JP4411279B2 - 細胞観察チェンバー - Google Patents

Description

本願の発明は、細胞観察チェンバーに関し、特に細胞が自力で一定の方向に移動するか否かの判定、細胞が自力で一定の方向に移動する状態の観察、自力で一定の方向に移動した細胞の数の計測および自力で一定の方向に移動する細胞の分離等のために使用される装置、すなわち、細胞走化性検出・走化性細胞分離装置において、その心臓部をなす、細胞を入れる複数のウエルと細胞の流路、細胞の動きを観察する窓等を備えて成る細胞観察チェンバーに関する。

従来、細胞走化性検出・走化性細胞分離装置としては、種々のものが提案され、市販されているが、特に走化性因子による細胞の走化性または走化性因子阻害剤による細胞の走化性阻害を検出するに当たり、少量の細胞試料を用いて、細胞の自力に基づく動きを正確、しかも、その過程を容易に観察、定量し得るようにした装置として、特開２００２−１５９２８７号公報に記載されたものがある。このものにおいては、また、細胞の走化性を利用して、細胞を分離することも可能である。

上記公報に記載された細胞走化性検出・走化性細胞分離装置において、細胞観察チェンバーは、次のように構成されている。
図１６に図示されるように、その細胞観察チェンバー００は、底部中央に細胞の動きを観察する窓０１ｃを備えた円形の浅い皿状の底支持体０１と、底支持体０１の底部０１ａ上に載置されるガラス基板０８と、底支持体０１に装着されて、後述するカバー０４の底支持体０１へのねじ結合により、ガラス基板０８を上方から圧し、これを底部０１ａ上に固定する皿状の中間支持体０２と、中間支持体０２の底部中央に形成された矩形状の開口部０２ｃに嵌め込まれて、ガラス基板０８上に定置される基板０７およびパッキン部材０１０と、中間支持体０２の中央凹部に嵌め込まれて、基板０７をパッキン部材０１０を介して圧し、図示されない押しねじによりこれをガラス基板０８上に固定するブロック体０９と、底支持体０１にねじ結合により装着されて、ブロック体０９を上方から圧し、これを固定するカバー０４とから成っている。基板０７は、シリコン単結晶素材から製作されている。

底支持体０１と中間支持体０２との結合は、底支持体０１の胴体部内周面に形成された雌ねじ０１ｄに、中間支持体０２の胴体部外周面に形成された雄ねじ０２ｄがねじ込まれることによって、さらに、底支持体０１とカバー０４とのねじ結合によってなされる。この底支持体０１とカバー０４とのねじ結合は、カバー０４の袖部内周面に形成された雌ねじ０４ａに、底支持体０１の外周面に形成された雄ねじ０１ｅがねじ込まれることによってなされる。中間支持体０２は、そのフランジ部０２ｂの下面に形成されたガイドピン受孔０２ｆに底支持体０１の胴体部上面に立設されたガイドピン（図示されず）が挿通されることによって、底支持体０１上に位置決めされる。また、ブロック体０９は、その底面に形成されたガイドピン受孔０９ａに中間支持体０２の底面に立設されたガイドピン０１３が挿通されることによって、中間支持体０２内に位置決めされる。

そして、これらの部品が一体に組み立てられて、使用される状態においては、基板０７とガラス基板０８との間に、少なくとも一対のウエルと、これらのウエルを連通する流路とが形成される。これらのウエルのうちの一方のウエルには、細胞浮遊液が入れられ、他方のウエルには、走化性因子含有溶液が入れられて、細胞が、走化性因子に反応して、一方のウエルから他方のウエルに流路を通って移動する。その状態の観察や移動する細胞の数の計測が、窓０１ｃを通して顕微鏡観察により行なわれる。

基板０７とガラス基板０８との間に形成される一方のウエルへの細胞浮遊液の注入、他方のウエルへの走化性因子含有溶液の注入は、マイクロピペットを用いて、ブロック体０９、パッキン部材０１０、基板０７にそれぞれ形成された専用の通孔を連ねて行なわれる。底支持体０１、中間支持体０２、カバー０４を組み立てた後、底支持体０１に充填された各溶液が漏れないように、中間支持体０２とガラス基板０８との間には、Ｏリング０１１が介装されている。他方、パッキン部材０１０も、基板０７とブロック体０９との間にあって、両ウエルとそれらの間を結ぶ流路から溶液が漏れないようにするために役立つ。

従来の細胞観察チェンバーは、前記のように構成されているので、中間支持体０２の底支持体０１への装着、カバー０４の底支持体０１への装着は、いずれもねじ結合によって行なわれており、このため、それらの圧接には一定の圧力を必要とするため、専用の組立工具が必要となり、分解・組立の操作性が良くなく、煩雑なものであった。

特開２００２−１５９２８７号公報 特開２００３−０８８３５７号公報

本願の発明は、従来の細胞観察チェンバーが有する前記のような問題点を解決して、中間支持体の底支持体への装着、カバーと一体化したブロック体の、中間支持体を装着した底支持体への装着に、専用の組立工具を必要とせず、関連部品相互間の圧接の圧力を常に一定に保持することができて、組立・分解の操作性が格段に向上された、細胞観察チェンバーを提供することを課題とする。

本願の発明によれば、このような課題は、次のような細胞観察チェンバーにより解決される。
すなわち、その細胞観察チェンバーは、細胞の走化性の検出や走化性細胞の分離のために用いられる装置における細胞観察チェンバーであって、底部中央に細胞の動きを観察するための窓が設けられた皿状の底支持体と、前記底支持体の底面上に載置されるガラス基板と、底部中央に開口部が形成され、前記底支持体に装着されて、前記ガラス基板を上方から圧し、これを前記底支持体の底面上に固定する皿状の中間支持体と、細胞浮遊液および走化性因子含有溶液を通す通孔が上下方向に複数貫通形成されるとともに、前記ガラス基板の中央部の表面上に定置されて、前記ガラス基板との間に少なくとも一対のウエルと、これらのウエルを連通する流路とを形成する凹凸形状が、前記ガラス基板との対向面に形成されている基板と、前記細胞浮遊液および前記走化性因子含有溶液を通す通孔が上下方向に複数貫通形成されていて、前記中間支持体の底部中央に形成された前記開口部に嵌め込まれ、前記基板を上方から圧するパッキン部材と、底部中央に前記細胞浮遊液および前記走化性因子含有溶液を通す通孔が上下方向に複数貫通形成されていて、前記中間支持体が装着される前記底支持体に装着され、前記基板を前記パッキン部材を介して上方から圧して、これを前記ガラス基板上に固定する皿状のカバーブロック体とを備えて成り、前記中間支持体の前記底支持体への装着、前記カバーブロック体の前記底支持体への装着は、カム機構を内蔵したレバー機構を用いて、それぞれの当接面同士を上下方向に圧接させることによって行なわれ、前記カム機構は、前記底支持体に回動自在に支持される２本のコの字状レバーの両脚部にそれぞれ形成されたカム溝と、該カム溝内を滑動し、前記中間支持体および前記カバーブロック体の各外周面上の対応する２点にそれぞれ植設されたピンとから成ることを特徴としている。

