JP4273534B2 - ヘム蛋白質の安定化剤及び安定化方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヘム蛋白質の安定化方法に関する。このヘム蛋白質は、血清、血漿または尿中のヘム蛋白質の免疫学的測定方法の標準物質などに用いられる。
【０００２】
【従来の技術】
心筋梗塞などの心疾患、急性腎疾患において、診断及び治療方針を決定する上で、患者血清、血漿または尿中のミオグロビンの測定は有用である。また糖尿病診断上でヘモグロビンＡ１ｃの測定は有用である。従来このようなヘム蛋白質の測定には、ヘム蛋白質を抗ヘム蛋白質抗体を用いて免疫学的に検出する方法が、迅速、簡便で優れているため汎用されている。この検出に用いる試薬には、抗ヘム蛋白質抗体を用いた検出用試薬と共にヒトヘム蛋白質を含む対照試薬が添付され、この測定試薬の活性確認に用いられていた。従来、ヘム蛋白質の保存の際にはグリセロールなどが添加されていた。
【０００３】
ところでヒトミオグロビン及びヒトヘモグロビンなどのヘム蛋白質は、温度・湿度などの変動により変性したり、酸素の結合などにより構造変化することなどにより、抗体との反応性が変化（劣化）することを本発明者らは見いだした。このヘム蛋白質と抗体との反応性の変化は、従来用いられていたグリセロールなどでは、防ぐことができないものであった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ヘム蛋白質が時間の経過と共に変性・変化することのない、ヘム蛋白質を安定化するための方法が求められていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意研究を行った結果、ヘム蛋白質の安定化剤を見いだし本発明を完成するに至った。即ち本発明は、以下のａ及びｂからなることを特徴とする、ヘム蛋白質の安定化剤である；ａ．アルブミン、ｂ．糖またはスピントラップ剤の１種以上。また本発明は、ヘム蛋白質に上述の安定化剤を添加することを特徴とする、ヘム蛋白質の安定化方法である。以下、本発明を更に詳細に説明する。
【０００６】
本発明で安定化されるヘム蛋白質には特に限定はなく、例えばミオグロビン又はヘモグロビンなどがあげられる。このヘム蛋白質の製法には特に限定はなく、例えば市販品、通常の方法により動物から精製されたもの、ヘム蛋白質全域又は一部の領域のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現させて得た組換え体、合成ペプチド、アミノ酸配列を置換、欠失、挿入した変異体などが用いられる。
【０００７】
本発明では、ヘム蛋白質の安定剤は以下のａ及びｂからなることが必須である。すなわちａとしては、アルブミンである。またｂとしては、糖またはスピントラップ剤の１種以上である。
【０００８】
このうちアルブミンは市販のものでよく、また牛、家兎、ヒト血清などから周知の方法により単離精製されたものでもよい。
【０００９】
糖は特に限定はないが、例えばグルコース、ガラクトース、フルクトース、サッカロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、マンニトール、またはソルビトールなどから選ばれる１種以上が好ましい。特にサッカロース、マンニトールが好ましく、中でもサッカロースはヘム蛋白質の安定化のために非常に有用である。
【００１０】
スピントラップ剤としては特に限定はないが、例えばピペリジン骨格、ピロリジン骨格、又はオキサゾリジン骨格を有する物質を用いることができる。一例をあげると、２，２，６，６−テトラメチル−４−ピペリジノール、２，２，５，５−テトラメチル−３−ピロリジンカルボキサミン、３，３，５，５−テトラメチル−１−ピロリンなどが好ましく用いられる。スピントラップ剤はフリーラジカルと結合する性質を有し、これによってヘム蛋白質の安定化がはかられると考えられる。
【００１１】
ヘム蛋白質の安定化剤しては上述のａ及びｂが用いられるが、その組み合わせには特に限定はなく、アルブミン及び糖を用いても、アルブミン及びスピントラップ剤を用いてもよい。しかしながらアルブミン及び糖を用いる方がヘム蛋白質を安定化する機能に優れたものとなる。またアルブミン、糖、及びスピントラップ剤の３種を併用することで、よりヘム蛋白質を安定化する機能に優れた安定化剤となるため好ましいものである。
【００１２】
本発明の安定化剤をヘム蛋白質に添加する場合、ヘム蛋白質と安定化剤の少なくとも一方が溶液であることが好ましい。これは両者が混合されたときに均一に混合されやすいからである。この時、溶液とするために緩衝液を用いることが好ましく、この緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液などｐＨ６．０〜８．０領域にて使用される緩衝液であればよい。さらにこの緩衝液には必要に応じてアジ化ナトリウムなどの防腐剤を添加することも可能である。
【００１３】
