JP4409304B2 - 微小物質のピックアップ装置及びピックアップ方法 - Google Patents

Description

本発明は、例えば培養された培養液やコロニー中の菌体細胞、溶菌されたＤＮＡ又はＲＮＡ、マイクロマニピュレーションで操作された組織・細胞等の微小物質を汚染することのないようにピックアップするピックアップ装置及び方法に関するものである。

細胞を回収する方法としてはマイクロマニピュレーションを利用する方法が一般的である。顕微鏡下で手動によりガラスキャピラリー等で操作し、必要な細胞を吸引して回収している。その他の方法としては、プレパラート上に固定化された細胞を回収する場合は、レーザーで固定化された細胞の周辺の組織を焼きはがし、細胞を接着や串刺しにしてつまみあげる方法（レーザー切断法）やシャ−レ等に培養された細胞やコロニーを回収する場合は、ピンに直接吸着させ液体培地されているマイクロプレートに移植する方法などがある。

しかしながら、マイクロマニピュレ−ション法は、キャピラリ−の位置決めや交換作業に手間がかかる。また人為操作であるため操作者の技量を必要としており、細胞を回収するのに時間がかかるという問題点がある。高価な微小径のキャピラリ−などは使い捨てになりコストもかかる。また、レーザー切断法は装置が大変高価になり、剥離するためのシ−トや串刺しのための精密な付帯機構が必要になる。更に、直接、鋭利なピンで細胞やコロニ−に接触させる場合は細胞を傷つける恐れがある。またピン先端の磨耗はコンタミネーションの原因となる。また、マイクロオーダーの極小の細胞の場合、ピックアップできない場合があり、再現性や定量性に欠けるといった問題があった。

以上のように、今日まで、数〜数十μｍといった細胞を単独で、指定した場所から指定した場所へ自由自在に簡単に自動で移動させることができるシステムは開発されていない。

一方、本出願人は、微小物質を指定した場所にスポットするスポッティング装置を提案している（例えば、特許文献１参照）。これは、マイクロウェル集積体の個々のマイクロウェル内に定められた試料を正確に配置する又は個々のマイクロウェル内の試薬を正確に採取することができるものである。
特開２００３−１４９０９４号公報

本発明は、培養された培養液やコロニー中の菌体細胞、溶菌されたＤＮＡ又はＲＮＡ、マイクロマニピュレーションで操作された組織・細胞等の微小物質を汚染することのないようにピックアップすることができ、更に、ピックアップ操作を繰り返して行っても汚染することがない装置及び方法を得ることを目的とする。

請求項１に記載された発明に係る微小物質のピックアップ装置は、指定された場所に置かれた微小物質をピックアップする装置であって、
汚染のない微小担体片と、該微小担体片を先端部で保持する担体保持ノズル手段とを備え、
前記担体保持ノズル手段には、前記微小担体片を微小物質に接触させて微小担体片に微小物質を転写する間では保持状態を保持し、別の微小物質をピックアップする前には前記微小担体片の保持状態を解除する保持制御手段を備え、
前記微小担体片がビーズであり、前記微小物質と接触する際に前記ノズル手段の先端部が微小物質に触れない大きさを有することを特徴とするものである。

請求項２に記載された発明に係る微小物質のピックアップ装置は、請求項１に記載の担体保持ノズル手段が、前記ノズル先端部を負圧にして微小担体片を保持する吸気吸引を行うものであることを特徴とするものである。

請求項３に記載された発明に係る微小物質のピックアップ装置は、請求項１又は２に記載の担体保持ノズル手段をＸ−Ｙ−Ｚ座標軸方向に移動させるノズル移動手段を更に備えたことを特徴とするものである。

請求項４に記載された発明に係る微小物質のピックアップ装置は、指定された場所に置かれた微小物質をピックアップする方法であって、
微小担体片を先端部で保持する担体保持ノズル手段に汚染のない微小担体片を保持し、この保持された微小担体片を微小物質に接触させて微小担体片に微小物質を転写し、別の微小物質をピックアップする前に前記微小担体片の保持状態を解除するものであり、
前記微小担体片として、前記微小物質と接触する際に前記ノズル手段の先端部が微小物質に触れない大きさのビーズを用いることを特徴とする方法である。

請求項５に記載された発明に係る微小物質のピックアップ方法は、請求項４に記載の表面に微小物質の吸着を促す接着層がコーティングされている前記微小担体片を用いることを特徴とする方法である。