この細胞観察チェンバーによれば、その中間支持体の底支持体への装着、カバーブロック体の底支持体への装着は、カム機構を内蔵した（一対の）レバー機構を用いて、それぞれの当接面同士を上下方向に圧接させることによって行なわれているので、組立・分解のための専用の工具が不要となり、組立・分解の操作性を格段に向上させることができる。また、これにより、装着に関連する部品相互間の圧接の圧力を常に一定に保持することができて、チェンバー内溶液の漏れを確実に防ぐことができる。

また、そのカム機構は、底支持体に回動自在に支持される２本のコの字状レバーの両脚部にそれぞれ形成されたカム溝と、該カム溝内を滑動し、中間支持体およびカバーブロック体の各外周面上の対応する２点にそれぞれ植設されたピンとから成るものとされている。これにより、カム機構の構造がきわめて簡単になるとともに、それぞれのコの字状レバーを回動操作するだけで、中間支持体の底支持体への装着と離脱、カバーブロック体の底支持体への装着と離脱とを行なうことができるので、カム機構の操作がきわめて容易になる。

好ましい実施形態では、前記レバー機構は、前記底支持体に回動自在に支持される２本のコの字状のカム操作レバーと、該各カム操作レバーの両端部にそれぞれ設けられた両脚部内側に形成されるカム溝と、該カム溝内を滑動され、前記中間支持体および前記カバーブロック体の各外周面上の対応する２点にそれぞれ植設されるピンと、で構成される第１および第２のカム機構を更に備え、前記中間支持体が前記底支持体に装着され、前記第１のカム機構を用いて、それぞれの当接面同士を上下方向に圧接し、前記カバーブロック体が前記中間支持体に装着され、前記第２のカム機構を用いて、それぞれの当接面同士を上下方向に圧接するようにされる。

別の好ましい実施形態では、前記底支持体の胴体部の外周面に、底支持体の軸心に関して対称の位置に一対の支持軸を植設し、平面視コの字状で、両側に脚部を有するカム操作レバーを内側と外側に２つ配置し、前記一対の支持軸の回りに、各カム操作レバーの両脚部を回動自在に設け、前記各カム操作レバーの両脚部の内面に、カム溝をそれぞれ湾曲状に形成し、前記中間支持体および前記カバーブロック体のそれぞれの上部に外周フランジ部を設け、前記中間支持体の外周フランジ部の外周面上に、中間支持体の軸心に関して対称の位置に一対のピンを植設し、前記カバーブロック体の外周フランジ部の外周面上に、カバーブロック体の軸心に関して対称の位置に一対のピンを植設し、前記中間支持体を前記底支持体に載せ、中間支持体のピンを内側のカム操作レバーのカム溝に嵌め込み、内側のカム操作レバーを回動させてピンをカム溝内で滑動させ、中間支持体を底支持体に固定し、前記カバーブロック体を前記中間支持体に載せ、カバーブロック体のピンを外側のカム操作レバーのカム溝に嵌め込み、外側のカム操作レバーを回動させてピンをカム溝内で滑動させ、カバーブロック体を中間支持体に固定するようにされる。

更に別の好ましい実施形態では、前記底支持体の胴体部の上面および前記カバーブロック体の外周フランジ部の下面に、それぞれ位置決め用ピンを取り付け、それらの位置決め用ピンにて、底支持体と中間支持体および中間支持体とカバーブロック体との周方向の相対的な位置決めを行なうようにされる。

以上に説明したとおり、本願の発明によれば、中間支持体の底支持体への装着、カバーブロック体の底支持体への装着が、カム機構を内蔵したレバー機構やクランプ機構などを用いて、それぞれの当接面同士を上下方向に圧接させることによって行なわれているので、組立・分解のための専用の工具が不要となり、組立・分解の操作性を格段に向上させることができる。また、これにより、装着に関連する部品相互間の圧接の圧力を常に一定に保持することができて、チェンバー内溶液の液漏れを確実に防ぐことができる。

また、そのカム機構は、底支持体に回動自在に支持される２本のコの字状レバーの両脚部にそれぞれ形成されたカム溝と、該カム溝内を滑動し、中間支持体およびカバーブロック体の各外周面上の対応する２点にそれぞれ植設されたピンとから成るものとされているので、カム機構の構造がきわめて簡単になるとともに、それぞれのコの字状レバーを回動操作するだけで、中間支持体の底支持体への装着と離脱、カバーブロック体の底支持体への装着と離脱とを行なうことができるので、カム機構の操作がきわめて容易になる。

本願の発明の細胞観察チェンバーの作動原理を示す、ウエル、流路および通孔を含む装置ユニット部分の縦断面図である。 同下面図である。 同流路部分の拡大横断面図である。 同流路部分の下面図である。 同流路部分の縦断面図である。 本実施例の細胞観察チェンバーが適用される細胞走化性検出・走化性細胞分離装置の全体斜視図である。 本実施例の細胞観察チェンバーの全体斜視図である。 同平面図である。 同前側面図である。 同右側面図である。 同ＸＩ−ＸＩ線矢視断面図である。 同ＸＩＩ−ＸＩＩ線矢視断面図である。 同一部分解斜視図である。 さらに分解を進めた同一部分解斜視図である。 チェンバー内混合液の温度制御システムのブロック線図である。 従来の細胞観察チェンバーの分解図である。

