ES2267264T3 - Metodo para generar perfiles de expresion genica. - Google Patents

Abstract

Un método que comprende: a) la selección y la fijación de células a un sustrato mediante microdisección con captura por láser, y el aislamiento de las células capturadas de las células restantes; b) la extracción del ARN de las células capturadas aisladas y la amplificación del ARN; c) la producción de ADNc a partir del ARN amplificado de la etapa b) y el marcaje del ADNc con una marca detectable para producir ADNc marcado; d) la hibridación del ADNc marcado de la etapa c) con sondas de ADN sobre una microserie de ADN inmovilizado; y e) la determinación de qué ADN inmovilizado en la microserie hibrida con el ADNc marcado, cuantitativamente y/o cualitativamente.

Description

Método para generar perfiles de expresión génica.

Antecedentes de la invención

Los perfiles de expresión génica de miles de genes pueden ser ahora examinados en conjunto mediante microseries de ADNc y oligonucleótidos (revisiones^{1-3}). Recientemente, se ha informado de estudios que examinaron cambios en la expresión génica de levaduras^{4,5} así como de líneas celulares^{6}, células primarias^{7} y tejidos^{8} de mamíferos.

Sin embargo, las aplicaciones actuales de la tecnología de microseries no incluyen el estudio de la expresión génica de tipos celulares individuales que residen en un tejido/órgano dado (esto es, in situ). Tales estudios facilitarían enormemente nuestra comprensión de las complejas interacciones que existen in vivo entre tipos celulares vecinos en estado normal y en estado de enfermedad. La presente invención demuestra que pueden obtenerse con éxito perfiles de expresión génica de tipos celulares adyacentes mediante la integración de las tecnologías de microdisección con captura mediante láser^{9} (LCM) y la amplificación de ARN basada en T7^{10} con microseries de ADNc^{11}.

Krizman y col. (1998), Proceedings of the American Association for Cancer Research, 39:453, describen un método que comprende la selección y el aislamiento de células por microdisección, la extracción del ARN, la producción de ADNc marcado, la hibridación del ADNc marcado con una serie de sondas de ADN inmovilizadas y la determinación de qué sondas inmovilizadas hibridaban con qué ADNc. Descripciones similares se encuentran en Simone y col. (1998), Trends in Genetics, 14:272-276 y en Bonner y col. (1997), Science, 278:1481-1483. Sin embargo, ninguno de estos documentos describe la amplificación de ARN antes de producir el ADNc marcado.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un método para la medida y la determinación reproducibles de la expresión de ARNs mensajeros específicos en un conjunto específico de células. Este método combina y utiliza las conocidas técnicas de microdisección con captura mediante láser, la amplificación de ARN basada en T7, la producción de ADNc a partir del ARN amplificado y microseries de ADN que contienen moléculas de ADN inmovilizadas para una amplia variedad de genes específicos con el fin de producir un perfil de análisis de la expresión génica para un número muy pequeño de células específicas de una nueva forma. Las células deseadas son identificadas individualmente y unidas a un sustrato mediante la técnica de captura con láser, y las células capturadas son separadas del resto de las células.

Posteriormente se extrae el ARN de las células capturadas y se amplifica alrededor de un millón de veces utilizando la técnica de amplificación basada en T7 y, opcionalmente, se prepara ADNc a partir del ARN amplificado. Se prepara una amplia variedad de moléculas de ADN específicas que hibridan con los ácidos nucleicos específicos de interés que puedan estar o no presentes, o que están presentes a cierto nivel en las células capturadas, y las moléculas de ADN son inmovilizadas en un sustrato adecuado para formar la microserie. El ADNc producido a partir de las células capturadas es aplicado a la microserie bajo condiciones que permiten la hibridación del ADNc al ADN inmovilizado en la serie. Se obtiene el perfil de expresión de las células capturadas a partir del análisis de los resultados de la hibridación utilizando el ARN amplificado u, opcionalmente, ADNc producido a partir del ARN amplificado de las células capturadas, y las moléculas de ADN específicas inmovilizadas en la microserie. Los resultados de la hibridación demuestran, por ejemplo, qué genes de los representados en la microserie como sondas hibridan con el ADNc de las células capturadas, y/o el nivel de expresión génica específica. Los resultados de la hibridación representan el perfil de expresión génica de las células capturadas. El perfil de expresión génica de las células capturadas puede ser utilizado para ser comparado con el perfil de expresión génica de un conjunto diferente de células capturadas, y las similitudes y diferencias pueden proporcionar una información útil para determinar las diferencias en la expresión génica entre diferentes tipos celulares, y las diferencias entre el mismo tipo celular bajo diferentes condiciones.

Por consiguiente, la presente invención proporciona los métodos de las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de las figuras

Figura 1 - Se muestra la microdisección con captura mediante láser (LCM) de secciones de 10 \mum teñidas con Nissl de neuronas grandes y pequeñas de los ganglios de la raíz dorsal (DRG) de rata adulta. La flechas rojas indican las neuronas de los DRG que van a ser capturadas (panel superior). El panel central y el panel inferior muestran la captura con éxito y la transferencia con éxito a la película, respectivamente. Barra de escala = 200 \mum.

Figura 2, Paneles A y B - Se muestran los patrones de expresión de microseries de ADNc de neuronas pequeñas (S) y grandes (L). En 2A hay un ejemplo de los datos de microseries de ADNc obtenidos. En el recuadro blanco hay una región idéntica de la microserie para las muestras L1 y S1 que está aumentada (mostrada directamente debajo). En 2B, diagramas de dispersión que muestran la correlación entre amplificaciones independientes de S1 frente a S2, de S1 frente a S3, de L1 frente a L2 y de L (L1 y L2) frente a S (S1, S2 y S3).

