JP4454980B2 - 顕微鏡の撮像光学系およびそれを用いた顕微鏡 - Google Patents

顕微鏡の撮像光学系およびそれを用いた顕微鏡 Download PDF

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Description

本発明は、顕微鏡の撮像光学系及びそれを用いた顕微鏡に関し、特に、標本からの光を波長等の光学特性によって分割し、夫々を撮像面内の異なる位置に投影する顕微鏡の撮像光学系およびそれを用いた顕微鏡に関する。
従来、生細胞等の標本の物性を解析する研究分野においては、細胞内の異なる組織を異なる蛍光波長の試薬で標識し、多波長励起と多波長測光による観察が一般的に行われている。また、近年、多波長測光による標本像の時間的同一性と撮像装置の感度の同一性を確保する手段として、一つの撮像装置の画角を複数の領域に分割して、波長等の光学特性ごとに分離した標本の投影像を各々異なる領域に投影するように構成された撮像光学系を具備した装置が考案され、例えば、特許文献１および特許文献２に示されるように広く一般的に用いられている。特許文献１においては、図９に示されるように、撮像光学系において、標本内の点106から発散した光を、対物レンズ110で平行光線にした後、分離選択手段111によって波長等の光学特性ごとに分離し、各々の光軸を光軸変換手段112によって位置設定した後、結像レンズ113を通して撮像装置の画角内の異なる位置Ａ，Ｂに投影する構成となっている。
特許文献２においては、図１０に示されるように、撮像光学系において、標本内の点200から発散した光を、レンズ群214および216を通して視野絞り220上に中間像218として投影し、中間像218から発散した光をコリメートレンズ224で平行光線にした後、分割プリズム226によって分割し、各々の平行光線を全反射ミラー228およびフィルタ230を透過した後、結像レンズ234を通して撮像装置236の画角の異なる位置に投影する構成となっている。
特開平5−164687号公報 特表2001−525534号公報
単一の撮像装置の画角内の異なる領域に複数の投影像を投影するにあたっては、各々の投影像の焦点位置は撮像装置の撮像面において合致するように構成してあるのが通常である。上記特許文献１および特許文献２による撮像装置においては、観察光路の分割は平行光線束中で行われ、各々の平行光線束は同一の結像レンズによって集光されることから、各々の投影像の焦点位置は撮像面において合致する。一方で、生細胞研究分野における観察対象は、標本内の特定の高さの面に限定されず、例えば細胞内部と細胞膜近辺で起こる現象を同時に観察したい場合がある。対物レンズで観察した像を撮像装置の画角内の異なる位置に分割して投影する撮像光学系を使用して、単一の撮像装置で標本上の異なる高さの情報を同時に撮像することが出来れば、時間的同一性の観察、検出、測定等を実現できると共に、撮像装置を一台しか必要とせずコスト的にも優れた装置になる。ところが、特許文献１および特許文献２に示される撮像装置おいては、先に述べたように、分割された各々の投影像の焦点位置は撮像面において合致するように固定されており、焦点位置を変えることは考慮されていない。
本発明は上記のような課題に鑑みて成されたものであり、標本の異なる高さの面を撮像装置の撮像面に分割して投影し、同時に観察することを可能とした撮像光学系およびそれを用いた顕微鏡を提供することを目的とする。
上記目的を達成するために、本発明の顕微鏡の撮像光学系は、標本からの光を像面に至る観察光路に導く対物レンズと、前記対物レンズから像側に出射された平行光線束または収束光線束を撮像面で集光する収束光線束に変換する結像レンズと、前記結像レンズより像側に配置されていて前記結像レンズによって変換された収束光線束を波長等の光学特性によって分割する分割手段と、前記分割手段によって分割された各々の収束光線束の投影像を前記撮像面内の異なる位置で形成するように配置構成された全反射手段群と、前記分割手段によって分割された各々の収束光線束のうち少なくとも一方の光路長または光路長の空気換算値を増減して該収束光線束の焦点位置を移動する光路長変換手段と、を具備し、前記標本上の異なる高さの面を同時に観察することを特徴とする。
また、本発明の顕微鏡の撮像光学系は、前記光路長変換手段は、前記全反射手段群のうち少なくとも２ケ所の全反射面を一体的に移動する移動手段によって構成されることを特徴とする。
