JP2005304470A - アポトーシスを促進又は抑制する化合物をスクリーニングする方法、アポトーシス促進剤及びアポトーシス抑制剤 - Google Patents

Abstract

【課題】 ｐ７３の活性化の分子メカニズムを解明し、そして、そのメカニズムから導き出されたアポトーシスを促進又は抑制する化合物のスクリーニング方法を提供する。
【解決手段】 ｐ７３とＩＫＫ−αとの相互作用を増強する化合物を、アポトーシスを促進する化合物と判定する判定工程を備える、アポトーシスを促進する化合物のスクリーニング方法。
【選択図】 図３４

Description

本発明は、アポトーシスを促進又は抑制する化合物をスクリーニングする方法、アポトーシス促進剤及びアポトーシス抑制剤に関する。

アポトーシス促進性のｐ５３やそのホモログであるｐ７３とは対照的に、ＮＦ−κＢシグナル伝達経路は、ＤＮＡ損傷のような様々なアポトーシス促進性の刺激に対する細胞保護において重要な役割を演じている。通常の条件下では、ＮＦ−κＢはｐ５０サブユニット及びｐ６５（ＲｅｌＡ）サブユニットから構成されるヘテロダイマー複合体として存在しており、ＩκＢ−αやＩκＢ−βなどの抑制性タンパク質との相互作用により、転写的に不活性の状態にある。ＩκＢはＮＦ−κＢの核移行シグナルをマスクしており、それによりＮＦ−κＢの核移行を妨げている。

ある刺激があると、ＮＦ−κＢシグナル伝達経路の上流のレギュレーターであるＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）複合体は、ＩκＢのＮ末端のシグナル応答ドメインにある特定のセリン残基を急速にリン酸化し、ＩκＢはプロテアソーム依存的にポリユビキチン化されて分解される。その結果、ＩκＢにマスクされていたＮＦ−κＢの核移行シグナルが露出され、ＮＦ−κＢは核に移行し活性化される。ＩＫＫ複合体は、２つの触媒サブユニットであるＩＫＫ−α（ＩＫＫ−１とも呼ばれる）及びＩＫＫ−β（ＩＫＫ−２とも呼ばれる）、並びに足場機能を有する１つの調節サブユニットであるＩＫＫ−γ（ＮＥＭＯとも呼ばれる）から構成される。

ＮＦ−κＢとｐ５３又はｐ７３との関係については、以下のようなことが知られている。一次抗原刺激に応答して、ＮＦ−κＢは、Ｔ細胞におけるアポトーシス促進性のｐ７３のアップレギュレーションを制限し、Ｔ細胞の生存を促進するが、ＮＦ−κＢの活性化がｐ７３の発現を阻害している正確な分子の基盤は分かっていない（非特許文献１）。抗癌剤であるドキソルビシンに応答して、ＩＫＫ−αではなくＩＫＫ−βがＮＦ−κＢを活性化し、それによって、タンパク質レベルのｐ５３の蓄積が阻害される（非特許文献２）。これらの結果は、ＮＦ−κＢの活性化はｐ５３、ｐ７３又はその双方により仲介されるアポトーシスを抑制するかもしれないということを示唆している。また、これと一致して、ｐ５３とＮＦ−κＢとの間に双方向性の抑制が存在することが示されている（非特許文献３）。

対照的に、ＮＦ−κＢはｐ５３の補因子として働き、ｐ５３依存性のアポトーシスに必要であるということが報告されている（非特許文献４）。さらに、ｐ５３はＮＦ−κＢの直接の転写標的であることや、ｐ５３活性化シグナルはＮＦ−κＢの活性化の阻害により部分的にブロックされることが示されている（非特許文献５〜７）。

Ｕボックス型ユビキチンプロテインリガーゼファミリーのメンバーであるＵＦＤ２ａ（ubiquitin fusion degradation protein-2a）は、最初にＥ４ユビキチン化因子として同定された。ＵＦＤ２ａはポリユビチキン鎖の伸長を触媒して、ポリユビキチン化された基質タンパク質をプロテアソームによる分解の標的とさせる（非特許文献８及び９）。Ｕボックスの予想三次元構造は、ＲＩＮＧフィンガーのそれに似ており、ＵＦＤ２ａはＥ３ユビキチンプロテインリガーゼとしても作用する（非特許文献９）。最近、ヒトＵＦＤ２ａ遺伝子が、神経芽細胞腫及び他の癌の候補腫瘍抑制遺伝子の遺伝子座である1p36.2-p36.3に位置づけられることが示された（非特許文献１０）。しかしながら、本発明者らが変異解析を行ったところ、神経芽細胞腫及び神経芽細胞腫由来株化細胞においてＵＦＤ２ａ遺伝子はめったに変異を起こさないことが示唆された。また、酵母においては、Ｕｆｄ２はストレス条件下での細胞生存に関係している（非特許文献８）。アポトーシス刺激により、ＵＦＤ２ａはカスパーゼ６又はグランザイムＢによって切断され、その酵素活性は顕著に損なわれる（非特許文献１１）。

Wan, Y. Y. et al., The survival of antigen-stimulated T cells requires NFkB-mediated inhibition of p73 expression. Immunity 18: 331-342 (2003). Tergaonkar, V. et al., p53 stabilization is decreased upon NFkB activation: a role for NFkB in acquisition of resistance to chemotherapy. Cancer Cell 1: 493-503 (2002). Webster, G. A. et al, Transcriptional crosstalk between NF-kB and p53. Mol. Cell. Biol. 19: 3485-3495 (1999). Ryan, K. M. et al., Role of NF-kB in p53-mediated programmed cell death. Nature 404: 892-897 (2000). Wu, H. et al, NF-kB activation of p53. A potential mechanism for suppressing cell growth in response to stress. J. Biol. Chem. 269: 20067-20074 (1994). Sun, X. et al., Identification of a novel p53 promoter element involved in genotoxic stress-inducible p53 gene expression. Mol. Cell. Biol. 15: 4489-4496 (1995). Hellin, A. C. et al., Nuclear factor-kB-dependent regulation of p53 gene expression induced by daunomycin genotoxic drug. Oncogene 16: 1187-1195 (1998). Kogl, M. et al., Cell 96:635-644 (1999). Hatakeyama, H. et al., J. Biol. Chem. 276: 33111-33120 (2001). Ohira, M. et al., Oncogene 19: 4302-4307 (2000). Mahoney, J. A. et al., Biochem. J. 351: 587-595 (2002).

しかしながら、ＮＦ−κＢシグナル伝達経路と、ｐ５３、ｐ７３又はその双方によって仲介されるアポトーシスとの間のあり得る関係の機能的な重要性については、いまだに確立されていない。ｐ７３のアポトーシス誘導活性をそのメカニズムを含めて明らかにし、それを増強又は抑制する化合物を見出すことは、癌又は神経変性疾患の治療・予防薬の開発につながる。

したがって、本発明は、ｐ７３の活性化の分子メカニズムを解明することを目的の一つとした。そして、そのメカニズムから導き出されたアポトーシスを促進又は抑制する化合物のスクリーニング方法を提供することも目的とする。

本発明者らは、シスプラチン処理により、ｐ７３及びｐ５３の誘導と関連してＩＫＫ−αが核内で顕著に蓄積することを見出した。また、ＩＫＫ−αを発現させると、ユビキチン化を阻害することによりｐ７３の半減期は上昇し、それによって、トランス活性化及びアポトーシス促進活性が増強することを見出した。さらに、免疫沈降及び免疫染色の実験から、ｐ７３はＩＫＫ−αと直接会合しており、核マトリックスにおいて両者は共存していることを見出した。以上の知見等から、本発明者らは、ＩＫＫ−αはｐ７３と直接相互作用することによりｐ７３を安定化し、ｐ７３が誘導するアポトーシスを促進するという分子メカニズムを明らかにし、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、ｐ７３とＩＫＫ−αとの相互作用を増強する化合物を、アポトーシスを促進する化合物と判定する判定工程を備える、アポトーシスを促進する化合物のスクリーニング方法を提供する。本スクリーニング方法は、ｐ７３とＩＫＫ−αとが直接相互作用するという分子メカニズムを応用したものである。かかる分子メカニズムは本発明者らが新たに見出したものであり、したがって、今までとは作用機序が全く異なるアポトーシス促進性化合物を本スクリーニング方法により得ることが可能である。かかる化合物は、アポトーシス促進剤や抗癌剤として応用することが可能である。

本発明は、また、被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、ｐ７３及びＩＫＫ−αを発現した細胞を培養する培養工程と、培養したそれぞれの細胞における、ｐ７３とＩＫＫ−αとの相互作用を測定する測定工程と、被検化合物の存在下において培養した細胞におけるｐ７３とＩＫＫ−αとの相互作用が、被検化合物の非存在下において培養した細胞におけるｐ７３とＩＫＫ−αとの相互作用よりも強い場合に、当該被検化合物をアポトーシスを促進する化合物と判定する判定工程と、を備える、アポトーシスを促進する化合物のスクリーニング方法を提供する。本スクリーニング方法により、今までとは作用機序が全く異なるアポトーシス促進性化合物を得ることが可能であり、また、かかる化合物は、アポトーシス促進剤や抗癌剤として応用することが可能である。

本発明は、また、ｐ７３とＩＫＫ−αとの相互作用を阻害する化合物を、アポトーシスを抑制する化合物と判定する判定工程を備える、アポトーシスを抑制する化合物のスクリーニング方法を提供する。本スクリーニング方法は、ｐ７３とＩＫＫ−αとが直接相互作用するという分子メカニズムを応用したものである。かかる分子メカニズムは本発明者らが新たに見出したものであり、したがって、今までとは作用機序が全く異なる抗アポトーシス性化合物を本スクリーニング方法により得ることが可能である。かかる化合物は、アポトーシス抑制剤や神経変性疾患の治療薬として応用することが可能である。

本発明は、また、被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、ｐ７３及びＩＫＫ−αを発現した細胞を培養する培養工程と、培養したそれぞれの細胞における、ｐ７３とＩＫＫ−αとの相互作用を測定する測定工程と、被検化合物の存在下において培養した細胞におけるｐ７３とＩＫＫ−αとの相互作用が、被検化合物の非存在下において培養した細胞におけるｐ７３とＩＫＫ−αとの相互作用よりも弱い場合に、当該被検化合物をアポトーシスを抑制する化合物と判定する判定工程と、を備える、アポトーシスを抑制する化合物のスクリーニング方法を提供する。本スクリーニング方法により、今までとは作用機序が全く異なる抗アポトーシス性化合物を得ることが可能である。かかる化合物は、アポトーシス抑制剤や神経変性疾患の治療薬として応用することが可能である。

