JP4419165B2 - 薬物耐性変異を付与することによる二次代謝物の生産性増大の方法 - Google Patents
薬物耐性変異を付与することによる二次代謝物の生産性増大の方法 Download PDFInfo
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Description
従って、本発明は、以下を提供する:
(1)2つ以上の抗生物質に対する耐性を微生物に付与することによって、この微生物における二次代謝物の生産性を増大するための方法。
(2)二次代謝物の生産性の増大を有する微生物を得るための方法であって、この方法は、抗生物質を含有する培地中での微生物の培養によって、2つ以上の抗生物質に対する耐性をこの微生物に付与する工程であって、ここでこの抗生物質の濃度が、本来のこの微生物に対するこの抗生物質のMICよりも高い工程、およびこの培地中で増殖し得るコロニーを単離する工程、を包含する、方法。
(3)上記微生物が細菌である、上記の(1)または(2)に記載の方法。
(4)上記微生物が、Streptomyces、Bacillus属、およびPseudomonas属からなる群より選択される属に属する、上記の(1)または(2)に記載の方法。
(6)上記抗生物質が、リボソームタンパク質攻撃抗生物質、リボソームRNA攻撃抗生物質、およびRNAポリメラーゼ攻撃抗生物質からなる群より選択される、上記の(1)または(2)に記載の方法。
(7)上記抗生物質が、ストレプトマイシン、ジェネティシン、ゲンタマイシン、およびリファンピシンからなる群より選択される、上記の(1)または(2)に記載の方法。
(8)上記二次代謝物が、抗生物質、酵素、および生理学的に活性な物質からなる群より選択される、上記の(1)または(2)に記載の方法。
少なくとも2つの抗生物質に対する耐性を有し、かつその本来の微生物と比べてこの二次代謝物の生産性の増大を有する微生物を、培地中で培養する工程、
二次代謝物を形成し、かつ蓄積する工程、ならびに
それからこの二次代謝物を回収する工程、
を包含する、方法。
(10)上記微生物が細菌である、上記の(9)に記載の方法。
(11)上記微生物が、Streptomyces、Bacillus属、およびPseudomonas属からなる群より選択される属に属する、上記の(9)に記載の方法。
(13)上記抗生物質が、リボソームタンパク質攻撃抗生物質、リボソームRNA攻撃抗生物質、およびRNAポリメラーゼ攻撃抗生物質からなる群より選択される、上記の(9)に記載の方法。
(14)上記抗生物質が、ストレプトマイシン、ジェネティシン、ゲンタマイシン、およびリファンピシンからなる群より選択される、上記の(9)に記載の方法。
(15)上記二次代謝物が、抗生物質、酵素、および生理学的に活性な物質からなる群より選択される、上記の(9)に記載の方法。
(17)上記微生物が細菌である、上記の(16)に記載の微生物。
(18)上記微生物が、Streptomyces、Bacillus属、およびPseudomonas属からなる群より選択される属に属する、上記の(16)に記載の微生物。
(19)上記微生物が、Streptomyces coelicolor、Streptomyces lividans、Streptomyces antibioticus、Streptomyces chattanoogensis、Bacillus subtilis、Bacillus cereus、およびPseudomonas pyrrociniaからなる群より選択される、(16)に記載の微生物。
(20)ストレプトマイシン以外の単一の抗生物質に対する耐性を微生物に付与することによって、この微生物における二次代謝物の生産性を増大するための方法。
本発明は、以下の図面を参考にして例示される:
図1は、組み合わせた薬物耐性変異を構築するためのストラテジーを示すグラフである。3種類の単一の変異、および二重変異、および1種類の3重変異を、示したとおり構築した。
図2は、Stereptomyces coelicolorの野生型および変異株における、空中の菌糸およびアクチノロージンを生成する能力を示す写真である。R4およびR3のアガープレートに胞子を接種して、30℃で6日間インキュベートした。
