JP4354611B2 - イソフラボンアグリコンを含む発酵豆乳およびその製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、イソフラボンアグリコン含量の高い発酵豆乳及びその製造方法を提供するものである。
【０００２】
【従来技術】
豆乳等の大豆製品に含まれてるイソフラボンは、近年注目されている栄養素であり、脂質代謝改善効果（Anthony et al. "Journal of Nutrition ", 126 , 43-50 (1996) ）や、骨代謝改善効果（Ishida et al." Biological & Pharmaceutical Bulletin ", 21 , 62-66 (1998)）、ガン予防効果（培養ガン細胞の増殖阻害；Okura et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 157, 183(1988)、実験的発ガンの抑制；Sharm et al. J.Steroid Biochem. Mol. Biol., 43, 557(1992)、発ガン遺伝子発現の抑制；Zwiller et al. Oncogene, 6, 219(1991)、太田俊久ら、１９９９年度日本癌学会講演要旨発表演題１３９０）等を有することが報告されている。
【０００３】
ところで、大豆中のイソフラボンは大部分がグルコースやアセチルグルコース、マロニルグルコース等が結合した配糖体として存在しており、食物として摂取されると、腸内菌の働きにより配糖体がアグリコンに分解されたのち吸収される。ところが、腸内細菌の構成は個体差が大きいため、イソフラボン配糖体の吸収は個体差や不利益が生じてしまうものと考えられている。事実等モルのイソフラボン配糖体とアグリコンを投与すると、アグリコン投与群の血中イソフラボン濃度が有意に高くなることがラットの実験で報告されている（King et al. Journal of Nutrition 126, 176-182(1996)）。
【０００４】
そこで、予め大豆中のイソフラボンをアグリコンに分解し、生体への吸収を促進させる試みがいくつかなされている。このような、イソフラボン配糖体をアグリコンに分解する手法としては、酵素処理による方法や、酸、加熱処理などがすでに知られている。例えば、ＷＯ９５／１０５１２号公報には、β−グルコシダーゼやエステラーゼを用いて配糖体を分解する方法が記載されている。
【０００５】
しかしながら、酵素処理による方法では、作業性の悪化や製造コストの上昇といった問題が生じてしまう。また、豆乳に酸、加熱処理などを施した場合、副次反応により風味の劣化や物性の変化を招くという問題がある。
【０００６】
一方、豆乳を乳酸菌発酵することにより得られる発酵豆乳は、風味や物性に優れた好ましい大豆食品である。そして上記のように、発酵豆乳の中には、豆乳中のイソフラボン配糖体がアグリコンに分解されるものもあり、本出願人もイソフラボン遊離能を有する乳酸菌、ビフィドバクテリウム属細菌等を用いることで、アグリコンの豊富な発酵豆乳が得られることを既に報告している（特開平９−２３８６４７号公報）。
【０００７】
しかし、このような発酵法では、ある程度までアグリコンが生成した後にはそれ以上の分解は進まない。このため、よりアグリコン量の多い、発酵豆乳の製造方法を確立することが望まれている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
このような現状において、本発明者らが発酵豆乳中のイソフラボンアグリコン量を増加させることを目的として更に検討を行ったところ、従来イソフラボン遊離能が高いと思われていた微生物は、各種イソフラボン配糖体のうちグルコース配糖体を分解する能力（β−グルコシダーゼ活性）は高いものの、マロニル配糖体を分解する能力が低いことを知った。
【０００９】
そして、マロニル配糖体は、豆乳中に多量に含まれており、また、マロニル基が結合していると、前記イソフラボン遊離能の高い微生物でも配糖体を分解できないため、アグリコンの生成が一定で停止する原因となっていることを見出した。
【００１０】
従って、本発明は、イソフラボンのマロニル配糖体を分解し、イソフラボンアグリコンを多量に生成させることができ、且つ風味や物性、作業性等に優れた発酵豆乳を提供することを目的とするものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく種々の微生物を鋭意検索していたところ、豆乳を発酵させると同時にイソフラボンのマロニル配糖体を分解する能力を有する微生物が存在することおよびこの微生物を用いればイソフラボンアグリコンの生成量が増加した発酵豆乳が得られることを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち本発明は、豆乳を微生物により発酵して得られる発酵豆乳であって、当該発酵豆乳中の総イソフラボン誘導体の５０重量％以上をイソフラボンアグリコンとして含有する発酵豆乳を提供するものである。
【００１３】
また本発明は、マロニル配糖体分解能を有する微生物を豆乳に接種し培養する発酵豆乳の製造方法を提供するものである。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明において発酵豆乳とは、豆乳に乳酸菌やビフィドバクテリウム属細菌等の微生物を接種し、発酵を行ったものをいう。原料として用いる豆乳は常法により得られるものでよく、例えば、丸大豆や脱脂大豆を、水浸漬するか又は水浸漬しないで含水状態にて摩砕して粉となし、これを濾過して不溶性画分を除去したものが挙げられる。
【００１５】
本発明の発酵豆乳は、発酵豆乳中の総イソフラボン誘導体の５０重量％（以下、単に「％」で示す）以上がアグリコンとして存在するものであり、例えば、豆乳発酵をイソフラボン配糖体のうち、グルコース配糖体及びマロニル配糖体を分解する能力を有する微生物を用いて行うことにより製造される。
【００１６】
この発酵においては、グルコース配糖体及びマロニル配糖体の分解能力を共に有する微生物を用いても良く、また、グルコース配糖体の分解能力を有する微生物と、マロニル配糖体の分解能力を有する微生物を組み合わせて用いても良い。
【００１７】
このうち、グルコース配糖体分解能を有する微生物とは、β−グルコシダーゼ活性等を有し、イソフラボン配糖体のうちグルコース配糖体を分解する能力を有する微生物をいう。ある微生物が、グルコース配糖体分解能を有するか否かは、例えば、高圧加熱殺菌（１２１℃、１５分間）した豆乳に微生物を接種して発酵させた発酵豆乳中の総イソフラボン量およびイソフラボンアグリコン量を、菊池−早川らの方法（参考例１に記載）に従い液体クロマトグラフィーのピーク面積から定量し、得られた値から下式により配糖体の分解率を算出して調べることができる。
【００１８】
【式１】
【００１９】
特に発酵豆乳において充分な量のイソフラボンアグリコンを得るためには、上記方法で５％以上の活性を有するものを使用することが好ましく、特に１０％以上、更に４０％以上の活性を有するものであることが好ましい。
【００２０】
また、本発明のマロニル配糖体分解能を有する微生物とは、イソフラボン配糖体のうちマロニル配糖体を分解する能力を有する微生物をいい、このような能力を有する微生物は、例えば、超高温（ＵＨＴ）殺菌（１３５℃、３.５秒間）した豆乳に微生物を接種して発酵させ、発酵前後における豆乳、発酵豆乳中の各種イソフラボン量を、松本らの方法（参考例２に記載）に従い液体クロマトグラフィーのピーク面積から定量し、マロニル配糖体量の分解率を下式に従い算出して選抜することができる。
【００２１】
【式２】
【００２２】
特に、発酵豆乳において充分な量のイソフラボンアグリコンを得るためには、上記方法でマロニル配糖体の分解率が５％以上の活性を有するものを使用することが好ましい。
【００２３】
