JP4338316B2 - 遺伝子発現概要の作製方法 - Google Patents
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Description
発明の背景
現在、cDNA及びオリゴヌクレオチドマイクロアレー(総説1-3)により一緒に何千もの遺伝子の遺伝子発現概要を調べることができる。最近、酵母4 5並びに哺乳類細胞系6、一次細胞7及び組織8における遺伝子発現変化を調べた研究が報告されている。
【0002】
しかしながら、マイクロアレー技術の現在の応用は、与えられた組織/器官(すなわち、インサイチュー)に存在する個々の細胞型からの遺伝子発現の研究を含まない。そのような研究は、正常及び疾病状態の隣接する細胞型間でインビボで存在する複雑な相互作用の我々の理解を非常に促進する。本発明は、レーザー捕獲顕微解剖9[laser capture microdissection(LCM)]及びT7に基づくRNA増幅10の技術をcDNAマイクロアレー11と組み合わせることにより隣接する細胞型からの遺伝子発現概要をうまく得ることができることを示す。
【0003】
発明の要約
本発明は、特定の一組の細胞における特定のメッセンジャーRNAの発現の再現性のある測定及び評価方法を提供する。この方法は、新しいやり方で非常に少数の特定の細胞の遺伝子発現分析の概要を作製するためにレーザー捕獲顕微解剖、T7に基づくRNA増幅、増幅したRNAからのcDNAの作製及び多種多様な特定の遺伝子の固定化DNA分子を含有するDNAマイクロアレーの既知の技術を組み合わせ、利用する。レーザー捕獲技術により所望する細胞を個々に同定し、基質に結合させ、捕獲細胞を残りの細胞から分離する。次に、捕獲細胞からRNAを抽出し、T7に基づく増幅技術を用いて約百万倍に増幅し、場合により、増幅したRNAからcDNAを調製する。捕獲細胞中に存在するかもしくはしない可能性がある、またはあるレベルで存在する目的の特定の核酸とハイブリダイズする多種多様な特定のDNA分子を調製し、それらのDNA分子を適当な基質上に固定してマイクロアレーを形成する。アレー上の固定化DNAにcDNAがハイブリダイズできる条件下で捕獲細胞から作製したcDNAをマイクロアレーに添加する。捕獲細胞の増幅したRNAまたは場合により増幅したRNAから作製したcDNA及びマイクロアレー上の特定の固定化DNA分子を用いたハイブリダイゼーション結果の分析から捕獲細胞の発現概要を得る。ハイブリダイゼーション結果は、例えば、マイクロアレー上にプローブとして示されるもののうちどの遺伝子が捕獲細胞からのcDNAにハイブリダイズされるか、及び/または特定の遺伝子発現の量を示す。ハイブリダイゼーション結果は、捕獲細胞の遺伝子発現概要を示す。異なる一組の捕獲細胞の遺伝子発現概要と比較するために捕獲細胞の遺伝子発現概要を用いることができ、そして類似点及び相違点は、異なる細胞型間の遺伝子発現の違い及び異なる条件下での同じ細胞型間の違いを決定するために有用な情報を与える。
【0004】
発明の詳細な説明
本発明は、特定の選択した一組の細胞における遺伝子発現概要の作製のための新規な方法を提供する。本発明の方法は、分析のために所望される細胞のみを正確に単離する方法論を与えるために新しいやり方で組み合わされる既知の技術を利用する。これはレーザー捕獲解剖により成し遂げられ、その場合、器官または組織サンプルのような、細胞の混合集団からの個々の細胞は、捕獲のために選択した特定の細胞にかけられたレーザーエネルギーにより基質に結合するようになる。捕獲細胞は非捕獲細胞から分離されて組内に含まれるように特異的に選択された一組の細胞を与える。選択規準は、組内に含まれることが所望される細胞のいかなる特性であってもよい。この技術を用いて、所望される特性を有する一組の細胞を集め、それは細胞の均一な収集を表す。次に、抽出されたRNAを生成するために捕獲細胞を用いる。既知の技術を用いて捕獲細胞からRNAを抽出する。次に、既知の技術を用いてこの抽出されたRNAを約百万倍増幅まで増幅し、場合により、既知の技術を用いてcDNAを作製するために増幅されたRNAを用いる。
