JP4283350B2 - 赤血球凝集を分類するために使用されるカセット中の異常反応を検出する方法 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、赤血球分類のための凝集物の検出及び定量化の分野に関し、より詳細には、凝集に基づく適切な分類を妨害しうるもっとも一般的な異常反応を検出しフラグを立てる方法に関する。さらに、こうした反応の中にはその中に重要な診断上の情報を生じるものがある。
【０００２】
【従来の技術】
免疫凝集反応は血液型を特定し、血液試料及び他の水性媒体中の様々な抗体及び抗原を検出するために使用される。
【０００３】
従来の手順では、赤血球等の結合剤を伴う粒子が試験管またはマイクロタイター(microtiter)・プレート中で試料または試薬と混合された後、混合物が培養または遠心分離される。粒子表面及び試薬試料中に存在する抗原または抗体によって様々な反応が発生したりしなかったりする。通常、こうした反応は、凝集物と呼ばれる血球または粒子の塊となって現れる。すなわち、こうした塊がないことは反応が起こらなかったことを示し、こうした塊が存在することは反応が起こったことを示し、こうした塊の寸法と量は試料中の抗原または抗体のレベルまたは濃度の半定量的指標または、反応強度すなわち血液試料が試験された複合体の親和性の指標である。
【０００４】
最近、カラム凝集技術（ＣＡＴ）と呼ばれる新しい凝集分析法が開発された。この凝集試験方法は、免疫学的検定適用業務のために非反応性成分から凝集粒子を分離する手段として濾過を利用する。この方法では、抗ＩｇＧといった試薬と共に、ゲルまたはガラスビーズ微粒子が、マイクロカラム(microcolumn) と呼ばれる小さなカラムに収容されている。赤血球または結合剤を伴う粒子がカラムの上の反応室に配置される。遠心分離中、血球または粒子は試薬と混合され、カラム中で反応することがある。反応が発生すると、血球の一部またはすべては凝集し、遠心分離後ビーズ領域に捕らえられる。反応が発生しなければ、非凝集血球は遠心力によってカラムの底部に移動する。その結果、遠心分離後のマイクロカラム中の粒子の性質と分布によって、反応発生の有無と、もし反応が発生した場合にはその反応の強度の視覚的指標が提供される。
【０００５】
従来、凝集反応は陰性（反応がない場合）または陽性（反応がある場合）に分類され、陽性の場合、反応はさらに、抗原抗体反応の強度によって＋０．５、＋１、＋２、＋３または＋４に分類されている。反応の性質が確実に分類できない場合、中間反応が与えられる。ＣＡＴ法では、凝集反応の分類はマイクロカラム中の赤血球の分布パターンによって決定される。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
米国特許ＵＳ−Ａ−５，５９４，８０８号では、正常反応と呼ばれる、上記の節で説明された凝集反応の種類を自動的に分類するシステムとソフトウェアが開示されている。このシステムとソフトウェアは多くの場合良好に動作する。しかし、時折、この発明の目的にとって異常と考えられる、赤血球との異なった種類の免疫反応が存在することがある。これには、次の反応が含まれる。
【０００７】
溶血反応：溶血反応では、赤血球の一部または全部が抗原抗体反応によって破壊される（溶血する）。血球が破壊されると、赤血球中のヘモグロビンが試験用試料中に放出され、液体の色が赤に変化する。
【０００８】
混合領域凝集：混合領域凝集では、赤血球の一部は凝集するが、残りの赤血球は凝集しない。これは試験用試料が２つの異なった個体の赤血球を含むことを示すが、これは検査以前の輸血や他の病理的状態によって発生することがある。
【０００９】
こうした反応や他の異常が、前述の第’８０８号特許で説明されたシステムとソフトウェアによる検出を妨害することがある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
私は第’８０８号特許で説明された検出を妨害する前述の異常等に対処する方法を考案した。
【００１１】
すなわち、赤血球凝集を分類するために使用されるカセット中の異常反応を検出する方法が提供されるが、この方法には、
ａ）患者の血液試料を凝集試薬と微粒子のカラムを備えたカセットに挿入するステップと、
ｂ）非凝集血球をカラムを通じて強制的に流すため、カセットを遠心分離する一方で、凝集血球をカラムの表示位置に保持するステップと、
ｃ）複数のピクセルを備えた検出器アレー上に、カラムと、カラムの内部及び周囲に分布する血球の画像を作成するステップと、
ｄ）アレー上の画像と既知の分類の凝集反応を表す画像の所定の分類とを相関させるステップと、
ｅ）ステップｄ）の前に、作成された画像中に、
ｉ）カラムまたはカラム中に作成された何れかのペレットの画像化された特徴を範囲外にする、ステップａ）、ｂ）またはｃ）の処理における誤り、
ｉｉ）ステップａ）で挿入された前記試料の溶血、
ｉｉｉ）カセット中に存在する血球の不足または過多、
ｉｖ）混合領域凝集、
ｖ）微粒子上部のフィブリンの存在、
からなるグループから選択された作成画像の何らかの異常がある場合その存在を検出するステップとが含まれる。
【００１２】
この方法の結果、上記の相関ステップｄ）の前に処理を中止し、望ましい場合試料の新しい部分標本についてすべての処理を繰り返すことが可能である。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明は以下ある好適実施形態に関連して説明されるが、この実施形態は好適な試薬の入った特定の形状と構成のカセットを利用しており、遠心分離の後赤血球凝集をある好適な種類に分類するために行われる。さらに、カラムまたはカセットの容器がここで特定された分類に対応する領域を有し、顕著な異常にフラグを立てるためにここで使用されるアルゴリズムに適合するならば、本発明は、カセットの形状または構成、カセット内の試薬、または遠心分離のあと使用される正常な凝集の分類と無関係に有益である。
