JP4384414B2 - 植物におけるジーントラップが可能とするｉｒｅｓ - Google Patents

Description

【０００１】
［技術分野］
本発明は、植物において機能し得る内部リボソームエントリー部位配列（ＩＲＥＳ）を含むＤＮＡベクターと植物におけるベクターの利用に関する。
【０００２】
［背景技術］
多くの生物体に関して進行中のゲノム配列決定プロジェクトの結果、大量の配列データが公開データベースに保管されている（Ｓｃｈｅｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｉｅｎｃｅ ２７４：５４０−５４６（１９９６））。種々の生物情報学的手段を用いてこれらのデータを分析することにより、機能、あるいはタンパク質の同定結果を多くのこれらの遺伝子に割り当てることができる。しかし、生物学的データ無しで真の生物学的機能を決定することは不可能である。動物および植物において、成功した多くの戦略は、飽和突然変異誘発によりランダムに、あるいはアンチセンス技術を利用してある遺伝子の表現型を一度に検討することにより、遺伝子機能を解明するものであった。これらの機能スクリーニングにおいて、特異的表現型または代謝プロフィルを分析するための多くの生物体を生産するために、突然変異誘発物質が使用されている。遺伝病変と表現型のマッチングにより、発生と代謝に関与する多くの遺伝子が同定された。このアプローチは、ショウジョウバエＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（Ｎｕｓｓｌｅｉｎ−Ｖｏｌｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２８７：７９５−８０１（１９８０））、線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ（Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７７：７１−９４（１９７４））、シロイヌナズナ（Ｍａｙｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５３：４０２−４０７（１９９１））において実施され、成功している。
【０００３】
マウスにおいて、ジーントラップにより、新しい表現型を回収し、同定するための効果的な研究方法が提供された（Ｂｒｏｗｎ，Ｊ Ｉｎｅｈｅｒｉｔ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓ ２１：５３２−５３９（１９９８））。理想的には、遺伝子発見の過程で、どの遺伝子または経路が破壊されるか、あるいは検討されるかに関して、仮説を立てるべきではない。しかし、時間の経過とともに、この研究方法はうまくいかないことが証明されてきた。しかし、マウスに関しては、胚幹細胞（ＥＳ）細胞系の出現と、遺伝変化を引き起こし、選択する手段の出現により、状況は劇的に変化した（Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１５４−１５６（１９８１））。ＥＳ細胞は、全能細胞として、すなわち適正な条件の下で全種類の分化細胞を生じることができる細胞として、培養で維持できる。これらの細胞は、比較的容易に遺伝変化が可能である（Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ５１：５０３−５１２（１９８７））。マウスのＥＳ細胞と同様に、多くの植物の植物細胞は全能細胞であり、同様の研究に使用できる。
【０００４】
形質転換された植物において遺伝子破壊に基づき表現型を観察することにより遺伝子機能を割り当てるのは、常に簡単とは限らない。ある遺伝子ファミリーのある遺伝子に複数のコピーが存在する場合、表現型が直ちに明らかにならない場合がある。破壊された遺伝子の空間的および時間的発現を決定することにより、遺伝子機能を割り当てるための更なる所見が得られる。これは、単純な表現型が明らかでない場合、あるいはより複雑な表現型を生物体全体の機能と発生に関係づける場合に特に有用である。場合によっては、明らかな表現型は識別できないが、リポーター遺伝子の空間的および時間的発現により、遺伝子座の機能を定義するための重要な情報が提供される場合がある。リポーター遺伝子は、組織特異性発現に関して、遺伝子チップまたはノザン分析よりもはるかに高度の分解能を提供できる。
【０００５】
ジーントラップベクターに更なる機能を含めることにより、新しい遺伝子発現手段を提供できる。ベクターに組み換え部位を組み込むことにより、目的の遺伝子を規定された部位に挿入することができる。これは、目的の遺伝子をリポーター遺伝子に隣接して単に挿入するか、リポーター遺伝子と置換するか、あるいは複数／縦列挿入および置換を可能にする様式で実施できる。表現型が正常な植物における発現パターンの分析により、目的の遺伝子を挿入するための「ランディングパッド（landing pad）」が供給され、高度に特異的で十分定義された発現パターンが得られる。植物の形質転換の際に遺伝子挿入を行う現行の方法のランダムな特性には多くの欠点があるため、この研究方法は顕著な利点を提供する。
【０００６】
［ジーントラップ］
遺伝子機能を同定するための代替戦略は、１９９０年代初期に探究された。「ジーントラップ」の研究方法は、ランダム突然変異体のライブラリをスクリーニングするために検討された。ジーントラップの原理は、本質的にはＤＮＡベクターのランダムな挿入とその後の内因性構造遺伝子の破壊である。この研究方法に対する更なる改善は、ベクターでの存在を容易に表示できるリポーター遺伝子を含めることであった。リポーター遺伝子は、内因性遺伝子の発現を擬態するが、同時にその同じ遺伝子座を突然変異させる（Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１３：３７０−３７４（１９９７））。ランダムな組み込みを持つクローンの大きなライブラリは、将来の分析のために分離され、無期限に保存できる。ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を用いることにより、「トラップされた」遺伝子の配列を同定できる。この技術により、生体内発現レベルとは無関係に遺伝子の同定が可能となる（Ｆｒｏｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：８９９８−９００２（１９８８））。特定の遺伝子を突然変異させ、表現型を同定し、発現を分析できることにより、ジーントラップは、ゲノム機能解析の非常に魅力的な手段となる。ジーントラップは、マウスＥＳ細胞における遺伝子（Ｓｋａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．６：９０３−９１８（１９９２）），Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９２：６０８−６１１（１９９８））、それらの膜と分泌タンパク質を含む遺伝子（Ｓｋａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：６５９２−６５９６（１９９５））、分化されたマウスＥＳ細胞において活性化された遺伝子（Ｓａｌｍｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２１２：３２６−３３３（１９８８））、レチノイン酸に反応するための遺伝子（Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１６７７−１６８２（１９９６））、哺乳動物神経系の発生に重要な遺伝子（Ｓｔｏｙｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｌ Ｄｙｎ．２１２：１９８−２１３（１９９８））の破壊と同定に使用されてきた。
【０００７】
［ジーントラップベクターのデザイン］
トラップベクターは本質的に二つの異なる範疇に分類される。「エンハンサー−トラップ」ベクターは、最小プロモーターに融合されたリポーター遺伝子を活性化するエンハンサー付近に組み込まれなくてはならない（Ｂｅｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ３：１２８８−１３００（１９８９））。「プロモータートラップ」ベクターは、リポーターの前に５’発現成分を持たない。ジーントラップベクターは、スプライスアクセプター（ＳＡ）をリポーター遺伝子の５’末端に含むことができ、活動的に転写される遺伝子のイントロンに組み込まれた後、融合転写物の産生を引き起こす（Ｓｋａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．６：９０３−９１８（１９９２）、Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１６７７−１６８２（１９９６），Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５５１７−５５１２（１９８９），ｖｏｎ Ｍｅｌｃｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．６：９１９−９２７（１９９２），Ｗｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３９：８８９−８９９（１９９５））。ゲノム機能分析のために、ジーントラップベクターは三つの最小機能を提供しなくてはならない。ジーントラップベクターは、遺伝子発現分析のための適切なリポーター遺伝子を持たなくてはならず、「トラップ事象」により内因性遺伝子を突然変異させなくてはならず、トラップされたｃＤＮＡと組み込みのゲノム部位の配列が決定できなくてはならない。ランディングパッドとして使用するために、ジーントラップベクターは、全ての細胞型および全ての発生段階において測定できる適切なリポーター遺伝子を持たなくてはならず、ジーントラップの挿入により植物に損傷を与えてはならず、組み換えシステムは組み込み後もなお機能できなくてはならない。ランディングパッドは、ゲノム機能分析にも利用できる。この点で、ランディングパッドは、遺伝子が同種由来であろうと、異種由来であろうと関わりなく、新しい遺伝子の発現による影響を検討するために使用される。コードされた遺伝子産物の機能は、その遺伝子の異所性発現の影響から決定できる。