安定化剤として使用される各成分の濃度には特に限定はないが、最終的に得られるヘム蛋白質溶液に対して、アルブミンは最終濃度０．１〜１０ｗｔ％で用いることが好ましく、また糖を用いる場合は最終濃度１〜１０ｗｔ％、スピントラップ剤を用いる場合は、最終濃度１〜１０ｍＭで用いることが好ましい。これら各成分は個別に又はあらかじめ混合してからヘム蛋白質に添加すればよい。
【００１４】
本発明の安定化剤を添加されたヘム蛋白質は、溶液のままでも安定に保存できるが、必要に応じ凍結乾燥し、凍結乾燥品としてより安定に保存することができる。
【００１５】
【実施例】
本発明を実施例により説明する。しかし本発明はこれら実施例にのみ限定されるものではない。
【００１６】
（実施例１）アルブミン、サッカロースを含むヒトミオグロビン試薬の製造
１ｗｔ％牛血清アルブミンを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、最終濃度１００ｎｇ／ｍｌになるようにヒトミオグロビンを添加した。さらに本品に対して最終濃度５ｗｔ％になるようにサッカロースを添加した後、凍結乾燥し、ヒトミオグロビン試薬１を得た。また、サッカロースを添加しない以外は同様の方法により比較試薬１を得た。
【００１７】
（実施例２）各試薬の安定性
実施例１で得たヒトミオグロビン試薬１及び比較試薬１をそれぞれ３５℃保温機中で、又は４℃で１，６，１０日間保存し、ヒトミオグロビン濃度を測定した。濃度百分率を以下のように求め、結果を表１に示した。
【００１８】
濃度百分率＝｛（３５℃保存品のヒトミオグロビン濃度）／（４℃保存品のヒトミオグロビン濃度）｝×１００
なおヒトミオグロビン濃度は、抗ミオグロビン抗体を２種用いたサンドイッチ酵素免疫測定法により求めた。
【００１９】
【表１】
【００２０】
表１から明らかなように、ヒトミオグロビン試薬１は、安定化剤としてアルブミン及びサッカロースを含むため、ヒトミオグロビンを安定に保存することができた。これに対し比較試薬１は、保存１日から急激にヒトミオグロビンの変性が生じ、ヒトヘモグロビンを安定に保存することが困難であった。
【００２１】
（実施例３）アルブミン、サッカロース及び２，２，６，６−テトラメチル−４−ピペリジノールを含むヒトミオグロビン試薬の製造
１ｗｔ％牛血清アルブミンを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、最終濃度１００ｎｇ／ｍｌになるようにヒトミオグロビンを添加した。さらに本品に対して最終濃度５ｗｔ％になるようにサッカロースを、５ｍＭになるように２，２，６，６−テトラメチル−４−ピペリジノールをそれぞれ添加した後、凍結乾燥することにより、ヒトミオグロビン試薬２を得た。
【００２２】
（実施例４）ヒトミオグロビン試薬２の安定性
実施例３で得たヒトミオグロビン試薬２を３５℃保温機中で、又は４℃で１，６，１０日間保存し、実施例２と同様にヒトミオグロビンの濃度を測定した。実施例２と同様に濃度百分率を求め、結果を表２に示した。
【００２３】
【表２】
【００２４】
表２から明らかなように、安定化剤としてアルブミン、糖及び２，２，６，６−テトラメチル−４−ピペリジノールの３種を併用することにより、より安定にヒトミオグロビンを保存することができた。
【００２５】
【発明の効果】
本発明の安定化剤を用いることにより、ヘム蛋白質を長期間安定に保存することができる。特に本発明の安定化剤は、ヘム蛋白質のエピトープ部分を安定に保存することができるため、抗ヘム蛋白質抗体を用いる免疫学的測定に使用されるヘム蛋白質を安定化するのに有用である。
【００２６】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ヘム蛋白質の安定化方法に関する。このヘム蛋白質は、血清、血漿または尿中のヘム蛋白質の免疫学的測定方法の標準物質などに用いられる。
【０００２】
【従来の技術】
心筋梗塞などの心疾患、急性腎疾患において、診断及び治療方針を決定する上で、患者血清、血漿または尿中のミオグロビンの測定は有用である。また糖尿病診断上でヘモグロビンＡ１ｃの測定は有用である。従来このようなヘム蛋白質の測定には、ヘム蛋白質を抗ヘム蛋白質抗体を用いて免疫学的に検出する方法が、迅速、簡便で優れているため汎用されている。この検出に用いる試薬には、抗ヘム蛋白質抗体を用いた検出用試薬と共にヒトヘム蛋白質を含む対照試薬が添付され、この測定試薬の活性確認に用いられていた。従来、ヘム蛋白質の保存の際にはグリセロールなどが添加されていた。
【０００３】