【００１４】
米国特許第ＵＳ−Ａ−５，５９４，８０８号は本発明を実行する好適な処理システムとカセットを開示する。第’８０８号特許で説明されるように、好適な自動光学読み取りシステム１０は、一般に、保持手段１２、照明手段１４、画像形成下位システム１６及び処理下位システム２０を含み、好適にはシステム１０にはさらに、移送下位システム２２、保管手段２４、廃物受け２６及びバーコード読み取り器３０が含まれる。図１に示すシステム１０の実施形態では、保持手段１２には基部３２とフレーム３４が含まれ、照明手段１４には一組の蛍光灯と散光器（図示せず）が含まれる。画像形成下位システム１６にはピクセル・アレー４２、外被４４及びレンズ組立体４６が含まれる。また、好適な処理下位システム２０にはプリプロセッサ５６、主プロセッサ６０及びキーボード６２のような入力手段が含まれ、図１に示す好適な移送下位システムには支持手段６４と移送器６６が含まれる。
【００１５】
一般に、保持手段１２は分析のための試験用試料を保持するために提供され、照明手段１４は画像形成下位システム１６上の試験用試料の照明された画像を作成するために提供される。下位システム１６はそこに形成された照明された画像を表す信号の組み合わせを発生し、その後その信号を処理下位システム２０に伝送する。処理下位システムはこれらの信号を下位システム１６から受信し、これらの信号を所定のプログラムによって処理して、分析される試験用試料中に凝集パタンが存在するかを判断し、存在する場合、そのパタンを複数の所定の分類の１つに分ける。
【００１６】
ここで説明されるシステム１０の好適実施形態は血液試料の分析に特に適しており、こうした試料は溶液と呼ばれることが多い。本発明は尿のような他の水性溶液を含む他の材料を分析するシステムでも実現されることに注意すべきである。しかし、分析される材料が液体または流体である必要はなく、「溶液」という術語はここで使用される場合、液体または固体の何らかの混合物という一般的な意味で使用される。
【００１７】
さらに、システム１０で分析される試験用試料は好適には容器内に保持され、多様な種類と寸法の容器がシステム１０と共に使用される。しかし、ここで詳細に説明されるシステム１０の好適実施形態は、図２及び図３で８０として示される種類のカセット容器と共に使用するのに特に適している。以下カセットと呼ばれるこれらの容器は透明な一体成形プラスチック材料製である。カラムまたはマイクロカラムと呼ばれる、図２の多数の空隙または受け８２がカセット内に形成されてカセットの上端８４から下向きに延びており、例えば、図２及び図３に示すカセットは６つのこうしたマイクロカラムを収容する。
【００１８】
１０〜１００マイクロメートル程度の大きさの直径を有する多数の非常に小さな透明ガラスビーズ９０が各マイクロカラムの下部部分に沈殿しフィルタを形成する。また、各マイクロカラムの下部部分が同じ一般的方法で微粒子として機能する適当なゲルを備えていることがある。試薬はカセットのカラムにあらかじめ分配され、カセットのカラムが望ましい材料を備えた後、箔が通常カセットの上端８４に固定され、カラム８２の上部を覆い閉鎖する。
【００１９】
何らかの特定のカセット８０が使用される場合、カセット中の１つ、数個またはすべてのマイクロカラム８２が使用される。さらに、各カセットは１人またはそれ以上の個体の血液試料と共に使用される。使用される各マイクロカラム内では、赤血球の試料と既知の作因と反応する１つかそれ以上の試薬がマイクロカラムに分注され、その１つかそれ以上の作因の存在について血液試料が試験される。カセットは培養された後遠心分離される。血液試料が試験される対象の作因がマイクロカラム中に存在する場合、作因は赤血球と反応して凝集物を形成し、マイクロカラム中の凝集物の数、寸法及び分布はその反応の強度の指標となる。
【００２０】
再び図１を参照すると、好適には一組の蛍光灯を備えた照明手段１４は移送器６６によって画像形成下位システム１６、とりわけピクセル・アレー４２の上に保持された試験用試料に光を向け、ピクセル・アレーは試験用試料を表す一連の信号を発生する。より詳細には、ピクセル・アレー４２はカメラ外被４４の内部に配置され、ピクセル・アレーは好適には多数の光センサからなり、その各々がセンサに入射する光の強度に比例するかまたはそれを表す大きさを有する対応する１つの電流を発生することができる。好適には、これらの光センサ、すなわちピクセルは、所定の数の均一な間隔を有する行と列の均一な格子に配置される。
【００２１】
当業技術分野に普通に熟練した者に理解されるように、任意の適当な光源１４、レンズ、フィルタ及びカメラ４４がシステム１０で使用される。例えば、実行するために修正されたシステム１０の実施形態では、カメラ４４はＳｏｎｙ ＸＣ−７５ＣＥビデオカメラであり、このカメラのピクセル・アレーまたはセンサ・エレメントは、７５２ピクセル×５８２ピクセルの矩形配列のピクセルのマトリックスを含む電荷結合素子（ＣＣＤ）である。カメラとフレーム３４に保持されるカセットの間の距離は、ピクセル・アレーの各画像がカセットの２つのカラム８２を含み、画像中の各カラムの幅が１４０ピクセルとなるように調節された。
【００２２】
Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって製造されるＣｏｍｐｏｎｏｎマイクロレンズが、Ｆ／４．０のＦ絞りに設定され、アダプタを介してカメラに取り付けられた。レンズとＣＣＤエレメントの間には中心波長５５０ｎｍ、帯域幅４０ｎｍの帯域通過フィルタが固定された。このフィルタは赤血球の画像を強調し信号対雑音比を改善するが、このフィルタは、赤血球が対応する波長範囲で光の吸収を増大させることを示す分光光度計測定に基づいて選択された。
【００２３】
第’８０８号特許でより詳細に説明されるように、プロセッサ６０は、画像プロセッサ中に保存されたデータ数値を処理及び分析し、分析された試験用試料中に凝集パタンがある場合それを特定するようプログラムされている。
【００２４】
好適には、主プロセッサは、キーボード６２と端末（図示せず）をも有するパーソナル・コンピュータであるか、またはその構成部分である。キーボード６２はプロセッサ６０に接続され、操作員によるプロセッサへの入力を可能にしており、端末はプロセッサに入力されたデータまたはメッセージを視覚的に表示するために使用される。さらに、モニタがプロセッサ５６に接続されプロセッサまたは画像プロセッサ５６に保存されたデータ数値からビデオ画像を生じる。例えば、Ｓデータ数値がモニタに伝送され、そこにピクセル・アレー４２上で発生した実際の画像の画像を生じる。他の組み合わせのデータ数値がモニタに伝送され、実画像の改良または処理された画像を生じる。プリンタがプロセッサ６０に接続され、プロセッサからプリンタに伝送される選択されたデータ数値の視覚的で永久的な記録を提供することがある。
【００２５】
当業技術分野に普通に熟練した者に理解されるように、下位システム２０が、操作員または分析者によるプロセッサ５６及び６０との対話を可能にする他の、または追加の入力または出力装置を備えることがある。また、下位システム２０の個々の構成部分は従来の、当業技術分野に普通に熟練した者に周知のものである。
【００２６】
保管手段２４が保持手段１２に隣接して配置され、多数の試験用試料を保持するために提供されており、好適には、ステップ・モータのような割り出し手段が提供され、一連の位置を通じて保管手段を移動させて内部に保持された各試験用試料を保持手段と位置合わせする。図１に示す保管手段２４はカセット８０を保持するために特に設計されており、保管手段はこれらのカセットを保持する多数のチャネルまたは溝２４ａを形成する。割り出し手段はこの保管手段２４を移動させて各チャネル２４ａとカセット移送器６６を位置合わせし、カセットが保管手段からフレームにスライドできるようにする。
【００２７】
好適には、各カセット８０はそのカセットに関する選択されたデータを特定するバーコード８６を備え、バーコード読み取り器３０が提供されて各カセットのバーコードを読み取り、そのデータをプロセッサ６０に伝送する。例えば、カセットのバーコードはカセットの種類、カセットの製造日付及びカセットの推奨有効期限を特定する。バーコードにはカセットの製造者と製造時期及び場所を特定する他のデータが含まれることがある。図１に示すように、標準バーコード読み取り器であるコード読み取り器は好適には保管ラック２４と移送器６６の間に配置されているので、読み取り器は、カセットが保管ラックからピクセル・アレー４２の前の位置に移動する際に各カセットのバーコードを走査する。必要に応じて、バーコード８６がすべての選択されたデータを正確に特定しない場合、システム１０はそのカセット８０からの画像データを処理しないように操作することができる。例えば、これはピクセル・アレー４２上にそのカセットの画像を形成しないようにすることや、画像が形成される場合はその画像を処理しないようにすることによってなされる。
【００２８】
システム１０の動作中、多数の試験用試料がカルーセル２４に配置され、カルーセルは回転して選択された１つの溝２４ａと移送器６６を位置合わせする。その後、移送器６６がその選択されたカルーセルの溝の試験用試料をピクセル・アレー４２前面の望ましい位置にスライドさせた後、照明手段１４が光のビームを試験用試料を通じてピクセル・アレー４２に向ける。移送器６６はその基部３２が回転し、カセットの反対側が画像化されるようにする。カセットの位置はカラムの位置を検出することによって決定される。個別の位置決め記号は必要ない。
【００２９】
他の処理の詳細は第’８０８号特許に見られる。
【００３０】
正常な凝集反応は次の種類の反応、すなわち陰性、陽性（＋０．５、＋１、＋２、＋３、＋４）と中間反応に分類される。第’８０８号特許で開示されるように、反応読み取りの処置には、画像収集、カラム検出、特徴抽出及び反応等級分けのステップが含まれる。画像処理ルーチンによる特徴抽出の完了後、反応パタンに関連する特徴の組み合わせが各カラムについて計算される。こうした特徴は、輝度基準値と共に反応分類プログラム（分類器）に入力され、反応分類器はこれらの特徴数値を上記の反応分類の１つに変換する。
【００３１】
〔本発明〕
問題は、第’８０８号特許のシステムとソフトウェアによる上記の分類の達成を妨げる異常反応が存在することである。それには上記の背景と概要で示した異常反応が含まれる。こうした異常反応を処理するために、特にカセット８０のカラム８２に関連してある術語が特定された。こうした術語とカセットに関する位置が以下表１に示される。

【００３２】
陰性部分は非凝集血球のペレット９４がある場合それを含む部分である。図６に示すように、ペレット９４は画像化される時、ペレットの上部表面９８の検出された画像の最適適合直線である「傾斜」直線９６に割り当てられる。コンパイルする際の便宜のために、「傾斜」は逆正接数値として、すなわち次の等式によって表される。