【０００８】
マウスＥＳ細胞において、エレクトロポレーションにより、あるいはトランスフェクションの頻度がより高く、無傷の単一コピーとして組み込まれるレトロウィルスベクターによりＤＮＡを導入できる。植物においても同様に、エレクトロポレーションまたは粒子衝突を用いることができ、一方、アグロバクテリウムの形質転換を、少数または単一コピー遺伝子を導入するために利用できる。
【０００９】
最も初期のベクターは、未分化ＥＳ細胞において使用された（Ｓｋａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．６：９０３−９１８（１９９２），Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５：１５１３−１５２３（１９９１））。最初のジーントラップベクターは、ＳＡ部位を、ｌａｃＺ（酵素β−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子；Ｓｋａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．６：９０３−９１８（１９９２））またはβ−ｇｅｏ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子（β−ｇａｌ）およびネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）のようなプロモーターを持たないリポーター遺伝子の前に含んでおり、融合タンパク質をコードする（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５：１５１３−１５２３（１９９１））。発現される遺伝子のイントロンの中にベクターを正しい方向性で組み込むことにより、融合メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物が生じる。その後、脳心筋炎ウィルス由来の内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）が、ＳＡ部位とリポーター遺伝子配列の間に挿入された（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：１５３１−１５３６（１９９７））。ＩＲＥＳにより、ジシストロン性翻訳が可能となり、従って、リポーター遺伝子は、トラップされた遺伝子がフレーム内で融合されていることと無関係に翻訳される。このベクターの場合、リポーター遺伝子の発現レベルは、トラップされた遺伝子からの転写速度に依存していることを理解することが重要である。
【００１０】
次世代ベクターは、導入されるマーカー遺伝子の末端にポリＡテイルの付加を命令するためのポリＡ部位を取り込まなかった。シグナルは、安定なｍＲＮＡを生産するために、内因性遺伝子により供給された（Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９２：６０８−６１１（１９９８）、Ｓａｌｍｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２１２：３２６−３３３（１９９８））。プロモーターでトラップするよりむしろ、これらのベクターは３’末端でのトラップに依存してプロモーターを取り込んだ。このベクターの利点は、遺伝子の３’末端がしばしば遺伝子同定により有用であることであった。
【００１１】
［植物におけるジーントラップ］
［Ｔ−ＤＮＡ］
Ｔ−ＤＮＡが特異的に挿入されることは明らかにされていないので、Ｔ−ＤＮＡ挿入によりゲノムを飽和させることは可能である（Ａｚｐｉｒｏｚ−Ｌｅｅｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１３：１５２−１５６（１９９７））。Ｔ−ＤＮＡ挿入物の巨大なコレクションがシロイヌナズナにおいて作製されており（Ｆｅｌｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０８：１−９（１９８７）；Ｂｏｕｃｈｅｚ ｅｔ ａｌ．，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｓｅｒ．ＩＩＩ Ｓｃｉ．Ｖｉｅ ３１６：１１８８−１１９３（１９９３）；Ｃａｍｐｉｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．１７：６９９−７０７（１９９９）；Ｋｒｙｓａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １１：２２８３−２２９０（１９９９）；Ｗｅｉｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２２：１０３３−１０１４（２００１））、また「逆遺伝子」スクリーニングのためにこれらのコレクションを利用するための努力が組織的に進行中である（ＭｃＫｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．８：６１３−６２２（１９９５）；Ｗｉｎｋｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１８：７４３−７５０（１９９８）；Ｋｒｙｓａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １１：２２８３−２２９０（１９９９））。この研究方法は、アグロバクテリウムにより形質転換が可能な植物種に限定される。アグロバクテリウムは、一般に少数または単一のコピー遺伝子挿入物をゲノムに挿入するが、複数のＴ−ＤＮＡ挿入物が一つの植物に存在することはしばしばある（Ｂｅｃｈｔｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｓｅｒ．ＩＩＩ．Ｖｉｅ ３１６：１１９４−１１９９（１９９３）；Ｌｉｎｄｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．２：３３−２４７（１９９３））。複数のエンハンサーまたはジーントラップリポーター遺伝子挿入物が発現パターンの解釈を複雑にする可能性がある。Ｔ−ＤＮＡ反復（順方向または逆方向）を含む複雑な挿入物の産生と隣接染色体ＤＮＡの転位も遺伝子発現パターンの解釈にとって問題となる可能性がある（Ｏｈｂａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．７：１５７−１６４ ８１９９５）；Ｎａｃｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４９：６４１−６５０（１９９８）；Ｌａｕｆｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．１８：１３１−１３９（１９９９））。複雑な遺伝子発現パターンに加えて、その後の分子分析も複雑となり、目的の遺伝子を分離するのも難しくなる。エンハンサー、プロモーターおよびジーントラップリポーター遺伝子は、多くの異なるグループにより植物において使用されてきた。リポーター遺伝子の発現は、リポーター遺伝子が、Ｔ−ＤＮＡの左端に配置された場合でも、右端に配置された場合でも効率的であった（。Ｌｉｎｄｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．２：３３−２４７（１９９３）、Ｃａｍｐｉｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．１７：６９９−７０７（１９９９））。
【００１２】
［転位因子］
挿入性突然変異誘発は、転位因子を用いてルーチンで実施されている。活性の転位因子系を持たない種において、あるいは特徴が十分明らかにされた転位因子系を持たない種において異種因子が利用されている（概説は、Ｏｓｂｏｒｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２９：８３３−８４４（１９９１）を参照）。この転位因子系の因子は、Ｔ−ＤＮＡにより仲介される形質転換により導入され、引き続き可動化が起こる。トランスポザーゼがない場合、挿入された転位因子は安定である。しかし、トランスポザーゼの発現で転位因子が選択的に不安定化される可能性がある。選択的再可動化により、復帰突然変異体を生じることが可能で、これは次に表現型がトランスポゾンの挿入により実際に引き起こされたかどうかを確認するために利用できる。
【００１３】
トウモロコシＡｃ／ＤｓおよびＥｎ／Ｓｐ転位因子が、非相同の種において、広範囲に研究されている。これらは、タバコ、トマト、シロイヌナズナにおいて、効率的な転位のために改変されてもいる（概説は、Ｏｓｂｏｒｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７：４０６−４１３（１９９５）参照。）。Ａｃ／Ｄｓ系は、今日までエンハンサーまたはジーントラップ系に関して利用されてきた。Ａｃ／Ｄｓ系は、コピー数が少数であるという利点を有し、これは増幅傾向を有するＥｎ／Ｓｐｍ系を凌ぐ利点である（Ａａｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４７：５５５−５６４（１９９５））。トウモロコシＭｕ因子は、トウモロコシにおけるゲノム機能分析研究のために利用されている。植物のレトロトランスポゾンも、本発明において利用できる。レトロトランスポゾンは、植物を含む真核生物に広く分布している（Ｌａｎｇｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５６：３１３−３２５（２０００））。これらの中には、タバコＴｎｔｌ（Ｇｒａｎｄｂａｓｔｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３７：３７６−３８０（１９８９）；Ｆｅｕｅｒｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：４００５−４０１５（１９９７））およびＴｔｏｌ（Ｈｉｒｏｓｈｉｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ １６５：２２９−２３２（１９９５）；Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．２８：３０７−３１７（２００１）のように、十分研究され、本発明において説明されている工学技術における利用が可能なものがある。