本発明の発酵豆乳の製造において、グルコース配糖体分解能を有する微生物（以下、「グルコース分解微生物」という）として使用される微生物は、食品に添加することができるβ−グルコシダーゼ生産菌であれば特に制限されず、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidphilus）、ラクトバチルス・ガセリ（L.gasseri）、ラクトバチルス・マリ（L.mali）、ラクトバチルス・プランタラム（L.plantarum）、ラクトバチルス・ブヒネリ（L.buchneri）、ラクトバチルス・カゼイ（L.casei）、ラクトバチルス・ジョンソニー（L.johnsonii）、ラクトバチルス・ガリナラム（L.gallinarum）、ラクトバチルス・アミロボラス（L.amylovorus）、ラクトバチルス・ブレビス（L.brevis）、ラクトバチルス・ラムノーザス（L.rhamnosus）、ラクトバチルス・ケフィア（L.kefir）、ラクトバチルス・パラカゼイ（L.paracasei）、ラクトバチルス・クリスパタス（L.crispatus）等のラクトバチルス属細菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptcoccus thermophilus）等のストレプトコッカス属細菌、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）等のラクトコッカス属細菌、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（B.longum）、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（B.adolescentis）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（B.infantis）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.breve）、 ビフィドバクテリウム・カテヌラータム（B.catenulatum）等のビフィドバクテリウム属細菌、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属細菌、サッカロマイセス・セルビシエ（Saccharomyses cerevisiae）、トルラスポラ・デルブルエッキー（Torulaspora delbrueckii）、キャンジダ・ケフィア等のサッカロマイセス属、トルラスポラ属、キャンジダ属等に属する酵母等のうち、前記方法でグルコース配糖体分解能を有すると判断された微生物が、好ましいものとして挙げられる。
【００２４】
中でも、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属、ラクトコッカス属に属する乳酸菌や、ビフィドバクテリウム属細菌がイソフラボンアグリコンの生成量や発酵豆乳の風味等の点から好ましく、特にラクトバチルス・ガセリ ＤＳＭ２０２４３株、ラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ１４９４７株およびＡＴＣＣ１０２４１株、ラクトバチルス・ブヒネリＡＴＣＣ４００５株、ラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ９０２９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１３６６）及びＡＴＣＣ３９３株、ラクトバチルス・マリ ＡＴＣＣ２７３０４（ＹＩＴ０２４３株）、ラクトバチルス・ガリナラムＪＣＭ２０１１株、ラクトバチルス・アミロボラスＪＣＭ１１２６株、ラクトバチルス・ブレビスＡＴＣＣ１４８６９株、ラクトバチルス・ラムノーザスＡＴＣＣ７４６９株及びＡＴＣＣ５３１０３株（ＹＩＴ０２３２株）、ラクトバチルス・ケフィア ＮＲＩＣ１６９３株、ラクトバチルス・パラカゼイ ＮＣＤＯ１５１株、ラクトコッカス・ラクチス ＹＩＴ２０２７（ＦＥＲＭ Ｐ−１６０７４）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＹＩＴ４０６０株（ＦＥＲＭ Ｐ−１５４８９）、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス ＡＴＣＣ１５７０３株、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ４０６５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１５４８８）は、β−グルコシダーゼ活性が特に高いため好ましい。
【００２５】
一方、マロニル配糖体分解能を有する微生物（以下、「マロニル分解微生物」という）として使用される微生物は、食品に添加することができ、前記方法でイソフラボンのマロニル配糖体を分解する能力を有すると判断されたものであれば特に制約はないが、ラクトバチルス・マリ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・ラムノーザス等のラクトバチルス属細菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス等のストレプトコッカス属細菌、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・カテヌラータム（B.caterulatum）等のビフィドバクテリウム属細菌を用いることが発酵豆乳の風味やアグリコンの生成量の点から好ましい。
【００２６】
特に、ラクトバチルス・マリ、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・ラムノーザスが好ましく、更にラクトバチルス・マリ ＹＩＴ０２４３株（ＡＴＣＣ２７３０４）、ラクトバチルス・ガセリ ＹＩＴ０１６８株（ＦＥＲＭ Ｐ−６２６２）、ラクトバチルス・ラムノーザス ＡＴＣＣ５３１０３株を使用することが好ましい。
【００２７】
なお、グルコース配糖体分解能とマロニル配糖体分解能を共に有する微生物として、例えばラクトバチルス・マリ ＹＩＴ０２４３株等が挙げられる。このような微生物を用いれば、１種の微生物で本発明の発酵豆乳を得ることができるが、一般には、グルコース分解微生物とマロニル分解微生物の２種以上を組み合わせて使用する方が培養時間を短縮できるため好ましい。
【００２８】
本発明の発酵豆乳の製造は、グルコース配糖体分解能とマロニル配糖体分解能を有する微生物を用いる以外は常法により行えばよい。例えば、まず豆乳を殺菌処理した後、グルコース分解微生物とマロニル分解微生物とを接種して培養を行い、これを均質化処理することにより発酵豆乳を得ることができる。豆乳を発酵するにあたり、グルコース分解微生物とマロニル分解微生物の双方を接種して培養（発酵）する際には、接種したそれぞれの微生物に共通に適した培養条件を選択すればよい。例えば、嫌気性菌であれば、培養基中の酸素を炭酸ガスや窒素ガスなどの不活性ガスで置換するか、または酸素反応剤などで除酸素して嫌気的条件化にて培養を行うこともできる。また、好気性菌であれば、酸素存在下の好気条件を選択すればよい。更に、上記の両種の微生物を同時に接種して培養してもよいが、まずグルコース分解微生物を接種して培養し、次いでマロニル分解微生物を接種して培養してもよい。
【００２９】
なお、本発明のグルコース分解微生物及びマロニル分解微生物を用いて大豆タンパク質を発酵すれば、豆乳と同様イソフラボンアグリコン量の多い発酵大豆タンパク質食品を製造することができる。発酵に用いる大豆タンパク質としては、例えば、大豆タンパク質粉末に適当量の水を加え、大豆タンパク質の溶液状、ペースト状あるいはエマルジョンとしたもの、または豆乳に酸、苦塩等の塩類を加えて沈殿させたタンパク質を中和、乾燥して得た分離大豆タンパク質に水や油脂を加えることにより作製した溶液、ペースト、エマルジョンおよびこれらを含む食品素材等を使用することができる。
【００３０】
このように大豆タンパク質を発酵させる場合も、用いる微生物は発酵豆乳の製造に用いるものと同様のものを使用すればよい。また、発酵大豆タンパク質の製造も、グルコース分解微生物とマロニル分解微生物を用いる以外は常法に従えばよい。例えば、発酵大豆タンパク質を殺菌処理した後、グルコース分解微生物とマロニル分解微生物を接種、培養すれば、発酵大豆タンパク質を得ることができるのである。
【００３１】
一方、豆乳を発酵する際の条件は、用いる微生物の種類に合わせ適宜設定すればよく、例えば乳酸菌やビフィドバクテリウム属細菌を用いる場合には、２５℃〜３７℃で、２４〜４８時間程度培養すればよく、豆乳濃度としては固形分換算で１〜２０％がイソフラボンアグリコンの生成量の点から好ましい。
【００３２】
この培養、発酵にあたり、原料である豆乳中に各種糖質等、例えば、グルコース、シュークロース、果糖ぶどう糖液糖、ぶどう糖果糖液糖等の糖質を０.５重量％〜５.０重量％程度添加してもよい。
【００３３】
かくして得られる発酵豆乳は、グルコース配糖体分解能とマロニル配糖体分解能を有する微生物を用いて得られたものであり、含有されるイソフラボン配糖体のうち、グルコース配糖体はグルコース分解微生物により、また、マロニル配糖体は、マロニル分解微生物、次いでグルコース分解微生物により分解されるため、その発酵豆乳中の総イソフラボン誘導体の５０％以上がアグリコンとして存在するものである。従ってこの発酵豆乳は、イソフラボン吸収効率の高い優れたものである。特に、イソフラボンの７０％以上がアグリコンとして存在するものは、イソフラボンの吸収向上に伴う各種生理作用が期待でき、好ましい。