請求項６に記載された発明に係る微小物質のピックアップ方法は、請求項４又は５に記載の担体保持ノズル手段として、前記ノズル先端部を負圧にして微小担体片を保持する吸気吸引ノズル手段を用いることを特徴とする方法である。

本発明は、培養された培養液やコロニー中の菌体細胞、溶菌されたＤＮＡ又はＲＮＡ、マイクロマニピュレーションで操作された組織・細胞等の微小物質を汚染することのないようにピックアップすることができ、ピックアップ操作を繰り返して行っても汚染することがないという効果がある。

本発明においては、汚染のない微小担体片と該微小担体片を先端部で保持する担体保持ノズル手段とを備え、前記担体保持ノズル手段には前記微小担体片を微小物質に接触させて微小担体片に微小物質を転写する間では保持状態を保持し別の微小物質をピックアップする前には前記微小担体片の保持状態を解除する保持制御手段を備えたものであるため、微小物質を汚染することのないようにピックアップすることができ、ピックアップ操作を繰り返して行っても汚染することがない。

本発明の担体保持ノズル手段としては、微小担体片を先端部で保持し、微小物質と接触する場合には微小担体片のみが触れ、ノズル手段の先端部は微小物質に触れないようにするものであればよく、例えば、微小担体片に保持用軸を突設して設け、この保持用軸をノズル手段の先端部で保持するようにしたり、ノズル手段の先端部に接着剤を配し、この接着剤に微小担体片を接着して保持するようにしたりしてもよいが、好ましくはノズル先端部を負圧にして微小担体片を保持する吸気吸引を行う。

本発明における微小担体片としては、担体保持ノズル手段に保持可能であり、微小物質と接触する場合にはノズル手段の先端部が微小物質に触れないような大きさ、形状であればよい。例えば、少なくとも接触対象の微小物質に当接する部分の形状が、円筒形、多角柱形、円錐形、多角錐形、長球形、扁球形、球形等が挙げられるが、接触対象の微小物質へ柔らかく当接するため、角部が丸くなったものが好ましい。

微小担体片の大きさはピックアップする微小物質の種類や状態に応じて相違する。例えば、培養された培養液やコロニー中の菌体細胞を単離したりするためのピックアップでは１mm程度の大きさでも良いが、溶菌されたＤＮＡ又はＲＮＡやマイクロマニピュレーションで操作された組織・細胞では、その１／１０〜１／１０００程度の大きさが好ましい。

微小担体片の材質は、樹脂製、金属製、セラミック製、ガラス製等のものが使用可能である。また、内部と表面とで相違させても良い。例えば、金属製の内部と樹脂製やセラミック製の表層とを備えたものやガラス製又はセラミック製の内部と樹脂製の表層とを備えたものなど種々の組合せが可能である。

これら微小担体片の好ましい条件として考慮すると、ガラス製、樹脂製、セラミック製、又は金属製のビーズが入手も容易であり、安価であるため、最も好ましい。即ち、予め生物学的及び化学的に汚染がないように、洗浄されて無菌としたビーズを用意し、これをピックアップ前に担体保持ノズル手段の先端部で保持し、保持状態のまま微小物質に接触させて微小担体片に転写する。転写された微小物質を所望の場所に移動させて、その移動先で微小物質を放出した後、新たな別の微小物質をピックアップする際には保持状態のビーズを廃棄して別のビーズを保持することにより、繰り返しのピックアップ作業においても前回の微小物質が混入することがなくコンタミネーション（汚染）の問題がない。

また、微小担体片の表面には、ピックアップの対象となる微小物質の吸着を促す接着層を更に形成させても良い。例えば、オレイル基等の細胞の脂質二重膜に結合する基を末端に持つ長鎖の分子を微小担体片の表面に表出させて細胞と接触させた際に細胞を接着固定するようなものが挙げられる。

本発明では好ましい態様として、担体保持ノズル手段をＸ−Ｙ−Ｚ座標軸方向に移動させるノズル移動手段を更に備える。これにより、指定した場所にある微小な細胞や物質をピックアップし、指定した位置に高精度に移動しスポットすることができる。例えば、シャーレ等に培養された微生物コロニーを、液体培地が貯留されているマイクロプレートに移植すること、５〜５００μｍの単一細胞を、移植すること、ＣＣＤカメラでばら撒かれた極小植物種子を認識し、培地に播種すること等を正確に行うことができる。