【００３３】
「傾斜」＝１０００・ｔａｎ（θ）、ここでθは図６に示すような直線９６の角度であり、１０００は「傾斜」をコンピュータによってより容易に扱われる整数値にするための係数である。次に直線９６は、画像の各ピクセルを見る時、そのピクセルの実際の表面９８から図６で「偏差」と書かれた距離だけ外れている。
【００３４】
さらに、カラムの下半分は図７で、「Ｂ左」領域と「Ｂ右」領域に分割される。
【００３５】
図４〜図７について示した術語に加えて、定義が必要な以下の派生的な術語が存在する。
【００３６】
第１に、画像から得られる輝度伝送測定の多くは、「前面」と「背面」の画像の結果の合計である。ここで「前面」と「背面」とは、各カラムが初め図３の１つの側面８１Ａをカメラに向け、次にもう１つの面８１Ｂをカメラに向けて２回画像化されることを意味する。そのどちらが実際に「前面」であるかは全く恣意的であるが、同じ申し合わせがすべてのカセットについて継続される。
【００３７】
すなわち、ここで使用されるように、「上変化」は、「前面上変化」と「背面上変化」の合計であるが、ここで後の２つの術語はそれぞれ、「上」領域のカラムの前面画像の液体輝度変化と、「上」領域のカラムの背面画像の液体輝度変化を意味する。ここで「液体輝度変化」とは各ピクセルの実際の輝度の標準偏差を意味し、より詳細には、次の公式によって計算された数値を意味する。
【数１】

ここでＩmeanは対象領域中の全ピクセルの平均輝度であり、Ｉactualは所定のピクセルの実際の輝度であり、Ｎは対象領域中のピクセルの合計数に等しい。
やはりここで使用されるように、「残余」は「前面残余」と「背面残余」の合計であるが、これらの各々は、次の公式
【数２】

によって測定され、上記で説明したように、それぞれ前面と背面から画像化された各ピクセル（図６）の実際のペレット表面９８からの直線９６の偏差の平方根である。
【００３８】
すなわち、要約すると、第’８０８号特許で説明されたように、反応読み取り手順には画像収集、カラム検出、特徴抽出及び反応等級分けの各ステップが含まれる。カセットの前面及び背面からの画像が共に分析される。画像処理の完了後、ソフトウェア・ルーチンは各々前面及び背面から見た各受けに関連する２組の特徴データを出力する。分類を開始する前に、前面及び背面の画像からの２つのデータの組み合わせは１つのベクトルに結合される。この結合操作は、以下説明される計算で使用される以下の主要な術語の各々について２つの画像の同じパラメータを加算するものである。

【００３９】
結合された特徴データはその後反応分類ルーチンへの入力として使用されるが、このルーチンはこれらの数値を使用して異常発生の有無を判断する。
【００４０】
〔検出された異常〕
以下の議論は、試験される特定の異常と共に、その存在を確認するために使用される計算のステートメント及びそれらの計算の正当化に関する。特定の誤りと特定の計算が検出にとって好適であるが、他のものも利用されることが容易に明らかとなる。例えば、数値制限は部分的に使用される装置の関数であり、装置の何らかの変化が数値制限の変化に帰結することがあるが、それらは当業技術分野に熟練した者によって容易に確認される。
【００４１】
一般に、実際の計算は、多数のカセット内に様々な程度の顕著な異常を人工的に発生させることによってか、またはある条件を有することがわかっている患者からの試料を選択し、そのカセットの特定のカラムがその異常を証明することを視覚的に評価する専門家にそれらのカセットを提出することによって得られた。必ず「異常」であるように規定されたこれらのカセットは信号処理装置に送られ、異常な特徴を有さない「正常」な試料と異なっているものとしてこれらの異常にフラグを立てるためにどのような数値制限を確立する必要があるかが確認された。
【００４２】
例えば、「存在する血球の不足」の異常では、１０μＬが正常値の場合、例えば、１μＬ、３μＬ、５μＬ、７μＬ及び１０μＬといった様々な量を含む多数のカラムが専門家に与えられた。専門家は３μＬ以下の血球を「不足」と判断した。その量を含むカラムが処理され、３μＬ以下のものにだけフラグを立てるようアルゴリズム（以下説明する）が調節された。
【００４３】
以下は検出された特定の異常である。
【００４４】
〔範囲外データを発生する処置中の誤り〕
試験処置または画像形成の際の誤りは非常に不規則な画像を生じるので、「正常」な試料中に観察される画像のデータベースに適合しないことがある。すなわち、こうした「範囲外」画像はカラム中の検出された血球の分布、詳細には左右の変化及びカラムの底部に形成される血球のペレットの形状に存在しやすい。
【００４５】
左右血球分布の不適切な変化を判定するために、コンピュータは血球バランス＝｜Ｂ左−Ｂ右｜を計算する。次にコンピュータはこの新しい術語を、上記で定義された「傾斜」及び「残余」という術語と同様次の式で使用する。
【００４６】
（血球バランス＞３６００）または（傾斜＞４５００）または（残余＞２０００）ならば、試験は「範囲外」でありそのカラムの反応は終了する。
【００４７】
この正当化は以下の通りである。図７で、「Ｂ左」と「Ｂ右」を比較する場合大きな不均衡があってはならない。血球バランスの読み取り値が３６００を越える不均衡は、その画像がデータベースの「正常な」試料に遭遇しなかったことを意味し、処理の際の誤りが考えられる。
【００４８】