【0005】
技術のこの組み合わせを示すために、後根神経節(DRG)における大型及び小型ニューロン間の異なる遺伝子発現を調べた。一般に、大型DRGニューロンは有髄で、迅速に伝導し、機械感覚情報を伝達し、一方、小型ニューロンは無髄で、ゆっくりと伝導し、侵害情報を伝達する12。(1)多数の異なって発現される遺伝子(小型対大型)が以前に報告されており;従って、この実験の成功を評価できるはずであり、そして(2)多数の小型及び大型ニューロンは相互に隣接しており、従って、個々のニューロンを正確に捕獲できるかどうかを試験するので、この系を選択した。
【0006】
図1に示されるように、大型(>40μmの直径)及び小型(直径<25μm)ニューロンをニッスル染色したラットDRGの10μm切片からLCMにより正確に個々に捕獲した。この研究では、2組の1000大型ニューロン及び3組の1000小型ニューロンをcDNAマイクロアレー分析のために捕獲した。
RNA増幅は個々の組のニューロン間で再現性がある
RNAを各組のニューロンから抽出し、T7 RNAポリメラーゼにより概算して106倍に直線状に増幅した。いったん増幅すると、個々に増幅したRNA(aRNA)から3個の蛍光的に標識したプローブを合成し、477 cDNA(以下に記述したチップ設計を参照)に加えて(非特異的核酸ハイブリダイゼーションの測定のための)植物遺伝子をコードする30 cDNAを含有するマイクロアレー(a.k.a.チップ)に三重反復でハイブリダイズさせた。(小型ニューロンはS1、S2及びS3、大型ニューロンはL1及びL2と称する)各ニューロン組における発現をこのように三重反復でモニターし、全部で15マイクロアレーを必要とした。マイクロアレーデータの質を図2Aに例示し、それはニューロン組S1由来のプローブへのハイブリダイゼーションから生じたもの及びニューロン組L2からのものの疑似色つき(pseudo-color)アレーを示す。図2Aにおいて、チップの拡大部分は、特定のcDNAの蛍光強度(すなわち、発現レベル)のいくらかの違いを示し、異なるcDNAを含有するスポットは大きさが比較的が均一であること及びスポット間のバックグラウンドが比較的低いことを示す。
【0007】
特定のcDNAに対応するシグナルが異なるチップ間で再現性があるかどうかを決定するために、各ニューロン組に対して、変動係数を計算した(CVまたは標準偏差/平均 X 100%)。これらの値から、ニューロン組当たりの全ての477 cDNAの総合平均CVを計算して:15.81%=S1、16.93%=S2、17.75%=S3、20.17%=L1及び19.55%=L2であった。
【0008】
より重要なことには、同じニューロンサブタイプの異なる組の別個の増幅(〜106倍)は全く類似した発現パターンを生じた。例えば、S1対S2間のシグナル強度の相関関係はR2=0.9688であり、S1対S3間はR2=0.9399であった(図2B)。類似した結果が2組の大型ニューロン間で得られた:L1対L2でR2=0.929(図2B)。
【0009】
逆に、3つ全ての小型ニューロン組(S1、S2及びS3)対2つの大型組(L1及びL2)間の比較は、はるかに低い相関関係を生じ(R2=0.6789)、予測されたように遺伝子のサブセットが2つのニューロンサブタイプ間で異なって発現されることを示す(図2B)。
小型及び大型ニューロン間で異なった遺伝子発現が示される。
【0010】
大型及び小型ニューロン間で異なって発現されるmRNAを同定するために、全ての477 cDNAを調べ、1.5倍またはそれより大きい違い(P<0.05で)を有するものをシークエンスし、表1及び2に示す。マイクロアレー上のcDNAの収集の中で、より多くのmRNAが小型ニューロンにおいて優先的に発現することが見いだされ(小型における27 mRNAに対して大型における14 mRNA);これは単にこのチップ上に用いたcDNAの組を反映する可能性がある。
【0011】
認められた異なる遺伝子発現を確かめるために、これらのcDNAのサブセットでインサイチューハイブリダイゼーションを実施した。
【0012】
