JP4229973B2 - 男性不妊関連遺伝子Ｓｃｏｔ−ｔ変異と男性不妊の診断方法 - Google Patents
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Description
この出願の発明は、男性不妊関連遺伝子変異と、この遺伝子変異を検査対象とする男性不妊の診断方法に関するものでる。さらに詳しくは、点突然変異によって特徴付けられる男性不妊関連遺伝子由来の変異ポリヌクレオチドと、その遺伝子産物である変異ポリペプチド、並びにこれらの変異ポリヌクレオチドまたは変異ポリペプチドを対象とする男性不妊の診断方法に関するものである。
夫婦の約10%が何らかの形態の不妊問題を経験していることが知られており、これらの約半数が男性側の因子に起因している可能性がある。男性不妊の原因の一部として示唆されているのは、内分泌障害、染色体異常を含む遺伝的因子、環境因子、潜伏精巣や精索静脈瘤を含む奇形などである（非特許文献1、2）。しかしながら男性不妊の原因の大半は不十分な精子形成や精子欠失であり、この問題の原因は現時点では未解明である（非特許文献3）。また男性不妊の中には様々な遺伝的因子に関係すると考えられる事例が存在するが（非特許文献4）、それらの全てについて原因遺伝子が特定されている訳ではない。
スクシニルCoA：3-オキソ酸CoAトランスフェラーゼ（OXCT/SCOT）はケトン体のエネルギー代謝における重要な酵素の一つであり、このケトン体は肝臓で生産され、末梢組織に輸送されてエネルギー源として用いられる（非特許文献5）。スクシニルCoAトランスフェラーゼ（SCOT）はいくつかの組織のミトコンドリア内に局在しており、CoA部分をスクシニルCoAからアセト酢酸に転移させてアセトアセチルCoAの形成を触媒するが、これはさらに分解され、トリカルボン酸サイクルに入ることが可能な2個のアセチルCoA分子になる（非特許文献6、7）。ScotのcDNAはブタおよびヒト心臓よりクローンされているが（非特許文献8、9）、この出願の発明者等はこれまでに、半数体の生殖細胞特異的なSCOTをコードするscot-tと名付けられた新規遺伝子を、マウス精巣の差分化cDNAライブラリよりクローニングしている（非特許文献10）。SCOT-tは生殖細胞に特異的なSCOTのイソ型であり、半数体精子と精子のミトコンドリア中に存在しており、精子形成や精子のエネルギー代謝にも特有の役割を果たしていると考えられている。ノーザンブロット、ウェスタンブロットおよび免疫組織科学的分析によれば、マウスscot-tの発現は精巣（特に後期精子細胞中）において検出されたが、他の体細胞中では検出されなかった。マウスscot-tのヌクレオチド配列は、ブタおよびヒト心臓のScotに対してそれぞれ63.4%および62.7%の同一性があり、推定されたアミノ酸配列はそれぞれ68.0%および67.4%の同一性があった。SCOT-tのNH2末端の1-39残基はミトコンドリアを標的とするシグナル配列を形成している。免疫蛍光染色では実際に、精巣上体尾部から得た固定精子中におけるSCOT-tタンパク質のミトコンドリアへの局在が示されている（非特許文献10）。SCOT-tのアミノ酸配列にはグルタミン酸残基が1箇所存在しているが（アミノ酸残基：341）、これはSCOTを含む全てのCoAトランスフェラーゼ中で保存されていることが知られているグルタミン酸344に対応するものである（非特許文献11）。この出願の発明者らはまた、マウスscot-tのヒトオーソログのクローニングおよび特徴付けを行った。ヒトScot-tのmRNAのコーディング領域全体と推定アミノ酸配列は、マウスscot-tに対してそれぞれ75.4%および75.8%の同一性を示した。同様に発明者らは、h-Scot-tがイントロンを持たない単一遺伝子であり、精巣内で特異的に発現することを示している（非特許文献12）。
精子の運動性と機能におけるエネルギー代謝においてミトコンドリア酵素の重要性が幾つか報告されている（非特許文献13、14、15）。Scot-tが特異的に存在する事実は、ケトン体を精子運動のためのエネルギー源として利用する新しい代謝系の存在を示すと考えられる。さらに、Scot-tは半数体の精子細胞で特異的に発現していることから、精子形成においてこれが何らかの特異的な役割を持つことも示唆される。