ところでヒトミオグロビン及びヒトヘモグロビンなどのヘム蛋白質は、温度・湿度などの変動により変性したり、酸素の結合などにより構造変化することなどにより、抗体との反応性が変化（劣化）することを本発明者らは見いだした。このヘム蛋白質と抗体との反応性の変化は、従来用いられていたグリセロールなどでは、防ぐことができないものであった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ヘム蛋白質が時間の経過と共に変性・変化することのない、ヘム蛋白質を安定化するための方法が求められていた。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは鋭意研究を行った結果、ヘム蛋白質の安定化剤を見いだし本発明を完成するに至った。即ち本発明は、以下のａ及びｂからなることを特徴とする、ヘム蛋白質の安定化剤である；ａ．アルブミン、ｂ．糖またはスピントラップ剤の１種以上。また本発明は、ヘム蛋白質に上述の安定化剤を添加することを特徴とする、ヘム蛋白質の安定化方法である。以下、本発明を更に詳細に説明する。
【０００６】
本発明で安定化されるヘム蛋白質には特に限定はなく、例えばミオグロビン又はヘモグロビンなどがあげられる。このヘム蛋白質の製法には特に限定はなく、例えば市販品、通常の方法により動物から精製されたもの、ヘム蛋白質全域又は一部の領域のアミノ酸配列をコードする遺伝子を発現させて得た組換え体、合成ペプチド、アミノ酸配列を置換、欠失、挿入した変異体などが用いられる。
【０００７】
本発明では、ヘム蛋白質の安定剤は以下のａ及びｂからなることが必須である。すなわちａとしては、アルブミンである。またｂとしては、糖またはスピントラップ剤の１種以上である。
【０００８】
このうちアルブミンは市販のものでよく、また牛、家兎、ヒト血清などから周知の方法により単離精製されたものでもよい。
【０００９】
糖は特に限定はないが、例えばグルコース、ガラクトース、フルクトース、サッカロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、マンニトール、またはソルビトールなどから選ばれる１種以上が好ましい。特にサッカロース、マンニトールが好ましく、中でもサッカロースはヘム蛋白質の安定化のために非常に有用である。
【００１０】
スピントラップ剤としては特に限定はないが、例えばピペリジン骨格、ピロリジン骨格、又はオキサゾリジン骨格を有する物質を用いることができる。一例をあげると、２，２，６，６−テトラメチル−４−ピペリジノール、２，２，５，５−テトラメチル−３−ピロリジンカルボキサミン、３，３，５，５−テトラメチル−１−ピロリンなどが好ましく用いられる。スピントラップ剤はフリーラジカルと結合する性質を有し、これによってヘム蛋白質の安定化がはかられると考えられる。
【００１１】
ヘム蛋白質の安定化剤しては上述のａ及びｂが用いられるが、その組み合わせには特に限定はなく、アルブミン及び糖を用いても、アルブミン及びスピントラップ剤を用いてもよい。しかしながらアルブミン及び糖を用いる方がヘム蛋白質を安定化する機能に優れたものとなる。またアルブミン、糖、及びスピントラップ剤の３種を併用することで、よりヘム蛋白質を安定化する機能に優れた安定化剤となるため好ましいものである。
【００１２】
本発明の安定化剤をヘム蛋白質に添加する場合、ヘム蛋白質と安定化剤の少なくとも一方が溶液であることが好ましい。これは両者が混合されたときに均一に混合されやすいからである。この時、溶液とするために緩衝液を用いることが好ましく、この緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液などｐＨ６．０〜８．０領域にて使用される緩衝液であればよい。さらにこの緩衝液には必要に応じてアジ化ナトリウムなどの防腐剤を添加することも可能である。
【００１３】
安定化剤として使用される各成分の濃度には特に限定はないが、最終的に得られるヘム蛋白質溶液に対して、アルブミンは最終濃度０．１〜１０ｗｔ％で用いることが好ましく、また糖を用いる場合は最終濃度１〜１０ｗｔ％、スピントラップ剤を用いる場合は、最終濃度１〜１０ｍＭで用いることが好ましい。これら各成分は個別に又はあらかじめ混合してからヘム蛋白質に添加すればよい。
【００１４】
本発明の安定化剤を添加されたヘム蛋白質は、溶液のままでも安定に保存できるが、必要に応じ凍結乾燥し、凍結乾燥品としてより安定に保存することができる。
【００１５】
【実施例】
本発明を実施例により説明する。しかし本発明はこれら実施例にのみ限定されるものではない。
【００１６】
（実施例１）アルブミン、サッカロースを含むヒトミオグロビン試薬の製造
１ｗｔ％牛血清アルブミンを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、最終濃度１００ｎｇ／ｍｌになるようにヒトミオグロビンを添加した。さらに本品に対して最終濃度５ｗｔ％になるようにサッカロースを添加した後、凍結乾燥し、ヒトミオグロビン試薬１を得た。また、サッカロースを添加しない以外は同様の方法により比較試薬１を得た。
【００１７】
（実施例２）各試薬の安定性
実施例１で得たヒトミオグロビン試薬１及び比較試薬１をそれぞれ３５℃保温機中で、又は４℃で１，６，１０日間保存し、ヒトミオグロビン濃度を測定した。濃度百分率を以下のように求め、結果を表１に示した。
【００１８】
濃度百分率＝｛（３５℃保存品のヒトミオグロビン濃度）／（４℃保存品のヒトミオグロビン濃度）｝×１００