【００３４】
上記のようにして得られた発酵豆乳は、そのままでも製品とすることもできるが、一般には、風味を上げたり、必要な形状とする等のために種々の成分を添加、配合し、更にフレーバーを添加して最終製品とすることができる。
【００３５】
本発明の発酵豆乳に添加、混合される成分としては、各種糖質や乳化剤、増粘剤、甘味料、酸味料、果汁等が挙げられる。より具体的には、グルコース、シュークロース、フラクトース、蜂蜜等の糖類、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、パラチニット等の糖アルコール、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン糖脂肪酸エステル、レシチン等の乳化剤、寒天、ゼラチン、カラギーナン、グァーガム、キサンタンガム、ペクチン、ローカストビーンガム等の増粘（安定）剤、が挙げられる。この他にも、ビタミンＡ、ビタミンＢ類、ビタミンＣ、ビタミンＥ等の各種ビタミン類やハーブエキス、穀物成分、野菜成分、乳成分等を配合しても、優れた風味の発酵豆乳を得ることができる。
【００３６】
また、本発明の発酵豆乳に添加することのできるフレーバーとしては、ヨーグルト系、ベリー系、オレンジ系、花梨系、シソ系、シトラス系、アップル系、ミント系、グレープ系、ペア、カスタードクリーム、ピーチ、メロン、バナナ、トロピカル、ハーブ系、紅茶、コーヒー系等のフレーバーが挙げられ、これらを１種または２種以上組み合わせて用いることができる。特に、ヨーグルト系、ストロベリー系、オレンジ系、花梨系のフレーバーは、上記甘蔗抽出物を含有する発酵豆乳との相性がよいため、これらを用いることが好ましい。フレーバーの添加量は特に限定されないが、風味面から０.０５〜０.５質量％、特に０.１〜０.３質量％程度が好ましい。
【００３７】
なお、大豆タンパク質を発酵して、発酵大豆タンパク質を製造する場合にも、上記の培養条件、添加物等は同様に用いることができるが、豆乳を基質とする場合の方が、大豆タンパク質を基質とするよりもイソフラボン分解率が高くなる傾向があり、発酵後の風味も豆乳の方がより好ましいため、本発明の微生物を用いた発酵は、豆乳に適用することの方がより適している。
【００３８】
以上説明した本発明の発酵豆乳は、プレーンタイプ、フルーツフレーバータイプ、固形状、液状等いずれの形態の製品とすることも可能である。また、発酵終了後、シロップ液との混合前等の段階で発酵豆乳に殺菌処理を施し、死菌含有タイプの製品としてもよい。
【００３９】
更に食品としては、各種の紙容器、合成樹脂容器や酸素透過性の低いバリヤー容器等の容器に充填して製品化することが可能である。なお、この充填は、気相を炭酸ガスや窒素ガスなどの不活性ガスで置換したうえで行っても良い。
【００４０】
【実施例】
次に実施例および参考例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例等に何ら制約されるものではない。なお、以下の実施例において、イソフラボン量の測定は、以下の方法で行った。
【００４１】
（イソフラボンの測定法）
菊地−早川らの方法（" Bioscience Biotechnology Biochemistry ", 62, 1688-1692 (1998)）に従い、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって定量した。
【００４２】
まず、サンプル約１ｇを秤量し、これに４ｍｌのメタノールを加え、抽出する。この抽出液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）し、得られた上清１ｍｌに４Ｎ−塩酸１ｍｌを混合して塩酸混液を得る。得られた塩酸混液０.１ｍｌに内部標準液＊０.１ｍｌを加え、混合した後、ＨＰＬＣ＊＊でアグリコン量を測定する。
【００４３】
一方、上記塩酸混液の残部を１００℃で３０分間加熱し、冷却後、反応液０.１ｍｌに内部標準液０.１ｍｌを加え、混合した後、ＨＰＬＣ＊＊で分析し、総イソフラボン量を測定する。
【００４４】
上記方法で測定した総イソフラボン量からアグリコン量を差し引いた値を配糖体量とした。
* 内部標準液 ： ４μｇ／ｍｌフラボンＤＭＳＯ溶液
** ＨＰＬＣ条件は以下の通りである。
検 出 器 ： 紫外吸光光度計（測定波長２６０ｎｍ）
カ ラ ム ： ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｃ４（４.６×１５０ｍｍ、ＹＭＣ）
カラム温度 ： ５０℃
移 動 相 ： １０％酢酸／メタノ−ル（７３：２７）混液
流 量 ： ２ｍｌ／ｍｉｎ
【００４５】
参 考 例 １
豆乳を超高温（ＵＨＴ）殺菌（１３５℃、３.５秒）し、その各々にフィルター滅菌した５０％グルコース水溶液２０ｍｌを加え、培地とした（グルコース終濃度１％）。各培地にβ−グルコシダーゼ活性の高い菌株であるラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）ＹＩＴ ９０２９もしくはビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）ＹＩＴ ４０６５シードを１％接種し、３７℃で培養し、上記イソフラボンの測定により総イソフラボン量およびイソフラボンアグリコン量を測定することにより経時的に配糖体の分解率を調べた。なお、採取した各発酵豆乳は分析まで氷中で保存した。この結果を図１に示す。
【００４６】
この結果、Ｌ.カゼイ ＹＩＴ ９０２９やＢ.ブレーベ ＹＩＴ ４０６５のようなβ−グルコシダーゼ活性の高い菌株により、豆乳を発酵させることで、イソフラボン配糖体のアグリコンへの分解がおこった。しかし、５０％未満で分解が止まってしまい、それ以上は分解が進まなかった。
【００４７】
実 施 例 １
素豆乳に１％濃度でグルコースを加え、超高温（ＵＨＴ）殺菌（１３５℃、３.５秒）した。ここに、豆乳であらかじめ数代継代した表１に示す乳酸菌の種菌を１％接種し、３０℃にて２４〜４８時間培養した。培養後のイソフラボンの配糖体分解率を測定したところ表１のようになった。
【００４８】
【表１】
【００４９】
上記の結果から明らかなように、Ｌ.マリ ＹＩＴ ０２４３株が突出して分解活性が高いことが明かとなり、単菌でもイソフラボンアグリコンを豊富に含む発酵豆乳を製造することが可能であった。また、他の菌株に関しては、培養時間を延長しても配糖体分解率が上記以上の値になることはなかった。
【００５０】
実 施 例 ２
素豆乳に１％濃度でグルコースを添加し、ＵＨＴ殺菌（１３５℃、３.５秒）した。ここに、Ｌ.カゼイＹＩＴ ９０２９株を０.０１％接種し、単独で３７℃にて２３時間培養したもの、およびＬ.カゼイ０.０１％に加えて表２に示す他の乳酸菌を１％同時に接種し、３７℃にて２３時間混合培養したものを調製した。培養後のイソフラボンの配糖体分解率を測定したところ表２のようになった。
【００５１】
【表２】
【００５２】
この結果から明らかなように、Ｌ.マリ、Ｌ.ガセリまたはＬ.ラムノーサスとＬ.カゼイの混合培養により、発酵豆乳中の配糖体は２３時間で５０％以上の分解がみられた。Ｌ.マリとＬ.カゼイの混合培養では、８０％以上の分解が見られ、Ｌ.マリの単独培養（表１）の培養時間４８時間よりも短時間で分解が可能になることが明らかになった。また、程度はやや弱いながらもＬ.アシドフィルスとの組み合わせも有効であった。
【００５３】
参 考 例 ２
β―グルコシダーゼ活性をもつ菌であるラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９株による発酵豆乳を作製し、含まれるイソフラボンを種類別に分析した。
【００５４】
（ 実験方法 ）
発酵豆乳調製：
豆乳をＵＨＴ殺菌（１３５℃、３.５秒）し、これにフィルター滅菌した５０％グルコース水溶液２０ｍｌを加え、培地とした（グルコース終濃度１％）。この培地にラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９株シードを１％接種し、３７℃で４８時間培養した。対照としては、ＵＨＴ滅菌した豆乳を用いた。
【００５５】
分析サンプル調製：
豆乳約１ｇをファルコンチューブに秤量し、４ｍｌのメタノールを添加、攪拌後、遠心分離（3000rpm、10分間）した。上清１００μｌとＤＭＳＯ １００μｌを混合し、ＨＰＬＣ分析用サンプルとした。
【００５６】