本発明は、また、配列番号２４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質からなるアポトーシス促進剤及び配列番号２４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸からなるアポトーシス促進剤を提供する。配列番号２４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は、ＩＫＫ−αタンパク質である。上述したように、本発明者らは、ＩＫＫ−αはｐ７３と直接相互作用することによりｐ７３を安定化し、ｐ７３が誘導するアポトーシスを促進するという分子メカニズムを明らかにした。このような分子メカニズムは、抗アポトーシス性の経路であるＮＦ−κＢシグナル伝達経路におけるＩＫＫ−αの役割からは、全く予想に反する。すなわち、ｐ７３が仲介するアポトーシスにおいて、ＩＫＫ−αは、抗アポトーシス的な役割ではなく、アポトーシス促進的な役割を演じていることになる。したがって、ＩＫＫ−αタンパク質やタンパク質をコードする核酸は、アポトーシス促進剤として用いることが可能である。

本発明は、また、配列番号２５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質からなるアポトーシス抑制剤及び配列番号２５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸からなるアポトーシス抑制剤を提供する。配列番号２５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は、ＩＫＫ−αの４４番目のリジン残基がアラニン残基に置換されたＩＫＫ−α（Ｋ４４Ａ）タンパク質である。本発明者らは、ＩＫＫ−α（Ｋ４４Ａ）はｐ７３と結合するもののｐ７３を安定化せず、ｐ７３が誘導するアポトーシスを抑制することを明らかにした。すなわち、ｐ７３が仲介するアポトーシスにおいて、ＩＫＫ−α（Ｋ４４Ａ）は、抗アポトーシス的に機能し、したがって、ＩＫＫ−α（Ｋ４４Ａ）タンパク質やタンパク質をコードする核酸は、アポトーシス抑制剤として用いることが可能である。

本発明は、さらに、配列番号２６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質からなるアポトーシス抑制剤及び配列番号２６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸からなるアポトーシス抑制剤を提供する。配列番号２６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は、ＵＦＤ２ａタンパク質である。本発明者らは、ＵＦＤ２ａがｐ７３を分解することにより、ｐ７３のアポトーシス活性を低下させることを明らかにした。すなわち、ｐ７３が仲介するアポトーシスにおいて、ＵＦＤ２ａは抗アポトーシス的に機能する。したがって、ＵＦＤ２ａタンパク質やそれをコードする核酸は、アポトーシス抑制剤として用いることが可能である。

本発明のスクリーニング方法によれば、今までとは作用機序が全く異なるアポトーシス促進性化合物及び抗アポトーシス性化合物を得ることが可能である。このような化合物を見出すことで、癌又は神経変性疾患の治療・予防に有効な薬を開発することが可能となる。

以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。

（アポトーシスを促進する化合物のスクリーニング方法）
本発明のアポトーシスを促進する化合物のスクリーニング方法は、ｐ７３とＩＫＫ−αとの相互作用を増強する化合物を、アポトーシスを促進する化合物と判定する判定工程を備える。本スクリーニング方法はｐ７３とＩＫＫ−αとが直接相互作用するという新たな分子メカニズムに基づいており、今までとは作用機序が全く異なるアポトーシス促進性化合物が得られる。

具体的なスクリーニング方法は、当業者にとって公知のタンパク質間相互作用を測定する系が利用可能であり、例えば、酵母ツーハイブリッド法やＰＣＡ法（プロテイン・フラグメント・コンプリメンテーション・アッセイ）が挙げられる。酵母ツーハイブリッド法及びＰＣＡ法の概要を以下に説明する。

まず、酵母ツーハイブリッド法を説明する。酵母Ｇａｌ４は、Ｎ末端側のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）とＣ末端側の転写活性化ドメイン（ＡＤ）とからなる転写制御因子である。両ドメインは基本的には自律的に機能し、ＤＢＤは単独でＤＮＡに結合できるが転写の活性化は起こせない。ＡＤはその反対である。この性質を応用して開発されたのが酵母ツーハイブリッド法である。つまり、Ｇａｌ４のＤＢＤに目的のタンパク質Ｐを融合したタンパク質（ベイト）と、Ｇａｌ４のＡＤに別のタンパク質Ｑを融合したタンパク質（プレイ）を酵母細胞に導入した場合、ＰとＱとが核内で相互作用すれば、酵母細胞内で転写制御複合体が再構成され、Ｇａｌ４結合部位依存的に転写が活性化されることになる。この活性をレポーター遺伝子を用いて検出することにより、タンパク質Ｐ及びＱの間の相互作用が容易に評価できる。レポーター遺伝子としては、例えば、ＨＩＳ３、ｌａｃＺ、ＵＲＡ３などを利用することができる。また、酵母Ｇａｌ４以外にも、ＳＲＦやＬｅｘＡを用いた系も利用することが可能である。

酵母ツーハイブリッド法において、タンパク質Ｐとしてｐ７３を、タンパク質ＱとしてＩＫＫ−αを用いた系（又はその逆の系でも構わない）によれば、本発明のスクリーニング方法を行うことが可能である。すなわち、ベイトとしてｐ７３又はＩＫＫ−αの一方を、プレイとしてｐ７３又はＩＫＫ−αの他方を酵母に発現させ、被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下で当該酵母を培養し、培養した酵母のレポーター遺伝子の転写活性（ｐ７３とＩＫＫ−αとの相互作用の強さを表す）を測定し、被検化合物存在下の転写活性が被検化合物非存在下の転写活性よりも上昇している場合、被検化合物はアポトーシスを促進する化合物であると判定できる。

次に、ＰＣＡ法について説明する。ＰＣＡ法では、一つの機能タンパク質Ａ（酵素、転写因子など）を二つの断片Ａ１及びＡ２に分割し、それぞれを目的タンパク質Ｐ及びＱと融合し、融合タンパク質Ａ１−Ｐ及びＡ２−Ｑを作製する。目的タンパク質Ｐ及びＱが結合すると、機能タンパク質Ａの機能が回復し、その活性を検出することで、Ｐ及びＱの相互作用を判定する、という原理に基づいている。機能タンパク質としては、例えばβ−ラクタマーゼを利用することができる。以下では、β−ラクタマーゼを利用したＰＣＡ法について説明する。

β−ラクタマーゼは細菌由来のβ−ラクタム環切断酵素である。Ｎ末端側のα１９７断片（２５〜１９７残基）とＣ末端側のω１９８断片（１９８〜２８８残基）に分割し、それぞれを目的タンパク質との融合タンパク質として発現すると、その両者が結合する場合にのみβ−ラクタマーゼタンパク質の立体構造が回復し、活性を示す。β−ラクタマーゼ活性は細胞透過性の蛍光プローブＣＣＦ２／ＡＭ（ＣＣＦ２アセトキシメチルエステル）により検出される。ＣＣＦ２／ＡＭは、セファロスポリン分子の両末端に２種類の異なる蛍光物質クマリン及びフルオレセインが結合した構造をしており、前者をドナー、後者をアクセプターとする分子内ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）を呈する。すなわち、クマリンを４０９ｎｍの光で励起すると、フルオレセイン由来の５２０ｎｍの蛍光を発することになる。しかし、ＣＣＦ２がβ−ラクタマーゼ活性による分解を受けると、両者が解離し、ＦＲＥＴは観察されなくなるため、４０９ｎｍの光の励起によってクマリン本来の４４７ｎｍの蛍光を発するようになる。４４７ｎｍの蛍光を測定することにより、β−ラクタマーゼの活性、すなわち、目的タンパク質の相互作用の強さを測定することが可能となる。

したがって、ＰＣＡ法を利用して本発明のスクリーニング方法を行うには、以下の方法によればよい。機能タンパク質の二つの断片Ａ１又はＡ２にｐ７３又はＩＫＫ−αを融合させた融合タンパク質を細胞に発現させ、被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下で当該細胞を培養し、培養した細胞における機能タンパク質の活性を測定し、被検化合物存在下培養した細胞における機能タンパク質の活性が、被検化合物非存在下培養した細胞における機能タンパク質の活性よりも上昇している場合、被検化合物はアポトーシスを促進する化合物であると判定できる。

また、本発明のアポトーシスを促進する化合物のスクリーニング方法は、被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、ｐ７３及びＩＫＫ−αを発現した細胞を培養する培養工程と、培養したそれぞれの細胞における、ｐ７３とＩＫＫ−αとの相互作用を測定する測定工程と、被検化合物の存在下において培養した細胞におけるｐ７３とＩＫＫ−αとの相互作用が、被検化合物の非存在下において培養した細胞におけるｐ７３とＩＫＫ−αとの相互作用よりも強い場合に、当該被検化合物をアポトーシスを促進する化合物と判定する判定工程と、を備える。本スクリーニング方法はｐ７３とＩＫＫ−αとが直接相互作用するという新たな分子メカニズムに基づいており、今までとは作用機序が全く異なるアポトーシス促進性化合物が得られる。

具体的なスクリーニング方法は、当業者にとって公知のタンパク質間相互作用を測定する系が利用可能であり、例えば、免疫沈降法が挙げられる。免疫沈降法を用いたスクリーニング方法を以下に説明する。

まず、ｐ７３及びＩＫＫ−αを発現した細胞を調製する。ｐ７３及びＩＫＫ−αを発現した細胞としては、両者を発現している細胞、どちらか一方を発現している細胞に他方をトランスフェクションさせて両者を発現させた細胞、又は、いずれも発現していない細胞に両者をコトランスフェクションさせた細胞のいずれを用いてもよい。また、シスプラチン処理等の薬剤処理などにより、ｐ７３を発現させた細胞を用いてもよい。そして、被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下で前記細胞を培養する。培養時間は、ｐ７３とＩＫＫ−αとが相互作用する時間であればよく、用いる細胞の種類によって異なるが、例えば、ｐ７３及びＩＫＫ−αをコトランスフェクトした場合、１２〜４８時間程度である。