【００１４】
［植物のＩＲＥＳ成分］
多くの真核ｍＲＮＡにとって伝統的なリボソームスキャニングモデルによれば、４０Ｓリボソームサブユニットは、５’キャップに結合し、ＡＵＧコドンに到達するまで、非翻訳５’配列に沿って移動する（Ｋｏｚａｋ，Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．３１：２２９−２９２（１９８６）；Ｋｏｚａｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０８：２２９−２４１（１９８９））。大多数の真核ｍＲＮＡに関しては、最初のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）だけが翻訳されるが、ｍＲＮＡが多シストロン性を発揮できる別の機序が存在する（Ｋｏｚａｋ，Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．３１：２２９−２９２（１９８６））。
【００１５】
大多数の真核ｍＲＮＡと対照的に、ピコルナウィルスＲＮＡの翻訳開始は、代替機序の内部リボソームエントリーにより起こる。ピコルナウィルスの５’非翻訳領域（５’ＮＴＲ）は、いわゆる内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）すなわちリボソームランディングパッドを含む（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３４：３２０−３２５（１９８８）；Ｍｏｌｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５６：２５５−２５７（１９９２））。内部リボソームエントリーはその他のウィルス（Ｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９８：４０５−４１１（１９９４）；Ｇｒａｍｓｔａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２２：３９１１−３９１７（１９９４））および細胞（Ｏｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎ Ｄｅｖ．６：１６４３−１６５３（１９９２））ＲＮＡに関しても報告されている。ピコルナウィルスとその他の既知のＩＲＥＳが植物細胞系では活性でないことを強調することは重要である。
【００１６】
最近、新しいトバモウイルス、ｃｒＴＭＶが、Ｏｌｅｒａｃｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ Ｌ．の植物から単離され、ｃｒＴＭＶゲノムが配列決定された（６３１２個のヌクレオチド）（Ｄｏｒｏｋｈｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｄｏｋｌａｄｙ ｏｆ Ｒｕｓｓｉａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３２：５１８−５２２（１９９３）；Ｄｏｒｏｋｈｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３５０：５−８（１９９４））。ｃｒＴＭＶの特殊な特徴は、十字花科に属する植物に対する全身性感染能力である。ｃｒＴＭＶ ＲＮＡは、１２２Ｋ（ＯＲＦ１）、１７８Ｋ（ＯＲＦ２）、１２２Ｋのリードスルー（read through）産物、３０Ｋ ＭＰ（ＯＲＦ３）、１７Ｋ ＶＰ（ＯＲＦ）のタンパク質をコードする４つのＯＲＦを含む。その他のトバモウイルスと異なり、ｃｒＴＭＶのＭＰおよびＣＰ遺伝子のコーディング領域は、２５のコドンに関してオーバーラップしている。すなわち、ＣＰコーディング領域の５’は、ＭＰをコードする配列である。
【００１７】
典型的なトバモウイルスのＲＮＡと異なり、ｃｒＴＭＶ ＲＮＡの３’近位ＣＰ遺伝子の翻訳は、特異的配列成分、ＩＲＥＳＣＰ１４８により仲介される内部リボソームエントリーの機序によりｉｎ ｖｉｔｒｏおよび植物中で起こることが明らかにされている（Ｉｖａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３２：３２−４３（１９９７））。結果から、ＣｒＴＭＶ ＲＮＡのＣＰ遺伝子の上流の１４８−ｎｔ領域は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで（原形質および形質転換植物）翻訳の内部開始を促進するＩＲＥＳ_CP148を含むことを示していた。
【００１８】
最近、トバモウイルスのゲノムＲＮＡが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでキャップ非依存的にキメラｍＲＮＡから３’近位遺伝子の発現を促進できるＭＰ遺伝子の上流領域を含むことが明らかにされた（Ｓｋｕｌａｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２６３：１３９−１５４（１９９９））。ＣｒＴＭＶ ＲＮＡのＭＰ遺伝子から上流の２２８−ｎｔ配列（ＩＲＥＳ_MP228 ^CR）は、３’近位ＧＵＳ遺伝子のバイシストロン性転写物からの翻訳を仲介する。ＣｒＴＭＶ ＲＮＡのＭＰ遺伝子の上流の７５−ｎｔ領域も、なお２２８−ｎｔ配列と同等に有効であることが明らかにされた。従って、７５−ｎｔ配列は、ＩＲＥＳＭＰ成分（ＩＲＥＳ_MP75 ^CR）を含む。ＣｒＴＭＶ ＲＮＡとの類似性において、トバモウイルスグループのあるタイプ（ＴＭＶ Ｕ１）のゲノムＲＮＡの上流の７５−ｎｔ配列も、ＲＲＬおよびＷＧＥの３’近位遺伝子のキャップ非依存性翻訳を仲介できるＩＲＥＳ_MP75 ^UI成分を含む。
【００１９】
総じて、データから、異なるトバモウイルスのゲノムＲＮＡから得られるＭＰ遺伝子の上流の２２８−ｎｔおよび７５−ｎｔ配列は、新しいＩＲＥＳ成分（ＩＲＥＳ_MP）を含むことが明白に証明される。内部翻訳におけるＩＲＥＳ_MPの効率は、ＩＲＥＳ_cpと同様であった。
【００２０】
トバモウイルスは、翻訳の内部開始の新しい例を提供し、これは、ピコルナウィルスおよびその他のウィルスおよび真核ｍＲＮＡに関して示されているＩＲＥＳとは明らかに異なる。
【００２１】
特許出願（ＰＣＴ／ＦＩ９８／００４５７）において、トバモウイルスＩＲＥＳ成分は、植物、動物、ヒトおよび酵母細胞において、バイシストロン性キメラＲＮＡ転写物からの３’近位遺伝子発現の内部翻訳経路を提供することが明らかにされている。移動タンパク質（ＭＰ）およびコートタンパク質（ＣＰ）遺伝子の上流に位置するこれらのＲＮＡ配列成分は、ＭＰ（ＩＲＥＳ_MP）およびＣＰ（ＩＲＥＳ_CP）遺伝子の内部リボソームエントリー部位としてそれぞれデザインされている。どちらのＩＲＥＳも、植物、動物、ヒトおよび酵母細胞、さらに形質転換植物および動物においても、異種（または複数の同種）遺伝子の同時発現のためのバイシストロン性または多シストロン性ｍＲＮＡを産生するために利用できる。バイシストロン性転写物からの第二の（３’）外来遺伝子の効率的な（モノシストロン性転写物と比較して３０％以上）ＩＲＥＳ_MPおよびＩＲＥＳ_CPを介する発現が、バイシストロン性構築物の形質転換植物において、一過性発現分析において（エレクトロポレーションされた原形質に関して、あるいは粒子衝撃実験において）および植物（麦芽抽出物）または動物（ウサギ網状赤血球溶解産物）由来のｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞を含まない細胞合成系において、バイシストロン性ＩＲＥＳ_MP含有構築物により形質転換されたヒト（ＨｅＬａ）細胞において、および前記バイシストロン性構築物により形質転換された酵母細胞において証明された。キャップ非依存性翻訳を仲介できるＩＲＥＳＭＰ成分は、ＣｒＴＭＶ ＲＮＡにのみ含まれているのではなく、トバモウイルス属のあるタイプのゲノムであるＴＭＶ Ｕ１にも、また別のトバモウイルスであるキュウリ緑斑モザイクウィルスにも含まれる。従って、トバモウイルス属に属する種々のウィルスがＩＲＥＳ_MPを含む。
【００２２】
［発明の概要］
本発明は、植物ゲノムにおける構造遺伝子を同定するために、また目的の核酸を導入するために植物ゲノムにランディングパッドを作るために、植物において機能するＩＲＥＳ成分を利用する。
【００２３】
本発明の一形態によれば、組み込み部位における常在遺伝子の挿入不活化に基づき、植物における転写活性領域を同定し、特徴を明らかにするために、ＩＲＥＳに基づくベクターの利用方法を提供する。この方法は、リポーター遺伝子に結合されたＩＲＥＳ成分を含むＩＲＥＳ構築物すなわちベクターの、植物ゲノムへのランダムな挿入を必然的に伴う。ＩＲＥＳは、ＩＲＥＳが挿入される常在遺伝子と時間的および空間的に同様に発現される目的の遺伝子の発現効率を高めるため、ＧＯＩを５’非翻訳領域の中に、あるいは正しいリーディングフレーム内に正確に挿入する必要はない。リポーター遺伝子は、ＩＲＥＳベクターが植物ゲノム内の構造遺伝子に挿入された場合に限り発現される（従って、検出される。）。従って、植物ゲノムの非コーディング領域にＩＲＥＳベクターが組み込まれた場合には、検出可能なシグナルは生じない。
【００２４】
本方法の利点は、リポーター遺伝子が発現されるために、ＩＲＥＳベクターが、適切なリーディングフレームにおいて構造遺伝子に組み込まれなくてもよい点である。更に、本方法は、ＩＲＥＳベクターが挿入される遺伝子の発現パターンに関して更なる情報を提供する。具体的に述べると、特定の植物部分および／または植物発生の特定時点におけるリポーター遺伝子の検出により、構造遺伝子がこの特定の植物部分および／または植物発生の特定時点で発現されることが示される。ＩＲＥＳベクターは、以下の意味で物理的な標識としても機能する。すなわち、ＩＲＥＳベクターは、ＩＲＥＳベクターを両側から挟む植物ＤＮＡとともに抽出でき、次にＩＲＥＳベクターが挿入された構造遺伝子が同定され、機能が明らかにされる。これらの工程により産生された形質転換植物、植物の部分、植物細胞および原形質、および植物から得られた種子も提供されている。
【００２５】
