JP4415145B2 - p53タンパク質の活性化を調節する薬物のスクリーニング法 - Google Patents
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Description
(a1)GADD34遺伝子を発現しうる細胞を、候補薬物の存在下において、該候補薬物の不在下で前記細胞がGADD34遺伝子を発現しうる条件下にて培養する工程;および
(b1)工程(a1)により得られる細胞において、GADD34遺伝子発現の促進または抑制を検出する工程。
(a2)GADD34遺伝子およびPP1α遺伝子を発現しうる細胞を、候補薬物の存在下において、該候補薬物の不在下で前記細胞がGADD34遺伝子およびPP1α遺伝子を発現しうる条件下にて培養する工程、ならびに、
(b2)工程(a2)により得られる細胞において、GADD34タンパク質とPP1αとの相互作用の促進または抑制を検出する工程。
1.材料および方法
細胞培養および試薬
NIH3T3細胞は、American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD)から入手し、10%ウシ胎児血清(GIBCO)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM, Sigma)中、5%CO2を含む加湿雰囲気下、37℃で維持した。SOAS−2細胞は、理研バイオリソースセンター(RIKEN BioResource Center, Ibaraki, Japan)から購入し、10%ウシ胎児血清(GIBCO)を補充したマッコイ5A培地(GIBCO)中で増殖させた。UV−C照射のために、細胞をPBSで洗浄し、その後、FUNA UV LINKER Fs1500(Funakoshi, Tokyo, Japan)を用いて培地の不在下で照射した。MMSおよびテトラサイクリンは、Sigma-Aldrichから購入した。シクロヘキサミドはCalbiochemから購入した。
GADD34 tet−off誘導可能細胞系を樹立するため、NIH3T3細胞を、tTA調節タンパク質を発現するpTet−offプラスミド(Clontech, Palo Alto, CA)でトランスフェクトし、G418耐性コロニーを選択して増殖させた。次いで、tTAタンパク質を発現する細胞を、pTREプラスミド(Clontech)のBamHI/HindIII部位中にGADD34遺伝子を挿入することにより調製したpTRE−GADD34構築物でさらにトランスフェクトした。pTRE−GADD34プラスミドでトランスフェクトされた細胞を21日間のハイグロマイシン(200μg/ml)処理により選択し、各ハイグロマイシン耐性コロニーを別々に回収し、それぞれについてtet−offシステムによるGADD34タンパク質発現の検出を行なった。GADD34誘導可能細胞を、10%ウシ胎児血清(GIBCO)を補充したDMEM培地中において、2μg/mlのテトラサイクリンの存在下で増殖させた。GADD34タンパク質の発現を誘導するため、テトラサイクリンを含有するDMEM培地を除去し、プレートをPBSで2回洗浄し、その後、テトラサイクリンを含まない新鮮なDMEM培地を細胞に加えた。GADD34タンパク質の誘導について調べるために、所定の時点で細胞を回収した。
SOAS−2細胞を6ウェルプレート上に1×106細胞/ウェルの密度で播種した。この細胞を、Effectene Transfection Reagent(Qiagen)を用いて、100ng/ウェルのプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、細胞をPBSで2回洗浄し、溶解緩衝液で溶解した。
GADD34欠損マウスおよび野生型マウスに由来するマウス胚繊維芽細胞(MEF)を、14.5日齢の胎児から調製した。全ての培養物は、10%ウシ胎児血清(FCS)を補充したダルベッコ改変必須培地(Sigma)中で維持した。予備培養および実験のために、細胞を2×106細胞/10cmプレートの密度で播種した。
溶解緩衝液(20mM HEPES(pH7.5)、1%Triton X−100、150mM NaCl、10%グリセロール、および1mM EDTA、ならびに1mMフェニルメタンスルホニルフルオリド(PMSF)、1μg/mlロイペプチン、および1μg/mlペプスタチン)を用いて、細胞を皿から取り出した。得られた抽出物を、12,000×g、4℃で15分間遠心分離し、上清をサンプリング緩衝液(100mM Tris−HCl(pH6.8)、4%SDS、20%グリセロール、150mM 2−メルカプトエタノール、および1%ブロモフェノールブルー)中で5分間煮沸した。約20μgのタンパク質を9%または12%のSDS/PAGE上で電気泳動し、ニトロセルロース膜に転写した。