次に、培養したそれぞれの細胞における、ｐ７３とＩＫＫ−αとの相互作用を測定する。相互作用の測定には、まず、培養した細胞を粉砕して細胞可溶化物を調製する。細胞可溶化物は細胞全体の細胞可溶化物を用いてもよいが、ｐ７３とＩＫＫ−αとは核内で相互作用することから、核画分の細胞可溶化物を用いることが好ましい。調製した細胞可溶化物にｐ７３又はＩＫＫ−αのいずれか一方の分子に対する抗体を加えて免疫沈降を行う。そして、得られた沈殿物（ｐ７３及びＩＫＫ−αの複合体が含まれている）を他方の分子に対する抗体を用いた免疫学的手法（イムノブロット等）により、ｐ７３及びＩＫＫ−αの複合体を検出、定量することにより、ｐ７３とＩＫＫ−αとの相互作用を測定できる。

測定の結果、被検化合物の存在下において培養した細胞におけるｐ７３とＩＫＫ−αとの相互作用が、被検化合物の非存在下において培養した細胞におけるｐ７３とＩＫＫ−αとの相互作用よりも強い場合（タンパク質複合体の形成量が多い場合）に、当該化合物を陽性と判定する。すなわち、当該化合物はアポトーシスを促進する化合物であると判定できる。

（アポトーシスを抑制する化合物のスクリーニング方法）
本発明のアポトーシスを抑制する化合物のスクリーニング方法は、ｐ７３とＩＫＫ−αとの相互作用を阻害する化合物を、アポトーシスを抑制する化合物と判定する判定工程を備える。本スクリーニング方法はｐ７３とＩＫＫ−αとが直接相互作用するという新たな分子メカニズムに基づいており、今までとは作用機序が全く異なる抗アポトーシス性化合物が得られる。

具体的なスクリーニング方法は、当業者にとって公知のタンパク質間相互作用を測定する系が利用可能であり、例えば、酵母ツーハイブリッド法やＰＣＡ法（プロテイン・フラグメント・コンプリメンテーション・アッセイ）が挙げられる。酵母ツーハイブリッド法及びＰＣＡ法の概要は先に説明した通りである。

酵母ツーハイブリッド法を利用した本スクリーニング方法は以下の通りである。ベイトとしてｐ７３又はＩＫＫ−αの一方を、プレイとしてｐ７３又はＩＫＫ−αの他方を酵母に発現させ、被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下で当該酵母を培養し、培養したそれぞれの酵母のレポーター遺伝子の転写活性（ｐ７３とＩＫＫ−αとの相互作用の強さを表す）を測定し、被検化合物存在下の転写活性が被検化合物非存在下の転写活性よりも低下している場合、被検化合物はアポトーシスを抑制する化合物であると判定できる。

ＰＣＡ法を利用した本スクリーニング方法は以下の通りである。機能タンパク質の二つの断片Ａ１又はＡ２にｐ７３又はＩＫＫ−αを融合させた融合タンパク質を細胞に発現させ、被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下で当該細胞を培養し、培養したそれぞれの細胞における機能タンパク質の活性を測定し、被検化合物存在下培養した細胞における機能タンパク質の活性が、被検化合物非存在下培養した細胞における機能タンパク質の活性よりも低下している場合、被検化合物はアポトーシスを抑制する化合物であると判定できる。

本発明のアポトーシスを抑制する化合物のスクリーニング方法は、被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、ｐ７３及びＩＫＫ−αを発現した細胞を培養する培養工程と、培養したそれぞれの細胞における、ｐ７３とＩＫＫ−αとの相互作用を測定する測定工程と、被検化合物の存在下において培養した細胞におけるｐ７３とＩＫＫ−αとの相互作用が、被検化合物の非存在下において培養した細胞におけるｐ７３とＩＫＫ−αとの相互作用よりも弱い場合に、当該被検化合物をアポトーシスを抑制する化合物と判定する判定工程と、を備える。本スクリーニング方法はｐ７３とＩＫＫ−αとが直接相互作用するという新たな分子メカニズムに基づいており、今までとは作用機序が全く異なる抗アポトーシス性化合物が得られる。

具体的なスクリーニング方法は、当業者にとって公知のタンパク質間相互作用を測定する系が利用可能であり、例えば、免疫沈降法が挙げられる。免疫沈降法を用いたスクリーニング方法は、化合物を判定する工程を除いて先に説明したのと同様である。すなわち、ｐ７３とＩＫＫ−αとの相互作用測定の結果、被検化合物の存在下において培養した細胞におけるｐ７３とＩＫＫ−αとの相互作用が、被検化合物の非存在下において培養した細胞におけるｐ７３とＩＫＫ−αとの相互作用よりも弱い場合（タンパク質複合体の形成量が少ない場合）に、当該化合物を陽性と判定する。すなわち、当該化合物はアポトーシスを抑制する化合物であると判定できる。

（アポトーシス促進剤）
本発明のアポトーシス促進剤は、配列番号２４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質からなる。配列番号２４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質はＩＫＫ−αタンパク質を表す。本発明者らが見出した分子メカニズムによれば、ＩＫＫ−αはｐ７３と直接相互作用することによりｐ７３を安定化し、ｐ７３が誘導するアポトーシスを促進する。したがって、本アポトーシス促進剤を細胞、組織又は個体に接触又は投与することにより、細胞、組織又は個体のアポトーシスを促進することが可能である。また、癌細胞、癌組織又は癌を患っている個体に本アポトーシス促進剤を接触又は投与することにより、癌の抑制・治療を行うことが可能である。すなわち、本アポトーシス促進剤は抗癌剤として用いることが可能である。本アポトーシス促進剤を接触又は投与する場合には、ｐ７３とともに接触又は投与することが好ましい。アポトーシスがより一層促進されるからである。

また、本発明のアポトーシス促進剤は、配列番号２４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸からなる。本発明のアポトーシス促進剤は、配列番号２３で表される塩基配列からなる核酸であることが好ましい。本発明者らが見出した分子メカニズムによれば、ＩＫＫ−αはｐ７３と直接相互作用することによりｐ７３を安定化し、ｐ７３が誘導するアポトーシスを促進する。したがって、本アポトーシス促進剤を適切なベクターに組み込み、当該ベクターを細胞、組織又は個体に接触又は投与することにより、細胞、組織又は個体のアポトーシスを促進することが可能である。また、癌細胞、癌組織又は癌を患っている個体に前記ベクターを接触又は投与することにより、癌の抑制・治療を行うことが可能である。すなわち、本アポトーシス促進剤は抗癌剤として用いることが可能である。本アポトーシス促進剤を接触又は投与する場合には、ｐ７３とともに接触又は投与することが好ましい。アポトーシスがより一層促進されるからである。

（アポトーシス抑制剤）
本発明のアポトーシス抑制剤は、配列番号２５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質からなる。配列番号２５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は、ＩＫＫ−αの４４番目のリジン残基がアラニン残基に置換されたＩＫＫ−α（Ｋ４４Ａ）タンパク質を表す。本発明者らは、ＩＫＫ−α（Ｋ４４Ａ）はｐ７３と結合するもののｐ７３を安定化せず、ｐ７３が誘導するアポトーシスを抑制することを明らかにした。したがって、本アポトーシス抑制剤を細胞、組織又は個体に接触又は投与することにより、細胞、組織又は個体のアポトーシスを抑制することが可能である。また、アポトーシスを起こしている細胞又は組織、若しくは神経変性疾患を患っている個体に本アポトーシス抑制剤を接触又は投与することにより、神経変性疾患の治療を行うことが可能である。すなわち、本アポトーシス抑制剤は神経変性疾患の治療剤として用いることが可能である。本アポトーシス抑制剤を接触又は投与する場合には、接触又は投与する細胞、組織又は個体がｐ７３を発現していることを確認するのが好ましい。アポトーシスをより確実に抑制することができるからである。

また、本発明のアポトーシス抑制剤は、配列番号２５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸からなる。本発明者らは、ＩＫＫ−α（Ｋ４４Ａ）はｐ７３と結合するもののｐ７３を安定化せず、ｐ７３が誘導するアポトーシスを抑制することを明らかにした。したがって、本アポトーシス抑制剤を適切なベクターに組み込み、当該ベクターを細胞、組織又は個体に接触又は投与することにより、細胞、組織又は個体のアポトーシスを抑制することが可能である。また、アポトーシスを起こしている細胞又は癌組織、若しくは神経変性疾患を患っている個体に前記ベクターを接触又は投与することにより、神経変性疾患の治療を行うことが可能である。すなわち、本アポトーシス抑制剤は神経変性疾患の治療剤として用いることが可能である。本アポトーシス抑制剤を接触又は投与する場合には、接触又は投与する細胞、組織又は個体がｐ７３を発現していることを確認するのが好ましい。アポトーシスをより確実に抑制することができるからである。

本発明のアポトーシス抑制剤は、配列番号２６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質からなる。配列番号２６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質は、ＵＦＤ２ａタンパク質を表す。本発明者らは、ＵＦＤ２ａがｐ７３を分解する一方でｐ５３を分解せず、ｐ７３が仲介するアポトーシスを選択的に抑制することを明らかにした。したがって、本アポトーシス抑制剤を細胞、組織又は個体に接触又は投与することにより、細胞、組織又は個体のアポトーシスを抑制することが可能である。また、アポトーシスを起こしている細胞又は組織、若しくは神経変性疾患を患っている個体に本アポトーシス抑制剤を接触又は投与することにより、神経変性疾患の治療を行うことが可能である。すなわち、本アポトーシス抑制剤は神経変性疾患の治療剤として用いることが可能である。本アポトーシス抑制剤を接触又は投与する場合には、接触又は投与する細胞、組織又は個体がｐ７３を発現していることを確認するのが好ましい。アポトーシスをより確実に抑制することができるからである。

また、本発明のアポトーシス抑制剤は配列番号２６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸からなる。本発明者らは、ＵＦＤ２ａがｐ７３を分解する一方でｐ５３を分解せず、ｐ７３が仲介するアポトーシスを選択的に抑制することを明らかにした。したがって、本アポトーシス抑制剤を適切なベクターに組み込み、当該ベクターを細胞、組織又は個体に接触又は投与することにより、細胞、組織又は個体のアポトーシスを抑制することが可能である。また、アポトーシスを起こしている細胞又は癌組織、若しくは神経変性疾患を患っている個体に前記ベクターを接触又は投与することにより、神経変性疾患の治療を行うことが可能である。すなわち、本アポトーシス抑制剤は神経変性疾患の治療剤として用いることが可能である。本アポトーシス抑制剤を接触又は投与する場合には、接触又は投与する細胞、組織又は個体がｐ７３を発現していることを確認するのが好ましい。アポトーシスをより確実に抑制することができるからである。