好ましい実施例において、転写終結シグナルおよびポリアデニル化部位を含む３’非翻訳領域も含む、ベクターは、プロモーター、選択マーカーおよび転写終結区を含む独立転写単位も含むことができる。ベクターはＩＲＥＳ上流の三つのリーディングフレームに終止コドンを、あるいはＩＲＥＳまたは終止コドンの上流にスプライスアクセプターを含むこともできる。ベクターは、二つの転写単位がベクターの両端にあるように、コンバージェントな方向性（convergent orientation）をもった第二のＩＲＥＳにより従動するマーカー遺伝子を含むことができる。構築物またはベクターは、トランスポゾン逆方向反復配列により両端を挟まれることもある。
【００２６】
本発明の別の点は、ＤＮＡ配列を植物に組み込むために定義されたランディングパッドを作製するために、ＩＲＥＳ構築物またはベクターを利用する方法を提供する。本発明の第一の形態に従って、例えば、特定の植物部分において、および／または植物発生時の特定の時点において発現される植物ゲノム内構造遺伝子を同定することにより、ランディングパッドの部位を決定できる。新しいＤＮＡ配列、例えば、植物本来の構造遺伝子、あるいは植物に本来存在しない構造遺伝子の組み込みは、特定のランディングパッド部位において植物ゲノムに導入される。ランディングパッド部位は、転写活性のある特定の遺伝子座において植物中で機能するＩＲＥＳ成分により適切な領域に配置することにより、新たに導入された遺伝子の所望の時間的および／または空間的発現を提供する。ランディングパッド部位は、ＩＲＥＳ成分とリポーター遺伝子の他に、一つ以上の部位特異的組み換え部位を含む。ランディングパッド部位に導入される目的の核酸は、一つ以上の部位特異的組み換え配列と関連している。目的の核酸は、所望の時間および／または空間で発現されなくてはならない有用な特徴を提供するあらゆる遺伝子が可能であるが、それらに限定されない。リコンビナーゼは、核酸のランディングパッド部位への導入を触媒する酵素であるが、同じベクターあるいは伴生種のベクターにおいて目的の核酸に組み換えのために安定的に、あるいは一過性に供給できる。好ましいリコンビナーゼは、バクテリオファージＰｈｉ Ｃ３１のインテグラーゼである。従って、植物ゲノムに導入されるべきＤＮＡを含む構築物の組成に関する性質は、ランディングパッドの形式と、リコンビナーゼがすでに植物の中に存在するかどうかによって左右される。ランディングパッドに構築物を導入する好ましい方法には、ＤＮＡ形質転換、ウィルスのトランスフェクション、植物の異種交配が含まれる。これらの工程により産生される形質転換された植物類、植物の部分、植物細胞類、および原形質体類も提供される。
【００２７】
本発明の更に別の形態によれば、機能が知られていないＤＮＡ配列を計画的に誤って発現し、異所性遺伝子発現に基づきそれらの機能を識別するために、種々のランディングパッド系を使用する方法に向けられている。本発明のこの点において、特定の植物部分および／または発生の特定の時点で発現されることが決定されているゲノム内構造遺伝子内部にランディングパッド部位を有する形質転換された固体は、更に機能が知られていない核酸により形質転換される。表現型の変化が観察され、知られていない核酸の機能との相関関係が検討される。これらの工程により産生される形質転換された植物類、植物の部分、植物細胞類、および原形質体類、および形質転換された植物から得られる種子も提供される。
【００２８】
［発明を実施する最良の方法］
本発明は、マーカー遺伝子に結合された植物において機能可能な新しい内部リボソームエントリー部位配列（ＩＲＥＳ）を含むプラスミド構築物と植物ゲノム機能分析への利用法、および新しい遺伝子の導入と発現のための遺伝子工学により作製されたゲノムレセプター部位（ランディングパッド）を説明している。ＩＲＥＳに基づく遺伝子標識ベクターおよびランディングパッドベクターは、宿主生物体のゲノムＤＮＡに挿入でき、プロモーターおよびエンハンサーのような異所性調節成分よりむしろ本来の遺伝子座の転写調節に基づき、マーカー遺伝子または目的の遺伝子の発現を可能にするＤＮＡ構築物である。導入された遺伝子の翻訳開始は、キャップ部位とは無関係である。
【００２９】
ジーントラップベクター（例えば、プラスミド）は、活発に転写される宿主ＤＮＡ配列へのベクター挿入に基づき、ゲノム調節成分および遺伝子を同定するためにデザインされた構築物である。最小限、これらはＩＲＥＳとリポーター遺伝子、あるいはＩＲＥＳとリポーター遺伝子を選択遺伝子とともに含む。
【００３０】
ゲノムランディングパッドベクターは、目的の遺伝子（ＧＯＩ）の挿入または部位特異的組み換えまたは相同組み換えによるマーカー遺伝子のＧＯＩによる置換を可能にする更なる成分を含むジーントラップベクターと類似している。
【００３１】
「タッチダウンベクター（touchdown vector）」は、ゲノムランディングパッドに組み込むためのＧＯＩおよび適切な成分（例えば、同族部位特異的組み換え部位）を持つベクター（例えば、プラスミド）構築物である。これらのベクターは、ＧＯＩに関連する転写調節配列を含まず、発現に関してはゲノム挿入部位の調節配列に依存している。
【００３２】
ＩＲＥＳ（内部リボソームエントリー部位）は、ＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）に沿った内部開始コドンにおいて、翻訳を開始できる核酸配列である。ＩＲＥＳは、ｍＲＮＡキャップおよび／またはリボソームスキャニングと無関係に機能する。これらは、本発明において、マーカー遺伝子を発現させ、それが導入されたゲノム転写物の発現パターン分析を可能にするために使用される。５’キャップまたはリボソームスキャニングと無関係に内部開始コドンにおける翻訳を可能にする、植物において機能することが可能なすべての配列が、その供給源と無関係に、本発明の目的のためのＩＲＥＳと見なされる。従って、植物、ウィルス、および合成された製品などの種々の供給源由来のＩＲＥＳを使用することができる。
【００３３】
具体例として、二つの特異的ＩＲＥＳ成分が、十字花植物タバコモザイクウィルス（crucifer tobacco mosaic virus:ＣｒＴＭＶ）のゲノムから得られる。ＩＲＥＳｍｐ７５^crは以下の通りである。
【化１】

ＩＲＥＳ_cp１４８^CRは以下の通りである。
【化２】

【００３４】
マーカー遺伝子は、遺伝子発現が、発現の欠失または発現レベルの変動から識別できるような、観察可能な、または測定可能な表現型を生じるタンパク質をコードする。マーカー遺伝子には視認できる比色、蛍光、発光、または生化学分析可能な産物を生じるリポーター遺伝子、生理学および成長差に基づき形質転換物を選択できる選択マーカー、または視認可能な生理学的または生化学的特徴を示すその他の遺伝子が含まれる。リポーター遺伝子の一般例には、ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）、ＧＵＳ（β−グルクロニダーゼ）、ＧＦＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ルシフェラーゼ、またはＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）が含まれ、これらは容易に視認可能であり、あるいは分析可能である。抗生物質（カナマイシンまたはヒグロマイシンン）耐性、殺草剤（フルフォシネート、イミダゾリノンまたはグリフォセート）耐性または生理学的マーカー（視認可能または生化学薬品）のような選択マーカーは、タンパク質を発現する細胞のみを選択するという長所を有するが、簡単に定量できない。
【００３５】
目的の遺伝子（ＧＯＩ）または構造的なＧＯＩは、宿主植物に挿入され、発現される遺伝子のすべての遺伝子（タンパク質コーディング領域）、センスまたはアンチセンスを指す。これは、過剰発現、交代発現パターン、相同性に依存的なサイレンシングまたはアンチセンスＲＮＡを介する遺伝子サイレンシングが必要な宿主遺伝子でも別の生物体由来の異種遺伝子でもよい。ＧＯＩは、農業経済学的に有意義な遺伝子に限らない。ＧＯＩは、例えば、医薬品として有用なタンパク質を発現できる。従って、ＧＯＩは植物において発現可能なすべての核酸である。
【００３６】
部位特異的リコンビナーゼ系は、バクテリオファージおよび組み込みプラスミドにおいて十分実証されている。これらの系は広範に研究され、動植物における導入遺伝子の組み込みおよび染色体作製への利用に適するように改変されている。部位特異的組み換え系は、一つ以上のリコンビナーゼまたはインテグラーゼタンパク質の発現と、リコンビナーゼにより認識される二つの部位の存在を必要とする。リコンビナーゼは、特異的部位を認識し、シスまたはトランスの二つの部位間で組み換えを引き起こす。リコンビナーゼは、組み換え部位の互いの相対的位置および方向性に基づき、交換、挿入、切除または逆位を引き起こすことができる。交換は、部位がＤＮＡの異なる線状断片にある場合に起こる。少なくとも一つの基質ＤＮＡが環状ならば、組み込みが起こる。組み換え部位が同じ断片にある場合、もしもこれらの部位が同じ方向性にあれば切除が起こるが、反対の方向性にあれば逆位が起こる。従って、適用例に応じて、認識部位のトポロジーと方向性が重要である。このため、部位特異的リコンビナーゼは、組み込みが非常に正確に行われるため、ゲノム作製に非常に適したものとなる。部位特異的組み換え系は、λインテグラーゼファミリーのリコンビナーゼ（バクテリオファージラムダ由来のλリコンビナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＦＬＰ−ＦＲＴ、Ｚｉｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉのＲ−ＲＳ系またはバクテリオファージＭｕのＧｉｎ−ｇｉｘ系）またはレソルバーゼ／インベルターゼファミリー（バクテリオファージφＣ３１由来のＣ３１インテグラーゼ）にもとづくことができる。ｃｒｅ−ｌｏｘ 系（Ｓａｕｅｒ，米国特許第４，９５９，３１７号，Ｏｄｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，６５８，７７２号；Ｏｄｅｌｌ，ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ／ＷＯ９１／０９９５７）およびＦＬＰ−ＦＲＴ系（Ｈｏｄｇｅｓ ａｎｄ Ｌｙｚｎｉｋ，米国特許第５，５２７，６９５号）を含めて、本発明における利用に適した部位特異的組み換え系の例は文献に開示されている。