Figura 3, Paneles A y B - Se muestran campos representativos de hibridación in situ radioisotópica de DRG de rata con ADNcs seleccionados. Las secciones fueron contrateñidas con Nissl. El panel de la izquierda (panel A) muestra los resultados con sondas radiomarcadas que codifican el neurofilamento-de alto peso molecular (NF-H), el neurofilamento-de bajo peso molecular (NF-L) y la subunidad \beta-1 del canal de sodio regulado por voltaje (SCN\beta-1). Las flechas rojas del panel de la izquierda indican neuronas pequeñas identificables. El panel de la derecha (panel B) muestra campos representativos de sondas radiomarcadas que codifican un producto relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP), el canal de Na regulado por voltaje (NaN) y fosfolipasa C delta 4 (PLC). Las flechas rojas del panel de la derecha indican neuronas grandes identificables. La cabeza de flecha roja grande indica una neurona grande que está también marcada. Barra de escala = 100 \mum.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona un nuevo método para la generación de perfiles de expresión génica en un conjunto de células específicas elegido. El método de la presente invención utiliza técnicas conocidas que son combinadas de una nueva forma con el fin de proporcionar una metodología para aislar de forma precisa únicamente las células deseadas para el análisis. Esto se lleva a cabo mediante disección con captura mediante láser en la cual células individuales de una población mixta de células, tal como una muestra de un órgano o de un tejido, resultan fijadas a un sustrato mediante energía láser aplicada a células específicas seleccionadas para la captura. Las células capturadas son separadas de las células no capturadas con el fin de proporcionar un conjunto de células que fueron seleccionadas específicamente para ser incluidas en el conjunto. Los criterios de selección pueden ser cualquier característica de las células que se desee incluir en el conjunto. Utilizando esta técnica se recoge un conjunto de células que tienen las características deseadas y representan una colección uniforme de células. Las células capturadas son utilizadas posteriormente para producir ARN extraído. El ARN es extraído de las células capturadas utilizando técnicas conocidas. Este ARN extraído es luego amplificado utilizando técnicas conocidas hasta una amplificación de un millón de veces aproximadamente, y el ARN amplificado es utilizado, opcionalmente, para producir ADNc utilizando técnicas conocidas.

Para demostrar esta integración de tecnologías, se examinó la expresión génica diferencial entre las neuronas de tamaño grande y de tamaño pequeño de los ganglios de la raíz dorsal (DRG). En general, las neuronas grandes de los DRG están mielinizadas, conduciendo y transmitiendo rápidamente la información mecanosensorial, mientras que las neuronas pequeñas no están mielinizadas y conducen y transmiten lentamente la información nociceptiva^{12}. Este sistema fue elegido debido a que: (1) se han descrito previamente numerosos genes expresados de forma diferencial (pequeñas frente a grandes); por tanto podía determinarse el éxito de este experimento y (2) muchas neuronas pequeñas y grandes son adyacentes unas a otras, analizando de este modo si pueden capturarse limpiamente neuronas individuales.

Según se muestra en la Figura 1, las neuronas grandes (diámetro > 40 \mum) y pequeñas (diámetro < 25 \mum) fueron capturadas limpiamente e individualmente mediante LCM de secciones de 10 \mum de DRGs de rata teñidas con Nissl. Para este estudio, se capturaron dos grupos de 1000 neuronas grandes y 3 grupos de 1000 neuronas pequeñas para el análisis con microseries de ADNc.

La amplificación del ARN es reproducible entre conjuntos individuales de neuronas

El ARN fue extraído de cada conjunto de neuronas y amplificado linealmente 10^{6} veces estimadas mediante ARN polimerasa de T7. Una vez amplificado, se sintetizaron tres sondas marcadas fluorescentemente a partir de un ARN amplificado individualmente (ARNa) y se hibridaron por triplicado a una microserie (conocida también como chip) que contenía 477 ADNcs (ver el diseño de los chips descrito más adelante) más 30 ADNcs que codificaban genes de plantas (para la determinación de la hibridación no específica de ácidos nucleicos). La expresión en cada conjunto neuronal (denominados S1, S2 y S3 para las neuronas pequeñas y L1 y L2 para las neuronas grandes) fue monitorizada por tanto por triplicado, requiriendo un total de 15 microseries. La calidad de los datos de las microseries está ejemplificada en la Figura 2A, que muestra series de pseudocolor, uno resultante de la hibridación con sondas derivadas del conjunto de neuronas S1 y el otro resultante del conjunto de neuronas L2. En la Figura 2A, la parte aumentada del chip muestra algunas diferencias en la intensidad de fluorescencia (esto es, en los niveles de expresión) para ADNcs particulares y demuestra que las manchas que contienen los diferentes ADNcs son relativamente uniformes en tamaño y que el fondo entre manchas es relativamente bajo.

Con el fin de determinar si una señal correspondiente a un ADNc particular es reproducible entre diferentes chips, para cada conjunto de neuronas, se calculó el coeficiente de variación (CV o desviación estándar/media x 100%). A partir de estos valores se calculó que el CV medio total para los 477 ADNcs por conjunto de neuronas era: 15,81% = S1, 16,93% = S2, 17,75% = S3, 20,17% = L1 y 19,55% = L2.

Y lo que es más importante, amplificaciones independientes (\sim10^{6} veces) de diferentes conjuntos del mismo subtipo neuronal produjeron patrones de expresión bastante similares. Por ejemplo, la correlación de las intensidades de la señal entre S1 y S2 fue de R^{2} = 0,9688, y entre S1 y S3 fue R^{2} = 0,9399 (Figura 2B). Se obtuvieron resultados similares entre los dos grupos de neuronas grandes: R^{2} = 0,929 para L1 frente a L2 (Figura 2B).