ＨＰＬＣ分析：
松本らの方法（" Chromatography ", 21, 37-42 (2000)）を用いた。分析の条件は以下のとおりである。
検 出 器 ： 紫外吸光光度計（測定波長：２６０ｎｍ）
カ ラ ム ： ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＣＮ（４.６−７５ｍｍ, Ｙ.Ｍ.Ｃ.）
カラム温度 ： ４０℃付近の一定温度
移 動 相 ： ０.１％ ぎ酸溶液／アセトニトリル／メタノール（８７:３:１０）混液
流 量 ： ゲニステインの保持時間が１４分となるように調整する（約２.０ｍｌ／ｍｉｎ）
【００５７】
図２中、ＡはＬ.カゼイ ＹＩＴ９０２９株を用いた発酵豆乳の、ＢはＵＨＴ滅菌豆乳のイソフラボンＨＰＬＣチャートである。また図中、１は、グルコース配糖体であるダイジンの、２はゲニスチンのピークであり、３はマロニル配糖体であるマロニルダイジンの、５はマロニルゲニスチンのピークであり、４はアグリコンであるダイゼインの、６はゲニステインのピークである。
【００５８】
図２では、マロニル配糖体（ピーク３、５）のみが残存していることが明らかであり、Ｌ.カゼイ ＹＩＴ ２０２９株のみを用いた場合の配糖体の分解率の低さはマロニル配糖体がほとんど分解されないことが原因であることがわかった。
【００５９】
実 施 例 ３
発酵豆乳におけるイソフラボン配糖体の分解様式を解析するために、実施例２においてＬ.カゼイ ＹＩＴ９０２９株単独よりも配糖体分解率が高くなった併用乳酸菌について、参考例２の方法を用い、マロニル配糖体の分解性を検討した。
【００６０】
（ 実験方法 ）
発酵豆乳調製：
豆乳をＵＨＴ殺菌（１３５℃、３.５秒）し、各々にフィルター滅菌した５０％グルコース水溶液２０ｍｌを加え、培地とした（グルコース終濃度１％）。この培地にラクトバチルス・マリ ＹＩＴ ０２４３株、ラクトバチルス・ガッゼリ（Lactobacillus gasseri） ＹＩＴ ０１６８株、もしくは、ラクトバチルス・ラムノーザス（Lactobacillus rhamnosus） ＹＩＴ ０２３２株をシードとして１％接種し、３７℃で４８時間培養した。こうして得られた各種発酵豆乳から、参考例２と同様に分析サンプルの調製、ＨＰＬＣ分析を行い、イソフラボンマロニル配糖体の残存状況を調べた。対照としては、ＵＨＴ滅菌した豆乳を用いた。この結果を図３に示す。
【００６１】
図３中、ＥはＬ.マリＹＩＴ ０２４３株を用いた発酵豆乳の、ＤはＬ.ガゼリＹＩＴ ０１６８株を用いた発酵豆乳の、ＣはＬ.ラムノーザス ＹＩＴ ０２３２株を用いた発酵豆乳のイソフラボンＨＰＬＣチャートであり、ＢはＵＨＴ殺菌した豆乳のイソフラボンＨＰＬＣチャートである。また図中、１から６は、参考例２と同じ物質のピークを示す。
【００６２】
図３の結果、Ｌ.マリ ＹＩＴ ０２４３株、Ｌ.ガゼリ ＹＩＴ ０１６８株およびＬ.ラムノーザス ＹＩＴ ０２３２株の３菌株がマロニル基を分解する能力を有することが示された。このうち、Ｌ.ガゼリ ＹＩＴ ０１６８株およびＬ.ラムノーザス ＹＩＴ ０２３２株についてはマロニル配糖体のピークがグルコース配糖体のピークに移行しており、マロニル配糖体をグルコース配糖体に変換する活性を持つことが示唆された。Ｌ.マリ ＹＩＴ ０２４３株はそのような活性に加え、配糖体をアグリコンに分解する活性を併せ持っていることが推察された。
【００６３】
実 施 例 ４
素豆乳に１％濃度でグルコースを添加し、ＵＨＴ殺菌（１３５℃、３.５秒）した。ここに、Ｌ.カゼイ ＹＩＴ ９０２９株を１％接種したもの、Ｌ.マリ ＹＩＴ ０２４３株を１％接種したもの、両者を０.５％ずつあわせて接種したもの、以上３サンプルについて、３７℃にて４８時間培養をおこなった。各サンプルについて培養後のイソフラボンを抽出し、ＨＰＬＣにて配糖体の種類別に同定をおこなった。対照としては、ＵＨＴ滅菌した豆乳を用いた。この結果を図４に示す。
【００６４】
図４中、ＧはＬ.マリ ＹＩＴ ０２４３株を用いた発酵豆乳の、ＦはＬ.カゼイＹＩＴ ９０２９株を用いた発酵豆乳のイソフラボンＨＰＬＣチャートであり、Ｈは両者を用いた場合のイソフラボンＨＰＬＣチャートである。なお、ＢはＵＨＴ殺菌した豆乳のイソフラボンＨＰＬＣチャートであり、図中、１から６は、参考例２と同じ物質のピークを示す。
【００６５】
未接種の豆乳にみられるマロニル配糖体のイソフラボンを示すピーク（図中、Ｂ）は、Ｌ.カゼイ ＹＩＴ ９０２９株による発酵ではほとんど変化していない（図中、Ｆ）のに対して、Ｌ.マリ ＹＩＴ ０２４３株による発酵後には減少し（図中、Ｇ）、両者の混合培養では完全に消失していた（図中、Ｈ）。よって、これらの菌株によるイソフラボン配糖体の分解特性は、Ｌ.マリのマロニル配糖体の分解能とＬ.カゼイのβ−グルコシダーゼ活性によると判断される。
【００６６】
実 施 例 ５
マロニル配糖体の分解様式についてマロン酸の生成により確認した。
【００６７】
（ 実験方法 ）
実施例３と同様にして得られたＬ.マリ ＹＩＴ ０２４３株の発酵物およびＬ.カゼイ ＹＩＴ ９０２９株の発酵物を経時的に採取し、1/10量の１０％過塩素酸を加え、２時間、４℃で放置した。その後、１００００ｒｐｍで１０分間遠心処理を行ない、得られた上清を０.４５μのフィルターでろ過した。このサンプルに含まれる有機酸の分析用サンプルとした。この分析用サンプル中のマロン酸濃度を測定した結果を図５に示す。
【００６８】
（ ＨＰＬＣ分析 ）
ＨＰＬＣ分析は以下の条件で行った。
【００６９】
図５の結果から、Ｌ.マリ ＹＩＴ ０２４３株の発酵物はＬ.カゼイ ＹＩＴ ９０２９株の発酵物に比べ、経時的にマロン酸濃度が高くなることが明かとなった。そして、マロン酸はマロニル配糖体のマロニル基が分解されると生成すると考えられるので、Ｌ.マリ ＹＩＴ ０２４３株はマロニル配糖体のマロニル基部分を分解する活性を持つことが示された。従って、実施例３で見出された菌群は、マロニル配糖体のマロニル基を分解していると判断された。
【００７０】
実 施 例 ６
Ｌ.カゼイおよびＬ.マリで混合培養した場合の、醗酵大豆タンパクのイソフラボン配糖体の分解率を次のようにして調べた。まず、大豆タンパク質（フジプロ１２００；不二製油製）を０.１％酵母エキス（ディフコ製）および１％グルコースを含む蒸留水に溶かして、６〜１２％の溶液を作り、ガラスホモゲナイザーで均一化した。この溶液を８０℃で３０分間加熱殺菌後冷却し、醗酵用の大豆タンパク溶液とした。こうして調製した大豆タンパク質溶液に、Ｌ.カゼイ ＹＩＴ９０２９株を０.０１％、Ｌ.マリ ＹＩＴ ０２４３株を１％接種し、３７℃にて２０時間培養し、発酵大豆タンパク質を調製した。得られた発酵大豆タンパク質について、そのイソフラボンの配糖体分解率を、前記方法に準じて測定した結果を表３に示す。
【００７１】
【表３】
【００７２】
原料である大豆タンパク質は加熱処理等を経て得られたものであり、ダイゼインは２６％前後、ゲニステインは１８％前後分解されている。そして、これを表３の結果と比較すると、よりイソフラボンの分解が進んでいることがわかる。すなわち、Ｌ.カゼイおよびＬ.マリを用いて大豆タンパク溶液を醗酵することにより、イソフラボン配糖体分解率は５０％以上になり、特に１２％溶液では７０％を超えることが理解される。
【００７３】
【発明の効果】
本発明によれば、総イソフラボン誘導体の５０％以上がアグリコンとして存在する発酵豆乳が得られる。そして、アグリコンは配糖体と比べ生体への吸収が高いので、本発明の発酵豆乳は脂質代謝改善効果や、骨代謝改善効果、ガン予防効果等を有する飲食品として極めて有利なものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 β−グルコシダーゼ活性の高い微生物で豆乳を発酵させた場合の配糖体分解率の変化を示す図面。
【図２】 Ｌ.カゼイ ＹＩＴ ９０２９株を用いて豆乳を発酵させた場合の発酵前後におけるイソフラボンの種類の変化を調べた結果を示す図面。
【図３】 いくつかのラクトバチルス属微生物について、豆乳を発酵させた後の培養物に含まれるイソフラボンの種類を分析した結果を示す図面。
【図４】 Ｌ.マリ ＹＩＴ ０２４３株およびＬ.カゼイ ＹＩＴ ９０２９株について、それぞれ単独で豆乳を発酵させた場合並びにこれら両者を使用して豆乳を発酵させた場合について、培養後のイソフラボンの種類を分析した結果を示す図面。
【図５】 Ｌ.マリ ＹＩＴ ０２４３株およびＬ.カゼイ ＹＩＴ ９０２９株について発酵豆乳中のマロン酸濃度を示す図面
以 上
【発明の属する技術分野】
本発明は、イソフラボンアグリコン含量の高い発酵豆乳及びその製造方法を提供するものである。
【０００２】
【従来技術】