【００３７】
バクテリオファージおよび酵母由来の部位特異的リコンビナーゼは、試験管および生体内の両者におけるＤＮＡ操作の手段として広く利用されている。本発明において利用するのに好ましいリコンビナーゼ／組み換え部位の組み合わせは
ｃｒｅ−ｌｏｘ、ＦＬＰ−ＦＲＴ、φＣ３１およびＲ−ＲＳである。その他の適切な系には、イントロンがコードされた酵母エンドヌクレアーゼであるＩ−ＳｃｅＩが含まれ、利用できる。Ｃｏｕｌｉｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５：１９６８−１９７３（１９９５）参照。組み換え部位が、一本鎖ＤＮＡ分子に、またはその内部に、順方向または逆方向の配向性を持つように配置されているかどうかに関係なく、あるいは非結合線状または環状ＤＮＡ分子で配置されているかどうかに関係なく、対応するリコンビナーゼは、相互交換を触媒し、削除、逆位、転座または同時組み込み事象を生じることができる。Ｂｏｌｌａｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２３：１９９−２２５ ８１９８９）；Ｋｉｌｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．９：４１３−４２１（１９９３）；およびＯｗ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．７：１８１−１８６（１９９６）参照。
【００３８】
本発明において、リコンビナーゼを介する部位特異的な転座は、導入されるＤＮＡと染色体上の目的の遺伝子中のランディングパッド部位において起こり、この場合、常在遺伝子は、空間的および／または時間的発現パターンに基づき選択できる。このイントランス（in-trans）リコンビナーゼ作用は、外因性ＤＮＡ分子と染色体間の導入遺伝子の移入に不可欠である。Ｄａｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ９１：７９−８５（１９９０）；Ｄａｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ９１：７９−８５（１９９０）；Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２３：３６９−３７８（１９９０）；Ｄａｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０５５８−１０５６２（１９９１）；Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３４：４９−５９（１９９２）；Ｌｙｚｎｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．８：１７７−１８６（１９９５）；Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．７：６４９−６５９ ８１９９５）；ｖａｎ Ｄｅｕｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：７３７６−７３８０（１９９５）参照。
【００３９】
植物における導入遺伝子処理のための公知の組み換え系の特殊な一つの利用法は、植物ゲノムからの導入遺伝子の切除、抗生物質選択マーカーのような望ましくない異種遺伝物質を市販の変種から除去できる方法を示している（Ｏｗ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ ＷＯ９３／０１２８３）。しかし、これらの系は、全く異なる利用範囲、すなわち導入遺伝子と常在植物遺伝子の流れの分離を扱うのではなく、異種での望ましくない部分を除去するために部位特異的組み換えを利用している。別の利用法は、Ｈｏｏｙｋａａｓ ａｎｄ Ｍｏｚｏ，米国特許第５，６３５，３８１号およびＯｆｆｒｉｎｇａ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，５０１，９６７号に説明されており、アグロバクテリウムにより仲介される形質転換を介する植物ゲノムへのＤＮＡの特定部位を標的とする組み込みを達成するために部位特異的組み換えの利用を指向している。
【００４０】
本発明により利用される部位特異的組み換え技術およびＩＲＥＳ成分は、明らかで強力な利点を有する。ＤＮＡ部位の相同性により正確に標的を定めることにより、前もって注意深く選択され、特徴を明らかにされた導入遺伝子「ランディングパッド」を作製できる。その結果、遺伝率、発現レベル、サイレンシングの欠如等、導入遺伝子の作用を高レベルに予測し、再現することができる。また、後発の導入遺伝子カセットを同じ部位で処理でき、古い導入遺伝子を新しいものと交換できる。あらかじめ選択去れ、決定され、マッピングされた組み込み部位によるこの材料のその後の育種は、非常に容易で、比較的簡単である。ＩＲＥＳは、目的の遺伝子が、それが挿入される常在遺伝子と同じ時間と空間で発現される効率を高め、従って、ＧＯＩを５’非翻訳領域または正しいリーディングフレームに正確に挿入する必要性がなくなった。
【００４１】
スプライスアクセプター（ＳＡ）には、３’イントロンスプライシング部位とブランチ部位が含まれ、内因性イントロン内部でゲノム挿入物からの発現を可能にするために構築物に付加できる。ブランチ部位とスプライスアクセプター部位は、イントロンへの構築物の挿入により、内因性スプライシングドナーを用いて融合転写物を形成できるように、発現カセットの５’に配置できる。
【００４２】
トランスポゾンは、自然界に存在する移動遺伝因子で、多くの植物種に一般的に見られ、ゲノム内部で移動、飛躍、移転する能力を有する。Ａｃ／Ｄｓ、Ｅｎ／Ｓｐｍ等の幾つかのトランスポゾンが、異種植物種における遺伝手段として、クローニングされ、特徴が明らかにされている。Ｍｕは、トウモロコシにおける遺伝手段として探求中である。転位には、多くのリコンビナーゼに非常に類似している二つの成分が必要である。第一は、トランスポサーゼ酵素の発現、第二はトランスポサーゼ酵素により認識される逆方向末端反復の存在である。リコンビナーゼとトランスポサーゼの大きな違いは、転位がゲノムのランダムな部位で起こるため、突然変異分析に有用である点である。更に、トランスポゾンは、誘導され、再度切除され、復帰突然変異体あるいは「機能の獲得」を得る。これは、突然変異遺伝子の機能を確立しようとする時に有用な情報である。
【００４３】
［遺伝因子／ジーントラップおよび機能的ノックアウト］
古典的ジーントラップベクターの制限の多くは、マーカー遺伝子の翻訳がキャップ構造ｍＲＮＡまたは融合タンパク質の使用に依存しなければ、克服できる。従って、本発明の一側面において、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）は、マーカー遺伝子と共に使用され、それによってマーカー遺伝子が挿入された転写物の発現を分析することができる。植物ゲノムの転写領域のどこに挿入されても、融合転写物を生じるように、ＩＲＥＳはマーカー遺伝子コーディング配列のすぐ上流に配置される。ＩＲＥＳ成分が存在しないと、発現は５’非翻訳領域または正しいフレーム内挿入でエキソンに挿入することにかかってしまう。ＩＲＥＳが存在すれば、内部部位における「非融合」リポータータンパク質の翻訳が可能となり、それによって内因性エキソン内部の挿入点に関わりなく非融合タンパク質の翻訳が可能となる。リーディングフレームと挿入点への依存性はなくなり、機能性リポーター遺伝子産物を介する有用な情報を生じる転写領域内部の挿入物数が劇的に増加する。「ヒット」数が増えるほど、より多くの有用なゲノムの位置が同定される。
【００４４】
ジーンエレメントトラップベクターは、活動的に転写される宿主ＤＮＡ配列への挿入に基づき、ゲノム調節成分と遺伝子を同定するようにデザインされた構築物である。それらのもっとも基本的な形態において、遺伝子標識ベクターはマーカー遺伝子の上流にＩＲＥＳ成分を含む。好ましい実施例において、ベクターは転写物をより効率的に処理するための３’非翻訳領域を含む（図１ａ）。好ましいマーカー遺伝子は、β−グルコニダーゼ（ＧＵＳ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはルシフェラーゼ（ＬＵＣ）のような可視シグナルを供給するリポーター遺伝子である。リポーター遺伝子の存在により、挿入のゲノム部位の転写活性の直接分析が可能となる。選択の種類により制限が生じるため、前者よりは好ましくない実施例において、マーカー遺伝子は選択マーカーである。例えば、形質転換体は、典型的には、抗生物質、殺草剤または選択的成長条件の選択圧から形質転換細胞を保護するために、適切な組織において選択マーカー遺伝子の構成性発現に基づいて選択される。このような遺伝子をゲノム調節配列の調節下に置くことにより、生産的挿入物の数が、選択マーカー遺伝子の適切なレベルの時間的および空間的発現パターンを生じる数に制限される可能性がある。従って、独立した構成的プロモーターにより駆動される形質転換および再生に関する選択マーカー遺伝子を使用することが好ましい。評価可能な表現型を表すその他の遺伝子も、標識遺伝子およびゲノム成分を同定し、分析するためにマーカー遺伝子として利用できる。
【００４５】
特に必要というわけではないが、独立した構成的プロモーターの調節下にある選択マーカー遺伝子をジーントラップ構築物に含めることができる。これによって、植物中に再生され、その後多様なマーカー遺伝子発現プロフィルに関してスクリーニングされる形質転換された細胞の選択が可能となる。
【００４６】
これに加えて、ベクター構築物は更に、適用に応じて以下の成分を含むことが可能である。
【００４７】
天然のオープンリーディングフレームからの翻訳を終結し、ＩＲＥＳからの効率的翻訳と融合タンパク質産物の可能性の排除を確実にするために、終止コドンをＩＲＥＳ上流の三つのリーディングフレームすべてに挿入できる（図１ｂ）。
【００４８】
挿入物からのイントロンへの発現を可能にするために、スプライスアクセプター（ＳＡ）を構築物に加えることができる。通常、ベクター配列は残りのイントロンによるｍＲＮＡ処理中に除去される。しかし、ブランチ部位と発現カセットの５’末端に配置される３’スプライシング部位を含めることにより、内因性スプライシングドナーを用いて融合転写物の形成が可能となる（図１ｃ参照）。