小型ニューロンでは、以下のもの:脂肪酸結合タンパク質(ジーンバンク受託番号M13501)、NaN(ナトリウム電位依存性チャネル、AF059030)、ホスホリパーゼCデルタ−4(U16655)、CGRP(L00111)及びアネキシンV(82462)をコードする5つのmRNAを調べた。5つ全てのmRNAは小型ニューロンにおいて優先的に発現される(5つのうち3つを図3に示す、5つ全ては表3を参照)。これは、与えられたmRNAに対して(1)小型及び大型ニューロンにおけるシグナルの全体的な強度並びに(2)小型または大型ニューロンのいずれかの全集団内の標識された細胞の%を測定する(表3)定量測定に基づいた。
【0013】
それらの結果は、NaN mRNA13及びCGRP mRNA14のインサイチューハイブリダイゼーション研究を裏付け、そしてアネキシンV15での免疫蛍光研究と一致する。ホスホリパーゼCデルタ4は以前に、細胞周期のS期で誘導され、核に存在することが示されている16。ニューロンは有糸分裂後であることを考えれば、この結果は、この酵素が小型ニューロンのサブセットにおいて異なる役割を果たす可能性があることを示唆する。大型ニューロンでは、ニューロフィラメントNF−L(M25628)及びNF−H(J04517)並びに電位依存性ナトリウムチャネルのβ−1サブユニット(M91808)の3つのcDNAを調べた。図3及び表3に示されるように、これらのmRNAの優先的発現が大型DRGニューロンにおいて見られた。最近のインサイチューハイブリダイゼーション研究もこれら3つのmRNAの大型ニューロンにおける優先的発現を示している14 17。さらに、以前のインサイチューハイブリダイゼーション研究は、P2X3受容体mRNA(X90651)、NF−中間(middle)(J04517)、hsp 2718及びペリフェリン(M26232)14 19 20の小型及び大型ニューロンにおける異なる発現に関するこのcDNAチップデータと一致する。しかしながら、一つの報告はペリフェリンmRNA発現に関して小型及び大型ニューロン間でいかなる違いも見いださない14。一般に、与えられたmRNAに対して、cDNAチップデータ及びインサイチューハイブリダイゼーション研究からの結果は一致する。しかしながら、大部分の場合において、インサイチューハイブリダイゼーション研究は、小型及び大型間の発現においてcDNAチップデータから認められるものよりかなり大きい違いを示す(表1及び2対表3)。これは低い強度のシグナルに対して特に明白である。例えば、ホスホリパーゼCデルタ4発現はほとんど小型ニューロンにおいてのみ見られたが(表3)、チップデータは発現の2.76倍の違いのみを示す(表2)。大部分において、非特異的核酸ハイブリダイゼーションによるバックグラウンドシグナル(すなわち、植物cDNAからのハイブリダイゼーションシグナル)が各cDNA強度から引かれていないことによりこれを説明できる。以下に示すように、植物cDNAの75百分位数値バックグラウンドシグナルは小型ニューロン組では48.68、大型では40.94である。従って、ホスホリパーゼCデルタ4の大型ニューロンに対する小型の発現の比率は、「非特異的」バックグラウンドを引く場合、2.76倍の違いから〜22倍の違いまでになる。このバックグラウンドを引かない理由は、分母(すなわち、シグナルの強度−75%植物値)が0に近づくにつれてそれは非常に大きい、潜在的に偽の倍数の違いももたらす可能性があることである。
【0014】
結局、大型または小型ニューロンのいずれかにおいて優先的に発現される41 mRNAのうち、これらのmRNAの12に対してインサイチューハイブリダイゼーション研究により類似した結果が示されている。この成功レベルは、他の30 mRNAの大部分も小型または大型ニューロンにおいて異なって発現されることを示唆する。
細胞型特異性を含有する遺伝子発現データベースの構築