また、本発明の顕微鏡の撮像光学系は、少なくとも一つの全反射蛍光照明手段を含む複数の励起波長による同時照明が可能な励起光照明手段を具備し、全反射蛍光照明手段によって励起された蛍光は前記光路長変換手段を含む光路側または他方の光路側の何れか一方で撮像されることを特徴とする。
また、本発明の顕微鏡の撮像光学系は、前記分割手段によって分割された第一の収束光線束の投影像と第二の収束光線束の投影像との重なりを防ぐための遮光手段を具備したことを特徴とする。
また、上記目的を達成するために、本発明の顕微鏡は、標本からの光を像面に至る観察光路に導く対物レンズと、前記対物レンズから像側に出射された平行光線束または収束光線束を撮像面で集光する収束光線束に変換する結像レンズと、前記結像レンズより像側に配置されていて前記結像レンズによって変換された収束光線束を波長等の光学特性によって分割する分割手段と、前記分割手段によって分割された各々の収束光線束の投影像を前記撮像面内の異なる位置で形成するように配置構成された全反射手段群と、前記分割手段によって分割された各々の収束光線束のうち少なくとも一方の光路長または光路長の空気換算値を増減して該収束光線束の焦点位置を移動する光路長変換手段と、前記異なる位置で形成された各々の投影像を前記撮像面で撮像する撮像装置と、を具備し、前記標本上の異なる高さの面を同時に観察することを特徴とする。
上記のように本願発明によれば、単一の撮像装置で標本上の異なる高さの面を同時に観察および撮像することが可能で、コスト的に有利な装置を提供できる。
以下、本発明の実施例について図面を用いて説明する。
図１は本発明の顕微鏡の撮像光学系の第１の実施例の全体構成の概念図である。本実施例の説明で用いる記号は、他の実施例の説明においても共通に用いられる。
図１において、１は標本であり、２は標本１からの光を像面に至る観察光路０に導く対物レンズであり、３は対物レンズ２から出射された平行光線束を収束光線束に変換する結像レンズであり、４は結像レンズから出射された収束光線束を撮像装置側に反射するミラーもしくはプリズム等で構成された反射手段である。５は前記収束光線束を波長によって選択的に透過と反射に分離するダイクロイックミラーである。ここでは、ダイクロイックミラー５によって設定された特定の波長より長波長の光は透過して第１の収束光線束０１を形成し、短波長の光は反射して第２の収束光線束０２を形成する。６１および６２は、各々第１の収束光線０１および第２の収束光線束０２の中で各々の観察に供する波長帯のみを選択的に透過する特性を持った第１のフィルタおよび第２のフィルタである。７はダイクロイックミラー５を透過した第１の収束光線束０１を反射する全反射プリズムで構成された第１の全反射手段であり、８はダイクロイックミラー５を反射した第２の収束光線束０２を撮像装置９側に全反射する全反射ミラーで構成された第２の全反射手段である。１０は第１の全反射手段７を反射した第１の収束光線束０１を撮像装置９側に全反射すると共に、第２の全反射手段８を反射した第２の収束光線束０２がその脇を通過する位置に配置された第３の全反射手段である。これら第１の全反射手段７、第２の全反射手段８、および第３の全反射手段１０は、第１の収束光線束０１および第２の収束光線束０２の投影像を、撮像装置９の画角内の異なる位置で形成するように配置構成されている。１３は、撮像装置９の画角内での第１の収束光線束０１の投影像と第２の収束光線束０２の投影像の重なりを防ぐための絞りである。１１は、第１の収束光線束０１中の第１の全反射手段７と第３の全反射手段の中間に設けられた光路長変換手段である。光路長変換手段１１は、固定くさびプリズム１１ａと移動くさびプリズム１１ｂから構成され、固定くさびプリズム１１ａと移動くさびプリズム１１ｂは同一のくさび角度を有し、互いに対向する面同士が平行で且つその反対側の面は各々第１の収束光線束０１の光軸と垂直になるように配置されている。また、移動くさびプリズム１１ｂは、固定くさびプリズム１１ａに対向する面と平行な方向に移動可能に設けられている。なお、第１の全反射手段7に用いられる全反射プリズムと光路長変換手段１１に用いられるくさびプリズム１１ａおよび１１ｂの硝路長の合計は、第１の収束光線束０１および第２の収束光線束０２の焦点位置が撮像装置９において概ね合致するように設定されている。