【００４９】
ＩＲＥＳ／マーカー構築物は、Ｔ−ＤＮＡの右または左の境界、あるいは両方に配置できる。それぞれ異なるマーカーを駆動する二つのＩＲＥＳ成分を、Ｔ−ＤＮＡの両端に、コンバージェントな方向性にあるように配置することにより、その方向性によって、片方または両方の遺伝子の発現が可能となる（図１ｄ参照）。
【００５０】
トランスポゾンも、遺伝因子標識系に対する有用な付加である。トランスポゾンは、自然界に存在する移動遺伝因子で、多くの植物種に特に多く見られ、ゲノム内部で移動、飛躍、移転する能力を有する。Ａｃ／Ｄｓ、Ｅｎ／Ｓｐｍ等の幾つかのトランスポゾンが、異種植物種における遺伝手段として、クローニングされ、特徴が明らかにされている。転位には、多くのリコンビナーゼに非常に類似している二つの成分が必要である。第一は、トランスポサーゼ酵素の発現、第二はトランスポサーゼ酵素により認識される逆方向末端反復の存在である。リコンビナーゼとトランスポサーゼの大きな違いは、転位がゲノムのランダムな部位で起こるため、突然変異の分析に有用である点である。更に、トランスポゾンは、誘導され、再度切除され、復帰突然変異体あるいは「機能獲得」を得る。これは、突然変異遺伝子の機能を確立しようとする時に有用な情報である。
【００５１】
本発明において、Ｄｓ成分のようなトランスポゾン逆方向反復配列は、ランディングパッド構築物を挟むが、Ｔ−ＤＮＡ境界の内側に配置できる。アグロバクテリウムによる形質転換により、この構築物は宿主ゲノムに導入される。次に、トランスポサーゼ酵素が、衝撃（bombardment）、エレクトロポレーションまたはウィルス送達等の技術により一時的に導入されるか、あるいは形質転換またはすでにトランスポサーゼを発現する植物との交差により安定的に導入される。これによって、二次的突然変異とリポーター遺伝子発現プロフィルがスクリーニングされるゲノム内部の別のランダムな遺伝子座に、構築物が転位される。Ａｃ／Ｄｓのような幾つかのトランスポゾン系は、結合されたゲノム遺伝子座を転位する傾向があるが、Ｍｕのように、ゲノム全体を転位する傾向があるものもある。突然変異体誘発および発現パターンに関して、それぞれ独自の長所、短所、有用性を有する。ゲノム全体をランダムに転位するトランスポゾン系は、目的が挿入物によるゲノムの飽和である場合に望ましい。結合された遺伝子座における挿入が有利なトランスポゾン系は、目的が遺伝子座または結合された遺伝子の特徴を明らかにすることである場合に望ましい。
【００５２】
プラスミドまたはコスミド配列は、ジーントラップまたはランディングパッドベクターに組み込み、遺伝子調節成分または遺伝子を含む興味深く、有用なゲノム遺伝子座の「プラスミドレスキュー」を可能にできる。細菌において機能する複製起点と選択マーカーを持つＤＮＡ断片は、構築物内部に配置される。
【００５３】
［植物の形質転換］
植物宿主ゲノムにＤＮＡ分子を移入または組み込むためのあらゆる方法が本発明の技術にとって有用である。大量の独立した形質転換個体を生じる形質転換法が好ましい。これによって、スクリーニングおよび分析のためのランダムな挿入物の大きなライブラリが作製される。シロイヌナズナ真空浸潤または液浸のような方法は、これに非常に適している。なぜならば、大量の植物が小さな空間で形質転換され、形質転換体スクリーニングのための大量の種子が得られるからである。形質転換効率と労働量も、この技術の利点である。アグロバクテリウムは、単一または少数のコピー挿入物を持つ形質転換植物を生じる傾向があるため好ましい。また、アグロバクテリウムは、典型的には定義された末端（Ｔ−ＤＮＡ境界）により線状ＤＮＡ断片（Ｔ−ＤＮＡ）を移入する。これは、所望の産物が、ｍＲＮＡ融合産物を作製する挿入物であるため、重要である。マイクロインジェクション、化学処理または微粒子銃のような直接ＤＮＡ形質転換も有用であるが、多数のコピー挿入物と挿入物の定義されない末端を生じる傾向がある。
【００５４】
シロイヌナズナのｉｎ ｐｌａｎｔａ形質転換の場合、アグロバクテリウム処理植物を成熟するまで成長させ、種子を収穫する。形質転換体を得るために、次に収穫した種子を選択圧の下で発芽させる（抗生物質、殺草剤、または選択的成長条件）。殺草剤耐性を利用する場合、種子は選択なしで大きな育苗用平箱で発芽させ、適当な成長段階で殺草剤を散布するだけでよい。
【００５５】
ほとんどのその他の形質転換技術は、組織培養段階を必要とし、そこで形質転換細胞は形質転換種に適した培地で再生するように誘導される。形質転換組織を識別するために再生工程は典型的には選択圧を含む。これは、ほとんどの種にとって、もっとも一般的な植物形質転換形態であるが、数百または数千の独立形質転換体を入手するには、時間と手間がかかる。
【００５６】
［標識植物の分析］
リポーター遺伝子は、定量的、発生的、誘導性および組織特異的発現を含む遺伝子座のプロフィルを監視するために利用できる。ルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ、種々の緑色蛍光タンパク質等のリポーター遺伝子は、それらの発現を化学蛍光または蛍光を用いて監視でき、分析が非破壊的であるため、特に有用である。発現は、低光量の撮像装置を用いて機能性産物に関して関しでき、あるいは蛍光光度計を用いて抽出物において定量できる。発現は、ＲＴ−ＰＣＲまたはノザン法を用いて転写レベルでも分析できる。有用な標識植物は、更にＰＣＲまたはサザン法を用いて遺伝子コピー数に関して分析でき、またハイブリダイゼーションに基づくＲＦＬＰ（制限断片長多形性）またはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＰＣＲに基づくＡＦＬＰ（増幅断片長さ多形性）、ＲＡＰＤ（ランダム増幅多形性ＤＮＡ）、ＳＳＲ（単純配列反復）、またはＣＡＰＳ（切断増幅された多形性配列）または従来の育種法を含む一つ以上の幾つかの技術を用いてゲノム部位に関して分析できる。ゲノム部位標識ベクターにより同定される有用な遺伝調節成分は、更なる分析とその他の応用のために分離できる。プラスミドレスキューおよび逆ＰＣＲのような技術を用いて、更なる分析のために周囲のゲノム配列を分離することができる。
【００５７】
［ゲノムランディングパッド］
望ましい量と時間的および空間的発現パターンのような特徴を示す特徴が十分明らかにされたプロモーターおよびその他の調節成分の有効性は限られている。植物の形質転換において、ゲノム挿入物、位置の影響、発現の安定性がランダムであるため、遺伝子発現には更なる複雑性が観察される。もっともよく研究されたプロモーター成分を用いた場合でさえ、導入遺伝子を駆動する異所性プロモーターの活性は、それらが挿入された宿主ゲノムの位置の配列とクロマチン構造により影響を受ける。これらの影響により、独立した形質転換個体ごとに発現レベルおよびプロフィルに変動が生じる。この変動の範囲は、導入遺伝子が非常に高度に発現するレベルから、全く発現しないレベルにまでおよび、遺伝子発現の長期安定性に影響を及ぼす可能性もある。この問題は一般に、大量の形質転換体をスクリーニングし、許容可能な発現レベル、パターン、安定性を示す形質転換体を同定することにより克服できる。遺伝子サイレンシング（発現の欠失）も、問題である。なぜならば、これらの「最良に機能する」植物が何世代にもわたり進化し、導入遺伝子発現が停止されるからである。
【００５８】
これらの問題を軽減する一つの方法は、目的の導入遺伝子を、正確で十分に特徴が明らかにされたゲノム部位に挿入することである。これによって、異所性転写調節成分ではなく、内因性調節成分により、所望の発現パターンおよびレベルがもたらされる。このターゲッティングは、本発明のゲノム部位標識技術と部位特異的組み換えを組み合わせて、「ランディングパッド」を作製することにより達成される。目的の遺伝子またはＤＮＡ配列はすべてトランスジェニック「ランディングパッド」に挿入できる。マーカー遺伝子の分析に基づき種々の時間的および空間的発現パターンを持つ「ゲノムランディングパッド」部位を含む形質転換植物のライブラリを作製できる。次に、部位特異的組み換えを用いて、新しいＧＯＩをランディングパッドに組み込み、これによってＧＯＩをこの座位の転写調節下に置く。リポーター遺伝子（選択マーカー遺伝子）を置換することにより「ランディングパッド」に組み込むために、あらゆるＧＯＩをクローニングするためにデザインされた構築物が図３および図５に示されている。この場合、新しいＧＯＩはすべて、右配向の二つのａｔｔｐ部位の間でクローニングされなくてはならない。新しい遺伝子は同じ部位に挿入されるので、位置の影響および相同性に依存的な遺伝子サイレンシングの短所は示さず、量的、空間および時間的調節を含めて、発現はリポーター遺伝子と類似または同一である。
【００５９】
ゲノムランディングパッドベクターは、実質的にゲノム部位標識ベクターと同じで、特異的リコンビナーゼ認識配列が付加されている（図２、３、４および６参照）。これらの部位は、幾つかの位置と方向性で配置でき、環状プラスミドの挿入（図２）または新しいＧＯＩによるマーカー遺伝子の置換（図３．４．６）を可能にする。例えば、単一の組み換え部位は、ＩＲＥＳの上流、ＩＲＥＳとマーカー遺伝子の間、またはマーカー遺伝子と３’ＵＴＲの間に配置できる。ＩＲＥＳの上流に組み換え部位を配置することは、部位特異的組み換え部位が翻訳開始に影響を及ぼす可能性があるＩＲＥＳとマーカーのコーディング領域の間に配置されないため有利である。組み換え部位を、コーディング配列と、組み換え部位、ＩＲＥＳ、ＧＯＩを含むタッチダウンベクターとの下流に配置することにより、両方の遺伝子を発現できる多シストロン性メッセージが形成される。同様に、遺伝子置換に関して、組み換え部位は、マーカー遺伝子および／または選択マーカー遺伝子の置換を含む所望の結果に応じて幾つかの位置に配置できる（図２および３に具体例が示されている。）。
【００６０】
ゲノムランディングパッドベクターによる植物の形質転換と形質転換体の分析は、上記のゲノム部位標識ベクターに関して実施される。一旦所望の発現特徴を有するゲノム部位が同定され、分析されたなら、タッチダウンベクターの新しいＧＯＩを挿入または置換により導入することができる。タッチダウンベクターは、ゲノムランディングパッドに組み込むためのＧＯＩと適切な成分を有するベクター（例えば、プラスミド）構築物である。ランディングパッドベクターのように、タッチダウンベクターは転写調節配列を含まず、転写発現のためのゲノム挿入部位における調節配列に依存している。タッチダウンベクターの組み換え部位の形態は、組み換え配列、構築物内配置、ＤＮＡの配向およびトポロジーを含む所定の適用のためのランディングパッドの部位に合わせなくてはならない。例えば、タッチダウンベクターは、挿入が起こるためには閉鎖環状形態でなくてはならず、他の形態は遺伝子置換または切除を引き起こすために使用される。