A la inversa, una comparación entre los tres grupos de neuronas pequeñas (S1, S2 y S3) frente a los dos grupos de neuronas grandes (L1 y L2) produjo una correlación mucho menor (R^{2} = 0,6789), demostrando, según se esperaba, que un subgrupo de genes se expresa diferencialmente entre los dos subtipos neuronales (Figura 2B).

Se demuestra la expresión génica diferencial entre las neuronas pequeñas y grandes

Para identificar los ARNms que se expresan diferencialmente entre las neuronas grandes y pequeñas, los 477 ADNcs fueron todos examinados y los que tenían diferencias de 1,5 veces o mayores (a P < 0,05) fueron secuenciados y están mostrados en las Tablas 1 y 2. Entre la colección de ADNcs de la microserie, se encontró que se expresaban preferencialmente más ARNms en las neuronas pequeñas (14 ARNms en las grandes frente a 27 en las pequeñas); esto puede reflejar sencillamente el grupo de ADNcs utilizado en este chip.

Para confirmar la expresión génica diferencial observada, se llevó a cabo una hibridación in situ con un subgrupo de estos ADNcs.

Para las neuronas pequeñas, se examinaron cinco ARNms que codificaban lo siguiente: la proteína de unión a ácidos grasos (# de acceso del GenBank M13501), NaN (canal de sodio regulado por voltaje, AF059030), fosfolipasa C delta 4 (U16655), CGRP (L00111) y anexina V (82462).

Los cinco ARNms se expresan todos preferencialmente en las neuronas pequeñas (tres de los cinco están mostrados en la Figura 3, ver la Tabla 3 para los cinco). Esto se basó en medidas cuantitativas en las cuales se midió para un ARNm dado (1) la intensidad total de la señal en las neuronas pequeñas y grandes y (2) el porcentaje de células marcadas en la población total de neuronas pequeñas o grandes (Tabla 3).

Los resultados confirmaron los estudios de hibridación in situ para el ARNm de NaN^{13} y para el ARNm de CGRP^{14} y son consistentes con los estudios de inmunofluorescencia con anexina V^{15}.

Se ha demostrado previamente que la fosfolipasa C delta 4 es inducida en la fase S del ciclo celular y reside en el núcleo^{16}. Dado que las neuronas son post-mitóticas, esta observación sugiere que este enzima puede desempeñar una función diferente en un subgrupo de neuronas pequeñas.

Para las neuronas grandes, se examinaron tres ADNcs, el de los neurofilamentos NF-L (M25638) y NF-H (J04517) así como el de la subunidad beta-1 (M91808) de los canales de sodio regulados por voltaje. Según se muestra en la Figura 3 y en la Tabla 3, se encontró una expresión preferente de estos ARNms en las neuronas grandes de los DRG. Estudios recientes de hibridación in situ han demostrado también la expresión preferente en neuronas grandes para estos tres ARNms^{14,17}. Además, estudios previos de hibridación in situ concuerdan con estos datos de los chips de ADNc para la expresión diferencial en neuronas pequeñas y grandes del ARNm del receptor P2X3 (X90651), del NF-medio (J04517), de hsp 27^{18} y de periferina (M26232)^{14,19,20}. Un informe, sin embargo, no encuentra diferencias en la expresión de ARNm de periferina entre las neuronas pequeñas y grandes^{14}.

En general, para un ARNm dado, los datos de los chips de ADNc y los resultados procedentes de los estudios de hibridación in situ concuerdan. Sin embargo, en la mayoría de los casos, los estudios de hibridación in situ indican diferencias en la expresión entre las neuronas pequeñas y grandes mucho mayores que las observadas a partir de los datos de los chips de ADNc (Tablas 1 y 2 frente a la Tabla 3). Esto es particularmente obvio para las señales de baja intensidad. Por ejemplo, la expresión de fosfolipasa C delta 4 se encontró casi exclusivamente en las neuronas pequeñas (Tabla 3) aunque los datos de los chips indican una diferencia en la expresión de solamente 2,76 veces (Tabla 2). En gran parte esto puede ser explicado por el hecho de que la señal de fondo debida a la hibridación no específica de ácidos nucleicos (esto es, la señal de hibridación procedente de los ADNcs de plantas) no había sido sustraída de cada intensidad de ADNc. Según se indica más adelante, la señal de fondo del valor del percentil 75 para los ADNcs de plantas es de 48,68 para los conjuntos de neuronas pequeñas y de 40,94 para los conjuntos de neuronas grandes. Por tanto, la relación de la expresión de fosfolipasa C delta 4 en neuronas pequeñas respecto a neuronas grandes iría desde una diferencia de 2,76 veces a una diferencia de \sim22 veces si se sustrajera el fondo "no específico". La razón de no sustraer este fondo es que puede dar lugar también a diferencias en el número de veces muy grandes y potencialmente falsas a medida que el denominador (esto es, la intensidad de la señal menos el valor de la señal del ADNc de plantas del 75%) se aproxima a cero.

En total, de los 41 ARNms expresados preferencialmente en las neuronas grandes o pequeñas, se han demostrado resultados similares para 12 de estos ARNms mediante estudios de hibridación in situ.

Este nivel de éxito sugiere que la mayor parte de los otros 30 ARNms se expresarán también diferencialmente en las neuronas pequeñas o grandes.