細胞観察チェンバーを構成する中間支持体の底支持体への装着、同じくカバーブロック体の底支持体への装着を、カム機構を内蔵したレバー機構を用いて、それぞれの当接面同士を上下方向に圧接させることによって行なうようにする。この場合において、カム機構は、底支持体に回動自在に支持される２本のコの字状レバーの両脚部にそれぞれ形成されたカム溝と、該カム溝内を滑動し、中間支持体およびカバーブロック体の外周面上の対応する２点にそれぞれ植設されたピンとから成るものとし、中間支持体の底支持体への装着、カバーブロック体の底支持体への装着のために、それぞれ専用のカム機構を設けるようにする。

次に、本願の発明の一実施例について説明する。
先ず、本願の発明が適用される細胞走化性検出・走化性細胞分離装置におけるチェンバーの作動原理について説明する。このチェンバーは、複数のウエルが流路を挟んで結合し、互いに連通しており、それぞれのウエルには、試料を注入もしくは採取するための管および試料の注入もしくは採取によるウエル内の昇圧もしくは減圧を回避するための管の２本の管が設けられている。この管は、ブロックに形成された通孔により形成されてもよい。ここで、流路とは、２つのウエルを連通させている部分であり、一方のウエルから他方のウエルに細胞が移動するときに、細胞が通過する通路である。この装置によれば、試料を注入・採取する際、流路において相対するウエルに向かう方向の液流が生じにくく、流路の両端にあるウエルの液体が互いに混ざり合うことがなく、その結果、細胞が専ら走化性因子の作用のみによって移動する場合を検出することができる。

図に基づいて、その原理を説明すると、図１および図２において、１は流路、２は細胞浮遊液や検体溶液等の試料を収納するウエルであり、一対のウエル２Ａ、２Ｂから成る。これらの試料は、マイクロピペット等により、ブロック体９に形成された通孔３を通じてウエル２に供給され、また、ウエル２から採取される。ウエル２の一方のウエル２Ａに細胞浮遊液を入れたとき、細胞は、他方のウエル２Ｂに入れられた検体溶液が走化性因子を含むもの（走化性因子含有溶液）である場合には、ウエル２Ｂに向かって移動しようとし、流路１を通過する。

試料の１つである細胞浮遊液を、マイクロピペット等により、通孔３を通じてウエル２Ａに供給する際、注入する液圧により、細胞が流路１を通過して反対側のウエル２Ｂに移動してしまうことが生じる。この事態が生ずると、細胞の移動が検体の有する走化性因子によるのか否かの判定に混乱を与える要因になるとともに、細胞の分離を目的とする場合には、所望の細胞に他の細胞が混入してしまうことになり、目的が達せられないことになる。この問題点を解決するために、この装置においては、通孔３に加わる注入圧を通孔４の方に逃がし、流路１に向かって細胞が強制的に流されることを防止している。

同様に、検体溶液を、マイクロピペット等により、通孔３を通じてウエル２Ｂに供給する際にも、注入する液圧により、検体溶液が流路１を通過して反対側のウエル２Ａに入り、細胞浮遊液と混合する事態が生じ、細胞がその走化性により流路１を通過する現象が混乱ないし阻害される。このような事態の発生を防止するために、検体を収納するウエル２Ｂにおいても、通孔４を設けるようにしている。

このようにして、試料を注入する通孔３に連通する通孔４を設けることにより、水平方向への液圧の影響を最小にすることができ、検体溶液が走化性を有するか否かの判定をより正確に行なうことができる。通孔４による圧力差の緩和作用は、ウエルから細胞などの試料を採取する際の減圧を緩和する上でも有効であり、試料の採取を容易にする。

本装置において、ウエル２に試料を注入する場合を、図１により説明すると、予め各ウエル２Ａ、２Ｂおよび流路１を細胞等張液で満たしておき、ウエル２Ａの通孔３から細胞浮遊液を、ウエル２Ｂの通孔３から走化性因子含有溶液を、それぞれ略等量ずつ注入する。このようにすることにより、試料注入時の昇圧は、通孔４により緩和される。

流路１は、図３ないし図５に図示されるように、ウエル２Ａからウエル２Ｂに、もしくはその逆に向かう方向と直交する方向に走る障壁６に、ウエル２Ａからウエル２Ｂに、もしくはその逆に向かう方向に沿わせて形成された１本ないし複数本、例えば、約１００本の溝５により構成されている。これらの溝５は、細胞の径もしくはその変形能に合わせた幅に形成される。このような溝５を設けることによって、細胞を個々のレベルで観察することが可能になり、また、細胞を所望の種類毎に分離することが可能になる。
なお、図１ないし図３における符号７ａは、ウエル２Ａとウエル２Ｂとの間に形成される土手を示し、図３および図４における符号７ｂは、土手７ａに形成されるテラスを示している。テラス７ｂは、障壁６を囲む平坦部である。

細胞が流路１を移動する状態の観察、流路１を通過中もしくは通過後の細胞数の計測は、図３に図示されるように、流路１に検知装置、例えば、顕微鏡７０をセットすることによって行なわれる。また、顕微鏡とビデオカメラあるいはＣＣＤカメラとを組み合わせることにより、自動的に細胞が移動する経過を記録することができる。

以上に説明したような、通孔３、４をそれぞれ備えたウエル２Ａ、２Ｂが流路１を介して連通されて成る装置を１ユニットとして、複数のユニットを集積させることにより、他種類の検体または他種類の細胞を対象として、同時に細胞の移動（走化性）の検出や走化性細胞の分離を行なうことができる装置を構成することができる。このような装置は、全体的に小型化されており、試料の処理を微量で行なうことができる。また、液体の注入・採取量のプログラム制御により、処理を自動化して行なうことが容易である。

以上に説明したような、通孔３、４をそれぞれ備えたウエル２Ａ、２Ｂが流路１を介して連通されて成るユニットは、実際には、次のようにして製作される。
ウエル２Ａ、２Ｂ、流路１の内部形状は、シリコン単結晶素材から成る基板７の表面上に、既知の集積回路の製作技術を応用することによって形成することができる。このようにして、その表面上にウエル２Ａ、２Ｂ、流路１の内部形状を写した凹凸形状が刻設された基板７をガラス基板８と対面させて、重ね合わせれば、それら両基板７、８の間にウエル２Ａ、２Ｂ、流路１が形成される。