【００６１】
次に、ランディングパッドベクターにより標識され、所望の特徴（配置、位置、コピー数を含む）を表すトランスジェニック植物を、新しいＧＯＩと適切な組み換え部位を有するタッチダウンベクターの挿入に使用する。ランディングパッドベクターは、独立した異所性プロモーターにより駆動される第二の選択マーカーを含むことが可能で、これによってタッチダウンベクターの安定な組み込みを選択できるが、第二の選択マーカーが必ずしも必要というわけではない。
【００６２】
ゲノムランディングパッド内の部位特異的組み換え部位において所望の配列を導入するために、ランディングパッドベクターとリコンビナーゼ酵素は、ランディングパッドを持つ同じ植物細胞内に存在しなくてはならない。タッチダウンベクターとリコンビナーゼの送達は、以前に述べられたどの方法によっても、安定的に、あるいは一過性に可能である。しかし、挿入に関しては、タッチダウンベクターは環状でなくてはならず、これによってプラスミドの直接的な移入は好ましい技術となる。φＣ３１インテグラーゼを介する組み込みは、このリコンビナーゼの機序が不可逆的で安定であるため好ましい。リコンビナーゼ酵素の分離または除去は、多くの他の組み換え系と同様に重要な問題ではない。これによって、酵素の送達と発現のために使用される技術の選択がより柔軟となる。
【００６３】
ゲノムランディングパッドとランディングパッドベクターの形態に応じて、組み換え植物はリポーター遺伝子の喪失、またはリポーターおよび選択マーカーの喪失および第二の選択マーカーがある場合と無い場合のＧＯＩ発現の獲得により選択できる。植物は更に、ｍＲＮＡレベルのノザン法またはＲＴ−ＰＣＲ分析およびエリザ、ウェスタンブロットまたは機能性生化学分析によりＧＯＩの発現を分析できる。サザン法のような更なる分子データ、ＰＣＲまたはマーカーにより補助される育種技術が、ランダムな組み込みではなく適切な挿入／置換が起こったことを確認するために望ましい場合がある。
【００６４】
［ゲノム部位標識ベクター］
ＩＲＥＳに基づくゲノム部位標識ベクターは、プロモーターとその他の転写調節成分を同定するために有用である。ゲノム機能分析に本発明を利用する場合、リポーター遺伝子の発現が機能性遺伝子におけるベクターのランディングの指標である。リポーター遺伝子の発現プロフィルは、構造遺伝子内の挿入突然変異による機能喪失と連結させることができる。
【００６５】
ＩＲＥＳ成分構築物は、導入遺伝子の発現がリーディングフレームに依存せず、融合タンパク質産物を減少させ、発現および機能性産物を生じる挿入物の数を増加させるため、現行の遺伝子標識およびプロモーターまたはエンハンサーに基づくトラッピングに改良を加える。
【００６６】
［ゲノムランディングパッド］
部位特異的組み換え部位を含めることにより、標識された遺伝子座を、新しい目的の遺伝子（ＧＯＩ）を挿入するための「ランディングパッド」（レシピエント遺伝子座）として利用できる。ＧＯＩは、同種組み換え部位（cognate recombination site）を持つように構築され、その結果、その特定の遺伝子座に関する宿主細胞の転写調節下に置かれることになるランディングパッド部位に効果的に挿入できる。ＧＯＩは、多様な発現プロフィルのランディングパッドを持つ多数の宿主系に配置できる。この技術は、ゲノム機能分析と共に、トランスジェニック植物の生産に有用である。ある遺伝子の未知の機能を解明するために、種々の異所性発現パターンのと、遺伝子のアップレギュレーションとダウンレギュレーションの影響を決定するために、センス形態およびアンチセンス形態における遺伝子をコードする領域を多くのランディングパッド部位に挿入することが有用な場合がある。
【００６７】
ゲノムランディングパッド技術は、転写調節成分の必要性を減じ、ベクター全体の大きさを縮小し、分離され、特徴を明らかにされた調節成分の大規模なライブラリの必要性を減じる。部位がその本来の環境に留まり、ゲノム配列が重複していないという事実は、位置効果と相同性に依存的な遺伝子サイレンシングの可能性を減じる。最終結果は、トランスジェニック植物の生産が、はるかに正確かつ効率的となり、遺伝子発現レベル、パターンおよび安定性の制御性が高まる。
【００６８】
本明細書に説明されているランディングパッドを含む植物は、ゲノム機能分析にも利用できる。一般に、遺伝子機能は、特定遺伝子の突然変異の影響を理解することにより定義されることがもっとも多い。この点に関して、大多数の場合に生じる突然変異は化学的に誘発されるか、放射線により誘発されるか、ある突然変異によるものである。多くの場合、これらの事象の結果は、遺伝子の機能の喪失と、その後の影響である。しかし、機能の獲得により遺伝子の機能を定義することも可能である。すなわち、通常は発現されない時間または場所で遺伝子（内因性または異種性）が発現された場合に、その系（植物）で発生することに関して観察が行われる。植物の形質転換には多くのロジスティックな限界があるため、この方法はウィルス送達方法の利用に例外の可能性はあるが、大規模な遺伝子試料の遺伝子機能の発見にルーチンに適用されていない。ウィルス送達方法も、ウィルス送達系に基づきすべての組織において目的の外因性遺伝子を発現することは不可能なので、やはり限界がある可能性がある。ランディングパッド系は、形質転換の工程において、空間的および時間的発現の変動（研究のために選択された独特のランディングパッド系の数によってのみ制限される）と組み込みの精度の両方を達成するため、他のポジティブな発現系に顕著な利点を提供する。
【００６９】
未知の遺伝子の機能または有用性を定義するために、ランディングパッド系はレシピエントとして利用し、機能が未知の遺伝子の種々の発現パターンの影響を分析することができる。例えば、異なる時間的および空間的発現パターンを持つランディングパッド植物（根、根毛、根の先端部、分裂組織、葉、葉縁、葉脈、幹、花弁、葯、花粉、卵細胞、種子、胚芽など）のストックを維持することができる。実験遺伝子は、適切な組み換え部位を含むようにクローニングされ、次に個別のランディングパッド発現系にそれぞれ挿入される。部位特異的組み換え部位とリコンビナーゼは、植物の形質転換に典型的なランダムな挿入ではなく特異的部位への挿入を命令するので、研究のために引き起こさなくてはならない系あたりの形質転換事象の数ははるかに少なくて済む。表現型の観察が行われ、異所に発現されると、植物に形態学的特徴の変化を引き起こす遺伝子が同定される。このような結果により、遺伝子の種々のホルモンまたは成長調節機能に注目が集まるであろう。同様に、農学的または分析学的なふるいわけが、大きなスケールであっても実施され、新しく導入された遺伝子の発現により影響される可能性がある特異的特性（油の含有量または種類、変化したアミノ酸またはデンプンのプロフィルなど）または品質（早期発芽、塩、干ばつ、病気に対する耐性等）が測定される。これらの工程により生産される形質転換された植物、植物部分、植物細胞および原形質体、および形質転換された植物から得られる種子は、標準技術に従って調製される。
【００７０】
本発明の方法は、すべての植物、特に顕花植物、単子葉植物、双子葉植物、穀物などの農作物に適用できる。
【００７１】
本発明は、以下の実験研究を参照してさらに説明される。本章は、説明のみを目的とし、他に明示されていない限り、制限することを目的とするものではない。
【００７２】
［具体例１］
一連のＩＲＥＳを介する発現ベクターは、標準的な分子生物学技術を用いて作製された（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２））。すべての構築物が、特許登録された二成分ベクターファミリーｐＩＣＢＶ（ｐＩＣＢＶ２；ｐＩＣＢＶ１０、図７参照）に基づいて作製された。本発明において使用された構築物の図は、図４〜６に示されている。本発明において使用されたすべての遺伝子および構造成分に関する配列および情報は、一連の出版物および一般にアクセス可能なデータベースから入手できる。インテグラーゼＰｈｉＣ３１およびその標的部位ａｔｔＰ／ａｔｔＢ（Ｔｈｏｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２６５，１０３１−８；ＷＯ０１０７５７２（２００１））。図５に示す構築物は、二つのａｔｔｐ部位の間に配置されたＳａｃ１−Ｘｂａ１制限部位を使用するあらゆる目的の配列のクローニングのためにデザインされ、その様にして、「ランディングパッド」部位を目標とするあらゆる目的の配列を持つ「着地」ベクターを作製する。別のＡｃ／Ｄｓ系と構築物デザインは、多くの出版物に広く説明されている（Ｂａｎｃｒｏｆｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３４：１２２１−９（１９９３）；Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．（１９９５）９．１７９７−８１０；Ｍｅｉｓｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．，２０００，２２，２６５−７４）。本発明において使用されるΔＡｃ（「デルタＡｃ」）または安定化Ａｃは、Ｂａｎｃｒｏｆｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ．２３３：４４９−６１（１９９２）に説明されている。構築物のデザインは、本発明の説明と引用されている出版物から特に「ジーントラップ」技術の分野から入手可能な情報に基づき、本技術に精通する者により容易に再現でき、多様化できる。
【００７３】
［具体例２］
［植物の形質転換］
＜シロイヌナズナのｉｎ ｐｌａｎｔａ形質転換＞
エレクトロポレーションにより、プラスミド（カルバニシリン耐性）を、アグロバクテリウムツメファシエンス（ＧＶ２２６０株）の中に固定化した。細菌細胞を、抗生物質を含む３００ｍｌの２ＹＴ培地で成長させ、遠心分離により収集し、５％のショ糖にＯＤ₆₀₀＝０．８まで再懸濁した。