本発明の別の好ましい態様として、担体保持ノズル手段を手持ち式とすることにより、マイクロピペットや白金耳の代わりとして使用することができる。好ましくは微小担体片の保持状態を保持・解除する保持制御手段の入出力スイッチを手持ち式の担体保持ノズル手段上に備えることにより、操作性が増す。例えば、ペン式の手持ち状態として使用するのであれば、ペン軸程度の太さの軸部を備え、入出力スイッチは軸部の側方に親指又は人差し指が当たる箇所に設けるようにすればよい。

本発明の方法では、微小担体片を先端部で保持する担体保持ノズル手段に汚染のない微小担体片を保持し、この保持された微小担体片を微小物質に接触させて微小担体片に微小物質を転写し、別の微小物質をピックアップする前に前記微小担体片の保持状態を解除することにより、培養された培養液やコロニー中の菌体細胞、溶菌されたＤＮＡ又はＲＮＡ、マイクロマニピュレーションで操作された組織・細胞等の微小物質を汚染することのないようにピックアップすることができ、ピックアップ操作を繰り返して行っても汚染することがない。

実施例１．ピックアップ＆プレイス装置
図１は本発明のピックアップ装置を含むピックアップ＆プレイス装置の概略を示す側面図である。図２は図１の平面図である。図に示す通り、基台１１の対向する平行な２辺を囲むように一対のレール１２，１３が立上り、このｙアーム部としてのレール１２，１３上に横架された状態で移動可能なｙステージ１４が備わっている。ｙステージ１４は一対のレール上を移動させるためのリニアモータ（図示せず）が搭載され、高い位置精度を得ることができる。尚、レールを移動させるためには、高精度ボールネジとサーボモータとで行っても良い。

ｙステージ１４にはレール１２，１３に直交する方向に渡されたｘアーム部１５に沿って移動可能なｘステージ１６が備わっている。このｘステージ１６にもｘアーム部１５上を移動させるためのリニアモータ（図示せず）が搭載され、高い位置精度を得ることができる。このｘステージ１６には高さ方向に延ばされたｚアーム部１７に沿って移動可能なｚステージ１８が備わっている。尚、レールを移動させるためには、高精度ボールネジとサーボモータとで行っても良い。このｚステージ１８ではサーボモータと高精度ボールネジ（図示せず）とでｚアーム部１７上を移動させるため、高い位置精度を得ることができると共に電源が切れた場合でも自重で下がることがない利点も有する。尚、ｘアーム部１５には、撮像手段としてのカメラ１９が載置されている。これら、ｘアーム部１５，ｙアーム部１２，１３及びｚアーム部１７によってノズル移動手段を構成している。

ｚステージ１８には、基台１１上に載置・固定された寒天培地シャーレ２３に形成されたコロニーを採取し、液体培地が貯留されている個々のマイクロプレート２４へ移送する担体保持ノズル手段としての担体保持ノズル２１が備わっている。シャーレ２３が載置・固定されている基台１１上には、予め洗浄して無菌とされたビーズが入れられたビーズストッカー２０と、ノズル先端部が汚染された場合にノズルの洗浄を行うエタノール溶液を貯留している洗浄槽２２と、乾燥槽２５とが並設されている。

実施例２．担体保持ノズルの動作
図３は担体保持ノズルの動作を示す説明図である。図に示す通り、微小物質のピックアップの前段階として、ａ図に示す通り、ノズル２１の先端部３１にビーズ３２を装着する。即ち、ビーズストッカー２０上に並んで載置されたビーズ３２の１つをノズル２１の先端部３１で接触させ、ノズル２１の軸心に沿って形成された吸引管３４内部の空気を圧力制御手段３３で吸引制御してビーズ３２を保持する。保持している間は吸引管３４内部の気圧を圧力制御手段３３によって負圧状態としてビーズ３２の保持を維持する。この吸引管３４の気圧を制御する圧力制御手段３３はｘステージ１８内部に配されている。

ｂ図に示す通り、カメラ１９でピックアップされる微小物質としてのコロニー３５の位置を認識させ、このカメラ１９によるコロニー３５の位置決めデータに基づいてＸ−Ｙ−Ｚ座標軸方向に移動させるノズル移動手段によってノズル先端３１をコロニー３５が載置されている位置の上方へ移動させる。