基板７には、また、ウエル２Ａ、ウエル２Ｂのそれぞれに対応させて、細胞浮遊液もしくは走化性因子含有溶液を通す通孔３’が上下方向に貫通形成されているとともに、それらの溶液をウエル２Ａ、ウエル２Ｂに注入もしくはそこから採取するに際して生ずる昇圧、降圧を緩和させるための通孔４’が、通孔３’と対にされて、上下方向に貫通形成されている。これら一対の通孔３’、４’は、ウエル２Ａもしくはウエル２Ｂを介して連通しているとともに、ブロック体９に上下方向に貫通形成された通孔３、４にそれぞれ連通している。なお、基板７とブロック体９との間には、実際には、パッキンが介在させられて、それらの間の液封がなされるようになっている。

次に、前記したような、通孔３、４をそれぞれ備えたウエル２Ａ、２Ｂが流路１を介して連通されて成るユニットが複数組み込まれて成る本実施例の細胞観察チェンバーについて、詳細に説明する。
先ず、本実施例の細胞観察チェンバーが適用される細胞走化性検出・走化性細胞分離装置の全体構造のあらましについて説明する。

図６に図示されるように、本実施例の細胞観察チェンバー３０が適用される細胞走化性検出・走化性細胞分離装置１０は、比較的高さの低い直方体形状のケーシング２０の上面からその一部が露出するようにして、細胞観察チェンバー３０が収納されている。また、そのケーシング２０の上面には、ノート型パソコン５０が設置されており、このノート型パソコン５０の作動により、細胞浮遊液等含有溶液の温度制御部に対する指令、同温度データや細胞観察データの解析、記録、モニター表示等が行なわれる。このモニター表示には、細胞の実際の動きの映像表示も含まれる。

ケーシング２０の上面には、他に水準器２１が取り付けられており、装置１０の水平を常時監視することができる。また、ケーシング２０の前側面には、図６において右下方から左上方に向かって順に、顕微鏡による細胞観察画像の明るさ（ライトの強弱）調整つまみ２２、顕微鏡の位置調整つまみ２３、焦点調整レバー２４等が取り付けられている。図示されない顕微鏡の光学系光軸は、ケーシング２０内において水平に配置されているので、ケーシング２０、牽いては装置１０の全高を低くすることができ、机上に置かれた本装置１０に対して、座位にて細胞走化性の検出、走化性細胞の分離、計数等の作業を行なうことができ、操作性が大きく改善される。

細胞観察チェンバー３０は、次のようにして構成されている。
図７〜図１０、図１３および図１４に図示されるように、本細胞観察チェンバー３０は、その外観および後述するカム操作レバー３６、３７の簡単な回動操作によるその一部分解から、次のようにして構成されていることが理解されるであろう。すなわち、最下段に配置される円形皿状の底支持体３１の上には、同じく円形皿状の中間支持体３２が装着され、中間支持体３２の上には、同じく円形皿状で、底部３３ａが比較的厚く、外周フランジ部３３ｂが比較的幅広のカバーブロック体３３が装着され、カバーブロック体３３の上には、該カバーブロック体３３の中央凹部３３ｃを跨ぎ、その中央膨大部３４ａを該中央凹部３３ｃに沈めるようにして、ガイドブロック体３４が装着され、カバーブロック体３３の上面には、温度センサー３５の台座部分３５ａが着座させられている。

そして、カバーブロック体３３は、カム操作レバー３６を回動することにより、中間支持体３２に上方から圧接され、これにより、中間支持体３２が、底支持体３１に上方から圧接されて、最終的には、カバーブロック体３３が、底支持体３１に装着される。また、中間支持体３２は、カム操作レバー３７を回動することにより、底支持体３１に上方から圧接されて、これに装着されている。なお、実際の装着の順序は、中間支持体３２が底支持体３１に装着されてから、カバーブロック体３３が底支持体３１に装着されることになる。分解の場合には、この逆の順序になる。カバーブロック体３３は、従来の細胞観察チェンバー００（図１６参照）におけるブロック体０９とカバー０４とが合体されたものに相当している。

カム操作レバー３６、３７は、いずれも平面視コの字状をなしており、それらの両脚部の端部３６ａ、３７ａは、円形皿状の底支持体３１の胴体部３１ｂの外周面上であって、その軸心に関して対称の位置に植設された一対の支持軸３８の回りに回動自在に支持されている。また、それらの両脚部の端部３６ａ、３７ａは、正面視矩形状に膨大化されていて、それらの内面には、カム操作レバー３６については、カム溝３６ｂが、カム操作レバー３７については、カム溝３７ｂが、それぞれ湾曲状に形成されている（図１３、図１４参照）。

円形皿状のカバーブロック体３３の外周フランジ部３３ｂの外周面上であって、その軸心に関して対称の位置には、ピン４０が植設されている（図１４、図１１参照）。このピン４０は、カム操作レバー３６のカム溝３６ｂに嵌まり込んで、カム操作レバー３６が回動操作されるとき、カム溝３６ｂ内を滑動する。これにより、カバーブロック体３３は、その外周フランジ部３３ｂの下面が中間支持体３２の外周フランジ部３２ｂの上面に上方から接近して、これに当接し、最終的には、中間支持体３２の開口部３２ｃに嵌め込まれたパッキング部材４４と基板７とをガラス基板８に押し付けながら、底支持体３１に装着される。また、カム操作レバー３６を逆に回動操作することにより、カバーブロック体３３は、底支持体３１から取り外される。カバーブロック体３３の外周フランジ部３３ｂと中間支持体３２の外周フランジ部３２ｂとの間には、カバーブロック体３３が中間支持体３２に装着されたとき、これらの間に形成される内部空間から媒質が漏洩するのを防止するために、Ｏリング４２が介装されている。