以下、実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（細胞培養及びトランスフェクション）
アフリカミドリザル肝細胞ＣＯＳ７細胞及びヒト骨肉種細胞Ｕ２ＯＳ細胞は、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ；インビトロジェン）及びペニシリン（１００ＩＵ／ｍＬ）／ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。ヒト肺癌細胞Ｈ１２９９細胞及びマウス線維芽細胞Ｌ９２９細胞は、１０％熱不活性化ＦＢＳ及び抗生剤混合物を含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。培養物は、５％ＣＯ_２の水飽和雰囲気下、３７℃で維持した。

一過的なトランスフェクションを行うため、ＣＯＳ７細胞を５０％コンフルエントになるまで培養し、ＦｕＧＥＮＥ６ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ）を用いて、製造業者の説明書に従い、所定の組合せの発現プラスミドをＣＯＳ７細胞にトランスフェクトした。Ｈ１２９９細胞及びＵ２ＯＳ細胞は、製造業者の説明書に従い、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロジェン）でトランスフェクトした。ｐｃＤＮＡ３ ｅｍｐｔｙ ｐｌａｓｍｉｄ（インビトロジェン）をブランクプラスミドとして用い、一過的なトランスフェクションで導入されるＤＮＡ量のバランスをとった。

（細胞生存アッセイ）
１００μＬの完全培地を添加してある９６ウェル組織培養皿に、Ｕ２ＯＳ細胞を５×１０^３／ウェルの密度で播き、一晩付着させた。シスプラチンの原液を０．４５μｍポアサイズのフィルターでろ過滅菌し、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で希釈した。シスプラチンを最終濃度が２０μＭとなるように培養物に加え、細胞の生存率を測定した。生存率は、改良３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−テトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）アッセイを用いて、シスプラチンの添加から所定時間後に測定した。ＭＴＴアッセイは、１０μＬのＭＴＴ溶液を各ウェルに添加し、培養物を３７℃で１時間インキュベーションして行った。マイクロプレートリーダー（モデル４５０；バイオラッド）を用いて、各ウェルの５７０ｎｍにおける吸光度を測定した。

（ＲＮＡ抽出及びＲＴ−ＰＣＲ）
Ｒｎｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン）を用い、製造業者のプロトコールに従って、シスプラチン（最終濃度：２０μＭ）に曝したＵ２ＯＳ細胞から全ＲＮＡを抽出した。逆転写反応は、全ＲＮＡ（５μｇ）をＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（インビトロジェン）及びランダムプライマーと混合し、４２℃で１時間インキュベーションすることで行った。反応が完了したら、ｃＤＮＡを水で希釈し、１５μＬの反応溶液（１００μＭの各デオキシヌクレオシド三リン酸、１×ＰＣＲバッファー、１μＭの各プライマー、０．２ユニットのｒＴａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）を含む）で増幅した。

用いたオリゴヌクレオチドプライマーは、以下のとおりである。
ＩＫＫ−α：
（フォワード、配列番号１） 5’-CCGACTTCAGCAGAACATGA-3’
（リバース、配列番号２） 5’-TGGGGACAGTGAACAAGTGA-3’
ＩＫＫ−β：
（フォワード、配列番号３） 5’-AACCAGCATCCAGATTGACC-3’
（リバース、配列番号４） 5’-CTCTAGGTCGTCCAGCGTTC-3’
ＩＫＫ−γ：
（フォワード、配列番号５） 5’-CCTCACTCCCTGTGAAGCTC-3’
（リバース、配列番号６） 5’-GAGACTCTTCGCCCAGTACG-3’
ＩκＢ−α：
（フォワード、配列番号７） 5’-GCAAAATCCTGACCTGGTGT-3’
（リバース、配列番号８） 5’-GCTCGTCCTCTGTGAACTCC-3’
ｐ５３：
（フォワード、配列番号９） 5’-ATTTGATGCTGTCCCCGGACGATATTGAAC-3’
（リバース、配列番号１０） 5’-ACCCTTTTTGGACTTCAGGTGGCTGGAGTG-3’
ｐ７３α：
（フォワード、配列番号１１） 5’-CCGGGAGAACTTTGAGATCC-3’
（リバース、配列番号１２） 5’-ATCTTCAGGGCCCCCAGGTC-3’
ｐ２１^ＷＡＦ１：
（フォワード、配列番号１３） 5’-CCGGGAGAACTTTGAGATCC-3’
（リバース、配列番号１４） 5’-ATCTTCAGGGCCCCCAGGTC-3’
Ｂａｘ：
（フォワード、配列番号１５） 5’-TTTGCTTCAGGGTTTCATCC-3’
（リバース、配列番号１６） 5’-CAGTTGAAGTTGCCGTCAGA-3’
ＧＡＰＤＨ：
（フォワード、配列番号１７） 5’-ACCTGACCTGCCGTCTAGAA-3’
（リバース、配列番号１８） 5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’
ＧＡＰＤＨの発現を測定して、内部標準とした。ＰＣＲ増幅産物を、ＴＡＥバッファー（４０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ）中、１．５％アガロースゲルの電気泳動にて分離し、エチジウムブロマイド（ポストステイン）で可視化した。

（ＩＫＫ−αを標識するＦＬＡＧエピトープ）
ＦＬＡＧエピトープでＩＫＫ−αのＮ末端をエピトープ標識し、ｐｃＤＮＡ３発現プラスミドにサブクローニングした。ＦＬＡＧ標識したＩＫＫ−αの発現プラスミドを得るため、ＩＫＫ−αのコード領域をＰＣＲで増幅した。ＰＣＲに用いたオリゴヌクレオチドプライマーは以下のとおりである。
（フォワード、配列番号１９） 5’-CCGGAATTCGAGCGGCCCCCGGGGCTGCGGC-3’
（リバース、配列番号２０） 5’-CCGCTCGAGCGGTCATTCTGCTAACCAACTCCAATCAAGACTCAT-3’
フォワードプライマーの下線部分のヌクレオチドは、ＥｃｏＲＩの切断部位を表し、リバースプライマーの下線部分のヌクレオチドは、ＸｈｏＩの切断部位を表す。ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで完全に消化し、ｐｃＤＮＡ３−ＦＬＡＧ発現プラスミドの同一切断部位に導入し、ＦＬＡＧタグの下流にインフレームとなるようにした。それは、ＦＬＡＧエピトープで標識されたＩＫＫ−αの全長をコードする（ｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＩＫＫ−α）。コンストラクトは、制限酵素による消化及びＤＮＡシーケンシングにより確認した。

（キナーゼ活性のないＩＫＫ−αの変異体の作製）
ＰｆｕＵｌｔｒａ^ＴＭ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン）を用い、製造業者の説明書に従って、Ｋ４４Ａ変異をワイルドタイプのＩＫＫ−αに導入した。以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた。
5’-GCGTCTTGTCGTTTAGAGCTAAGTTCCAAAAACAGAGAGCGATGGTGCCAT-3’ （フォワード、配列番号２１、下線部分が４４番目のアミノ酸のＡｌａをコードする）
5’-AATTGCTATTTTGAGATCAAGTTCCCGGTGCTGGTACAGACTGACGTTCCC-3’ （リバース、配列番号２２）

Ｔ４ＤＮＡライゲース（タカラバイオ）の存在下、ＰＣＲ産物をセルフライゲーションさせ、それらの核酸配列を決定し、期待通りの変異が存在し、かつランダム変異が存在しないことを確かめた。

（イムノブロット）
細胞に全部で２μｇの発現プラスミドを一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を氷冷したＰＢＳで洗浄し、溶解バッファー（ｐＨ８．０；２５ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、１３７ｍＭの塩化ナトリウム、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）、プロテアーゼインヒビターミックス（ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ）を含む）に懸濁させ、軽く超音波処理を行った。１５０００ｒｐｍで１０分間、遠心を行い、上清を回収し、ブラッドフォード法（バイオラッド）により、タンパク濃度を測定した。等量の細胞全体の可溶化物（タンパク量：５０μｇ）をＬａｅｍｍｌｉのＳＤＳサンプルバッファー中で煮沸して変性させ、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離し、１０％メタノール含有トリス−グリシンバッファー中でポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ；ミリポア）に室温下にて１時間で転写した。５％の脱脂乳及び０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ−Ｔ）で室温にて１時間、膜をブロックをした。

その後、抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体（Ｍ２；シグマ）、抗ＨＡモノクローナル抗体（１２ＣＡ５；ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ）、抗ｐ７３モノクローナル抗体（Ａｂ−４；ネオマーカーズ）、抗ｐ５３モノクローナル抗体（ＤＯ−１；オンコジーンリサーチプロダクツ）、抗Ｂａｘモノクローナル抗体（６Ａ７；ｅバイオサイエンス）、抗ＩＫＫ−αポリクローナル抗体（Ｍ−２８０；サンタクルーズバイオテクノロジー）、抗ＩＫＫ−βポリクローナル抗体（Ｈ−４７０；サンタクルーズバイオテクノロジー）、抗ＩＫＫ−γポリクローナル抗体（ＦＬ−４１７；サンタクルーズバイオテクノロジー）、抗ｐ６５ポリクローナル抗体（Ｃ−２０；サンタクルーズバイオテクノロジー）、抗ＩκＢ−αポリクローナル抗体（Ｃ−２１；サンタクルーズバイオテクノロジー）、抗アクチンポリクローナル抗体（２０−３３；シグマ）又は抗ｐ２１^ＷＡＦ１ポリクローナル抗体（Ｈ−１６４；サンタクルーズバイオテクノロジー）を一次抗体に用いて反応させた。一次抗体と反応させた後、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ヤギ抗マウス又は抗ウサギ二次抗体（セルシグナリングテクノロジー）をＴＢＳ−Ｔで２０００倍に希釈したものを用いて、室温にて１時間反応させた。ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｓｙｓｔｅｍ（ＥＣＬ；アマシャム・ファルマシア・バイオテック）を説明書に従って用いることにより、免疫反応性のタンパク質は最終的に可視化された。