ｃ図に示す通り、圧力制御手段３３により吸引管３４内の負圧状態を維持したまま、コロニー３５と接触させる。ビーズ３２の接触面にコロニー３５を形成する細菌が付着し、ノズル先端３１にピックアップされる。尚、微小物質へのビーズ３２の接触面は、ノズル先端３１に対して対向する半球面であることを原則とする。この半球面を越えてノズル先端３１側の面と接触すると吸引管３４の吸引により微小物質が引き込まれ、ノズル先端３１が汚染される虞があるからである。尚、ピックアップする微小物質が液体又は液体中に懸濁された物質である場合には、表面張力があるため、前記半球面よりも小さくする必要がある。

微小物質をピックアップさせた後、ノズル移動手段によって予め定められたマイクロプレート２４内の特定のウェル３６上方に移動させ、圧力制御手段３３で吸引管３４内を正圧とすることで、ｄ図に示す通り、ビーズ３２の保持が解除されてウェル３６内に落下しピックアップされた微小物質としてのコロニー３５を形成していた細菌が分離される。尚、ノズル移動手段の高さ位置を制御することにより、ビーズ３２の最低部のみをウェル３６内に浸して細菌を分離することも可能である。

連続してピックアップする場合には、ｄ図に示したようにノズル先端部３１にはビーズ３２が保持されていない状態であって、ノズル先端部３１は汚染のない状態となっているため、ａ図に示すように、別のビーズ３２を保持して、別のコロニーの細菌をピックアップすればよい。

これらの方法でピックアップ＆プレイスを行うことで、ノズルと微小物質との直接の接触はなく、ノズルの磨耗は半永久的にない。コンタミネーションも発生せず、ランニングコストの削減や洗浄度向上に大きく貢献することになる。同じく、微小物質もノズルと接触しないので微小物質に損傷を与えない。

本発明のピックアップ装置を含むピックアップ＆プレイス装置の概略を示す側面図である。 図１の平面図である。 担体保持ノズルの動作を示す説明図である。

符号の説明

１１…基台、
１２…レール、
１３…レール、
１４…ｙステージ、
１５…ｘアーム部、
１６…ｘステージ、
１７…ｚアーム部、
１８…ｚステージ、
１９…カメラ、
２０…ビーズストッカー、
２１…担体保持ノズル、
２２…洗浄槽、
２３…寒天培地シャーレ、
２４…マイクロプレート、
２５…乾燥槽、
３１…ノズル先端部、
３２…ビーズ、
３３…圧力制御手段、
３４…吸引管、
３５…コロニー（微小物質）、
３６…ウェル、

Claims (6)

1. 指定された場所に置かれた微小物質をピックアップする装置であって、
   汚染のない微小担体片と、該微小担体片を先端部で保持する担体保持ノズル手段とを備え、
   前記担体保持ノズル手段には、前記微小担体片を微小物質に接触させて微小担体片に微小物質を転写する間では保持状態を保持し、別の微小物質をピックアップする前には前記微小担体片の保持状態を解除する保持制御手段を備え、
   前記微小担体片がビーズであり、前記微小物質と接触する際に前記ノズル手段の先端部が微小物質に触れない大きさを有することを特徴とする微小物質のピックアップ装置。
2. 前記担体保持ノズル手段が、前記ノズル先端部を負圧にして微小担体片を保持する吸気吸引を行うものであることを特徴とする請求項１に記載の微小物質のピックアップ装置。
3. 前記担体保持ノズル手段をＸ−Ｙ−Ｚ座標軸方向に移動させるノズル移動手段を更に備えたことを特徴とする請求項１又は２に記載の微小物質のピックアップ装置。
4. 指定された場所に置かれた微小物質をピックアップする方法であって、
   微小担体片を先端部で保持する担体保持ノズル手段に汚染のない微小担体片を保持し、この保持された微小担体片を微小物質に接触させて微小担体片に微小物質を転写し、別の微小物質をピックアップする前に前記微小担体片の保持状態を解除するものであり、
   前記微小担体片として、前記微小物質と接触する際に前記ノズル手段の先端部が微小物質に触れない大きさのビーズを用いることを特徴とする微小物質のピックアップ法。
5. 表面に微小物質の吸着を促す接着層がコーティングされている前記微小担体片を用いることを特徴とする請求項４に記載の微小物質のピックアップ法。
6. 前記担体保持ノズル手段として、前記ノズル先端部を負圧にして微小担体片を保持する吸気吸引ノズル手段を用いることを特徴とする請求項４又は５に記載の微小物質のピックアップ法。

Images