Rubio C, et al. Human Reprod 2001; 10: 2084-2092 Lee PA, et al. (2000) J Urol., 164(5), 1697-1701 Cram DS, et al. (2001) J Androl 22(5), 738-746 Thielemans BFJ, et al. Eur. J. Obst Gynec 1998; 81: 217-225 Mitchell GA, et al. Clin. Invest. Med. 1995; 18: 193-216 Williamson, D. H., et al. (1971) Biochem. J., 121, 41-47 Tildon JT, et al. J Clinic Invest 1972; 51: 493-498 Lin, T. W. and Bridger, W. A. (1992) J. Biol. Chem., 267, 975-978 Kassovska-Bratinova S, et al. Am J Hum Genet 1996; 59: 519-528 Koga M, et al. Biol Reprod 2000; 63: 1601-1609 Rochet JC, Bridger WA. (1994) Protein Sci., 3, 975-81 Tanaka H, et al. Mol Human Reprod 2001; 8: 16-23 Pascual, M. I., et al. (1996) Biosci. Rep., 16, 35-40 Yeung, C. H., et al. (1996) Mol. Hum. Reprod., 2, 591-596 Ruiz-Pesini, E., et al.(1998) Clin. Chem., 44, 1616-1620
Rubio C, et al. Human Reprod 2001; 10: 2084-2092 Lee PA, et al. (2000) J Urol., 164(5), 1697-1701 Cram DS, et al. (2001) J Androl 22(5), 738-746 Thielemans BFJ, et al. Eur. J. Obst Gynec 1998; 81: 217-225 Mitchell GA, et al. Clin. Invest. Med. 1995; 18: 193-216 Williamson, D. H., et al. (1971) Biochem. J., 121, 41-47 Tildon JT, et al. J Clinic Invest 1972; 51: 493-498 Lin, T. W. and Bridger, W. A. (1992) J. Biol. Chem., 267, 975-978 Kassovska-Bratinova S, et al. Am J Hum Genet 1996; 59: 519-528 Koga M, et al. Biol Reprod 2000; 63: 1601-1609 Rochet JC, Bridger WA. (1994) Protein Sci., 3, 975-81 Tanaka H, et al. Mol Human Reprod 2001; 8: 16-23 Pascual, M. I., et al. (1996) Biosci. Rep., 16, 35-40 Yeung, C. H., et al. (1996) Mol. Hum. Reprod., 2, 591-596 Ruiz-Pesini, E., et al.(1998) Clin. Chem., 44, 1616-1620
遺伝的要因による男性不妊について、その遺伝的要因を特定することは、その正確な診断や治療法の確立にとって重要である。
前記のとおり、Scot-t遺伝子の何らかの変異が男性不妊に関連づけられることが指摘されているが、その実体は全く解明されていない。
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであって、男性不妊の原因遺伝子としてScot-t遺伝子変異を提供することを課題としている。
またこの出願は、遺伝子変異に伴って発現する変異ポリペプチド、この変異ポリペプチドに対する抗体、並びに、これらの変異遺伝子や変異ポリペプチドを検査対象とする男性不妊診断方法を提供することを課題としている。
この発明は、ヒト男性不妊関連遺伝子Scot-tから転写されるmRNAに相補的なポリヌクレオチドであって、配列番号１のDNA配列において、以下の群：
第129位tがcに置換；
第870位tがgに置換；
第1071位cがtに置換；および
第1667位tがcに置換
より選択される１以上の変異を有するポリヌクレオチド（Scot-t変異ポリヌクレオチド）またはその相補配列を提供する。
第129位tがcに置換；
第870位tがgに置換；
第1071位cがtに置換；および
第1667位tがcに置換
より選択される１以上の変異を有するポリヌクレオチド（Scot-t変異ポリヌクレオチド）またはその相補配列を提供する。
この発明は、前記のScot-t変異ポリヌクレオチドの一部であって、その変異箇所を含む10〜99の連続したDNA配列からなるScot-t変異オリゴヌクレオチドまたはその相補配列を提供する。