豆乳等の大豆製品に含まれてるイソフラボンは、近年注目されている栄養素であり、脂質代謝改善効果（Anthony et al. "Journal of Nutrition ", 126 , 43-50 (1996) ）や、骨代謝改善効果（Ishida et al." Biological & Pharmaceutical Bulletin ", 21 , 62-66 (1998)）、ガン予防効果（培養ガン細胞の増殖阻害；Okura et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 157, 183(1988)、実験的発ガンの抑制；Sharm et al. J.Steroid Biochem. Mol. Biol., 43, 557(1992)、発ガン遺伝子発現の抑制；Zwiller et al. Oncogene, 6, 219(1991)、太田俊久ら、１９９９年度日本癌学会講演要旨発表演題１３９０）等を有することが報告されている。
【０００３】
ところで、大豆中のイソフラボンは大部分がグルコースやアセチルグルコース、マロニルグルコース等が結合した配糖体として存在しており、食物として摂取されると、腸内菌の働きにより配糖体がアグリコンに分解されたのち吸収される。ところが、腸内細菌の構成は個体差が大きいため、イソフラボン配糖体の吸収は個体差や不利益が生じてしまうものと考えられている。事実等モルのイソフラボン配糖体とアグリコンを投与すると、アグリコン投与群の血中イソフラボン濃度が有意に高くなることがラットの実験で報告されている（King et al. Journal of Nutrition 126, 176-182(1996)）。
【０００４】
そこで、予め大豆中のイソフラボンをアグリコンに分解し、生体への吸収を促進させる試みがいくつかなされている。このような、イソフラボン配糖体をアグリコンに分解する手法としては、酵素処理による方法や、酸、加熱処理などがすでに知られている。例えば、ＷＯ９５／１０５１２号公報には、β−グルコシダーゼやエステラーゼを用いて配糖体を分解する方法が記載されている。
【０００５】
しかしながら、酵素処理による方法では、作業性の悪化や製造コストの上昇といった問題が生じてしまう。また、豆乳に酸、加熱処理などを施した場合、副次反応により風味の劣化や物性の変化を招くという問題がある。
【０００６】
一方、豆乳を乳酸菌発酵することにより得られる発酵豆乳は、風味や物性に優れた好ましい大豆食品である。そして上記のように、発酵豆乳の中には、豆乳中のイソフラボン配糖体がアグリコンに分解されるものもあり、本出願人もイソフラボン遊離能を有する乳酸菌、ビフィドバクテリウム属細菌等を用いることで、アグリコンの豊富な発酵豆乳が得られることを既に報告している（特開平９−２３８６４７号公報）。
【０００７】
しかし、このような発酵法では、ある程度までアグリコンが生成した後にはそれ以上の分解は進まない。このため、よりアグリコン量の多い、発酵豆乳の製造方法を確立することが望まれている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
このような現状において、本発明者らが発酵豆乳中のイソフラボンアグリコン量を増加させることを目的として更に検討を行ったところ、従来イソフラボン遊離能が高いと思われていた微生物は、各種イソフラボン配糖体のうちグルコース配糖体を分解する能力（β−グルコシダーゼ活性）は高いものの、マロニル配糖体を分解する能力が低いことを知った。
【０００９】
そして、マロニル配糖体は、豆乳中に多量に含まれており、また、マロニル基が結合していると、前記イソフラボン遊離能の高い微生物でも配糖体を分解できないため、アグリコンの生成が一定で停止する原因となっていることを見出した。
【００１０】
従って、本発明は、イソフラボンのマロニル配糖体を分解し、イソフラボンアグリコンを多量に生成させることができ、且つ風味や物性、作業性等に優れた発酵豆乳を提供することを目的とするものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく種々の微生物を鋭意検索していたところ、豆乳を発酵させると同時にイソフラボンのマロニル配糖体を分解する能力を有する微生物が存在することおよびこの微生物を用いればイソフラボンアグリコンの生成量が増加した発酵豆乳が得られることを見出し、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち本発明は、豆乳を微生物により発酵して得られる発酵豆乳であって、当該発酵豆乳中の総イソフラボン誘導体の５０重量％以上をイソフラボンアグリコンとして含有する発酵豆乳を提供するものである。
【００１３】
また本発明は、マロニル配糖体分解能を有する微生物を豆乳に接種し培養する発酵豆乳の製造方法を提供するものである。
【００１４】
【発明の実施の形態】
本発明において発酵豆乳とは、豆乳に乳酸菌やビフィドバクテリウム属細菌等の微生物を接種し、発酵を行ったものをいう。原料として用いる豆乳は常法により得られるものでよく、例えば、丸大豆や脱脂大豆を、水浸漬するか又は水浸漬しないで含水状態にて摩砕して粉となし、これを濾過して不溶性画分を除去したものが挙げられる。
【００１５】
本発明の発酵豆乳は、発酵豆乳中の総イソフラボン誘導体の５０重量％（以下、単に「％」で示す）以上がアグリコンとして存在するものであり、例えば、豆乳発酵をイソフラボン配糖体のうち、グルコース配糖体及びマロニル配糖体を分解する能力を有する微生物を用いて行うことにより製造される。
【００１６】
この発酵においては、グルコース配糖体及びマロニル配糖体の分解能力を共に有する微生物を用いても良く、また、グルコース配糖体の分解能力を有する微生物と、マロニル配糖体の分解能力を有する微生物を組み合わせて用いても良い。
【００１７】
このうち、グルコース配糖体分解能を有する微生物とは、β−グルコシダーゼ活性等を有し、イソフラボン配糖体のうちグルコース配糖体を分解する能力を有する微生物をいう。ある微生物が、グルコース配糖体分解能を有するか否かは、例えば、高圧加熱殺菌（１２１℃、１５分間）した豆乳に微生物を接種して発酵させた発酵豆乳中の総イソフラボン量およびイソフラボンアグリコン量を、菊池−早川らの方法（参考例１に記載）に従い液体クロマトグラフィーのピーク面積から定量し、得られた値から下式により配糖体の分解率を算出して調べることができる。
【００１８】
【式１】
特に発酵豆乳において充分な量のイソフラボンアグリコンを得るためには、上記方法で５％以上の活性を有するものを使用することが好ましく、特に１０％以上、更に４０％以上の活性を有するものであることが好ましい。
【００２０】
また、本発明のマロニル配糖体分解能を有する微生物とは、イソフラボン配糖体のうちマロニル配糖体を分解する能力を有する微生物をいい、このような能力を有する微生物は、例えば、超高温（ＵＨＴ）殺菌（１３５℃、３.５秒間）した豆乳に微生物を接種して発酵させ、発酵前後における豆乳、発酵豆乳中の各種イソフラボン量を、松本らの方法（参考例２に記載）に従い液体クロマトグラフィーのピーク面積から定量し、マロニル配糖体量の分解率を下式に従い算出して選抜することができる。
【００２１】
【式２】
特に、発酵豆乳において充分な量のイソフラボンアグリコンを得るためには、上記方法でマロニル配糖体の分解率が５％以上の活性を有するものを使用することが好ましい。
【００２３】