また、ペレットの形状もあるパラメータの範囲内にある必要がある。「傾斜＞４５００」は、図６で角度θが６６°を越える傾斜を意味する。「残余＞２０００」は直線９６の上下の表面９８の偏差が正常に発生する偏差を越えていることを意味する。「傾斜」または「残余」（偏差）のどちらかがこれらの境界を越えている場合、プログラムは中止され、分類ステップが起こりうる誤った結果を生じないようにする。
【００４９】
〔試料の溶血〕
周知の通り、赤血球の溶血があるとヘモグロビンが放出され、試料液体の全体が赤くなるが、これは一般に遠心分離段階によって影響されない。溶血はまた画像化される血球の量を減少させる。
【００５０】
従って、信号処理装置は特に「上」、「外」、「上変化」に注目し、コンピュータは２つの派生的な術語を計算する。
【００５１】
１つは「比」であり、次の公式を使用する。
比＝上／外。
【００５２】
もう１つは「血球量」であり、次の公式を使用する。
（Ａ）血球量＝陽性部分＋陰性部分＋（ゾーン１＋ゾーン２＋ゾーン３）／３
【００５３】
この等式は以下のように使用される。
（比＜０．７５）かつ（比・血球量＜１０００）かつ（血球量・上変化＜２０，０００）ならば溶血が考えられ、その種類の血液の分類処理はこの異常のために終了する。
【００５４】
この正当化は以下の通りである。ヘモグロビンが「上」領域の液体の色を暗くするので、その領域で検出された輝度が低下する。しかしそれは図４の「外」領域の画像輝度を低下させることはない。よって比を測定する。専門家による上記で説明された経験的試験によって、０．７５のカットオフ「比」が生じた。
【００５５】
プラズマ中の光学濃度の変化のためこれだけでは十分ではない。本来の溶血は血球量も低下させる。しかし、血球量自体も試料赤血球の濃度と当初カラムに加えられた量の正常な変化のために変化することがある。さらに、血球量はすべてのが増加された量の合計ではなく好適にはゾーン１、ゾーン２及びゾーン３の平均値の合計であるが、それはそうしないとこれらのゾーンが血球の量に不適当に影響する傾向があることが発見されたからである。すなわち、このように定義された血球量をアルゴリズムに適用する際、処理された数は経験的に決定された限度に対して照合される前に「比」によって、また第２の経験的に決定された限度に対して照合される前に「上変化」（液体輝度の変化）によって掛け算される。すなわち、「比」と共に液体輝度変化が低下することが発見されて初めて、「血球量」の低下が溶血の正確な前兆であると確実に言える。（大きな液体輝度の変化は血液凝固といった状態の特徴であるので、等式は２０，０００未満に設定されている。）また、比の低下、血球数と比の積の低下、血球数と液体輝度変化の積の低下という３つの個別の条件が発生することが好適であることが発見された。
【００５６】
溶血状態は正常な試験を妨害する異常であるだけでなく、有益な診断上の情報を示すことが認識される。
【００５７】
〔空きカラム試験〕
概念上、この試験は以下説明される「血球の不足」の下位集合である。すなわち、この試験は、ゼロより多いがカットオフ値（定格要求が１０μＬの場合３μＬ）より少ない値を検出するよう設定されるが、カラム中に血球が存在しない場合も異常フラグを作動させる。
【００５８】
〔存在する血球の不足／過多〕
不足した試料または多すぎる試料は明らかに処置の誤りである。どちらの極端な数値も検出し除去する必要がある。このため、コンピュータは上記で溶血について得られた血球量の条件を再び照合し、以下のように修正された血球量’を計算する。血球量’＝（陽性部分／２）＋陰性部分＋（ゾーン１＋ゾーン２＋ゾーン３）／３。これから次の計算が導かれる。
【００５９】
（血球量＜８００）ならば、血球数不足が存在し、そのカラムの血液分類処理は終了する。
【００６０】
（血球量’＞７０００）ならば、血球数過多が存在し、そのカラムの血液分類処理は終了する。
【００６１】
正当化としては、上記の限度と血球数’の使用は経験的試験から得られる。いくつかの理由によって、陽性部分は必ずしも異常でないのにかなり多いことがある。そこで２で割り算することが行われる。
【００６２】
〔混合領域凝集またはフィブリンの試験〕
以下簡単に「混合領域」と呼ばれる混合領域凝集は、計量し試験することが断然困難な異常である。実際、それは現在非常に困難なので、微粒子の上部からフィブリンの機械的除去を試み、それによってそれが混合領域の存在でなくフィブリンであることを確認する以外には、混合領域の存在とフィブリンの存在をフラグを立てて分類することはできない。
【００６３】
当業技術分野で理解されるように、混合領域とは１つより多い種類の血液分類が存在することを意味する。その例には血液循環に胎児の血球が含まれる女性が含まれる。こうした血液は「混合領域」として分類される。血液銀行は、明らかな理由からこうした血液が潜在的に献血されることを除去しようと熱心に努力している。すなわち、その検出は本質的で、非常に重要なので、フィブリンが同じ結果を生じ完全に許容できるという事実だけでも試験を停止しその結果を報告するには十分である。
【００６４】
検出の困難は、混合領域は視覚的にいくつかの正常な種類の凝集の特性をある程度有しているという事実から明らかである。一般に、「混合領域」は、（ペレットを形成する）カラム底部の血球の過多及び、前記微粒子の上部と前記底部の間のカラムの部分で検出される血球の不足と共に、カラムの微粒子の上部またはその近くに血球の過多が存在することによって決定される。これは、正常な＋４反応が前記上部またはその近くでは多数の血球の凝集を生じ、正常な陰性反応が底部のペレットで多数の非凝集血球を生じ、正常な＋２が（一部は上部、一部は底部、そして最も重要なことだが、一部はその間に）血球を分布させることから理解される。すなわち、上部と底部の両方で多数の血球が画像化され、中間で不十分な結果はおそらく混合領域である。