同様に、円形皿状の中間支持体３２の外周フランジ部３２ｂの外周面上であって、その軸心に関して対称の位置には、ピン４１が植設されている（図１１参照）。このピン４１は、カム操作レバー３７のカム溝３７ｂに嵌まり込んで、カム操作レバー３７が回動操作されるとき、カム溝３７ｂ内を滑動する。これにより、中間支持体３２は、その外周フランジ部３２ｂの下面が底支持体３１の胴体部３１ｂの上面に上方から接近して、これに当接し、底支持体３１に堅固に装着される。また、カム操作レバー３７を逆に回動操作することにより、中間支持体３２は、底支持体３１から取り外される。

ガイドブロック体３４の中央膨大部３４ａには、上下方向に貫通し、ガイドブロック体３４の長さ方向に一列に整列させられて、細い６個の通孔３４ｃが形成されている。これらの通孔３４ｃは、作業者が細胞浮遊液や検体溶液等の試料を含んだマイクロピペット（図示されず）の針先をチェンバー３０内に挿入し、また、そこから抜き出すときに、マイクロピペットの針先をガイドするとともに、マイクロピペットから吐出されたそれらの溶液を後述するウエル（このウエルは、前記した、一対のウエル２Ａ、２Ｂ（図１）のうちのいずれかのウエルと同じものである。）に導くのに役立つ。６個の通孔３４ｃの整列位置は、ガイドブロック体３４を平面視幅方向に二分する中心線ａから片方にわずかに変位させられている（図８参照）。

ガイドブロック体３４は、その中央膨大部３４ａを挟んだ両側のアーム部３４ｂ、３４ｂとカバーブロック体３３のフランジ部３３ｂとの間にピン３９が通されることにより、位置決めされて、フランジ部３３ｂ上に着脱自在に装着されている。したがって、ガイドブロック体３４は、これをカバーブロック体３３から取り外し、両側のアーム部３４ｂ、３４ｂの位置が入れ替わるように１８０度回転させて、反転前と同様にピン３９により位置決めすることにより、カバーブロック体３３のフランジ部３３ｂ上に再び着脱自在に装着することができる。このとき、６個の通孔３４ｃの整列位置は、反転前の整列位置と中心線ａに関して対称の位置にある。

カバーブロック体３３と中間支持体３２との間の円周方向の相対的な位置決めを行なうために、一対の位置決め用ピン４６ａ、４６ｂが、カバーブロック体３３と中間支持体３２とに跨がるようにして、それぞれに形成された孔内に通されている。同様に、中間支持体３２と底支持体３１との間の円周方向の相対的な位置決めを行なうために、一対の位置決め用ピン４７ａ、４７ｂが、中間支持体３２と底支持体３１とに跨がるようにして、それぞれに形成された孔内に通されている。ピン４６ａとピン４６ｂ、ピン４７ａとピン４７ｂは、それぞれ異なる径を持ち、組立時の組み間違いを未然に防止する機能を果している。

次に、本細胞観察チェンバー３０の内部構造について、詳細に説明する。
底支持体３１は、その底部３１ａの中央に、細胞の動きを観察する窓３１ｃが設けられている。また、その底面上には、透明なガラス基板８が載置されている。このガラス基板８は、中間支持体３２が底支持体３１に装着されたとき、中間支持体３２の底部３２ａにより底部３１ａに強く押し付けられて、そこに固定される。底部３２ａとガラス基板８との間には、それらの外周側に、Ｏリング４３が介装されており、これにより、それらの間に形成される内部空間から媒質が漏洩するのを防止するようになっている。

ガラス基板８の中央部の表面上には、基板７が載置されている。これらガラス基板８、基板７は、前記した、図１におけるガラス基板０８、基板０７と基本的に同じ構造の同じものである。したがって、基板７のガラス基板８と対向する側の表面上には、一対のウエル２Ａ、２Ｂと、これらを連通させる流路１の内部形状を写した凹凸形状が６ユニット分、刻設されており、これがガラス基板８と対面させられて、重ね合わされた状態においては、それら両基板７、８間に６ユニット分のウエル２Ａ、２Ｂ、流路１の組合せ構造が形成される。

基板７には、また、前記のとおり、ウエル２Ａ、ウエル２Ｂのそれぞれに対応させて、細胞浮遊液もしくは走化性因子含有溶液を通す通孔３’が上下方向に貫通形成されているとともに、それらの溶液をウエル２Ａ、ウエル２Ｂに注入もしくはそこから採取するに際して生ずる昇圧、降圧を緩和させるための通孔４’が、通孔３’と対にされて、上下方向に貫通形成されている。これら一対の通孔３’、４’は、ウエル２Ａもしくはウエル２Ｂを介して連通している。

中間支持体３２の底部３２ａの中央部には、開口部３２ｃが形成されており、この開口部３２ｃには、底部３２ａの厚さよりもわずかに厚いパッキン部材４４が嵌め込まれる。このパッキン部材４４は、カバーブロック体３３が前記のようにして底支持体３１に装着されると、その開口部３２ｃから突出して、ガラス基板８上に載置された基板７を上方から圧し、これをガラス基板８に押し付ける。
基板７は、非常に薄いので、図１１、図１２においては、ガラス基板８とパッキン部材４４とに挟まれた太い実線の線分として描かれている。基板７に形成される通孔３’、４’、ウエル２Ａ、２Ｂ、流路１の形状は、図示されていない。

このパッキン部材４４には、基板７に貫通形成された通孔３’、４’にそれぞれ連通する通孔３−１、４−１が、通孔３’、４’の総数と同じ数だけ、上下方向に貫通形成されている。通孔３’、４’は、それらの一対がウエル２Ａ、ウエル２Ｂのそれぞれに形成されているから、１ユニットについて合計４個の通孔が形成されていることになり、それが６ユニット分集積されるから、総計２４個の通孔（通孔３−１、４−１の群）が縦横に整列させられて形成されていることになる。通孔３−１は、図１１において、紙面と直交する奥方および手前側にあり、図示されていない。