（細胞成分分画）
核抽出物及び細胞質抽出物を調製するため、細胞を氷冷したＰＢＳで洗浄し、溶解バッファー（ｐＨ７．５；１０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０（ＮＰ−４０）、１ｍＭのＰＭＳＦ、プロテアーゼインヒビターミックス（シグマ）を含む）に懸濁させた。懸濁させた細胞を４℃にて３０分間インキュベーションし、５０００ｒｐｍで１０分間、遠心を行い、可溶性画分を回収した（これを細胞質抽出物とする）。不溶性画分を溶解バッファーで洗浄し、１×ＬａｅｍｍｌｉのＳＤＳサンプルバッファー（ｐＨ６．８；６２．５ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、２％のＳＤＳ、２％のβ−メルカプトエタノール、０．０１％のブロモフェノールブルーを含む）に溶解して核抽出物を回収した。核及び細胞質画分を抗ラミンＢモノクローナル抗体（Ａｂ−１；オンコジーンリサーチプロダクツ）又は抗α−チューブリンモノクローナル抗体（ＤＭ１Ａ；セルシグナリングテクノロジー）を用いたイムノブロット分析に供した。

（タンパク分解速度分析）
ＨＡ−ｐ７３α発現プラスミドを、ＩＫＫ−α発現プラスミドと一緒に又は無しに、ＣＯＳ７細胞に一過的にトランスフェクトした。シクロヘキシミド（最終濃度：１００μｇ／ｍＬ）による前処理から所定時間後に、細胞を回収した。細胞全体の可溶化物を調製し、抗ｐ７３モノクローナル抗体又は抗アクチンポリクローナル抗体によるイムノブロット分析を行った。デンシトメトリーを用いて、アクチンで規格化したＨＡ−ｐ７３αの量を定量した。

（ユビキチン化アッセイ）
量を変化させたＩＫＫ−α発現プラスミドの存在下又は非存在下、ＨＡ−ｐ７３α及びＨＡ−Ｕｂをコードする発現プラスミドを一定量、ＣＯＳ７細胞に一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションから４時間後、プロテアソームインヒビターであるＭＧ−１３２（最終濃度：２０μＭ）に６時間、細胞を曝し、細胞全体の可溶化物をまず抗ｐ７３モノクローナル抗体と免疫沈降させ、次に抗ＨＡモノクローナル抗体（１２ＣＡ５；ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ）を用いたイムノブロットを行うことにより、ユビキチン化レベルを分析した。

（免疫沈降分析）
細胞全体の可溶化物を１５０００ｒｐｍで１５分間、遠心して細胞片を除いた。プロテインＧ−セファロース（５０％スラリー、３０μＬ；アマシャム・ファルマシア・バイオテック）を用いて、４℃にて３０分間、得られた上清を前処理した。遠心した後、抗ＨＡポリクローナル抗体（医学生物学研究所）又は抗ＦＬＡＧモノクローナル抗体を用いて、上清を４℃にて２時間インキュベーションした。４℃にて３０分間、免疫複合体をプロテインＧ−セファロースビーズで沈降させた。軽く遠心して回収した後、免疫沈降物を溶解バッファーで３回洗浄し、３０μＬの２×ＬａｅｍｍｌｉのＳＤＳサンプルバッファーに懸濁させ、１００℃にて５分間処理した。上清を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードし、上述したようにイムノブロットで分析を行った。

（ＧＳＴプルダウンアッセイ）
ＦＬＡＧ−ＩＫＫ−αを発現しているＣＯＳ７細胞から調製した細胞全体の可溶化物をグルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）又はＧＳＴ融合タンパク質と混ぜ、グルタチオン−セファロースビーズ（アマシャム・ファルマシア・バイオテック）の存在下、４℃にて２時間、ゆっくり振盪しながらインキュベーションした。その後、軽く遠心してセファロースビーズを沈殿させ、１ｍＭのＰＭＳＦを含むＮＥＴＮバッファー（ｐＨ７．５；５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．１％のＮＰ−４０、１ｍＭのＥＤＴＡ）で激しく洗浄した。結合したタンパク質は、３０μＬの２×ＬａｅｍｍｌｉのＳＤＳサンプルバッファーを加えてビーズから溶出させ、５分間煮沸し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、上述したようにＦＬＡＧ−ＩＫＫ−αでイムノブロットした。

（免疫蛍光分析）
Ｕ２ＯＳ細胞をカバーガラス上で培養し、所定の発現プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後、細胞を氷冷したＰＢＳで洗浄し、−２０℃にて２０分間、１００％メタノールで固定した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のＰＢＳ溶液（０．１％グリシン及び０．１％アジ化ナトリウムを含む）を用いて室温にて１時間ブロックした。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、５０倍希釈した抗ラミンＢモノクローナル抗体及び２００倍希釈した抗ＦＬＡＧポリクローナル抗体（シグマ）を同時に用いて、室温にて１時間インキュベーションした。結合した免疫グロブリンを検出するため、２００倍に希釈したローダミン又はフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識した二次抗体（インビトロジェン）と、室温にて１時間、インキュベーションした。二次抗体とインキュベーションした後、カバーグラスをＰＢＳで洗浄し、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ（サザンバイオテック）を用いてガラススライド上にマウントして、共焦点レーザー顕微鏡（オリンパス）で調べた。

（ルシフェラーゼレポーターアッセイ）
ｐ５３を欠損したＨ１２９９細胞を５×１０^４細胞／ウェルの密度で１２ウェル組織培養皿に播き、以下のもので細胞を一過的にトランスフェクトした：１００ｎｇのルシフェラーゼレポーターコンストラクト（ｐ２１^ＷＡＦ１、ＭＤＭ２又はＢａｘプロモーターに由来するｐ５３／ｐ７３応答配列を保有する）、１０ｎｇのｐＲＬ−ＴＫウミシイタケルシフェラーゼｃＤＮＡ、及び２５ｎｇの所定の発現プラスミド（ｐ５３、ＨＡ−ｐ７３α又はＨＡ−ｐ７３β）を量を変化させたＩＫＫ−α又はＦＬＡＧ−ＩＫＫ−β発現プラスミドと一緒に又は無しに。ｐｃＤＮＡ３ ｅｍｐｔｙ ｐｌａｓｍｉｄを用いて、トランスフェクションあたりのトータルのＤＮＡ量は一定（５１０ｎｇ）に保った。トランスフェクションから４８時間後、細胞を氷冷したＰＢＳで２回洗浄し、ｐａｓｓｉｖｅ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（プロメガ）に懸濁させた。デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（プロメガ）を用いて、説明書に従い、ホタル及びウミシイタケの両ルシフェラーゼ活性を測定した。蛍光強度はＴＤ−２０ルミノメーター（ターナーデザイン）を用いて測定した。ホタルルシフェラーゼのシグナルを、ウミシイタケルシフェラーゼのシグナルに基づいて規格化した。少なくとも３回のトランスフェクションを行って得られた結果を、平均値±標準偏差で表した。

（アポトーシスアッセイ）
ｐ７３α及びＩＫＫ過剰発現を介したアポトーシスを検出するため、１．５×１０^４細胞／ウェルの密度でＨ１２９９細胞を６ウェル組織培養皿に播いた。翌日、５０ｎｇのβ−ガラクトシダーゼ発現プラスミド及び５０ｎｇのＨＡ−ｐ７３α発現プラスミドを、量を変化させたＩＫＫ−α又はＩＫＫ−β発現ベクター（１００、２００又は４００ｎｇ）の存在下又は非存在下、細胞に一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を氷冷したＰＢＳで洗浄し、０．４％トリパンブルー（ＰＢＳ溶液）で室温にて１０分間染色した。その後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、２．５％のグルタルアルデヒド、１ｍＭの塩化マグネシウム及び２ｍＭのＥＧＴＡを含むＰＢＳで１０分間固定し、Ｒｅｄ−Ｇａｌ（リサーチオルガニクス）を用いて、Bayon, Y. et al., Mol. Cell. Biol. 23: 1061-1074 (2003).に記載の方法で２時間染色した。トランスフェクトした細胞を可視化するためのマーカーとしてＲｅｄ−Ｇａｌを用い、トランスフェクタントにどのくらいアポトーシスが生じているかを評価した。Ｒｅｄ−Ｇａｌ及びトリパンブルーの二重染色によって暗いピンク−パープルになっている細胞を集めて、アポトーシス細胞をスコア化した。結果は３回の独立したトランスフェクション−それぞれ、３回以上行った−の平均で表した。

（実施例１） Ｕ２ＯＳ細胞におけるシスプラチンを介したアポトーシス中のＩＫＫ−αの誘導
ＤＮＡ損傷により誘導されるシグナル伝達において、ＩκＢキナーゼ（ＩＫＫｓ）の潜在的な機能を規定するため、ＤＮＡを損傷する化学療法剤であるシスプラチンにＵ２ＯＳ細胞をさらして、それらのタンパク質及びｍＲＮＡの発現レベルを調べた。細胞生存アッセイにより調べたところ、Ｕ２ＯＳ細胞は時間依存的にアポトーシスを起こしていた（図１）。イムノブロット分析を行ったところ、ｐ５３及びそのホモログであるｐ７３α（両者はＤＮＡ損傷応答における主要なメディエーターである（Melino, G. et al., Nat. Rev. Cancer 2: 605-615 (2002). 及び Vousden, K. H. et al., Nat. Rev. Cancer 2: 594-604 (2002).）は、シスプラチンに応答してタンパク質レベルで顕著に誘導された（図２）。その一方、ｐ５３及びｐ７３αのｍＲＮＡの発現は誘導されなかった（図３）。これらの蓄積は、ｐ２１^ＷＡＦ１やＢａｘのような下流のエフェクターに関連している。特に、シスプラチン処理により、ＩＫＫ−αが顕著に蓄積し、シスプラチン曝露から１２〜３６時間後の間にその誘導が認められた（図２）。シスプラチン処理の１２時間後、ＩＫＫ−γ（ＮＥＭＯ）のタンパク質レベルが一過的に上昇したが、２４〜３６時間までシスプラチン処理時間を延長するとＩＫＫ−γレベルは減少し、未処理の細胞とほとんど区別できない程度であった。対照的に、シスプラチン処理によってＩＫＫ−βの量はほとんど変化しなかった。ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果、ＩＫＫ−α及びＩＫＫ−βのｍＲＮＡの発現はシスプラチン処理で変化せず、その一方、ＩＫＫ−γのｍＲＮＡの発現レベルは、シスプラチン処理に応じて時間依存的に、顕著な増加が認められた（図３）。興味深いことに、イムノブロット分析の結果は、シスプラチン処理によってリン酸化型のＩκＢ−α（特徴がよく分かっている、ＩＫＫ複合体の基質である）が顕著に増加していることを示している。