次に、本実施例の作用、効果について説明する。図２(ａ)および２(ｂ)は、光路長変換手段１１において、移動くさびプリズム１１ｂを移動させた状態を示したものである。図２において、移動くさびプリズム１１ｂを図２(ａ)の状態から図２(ｂ)の状態へと移動させると、固定くさびプリズム１１ａと移動くさびプリズム１１ｂを通る第１の収束光線束０１の硝路長が変化する。また、移動くさびプリズム１１ｂを図２(ｂ)の状態から図２(ａ)の状態へと移動させた場合も同様である。ここで、固定くさびプリズム１１ａと移動くさびプリズム１１ｂの間隔は常に一定であり、また第１の収束光線束０１の光軸が固定くさびプリズム１１ａに入射する角度および移動くさびプリズム１１ｂから出射する角度は常に垂直であるから、第１の収束光線束０１の光軸は変化しない。光路長変換手段１１における硝路長が増大すると、光路長の空気換算値が減小するため、第１の収束光線束０１の焦点位置は撮像装置９を通り過ぎた先方に移動する。逆に、光路長変換手段１１における硝路長が減小すると、光路長の空気換算値が増大するため、第１の収束光線束０１の焦点位置は撮像装置9の手前に移動する。
次に、移動くさびプリズム１１ｂを意図的にずらした場合について図３により説明する。図３において対物レンズ２の焦点位置にある標本１上の面１ａの投影像は、収束光線束０２によって撮像装置９上に投影される。一方、移動くさびプリズム１１ｂを意図的にずらして収束光線束０１の光路長の空気換算値を変えた場合、収束光線束０１の焦点位置は移動する。一方で、例えば収束光線束０１の焦点位置を撮像装置９より距離Ｘだけ手前に移動し、この位置に標本面１ａの像が投影されるようにした場合、この状態で撮像装置９上にある像点を対物レンズ２側に逆投影すると、その光線束は点線０３で示されるような光路を経て対物レンズ２の焦点面である標本面１ａより距離Ｘ／M2（Mは対物レンズ２の倍率）だけ対物レンズに近づいた１ｂ上に投影される。言い換えれば、ダイクロイックミラー５を透過して光路長変換手段１１を通る観察光路では、対物レンズ２の焦点位置より距離Ｘ／M2だけ近づいた位置にある標本面１ｂの像が撮像装置９上に投影される。
以上のように、本実施例の構成によれば、撮像装置９の画角内の異なる位置に、標本１上の異なる高さの面の投影像を投影し、同時に観察することが可能となる。例えば、４０倍の対物レンズを用い、カバーガラスに接着した細胞の内側１μmの位置に対物レンズ２の焦点を合わせた場合、像側の光路長を0．001×402＝1．6mm長くすることで、カバーガラスの細胞接着面を投影することができる。本実施例の構成によれば、光路長変換手段１１における硝路長を4．8mm（使用するガラスの屈折率を1．5とした場合）減らすことにより実現できる。
以上、本発明の第１の実施例について述べたが、この変形例として上記の光路長変換手段１１のような連続的な補正手段の代わりに数種類の厚さの平行平面ガラス板を選択的に収束光線束中に挿入することによっても同様の成果を得られる。また、光分割手段はダイクロイックミラーに限定されず、ハーフミラーや偏光ビームスプリッタを使用してもよい。
図４は本発明の第２の実施例の全体構成の概念図であり、図１における構成要素と同じものには同一の符号を付している。これらについては、その説明を省略する。
図４において、１２は、第１の全反射手段７で反射された第１の結像光線束０１を２回全反射して第３の全反射手段１０に導くように構成した第４の全反射手段である。ここで、第４の全反射手段１２は、第１の収束光線束０１の光軸が入射側と出射側で平行になるように構成され、且つ第４の全反射手段１２自体が第１の収束光線束の入射側および出射側の光軸と平行な方向に移動可能なように設けられている。１４は、第１の結像光線束０１の光路長の空気換算値を、第２の結像光線束と合わせるための透過プリズムである。
次に、本実施例の作用、効果について説明する。図５は、第４の全反射手段１２を移動させた状態(ａ)および(ｂ)を示したものである。
図５(ａ)および(ｂ)から分かるように、第４の全反射手段１２を矢印の方向に移動させると第１の収束光線束０１の硝路長が変化する。ここで、第４の全反射手段１２の移動方向は、第１の収束光線束０１の入射側および出射側の光軸と平行であるから、第１の収束光線束０１の光軸は変化しない。図５(ａ)に示すように第４の全反射手段１２を第１の全反射手段７に近づけると、光路長が減るため、第１の収束光線束０１の焦点位置は撮像装置９を通り過ぎた先に移動する。また、図５(ｂ)に示すように、逆に、第４の全反射手段１２を第１の全反射手段７から遠ざけると、光路長が増えるため、第１の収束光線束０１の焦点位置は撮像装置９の手前に移動する。