なお、パッキン部材４４に貫通形成される通孔３−１、４−１は、必ずしも分離して別々に形成される必要はなく、通孔３−１が通孔４−１に合体させられてもよい。このようにしても、例えば、流下する溶液と上昇しようとする気体とが混じり合ってしまうことはなく、気体は、流下する溶液中を抜けて、その上の通孔４−２を通って排気されるから、ウエル内の昇圧を緩和する機能に支障は生じない。図１２には、このようにされたパッキン部材４４の構造が図示されている。また、そのためには、カバーブロック体３３に形成される通孔３−２、４−２の下端部をわずかな長さ切除して、そこに小さな空所を形成するようにすると、昇圧・降圧緩和の機能を一層確実に保持することができる（図１２中、通孔３−２、４−２直下の左右２つの小さな空白部参照）。

カバーブロック体３３が底支持体３１に装着されるとき、カバーブロック体３３の底部３３ａの下面は、パッキン部材４４の上面に当接して、これを圧する。したがって、基板７は、結局、パッキン部材４４を介してカバーブロック体３３により押圧されて、ガラス基板８上に固定されることになる。

カバーブロック体３３の底部３３ａの周縁寄りの１個所には、チェンバー３０内の混合液が中央凹部３３ｃに出入りするための比較的大径の通孔３３ｄが上下方向に貫通形成されている。また、底部３３ａの中央部には、パッキン部材４４に貫通形成された通孔３−１、４−１に連通する通孔３−２、４−２が、通孔３−１、４−１の総数と同じ数だけ、上下方向に貫通形成されている。これら底部３３ａの中央部に形成された通孔群のうち、ウエル２Ａ側に属する通孔４−２の６ユニット分、すなわち、ウエル２Ａ側に属する整列させられた６個の通孔４−２は、図８に図示される姿勢でカバーブロック体３３に装着されたガイドブロック体３４の６個の通孔３４ｃに１対１で対応して、それらの中心線を共有している。

ガイドブロック体３４を図８に図示される姿勢から１８０度回転させて、両側のアーム部３４ｂ、３４ｂの位置を入れ替えれば、今度は、ウエル２Ｂ側に属する整列させられた６個の通孔４−２が、ガイドブロック体３４の６個の通孔３４ｃに１対１で対応することになる。ガイドブロック体３４のこのような姿勢の転換は、例えば、マイクロピペットによる細胞浮遊液のウエル２Ａへの注入と、マイクロピペットによる走化性因子含有溶液のウエル２Ｂへの注入とが、引き続いて行なわれる場合に、採られることができる。

以上の説明から明らかなとおり、基板７に貫通形成された通孔３’、４’、パッキン部材４４に貫通形成された通孔３−１、４−１、カバーブロック体３３の底部３３ａに貫通形成された通孔３−２、４−２は、それぞれ互いに連通し合っており、このようにして連通し合う通孔４’、４−１、４−２から形成される１本の通孔集合体の６ユニット分は、図８に図示される姿勢でカバーブロック体３３に装着されたガイドブロック体３４に形成された６個の通孔３４ｃに１対１で対応して、それらの中心線を共有している（図１１、図１２参照）。なお、基板７に貫通形成された通孔３’、４’は、非常に微小であるので、図１１、図１２においては、図示されていない。通孔４−１、４−２から成る通孔の集合体は、図１における通孔４に相当している。

したがって、今、ウエル２Ａ、２Ｂ、通路１に細胞等張液が満たされ、ウエル２Ｂに走化性因子含有溶液が注入されているとし、ウエル２Ａにマイクロピペットにより細胞浮遊液を注入しようとするとき、マイクロピペットの先端を使用対象となるユニットのウエル２Ａに通ずる通孔３４ｃに挿入して、これにガイドさせながら所要深さまで進入させ、そこで細胞浮遊液を吐出すると、吐出された細胞浮遊液は、次いで、通孔４−２、４−１、４’を順次流下して、ウエル２Ａに到る。このとき、ウエル２Ａ内の圧力上昇は、通孔３’、３−１、３−２を経て外部に逃がすことができ、走化性因子含有溶液に反応する細胞の走化性に対する圧力変動の影響を最小限にすることができる。

ウエル２Ｂにマイクロピペットにより走化性因子含有溶液を注入しようとするときも、同じ要領にて行ない、マイクロピペットから吐出された走化性因子含有溶液を、今度は、ウエル２Ｂ側に属する通孔４−２、４−１、４’を順次流下させて、ウエル２Ｂに到らせることができる。

ウエル２Ａに供給された細胞浮遊液中の細胞は、ウエル２Ｂ内の走化性因子含有溶液に反応すると、流路１を通ってウエル２Ａからウエル２Ｂへと移動する。その状態および数を、細胞レベルで、窓３１ｃを通して顕微鏡により観察、計測することができる。

このようにして、流路１を通ってウエル２Ａからウエル２Ｂへと移動する細胞の走化性の検出、その性質を利用した細胞の分離などの作業を行なうのには、これらの領域を満たしている混合液の温度を、その細胞の活動に適した温度に管理する必要がある。また、細胞の温度変化による反応等をより正確に計測、分析したいときにも、混合液の温度管理は必要である。なお、ここで、これらの領域を満たしている混合液とは、細胞等張液と細胞浮遊液との混合液、細胞等張液と走化性因子含有溶液との混合液であり、両混合液の温度は、略等しい。

上記の目的のために、本実施例においては、図１５に図示されるように、２台の温度調節器６２、６３を用い、そのうちの１台目の温度調節器６２は、温度センサー３５を用いて混合液の温度を直接計測し、ヒータにより加熱される加熱部６４を、チェンバー３０をその上にセットした状態で、温度制御して、温度管理の精度を高める。また、２台目の温度調節器６３は、加熱部６４を事前に加熱しておき、混合液の温度が所望の温度に調節できるまでの時間を短縮できるようにする。この温度調節器６３は、また、加熱部６４の過熱防止の機能をも備えている。

温度センサー３５を用いて混合液の温度を直接計測するために、温度センサー３５の温度感知部３５ｂは、図１２に図示されるように、台座部分３５ａから下方に伸びて、混合液と同等の溶液で満たされた液溜め室４５内に直接沈められている。この液溜め室４５内の溶液は、加熱部６４による間接的な加熱を一対のウエル２Ａ、２Ｂと流路１とを満たしている溶液と等しく受けて、その溶液の温度と等しい温度に昇温することができ、温度センサー３５は、一対のウエル２Ａ、２Ｂと流路１とを満たしている溶液の温度と略等しい温度を測定することができる。液溜め室４５内の溶液の液位レベルは、カバーブロック体３３内の混合液の液位レベルＬと略同等である。