以上の結果をあわせると、ＤＮＡ損傷で誘導されるｐ５３及びｐ７３の蓄積はＩＫＫ−αのアップレギュレーションと関連していること、及び、ＤＮＡ損傷が介するアポトーシス経路の間にそれらの機能的な相互作用が存在する可能性があることが示唆された。

（実施例２） シスプラチンに応答したＩＫＫ−αの核内の蓄積
ＣＲＭ−１依存的に、ＩＫＫ−αが核と細胞質との間を往復していることが、最近示された（Birbach, A. et al., J. Biol. Chem. 277: 10842-10851 (2002).）。また、核のＩＫＫ−αは、サイトカイン曝露後の生存経路を制御するＮＦ−κＢ応答遺伝子をトランス活性化する能力を有している（Yamamoto, Y. et al., Nature 423: 655-659 (2003). 及び
Anest, V. et al., Nature 423: 659-663 (2003).）。これらを踏まえて、内在性のＩＫＫｓの細胞下の局在がシスプラチンに応じて変化するかを調べた。

シスプラチンに曝した又は未処理のＵ２ＯＳ細胞から、核及び細胞質抽出物を調製し、所定の抗体とのイムノブロットに供した。核及び細胞質画分の純度は、それぞれ、抗ラミンＢ抗体及び抗α−チューブリン抗体を用いたイムノブロットで確認した。既報の結果と一致して、ＩＫＫ−αは核及び細胞質の両方に局在しており、他方、ＩＫＫ−βはもっぱら細胞質で発現していた（図４）。細胞質中のＩＫＫ−α、ＩＫＫ−β及びＩＫＫ−γの量は、シスプラチン処理にかかわらず変化しなかった。シスプラチン処理によって、時間依存的にＩＫＫ−αは核内で顕著に蓄積した一方、ＩＫＫ−βは核内でそれほど蓄積しなかった。また、ＩＫＫ−γの一過的な核内の蓄積が、シスプラチン処理の１２時間後に認められた。シスプラチンに応答してＩκＢ−αのリン酸化が亢進することと一致して、細胞質のＩκＢ−αは時間依存的に減少した。しかしながら、ｐ６５−ＮＦκＢサブユニット（ＲｅｌＡ）の核内での蓄積に対して、シスプラチン処理はほとんど影響を与えなかった。このことは、シスプラチンの存在によって、ｐ６５の核内移行が阻害されている可能性があることを示している。このように考えると、ＩＫＫｓのうち、シスプラチン処理によってＩＫＫ−αの顕著に核内に蓄積し、ＩＫＫ−αはシスプラチンを介したアポトーシスの間に核内における何らかの機能を持っている可能性が考えられる。

外因的にＩＫＫ−αを発現させると、内在性のＩＫＫ−αの挙動を左右するかを調べるため、イムノブロット及び免疫蛍光染色によって外因性のＩＫＫ−αの細胞内分布を調べた。ＦＬＡＧ−ＩＫＫ−α又はＨＡ−ｐ７３αをコードする発現プラスミドをトランスフェクトしたＵ２ＯＳ細胞から、核及び細胞質画分を調製し、それぞれ、抗ＦＬＡＧ抗体又は抗ｐ７３抗体を用いたイムノブロットに供した。図５（トランスフェクトの４８時間後の細胞のイムノブロットの結果を表している）に示したように、ＨＡ−ｐ７３αはもっぱら核に局在しており、ＦＬＡＧ−ＩＫＫ−αは、核及び細胞質の両方に存在していた。驚くべきことに、抗ＦＬＡＧ抗体及び抗ラミン抗体を用いた免疫蛍光染色の結果から、核マトリックスマーカーであるラミンＢと広範囲にわたって共存していることからも示されるとおり、外因性のＩＫＫ−αは細胞質及び核マトリックスに局在していることがはっきりと示された（図６）。興味深いことに、ＨＡ−ｐ７３αはＦＬＡＧ−ＩＫＫ−αと共存して、核マトリックスに存在しており、これは、核のＩＫＫ−αがアポトーシス促進性のｐ７３と相互作用し、その機能を調整している可能性を示唆している。

（実施例３） シスプラチン曝露による、Ｕ２ＯＳ細胞におけるＮＦ−κＢの活性化の変化
上述の通り、核内のトランス活性化性ｐ６５サブユニットの量は、シスプラチン処理をしたＵ２ＯＳ細胞において変化しなかった。これらの結果を受け、シスプラチンに応答して、ＮＦ−κＢが活性化するかどうかを調べた。ＮＦ−κＢレポータープラスミドをトランスフェクトしたＵ２ＯＳ細胞をシスプラチンで処理し、ルシフェラーゼ活性を測定した。シスプラチン処理は、ＮＦ−κＢ依存性の転写活性化を亢進しなかった（図７）。マウス線維芽細胞であるＬ９２９細胞をＴＮＦ−αに曝すと、２時間後に、ＮＦ−κＢに依存した転写活性化が認められた（図８）。Ｌ９２９細胞は、ＴＮＦ−α依存性のＮＦ−κＢの活性化を調べるために広く用いられている。また、Ｌ９２９細胞をＴＮＦ−αで処理すると、ｐ６５が核に顕著に蓄積する（図９）。以上から、ＴＮＦ−αと異なり、ＮＦ−κＢ依存性の転写活性化にシスプラチンが顕著な効果を及ぼさないことは、核内のｐ６５の蓄積が調節されないためであると考えられる。

（実施例４） ＩＫＫ−αとｐ７３の相互作用
哺乳動物の培養細胞において、ＩＫＫ−αがｐ７３と相互作用するかどうかを調べるため、トランスフェクトしたＣＯＳ７細胞から細胞全体の可溶化物を調製し、その可溶化物を抗ＦＬＡＧ抗体又は抗ＨＡ抗体と免疫沈降させ、それぞれ、抗ｐ７３又は抗ＦＬＡＧ抗体を使ったイムノブロットで分析した。図１０に示したように、外因的に発現させたＦＬＡＧ−ＩＫＫ−α及びＨＡ−ｐ７３αは、ＣＯＳ７細胞中で安定複合体を形成した。同様に、ＨＡ−ｐ７３βはＦＬＡＧ−ＩＫＫ−αと免疫共沈降した（データは示さず）。対照的に、内在性のｐ５３の免疫沈降をし、抗ＦＬＡＧ抗体でイムノブロットをしたところ、免疫共沈降したＦＬＡＧ−ＩＫＫ−αは検出されなかった（図１１）。これは、細胞中において、ＩＫＫ−αはｐ７３と相互作用するが、ｐ５３とは相互作用しないことを示している。ＩＫＫ−αとの相互作用に関与するｐ７３の決定基を同定するため、ＧＳＴに融合したｐ７３の欠失変異体をいくつか作製し、インビトロのプルダウンアッセイにおいてＦＬＡＧ−ＩＫＫ−αへの結合能を調べた。トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、オリゴマー化ドメイン及びＳＡＭドメインを含むｐ７３の機能的ドメインに基づいて、これらの変異体を設計した（図１２）。ＦＬＡＧ−ＩＫＫ−αは、ＧＳＴ−ｐ７３（１１４−３２８）には結合したが、他のＧＳＴ融合タンパク質には結合しなかった（図１３）。以上の結果から、ＩＫＫ−αは、ｐ７３のＤＮＡ結合ドメインを介して、直接ｐ７３と相互作用していることが示唆された。

（実験５） ＩＫＫαによるｐ７３の安定化
既に報告されているように、ｐ７３と相互作用するいくつかのプロテインキナーゼ（例えば、ｃ−Ａｂｌ及びＰＫＣδ）は、ｐ７３を安定化することができる。ＩＫＫ−αがｐ７３の安定化に影響を与えるかどうか確かめるため、一定量のＨＡ−ｐ７３α発現プラスミドを、量を変化させたＩＫＫ−α発現プラスミドと一緒に又は無しに、ＣＯＳ７細胞にトランスフェクトし、ＨＡ−ｐ７３αのタンパク質レベルを調べた。図１４に示したように、外因性のＩＫＫ−αの存在によって、ＨＡ−ｐ７３αの量は顕著に増加した一方、ＦＬＡＧ−ｐ５３の安定化に対しては検出可能な効果をＩＫＫ−αは有していなかった。さらに、ＨＡ−ｐ７３βもＩＫＫ−αによって安定化されるが、安定化の程度はＨＡ−ｐ７３αに比べれば少ない。ＩＫＫ−αが増加した実験条件下では、ｐ７３αのｍＲＮＡの発現レベルは顕著な変化を見せなかった（図１４）。このことは、ＩＫＫ−αがｐ７３をタンパク質レベルで制御していることを示唆している。次に、一過的なトランスフェクションによって、ＩＫＫ−βがｐ７３及びｐ５３の安定化に影響を与えるかを調べた。図１５に示したように、ＦＬＡＧ−ＩＫＫ−βはｐ７３及びｐ５３の両者の安定化には検出し得る効果を有していなかった。

ＩＫＫ−αがｐ７３のターンオーバーを調節しているかどうかを確かめるため、トランスフェクトしたＣＯＳ７細胞におけるｐ７３の分解速度を調べた。トランスフェクションの２４時間後、細胞をシクロヘキシミドで処理した。指定した時間において、細胞全体の可溶化物を調整し、抗ｐ７３抗体を用いたイムノブロットに供した。図１６に示したように、ＨＡ−ｐ７３α及びＩＫＫ−αの両方を発現させた細胞におけるＨＡ−ｐ７３αの分解速度は、ＨＡ−ｐ７３αを単独で発現させた細胞における分解速度よりも遅かった。対照的に、ＦＬＡＧ−ＩＫＫ−βが存在していても、ＨＡ−ｐ７３αの半減期は延びなかった（図１７）。このように、ＩＫＫ−αが仲介するｐ７３の安定化は、ｐ７３の半減期の増加によるものである。

Lee, C.-W. et al., Oncogene 18: 4171-4181 (1999).に記載されているように、ｐ７３の定常状態のレベルは、少なくとも一部はユビキチン−プロテアソーム経路を通じたタンパク質分解過程によって調節されている。ｐ７３のユビキチン化をＩＫＫ−αが阻害するかどうかを調べた。ＨＡ−ｐ７３α及びＨＡ−ユビキチン発現プラスミドを、量を変化させたＩＫＫ−α又はＦＬＡＧ−ＩＫＫ−β発現プラスミドと一緒に又は無しに、ＣＯＳ７細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞全体の可溶化物を免疫沈降及びイムノブロットにより分析し、ＨＡ−ユビキチンを含むｐ７３αが存在するかどうかを調べた。ユビキチン化したｐ７３αの量は、ＩＫＫ−αの存在によって減少した（図１８）一方、ＦＬＡＧ−ＩＫＫ−βはｐ７３αのユビキチン化をいくぶん少ない程度であるが阻害した（図１９）。