図3は、リファンピシン耐性変異におけるRNAポリメラーゼのβサブユニットにおけるアミノ酸変更を示すグラフである。クラスターIおよびクラスターIIは、以前に公知の耐性決定領域を表す。番号付けは、オープンリーディングフレームの出発アミノ酸(Met)から始まる。変異位置は、矢印および数で示され、そして単一の大文字が、本研究で見出された変更されたアミノ酸を示す。影付きの部分は、本発明者らの研究において新しく発見された置換を示す。
図5は、培地R3およびR4におけるアクチノロージン産生を示すグラフである。記号:黒四角、1147(野生型);□、S−1(str);●、SG−1(Str−gen);○、SGR−1(str−gen−rif)。
図6は、アクチノロージンの産生に対する、酵母抽出液、カザミノ酸、およびKH2PO4の効果を示すグラフである。種々の濃度の酵母抽出液、カザミノ酸、またはKH2PO4を補充したR4培地中で6日間、株を増殖した。記号:黒四角、1147(野生型);□、S−1(str);●、SG−1(Str−gen);○、SGR−1(str−gen−rif)。
図8は、Streptomyces coelicolorによって産生されたアクチノロージンの化学構造を示すグラフである。
図9は、薬物耐性変異を導入することによって、特定のStreptomycesの株番号618824の変異において生成された、可能性のある新しい抗菌剤を示す写真である。
図10は、耐性を付与するために用いた4つの抗生物質(ゲンタマイシン、ジェネティシン、ストレプトマイシン、およびリファンピシンを含む)の構造を示すグラフである。
アクチノロージンの特徴:ジオキサンからの細い赤い針状物、分解270℃。最大吸収(ジオキサン):560nm、523nm。ピペリジン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、フェノールに可溶性;アルコール、酢酸、アセトンにわずかに可溶性。酸性水溶液に事実上、不溶性;アルカリ水溶液に溶けて、明青色を呈する。
(ゲンタマイシン:)
構成:この抗生物質複合体は以下の、3つの成分からなる:ゲンタマイシンC1、ゲンタマイシンC2、およびゲンタマイシンC1a。図10に示すとおり、それらは類似の構造を有する。
作用機序:リボソーム16S RNA、または他のリボソームタンパク質(L6タンパク質、または他の未知のタンパク質)の上で作用し、リボソームにおけるタンパク質合成の阻害を生じる。
クラス:アミノグリコシド抗生物質に属する。
構成:単一の成分、およびその構造は、図10に示されるとおりである。
作用機序:16S リボソーム RNA、または未知のタンパク質上で作用することによって、タンパク質合成を阻害する。
クラス:アミノグリコシド抗生物質に属する。
構成:単一の成分、および構造は、図10に示されるとおりであり、ここで、ゲンタマイシンおよびジェネティシンの成分および構造に大きな相違が存在する。
作用機序:リボソーム S12タンパク質、および/または16S RNA上で作用することによって、タンパク質合成を阻害する。
クラス:アミノグリコシド抗生物質に属する。
構成:単一の成分、および構造は、図10に示されるとおりであり。
作用機序:RNAポリメラーゼのβサブユニット上で作用することによって、RNA合成を阻害した。
クラス:アンサマイシン抗生物質に属する。
b:GYMアガー上でのインキュベーションの2日後に決定した。
c:出発株よりも抗生物質を多く産生する変異体。カッコ内の数は、以下である:抗生物質をより多く産生する変異体の数/試験した変異体の数。
c.GYMアガー上での培養の4日後に決定した。
d.STR、GEN、RIF、およびGNEはそれぞれ、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、リファンピシン、およびジェネティシンを表す。
e.−、野生型rpsL遺伝子。
f.rpsL遺伝子またはrpoB遺伝子内では、変異体は検出されなかった。
スクリーニングの結果を、図9および表3に示す。
*2.GENは、ゲンタマイシンを示し、そしてRIFは、リファンピシンを示す。
*3.WB2045は、Bacillus cereusのNo.2045(=FERM BP−1791)(USP4,950,605)によって産生される、抗菌活性を有する物質である。
