩衝液
AVL 9120^TMナトリウム／カリウム分析計（ジョージア州ロスウェル（Roswell ）所在のAVL Scientific Corp.製）により測定した場合に１３８mMのＮａＣｌを含むＨＥＰＥＳの５０mM溶液を Lauda^TM RC 20恒温水槽（ドイツ所在のLauda Dr. R. Wobser CmbH & Co. KG 製）内で一定温度に保ち、モデル13400 蠕動ポンプ（ミシガン州アナーバー（Ann Arbor ）所在のSarns/3M Health Care製）によりセンサーループを通して循環させた。７〜８にわたる溶液のpHを Orion^TM pH 計（ナサチューセッツ州ケンブリッジ（Cambridge ）所在のOrion Research製）により監視した。２８５〜３０５mOsmにわたる溶液の浸透圧モル濃度を Advanced Wide-Range Osmometer 3W2^TM（マサチューセッツ州ニーダムハイツ（Needham Heights ）所在のAdvanced Instrument Inc.製）により測定した。緩衝液の［Ｋ⁺］をIL 643^TM炎光光度計（マサチューセッツ州レキシントン（Lexington ）所在のInstrumental Laboratories 製）により決定した。
【０２４８】
２組の［Ｋ⁺］「段階的」実験を（両方とも室温で）実施した。まず、［Ｋ⁺］を０〜８mMの間で変化させた。実施例４４に記載した通りの検出用複合材料を８mMのＫＣｌ溶液に浸漬する前に０mMのＫＣｌ溶液で平衡にし、その後、当該検出用複合材料を新たな［Ｋ⁺］で（完全な平衡は非常に速かったが）５〜１０分間を要して平衡にさせた。５時間にわたってこの操作を５回繰り返した。両方の溶液の蛍光強度（すなわち、 CDI^TM S400 モニターにより測定した場合の０mM溶液でのカウント数は約４８８、８mM溶液でのカウント数は約５６７）は、実験時間中に実質的に変化しなかった。
【０２４９】
第２の「段階的」実験は、IL 643^TM炎光光度計により測定した場合に３及び７mM（バイパス手術の際に通常遭遇する濃度範囲）である［Ｋ⁺］を使用した。検出用複合材料を７mMのＫＣｌ溶液に浸漬する前に３mMのＫＣｌ溶液で平衡にし、その後、当該検出用複合材料を数分間を要して新たな［Ｋ⁺］で（完全な平衡は約９０秒以内に起こったが）５〜１０分間を要して平衡にさせた。約３時間半にわたってこの操作を５回繰り返した。両方の溶液の蛍光強度（すなわち、 CDI^TM S400 モニターにより測定した場合の３mM溶液でのカウント数は約６４７、７mM溶液でのカウント数は約６７７）は、実験時間中に実質的に変化しなかった。
【０２５０】
Ｂ．血液
前項に記載したようにウシ血液を１３８mMの［Ｎａ⁺］及び３００mOsmの浸透圧モル濃度に調節した。上記のようにＫＣｌを加えることによって、約３及び９mMのカリウムイオン濃度を得た。２．８％のＣＯ₂、５．５％のＯ₂、９１．７％のＮ₂からなるガス組成物で連続的にスパージすることによって、ABL-7 ^TM血液ガス分析計（デンマーク、コペンハーゲン（Copenhagen）所在のRAdiometer A/S製）で測定した場合に約７．３４±０．０２となるように血液のpHを保った。血液溶液を試験用ループに導入した後に恒温に保たれた水浴中に貯蔵し、蠕動ポンプにより循環させた。（前項を参照）センサーを CDI^TM S400 モニターカセット及び大きさが3/8 インチの CDI^TM Model 6730 Quik-cell 血液ガス監視装置（CDI/3M Health Care製）に固定した。
【０２５１】
２種の［Ｋ⁺］溶液を交換するために、３mM溶液で初期センサー強度を得、そして９mM溶液を直接導入する前に試験ループを空にした。この操作を逆にした時に、試験ループを［Ｋ⁺］＝３mMの血液洗浄液で濯ぎ、３mM試験溶液の混入を防いだ。（この洗浄操作は、血液溶液の交換の間にセンサーが空気に暴露する原因となり、その結果、センサーの応答時間が長くなる。８mMのＫ⁺と少量のTriton^TM X-100又は Tween^TM 80 （両方ともAldrich から入手可能）、好ましくは内用薬用途に対するその認可のために後者のような界面活性剤を含むＨＥＰＥＳ緩衝液中でセンサーを水和させると安定したセンサー強度が得られることが見出された。）
【０２５２】
血液溶液の交換の間に中間洗浄浴を使用しない場合に、［Ｋ⁺］が３mMから９mMになるまでの応答時間（９５％）は約４０秒間であり、９mMから３mMになるまでの応答時間は約６５秒間であた。
【０２５３】
センサーは約５時間にわたって優れた安定性を示した。９mM溶液により得られた強度は試験期間中に徐々に（すなわち、約５カウント）減少したが、このことは交換した３mM溶液によりこの溶液が稀釈されたためであると考えられる。
【０２５４】
本発明の範囲及び真意から逸脱することなく、本発明の種々の改良及び変更が当業者には明らかになるであろう。また、本発明は本明細書に記載した例示的態様に無論のこと限定されない。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１ａ、１ｂ及び１ｃは、それぞれ、Ｋ⁺濃度の増加に対する本発明のクマロクリプタンドイオノホアの蛍光発光応答のグラフ図（図１ａ）及び従来のクマロクリプタンドの蛍光発光応答のグラフ図（図１ｂ）と、０及び１５mMのＫ⁺濃度でのクマロクリプタンドの応答を比較するグラフ図（図１ｃ）である。
【図２】図２は、０、８及び０mMのＫ⁺濃度の連続変化にそれぞれかけられた本発明のクマロクリプタンドイオノホアの蛍光発光応答のグラフ図である。
【図３】図３は、本発明のカリウムセンサーに及ぼす照射効果を表すグラフ図である。
【図４】図４ａ及び４ｂは、本発明のクマロクリプタンドイオノホア（図４ｂ）及び従来のクマロクリプタンド（図４ａ）に対する、カリウム濃度が測定されるべき生理的媒体のpH変化の効果を表すグラフ図である。
【図５】図５は、ＨＥＰＥＳ緩衝液中での０mMＫ⁺と１６mMＫ⁺の間で循環させた本発明のカリウム検出用装置の応答を表すグラフ図である。
【図６】図６ａ及び６ｂは、特定の置換クマロクリプタンドのＫ⁺応答と同様に置換されたモデル化合物ＭＤＯ及びＥＤＯ（図６ａ）並びにモデル化合物ＤＭＯ及びＥＤＯ（図６ｂ）の相対量子収率との間の相関を表すグラフ図である。
【図７】図７は、分子内無放射遷移に関する障壁幅に対する弱い、強い及び非常に強い振電カップリング効果を表すポテンシャルエネルギー図である。
【図８】図８は、実験的蛍光発光極大波長と置換されたモデル化合物ＤＭＯ及びＥＤＯに関する発光率との間の相関を表すグラフ図である。
【図９】図９ａは、ＥＤＯ型モデル化合物群について計算及び測定された吸収波長間の相関を表すグラフ図である。
図９ｂは、ＥＤＯ型モデル化合物群について計算及び測定されたストークスシフト間の相関を表すグラフ図である。
【図１０】図１０は、モデル化合物及び本発明のクマロクリプタンドイオノホアのカリウム応答を評価するために使用した３０kHz 位相変調ブレッドボードの略図である。
【図１１】図１１は、本発明のクマロクリプタンドイオノホアを使用することができる流体パラメーター測定装置と共に較正用及び流体パラメーター測定カセットを表す斜視図である。
【図１２】図１２は、図１１に示した測定装置の部分拡大図であって、前記カセットと前記装置を結合させた場合に当該測定装置と向かいあうカセットの側から見た図である。
【図１３】図１３は、図１１に示したカセットのみの拡大斜視図であって、例示のために前記カセットの２構成構造を別の角度から示す図である。