LCM、aRNA及びcDNAチップを組み合わせることにより、インサイチューから得られた異なる細胞型をうまく選別し、続いて異なる遺伝子発現を同定できることが示された。この研究はDRGニューロン内の異なる発現を有するmRNAを同定したが、単に小型及び大型以外にDRGニューロン内に多量のより異種性が存在する。例えば、小型ニューロン(すなわち、侵害ニューロン)内には、遺伝子発現に関して異種性があり、それはおそらく少なくとも一つには伝達される異なる感覚様式を表す。このより複雑な異種性に取り組むために、LCMへの免疫細胞化学の連結及びそれに続くaRNA及びDNAチップ分析を実施することができる。さらに、大型及び小型ニューロン間の異なる遺伝子発現をより完全に同定するために、より多数のcDNA(すなわち、>10,000)を含有するチップを完成することができる。
【0015】
本明細書に示した結果は、既知の技術のこの組み合わせにより作製した発現概要がcDNAをスクリーニングするためだけでなく、より重要なことには、細胞型特異的遺伝子発現を含有するデータベースを作るためにも有用である可能性があることを示す。データベース内の細胞型特異性は、特定の正常または疾病状態への個々の細胞型の寄与を理解することにおいて研究者により多くの影響力を与え、従って、はるかに優れた仮説を続いて作製することができる。さらに、データベースが様々な細胞型(またはニューロンサブタイプ)からの多数の遺伝子発現概要を含有するようになるにつれて、与えられた細胞型内で同等に発現される遺伝子を同定することができる。また、同等な遺伝子発現は、コードされるタンパク質間の機能的連結も示唆する可能性があり、従って、現在クローン化されたcDNAの膨大な大多数に対して機能を決定しようとする試みを促進する。
表1
大型DRGニューロンにおいて豊富なmRNA.[GB]ジーンバンク受託番号;[平均]DNAチップマイクロアレーの平均強度;[S.E.M.]平均の標準誤差;[比率]小型DRGニューロンに対する大型DRGの平均強度比率;[*]植物値の75%から有意に異ならない(p>0.05)平均強度。
表2
小型DRGニューロンにおいて豊富なmRNA.[GB]ジーンバンク受託番号;[平均]DNAチップマイクロアレーの平均強度;[S.E.M.]平均の標準誤差;[比率]大型DRGニューロンに対する小型DRGの平均強度比率;[*]植物値の75%から有意に異ならない(p>0.05)平均強度。
表3
選択したcDNAクローンのインサイチューハイブリダイゼーション.[強度]=以下のような細胞当たりの概算したmRNA発現レベル:[−]バックグラウンドより上の発現なし;[±]弱い発現;[+]低い発現;[++]中程度の発現;[+++]強い発現。[%]=バックグラウンドより上の目的のmRNAを発現するDRGニューロンの%。
【0016】
【表1】
【0017】
【表2】
【0018】
【表3】
【0019】
実施例1
レーザー捕獲顕微解剖(LCM). 2匹の成体メスSprague Dawleyラットをこの研究に用いた。メトファン(メトキシフルラン、カタログ番号556850、Mallinckrodt Veterinary Inc.Mundelein、IL、USA)で動物に麻酔をかけ、断頭により屠殺した。RNアーゼを含まない条件を用いて、頸部後根神経節(DRG)を素早く切断して出し、凍結型中に置き、凍結組織包埋媒質OCT(Tissue−Tek)で覆い、ドライアイスで冷やした2−メチルブタン(〜−60℃)中で凍らせた。次に、DRGをクリオスタットで7−10μmで切片を作り、普通の(被覆していない)きれいな顕微鏡スライド上に載せ、ドライアイスの塊上ですぐに凍らせた。それらの切片をさらに使用するまで−70℃で保存した。
【0020】
DRGニューロンを同定するために急速ニッスル(クレシルバイオレットアセテート)染色を用いた。これを以下のように完了した。切片を含有するスライドをスライドホルダー上に素早く載せ、すぐに100%エタノール中で1分間固定し、続いて、RNアーゼを含まない脱イオンH2O中に希釈した95%、70%、50%エタノールの連続段階により再水和させた(各5秒)。次に、スライドを0.5%ニッスル/0.1M酢酸ナトリウムバッファーで1分間染色し、段階的エタノール(各5秒)中で脱水し、キシレン中できれいにした(1分)。いったん風乾させると、スライドはLCMに使用できた。
【0021】