この発明は、前記Scot-t変異ポリヌクレオチドまたはScot-t変異オリゴヌクレオチド、もしくはそれらの相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヒト染色体DNA由来のポリヌクレオチド（Scot-t変異ゲノムポリヌクレオチド）を提供する。
この発明は、前記Scot-t変異ポリヌクレオチド、Scot-t変異ゲノムポリヌクレオチド、またはScot-t変異ゲノムポリヌクレオチドから転写されるmRNAをPCR増幅するためのプライマーセットであって、一方のプライマーが、変異箇所を含む15〜45の連続したDNA配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマーセットを提供する。
この発明は、前記のScot-t変異ポリヌクレオチドまたはScot-t変異ゲノムポリヌクレオチドの発現産物であって、配列番号２のアミノ酸配列において、以下の群：
第38位LeuがProに置換；
第285位LeuがArgに置換；および
第352位ThrがMetに置換；
より選択される１以上の変位を有するポリペプチド（Scot-t変異ポリペプチド）を提供する。
第38位LeuがProに置換；
第285位LeuがArgに置換；および
第352位ThrがMetに置換；
より選択される１以上の変位を有するポリペプチド（Scot-t変異ポリペプチド）を提供する。
この発明は、前記のScot-t変異ポリペプチドの一部であって、変異箇所を含む5〜30の連続したアミノ酸配列からなるオリゴペプチド（Scot-t変異オリゴペプチド）を提供する。
この発明は、前記のScot-t変異オリゴペプチドを抗原として作製された抗体（抗変異Scot-t抗体）を提供する。
この発明はまた、ヒト男性不妊の診断方法であって、被験者から単離した染色体DNA中にScot-t変異ゲノムポリヌクレオチドが存在するか否かを検出することを特徴とする方法を提供する。
上記の診断方法においては、被験者から単離した染色体DNAまたはそのmRNAと、Scot-t変異ポリヌクレオチド、またはScot-t変異オリゴヌクレオチド、もしくはそれらの相補配列がストリンジェントな条件下でハイブリダイズするか否かを検出することを好ましい態様としている。またこの診断方法では、被験者から単離した染色体DNAまたはmRNAを鋳型とし、前記のそれぞれのプライマーセットを用いてPCRを行った場合のPCR産物の有無を検出することを好ましい態様としてもいる。
この発明は、ヒト男性不妊の診断方法であって、被験者から単離した生体試料中にScot-t変異ポリペプチドが存在するか否かを検出することを特徴とする方法を提供する。
上記の診断方法においては、被験者から単離した生体試料中に、抗変異Scot-t抗体と反応するポリペプチドが存在するか否かを検出することを好ましい態様としている。
この発明は、前記のScot-t変異オリゴヌクレオチドを標識化したことを特徴とするDNAプローブを提供する。
この発明は、前記のScot-t変異オリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするDNAチップを提供する。
この発明は、前記の抗変異Scot-t抗体を標識化したことを特徴とする標識化抗体を提供する。
すなわち、この出願の発明者らは、Scot-t遺伝子について516名の男性（不妊症255例、健常者261例）のDNA資料について分析した結果、そのcDNA（Scot-t：配列番号１）には、表１に示したようなヌクレオチド変異と、それに伴うアミノ酸変異が存在し、その一塩基置換およびアミノ酸変異が、男性不妊の原因として重要であることを見出した。なお、配列番号１は、公知のヒトScot-t cDNA（GenBank/AB050193）の第4-1760塩基配列に相当する。表１におけるヌクレオチド変異およびアミノ酸変異の位置（数字）は、配列表の塩基位置およびアミノ酸位置に対応する。また「−」は非コード領域であることを示す。
この出願の各発明において、「遺伝子」とは、ゲノムDNAに存在し、特定のポリペプチド（タンパク質）をコードする２本鎖DNAであり、そのコード領域（open readig frame：ORF）、およびORFに対する発現制御領域（プロモーター／エンハンサー配列、リプレッサー配列）を含む。
この出願の発明において、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」とは、それぞれ長鎖および単鎖のヌクレオチド鎖であり、ポリヌクレオチドが100bp以上、オリゴヌクレオチドが100bp未満を一応の基準とするが、例外も存在する。