Claims

一般式：

［式中、
Ｔは、ＴがＯである場合にｑが０であり、かつ、ｎが０〜２であること並びにＴがＮである場合にｑが１であり、かつ、ｍ及びｎが独立に０又は１であることを条件として、Ｏ又はＮであり；
各Ｒ² は独立に、水素、ハロゲン、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキル、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルコキシ、Ｃ₂ 〜Ｃ₁₀アルケニル、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキルアミノ、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀ジアルキルアミノ及び式：（ＣＨ₂ Ｘ）_a Ｅ（式中、ＸはＯ、ＮＨ若しくは単結合であり、Ｅは活性水素を含有する官能基であり、ａは１〜１００の整数である）からなる群から選ばれ；
Ｒ³ は、水素、Ｃ₁ 〜Ｃ₁₀アルキル、Ｃ₅ 〜Ｃ₈ シクロアルキル、Ｃ₆ 〜Ｃ₁₀アリール、少なくとも１個のＯ、Ｎ又はＳ原子を含む複素環式基、Ｃ₂ 〜Ｃ₁₀アルケニル及び式：（ＣＨ₂ Ｘ）_b Ｅ（式中、Ｘ及びＥは上記定義の通りのものであり、ｂは０〜１０の整数である）からなる群から選ばれ；
Ｒ¹ は、

（式中、Ｙは、Ｏ、Ｓ又はＮＨである）
により表わされる部分であり；
Ｚは、Ｏ又はＮＲ⁵ （式中、Ｒ⁵ は水素又はヒドロカルビル含有基である）である］
により表わされる蛍光イオノホア化合物。
ＹがＯである、請求項１に記載の化合物。
ＹがＳである、請求項１に記載の化合物。
ＹがＮＨである、請求項１に記載の化合物。
ｍ及びｎの両方が１であり、ＺがＯであり、ＴがＮである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物を用いたカチオン検出用構造物であって、前記化合物はＫ⁺ に対して選択性があり、かつ、前記化合物は基材に結合されて当該カチオン検出用構造物を形成しており、当該カチオン検出用構造物は流体チャンバーを有するカセットに提供されており、当該カチオン検出用構造物は当該流体チャンバー内に収容される流体中のＫ⁺ イオンとイオン連絡がある、カチオン検出用構造物。
流路を有するカチオン検出用カセットにおいて使用するためのイオンセンサーであって、基材に結合された請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物が組み込まれたイオンセンサー。
入口及び出口とイオン透過性膜で被覆された開口部とを有するフロースルーカセットケーシング並びにイオンセンサーが上に配置されたイオン検出カセット本体を具備し、前記イオンセンサーに基材に結合された請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物が組み込まれているカセット集成体。
流路を有するカチオン検出用カセットであって、基材に結合された請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物が組み込まれたイオンセンサーが前記流路の内側に配置されているカチオン検出用カセット。