液溜め室４５は、カバーブロック体３３の胴体部の外周壁の一部が上下方向に削り取られて形成された凹部が、中間支持体３２の内周壁により周囲を囲まれて形成されたものである。この液溜め室４５は、ウエル２Ａ、２Ｂ、通路１およびこれらに連通する領域から隔離されて設けられるのが望ましい。このために、液溜め室４５の下方部において、液溜め室４５がウエル２Ａ、２Ｂ、通路１およびこれらに連通する領域と接続する個所にパッキン（図示されず）を介装するようにする。このようにすることにより、１台目の温度調整器６２の温度感知部３５ｂは、一対のウエル２Ａ、２Ｂや流路１内に満たされた細胞を含む溶液を汚染することなく、その溶液の温度を正確に測定することができる。

図１５に図示されるブロック線図により、チェンバー内混合液の温度制御システム６０について、さらに詳細に説明すると、先ず、温度調節スイッチ６６がＯＮにされ、切り替えスイッチ６７の予熱側がＯＮにされることにより、温度調節器６３による調節下での加熱部６４の予熱が開始される。この予熱は、加熱部６４の温度をセンサ６５により測定して、それをフィードバックしながら行なわれる。予熱温度の指定は、コンピュータ６１により行なわれる。このコンピュータ６１は、ノート型パソコン５０に内蔵されるものである。６９は、ソリッドステートリレー（ＳＳＲ）である。

加熱部６４の温度が所定の予熱温度に到達し、加熱部６４の上に細胞観察チェンバー３０が載置されると、切り替えスイッチ６７の加熱側がＯＮになるように切り替えられ、温度調節器６２による調節下での加熱部６４の加熱が開始される。この加熱は、チェンバー内混合液を所定の温度にまで加熱することを目的としており、チェンバー内混合液の温度をセンサ３５により測定して、それをフィードバックしながら行なわれる。加熱温度の指定は、コンピュータ６１により行なわれる。加熱部６４は、前記した予熱により、所定の温度にまで上昇しているので、この加熱により、チェンバー内混合液を所定の温度にまで加熱するのは、短時間で行なわれる。

チェンバー内混合液の温度が所定の温度に到達すると、温度調節器６２は、その温度を維持するように加熱部６４の加熱制御を行なう。何らかの原因、例えば、チェンバー３０が加熱部６４に接触していない、などにより、加熱部６４の温度が異常（例えば、４３°Ｃ）に上昇すると、温度調節器６３がリレー６８を作動させ、回路を遮断する。なお、温度調節器６２も、チェンバー内混合液の温度が異常（例えば、３８〜４０°Ｃ）に上昇すると、リレー６８を作動させ、回路を遮断するようになっている。

コンピュータ６１は、加熱部６４の温度、チェンバー内混合液の温度、センサ３５、６５の状態等を常時モニターし、ディスプレイに表示し、また、温度調節器６２、温度調節器６３に加熱温度、予熱温度の指定をそれぞれ行なう。

なお、ここで、本実施例の細胞観察チェンバー３０の実際の組立の手順について、詳細に説明しておく。
先ず、底支持体３１にガラス基板８を装着する。次いで、底支持体３１に中間支持体３２を嵌め合わせ、カム操作レバー３７を回動することにより、中間支持体３２を上方からＯリング４３を介して底支持体３１に圧接させて、これに装着する。これにより、媒質の漏洩が防止されて、これらの部品組立体に容器としての機能を持たせることができる。次いで、中間支持体３２の底部３２ａの中央部に形成された開口部３２ｃにガイドさせながら、基板７をガラス基板８上に載置し、底面部にパッキン部材４４が装着されたカバーブロック体３３を中間支持体３２に嵌め合わせ、カム操作レバー３６を回動することにより、パッキン部材４４を上方から基板７に圧接させるとともに、基板７をガラス基板８に圧接させる。同時に、カバーブロック体３３は、Ｏリング４２を介して中間支持体３２に圧接されて、媒質の漏洩が防止され、これらの部品全体から成る組立体（細胞観察チェンバー３０）にも、容器としての機能を持たせることができる。

本実施例の細胞観察チェンバー３０は、前記のように構成されているので、次のような効果を奏することができる。
中間支持体３２の底支持体３１への装着、カバーブロック体３３の底支持体３１への装着は、カム機構を内蔵したレバー機構（カム操作レバー）３６、３７を用いて、それぞれの当接面同士を上下方向に圧接させることによって行なわれているので、組立・分解のための専用の工具が不要となり、組立・分解の操作性を格段に向上させることができる。また、これにより、装着に関連する部品（底支持体３１、中間支持体３２、カバーブロック体３３）相互間の圧接の圧力を常に一定に保持することができて、チェンバー内溶液の漏れを確実に防ぐことができる。

また、カム機構は、底支持体３１に回動自在に支持される２本のコの字状レバー３６、３７の両脚部にそれぞれ形成されたカム溝３６ｂ、３７ｂと、該カム溝３６ｂ、３７ｂ内を滑動し、カバーブロック体３３および中間支持体３２の各外周面上の対応する２点にそれぞれ植設されたピン４０、４１とから成るものとされているので、カム機構の構造がきわめて簡単になるとともに、コの字状レバー３６、３７を回動操作するだけで、中間支持体３２の底支持体３１への装着と離脱、カバーブロック体３３の中間支持体３２への装着と離脱とを行なうことができるので、カム機構の操作がきわめて容易になる。

また、カバーブロック体３３には、さらに、ガイドブロック体３４が装着されており、該ガイドブロック体３４には、細胞浮遊液および走化性因子含有溶液のいずれかを吸入したマイクロピペットをガイドする通孔３４ｃが、上下方向に複数貫通形成されているので、マイクロピペットを用いた、細胞観察チェンバー３０内のウエルへの細胞浮遊液や走化性因子含有溶液の注入もしくは採取作業がきわめて容易になる。
その他、前記したような種々の効果を奏することができる。