Acturus Engineering Inc.(Mountain View、CA)からのPixCell II LCMTM(商標)システムをレーザー捕獲に用いた。製造業者のプロトコルに従って、2組の大型及び3組の小型DRGニューロン(1組当たり1000細胞)をレーザー捕獲した。大型及び小型DRGニューロンの規準は以下のとおりである:DRGニューロンが直径<25μmに加えて同定できる核を有する場合、それを小型として分類し、一方、直径>40μmに加えて同定できる核を有するDRGニューロンを大型として分類した。
【0022】
実施例2
LCMサンプルのRNA抽出. いくらか改変してMicro RNA単離キット(Stratagene、San Diego、CA)を用いて、LCMサンプルから全RNAを抽出した。簡潔に言えば、LCMサンプルを200μlの変性バッファー及び1.6μlのβ−MEと室温で5分間インキュベートした後、LCMサンプルを20μlの2M酢酸ナトリウム、220μlのフェノール及び40μlのクロロホルム:イソアミルアルコールで抽出した。水層を集め、次に、1μlの10mg/mlキャリヤーグリコーゲンと混合し、200μlのイソプロパノールで沈殿させた。70%エタノール洗浄及び風乾後、ペレットを16μlのRNアーゼを含まないH2O、2μlの10X DNアーゼI反応バッファー、1μlのRNasin及び1μlのDNアーゼI中に再懸濁し、37℃で30分間インキュベートしてあらゆるゲノムDNA混入を除いた。次に、フェノールクロロホルム抽出を上記のように繰り返した。ペレットを11μlのRNアーゼを含まないH2O中に再懸濁し、そのうち1μを取っておき、逆転写PCRの陰性コントロール(RTなしコントロール)として用い、そして残り(10μl)をRT−PCR及びRNA増幅のために処理した。
【0023】
実施例3
RNAの逆転写(RT). 上記からの10μlの精製したRNA及び1μlの0.5mg/ml T7−オリゴdTプライマー(5’TCTAGTCGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGCGT21−3’)を一緒に添加することにより第一鎖合成を完了した。プライマー及びRNAを70℃で10分間、続いて42℃で5分間インキュベートした。次に、4μlの5X第一鎖反応バッファー、2μlの0.1M DTT、1μlの10mM dNTPs、1μlのRNasin及び1μlのSuperscript II(Gibco BRL)を添加し、42℃で1時間インキュベートした。次に、30μlの第二鎖合成バッファー、3μlの10mM dNTPs、4μlのDNAポリメラーゼI、1μlのエシェリキア・コリ(E.coli)RNaseH、1μlのエシェリキア・コリDNAリガーゼ及び92μlのRNアーゼを含まないH2Oを添加し、16℃で2時間インキュベートし、続いて、2μlのT4 DNAポリメラーゼを添加して16℃で10分間インキュベートした。次に、cDNAをフェノール−クロロホルム抽出し、Microcon−100カラム(Millipore)で500μlのH2Oで3X洗浄した。カラムから集めた後、cDNAをインビトロ転写のために8μlまで乾燥させた。
【0024】
実施例4
T7 RNAポリメラーゼ増幅(aRNA). Ampliscribe T7転写キット(Epicentre Technologies)を用いた:8μlの二本鎖cDNA、2μlの10X Ampliscribe T7バッファー、1.5μlの各100mM ATP、CTP、GTP及びUTP、2μlの0.1M DTT及び2μlのT7 RNAポリメラーゼ、42℃で3時間。aRNAをMicrocon−100カラムで3X洗浄し、集め、10μlまで乾燥させた。