この出願の発明において、「ポリペプチド」および「オリゴペプチド」とは、それぞれ長鎖および単鎖のペプチド鎖であり、ポリペプチドが30アミノ酸残基以上、オリゴペプチドが30アミノ酸残基未満を一応の基準とするが、例外も存在する。
また、以下の説明において、「生殖に及ぼす影響」とは、催奇性ではなく、精子形成および妊よう性に及ぼす影響を意味する。
さらに、この発明において使用するその他の用語や概念については、発明の実施形態や実施例の記載において説明する。なお、この発明を実施するために使用する様々な遺伝子操作技術や分子生物学的技術等は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献（例えば、Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y, 1995等）に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能なものである。
以下、この出願の発明について、実施形態を詳しく説明する。
この発明のScot-t変異ポリヌクレオチドは、配列番号１のDNA配列において、
第129位tがcに置換；
第870位tがgに置換；
第1071位cがtに置換；および
第1667位tがcに置換
のいずれか１以上を有するポリヌクレオチドまたはその相補配列である。
第129位tがcに置換；
第870位tがgに置換；
第1071位cがtに置換；および
第1667位tがcに置換
のいずれか１以上を有するポリヌクレオチドまたはその相補配列である。
このScot-t変異ポリヌクレオチドは、例えば、後記のScot-t変異オリゴヌクレオチドをプローブとして、男性不妊者の全mRNAから調製したcDNAライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。また後記発明のプライマーセットを用い、男性不妊者のmRNAを鋳型とするRT-PCRによって単離することもできる。あるいは、野性型Scot-t cDNAに、市販のミューテーションキット等を用いて前記の塩基置換を導入することによって取得することもできる。得られたcDNAは、例えば、PCR（Polymerase Chain Reaction）法、NASBN（Nucleic acid sequence based amplification）法、TMA（Transcription-mediated amplification）法およびSDA（Strand Displacement Amplification）法などの通常行われる遺伝子増幅法により増幅することができる。
この発明のScot-t変異ポリヌクレオチドは、この発明の男性不妊診断方法に使用することができる。また、後記発明のScot-t変異ポリペプチドを遺伝子工学的に作製するための材料としても使用することができる。
この発明のScot-t変異オリゴヌクレオチドは、前記のScot-t変異ポリヌクレオチドの一部であって、各々の変異箇所を含む10〜99の連続したDNA配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補配列である。
このScot-t変異オリゴヌクレオチドは、公知の方法によって化学的に合成して作製することができる。また、Scot-t変異ポリヌクレオチドを適当な制限酵素で切断するなどの方法によって作製することもできる。
このScot-t変異オリゴヌクレオチドもまた、この発明の男性不妊診断方法に使用することができる。あるいは、Scot-t変異オリゴペプチドを遺伝子工学的に作成するための材料として使用することもできる。
この発明のScot-t変異ゲノムポリヌクレオチドは、Scot-t変異ポリヌクレオチドまたはScot-t変異オリゴヌクレオチド若しくはそれらの相補配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヒト染色体DNA由来のポリヌクレオチド（ゲノムDNA）である。ここで、ストリンジェント（stringent）な条件とは、前記のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドと、染色体由来のゲノムDNAとの選択的かつ検出可能な特異的結合を可能とする条件である。ストリンジェント条件は、塩濃度、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）、温度、およびその他公知の条件によって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、またはハイブリダイゼーション温度を上昇させるかによってストリンジェンシー（stringency）は増加する。