得られたブロットを、5%スキムミルクを含有するPBS−T(0.05%Tween20を補充した1×PBS)で1時間ブロッキングし、一次抗体とともに室温で6時間または4℃で一晩インキュベートし、3回洗浄した後に、HRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)に結合した二次抗体とともにインキュベートした。タンパク質は、化学発光ECLキット(Amersham)により、次の抗体のいずれかを用いて検出した:抗ホスホp53(Ser15)抗体(#9284, Cell Signaling Technology)、抗ホスホeIF2α(Ser52)抗体(44-728, BIOSOURCE international)、抗eIF2α抗体(sc7629, C-20)、抗PP1α抗体(sc-6104, C-19)、および抗GADD34抗体(sc-825, C-19, Santa Cruz)。
既知の方法に従って、細胞質抽出物および核抽出物を得た。概説すると、細胞をトリプシン処理し、PBSですすぎ、プロテアーゼ阻害剤(1μg/mlロイペプチン、1μg/mlアプロチニン、および0.5mMフェニルメタンスルホニルフルオリド)を補充した200μlの緩衝液A(10mM HEPES(pH7.9)、10mM KCl、1.5mM MgCl2)中において、氷上でインキュベートした。細胞質抽出物を得るため、2.5%Nonidet P−40 plusプロテアーゼ阻害剤を含有する25μlの緩衝液Aの添加によって細胞を溶解した。核をペレット化(3,500rpm、4℃、4分間)し、上清を回収し、この上清を5回凍結融解した後に遠心分離(3,500rpm、4℃、10分間)した。核画分を調製するため、プロテアーゼ阻害剤を補充した抽出緩衝液C(20mM HEPES(pH7.9)、0.45M NaCl、1mM EDTA)中で核ペレットをインキュベートし、遠心分離(14,000rpm、4℃、10分間)を行ない、上清を回収した。全細胞溶解物は、上述のように調製した。
細胞を、ポリ−D−リシンでコーティングされたガラスカバー片上に播種した。24時間後、MMSを最終濃度80μg/mlで添加し、カバー片を8時間インキュベートした。細胞をPBSで洗浄し、4%(w/v)パラホルムアルデヒドを含有するPBS中で10分間固定化し、0.2%(w/v)Triton X−100を含有するPBS中で5分間浸透化した。次いで、得られた細胞を、2%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)を含有するPBSを用いて、1時間ブロッキングした。免疫検出は、一次抗体(1:100希釈)と、フルオレセイン結合型二次抗体および/またはローダミン結合型二次抗体(1:200希釈)とを用いて行なった。タンパク質は、次の抗体のうちの一つまたは二つを用いて検出した:抗myc抗体(Invitrogen)、抗PP1α抗体(sc-6104, C-19)、ウシ抗ヤギ抗体ローダミン結合体(sc-2349, Santa Cruz)、およびウサギ抗マウス抗体フルオレセイン結合体(DAKO)。2μg/mlのヨウ化プロピディウム(PI)染色剤を用いて核(DNA)を染色し、カバー片をガラススライド上に置いた。
データは平均値±標準偏差として示した。グループ間の統計学的有意差は、two-way repeated-measures ANOVAによって評価した。p<0.05の場合に、有意差があるものとした。
DNA損傷により誘導されるp53リン酸化のGADD34による増強
p53とGADD34の関連を分析するため、SOAS−2細胞(p53を有さない細胞系)を、2μg/mlまたは0.2μg/mlのテトラサイクリンを補充したDMEM培地中で培養し、変異型p53(143A)の発現プラスミドでトランスフェクトし、さらに、pTRE−GADD34ベクターおよびpTet−offベクターで同時トランスフェクトした。トランスフェクションの12時間後、テトラサイクリンを除いた。トランスフェクションの36時間後に、細胞を冷却したPBSで2回洗浄した。全細胞抽出物を調製し、p53タンパク質のリン酸化のレベルをイムノブロッティングによって決定した。その結果を図1に示す。図1によれば、GADD34の過剰発現により、用量依存的にp53リン酸化が促進されることが示される。
GADD34がp53リン酸化を促進する際の作用機序を明らかにするため、GADD34に結合しうるPP1αの挙動を調べた。