次の一連のaRNA増幅. 1回目の増幅からの10μlのaRNAを1μlの1mg/mlランダムヘキサマー(Pharmacia)と一緒に70℃で10分間混合し、氷上で冷やし、室温で10分間平衡化し、次に、4μlの5X第一鎖バッファー、2μlの0.1M DTT、1μlの10mM dNTPs、1μlのRNasin及び1μlのSuperscript RT IIを添加し、室温で5分間、続いて37℃で1時間インキュベートした。次に、1μlのRNアーゼHを添加し、37℃で20分間インキュベートした。第二鎖cDNA合成のために、1μlの0.5mg/ml T7−オリゴdTプライマーを添加し、70℃で5分間、42℃で10分間インキュベートした。次に、30μlの第二鎖合成バッファー、3μlの10mM dNTPs、4μlのポリメラーゼI、1μlのエシェリキア・コリRNアーゼH、1μlのエシェリキア・コリDNAリガーゼ及び90μlのRNアーゼを含まないH2Oを添加し、37℃で2時間インキュベートした。次に、2μlのT4 DNAポリメラーゼを16℃で10分間添加した。タンパク質を除くためにcDNAの二本鎖を150μlのフェノールクロロホルムで抽出し、Microcon−100カラム(Millipore)で精製して取り込まれなかったヌクレオチド及び塩から分離した。cDNAは上記のような2回目のT7インビトロ転写、そして次に続く3回目のaRNA増幅に使用できる。
【0025】
実施例5
マイクロアレー設計. 2つの別個の示差展示(differential display)21実験からチップ上に存在するcDNAを得た。第一に、脳、腎臓及び肝臓に対してDRGにおいて優先的に発現されるmRNAをクローン化するために選別を実施した。第二に、反対側の(「コントロール」)腰椎5及び6DRGに対して後根神経節の末梢にきつく連結された同側の(「処置した」)腰椎5及び6DRG(「Chung」モデル22)において減少したまたは増加した濃度を有するmRNAを同定する/クローン化するために選別を実施した。
マイクロアレープリント. (上記のような)我々の以前の示差展示研究からのベクターPCR 2.1中の477クローンをシリル化したスライド(CEL Associates)上につけた。cDNAを5’アミノ−連結プライマーでPCR増幅し、Qiagen 96 PCR精製キットで精製した。プリントスポットは約125μmの直径であり、中心から中心まで300μmの間隔を置いて配置した。また、30植物遺伝子も非特異的ハイブリダイゼーションのコントロールとしてスライド上につけた(Mark Schenaからの贈与)。
【0026】
実施例6
マイクロアレープローブ合成. cDNA合成のためのSuperscript選択システム(Superscript Choice System for cDNA Synthesis)(Gibco BRL)でLCM DRGのaRNAからCy3標識したcDNAプローブを合成した。簡潔に言えば、5μgのaRNA、3μgのランダムヘキサマーを(RNアーゼを含まないH2Oを含有する)26μlの全容量で混合し、70℃に10分間加熱し、氷上で冷やした。次に、10μlの第一鎖バッファー、5μlの0.1M DTT、1.5μlのRNasin、1μlの25mM d(GAT)TP、2μlの1mM dCTP、2μlのCy3−dCTP(Amersham)及び2.5μlのSuperscript RT IIを添加し、室温で10分間、次に37℃で2時間インキュベートした。aRNA鋳型を分解するために、6μlの3N NaOHを添加し、65℃で30分間インキュベートした。次に、20μlの1M Tris−HCl pH 7.4、12μlの1N HCl及び12μlのH2Oを添加した。プローブをMicrocon 30カラム(Millipore)で、次にQiagenヌクレオチド除去カラムで精製した。プローブを真空乾燥させ、マウスCot1 DNA(Gibco BRL)を含有する20μlのハイブリダイゼーションバッファー(5X SSC、0.2% SDS)中に再懸濁した。
マイクロアレーハイブリダイゼーション及び洗浄. スライドへのcDNAのアミノ−連結を確実にするために、プリントしたガラススライドをホウ水素化ナトリウム(sodium borohydrate)溶液(0.066M NaBH4、0.06M Na AC)で処理した。次に、cDNAを変性させるためにスライドを水中で2分間沸騰させた。Cy3標識したプローブを99℃で5分間、室温で5分間加熱し、スライドに添加した。スライドをガラスカバーガラスで覆い、DPX(Fluka)で密封し、60℃で4−6時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの終わりにスライドを室温まで冷却した。スライドを1X SSC、0.2% SDS中で55℃で5分間、0.1X SSC、0.2% SDS中で55℃で5分間洗浄した。0.1X SSC、0.2% SDS中で素早くすすいだ後、スライドを空気を送って乾燥させ、走査に使用できた。