例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、NaCl約750 mM以下およびクエン酸三ナトリウム約75 mM以下、より好ましくはNaCl約500 mM以下およびクエン酸三ナトリウム約50 mM以下、最も好ましくはNaCl約250 mM以下およびクエン酸三ナトリウム約25 mM以下である。ストリンジェントな有機溶媒濃度は、ホルムアミド約35%以上、最も好ましくは約50%以上である。ストリンジェントな温度条件は、約30℃以上、より好ましくは約37℃以上、最も好ましくは約42℃以上である。その他の条件としては、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤（例えば、SDS）の濃度、およびキャリアーDNAの存否等であり、これらの条件を組み合わせることによって、様々なストリンジェンシーを設定することができる。１つの好ましい態様としては、750 mM NaCl、75 mM クエン酸三ナトリウムおよび1% SDSの条件で、30℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。より好ましい態様としては、500 mM NaCl、50 mM クエン酸三ナトリウム、1% SDS、35%ホルムアミド、100 μg/mlの変性サケ精子DNAの条件で、37℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。最も好ましい態様としては、250 mM NaCl、25 mM クエン酸三ナトリウム、1% SDS、50%ホルムアミド、200 μg/mlの変性サケ精子DNAの条件で、42℃の温度によりハイブリダイゼーションを行う。また、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。例えば、洗浄のためのストリンジェントな塩条件は、好ましくはNaCl約30 mM以下およびクエン酸三ナトリウム約3 mM以下、最も好ましくはNaCl約15 mM以下およびクエン酸三ナトリウム約1.5 mM以下である。洗浄のためのストリンジェントな温度条件は、約25℃以上、より好ましくは約42℃以上、最も好ましくは約68℃以上である。１つの好ましい態様としては、30 mM NaCl、3 mM クエン酸三ナトリウムおよび0.1% SDSの条件で、25℃の温度により洗浄を行う。より好ましい態様としては、15 mM NaCl、1.5 mMクエン酸三ナトリウムおよび0.1% SDSの条件で、42℃の温度により洗浄を行う。最も好ましい態様としては、15 mM NaCl、1.5 mMクエン酸三ナトリウムおよび0.1% SDSの条件で、68℃の温度により洗浄を行うことである。
このScot-t変異ゲノムポリヌクレオチドは、例えば、Scot-t変異オリゴヌクレオチドをプローブとして、以上のとおりのストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄処理により、男性不妊者の染色体DNAから調製したゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。
このScot-t変異ゲノムポリヌクレオチドは、例えばこの発明の診断方法において検出対象となる。
この発明のScot-tプライマーセットは、前記発明のScot-t変異ポリヌクレオチド、Scot-t変異ゲノムポリヌクレオチドとその相補配列からなる二本鎖ポリヌクレオチド、またはScot-t変異ゲノムポリヌクレオチドから転写されるmRNAをPCR増幅するためのプライマーセットである。そしてこれらのプライマーセットは、一方のオリゴヌクレオチドプライマーが、配列番号１（Scot-t cDND）の少なくとも１箇所のヌクレオチド変異箇所を含む15〜45nt、好ましくは15〜30ntの連続したDNA配列またはその相補配列からなっている。他方のプライマーは、配列番号１の各変異箇所の5’側または3’側の任意の連続DNA配列またはその相補配列とすることができる。
これらのプライマーセットは、それぞれの変異箇所を含む配列番号１に基づいて公知のDNA合成法により作製することができる。また、プライマーの端部にはリンカー配列等を付加することもできる。さらに、配列の設計には、市販のソフトウェア、例えばOligoTM［National Bioscience Inc.（米国）製］、GENETYX［ソフトウェア開発（株）（日本）製］等を用いることもできる。
この発明のScot-tプライマーセットは、この発明の男性不妊診断方法等に使用することができる。
この発明のScot-t変異ポリペプチドは、前記発明のScot-t変異ポリペプチドまたは変異ゲノムポリヌクレオチドの発現産物であって、配列番号2のアミノ酸配列において、
第38位LeuがProに置換；