なお、本願の発明は、以上の実施例に限定されず、その要旨を逸脱しない範囲において、種々の変形が可能である。

１…細胞の流路、２（２Ａ、２Ｂ）…ウエル、３、３’、３−１、３−２…通孔、４、４’、４−１、４−２…通孔、５…溝、６…障壁、７…基板、８…ガラス基板、９…ブロック体、１０…細胞走化性検出・走化性細胞分離装置、２０…ケーシング、２１…水準器、２２…明るさ調整つまみ、２３…位置調整つまみ、２４…焦点調整レバー、３０…細胞観察チェンバー、３１…底支持体、３１ａ…底部、３１ｂ…胴体部、３１ｃ…窓、３２…中間支持体、３２ａ…底部、３２ｂ…フランジ部、３２ｃ…開口部、３３…カバーブロック体、３３ａ…底部、３３ｂ…フランジ部、３３ｃ…中央凹部、３４…ガイドブロック体、３４ａ…中央膨大部、３４ｂ…アーム部、３４ｃ…通孔、３５…温度センサー、３５ａ…台座部分、３５ｂ…温度感知部、３６…カム操作レバー、３６ａ…脚部の端部、３６ｂ…カム溝、３７…カム操作レバー、３７ａ…脚部の端部、３７ｂ…カム溝、３８…支持軸、３９、４０、４１…ピン、４２、４３…Ｏリング、４４…パッキン部材、４５…液溜め室、４６、４７…ピン、５０…ノート型パソコン、６０…チェンバー内混合液温度制御システム、６１…コンピュータ、６２、６３…温度調節器、６４…加熱部、６５…温度センサー、６６…温度調節スイッチ、６７…切り替えスイッチ、６８…リレー、６９…ソリッドステートリレー（ＳＳＲ）、７０…顕微鏡、ａ…中心線、Ｌ…液レベル。

Claims (4)

1. 細胞の走化性の検出や走化性細胞の分離のために用いられる装置における細胞観察チェンバーであって、
   底部中央に細胞の動きを観察するための窓が設けられた皿状の底支持体と、
   前記底支持体の底面上に載置されるガラス基板と、
   底部中央に開口部が形成され、前記底支持体に装着されて、前記ガラス基板を上方から圧し、これを前記底支持体の底面上に固定する皿状の中間支持体と、
   細胞浮遊液および走化性因子含有溶液を通す通孔が上下方向に複数貫通形成されるとともに、前記ガラス基板の中央部の表面上に定置されて、前記ガラス基板との間に少なくとも一対のウエルと、これらのウエルを連通する流路とを形成する凹凸形状が、前記ガラス基板との対向面に形成されている基板と、
   前記細胞浮遊液および前記走化性因子含有溶液を通す通孔が上下方向に複数貫通形成されていて、前記中間支持体の底部中央に形成された前記開口部に嵌め込まれ、前記基板を上方から圧するパッキン部材と、
   底部中央に前記細胞浮遊液および前記走化性因子含有溶液を通す通孔が上下方向に複数貫通形成されていて、前記中間支持体が装着される前記底支持体に装着され、前記基板を前記パッキン部材を介して上方から圧して、これを前記ガラス基板上に固定する皿状のカバーブロック体と
   を備えて成り、
   前記中間支持体の前記底支持体への装着、前記カバーブロック体の前記底支持体への装着は、カム機構を内蔵したレバー機構を用いて、それぞれの当接面同士を上下方向に圧接させることによって行なわれ、
   前記カム機構は、前記底支持体に回動自在に支持される２本のコの字状レバーの両脚部にそれぞれ形成されたカム溝と、該カム溝内を滑動し、前記中間支持体および前記カバーブロック体の各外周面上の対応する２点にそれぞれ植設されたピンとから成る
   ことを特徴とする細胞観察チェンバー。
2. 前記レバー機構は、前記底支持体に回動自在に支持される２本のコの字状のカム操作レバーと、該各カム操作レバーの両端部にそれぞれ設けられた両脚部内側に形成されるカム溝と、該カム溝内を滑動され、前記中間支持体および前記カバーブロック体の各外周面上の対応する２点にそれぞれ植設されるピンと、で構成される第１および第２のカム機構を更に備え、
   前記中間支持体が前記底支持体に装着され、前記第１のカム機構を用いて、それぞれの当接面同士を上下方向に圧接し、
   前記カバーブロック体が前記中間支持体に装着され、前記第２のカム機構を用いて、それぞれの当接面同士を上下方向に圧接した、
   ことを特徴とする請求項１に記載の細胞観察チェンバー。
3. 前記底支持体の胴体部の外周面に、底支持体の軸心に関して対称の位置に一対の支持軸を植設し、
   平面視コの字状で、両側に脚部を有するカム操作レバーを内側と外側に２つ配置し、
   前記一対の支持軸の回りに、各カム操作レバーの両脚部を回動自在に設け、
   前記各カム操作レバーの両脚部の内面に、カム溝をそれぞれ湾曲状に形成し、
   前記中間支持体および前記カバーブロック体のそれぞれの上部に外周フランジ部を設け、
   前記中間支持体の外周フランジ部の外周面上に、中間支持体の軸心に関して対称の位置に一対のピンを植設し、
   前記カバーブロック体の外周フランジ部の外周面上に、カバーブロック体の軸心に関して対称の位置に一対のピンを植設し、
   前記中間支持体を前記底支持体に載せ、中間支持体のピンを内側のカム操作レバーのカム溝に嵌め込み、内側のカム操作レバーを回動させてピンをカム溝内で滑動させ、中間支持体を底支持体に固定し、
   前記カバーブロック体を前記中間支持体に載せ、カバーブロック体のピンを外側のカム操作レバーのカム溝に嵌め込み、外側のカム操作レバーを回動させてピンをカム溝内で滑動させ、カバーブロック体を中間支持体に固定した、
   ことを特徴とする請求項１または請求項２に記載の細胞観察チェンバー。
4. 前記底支持体の胴体部の上面および前記カバーブロック体の外周フランジ部の下面に、それぞれ位置決め用ピンを取り付け、それらの位置決め用ピンにて、底支持体と中間支持体および中間支持体とカバーブロック体との周方向の相対的な位置決めを行なう
   ことを特徴とする請求項３に記載の細胞観察チェンバー。

Images