マイクロアレー定量. ScanArray 3000(General Scanning,Inc.)を用いてcy3蛍光に関してcDNAマイクロアレー(すなわち、顕微鏡スライド)を走査した。次に、ImaGene Software(Biodiscovery,Inc.)を続いて定量に用いた。3チップ/ニューロン組(本文参照)で、全部で15チップを処理した。簡潔に言えば、即時周囲バックグラウンドを引くことにより各スポット(すなわち、cDNA)の強度を修正した。次に、修正した強度を各cDNA(すなわち、スポット)について以下の式:強度(バックグラウンド修正した)/全チップの強度の75百分位数値 x 1000で正規化した。「非特異的」核酸ハイブリダイゼーションを測定するために、各ニューロン組からの各植物cDNA(全部で30の異なるcDNA)の個々の平均から75百分位数値を計算した。S1、S2及びS3の総合75百分位数値=48.68、L1及びL2の総合75百分位数値=40.94。
統計的分析. ニューロンの個々の組間(例えば、図2BにおけるS1対S2)または2種のニューロンサブタイブ間(すなわち、図2BにおけるS1、S2及びS3対L1及びL2)の各cDNAの強度値の相関関係を評価するために、散布図を用い、直線関係を測定した。計算した測定係数R2は、ある群に対する別の群の強度値の変動を示す。
【0027】
マイクロアレー定量から測定した強度値が真のシグナルであるかどうかを統計的に決定するために、各チップ上に存在する(非特異的核酸ハイブリダイゼーションを表す)30植物cDNAの75百分位数値に対して1サンプルt試験により各強度を比較する。75百分位数値から有意に異ならない値を表1及び2に示し、そのように表す。どのcDNAが大型及び小型ニューロン間のそれらの異なる遺伝子発現において統計的に有意であるかを決定するために、大型ニューロン(L1及びL2)並びに小型ニューロン(S1、S2及びS3)のニューロン組からの各cDNAの強度をそれぞれ一緒に分類し、強度値を各対応するcDNAについて平均した。小型ニューロン及び大型ニューロン間の遺伝子発現差を検出するために片側仮説のための2サンプルt試験を用いた。
【0028】
実施例7
インサイチューハイブリダイゼーション. インサイチューハイブリダイゼーションを以前に記述されたように23実施した。簡潔に言えば、線状にしたpBluescript II SK(Stratagene)中にcDNAをサブクローン化し、T7またはT3 RNAポリメラーゼでインビトロ転写により35S−UTPを取り込んだ。次に、プローブをQuick SpinTM(商標)カラム(Boehringer Mannheim)で精製した。Superfrost Plusスライド(VWR)上に載せた10μm、4%パラホルムアルデヒド固定したラットDRG切片にプローブ(107cpm/プローブ)をハイブリダイズさせた。58℃で一晩ハイブリダイズさせ、後洗浄した後、一次データのためにスライドをフィルムに感光させた。続いて、スライドをKodak感光乳剤液NTB2で覆い、耐光性の箱の中で4℃で1−2週間感光させた。スライドをKodak現像液D−19中で現像し、Kodak定着液中で定着し、発現分析のためにニッスル染色した。
【0029】
明視野顕微鏡検査で、特定のcDNAのmRNA発現レベルを半定量的に分析した。これを以下のように実施した:発現なし(−、粒子はバックグラウンドの<5倍であった);弱い発現(±、粒子はバックグラウンドの5−10倍であった);低い発現(+、粒子はバックグラウンドの10−20倍であった);中程度の発現(++、粒子はバックグラウンドの20−30倍であった);強い発現(+++、粒子はバックグラウンドの>30倍であった)。4切片からの大型または小型のいずれかのニューロンから標識された(バックグラウンドより上)及び標識されなかった細胞の数を数えることにより(少なくとも200細胞を数えた)特定のmRNAを発現する小型または大型ニューロンの%を得た。