Construcción de bases de datos de expresión génica conteniendo especificidad de tipos celulares

Se demostró que mediante la integración de LCM, ARNa y chips de ADNc, pueden someterse a selección con éxito diferentes tipos celulares obtenidos in situ e identificar posteriormente la expresión génica diferencial. Aunque este estudio ha identificado ARNms con expresión diferencial en neuronas de los DRG, existe mucha más heterogeneidad en las neuronas de los DRG más allá de ser simplemente pequeñas y grandes. Por ejemplo, en las neuronas pequeñas (esto es, las neuronas nociceptivas) existe heterogeneidad con respecto a la expresión génica que refleja presumiblemente, al menos en parte, las diferentes modalidades sensoriales transmitidas. Para abordar esta heterogeneidad más complicada, puede realizarse el acoplamiento de inmunocitoquímica a la LCM seguido por ARNa y análisis con chips de ADN. Además, pueden completarse chips conteniendo un número mayor de ADNcs (esto es, > 10.000) con el fin de identificar más completamente la expresión génica diferencial entre las neuronas grandes y pequeñas.

Los resultados mostrados en la presente demuestran que los perfiles de expresión generados a través de esta integración de tecnologías conocidas pueden ser útiles no sólo para seleccionar ADNcs sino también, y lo que es más importante, para producir bases de datos que contengan la expresión génica específica de tipos celulares.

La especificidad de tipos celulares en una base de datos proporcionará a un investigador una ventaja mucho mayor para comprender las contribuciones de tipos celulares individuales a un estado particular normal o de enfermedad, y por tanto permitirá la generación posterior de hipótesis mucho más refinadas.

Además, pueden identificarse genes que son expresados de manera coordinada en un tipo celular dado a medida que la base de datos crezca para contener numerosos perfiles de expresión génica de una variedad de tipos celulares (o de subtipos neuronales). La expresión génica coordinada puede sugerir también un acoplamiento funcional entre las proteínas codificadas y por tanto servir de ayuda en los intentos para determinar la función de la amplia mayoría de ADNcs actualmente clonados.

Tabla 1

ARNm enriquecido en neuronas grandes de los DRG. [GB] número de acceso del banco de genes; [Media] intensidad media de las microseries de chips de ADN; [E.S.M.] error estándar de la media; [Proporción] proporción de la intensidad media de las neuronas grandes de los DRG frente a la de las neuronas pequeñas de los DRG; [*] intensidad media no diferente significativamente (p > 0,05) del 75% del valor de la de los ADNcs de plantas.

Tabla 2

ARNm enriquecido en neuronas pequeñas de los DRG. [GB] número de acceso del banco de genes; [Media] intensidad media de las microseries de chips de ADN; [E.S.M.] error estándar de la media; [Proporción] proporción de la intensidad media de las neuronas pequeñas de los DRG frente a la de las neuronas grandes de los DRG; [*] intensidad media no diferente significativamente (p > 0,05) del 75% del valor de la de los ADNcs de plantas.

Tabla 3

Hibridación in situ de los clones de ADNc seleccionados. [Intensidad] = nivel estimado de expresión de ARNm por célula según sigue: [-] no hay expresión por encima del fondo; [\pm] expresión débil; [+] expresión ligera; [++] expresión moderada; [+++] expresión potente. [%] = porcentaje de neuronas de los DRG que expresan el ARNm de interés por encima del fondo.

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TABLA 1

Clon ID	GB	Descripción	Neuronas pequeñas	Neuronas grandes
			de los DRG	de los DRG
				% de		% de
			Intensidad	Marcadas	Intensidad	Marcadas
192393	M25638	Proteína del neurofilamento	\pm	100%	+++	100%
		más pequeño de rata (NF-L)
192157	J04517	Neurofilamento de alto peso	\pm/-	21,40%	+++	98,60%
		molecular de rata (NF-H)
192424	M91808	Canal de sodio beta-1 de	\pm/-	10%	++	96,30%
		Rattus norvegicus
192273	M13501	Proteína de unión a ácidos	+/++	62,20%	+/-	1%
		grasos de hígado de rata
192294	AF059030	Canal de Na regulado por	++/+	96,70%	+/-	4,20%
		voltaje NaN de Rattus
		norvegicus
192199	D42137	Gen de anexina V de rata	+/++	95,00%	+/++	74,00%

TABLA 1 (continuación)

Clon ID	GB	Descripción	Neuronas pequeñas	Neuronas grandes
			de los DRG	de los DRG
				% de		% de
			Intensidad	Marcadas	Intensidad	Marcadas
192207	U16655	Fosfolipasa C delta 4 de	++	42,20%	-	0%
		Rattus norvegicus
191857	L00111	CGRP de rata	+++/++	83,70%	++/-	9,40%

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TABLA 2

192294	AF059030	Subunidad alfa de los canales de	161,34\pm20,07	51,3\pm12,99^{*}	3,15	0,0005
		Na regulados por voltaje NaN de
		Rattus norvegicus
192195	D86642	ARNm de rata para la proteína de	496,33\pm40,11	158,8\pm35,13	3,13	0,0005
		unión a FK506
192207	U16655	Fosfolipasa C delta 4 de Rattus	146,33\pm10,03	53,06\pm4,23	2,76	0,0005
		norvegicus
192163	X90651	Receptor P2X3 de R. norvegicus	390,28\pm10,4	164,81\pm26,22	2,37	0,0005
191858	S69874	C-FABP=proteína de unión a	448,26\pm30,01	196,97\pm18,68	2,28	0,0005
		ácidos grados cutánea [rata]
192139	D45249	Subunidad alfa del activador de	104,46\pm5,24	47,74\pm6,97^{*}	2,19	0,0005
		proteasomas rPA28 de rata
192178	L12447	Proteína de unión al factor de	288,97\pm8,47	141,67\pm5,61	2,04	0,0005
		crecimiento similar a insulina 5
		de Mus musculus
192306	X77953	Proteína ribosómica S15a de	415,77\pm54,08	204,19\pm25,03	2,04	0,005
		R. norvegicus
192129	M38188	Proteína humana desconocida	144,72\pm10,98	57,47\pm11,64^{*}	2,00	0,0025
		del clon pHGR74
192339		Nueva	83,94\pm6,26	42,42\pm7,75^{*}	1,98	0,001
191857	L00111	CGRP de rata	900,1\pm45,83	459,99\pm35,39	1,96	0,0005
192203	AF059486	Supuesta proteína de unión a	861,16\pm32,58	448,32\pm68,77	1,92	0,0005
		actina DOC6 de Mus musculus
192351	U25844	Inhibidor de serina proteinasa	271,95\pm30,44	142,81\pm6,93	1,90	0,0025
		(SPI3) de Mus musculus
191837	M29472	Mevalonato quinasa de Rattus	94,44\pm9,63	51,83\pm5,95^{*}	1,82	0,0025
		norvegicus
191628		Nueva	635,92\pm73,01	363,86\pm11,53	1,75	0,005
192175		Nueva	181,28\pm13,23	105,36\pm10,39	1,72	0,0005