次に第４の全反射手段１２を意図的にずらした場合について図６により説明する。図６において対物レンズ２の焦点位置にある標本１上の面１ａの投影像は、収束光線束０２によって撮像装置９上に投影される。一方、第４の全反射手段１２を意図的にずらして収束光線束０１の光路長を変えた場合、例えば第４の全反射手段１２を距離Ｘ／２だけ第１の全反射手段７から遠ざけた場合、収束光線束０１の焦点位置は撮像装置９より距離Ｘだけ手前に移動し、この位置に標本面１ａの像が投影される。一方、この状態で撮像装置９上にある像点を対物レンズ２側に逆投影すると、その光線束は点線０３で示されるような光路を経て対物レンズ２の焦点面である標本面１ａより距離Ｘ／M2（Mは対物レンズ２の倍率）だけ対物レンズに近づいた１ｂ上に投影される。言い換えれば、ダイクロイックミラー５を透過して第４の全反射手段１２を通る観察光路では、対物レンズ２の焦点位置より距離Ｘ／M2だけ近づいた位置にある標本面１ｂの像が撮像装置９上に投影される。
本実施例２の構成によれば、撮像装置９の画角内の異なる位置に、例えば、４０倍の対物レンズを用い、カバーガラスに接着した細胞の内側１μmの位置に対物レンズ２の焦点を合わせた場合、像側の光路長を0．001×402＝1．6mm長くすることで、カバーガラスの細胞接着面を投影することができる。本実施例の構成によれば、第４の全反射手段１２を0．8mm移動させることにより実現できる。
図７は本発明の第３の実施例の全体構成の概念図であり、図１乃至図６における構成要素と同じものには同一の符号を付している。これらについては、その説明を省略する。
図７において、２１ａは落射照明用の光源であり、２２ａは落射照明光の投影レンズである。２５ａは、落射照明光の特定の波長のみを透過する励起フィルタである。２３ａは励起フィルタ２５ａを透過した励起光を対物レンズ2側へ反射するダイクロイックミラーである。また、６２は第２の収束光線束０２中にあるフィルタであり、励起フィルタ２５ａを透過した波長帯の光によって励起される蛍光試薬の蛍光を選択的に透過するような特性を有するものである。２１ｂはガラスファイバの出射端等によって構成される全反射蛍光照明用の光線出射部であり、２２ｂは全反射照明光の投影レンズである。２４は標本１を挟んで対物レンズ２と対向する位置に配置されたコンデンサレンズであり、全反射照明が可能な開口数を有する。２３ｂは、全反射照明光をコンデンサレンズ２４側へ反射するミラーである。
ミラー２３ｂを反射した全反射照明光はコンデンサレンズ２４の前側焦点面上の光軸からずれた位置に集光され、コンデンサレンズ２４を出射した後、標本１に対して全反射角より大きい角度で入射し、全反射する。標本１側には数100nm以下の深さでエバネッセント光のみが侵入し、励起光として利用される。一方、第１の収束光線束０１中に設けられるフィルタ６１は、エバネッセント光の波長帯の光によって励起される蛍光試薬の蛍光を選択的に透過するような特性を有するものを用いる。
次に、本実施例の作用、効果について説明する。落射照明の励起光によって励起された蛍光のうち、対物レンズ２の焦点位置にある標本１上の面１ａから発光された蛍光の投影像は、収束光線束０２によって撮像装置９上に投影される。一方、第４の全反射手段１２をずらして収束光線束０１の光路長を減らすことで、対物レンズ２の焦点位置より遠ざかった位置、即ち、コンデンサレンズ２４に近づいた位置にある標本面１ｂの像を撮像装置９上に投影するようにする。光路長の減少量を調節して、標本面１ｂをコンデンサレンズ２４側のカバーガラス面近傍に持ってくると、コンデンサレンズから入ったエバネッセント光による励起光が届くため、標本面１ｂから発光された蛍光の投影像は、収束光線束０１によって撮像装置９上に投影される。
以上のように、本実施例３の構成によれば、落射照明と全反射照明による２波長同時励起照明により、標本内部に対物の焦点位置を合わせて落射照明による詳細形状の観察を行いつつ、光路長変換による投影像をカバーガラス近傍に合わせて全反射照明による蛍光検出を行い、これらを一つの撮像装置で同時に撮像することができる。例えば、生細胞に観察において、細胞骨格付近におけるCa2+誘導蛋白の挙動の落射蛍光による観察と、細胞接着斑における開口放出に伴う発光の全反射蛍光による検出を同時に行う等、研究者の新たな要望に応え得る撮像装置を提供できる。
以上、本発明の第３の実施例について述べたが、この変形例として図８に示すように、落射照明用光源２１ａ、投影レンズ２２ａおよびミラー２３ｂをコンデンサレンズ２の側に設け、エバネッセント光の浸みだし深さが異なる２種類の波長の全反射照明光をコンデンサレンズ２４側から入射させることもできる。また、上記の全反射照明光をコンデンサレンズ２４側ではなく、対物レンズ２側から入射するような構成にすることも可能である。このような構成によっても同様な効果を達成できる。