第285位LeuがArgに置換；および
第352位ThrがMetに置換；
のいずれか１以上を有するポリペプチドである。
すなわち、これらのScot-t変異ポリペプチドは、前記発明のScot-t変異ポリヌクレオチドにおけるミスセンス変異によって、正常（野性型）ポリペプチド（配列番号２）のアミノ酸が前記のとおりに変異している。
第38位LeuがProに置換；
第285位LeuがArgに置換；および
第352位ThrがMetに置換；
のいずれか１以上を有するポリペプチドである。
すなわち、これらのScot-t変異ポリペプチドは、前記発明のScot-t変異ポリヌクレオチドにおけるミスセンス変異によって、正常（野性型）ポリペプチド（配列番号２）のアミノ酸が前記のとおりに変異している。
この変異ポリペプチドは、男性不妊者の生体試料から公知の方法に従って単離する方法、それぞれの変異アミノ酸残基を含む配列番号２のアミノ酸配列に基づき化学合成によってペプチドを調製する方法、あるいは前記発明の変異ポリヌクレオチド（変異cDNA）を用いて組換えDNA技術で生産する方法などにより取得することができる。これらの変異ポリペプチドは、例えば、この発明の男性不妊診断方法の検査対象とすることができる。
この出願の変異オリゴペプチドは、前記発明のそれぞれの変異ポリペプチドの一部であって、各々のアミノ酸変異を含む5-30の連続したアミノ酸配列を有するオリゴペプチドである。これらの変異オリゴペプチドは、所定のアミノ酸配列に基づいて化学的に合成する方法、あるいは前記の変異ポリペプチドを適当なプロテアーゼによって消化する方法等によって作製することができる。これらのオリゴペプチドは、例えば、この発明の抗体作製のための抗原として使用することができる。
この発明の抗変異Scot-t抗体は、前記発明のオリゴペプチドを抗原として作製されたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり、この発明の変異ポリペプチドのエピトープに結合することができる全体分子、およびFab、F(ab')2、Fv断片等が全て含まれる。このような抗体は、MSGs発明について説明した抗体と同様にして作成することができる。またこれらの抗体は、前記の変異ポリペプチドを特異的に認識することができ、この発明の診断方法等に使用することができる。
この発明の診断方法は、被験者が男性不妊であるか否かを診断する方法である。すなわち、被験者の生体試料から染色体DNAを単離し、このDNA中に、前記発明の変異ゲノムポリヌクレオチドが存在する場合に、この被験者を男性不妊のハイリスク者と判定する。被験者は、不妊男性、あるいは母方の親族に男性不妊者を有する男児等とすることができるが、それらの者に限定されるものではない。変異ポリヌクレオチドの検出は、それを直接シークエンシングする方法によっても行うことができるが、以下の方法が好ましい。
第１には、被験者から単離した染色体DNAまたはそのmRNAと、前記発明のScot-t変異ポリヌクレオチド、またはScot-t変異オリゴヌクレオチドがストリンジェントな条件下でハイブリダイズするか否かを検出する。被験者が男性不妊に関連した遺伝子変異を有している場合には、染色体DNAまたはそのmRNAと変異ポリヌクレオチドまたは変異オリゴヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下でもハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションは公知の方法によって検出することができ、例えば、この発明のDNAプローブやDNAチップを用いて簡便かつ高精度で行うことができる。標識DNAプローブを用いたハイブリダイゼーション法としては、具体的には、例えばAllele-specific Oligonucleotide Probe法、Oligonucleotide Ligation Assay法、Invader法等の公知の方法を採用することができる。また、DNAチップは、変異ポリヌクレオチドおよび／または変異オリゴヌクレオチドを基盤上に直接合成したものであってもよく、あるいはヌクレオチドが結合するような素材でコーティングした基盤上にオリゴヌクレオチドをスポットしたものであってもよい。そして、標識化した被験サンプルDNAと基盤上のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの有無を指標として、被験サンプルDNAにおけるヌクレオチド変異を同定することができる。