TABLA 2 (continuación)

192284		Nueva	188,28\pm13	110,53\pm7,27	1,70	0,0005
192330	Y10386	Inhibidor de C1 de M. musculus	134,88\pm11,01	79,3\pm5,51	1,70	0,0005
		MMC1INH
192199	D42137	Gen de la anexina V de rata	439,57\pm13,62	265,21\pm14,97	1,66	0,0005
192011	M98194	Quinasa 1 regulada por señales	319,35\pm32,79	194,88\pm6,83	1,64	0,005
		extracelulares de rata
192206	U59673	Receptor de 5HT3 de Rattus	139,96\pm4,07	85,48\pm6,17	1,64	0,0005
		norvegicus
192167	U23146	SSeCKS de regulación mitogénica	456,44\pm13,34	300,71\pm23,25	1,52	0,0005
		de Rattus norvegicus
191848	M93056	Inhibidor de elastasa de monocitos/	125,16\pm14,76	82,56\pm15,38	1,52	0,05
		neutrófilos humana
192309		Nueva	463,17\pm45,37	308,05\pm25,45	1,50	0,01

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TABLA 3

PRI ID	GB	Descripción	Media\pmE.S.M.	Media\pmE.S.M.	Proporción	P
			(Pequeñas)	(Grandes)
192393	M25638	Proteína del neurofilamento	63,3\pm6,12	551,56\pm34,94	8,71	0,0005
		más pequeña de rata (NF-L)
191624	M14656	Osteopontina de rata	53,4\pm4,11^{*}	218,52\pm22,81	4,09	0,0005
192157	J04517	Neurofilamento de alto peso	475,86\pm18,59	1319,77\pm50,3	2,77	0,0005
		molecular de rata (NF-H)
192282	Z12152	Proteína mediana del	75,93\pm3,75	206,55\pm9,92	2,72	0,0005
		neurofilamento de R.
		norvegicus
192378	D87445	KIAA0256 humana	30,26\pm2,66^{*}	77,42\pm17,52	2,56	0,025
192283		Nueva	50,9\pm3,45^{*}	128,56\pm6,86	2,53	0,0005
192125	V00681	Genes mitocondriales de	186,5\pm14,61	445,82\pm23,95	2,39	0,0005
		R. norvegicus para 16S
		ARNr, ARNt
191851	X51396	Proteína asociada a	90,84\pm5,91	215,55\pm21,35	2,37	0,0025
		microtúbulos MAP1B de
		ratón
192424	M91808	Canal de sodio beta-1	83,99\pm7,93	194,88\pm20,61	2,32	0,0025
		de Rattus norvegicus
191862	S67755	hsp 27=proteína del golpe	144,74\pm10,14	265,94\pm19,44	1,84	0,0005
		de calor 12 [ratas, Sprague-
		Dawley)

TABLA 3 (continuación)

PRI ID	GB	Descripción	Media\pmE.S.M.	Media\pmE.S.M.	Proporción	P
			(Pequeñas)	(Grandes)
192016	L10426	Proteína relacionada con ets	43,85\pm1,89^{*}	80,04\pm7,16	1,83	0,0025
		81 de Mus musculus (ER81)
192228		Nueva	28,9\pm1,11^{*}	52\pm3,41	1,80	0,0005
192411	M21551	Neuromedina B humana	57,62\pm5,56^{*}	97,18\pm6,61	1,69	0,0005
192422		Nueva	110,06\pm11,78	168,52\pm12,14	1,53	0,0025

Ejemplo 1 Microdisección con Captura mediante Láser (LCM)

Se utilizaron en este estudio dos ratas hembra Sprague-Dawley adultas. Los animales fueron anestesiados con Metofano (Metoxiflurano, # de Catálogo 556850, Mallinckrodt Veterinary Inc., Mundelein, IL, EE.UU.) y sacrificados por decapitación. Utilizando condiciones libres de ARNasa, se extrajeron rápidamente por disección los ganglios de la raíz dorsal cervical (DRGs), se colocaron en criomoldes, se cubrieron con medio de inclusión de tejido congelado OCT (Tissue-Tek) y se congelaron en 2-metilbutano enfriado con hielo seco (\sim -60ºC). Los DRGs fueron posteriormente seccionados a 7-10 \mum en un criostato, montados en portaobjetos de microscopio limpios, sencillos (no revestidos) y congelados inmediatamente sobre un bloque de hielo seco. Las secciones fueron almacenadas a -70ºC hasta su uso posterior.