【００６５】
図８及び図９は混合領域の性質をよりよく例示する。すなわち、図８の受け８２が混合領域反応（またはフィブリン）の範囲を例示する一方、それと比較して、図９の受け８２は、図８に示す範囲を一括する２つの「正常」反応を例示する。
【００６６】
すなわち、図８の受け８２Ａは、陽性部分１００に集まった多量の凝集物を有するが、これは図４で部分９０として示された微粒子の上部表面である。（微粒子は図８及び図９では点で示していないので、血球が特定できる。）この受けを混合領域にしているのは、非凝集血球の、１０２での小さいが重要な陰性部分の集まりが存在することである。これは１００での画像によれば＋４の混合領域であり、１０２での画像によればゼロの混合画像である。
【００６７】
受け８２Ｂは８２Ａと同様であり、唯一の相違は１０２では陰性部分の集まりが非常に大きいことであるので、ここでも結果は（４／０）の混合領域反応として分類される。
【００６８】
受け８２Ｃ及び８２Ｄでは、初めて、領域１００及び１０２（陽性部分及び陰性部分）と同様図５のゾーン１、ゾーン２及びゾーン３に及ぶ領域１０４で小さな赤血球凝集物の分布が見られる。領域１０４でのこの分布は、試料は＋３であるが、陰性部分（領域１０２）のかなりの量がゼロ分類であること、別言すれば混合領域反応であることを示す。（受け８２Ｄは、８２Ｄでは１０２の非凝集物の集まりが８２Ｃより大きいことで受け８２Ｃと異なっている。
【００６９】
受け８２Ｂはフィブリンの例でもあることが認識される。すなわち、領域１００での暗色の外観は微粒子の上部のフィブリンによって引き起こされたものであるが、これはそれがなければゼロ分類反応である。とにかく、視覚的または自動的な判定では混合領域かフィブリンかを区別することはできない。
【００７０】
比較すると、領域１００に凝集物が顕著に存在し、領域１０２に有意の血球が存在しないこと（陰性部分）によって示されるように、図９の受け８２’は正常な＋４反応を示す。これを図８の受け８２Ａと比較されたい。同様に、受け８２’’は、すべての血球が領域１０２に遠心分離されて集まったため、正常ゼロ分類である。受け８２’’の破線１００’は、微粒子の上部表面の位置を示すためにだけ存在している。１００’には血球は存在しない。
【００７１】
本発明の方法は、例えば図９に示す条件と比較して、図８のすべての条件を異常であるとして区別することができ、試験の終了を要求する。
【００７２】
すなわち、混合領域またはフィブリンの存在を判定するために、コンピュータは以下の計算を行う。
（ｉ） （陰性部分＞３００）でありかつ
（ｉｉ） （陽性部分＞２６０）または（ゾーン１＞１２００）でありかつ
（ｉｉｉ） （ゾーン２＜５００）または（ゾーン２＜０．３３・（陽性部分＋ゾーン１）かつゾーン２＜（１．５・陰性部分）ならば、
混合領域またはフィブリンが存在し、このカラムを使用する分類は終了する。
【００７３】
正当化は上記の計算の部分（ｉ）及び（ｉｉ）については容易に明らかになる。すなわち、これら２つから、大きなペレットが形成され、大きな凝集が上部に形成されていることが推定される。部分（ｉｉｉ）からは、中間に有意の血球が存在しないことが推定され、そこからゾーン２の測定がもっとも信頼できることがわかる。すなわち、ゾーン２がある無名数より小さいか、または微粒子の上部部分（陽性部分及びゾーン１）の分数より小さいならばそれは疑わしい。さらに、その減少した内容もまたペレット量（陰性部分）のある定数（ここでは１．５）倍より小さいことだけでも疑わしい。
【００７４】
上記のように、この条件のフラグは分類を停止するが、もし停止しなければ分類はこのカセット・カラムと第’８０８号特許のハードウェア及びソフトウェアを使用して進められる。しかし、本発明によってフラグを立てられるすべての異常について言えるように、ユーザはここで停止する必要はない。また、同じかまたは別のカセットの新しいカラムが使用され、問題の血液と同じ供給源から得られた新鮮な部分標本について試験が繰り返されることがある。例えば、「混合領域／フィブリン」のフラグの場合、再試験の結果異常反応が示されないことがあるが、これは第１の結果がフィブリンのためであったという蓋然的な結論に導かれる。「混合領域」と異なって、条件が正当にフィブリンの存在だけだったならば、問題の血液が血液銀行に適さないという理由はない。
【００７５】
〔例〕
以下の作業例は網羅的なものではなく、単に上記で説明された実施形態を例示するために提示される。各場合において、オーソ・ダイアグノスティック・システム社(Ortho Diagnostic System Inc.)から“Ｏｒｔｈｏ ＢｉｏＶｕｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ”の商標で入手可能な６カラム・カセットが、上記の第’８０８号特許で説明された装置とソフトウェアを使用して試験された。
【００７６】
〔例１−溶血反応〕
故意に溶血させた試料が試験のために“Ｏｒｔｈｏ ＢｉｏＶｕｅ”カセットに挿入された。表ＩＩは検出された実際の輝度の数値を示す。

ここから、「比」が次のように計算された。
（前面上＋背面上）／（前面外＋背面外）すなわち（７９＋８２）／（２３８＋２３８）＝１６１／４７６＝０．３３８。
血球量（上記の公式（Ａ）を使用する）＝
（０＋４）＋（６０６＋６２２）＋［（０＋０）＋（１７＋０）＋（５４＋０）］／３、
すなわち１２３２＋７１／３＝１２５５．７。
上変化＝
前面上変化＋背面上変化＝
４．５７＋６．４２＝１０．９９
試験の基準は、比＜．７５かつ
比・血球量＜１０００かつ