本発明の発酵豆乳の製造において、グルコース配糖体分解能を有する微生物（以下、「グルコース分解微生物」という）として使用される微生物は、食品に添加することができるβ−グルコシダーゼ生産菌であれば特に制限されず、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidphilus）、ラクトバチルス・ガセリ（L.gasseri）、ラクトバチルス・マリ（L.mali）、ラクトバチルス・プランタラム（L.plantarum）、ラクトバチルス・ブヒネリ（L.buchneri）、ラクトバチルス・カゼイ（L.casei）、ラクトバチルス・ジョンソニー（L.johnsonii）、ラクトバチルス・ガリナラム（L.gallinarum）、ラクトバチルス・アミロボラス（L.amylovorus）、ラクトバチルス・ブレビス（L.brevis）、ラクトバチルス・ラムノーザス（L.rhamnosus）、ラクトバチルス・ケフィア（L.kefir）、ラクトバチルス・パラカゼイ（L.paracasei）、ラクトバチルス・クリスパタス（L.crispatus）等のラクトバチルス属細菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptcoccus thermophilus）等のストレプトコッカス属細菌、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）等のラクトコッカス属細菌、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（B.longum）、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（B.adolescentis）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（B.infantis）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（B.breve）、 ビフィドバクテリウム・カテヌラータム（B.catenulatum）等のビフィドバクテリウム属細菌、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）等のバチルス属細菌、サッカロマイセス・セルビシエ（Saccharomyses cerevisiae）、トルラスポラ・デルブルエッキー（Torulaspora delbrueckii）、キャンジダ・ケフィア等のサッカロマイセス属、トルラスポラ属、キャンジダ属等に属する酵母等のうち、前記方法でグルコース配糖体分解能を有すると判断された微生物が、好ましいものとして挙げられる。
【００２４】
中でも、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属、ラクトコッカス属に属する乳酸菌や、ビフィドバクテリウム属細菌がイソフラボンアグリコンの生成量や発酵豆乳の風味等の点から好ましく、特にラクトバチルス・ガセリ ＤＳＭ２０２４３株、ラクトバチルス・プランタラムＡＴＣＣ１４９４７株およびＡＴＣＣ１０２４１株、ラクトバチルス・ブヒネリＡＴＣＣ４００５株、ラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ９０２９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１３６６）及びＡＴＣＣ３９３株、ラクトバチルス・マリ ＡＴＣＣ２７３０４（ＹＩＴ０２４３株）、ラクトバチルス・ガリナラムＪＣＭ２０１１株、ラクトバチルス・アミロボラスＪＣＭ１１２６株、ラクトバチルス・ブレビスＡＴＣＣ１４８６９株、ラクトバチルス・ラムノーザスＡＴＣＣ７４６９株及びＡＴＣＣ５３１０３株（ＹＩＴ０２３２株）、ラクトバチルス・ケフィア ＮＲＩＣ１６９３株、ラクトバチルス・パラカゼイ ＮＣＤＯ１５１株、ラクトコッカス・ラクチス ＹＩＴ２０２７（ＦＥＲＭ Ｐ−１６０７４）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＹＩＴ４０６０株（ＦＥＲＭ Ｐ−１５４８９）、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス ＡＴＣＣ１５７０３株、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ４０６５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１５４８８）は、β−グルコシダーゼ活性が特に高いため好ましい。
【００２５】
一方、マロニル配糖体分解能を有する微生物（以下、「マロニル分解微生物」という）として使用される微生物は、食品に添加することができ、前記方法でイソフラボンのマロニル配糖体を分解する能力を有すると判断されたものであれば特に制約はないが、ラクトバチルス・マリ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・ラムノーザス等のラクトバチルス属細菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス等のストレプトコッカス属細菌、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・カテヌラータム（B.caterulatum）等のビフィドバクテリウム属細菌を用いることが発酵豆乳の風味やアグリコンの生成量の点から好ましい。
【００２６】
特に、ラクトバチルス・マリ、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・ラムノーザスが好ましく、更にラクトバチルス・マリ ＹＩＴ０２４３株（ＡＴＣＣ２７３０４）、ラクトバチルス・ガセリ ＹＩＴ０１６８株（ＦＥＲＭ Ｐ−６２６２）、ラクトバチルス・ラムノーザス ＡＴＣＣ５３１０３株を使用することが好ましい。
【００２７】
なお、グルコース配糖体分解能とマロニル配糖体分解能を共に有する微生物として、例えばラクトバチルス・マリ ＹＩＴ０２４３株等が挙げられる。このような微生物を用いれば、１種の微生物で本発明の発酵豆乳を得ることができるが、一般には、グルコース分解微生物とマロニル分解微生物の２種以上を組み合わせて使用する方が培養時間を短縮できるため好ましい。
【００２８】
本発明の発酵豆乳の製造は、グルコース配糖体分解能とマロニル配糖体分解能を有する微生物を用いる以外は常法により行えばよい。例えば、まず豆乳を殺菌処理した後、グルコース分解微生物とマロニル分解微生物とを接種して培養を行い、これを均質化処理することにより発酵豆乳を得ることができる。豆乳を発酵するにあたり、グルコース分解微生物とマロニル分解微生物の双方を接種して培養（発酵）する際には、接種したそれぞれの微生物に共通に適した培養条件を選択すればよい。例えば、嫌気性菌であれば、培養基中の酸素を炭酸ガスや窒素ガスなどの不活性ガスで置換するか、または酸素反応剤などで除酸素して嫌気的条件化にて培養を行うこともできる。また、好気性菌であれば、酸素存在下の好気条件を選択すればよい。更に、上記の両種の微生物を同時に接種して培養してもよいが、まずグルコース分解微生物を接種して培養し、次いでマロニル分解微生物を接種して培養してもよい。
【００２９】
なお、本発明のグルコース分解微生物及びマロニル分解微生物を用いて大豆タンパク質を発酵すれば、豆乳と同様イソフラボンアグリコン量の多い発酵大豆タンパク質食品を製造することができる。発酵に用いる大豆タンパク質としては、例えば、大豆タンパク質粉末に適当量の水を加え、大豆タンパク質の溶液状、ペースト状あるいはエマルジョンとしたもの、または豆乳に酸、苦塩等の塩類を加えて沈殿させたタンパク質を中和、乾燥して得た分離大豆タンパク質に水や油脂を加えることにより作製した溶液、ペースト、エマルジョンおよびこれらを含む食品素材等を使用することができる。
【００３０】
このように大豆タンパク質を発酵させる場合も、用いる微生物は発酵豆乳の製造に用いるものと同様のものを使用すればよい。また、発酵大豆タンパク質の製造も、グルコース分解微生物とマロニル分解微生物を用いる以外は常法に従えばよい。例えば、発酵大豆タンパク質を殺菌処理した後、グルコース分解微生物とマロニル分解微生物を接種、培養すれば、発酵大豆タンパク質を得ることができるのである。
【００３１】
一方、豆乳を発酵する際の条件は、用いる微生物の種類に合わせ適宜設定すればよく、例えば乳酸菌やビフィドバクテリウム属細菌を用いる場合には、２５℃〜３７℃で、２４〜４８時間程度培養すればよく、豆乳濃度としては固形分換算で１〜２０％がイソフラボンアグリコンの生成量の点から好ましい。
【００３２】
この培養、発酵にあたり、原料である豆乳中に各種糖質等、例えば、グルコース、シュークロース、果糖ぶどう糖液糖、ぶどう糖果糖液糖等の糖質を０.５重量％〜５.０重量％程度添加してもよい。
【００３３】
かくして得られる発酵豆乳は、グルコース配糖体分解能とマロニル配糖体分解能を有する微生物を用いて得られたものであり、含有されるイソフラボン配糖体のうち、グルコース配糖体はグルコース分解微生物により、また、マロニル配糖体は、マロニル分解微生物、次いでグルコース分解微生物により分解されるため、その発酵豆乳中の総イソフラボン誘導体の５０％以上がアグリコンとして存在するものである。従ってこの発酵豆乳は、イソフラボン吸収効率の高い優れたものである。特に、イソフラボンの７０％以上がアグリコンとして存在するものは、イソフラボンの吸収向上に伴う各種生理作用が期待でき、好ましい。
【００３４】
上記のようにして得られた発酵豆乳は、そのままでも製品とすることもできるが、一般には、風味を上げたり、必要な形状とする等のために種々の成分を添加、配合し、更にフレーバーを添加して最終製品とすることができる。