Se empleó una tinción rápida de Nissl (acetato de violeta de cresilo) con el fin de identificar las neuronas de los DRG. Esto se completó según sigue. Los portas que contenían las secciones fueron cargados rápidamente en un soporte de portas, fijados inmediatamente en etanol al 100% durante 1 minuto, seguido por rehidratación a través de etapas posteriores de etanol 95%, 70%, 50%, diluido en H_{2}O desionizada libre de ARNasa (5 segundos en cada uno). Posteriormente, los portas fueron teñidos con Nissl 0,5%/tampón acetato de sodio 0,1 M durante 1 minuto, deshidratados en etanoles de graduación progresiva (5 segundos en cada uno) y aclarados en xileno (1 minuto). Una vez secados al aire, los portas estaban listos para LCM.

Para la captura mediante láser se utilizó el Sistema PixCell II LCM™ de Acturus Engineering Inc. (Mountain View, CA). Siguiendo los protocolos del fabricante, se capturaron con láser 2 grupos de neuronas grandes y 3 grupos de neuronas pequeñas de los DRG (1000 células por grupo). Los criterios para las neuronas grandes y pequeñas de los DRG son según sigue: una neurona de los DRG era clasificada como pequeña si tenía un diámetro < 25 \mum más un núcleo identificable, mientras que una neurona de los DRG con un diámetro > 40 \mum más un núcleo identificable era clasificada como grande.

Ejemplo 2 Extracción de ARN de las Muestras de LCM

El ARN total fue extraído de las muestras de LCM con el kit "Micro RNA Isolation Kit" (Stratagene, San Diego, CA) con algunas modificaciones.

Brevemente, después de incubar la muestra de LCM con 200 \mul de tampón desnaturalizante y 1,6 \mul de \beta-ME a temperatura ambiente durante 5 minutos, la muestra de LCM fue extraída con 20 \mul de acetato de sodio 2 M, 220 \mul de fenol y 40 \mul de cloroformo: alcohol isoamílico. La capa acuosa fue recogida y mezclada posteriormente con 1 \mul de glucógeno portador 10 mg/ml, y precipitada con 200 \mul de isopropanol. Después de lavar con etanol 70% y de secar al aire, la pella fue resuspendida en 16 \mul de H_{2}O sin ARNasas, 2 \mul de tampón de reacción de ADNasa I 10X, 1 \mul de RNasin y 1 \mul de ADNasa I, incubada a 37ºC durante 30 minutos para eliminar cualquier contaminación con ADN genómico. A continuación, se repitió la extracción con fenol cloroformo igual que anteriormente. La pella fue resuspendida en 11 \mul de H_{2}O libre de ARNasas, 1 \mul de los cuales fue reservado y utilizado como control negativo para PCR de
transcripción inversa (control sin RT) y el resto (10 \mul) fueron procesados para RT-PCR y amplificación del ARN.

Ejemplo 3 Transcripción Inversa (RT) del ARN

La síntesis de la primera hebra fue completada mediante la adición conjunta de 10 \mul del ARN purificado anteriormente y 1 \mul del cebador T7-oligodT 0,5 mg/ml (5'TCTAGTCGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAG
GGCGT_{21}-3'). El cebador y el ARN fueron incubados a 70ºC durante 10 minutos, seguido por una incubación a 42ºC durante 5 minutos. A continuación, se añadieron 4 \mul de tampón de reacción de la primera hebra 5X, 2 \mul de DTT 0,1 M, 1 \mul de dNTPs 10 mM, 1 \mul de RNasin y 1 \mul de Superscript II (Gibco BRL) y se incubó a 42ºC durante una hora. A continuación, se añadieron 30 \mul de tampón de síntesis de la segunda hebra, 3 \mul de dNTPs 10 mM, 4 \mul de ADN polimerasa I, 1 \mul de ARNasa H de E. coli, 1 \mul de ADN ligasa de E. coli y 92 \mul de H_{2}O libre de ARNasas y se incubó a 16ºC durante 2 horas, seguido por 2 \mul de ADN polimerasa de T4 a 16ºC durante 10 minutos. A continuación, el ADNc fue extraído con fenol-cloroformo y lavado 3X con 500 \mul de H_{2}O en una columna Microcon-100 (Millipore). Después de ser recogido de la columna, el ADNc fue secado hasta 8 \mul para la transcripción in vitro.

Ejemplo 4 Amplificación con ARN Polimerasa de T7 (ARNa)

Se utilizó el Kit de Transcripción Ampliscribe T7 (Epicentre Technologies): 8 \mul de ADNc de doble hebra, 2 \mul de tampón Ampliscribe T7 10X, 1,5 \mul de cada uno de ATP, CTP, GTP y UTP 100 mM, 2 \mul de DTT 0,1 M y 2 \mul de ARN Polimerasa de T7, a 42ºC durante 3 horas. El ARNa fue lavado 3X en una columna Microcon-100, recogido y secado hasta 10 \mul.

Rondas Posteriores de Amplificación del ARNa

Se mezclaron 10 \mul del ARNa procedente de la primera ronda de amplificación con 1 \mul de hexámeros aleatorios a 1 mg/ml (Pharmacia) a 70ºC durante 10 minutos, se enfriaron en hielo y se equilibraron a temperatura ambiente durante 10 minutos; posteriormente se añadieron 4 \mul de tampón de la primera hebra 5X, 2 \mul de DTT 0,1 M, 1 \mul de dNTPs 10 mM, 1 \mul de RNasin y 1 \mul de RT II Superscript y se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos, seguido por incubación a 37ºC durante 1 hora. Posteriormente, se añadió 1 \mul de ARNasa H y se incubó a 37ºC durante 20 minutos. Para la síntesis de la segunda hebra de ADNc, se añadió 1 \mul del cebador T7-oligodT 0,5 mg/ml y se incubó a 70ºC durante 5 minutos y a 42ºC durante 10 minutos. A continuación, se añadieron 30 \mul de tampón de síntesis de la segunda hebra, 3 \mul de dNTPs 10 mM, 4 \mul de Polimerasa I, 1 \mul de ARNasa H de E. coli, 1 \mul de ADN ligasa de E. coli y 90 \mul de H_{2}O libre de ARNasas y se incubó a 37ºC durante 2 horas. Posteriormente se añadieron 2 \mul de ADN polimerasa de T4 a 16ºC durante 10 minutos. La doble hebra de ADNc fue extraída con 150 \mul de fenol cloroformo para eliminar las proteínas y purificada con una columna Microcon-100 (Millipore) para separarla de los nucleótidos no incorporados y de las sales. El ADNc está listo para una segunda ronda de transcripción in vitro con T7 igual que anteriormente y luego para una tercera ronda posterior de amplificación del ARNa.