これらの結果を合わせると、ＩＫＫ−αはｐ７３のユビキチン化を阻害し、それによりｐ７３の安定化を向上させていることが強く示唆された。

（実施例６） ｐ５３を欠損したＨ１２９９細胞における、ｐ７３が仲介するトランス活性化機能のＩＫＫ−αによる増強
ＩＫＫ−α及びｐ７３の相互作用の機能的な意味を探るため、まず、ｐ−７３が仲介する転写活性化に及ぼすＩＫＫ−αの効果を調べた。ｐ５３を欠損したＨ１２９９細胞に、ＨＡ−ｐ７３α又はＨＡ−ｐ７３β発現プラスミド、及びｐ２１^ＷＡＦ１、Ｂａｘ又はＭＤＭ２プロモーターのコントロール下のルシフェラーゼレポーターコンストラクトを、量を変化させたＩＫＫ−αの発現プラスミドと一緒に又は無しにトランスフェクトした。図２０及び２１に示したように、エンプティプラスミドの対照に比べて、異所的に発現したｐ７３は、ｐ５３／ｐ７３応答性レポーターの転写を活性化した。また、ＩＫＫ−α単独では、ルシフェラーゼ活性にはほとんど影響を与えなかった。ＨＡ−ｐ７３α又はＨＡ−ｐ７３βをＩＫＫ−αと共発現させたときは、ｐ７３依存的な転写活性化の顕著な増加が、用量依存的に認められた。対照的に、ｐ５３応答レポーター遺伝子活性の増加は、ＩＫＫ−αによって誘導されなかった（図２２）。ＩＫＫ−αによって仲介されるｐ７３依存性の転写の活性化の特異性を調べるため、ＩＫＫ−βがｐ５３／ｐ７３応答性プロモーターに対するｐ７３転写活性を増強するかどうかを確かめた。図２３に示したように、ＦＬＡＧ−ＩＫＫ−βによって、ｐ７３依存性の転写活性化に顕著な変化は認められなかった。さらに、Ｈ１２９９細胞に外因的にＩＫＫ−αを発現させたところ、ｐ７３αが仲介する内在性のｐ２１^ＷＡＦ１の誘導が顕著にアップレギュレートした（図２４）。

これらの結果をあわせると、ＩＫＫ−αはｐ７３の転写活性を特異的に増強していることが示唆された。

（実施例７） ｐ７３を介したアポトーシスに対するＩＫＫ−αの寄与
アポトーシスの調節のようなｐ７３依存性の生物学的機能に対するＩＫＫ−αの潜在的な効果を調べた。一定量のＨＡ−ｐ７３α及びβ−ガラクトシダーゼの発現プラスミドを、量を変化させたＩＫＫ−α又はＦＬＡＧ−ＩＫＫ−β発現プラスミドと一緒に又は無しに、Ｈ１２９９細胞に一過的にトランスフェクトした。β−ガラクトシダーゼ発現プラスミドはトランスフェクトした細胞を同定するために使用した。トランスフェクションの４８時間後、トリパンブルー（生育不能細胞）及びＲｅｄ−Ｇａｌ（トランスフェクトした細胞）を用いた二重染色に細胞を供し、紫色の細胞の数をスコア化した。図２５及び２６に示したように、ＩＫＫ−αをＨＡ−ｐ７３αと共発現させると、ＨＡ−ｐ７３α単独でトランスフェクトした場合に比べて、アポトーシスを起こした細胞の数が増加していた。対照的に、ＦＬＡＧ−ＩＫＫ−βの共発現は、ｐ７３α依存性のアポトーシスには顕著な効果を及ぼさなかった（図２７）。

これらのデータは、ｐ７３依存性の転写活性化に対するＩＫＫ−αの正の効果と一致している。

（実施例８） キナーゼ活性を欠損した変異型ＩＫＫ−αがｐ７３の安定化に及ぼす影響
ＩＫＫ−αの内在的なキナーゼ活性がｐ７３の安定化に必要かどうかを調べるため、変異型のＩＫＫ−αであるＩＫＫ−α（Ｋ４４Ａ）を作製した。この変異体は、ＡＴＰ結合モチーフ中のリジン−４４がアラニンに置換されている。Ling, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 3792-3797 (1998).に記載されているとおり、この部位を変異すると、ＩＫＫ−αのキナーゼ活性が損なわれる。免疫沈降分析から分かるように、哺乳動物の培養細胞において、ＩＫＫ−α（Ｋ４４Ａ）は、ｐ７３αとの複合体を形成する能力は維持している（図２８）。ワイルドタイプのＩＫＫ−αとは極めて対照的に、ＦＬＡＧ−ＩＫＫ−α（Ｋ４４Ａ）の共発現は、外因的に発現させたＨＡ−ｐ７３αの細胞内レベルにはほとんど影響を及ぼさなかった（図２９）。内在性のｐ７３に対する、キナーゼ活性を欠損したＩＫＫ−αの効果を調べるため、Ｕ２ＯＳ細胞又はＨ１２９９細胞に、エンプティプラスミド又はＦＬＡＧ−ＩＫＫ−α（Ｋ４４Ａ）の発現プラスミドを一過的にトランスフェクトし、シスプラチンに２４時間曝すか、未処理のままにした。細胞全体の可溶化物及び全ＲＮＡを調製し、それぞれ、イムノブロット及びＲＴ−ＰＣＲに供した。図３０に示したように、ＦＬＡＧ−ＩＫＫ−α（Ｋ４４Ａ）発現プラスミドをトランスフェクトしたＵ２ＯＳ細胞において、シスプラチンを介した内在性のｐ７３αの安定化が阻害された。その一方、ＦＬＡＧ−ＩＫＫ−α（Ｋ４４Ａ）は、内在性のｐ５３の量には顕著な影響を与えなかった。同じような結果は、ｐ５３を欠損したＨ１２９９細胞においても得られた（図３２）。上記結果とよく一致するように、ＦＬＡＧ−ＩＫＫ−α（Ｋ４４Ａ）の存在下、シスプラチンで誘導されるアポトーシスが顕著に阻害された（図３１及び３３）。

このように、シスプラチンに誘導されるＤＮＡ損傷に応答するｐ７３の安定化には、ＩＫＫ−αのキナーゼ活性が必要であると考えられる。

（実施例９） ＵＦＤ２ａの内在性ｐ７３への影響
ＵＦＤ２ａが内在性ｐ７３に及ぼす影響について調べるため、以下の実験を行った。ＣＯＳ７細胞にＦＬＡＧ−ＵＦＤ２ａ発現プラスミドをトランスフェクトした、又はトランスフェクトしなかった。トランスフェクションの２４時間後、細胞をシスプラチン（最終濃度２０μｇ／ｍＬ）に２４時間曝すか、未処理のままにした。トランスフェクトした細胞から細胞全体の可溶化物を調製し、ｐ７３α、ｐ５３及びＵＦＤ２ａの発現をイムノブロットにより解析した。なお、アクチンを添加のコントロールとして利用した。図３５に示したように、ＦＬＡＧ−ＵＦＤ２ａ発現プラスミドをトランスフェクトした細胞において、シスプラチンによるｐ７３αの誘導が阻害された。その一方、内在性のｐ５３の量には影響を与えなかった。この結果は、ｐ７３αがＵＦＤ２ａにより分解されることを示唆している。

（実施例１０） ＵＦＤ２ａのｐ７３依存性アポトーシスへの影響
ＵＦＤ２ａがｐ７３依存性のアポトーシスに及ぼす影響について調べるため、以下の実験を行った。ｐ５３を欠損したＨ１２９９細胞に所定の組み合わせ（ＨＡ−ｐ７３α、ｐ５３及びＦＬＡＧ−ＵＦＤ２ａ）の発現プラスミドを一過的にコトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を３．７％ホルムアルデヒドで３０分間、室温にて固定し、０．２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で５分間、室温にて透過処理を行い、３％ＢＳＡで１時間ブロックした。細胞を１×ＰＢＳで３回洗浄し、ＤＡＰＩ（４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール；１μｇ／ｍＬ）で２０分間、室温にて染色した。ＧＦＰがトランスフェクトされた細胞のうち異常な核を有する細胞を顕微鏡下で計測した。図３６に示したように、ＨＡ−ｐ７３α及びＦＬＡＧ−ＵＦＤ２ａをコトランスフェクトすると、ＨＡ−ｐ７３α単独でトランスフェクトした場合に比べて、アポトーシスを起こしている細胞の数が減少した。対照的に、ｐ５３及びＦＬＡＧ−ＵＦＤ２ａをコトランスフェクトした場合は、ｐ５３依存性のアポトーシスを抑制することができなかった。