血球量・上変化＜２０００であるので、
上記の計算から
０．３３８は＜０．７５でありかつ
０．３３８・１２５５．７≡４２４は＜１０００でありかつ、
１２５５．７・１０．９９≡１３，８００は＜２０，０００となる。
３つの条件がすべて満たされたので、この試料は溶血としてフラグを立てられた。
【００７７】
〔例２−範囲外特徴〕
例１の結果は、上記で説明したように範囲外パラメータの存在の有無についても照合される。そのため、血球バランスが｜（８６＋３７）−（１５９＋５１）｜として計算されたので、血球バランス＝８７であった。血球バランス試験の基準は７３，６００であるので、答えは無である。
【００７８】
「傾斜」も照合され、「傾斜」＞４５００かが判定される。ここでは傾斜＝１１０＋６３＝１７３であり、＞４５００ではない。
【００７９】
最後に「残余」が照合され、残余＞２０００かが確認される。ここでは残余＝２０５＋１１１、すなわち３１６であり、＞２０００ではない。この例は範囲外ではない。
【００８０】
本発明を実行する際「範囲外」試験は最初に行われるが、それはもし範囲外ならば、溶血試験を行う必要はなく、コンピュータもそれを行わないからである。
【００８１】
〔例３−血球の不足〕
例１が繰り返されたが、今回はごく少ない血球が沈殿した、すなわちわずか３μＬの量だけが使用された。表ＩＩＩは検出された読み取り値とそれによる計算を示す。
表ＩＩＩ
特徴 前面 背面
陽性部分 ０ ０
陰性部分 ３１３ ４３５
ゾーン１ ０ ８
ゾーン２ ６ １６
ゾーン３ ０ ０
傾斜 ２７ １６
残余 ４３ ３６
Ｂ左 ２２ ５４
Ｂ右 ３２ ３８
ここから、血球の不足に関する計算が次の結果を生じた。［（０＋０）＋（３１３＋４３５）］＋０．３３・［（０＋８）＋（６＋１６）＋（０＋０）］、これは＝７５８であり、確かに＜８００である。従って、この結果は「血球の不足」としてフラグを立てられた。
【００８２】
〔例４−血球の過多〕
例１が繰り返されたが、今回は５０μＬの量を加えることによって故意に多すぎる量の血球が追加された。表ＩＶは検出された読み取り値とそこから行われた計算を示す。

血球の過多に関する計算を使用すると、０．５・（０＋０）＋（５３６５＋４６６５）＋０．３３・［（０＋２９）＋（０＋５５）＋（０＋０）］、すなわち≒１００５８であり、確かにこれは＞７０００である。従って、このカラムは血球の過多としてフラグを立てられる。
【００８３】
〔例５−混合領域凝集〕
例１が繰り返されたが、今回は追加された試料が、専門家によって視覚的に判定されるような混合領域反応を有することが知られている患者の試料から取られた。表Ｖは検出された読み取り値の結果とそこから行われた計算を示す。

ここから、「混合領域」に関する計算が以下のようになされた。
（ｉ） 陰性部分＞３００か？
すなわち、（１３８１＋１６３６）≡３０００なので、これは＞３００である。
（ｉｉ） （陽性部分＞２６０）または（ゾーン１＞１２００）か？
すなわち、８６８＋６４４は２６０より大きいが、０＋０は１２００より大きくない。
従って、２つのうち第１の条件は真である。
（ｉｉｉ） （ゾーン２＜５００）または（（ゾーン２＜．３３（陽性部分＋ゾーン１）かつゾーン２＜（１．５・陰性部分））か？ すなわち、（６＋０）は５００より小さいので、これは満足される。従って、（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）の３つがすべて満足されたので、このカラムは混合領域を有するものとしてフラグを立てられた。
【００８４】
〔ソフトウェア〕
従来のプログラミングが使用されてコンピュータをプログラムし、図１０の流れ図のステップを達成する際にそのコードが使用される。（これはステップ１００２からステップ１０３４まで、わずか２００行ほどのソースコードで容易に達成される。）すなわち、ステップ１０００では、第’８０８号特許で説明されたように、画像処理ソフトウェアから得られた結果がプロセッサ６０の分類プログラムに入力される。次に、ステップ１００２では、上記で説明したように、コンピュータがカラム画像の範囲外特徴を生じる処理上の誤りを照合する。こうした誤りの１つが検出されると、ステップ１００４では、そのカラムはそのようにフラグを立てられ、その試料／カラムはそれ以上先の計算に進まない（ステップ１００６）。ステップ１００４でフラグが発行されない場合、次にコンピュータは、ステップ１０１０で、上記で説明したように溶血について照合する。溶血が検出された場合、カラムはステップ１０１２でそのようにフラグを立てられ、ステップ１０１４でそのカラムに関する処理は終了する。
【００８５】
次に、まだフラグが発行されない場合、コンピュータはステップ１０２０で、上記で説明したように、赤血球の量、すなわち、血球量の不足または過多の存在について試験する。どちらかの試験の結果が陽性である場合、ステップ１０２２で血球量が不適切であるというフラグが発行され（これは実際にどういう状態であるかについてより詳細であることもある）、ステップ１０２４でそのカラムに関する処理は終了する。
【００８６】
まだフラグが発行されない場合、コンピュータは次にステップ１０３０で、上記で説明したように混合領域／フィブリンについて試験する。この試験が陽性の場合、ステップ１０３２でそのカラムに関するフラグが発行され、そのカラムについてそれ以上の計算は行われない（ステップ１０３４）。
【００８７】