Ejemplo 5 Diseño de las Microseries

Los ADNcs presentes en el chip fueron obtenidos a partir de dos experimentos separados de presentación diferen-
cial^{21}. En primer lugar, llevamos a cabo una selección para clonar los ARNms expresados preferencialmente en los DRG frente a los expresados en el cerebro, el riñón y el hígado. En segundo lugar, se realizó un proceso de selección para identificar/clonar los ARNms con una concentración disminuida o incrementada en los DRGs lumbares 5 y 6 ipsilaterales ("tratados") que fueron fuertemente ligados distalmente al ganglio de la raíz dorsal (modelo de "Chung"^{22}) frente a los DRGs lumbares 5 y 6 contralaterales ("control").

Impresión de las Microseries

Se imprimieron 477 clones en el vector PCR 2.1 procedentes de nuestros estudios previos de presentación diferencial (según se describió anteriormente) en portas sililados (CEL Associates). Los ADNcs fueron amplificados por PCR con cebadores unidos al amino 5' y purificados con kits "96 PCR Purification Kits" de Qiagen. Las manchas impresas tenían 125 \mum de diámetro aproximadamente y estaban separadas 300 \mum de centro a centro. Se imprimieron también 30 genes de plantas en los portas como control de la hibridación no específica (donación de Mark Schena).

Ejemplo 6 Síntesis de las Sondas para las Microseries

Se sintetizaron sondas de ADNc marcadas con Cy3 a partir del ARNa de los DRGs LCM con el sistema "Supercript Choice System" para la síntesis de ADNc (Gibco BRL). Brevemente, 5 \mug de ARNa y 3 \mug de hexámeros aleatorios fueron mezclados en un volumen total de 26 \mul (conteniendo H_{2}O libre de ARNasas), se calentaron a 70ºC durante 10 minutos y se enfriaron en hielo. Posteriormente se añadieron 10 \mul de tampón de la primera hebra, 5 \mul de DTT 0,1 M, 1,5 \mul de RNasin, 1 \mul de d(GAT)TP 25 mM, 2 \mul de dCTP 1 mM, 2 \mul de Cy3-dCTP (Amersham) y 2,5 \mul de RT II Superscript y se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos y posteriormente a 37ºC durante 2 horas. Para degradar el ARNa molde, se añadieron 6 \mul de NaOH 3 N y se incubó a 65ºC durante 30 minutos. Posteriormente se añadieron 20 \mul de Tris-HCl 1 M pH 7,4, 12 \mul de HCl 1 N y 12 \mul de H_{2}O. Las sondas fueron purificadas con columnas Microcon-30 (Millipore) y posteriormente con Columnas para la Extracción de Nucleótidos de Quiagen. Las sondas fueron secadas al vacío y resuspendidas en 20 \mul de tampón de hibridación (SSC 5X, SDS 0,2%) conteniendo ADN de Cot1 de ratón (Gibco BRL).

Hibridación con las Microseries y Lavados

Los portaobjetos de vidrio impresos fueron tratados con una solución de borohidrato de sodio (NaBH_{4} 0,066 M, Na Ac 0,06 M) para asegurar el enlace amino de los ADNcs a los portas. Posteriormente, los portaobjetos fueron llevados a ebullición en agua durante 2 minutos para desnaturalizar el ADNc. Las sondas marcadas con Cy3 fueron calentadas a 99ºC durante 5 minutos, posteriormente se dejaron a temperatura ambiente durante 5 minutos y se aplicaron a los portaobjetos. Los portas fueron cubiertos con cubreobjetos de vidrio, sellados con DPX (Fluka) e hibridados a 60ºC durante 4-6 horas. Al final de la hibridación, los portaobjetos fueron enfriados hasta temperatura ambiente. Los portas fueron lavados en SSC 1X, SDS 0,2% a 55ºC durante 5 minutos, SSC 0,1X, SDS 0,2% a 55ºC durante 5 minutos. Después de un lavado rápido en SSC 0,1X, SDS 0,2%, los portas fueron secados con una corriente de aire y estaban listos para el escáner.

Cuantificación de las Microseries

Las microseries de ADNc (esto es, los portaobjetos de microscopio) fueron escaneados para detectar la fluorescencia de Cy3 utilizando el ScanArray 3000 (General Scanning, Inc.). Posteriormente se utilizó para la cuantificación el programa de ordenador ImaGene (Biodiscovery, Inc.). En total se procesaron 15 chips, con 3 chips/conjunto de neuronas (ver el texto). Brevemente, la intensidad de cada mancha (esto es, del ADNc) fue corregida sustrayendo el fondo circundante inmediato. Posteriormente, las intensidades corregidas fueron normalizadas para cada ADNc (esto es, para cada mancha) con la fórmula siguiente: intensidad (corregida por el fondo)/valor del percentil 75 de la intensidad del chip completo x 1000. Para determinar la hibridación "no específica" de los ácidos nucleicos, se calcularon los valores del percentil 75 de las medias individuales de cada ADNc de plantas (para un total de 30 ADNcs diferentes) de cada conjunto de neuronas. El valor total del percentil 75 para S1, S2 y S3 = 48,68 y para L1 y L2 = 40,94.