【００３５】
本発明の発酵豆乳に添加、混合される成分としては、各種糖質や乳化剤、増粘剤、甘味料、酸味料、果汁等が挙げられる。より具体的には、グルコース、シュークロース、フラクトース、蜂蜜等の糖類、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、パラチニット等の糖アルコール、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン糖脂肪酸エステル、レシチン等の乳化剤、寒天、ゼラチン、カラギーナン、グァーガム、キサンタンガム、ペクチン、ローカストビーンガム等の増粘（安定）剤、が挙げられる。この他にも、ビタミンＡ、ビタミンＢ類、ビタミンＣ、ビタミンＥ等の各種ビタミン類やハーブエキス、穀物成分、野菜成分、乳成分等を配合しても、優れた風味の発酵豆乳を得ることができる。
【００３６】
また、本発明の発酵豆乳に添加することのできるフレーバーとしては、ヨーグルト系、ベリー系、オレンジ系、花梨系、シソ系、シトラス系、アップル系、ミント系、グレープ系、ペア、カスタードクリーム、ピーチ、メロン、バナナ、トロピカル、ハーブ系、紅茶、コーヒー系等のフレーバーが挙げられ、これらを１種または２種以上組み合わせて用いることができる。特に、ヨーグルト系、ストロベリー系、オレンジ系、花梨系のフレーバーは、上記甘蔗抽出物を含有する発酵豆乳との相性がよいため、これらを用いることが好ましい。フレーバーの添加量は特に限定されないが、風味面から０.０５〜０.５質量％、特に０.１〜０.３質量％程度が好ましい。
【００３７】
なお、大豆タンパク質を発酵して、発酵大豆タンパク質を製造する場合にも、上記の培養条件、添加物等は同様に用いることができるが、豆乳を基質とする場合の方が、大豆タンパク質を基質とするよりもイソフラボン分解率が高くなる傾向があり、発酵後の風味も豆乳の方がより好ましいため、本発明の微生物を用いた発酵は、豆乳に適用することの方がより適している。
【００３８】
以上説明した本発明の発酵豆乳は、プレーンタイプ、フルーツフレーバータイプ、固形状、液状等いずれの形態の製品とすることも可能である。また、発酵終了後、シロップ液との混合前等の段階で発酵豆乳に殺菌処理を施し、死菌含有タイプの製品としてもよい。
【００３９】
更に食品としては、各種の紙容器、合成樹脂容器や酸素透過性の低いバリヤー容器等の容器に充填して製品化することが可能である。なお、この充填は、気相を炭酸ガスや窒素ガスなどの不活性ガスで置換したうえで行っても良い。
【００４０】
【実施例】
次に実施例および参考例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例等に何ら制約されるものではない。なお、以下の実施例において、イソフラボン量の測定は、以下の方法で行った。
【００４１】
（イソフラボンの測定法）
菊地−早川らの方法（" Bioscience Biotechnology Biochemistry ", 62, 1688-1692 (1998)）に従い、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって定量した。
【００４２】
まず、サンプル約１ｇを秤量し、これに４ｍｌのメタノールを加え、抽出する。この抽出液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分間）し、得られた上清１ｍｌに４Ｎ−塩酸１ｍｌを混合して塩酸混液を得る。得られた塩酸混液０.１ｍｌに内部標準液＊０.１ｍｌを加え、混合した後、ＨＰＬＣ＊＊でアグリコン量を測定する。
【００４３】
一方、上記塩酸混液の残部を１００℃で３０分間加熱し、冷却後、反応液０.１ｍｌに内部標準液０.１ｍｌを加え、混合した後、ＨＰＬＣ＊＊で分析し、総イソフラボン量を測定する。
【００４４】
上記方法で測定した総イソフラボン量からアグリコン量を差し引いた値を配糖体量とした。
* 内部標準液 ： ４μｇ／ｍｌフラボンＤＭＳＯ溶液
** ＨＰＬＣ条件は以下の通りである。
検 出 器 ： 紫外吸光光度計（測定波長２６０ｎｍ）
カ ラ ム ： ＹＭＣ−Ｐａｃｋ Ｃ４（４.６×１５０ｍｍ、ＹＭＣ）
カラム温度 ： ５０℃
移 動 相 ： １０％酢酸／メタノ−ル（７３：２７）混液
流 量 ： ２ｍｌ／ｍｉｎ
【００４５】
参 考 例 １
豆乳を超高温（ＵＨＴ）殺菌（１３５℃、３.５秒）し、その各々にフィルター滅菌した５０％グルコース水溶液２０ｍｌを加え、培地とした（グルコース終濃度１％）。各培地にβ−グルコシダーゼ活性の高い菌株であるラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）ＹＩＴ ９０２９もしくはビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）ＹＩＴ ４０６５シードを１％接種し、３７℃で培養し、上記イソフラボンの測定により総イソフラボン量およびイソフラボンアグリコン量を測定することにより経時的に配糖体の分解率を調べた。なお、採取した各発酵豆乳は分析まで氷中で保存した。この結果を図１に示す。
【００４６】
この結果、Ｌ.カゼイ ＹＩＴ ９０２９やＢ.ブレーベ ＹＩＴ ４０６５のようなβ−グルコシダーゼ活性の高い菌株により、豆乳を発酵させることで、イソフラボン配糖体のアグリコンへの分解がおこった。しかし、５０％未満で分解が止まってしまい、それ以上は分解が進まなかった。
【００４７】
実 施 例 １
素豆乳に１％濃度でグルコースを加え、超高温（ＵＨＴ）殺菌（１３５℃、３.５秒）した。ここに、豆乳であらかじめ数代継代した表１に示す乳酸菌の種菌を１％接種し、３０℃にて２４〜４８時間培養した。培養後のイソフラボンの配糖体分解率を測定したところ表１のようになった。
【００４８】
【表１】
上記の結果から明らかなように、Ｌ.マリ ＹＩＴ ０２４３株が突出して分解活性が高いことが明かとなり、単菌でもイソフラボンアグリコンを豊富に含む発酵豆乳を製造することが可能であった。また、他の菌株に関しては、培養時間を延長しても配糖体分解率が上記以上の値になることはなかった。
【００５０】
実 施 例 ２
素豆乳に１％濃度でグルコースを添加し、ＵＨＴ殺菌（１３５℃、３.５秒）した。ここに、Ｌ.カゼイＹＩＴ ９０２９株を０.０１％接種し、単独で３７℃にて２３時間培養したもの、およびＬ.カゼイ０.０１％に加えて表２に示す他の乳酸菌を１％同時に接種し、３７℃にて２３時間混合培養したものを調製した。培養後のイソフラボンの配糖体分解率を測定したところ表２のようになった。
【００５１】
【表２】
この結果から明らかなように、Ｌ.マリ、Ｌ.ガセリまたはＬ.ラムノーサスとＬ.カゼイの混合培養により、発酵豆乳中の配糖体は２３時間で５０％以上の分解がみられた。Ｌ.マリとＬ.カゼイの混合培養では、８０％以上の分解が見られ、Ｌ.マリの単独培養（表１）の培養時間４８時間よりも短時間で分解が可能になることが明らかになった。また、程度はやや弱いながらもＬ.アシドフィルスとの組み合わせも有効であった。
【００５３】
参 考 例 ２
β―グルコシダーゼ活性をもつ菌であるラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９株による発酵豆乳を作製し、含まれるイソフラボンを種類別に分析した。
【００５４】
（ 実験方法 ）
発酵豆乳調製：
豆乳をＵＨＴ殺菌（１３５℃、３.５秒）し、これにフィルター滅菌した５０％グルコース水溶液２０ｍｌを加え、培地とした（グルコース終濃度１％）。この培地にラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９株シードを１％接種し、３７℃で４８時間培養した。対照としては、ＵＨＴ滅菌した豆乳を用いた。
【００５５】
分析サンプル調製：
豆乳約１ｇをファルコンチューブに秤量し、４ｍｌのメタノールを添加、攪拌後、遠心分離（3000rpm、10分間）した。上清１００μｌとＤＭＳＯ １００μｌを混合し、ＨＰＬＣ分析用サンプルとした。
【００５６】
ＨＰＬＣ分析：
松本らの方法（" Chromatography ", 21, 37-42 (2000)）を用いた。分析の条件は以下のとおりである。
検 出 器 ： 紫外吸光光度計（測定波長：２６０ｎｍ）
カ ラ ム ： ＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＣＮ（４.６−７５ｍｍ, Ｙ.Ｍ.Ｃ.）
カラム温度 ： ４０℃付近の一定温度
移 動 相 ： ０.１％ ぎ酸溶液／アセトニトリル／メタノール（８７:３:１０）混液