【００７４】
シロイヌナズナを開花するまで成長させた。次に、開花したシロイヌナズナの束を数秒間真空状態でアグロバクテリウム溶液に浸した。形質転換された植物を高湿度の暗所で２４時間保持し、温室に移した。選択マーカーとしてＢＡＲ遺伝子使用の場合、種子を３〜４週間後に収集し、土壌にまき、１００ｍｇ／Ｌホスフィノスリシン、０．０１％のシルべットを散布した。選択効率と晩期発芽事象の頻度に応じて、処理を２〜３回繰り返した。選択マーカーとしてＮＰＴＩＩ使用の場合、収穫した種子を滅菌し、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＧＭ＋１％グルコース培地（Ｖａｌｖｅｋｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５５３６−５５４０（１９８８））で形質転換体に関してスクリーニングを行った。
【００７５】
アブラナ（brassica napus, ウェスター栽培変種）胚軸形質転換と形質転換体の再生が、以前に報告されているように実施された（Ｒａｄｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７５：６８５−６９４（１９８８）。
【００７６】
［具体例３］
［発現プロフィルの選択］
シロイヌナズナとアブラナの一次形質転換体を、Ｔ−ＤＮＡに基づく「ジーントラップ」構築物の場合のリポーター遺伝子発現パターンを研究するために直接利用した。トランスポゾンに基づく「ジーントラップ」に関して、転座頻度がもっとも高い一次形質転換体の自己子孫（Ｘ−ｇｌｕｃ染色組織におけるＧＵＳ＋セクターの数（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，Ｐｌａｎｔ ＭＯｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．５：３８７−４０５（１９８７））を、目的の発現プロフィルのスクリーニングに使用した。組織、器官、発生、誘導性または構成性発現プロフィルを示すが、ＧＵＳ染色セクターを持たない（Ａｃトランスポサーゼ活性がない）植物が選択された。ＧＦＰ発現プロフィルの検出を、紫外線光源（Ｌｅｉｃａ，ＧＦＰ３フィルター）を用いて、または移動式紫外線ランプモデルＢ１００ＡＰ（ＵＶＰ、Ｕｐｌａｎｄ製，カリフォルニア州、米国）を補助的に用いて、顕微鏡下で実施した。ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）遺伝子発現の検出は、光度計測デジタルシステムＣＯＯＬＳＮＰＨＯ−Ｍ（Ｒｏｐｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ニュージャージー州、米国）を補助的に用いて決定した。
【００７７】
［産業利用］
本発明は、遺伝子標識、ゲノム機能分析、植物形質転換および育種のような植物科学において利用できる。
【００７８】
本明細書に引用されている全ての特許文献および非特許文献は、本発明が属する技術に精通する者の技術レベルを表している。これらの出版物および特許明細書は全て、それぞれの出版物または特許明細書が、引用することにより本明細書の一部を成すこととすると、具体的かつ個別に表示されるのと同程度に、引用する事により本明細書の一部を成す事とする。
【００７９】
本技術に精通する者は、わずかにルーチンの実験を用いるだけで、本明細書に説明されている特定の物質および手順との均等物を多数認識し、あるいは確認することができる。このような均等物は、本発明の範囲内であると見なされる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ａからｅは、種々の「ジーントラップ」ベクターの概略図である。
【図２】 組み込みにより「ランディングパッド」に組み込むために、あらゆるＧＯＩをクローニングするためにデザインされた構築物を示す概略図である。
【図３】 リポーター遺伝子（および選択マーカー）の置換により「ランディングパッド」に組み込むために、あらゆるＧＯＩをクローニングするためにデザインされた構築物を示す概略図である。
【図４】 バイナリベクターｐＩＣＨＴ−ＬＰＧのＴ−ＤＮＡ領域の構造を示す概略図である。
【図５】 プラスミドｐＩＣＨ４３２１の概略図である（図中、「ＲＢ」と「ＬＢ」は、Ｔ−ＤＮＡの右と左の境界を示す）。
【図６】 プラスミドｐＩＣ−Ｄｓの概略図である。
【図７】 バイナリベクターｐＩＣＢＶ２およびｐＩＣＢＶ１０を示す概略図である。

Claims (21)

1. 第１のリポーター遺伝子と機能的に結合している少なくとも一つの第１の内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）と、第２の異なるリポーター遺伝子と機能的に結合している第２の内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）とを含む核酸構築物を提供するステップであって、該第１のＩＲＥＳと第２のＩＲＥＳとがコンバージェントな方向性にあり、第１のＩＲＥＳと第２のＩＲＥＳとが同一または異なり、
   前記核酸構築物を植物細胞に導入するステップと、
   転写活性領域への核酸構築物の挿入の指標としてのリポーター遺伝子発現を検出するステップと
   を含む、植物における転写活性領域を識別し、特徴づける方法。
2. 前記核酸構築物が、少なくとも一つの前記リポーター遺伝子の下流に転写終結領域を更に含む請求項１に記載の方法。
3. 前記核酸構築物が、プロモーターと、選択マーカー遺伝子と、転写終結領域とを更に含む請求項１または２に記載の方法。
4. 前記構築物が、前記第１のＩＲＥＳまたは第２のＩＲＥＳの上流に、三つのリーディングフレームに関する翻訳終止コドンを更に含む請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. 前記核酸構築物が更に、前記第１のＩＲＥＳまたは第２のＩＲＥＳの上流に少なくとも一つのスプライスアクセプター部位を含む請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. 少なくとも一つのリポーター遺伝子が、β−グルクロニダーゼ、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼまたはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼからなる群から選択されるタンパク質をコードする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
7. 少なくとも一つのＩＲＥＳが植物由来である請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
8. 少なくとも一つのＩＲＥＳが天然に生じないものである請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
9. 少なくとも一つのＩＲＥＳがウイルス由来である請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
10. 前記ウイルス由来のＩＲＥＳが十字花科植物トバモウイルスの遺伝子をコードするコートタンパク質または移動タンパク質から単離される請求項９に記載の方法。
11. 前記レポーター遺伝子を発現する形質転換された植物細胞から植物全体を再生するステップをさらに含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
12. ａ． 第一の核酸構築物を転写される領域に有する植物細胞を提供するステップであって、該第一の核酸構築物が少なくとも一つのＩＲＥＳと、少なくとも一つの部位特異的組み換え部位と、リポーター遺伝子とを機能的に結合した状態で含むことを特徴とするステップと、
    ｂ． 前記部位特異的組み換え部位を認識する部位特異的リコンビナーゼを、（ａ）の植物細胞に提供するステップと、
    ｃ． （ａ）の植物細胞に、第二の核酸構築物を導入するステップであって、第二の核酸構築物が、目的の構造遺伝子が前記第一の核酸構築物に組み込まれるか、あるいは前記第一の核酸構築物の一部と前記部位特異的組み換え部位において置換されるように、かつ目的の構造遺伝子がＩＲＥＳの機能的制御下にあるように、組み換え部位により両側を挟まれた目的の構造遺伝子を含み、前記部位特異的リコンビナーゼが構造遺伝子の前記第一の核酸構築物への組み込みを触媒する、ステップと、
    ｄ． 前記第一の核酸構築物に組み込まれているか、または、前記第一の核酸構築物の一部と置換されている目的の構造遺伝子であって、ＩＲＥＳの機能的制御下にある目的の構造遺伝子を有する植物細胞を選択するステップと
    を含む、植物への核酸の導入方法。
13. 前記リコンビナーゼが、バクテリオファージＰｈｉＣ３１のインテグラーゼ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ｆｌｐ−リコンビナーゼ及びＲリコンビナーゼからなる群から選択される請求項１２に記載の方法。
14. 前記構造遺伝子が既知の機能を有する請求項１２に記載の方法。
15. 前記構造遺伝子の機能が知られていない請求項１２に記載の方法。
16. 前記第一の核酸構築物が一つの部位特異的組み換え部位を含む請求項１２に記載の方法。
17. 前記第一の核酸構築物が二つ以上の部位特異的組み換え部位を含む請求項１２に記載の方法。
18. 前記第二の核酸構築物が、選択マーカー遺伝子と機能的に結合しているプロモーターと、転写終結領域とを含み、前記第二の核酸とともに植物細胞を選択することが可能な請求項１２に記載の方法。
19. 前記リコンビナーゼが、前記目的の構造遺伝子と同一のベクターに提供される請求項１２に記載の方法。
20. 前記リコンビナーゼが、前記目的の構造遺伝子と異なるベクターに提供される請求項１２に記載の方法。
21. 前記ＩＲＥＳが、ＩＲＥＳ _MP75 ^UI 、ＩＲＥＳ _MP228 ^CR 、ＩＲＥＳ _MP75 ^CR 、及びＩＲＥＳ _CP148 ^CR からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。

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