Análisis Estadísticos

Para determinar la correlación del valor de la intensidad para cada ADNc entre los grupos individuales de neuronas (por ejemplo, S1 frente a S2 en la Fig. 2B) o entre dos subtipos neuronales (por ejemplo, S1, S2 y S3 frente a L1 y L2 en la Fig. 2B), se utilizaron diagramas de dispersión y se midieron las relaciones lineales. El coeficiente de determinación, R^{2}, que fue calculado, indica la variabilidad de los valores de la intensidad en un grupo frente al otro.

Con el fin de determinar estadísticamente si los valores de intensidad medidos procedentes de la cuantificación de las microseries eran o no señales auténticas, se comparó cada intensidad, mediante un test t de una muestra, con el valor del percentil 75 de 30 ADNcs de plantas que estaban presentes en cada chip (que representaban la hibridación no específica de ácidos nucleicos). Los valores no diferentes significativamente del valor del percentil 75 están presentados en la Tabla 1 y 2 y así indicados. Para determinar qué ADNcs son estadísticamente significativos en su expresión génica diferencial entre las neuronas grandes y pequeñas, se agruparon las intensidades para cada ADNc de los grupos neuronales para las neuronas grandes (L1 y L2) y para las neuronas pequeñas (S1, S2 y S3) respectivamente y se hizo la media de los valores de la intensidad para cada ADNc correspondiente. Se utilizó un test t de dos muestras para hipótesis de una cola con el fin de detectar una diferencia en la expresión génica entre las neuronas pequeñas y las neuronas grandes.

Ejemplo 7 Hibridación In Situ

La hibridación in situ se llevó a cabo según se ha descrito previamente^{23}. Brevemente, los ADNcs fueron subclonados en pBluescript II SK (Stratagene) y linealizados, y se incorporó ^{35}S-UTP mediante transcripción in vitro con ARN polimerasa de T7 o T3. Las sondas fueron purificadas posteriormente con Columnas Quick Spin™ (Boehringer Mannheim). Las sondas (10^{7} cpm/sonda) fueron hibridadas a secciones de DRG de rata de 10 \mum fijadas en paraformaldehído al 4% que estaban montadas en portaobjetos Superfrost Plus (VWR). Después de hibridación durante una noche a 58ºC y de los lavados posteriores, los portaobjetos fueron expuestos a una película para obtener los datos primarios.

Posteriormente los portaobjetos fueron revestidos con una emulsión líquida NTB2 de Kodak y expuestos en cajas opacas durante 1-2 semanas a 4ºC. Los portaobjetos fueron revelados en un Revelador Kodak D-19, fijados en Fijador Kodak y teñidos con Nissl para el análisis de la expresión.

Bajo microscopía de campo claro, los niveles de expresión de ARNm de los ADNcs específicos fueron analizados semicuantitativamente. Esto se realizó según sigue: sin expresión (-, los granos eran < 5 veces el fondo); expresión débil (\pm, los granos eran 5-10 veces el fondo); expresión baja (+, los granos eran 10-20 veces el fondo); expresión moderada (++, los granos eran 20-30 veces el fondo); expresión potente (+++, los granos eran > 30 veces el fondo). El porcentaje de neuronas pequeñas o grandes que expresaban un ARNm específico fue obtenido contando el número de células marcadas (por encima del fondo) y de células no marcadas de las neuronas grandes o pequeñas de cuatro secciones (se contaron al menos 200 células).

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Claims (3)

1. Un método que comprende:

a) la selección y la fijación de células a un sustrato mediante microdisección con captura por láser, y el aislamiento de las células capturadas de las células restantes;

b) la extracción del ARN de las células capturadas aisladas y la amplificación del ARN;

c) la producción de ADNc a partir del ARN amplificado de la etapa b) y el marcaje del ADNc con una marca detectable para producir ADNc marcado;

d) la hibridación del ADNc marcado de la etapa c) con sondas de ADN sobre una microserie de ADN inmovilizado; y

e) la determinación de qué ADN inmovilizado en la microserie hibrida con el ADNc marcado, cuantitativamente y/o cualitativamente.

2. Un método que comprende:

a) la selección y la fijación de células a un sustrato mediante microdisección con captura por láser, y el aislamiento de las células capturadas de las células restantes;

b) la extracción del ARN de las células capturadas aisladas y la amplificación del ARN y el marcaje del ARN amplificado con una marca detectable para producir ARN amplificado marcado;

c) la hibridación del ARN amplificado marcado de la etapa b) con ADN inmovilizado en una microserie de ADN inmovilizado; y

d) la determinación de qué ADN inmovilizado en la microserie hibrida con el ARN amplificado marcado, cuantitativamente y/o cualitativamente.

3. Un método que comprende:

a) la selección y la fijación de células a un sustrato mediante microdisección con captura por láser, y el aislamiento de las células capturadas de las células restantes;

b) la extracción del ARN de las células capturadas aisladas y la amplificación del ARN y el marcaje del ARN amplificado con una marca detectable para producir ARN amplificado marcado;

c) la producción de ADNc a partir del ARN amplificado de la etapa b) y el marcaje del ADNc con una marca detectable para producir ADNc marcado;

d) la hibridación del ARN amplificado marcado y/o del ADNc marcado con ADN en una microserie de ADN inmovilizado; y

e) la determinación de qué ADN inmovilizado en la microserie hibrida con el ARN amplificado marcado y/o con el ADNc marcado, cuantitativamente y/o cualitativamente.