最後に、すべての異常試験が「陰性」であると仮定すると、コンピュータは分類ステップ１２００に進むが、これは試料が陽性グループ１２１０または「陰性」グループ１２１１の中に入るかを判定するステップを含む。試料が陽性グループの中に入る場合、第’８０８号特許で説明されたように、試料はさらにステップ１２１２で、＋１、＋２、＋３または＋４として分類される。試料が「陰性」グループの中に入る場合、試料はさらに、ゼロ、＋０．５または、図１０のステップ１２１４で「不定」として示される不定グループに下位分類される。
【００８８】
従って、コンピュータは好適には試験１０３０の前に、試験１０２０を行い、その前に試験１０１０を行い、その前に試験１００２を行う。最初に試験１００２を行う論理は容易に明らかである。すなわち、実験的に結果が範囲外ならば、以後の他の試験は無効であるというものである。また、試験１０１０は好適には試験１０２０または１０３０の前に行われるので、システムが試料に血球の不足というフラグを立てるかもしれない場合でも溶血状態は判明する。しかし、試験１０２０が１０３０の前に行われることは絶対に必要ではない。
【００８９】
【発明の効果】
第’８０８号特許の反応分類ルーチンが、上記の異常の存在によって誤った結果を出す可能性が減少することが、本発明の有利な特徴である。
【００９０】
さらに有利な特徴は、診断上有益な異常が検出され、結果として使用されることである。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明で使用される自動血液分析システムの概略図である。
【図２】本発明で使用されるカセットの前面図である。
【図３】本発明で使用されるカセットの側面立面図である。
【図４】本発明の処理で特定されるいくつかの領域のカセットでの配置を例示する、図２に示すカセットの一部分の切断部分概略図である。
【図５】本発明の処理で特定されるカセットのさらなる領域の配置を示す、図４の１つのカラムの拡大切断図である。
【図６】陰性部分領域のペレットを有し、本発明の処理で使用される別の術語を例示する、図５のカラムの底部部分の拡大切断図である。
【図７】図５と同様だが、本発明の処理で特定されるカセットのさらに別の領域を例示する切断図である。
【図８】本発明によって処理される際に実際に見られるカセット・カラムの切断図であり、混合領域凝集及び／またはフィブリン反応の例である。
【図９】本発明によって処理される際に実際に見られるカセット・カラムの切断図である。
【図１０】本発明のステップと、汎用コンピュータで本発明を実行するために使用されるアルゴリズムの流れ図である。
【符号の説明】
４２…ピクセル・アレー
８０…カセット
８２…カラム

Claims (1)

1. 赤血球凝集を分類するために使用されるカセット中の異常反応を検出する方法であって、前記方法が、
   ａ）患者の血液試料を凝集試薬と微粒子のカラムを備えたカセットに挿入するステップと、
   ｂ）非凝集血球を前記カラムを通じて強制的に流すため、前記カセットを遠心分離する一方で、凝集血球を前記カラムの表示位置に保持するステップと、
   ｃ）複数のピクセルを備えた検出器アレー上に、前記カラムと、前記カラムの内部及び周囲に分布する血球の画像を作成するステップと、
   ｄ）前記アレー上の画像と既知の分類の凝集反応を表す画像の所定の分類とを相関させるステップと、
   ｅ）前記ステップｄ）の前に、前記作成された画像中に、
   ｉ）前記カラムまたは前記カラム中に作成された何れかのペレットの画像化された特徴を範囲外にする、ステップａ）、ｂ）またはｃ）の処理における誤りであって、
   前記誤りは、前記カラムの半分と前記カラムの残りの半分を比較する時に、前記カラム中の血球の分布における異常に大きなアンバランスによって表される誤りと、前記ステップｂ）によって、前記カラムの底部に不適切に形成される血球のペレットによって表される誤りとを含み、
   異常である、前記不適切に形成されたペレットが、前記ステップｃ）によって検出された前記ペレットの上面に適合する線の傾斜と、前記適合する線と実際のペレットの下面との間の二乗平均平方根とによって確定される、ステップａ）、ｂ）またはｃ）の処理における誤りと、
   ｉｉ）前記ステップａ）で挿入された前記試料の溶血であって、
   前記溶血は、前記微粒子の上方の前記カラムの内側で画像化された液体輝度と前記カラムの外側の予め定めた領域において画像化された液体輝度の比と、前記血球量と、前記液体輝度の変化とによって計算され、前記変化は、平均輝度値からの、各ピクセルにおける前記輝度値の差の二乗平均平方根によって、計測領域で計測される、前記ステップａ）で挿入された前記試料の溶血と、
   ｉｉｉ）血球量を確定することによって検出されうる、前記カセット中に存在する血球の不足または過多であって、
   前記血球量は、前記微粒子の上側界面において画像化された血球と、前記カラムの底部における、あるならば、前記ペレットと、前記上側界面と前記ペレットの間の領域において検出された血球の平均の合計として計算される、前記カセット中に存在する血球の不足または過多と、
   ｉｖ）混合領域凝集、又は、前記微粒子上部のフィブリンの存在であって、
   前記異常ｉｖ）は、前記カラムの底部において存在する血球の過多と共に、前記カラムの微粒子の上部において又は前記上部近傍において存在する血球の過多と、前記上部と前記底部の間の前記カラムの部分において検出された血球の不足を検出することによって確定される、混合領域凝集、又は、前記微粒子上部のフィブリンの存在と、からなるグループから選択された作成画像の何らかの異常がある場合にその存在を検出するステップとを含む方法。

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