なおヒトミオグロビン濃度は、抗ミオグロビン抗体を２種用いたサンドイッチ酵素免疫測定法により求めた。
【００１９】
【表１】
表１から明らかなように、ヒトミオグロビン試薬１は、安定化剤としてアルブミン及びサッカロースを含むため、ヒトミオグロビンを安定に保存することができた。これに対し比較試薬１は、保存１日から急激にヒトミオグロビンの変性が生じ、ヒトヘモグロビンを安定に保存することが困難であった。
【００２１】
（実施例３）アルブミン、サッカロース及び２，２，６，６−テトラメチル−４−ピペリジノールを含むヒトミオグロビン試薬の製造
１ｗｔ％牛血清アルブミンを含む１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、最終濃度１００ｎｇ／ｍｌになるようにヒトミオグロビンを添加した。さらに本品に対して最終濃度５ｗｔ％になるようにサッカロースを、５ｍＭになるように２，２，６，６−テトラメチル−４−ピペリジノールをそれぞれ添加した後、凍結乾燥することにより、ヒトミオグロビン試薬２を得た。
【００２２】
（実施例４）ヒトミオグロビン試薬２の安定性
実施例３で得たヒトミオグロビン試薬２を３５℃保温機中で、又は４℃で１，６，１０日間保存し、実施例２と同様にヒトミオグロビンの濃度を測定した。実施例２と同様に濃度百分率を求め、結果を表２に示した。
【００２３】
【表２】
表２から明らかなように、安定化剤としてアルブミン、糖及び２，２，６，６−テトラメチル−４−ピペリジノールの３種を併用することにより、より安定にヒトミオグロビンを保存することができた。
【００２５】
【発明の効果】
本発明の安定化剤を用いることにより、ヘム蛋白質を長期間安定に保存することができる。特に本発明の安定化剤は、ヘム蛋白質のエピトープ部分を安定に保存することができるため、抗ヘム蛋白質抗体を用いる免疫学的測定に使用されるヘム蛋白質を安定化するのに有用である。
【００２６】
Claims (4)
- 以下のａ、ｂ及びｃからなることを特徴とする、ミオグロビン及び／又はヘモグロビンの安定化剤；
ａ．アルブミン
ｂ．糖
ｃ．２，２，６，６−テトラメチル−４−ピペリジノール - 請求項１に記載の安定化剤において、アルブミンが牛、家兎、またはヒト由来であることを特徴とする安定化剤。
- 請求項１または２に記載の安定化剤において、糖が、グルコース、ガラクトース、フルクトース、サッカロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、マンニトール、またはソルビトールであることを特徴とする安定化剤。
- ミオグロビン及び／又はヘモグロビンに、請求項１〜３いずれかの項に記載の安定化剤を添加することを特徴とする、ミオグロビン及び／又はヘモグロビンの安定化方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12840798A JP4273534B2 (ja) | 1998-05-12 | 1998-05-12 | ヘム蛋白質の安定化剤及び安定化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12840798A JP4273534B2 (ja) | 1998-05-12 | 1998-05-12 | ヘム蛋白質の安定化剤及び安定化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11322795A JPH11322795A (ja) | 1999-11-24 |
| JP4273534B2 true JP4273534B2 (ja) | 2009-06-03 |
Family
ID=14984028
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12840798A Expired - Fee Related JP4273534B2 (ja) | 1998-05-12 | 1998-05-12 | ヘム蛋白質の安定化剤及び安定化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4273534B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6467182B2 (ja) * | 2014-10-03 | 2019-02-06 | 株式会社ビー・エム・エル | ヘモグロビンｆの管理試料 |
| CN118465285A (zh) * | 2024-06-05 | 2024-08-09 | 厦门宝太和瑞生物技术有限公司 | 肌红蛋白校准品缓冲液及校准品 |
-
1998
- 1998-05-12 JP JP12840798A patent/JP4273534B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH11322795A (ja) | 1999-11-24 |
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