流 量 ： ゲニステインの保持時間が１４分となるように調整する（約２.０ｍｌ／ｍｉｎ）
【００５７】
図２中、ＡはＬ.カゼイ ＹＩＴ９０２９株を用いた発酵豆乳の、ＢはＵＨＴ滅菌豆乳のイソフラボンＨＰＬＣチャートである。また図中、１は、グルコース配糖体であるダイジンの、２はゲニスチンのピークであり、３はマロニル配糖体であるマロニルダイジンの、５はマロニルゲニスチンのピークであり、４はアグリコンであるダイゼインの、６はゲニステインのピークである。
【００５８】
図２では、マロニル配糖体（ピーク３、５）のみが残存していることが明らかであり、Ｌ.カゼイ ＹＩＴ ２０２９株のみを用いた場合の配糖体の分解率の低さはマロニル配糖体がほとんど分解されないことが原因であることがわかった。
【００５９】
実 施 例 ３
発酵豆乳におけるイソフラボン配糖体の分解様式を解析するために、実施例２においてＬ.カゼイ ＹＩＴ９０２９株単独よりも配糖体分解率が高くなった併用乳酸菌について、参考例２の方法を用い、マロニル配糖体の分解性を検討した。
【００６０】
（ 実験方法 ）
発酵豆乳調製：
豆乳をＵＨＴ殺菌（１３５℃、３.５秒）し、各々にフィルター滅菌した５０％グルコース水溶液２０ｍｌを加え、培地とした（グルコース終濃度１％）。この培地にラクトバチルス・マリ ＹＩＴ ０２４３株、ラクトバチルス・ガッゼリ（Lactobacillus gasseri） ＹＩＴ ０１６８株、もしくは、ラクトバチルス・ラムノーザス（Lactobacillus rhamnosus） ＹＩＴ ０２３２株をシードとして１％接種し、３７℃で４８時間培養した。こうして得られた各種発酵豆乳から、参考例２と同様に分析サンプルの調製、ＨＰＬＣ分析を行い、イソフラボンマロニル配糖体の残存状況を調べた。対照としては、ＵＨＴ滅菌した豆乳を用いた。この結果を図３に示す。
【００６１】
図３中、ＥはＬ.マリＹＩＴ ０２４３株を用いた発酵豆乳の、ＤはＬ.ガゼリＹＩＴ ０１６８株を用いた発酵豆乳の、ＣはＬ.ラムノーザス ＹＩＴ ０２３２株を用いた発酵豆乳のイソフラボンＨＰＬＣチャートであり、ＢはＵＨＴ殺菌した豆乳のイソフラボンＨＰＬＣチャートである。また図中、１から６は、参考例２と同じ物質のピークを示す。
【００６２】
図３の結果、Ｌ.マリ ＹＩＴ ０２４３株、Ｌ.ガゼリ ＹＩＴ ０１６８株およびＬ.ラムノーザス ＹＩＴ ０２３２株の３菌株がマロニル基を分解する能力を有することが示された。このうち、Ｌ.ガゼリ ＹＩＴ ０１６８株およびＬ.ラムノーザス ＹＩＴ ０２３２株についてはマロニル配糖体のピークがグルコース配糖体のピークに移行しており、マロニル配糖体をグルコース配糖体に変換する活性を持つことが示唆された。Ｌ.マリ ＹＩＴ ０２４３株はそのような活性に加え、配糖体をアグリコンに分解する活性を併せ持っていることが推察された。
【００６３】
実 施 例 ４
素豆乳に１％濃度でグルコースを添加し、ＵＨＴ殺菌（１３５℃、３.５秒）した。ここに、Ｌ.カゼイ ＹＩＴ ９０２９株を１％接種したもの、Ｌ.マリ ＹＩＴ ０２４３株を１％接種したもの、両者を０.５％ずつあわせて接種したもの、以上３サンプルについて、３７℃にて４８時間培養をおこなった。各サンプルについて培養後のイソフラボンを抽出し、ＨＰＬＣにて配糖体の種類別に同定をおこなった。対照としては、ＵＨＴ滅菌した豆乳を用いた。この結果を図４に示す。
【００６４】
図４中、ＧはＬ.マリ ＹＩＴ ０２４３株を用いた発酵豆乳の、ＦはＬ.カゼイＹＩＴ ９０２９株を用いた発酵豆乳のイソフラボンＨＰＬＣチャートであり、Ｈは両者を用いた場合のイソフラボンＨＰＬＣチャートである。なお、ＢはＵＨＴ殺菌した豆乳のイソフラボンＨＰＬＣチャートであり、図中、１から６は、参考例２と同じ物質のピークを示す。
【００６５】
未接種の豆乳にみられるマロニル配糖体のイソフラボンを示すピーク（図中、Ｂ）は、Ｌ.カゼイ ＹＩＴ ９０２９株による発酵ではほとんど変化していない（図中、Ｆ）のに対して、Ｌ.マリ ＹＩＴ ０２４３株による発酵後には減少し（図中、Ｇ）、両者の混合培養では完全に消失していた（図中、Ｈ）。よって、これらの菌株によるイソフラボン配糖体の分解特性は、Ｌ.マリのマロニル配糖体の分解能とＬ.カゼイのβ−グルコシダーゼ活性によると判断される。
【００６６】
実 施 例 ５
マロニル配糖体の分解様式についてマロン酸の生成により確認した。
【００６７】
（ 実験方法 ）
実施例３と同様にして得られたＬ.マリ ＹＩＴ ０２４３株の発酵物およびＬ.カゼイ ＹＩＴ ９０２９株の発酵物を経時的に採取し、1/10量の１０％過塩素酸を加え、２時間、４℃で放置した。その後、１００００ｒｐｍで１０分間遠心処理を行ない、得られた上清を０.４５μのフィルターでろ過した。このサンプルに含まれる有機酸の分析用サンプルとした。この分析用サンプル中のマロン酸濃度を測定した結果を図５に示す。
【００６８】
（ ＨＰＬＣ分析 ）
ＨＰＬＣ分析は以下の条件で行った。
図５の結果から、Ｌ.マリ ＹＩＴ ０２４３株の発酵物はＬ.カゼイ ＹＩＴ ９０２９株の発酵物に比べ、経時的にマロン酸濃度が高くなることが明かとなった。そして、マロン酸はマロニル配糖体のマロニル基が分解されると生成すると考えられるので、Ｌ.マリ ＹＩＴ ０２４３株はマロニル配糖体のマロニル基部分を分解する活性を持つことが示された。従って、実施例３で見出された菌群は、マロニル配糖体のマロニル基を分解していると判断された。
【００７０】
実 施 例 ６
Ｌ.カゼイおよびＬ.マリで混合培養した場合の、醗酵大豆タンパクのイソフラボン配糖体の分解率を次のようにして調べた。まず、大豆タンパク質（フジプロ１２００；不二製油製）を０.１％酵母エキス（ディフコ製）および１％グルコースを含む蒸留水に溶かして、６〜１２％の溶液を作り、ガラスホモゲナイザーで均一化した。この溶液を８０℃で３０分間加熱殺菌後冷却し、醗酵用の大豆タンパク溶液とした。こうして調製した大豆タンパク質溶液に、Ｌ.カゼイ ＹＩＴ９０２９株を０.０１％、Ｌ.マリ ＹＩＴ ０２４３株を１％接種し、３７℃にて２０時間培養し、発酵大豆タンパク質を調製した。得られた発酵大豆タンパク質について、そのイソフラボンの配糖体分解率を、前記方法に準じて測定した結果を表３に示す。
【００７１】
【表３】
原料である大豆タンパク質は加熱処理等を経て得られたものであり、ダイゼインは２６％前後、ゲニステインは１８％前後分解されている。そして、これを表３の結果と比較すると、よりイソフラボンの分解が進んでいることがわかる。すなわち、Ｌ.カゼイおよびＬ.マリを用いて大豆タンパク溶液を醗酵することにより、イソフラボン配糖体分解率は５０％以上になり、特に１２％溶液では７０％を超えることが理解される。
【００７３】
【発明の効果】
本発明によれば、総イソフラボン誘導体の５０％以上がアグリコンとして存在する発酵豆乳が得られる。そして、アグリコンは配糖体と比べ生体への吸収が高いので、本発明の発酵豆乳は脂質代謝改善効果や、骨代謝改善効果、ガン予防効果等を有する飲食品として極めて有利なものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】 β−グルコシダーゼ活性の高い微生物で豆乳を発酵させた場合の配糖体分解率の変化を示す図面。
【図２】 Ｌ.カゼイ ＹＩＴ ９０２９株を用いて豆乳を発酵させた場合の発酵前後におけるイソフラボンの種類の変化を調べた結果を示す図面。
【図３】 いくつかのラクトバチルス属微生物について、豆乳を発酵させた後の培養物に含まれるイソフラボンの種類を分析した結果を示す図面。
【図４】 Ｌ.マリ ＹＩＴ ０２４３株およびＬ.カゼイ ＹＩＴ ９０２９株について、それぞれ単独で豆乳を発酵させた場合並びにこれら両者を使用して豆乳を発酵させた場合について、培養後のイソフラボンの種類を分析した結果を示す図面。
【図５】 Ｌ.マリ ＹＩＴ ０２４３株およびＬ.カゼイ ＹＩＴ ９０２９株について発酵豆乳中のマロン酸濃度を示す図面
以 上
Claims (2)
- 豆乳を微生物により発酵して得られる発酵豆乳であって、当該微生物がラクトバチルス・マリ又は、ラクトバチルス・マリ、ラクトバチルス・ガセリ及びラクトバチルス・ラムノーザスから選ばれる微生物とラクトバチルス・カゼイとの組み合わせであり、当該発酵豆乳中の総イソフラボン誘導体の５０重量％以上をイソフラボンアグリコンとして含有することを特徴とする発酵豆乳。
- ラクトバチルス・マリ又は、ラクトバチルス・マリ、ラクトバチルス・ガセリ及びラクトバチルス・ラムノーザスから選ばれる微生物とラクトバチルス・カゼイとの組み合わせを豆乳に接種し培養することを特徴とする発酵豆乳の製造方法。
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