本発明の顕微鏡の撮像光学系の第１実施例の全体構成の概念図である。 本発明による顕微鏡の撮像光学系の第１実施例における光路長変換手段の概念図である。(ａ)は移動くさびプリズムを移動させた状態を示す図であり、(ｂ)は移動くさびプリズムを他の位置に移動させた状態を示す図である。 本発明による顕微鏡の撮像光学系の第１実施例の構成において移動くさびプリズムをずらした状態を示す図である。 本発明の顕微鏡の撮像光学系の第２の実施例にかかる全体構成の概念図である。 本発明による顕微鏡の撮像光学系の第２の実施例において全反射手段を移動させた状態(ａ)および他の状態(ｂ)を示す図である。 本発明による顕微鏡の撮像光学系の第２の実施例において全反射手段を意図的にずらした場合の状態を示す図である。 本発明の顕微鏡の撮像光学系およびその照明手段の第３実施例にかかる全体構成の概念図である。 本発明の第３実施例にかかる変形例の構成のの概念図である。 従来の撮像光学系の概念構成図である。 従来の他の撮像光学系の概念構成図である。
符号の説明
０、０１、０２、０３ 光線束
１ 標本
２ 対物レンズ
３ 結像レンズ
４ ミラー
５ ダイクロイックミラー
７、８、１０ 全反射手段
９ 撮像装置
１１ 光路長変換手段
１１ａ 固定くさびプリズム
１１ｂ 移動くさびプリズム
１３ 絞り
１４ 透過プリズム
２１ａ 落射照明用光源
２１ｂ 蛍光照明用光線射出部
２２ａ、２２ｂ 投影レンズ
２３ａ、２３ｂ ミラー
２５ａ 励起フィルター
６１、６２ フィルター
Ｘ 焦点移動距離

Claims (5)

  1. 標本からの光を像面に至る観察光路に導く対物レンズと、
    前記対物レンズから像側に出射された平行光線束または収束光線束を撮像面で集光する収束光線束に変換する結像レンズと、
    前記結像レンズより像側に配置されていて前記結像レンズによって変換された収束光線束を波長等の光学特性によって分割する分割手段と、
    前記分割手段によって分割された各々の収束光線束の投影像を前記撮像面内の異なる位置で形成するように配置構成された全反射手段群と、
    前記分割手段によって分割された各々の収束光線束のうち少なくとも一方の光路長または光路長の空気換算値を増減して該収束光線束の焦点位置を移動する光路長変換手段と、
    を具備し、
    前記標本上の異なる高さの面を同時に観察することを特徴とする顕微鏡の撮像光学系。
  2. 前記光路長変換手段は、前記全反射手段群のうち少なくとも２ケ所の全反射面を一体的に移動する移動手段によって構成されることを特徴とする請求項１に記載の顕微鏡の撮像光学系。
  3. 少なくとも一つの全反射蛍光照明手段を含む複数の励起波長による同時照明が可能な励起光照明手段を具備し、全反射蛍光照明手段によって励起された蛍光は前記光路長変換手段を含む光路側または他方の光路側の何れか一方で撮像されることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の顕微鏡の撮像光学系。
  4. 前記分割手段によって分割された第一の収束光線束の投影像と第二の収束光線束の投影像との重なりを防ぐための遮光手段を具備したことを特徴とする請求項１乃至請求項３の何れかに記載の顕微鏡の撮像光学系。
  5. 標本からの光を像面に至る観察光路に導く対物レンズと、
    前記対物レンズから像側に出射された平行光線束または収束光線束を撮像面で集光する収束光線束に変換する結像レンズと、
    前記結像レンズより像側に配置されていて前記結像レンズによって変換された収束光線束を波長等の光学特性によって分割する分割手段と、
    前記分割手段によって分割された各々の収束光線束の投影像を前記撮像面内の異なる位置で形成するように配置構成された全反射手段群と、
    前記分割手段によって分割された各々の収束光線束のうち少なくとも一方の光路長または光路長の空気換算値を増減して該収束光線束の焦点位置を移動する光路長変換手段と、
    前記異なる位置で形成された各々の投影像を前記撮像面で撮像する撮像装置と、
    を具備し、
    前記標本上の異なる高さの面を同時に観察することを特徴とする顕微鏡。
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