実施例９及び１０の結果から、ＵＦＤ２ａはｐ７３αを分解し、ｐ７３αのアポトーシス活性を低下させることが明らかとなった。

骨肉種細胞Ｕ２ＯＳ細胞をシスプラチンに曝したときの細胞生存率を表すグラフである。 シスプラチン処理したＵ２ＯＳ細胞の細胞可溶化物のイムノブロットの結果を表す図である。 シスプラチン処理したＵ２ＯＳ細胞からのＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ分析した結果を表す図である。 シスプラチン処理したＵ２ＯＳ細胞の核画分（Ｎ）及び細胞質画分（Ｃ）のイムノブロットの結果を表す図である。 ＦＬＡＧ−ＩＫＫ−α又はＨＡ−ｐ７３α発現プラスミドをトランスフェクトしたＵ２ＯＳ細胞の核画分（Ｎ）及び細胞質画分（Ｃ）のイムノブロットの結果を表す図である。 ＦＬＡＧ−ＩＫＫ−α発現プラスミドを単独で（上段の３つの写真）又はＨＡ−ｐ７３αと一緒に（下段の３つの写真）一過的にトランスフェクトしたＵ２ＯＳ細胞の関節免疫蛍光で二重染色した結果を表す写真である。マージは、ＦＬＡＧ−ＩＫＫ−α及びラミンＢ、又は、ＨＡ−ｐ７３α及びＦＬＡＧ−ＩＫＫ−αの写真を併せた写真を表している。 Ｕ２ＯＳ細胞をシスプラチン処理したときの、ＮＦ−κＢの活性化倍率を表すグラフである。 Ｌ９２９細胞をＴＮＦ−α処理したときの、ＮＦ−κＢの活性化倍率を表すグラフである。 ＴＮＦ−αに曝されたＬ９２９細胞の核画分（Ｎ）及び細胞質画分（Ｃ）のイムノブロットの結果を表す図である。ＩＫＫ−α及びｐ７３の相互作用 所定の組合せの発現プラスミドを一過的にトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を免疫沈降及びイムノブロットした結果を表す図である。ＩＰは免疫沈降に用いた抗体を、ＩＢはイムノブロットに用いた抗体を、それぞれ表す。 ＦＬＡＧ−ＩＫＫ−α発現プラスミドを一過的にトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を、正常マウス血清（ＮＭＳ）又は抗ｐ５３抗体使った免疫沈降、及び、抗ＦＬＡＧ抗体を使ったイムノブロットした結果を表す図である。 ＧＳＴ−ｐ７３融合タンパク質の模式図である。ＴＡはトランス活性化ドメインを、ＤＢはＤＮＡ結合ドメインを、ＯＤはオリゴマー化ドメインを、ＳＡＭはステライルαモチーフドメインを表す。 上図は、インビトロプルダウンアッセイにおいて、抗ＦＬＡＧ抗体を使ったイムノブロットの結果を表す図である。下図は、インビトロプルダウンアッセイにおいて、抗ＧＳＴ抗体を使ったイムノブロットの結果を表す図である。 所定の組合せの発現プラスミドをＣＯＳ７細胞に一過的にコトランスフェクトしたときの、イムノブロット（上図）又はＲＴ−ＰＣＲ（下図）の結果を表す図である。 所定の組合せの発現プラスミドをＣＯＳ７細胞に一過的にコトランスフェクトしたときの、イムノブロットの結果を表す図である。 上図は、ＨＡ−ｐ７３α発現プラスミドを、単独で又はＩＫＫ−α発現プラスミドと一緒に、一過的にトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）処理したときの、イムノブロットの結果を表す図である。下図は、残存しているＨＡ−ｐ７３αを表したグラフである。 上図は、ＨＡ−ｐ７３α発現プラスミドを、単独で又はＩＫＫ−β発現プラスミドと一緒に、一過的にトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞を、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）処理したときの、イムノブロットの結果を表す図である。下図は、残存しているＨＡ−ｐ７３αを表したグラフである。 ＨＡ−ｐ７３α及びＨＡ−Ｕｂ発現プラスミドを、量を変化させたＩＫＫ−α発現プラスミドと一緒に又は無しに、一過的にコトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞をＭＧ−１３２で処理し、抗ｐ７３抗体で免疫沈降し、抗ＨＡ抗体でイムノブロットした結果を表す図である。Ｕｂｘｎ−ｐ７３αは、ゆっくり泳動しているユビキチン化型のＨＡ−ｐ７３αを表す。 ＨＡ−ｐ７３α及びＨＡ−Ｕｂ発現プラスミドを、量を変化させたＩＫＫ−β発現プラスミドと一緒に又は無しに、一過的にコトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞をＭＧ−１３２で処理し、抗ｐ７３抗体で免疫沈降し、抗ＨＡ抗体でイムノブロットした結果を表す図である。Ｕｂｘｎ−ｐ７３αは、ゆっくり泳動しているユビキチン化型のＨＡ−ｐ７３αを表す。 ＨＡ−ｐ７３αをコードする発現プラスミドを、ｐ２１^ＷＡＦ１、Ｂａｘ又はＭＤＭ２プロモーター由来のｐ５３応答配列を運ぶルシフェラーゼレポーター、ウミシイタケルシフェラーゼプラスミド（ｐＲＬ−ＴＫ）とともに、量を変化させたｐｃＤＮＡ３−ＩＫＫ−αの存在下又は非存在下、一過的にコトランスフェクトしたｐ−５３欠損Ｈ１２９９細胞におけるｐ５３／ｐ７３応答性プロモーターの転写活性化の倍率を表すグラフである。 ＨＡ−ｐ７３βをコードする発現プラスミドを、ｐ２１^ＷＡＦ１、Ｂａｘ又はＭＤＭ２プロモーター由来のｐ５３応答配列を運ぶルシフェラーゼレポーター、ウミシイタケルシフェラーゼプラスミド（ｐＲＬ−ＴＫ）とともに、量を変化させたｐｃＤＮＡ３−ＩＫＫ−αの存在下又は非存在下、一過的にコトランスフェクトしたｐ−５３欠損Ｈ１２９９細胞におけるｐ５３／ｐ７３応答性プロモーターの転写活性化の倍率を表すグラフである。 ｐ５３をコードする発現プラスミドを、ｐ２１^ＷＡＦ１、Ｂａｘ又はＭＤＭ２プロモーター由来のｐ５３応答配列を運ぶルシフェラーゼレポーター、ウミシイタケルシフェラーゼプラスミド（ｐＲＬ−ＴＫ）とともに、量を変化させたｐｃＤＮＡ３−ＩＫＫ−αの存在下又は非存在下、一過的にコトランスフェクトしたｐ−５３欠損Ｈ１２９９細胞におけるｐ５３／ｐ７３応答性プロモーターの転写活性化の倍率を表すグラフである。 ＨＡ−ｐ７３α発現プラスミドを、所定のルシフェラーゼレポーターコンストラクトとともに、量を変化させたＩＫＫ−β発現プラスミドの存在下又は非存在下、一過的にトランスフェクトしたＨ１２９９細胞におけるｐ５３／ｐ７３応答性プロモーターの転写活性化の倍率を表すグラフである。 一定量のＨＡ−ｐ７３α発現プラスミドを、量を変化させたＩＫＫ−α発現プラスミドと一緒に又は無しに、一過的にコトランスフェクトしたＨ１２９９細胞のイムノブロットの結果を表す図である。 所定の発現プラスミドを一過的にトランスフェクションしたＨ１２９９細胞を二重染色した写真である。 所定の発現プラスミドを一過的にトランスフェクションしたＨ１２９９細胞のうち、アポトーシスを起こしている細胞の割合を示したグラフである。 所定の発現プラスミドを一過的にトランスフェクションしたＨ１２９９細胞のうち、アポトーシスを起こしている細胞の割合を示したグラフである。 所定の発現プラスミドを一過的にコトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞に対して免疫沈降及びイムノブロットを行った結果を表す図である。 所定の発現プラスミドを一過的にコトランスフェクトしたＣＯＳ７細胞に対して免疫沈降及びイムノブロットを行った結果を表す図である。 ＦＬＡＧ−ＩＫＫ−α（Ｋ４４Ａ）をトランスフェクトした／しないＵ２ＯＳ細胞をシスプラチンで処理した／処理しなかったときの、イムノブロット（上図）及びＲＴ−ＰＣＲ分析（下図）の結果を表す図である。 β−ガラクトシダーゼ発現プラスミドを、ＦＬＡＧ−ＩＫＫ−α（Ｋ４４Ａ）発現プラスミドと一緒に又は無しに、トランスフェクトしたＵ２ＯＳ細胞のうち、アポトーシスを起こしている細胞の割合を示したグラフである。 ＦＬＡＧ−ＩＫＫ−α（Ｋ４４Ａ）をトランスフェクトした／しないＨ１２９９細胞をシスプラチンで処理した／処理しなかったときの、イムノブロット（上図）及びＲＴ−ＰＣＲ分析（下図）の結果を表す図である。 β−ガラクトシダーゼ発現プラスミドを、ＦＬＡＧ−ＩＫＫ−α（Ｋ４４Ａ）発現プラスミドと一緒に又は無しに、トランスフェクトしたＨ１２９９細胞のうち、アポトーシスを起こしている細胞の割合を示したグラフである。 ＤＮＡ損傷により誘導されるアポトーシス中の、ＩＫＫ、ｐ７３及びＮＦ−κＢの模式図を表す。 ＦＬＡＧ−ＵＦＤ２ａをトランスフェクトした／しなかったＣＯＳ７細胞をシスプラチンで処理した／しなかったときの、イムノブロットの結果を表す図である。 所定の組み合わせの発現プラスミドを一過的にコトランスフェクトしたＨ１２９９細胞のうち、アポトーシスを起こしている細胞の割合を示したグラフである。

Claims (10)

1. ｐ７３とＩＫＫ−αとの相互作用を増強する化合物を、アポトーシスを促進する化合物と判定する判定工程を備える、アポトーシスを促進する化合物のスクリーニング方法。
2. 被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、ｐ７３及びＩＫＫ−αを発現した細胞を培養する培養工程と、
   培養したそれぞれの細胞における、ｐ７３とＩＫＫ−αとの相互作用を測定する測定工程と、
   被検化合物の存在下において培養した細胞におけるｐ７３とＩＫＫ−αとの相互作用が、被検化合物の非存在下において培養した細胞におけるｐ７３とＩＫＫ−αとの相互作用よりも強い場合に、当該被検化合物をアポトーシスを促進する化合物と判定する判定工程と、
   を備える、アポトーシスを促進する化合物のスクリーニング方法。
3. ｐ７３とＩＫＫ−αとの相互作用を阻害する化合物を、アポトーシスを抑制する化合物と判定する判定工程を備える、アポトーシスを抑制する化合物のスクリーニング方法。
4. 被検化合物の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、ｐ７３及びＩＫＫ−αを発現した細胞を培養する培養工程と、
   培養したそれぞれの細胞における、ｐ７３とＩＫＫ−αとの相互作用を測定する測定工程と、
   被検化合物の存在下において培養した細胞におけるｐ７３とＩＫＫ−αとの相互作用が、被検化合物の非存在下において培養した細胞におけるｐ７３とＩＫＫ−αとの相互作用よりも弱い場合に、当該被検化合物をアポトーシスを抑制する化合物と判定する判定工程と、
   を備える、アポトーシスを抑制する化合物のスクリーニング方法。
5. 配列番号２４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質からなるアポトーシス促進剤。
6. 配列番号２４に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸からなるアポトーシス促進剤。
7. 配列番号２５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質からなるアポトーシス抑制剤。
8. 配列番号２５に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸からなるアポトーシス抑制剤。
9. 配列番号２６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質からなるアポトーシス抑制剤。
10. 配列番号２６に示すアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする核酸からなるアポトーシス抑制剤。

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