既報の研究により、化学的PP1阻害剤であるオカダ酸はp53のリン酸化の状態に影響を与えるが、通常の条件下ではp53のセリン18は変化しないことが示されている(Merrick B.A. et al., Biochemistry 40, 4053-4066, 2001)。しかし、ストレス条件下においてp53のリン酸化に変化が見られるか否かについては、これまでに報告されていない。p53リン酸化とPP1αとの関連を調べるため、オカダ酸の存在下および不在下でのp53のセリン18におけるリン酸化の量を比較した。まず、NIH3T3細胞を、60mm培養皿中に1×106細胞/ウェルの密度で播種した。24時間増殖させた後、これらの細胞をUVC(50J/m2)に曝し、照射後4時間の時点で、シクロヘキサミド(10μg/ml)を添加して新たなp53タンパク質合成を阻害した。シクロヘキサミド処理の後、所定の時点において細胞を回収し、セリン18においてリン酸化されたp53のレベルを決定した。その結果を図5に示す。図5によれば、NIH3T3細胞において、UV処理によりp53リン酸化が誘導されることが示される。UV処理によるp53リン酸化のレベルは、オカダ酸処理によって明らかに促進されていた。また、興味深いことに、オカダ酸で処理した場合には、シクロヘキサミド処理を行なった後においてもp53リン酸化のレベルが減少しなかった(例えば、シクロヘキサミド処理後15分および30分の時点でのデータを参照のこと)。
GADD34が細胞増殖を抑制するか否かを調べるため、GADD34タンパク質の発現がテトラサイクリン−誘導システムによって制御されるテトラサイクリン調節GADD34誘導可能細胞系を樹立した。この実験では、上述の方法に従って樹立したNIH3T3−GADD34誘導可能細胞系を用いた。
Claims (13)
- 哺乳動物細胞内におけるp53タンパク質の活性化を促進または抑制する薬物を同定する方法であって、
(a)GADD34遺伝子を発現する細胞を、候補薬物の存在下において、該候補薬物の不在下で前記細胞がGADD34遺伝子を発現する条件下にて培養する工程、および、
(b)工程(a)により得られる細胞において、GADD34遺伝子発現の促進または抑制を検出する工程
を含んでなり、
工程(b)においてGADD34遺伝子発現の促進が検出された場合には、その候補薬物がp53タンパク質の活性化を促進する薬物として同定され、工程(b)においてGADD34遺伝子発現の抑制が検出された場合には、その候補薬物がp53タンパク質の活性化を抑制する薬物として同定される、方法。 - 前記工程(a)において用いられる細胞が哺乳動物細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(b)が、細胞内のGADD34のmRNA量を測定することを含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(b)が、細胞内のGADD34タンパク質の量を測定することを含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 前記工程(b)が、前記工程(a)により得られる細胞におけるGADD34遺伝子発現の強度と、候補化合物の不在下で培養された対照細胞におけるGADD34遺伝子発現の強度とを比較することを含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 哺乳動物細胞内におけるp53タンパク質の活性化を促進または抑制する薬物を同定する方法であって、
(a)GADD34遺伝子およびPP1α遺伝子を発現する細胞を、候補薬物の存在下において、該候補薬物の不在下で前記細胞がGADD34遺伝子およびPP1α遺伝子を発現する条件下にて培養する工程、ならびに、
(b)工程(a)により得られる細胞において、GADD34タンパク質とPP1αとの相互作用の促進または抑制を検出する工程
を含んでなり、
工程(b)において、前記相互作用の促進が検出された場合には、その候補薬物がp53タンパク質の活性化を促進する薬物として同定され、工程(b)において、前記相互作用の抑制が検出された場合には、その候補薬物がp53タンパク質の活性化を抑制する薬物として同定される、方法。 - 前記工程(a)において用いられる細胞が哺乳動物細胞である、請求項6に記載の方法。
- 前記工程(b)が、核内のPP1αタンパク質の量を測定することを含んでなる、請求項6に記載の方法。
- 核内のPP1αタンパク質量の減少が前記相互作用の促進を示すものであり、核内のPP1αタンパク質量の増加が前記相互作用の抑制を示すものである、請求項8に記載の方法。
- 前記工程(b)が、細胞質中のPP1αタンパク質の量を測定することを含んでなる、請求項6に記載の方法。
- 細胞質中のPP1αタンパク質量の増加が前記相互作用の促進を示すものであり、細胞質中のPP1αタンパク質量の減少が前記相互作用の抑制を示すものである、請求項10に記載の方法。
- 前記工程(b)が、前記工程(a)により得られる細胞における前記相互作用の強度と、候補化合物の不在下で培養された対照細胞における前記相互作用の強度とを比較することを含んでなる、請求項6に記載の方法。
- 哺乳動物細胞内におけるp53タンパク質の活性化を促進する方法であって、目的とする哺乳動物細胞を、GADD34遺伝子発現促進剤を用いて処理する工程を含んでなり、該GADD34遺伝子発現促進剤が、GADD34をコードするDNAを含んでなる発現ベクターである、方法。
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