【0030】
【表4】
【0031】
【表5】
【0032】
【表6】
【図面の簡単な説明】
【図1】 成体ラット大型及び小型後根神経節(DRG)ニューロンの10μmニッスル染色切片からのレーザー捕獲顕微解剖(LCM)を示す。赤色矢印は、捕獲されるDRGニューロンを示す(上のパネル)。真ん中及び下のパネルは、それぞれ成功した捕獲及びフィルム移動を示す。縮尺棒=200μm。
【図2】 パネルA及びB−小型(S)及び大型(L)ニューロンのcDNAマイクロアレー発現パターンを示す。2Aは、得られたcDNAマイクロアレーデータの例である。白で囲んだものは、(以下に直接示す)拡大したL1及びS1サンプルのマイクロアレーの同一領域である。2Bは、S1対S2、S1対S3、L1対L2並びにL(L1及びL2)対S(S1、S2及びS3)の別個の増幅間の相関関係を示す散布図である。
【図3】 パネルA及びB−選択したcDNAとラットDRGの放射性同位体インサイチューハイブリダイゼーションの代表的な視野を示す。切片をニッスル対比染色した。左のパネル(パネルA)は、高分子量ニューロフィラメント(NF−H)、低分子量ニューロフィラメント(NF−L)及び電位依存性ナトリウムチャネル(SCNβ−1)のβ−1サブユニットをコードする放射性標識プローブでの結果を示す。左のパネル中の赤色矢印は、同定できる小型ニューロンを示す。右のパネル(パネルB)は、カルシトニン遺伝子関連生成物(CGRP)、電位依存性Naチャネル(NaN)及びホスホリパーゼCデルタ4(PLC)をコードする放射性標識プローブからの代表的な視野を示す。右のパネル中の赤色矢印は、同定できる大型ニューロンを示す。大きな赤色矢じりは、同様に標識される大型ニューロンを示す。縮尺棒=100μm。
Claims (3)
- a)レーザー捕獲顕微解剖により細胞を選択し、次いで基質に結合させ、残りの細胞から捕獲細胞を単離する工程;
b)単離した捕獲細胞からRNAを抽出し、次いでそのRNAを増幅する工程;
c)工程b)の増幅したRNAからcDNAを作製し、該cDNAを検出可能な標識で標識して標識したcDNAを作製する工程;
d)固定化DNAマイクロアレー上のDNAプローブと工程c)の標識したcDNAをハイブリダイズさせる工程;及び
e)定量的に、そして/または定性的に、マイクロアレー上のどの固定化DNAが標識したcDNAとハイブリダイズしたかを決定する工程
を含んでなる方法。 - a)レーザー捕獲顕微解剖により細胞を選択し、次いで基質に結合させ、残りの細胞から捕獲細胞を単離する工程;
b)単離した捕獲細胞からRNAを抽出し、次いでそのRNAを増幅し、増幅したRNAを検出可能な標識で標識して標識した増幅RNAを作製する工程;
c)固定化DNAマイクロアレー上の固定化DNAと工程b)の標識した増幅RNAをハイブリダイズさせる工程;及び
d)定量的に、そして/または定性的に、マイクロアレー上のどの固定化DNAが標識した増幅RNAとハイブリダイズしたかを決定する工程
を含んでなる方法。 - a)レーザー捕獲顕微解剖により細胞を選択し、次いで基質に結合させ、残りの細胞から捕獲細胞を単離する工程;
b)単離した捕獲細胞からRNAを抽出し、次いでそのRNAを増幅し、増幅したRN
Aを検出可能な標識で標識して標識した増幅RNAを作製する工程;
c)工程b)の増幅したRNAからcDNAを作製し、次いでそのcDNAを検出可能な標識で標識して標識したcDNAを作製する工程;
d)固定化DNAマイクロアレー上のDNAと標識した増幅RNA及び/または標識したcDNAをハイブリダイズさせる工程;及び
e)定量的に、そして/または定性的に、マイクロアレー上のどの固定化DNAが標識した増幅RNA及び/または標識したcDNAとハイブリダイズしたかを決定する工程を含んでなる方法。
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