*4.1.7×NG培地[Bacillus subtilisによる抗生物質産生のために開発された培地であって、(1リットルあたり)17gの栄養ブロス(Difco)、17gのグルコース、3.4gのNaCl、8.5mgのCuSO4・5H2O、12.75mgのFeSO4・7H2O、6.12mgのMnSO4・5H2O、25.5mgのCaCl2・H2O、および15.3mgのZnSO4・7H2Oを含んだ(NaOHを用いてpH7.2に調整した)]を用いるアガープレート上の従来のペーパーディスク拡散アッセイ(Toyo Roshi;厚さ9mmφ)によって、30℃で48時間、Bacillus subtilis 6633株に対するWB2045の抗菌活性を決定した。
*2.30℃で5日間の培養後、R4培地における液体培養の上清の633nmでのOD値をアッセイすることによって、アクチノロージン(Act)生産を決定した。
Claims (5)
- 生理活性物質および抗生物質からなる群より選択される二次代謝物、または、プロテアーゼ、アミラーゼ、アシラーゼ、アデノシンデアミナーゼおよびデメチラーゼからなる群より選択される酵素の生産性が増大したストレプトマイセス(Streptomyces)属、バシラス(Bacillus)属またはシュードモナス(Pseudomonas)属に属する細菌を得る方法であって、該方法は、以下の工程:
リファンピシン、ゲンタマイシンおよびジェネティシンから選択される少なくとも1種とストレプトマイシンとを含有する培地中でストレプトマイセス(Streptomyces)属、バシラス(Bacillus)属またはシュードモナス(Pseudomonas)属に属する細菌を培養することによって、リファンピシン、ゲンタマイシンおよびジェネティシンから選択される少なくとも1種とストレプトマイシンとの両方に対する耐性を付与する工程であって、ここで、該培地中の各抗生物質の濃度は、該細菌に対する各抗生物質の最小阻止濃度よりも高い、工程;および
該培地中で増殖する該細菌を単離する工程、
を包含する、方法。 - 前記ストレプトマイセス(Streptomyces)属が、ストレプトマイセス・セリカラー(Streptomyces coelicolor)、ストレプトマイセス・リビダンス(Streptomyces lividans)、ストレプトマイセス・アンチバイオティカス(Streptomyces antibioticus)またはストレプトマイセス・チャタノジェネシス(Streptomyces chattanoogensis)である請求項1に記載の方法。
- 前記バシラス(Bacillus)属が、バシラス・サブチリス(Bacillus subtilis)またはバシラス・セレウス(Bacillus cereus)である請求項1に記載の方法。
- 前記シュードモナス(Pseudomonas)属が、シュードモナス・ピロシニア(Pseudomonas pyrrocinia)である請求項1に記載の方法。
- 生理活性物質および抗生物質からなる群より選択される二次代謝物、または、プロテアーゼ、アミラーゼ、アシラーゼ、アデノシンデアミナーゼおよびデメチラーゼからなる群より選択される酵素を生成するための方法であって、以下の工程:
請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法でストレプトマイセス(Streptomyces)属、バシラス(Bacillus)属またはシュードモナス(Pseudomonas)属に属する細菌を得て、該細菌を培養する工程、
生理活性物質および抗生物質からなる群より選択される二次代謝物、または、プロテアーゼ、アミラーゼ、アシラーゼ、アデノシンデアミナーゼおよびデメチラーゼからなる群より選択される酵素を形成し、かつ蓄積する工程、ならびに
それから該生理活性物質および抗生物質からなる群より選択される二次代謝物、または、プロテアーゼ、アミラーゼ、アシラーゼ、アデノシンデアミナーゼおよびデメチラーゼからなる群より選択される酵素を回収する工程、
を包含する、方法。
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