第２の好ましい方法では、被験者から単離した染色体DNAまたはmRNAを鋳型とし、前記発明のプライマーセットを用いてPCRを行った場合のPCR産物の有無を検出する。被験者が男性不妊に関連した遺伝子変異を有している場合には、プライマーセットによって規定されるポリヌクレオチドのPCR産物が得られる。PCRまたはRT-PCRは公知の方法により行うことができる。ヌクレオチド変異の検出は、PCR産物を直接シークエンシングする方法の他に、例えばPCR-SSCP法、PCR-CFLP法、PCR-PHFA法等を行ってもよい。また、Rolling Circle Amplification法、Primer Oligo Base Extension法の公知の方法を採用することもできる。
この発明の別の男性不妊診断方法出願は、被験者から単離した生体試料中に、前記発明のScot-t変異ポリペプチドが存在する場合に、その被験者を男性不妊のハイリスク者と判定する。ポリペプチドの検出は様々な公知方法によって行うことができるが、抗変異Scot-t抗体を用い、Scot-t変異ポリペプチドを検出する方法が好ましい方法の一つである。
以上の抗体を用いる診断方法の場合には、特にこの発明に標識化抗体を用いることによって、簡便かつ高精度の検出が可能となる。標識は、酵素、放射性同位体または蛍光色素を使用することができる。酵素は、turnover numberが大であること、抗体と結合させても安定であること、基質を特異的に着色させる等の条件を満たすものであれば特段の制限はなく、通常のEIAに用いられる酵素、例えば、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコース−６−リン酸化脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素等を用いることもできる。また、酵素阻害物質や補酵素等を用いることもできる。これら酵素と抗体との結合は、マレイミド化合物等の架橋剤を用いる公知の方法によって行うことができる。基質としては、使用する酵素の種類に応じて公知の物質を使用することができる。例えば酵素としてペルオキシダーゼを使用する場合には、3,3',5,5'−テトラメチルベンジシンを、また酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、パラニトロフェノール等を用いることができる。放射性同位体としては、125Ｉや3Ｈ等の通常のRIAで用いられているものを使用することができる。蛍光色素としては、フルオレッセンスイソチオシアネート（FITC）やテトラメチルローダミンイソチオシアネート（TRITC）等の通常の蛍光抗体法に用いられるものを使用することができる。酵素を用いる場合には、酵素作用によって分解して発色する基質を加え、基質の分解量を光学的に測定することによって酵素活性を求め、これを結合抗体量に換算し、標準値との比較から抗体量が算出される。放射生同位体を用いる場合には、放射性同位体の発する放射線量をシンチレーションカウンター等により測定する。また、蛍光色素を用いる場合には、蛍光顕微鏡を組み合わせた測定装置によって蛍光量を測定すればよい。さらに、１次抗体と標識化２次抗体を用いたサンドイッチ法（標識として酵素を用いた場合には「ELISA法」）も好ましく用いることができる。
以下、前記発明の基礎となった遺伝子変異を確認したスクリーニングの手続と結果を示す。
1. 方法
1-1. 被験者とゲノムDNAの抽出
Scot-t遺伝子の分析には、合計255例の男性不妊患者を精液学に従って複数の下位群に分けた。152例（60%）は非閉塞性の無精子症であり、72例（28%）には重度の精子減少症（0.1から3×106細胞/ml）、27例（11%）は精子運動性が低く、4例（2%）が精子の数、形態および運動に異常がない特発性不妊症であった。対照群は、生殖可能な男性261例（産科医院を訪れた妊娠した妻の夫）を対象とした。
1. 方法
1-1. 被験者とゲノムDNAの抽出
Scot-t遺伝子の分析には、合計255例の男性不妊患者を精液学に従って複数の下位群に分けた。152例（60%）は非閉塞性の無精子症であり、72例（28%）には重度の精子減少症（0.1から3×106細胞/ml）、27例（11%）は精子運動性が低く、4例（2%）が精子の数、形態および運動に異常がない特発性不妊症であった。対照群は、生殖可能な男性261例（産科医院を訪れた妊娠した妻の夫）を対象とした。
前記の各不妊患者および健常者のゲノムDNAを、プロテアーゼおよびフェノールを用いる公知の方法（Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989）により抽出して使用した。
1-2. ヒトScot-tゲノムDNA中の変異同定
ヒトScot-tにはコーディング領域の中央部に19bpの欠失（745番から762番までの18個のヌクレオチドと、15個のヌクレオチドをはさんで778番の1個のヌクレオチド）を持つ偽遺伝子があるため（Tanaka H, et al. Mol Human Reprod 2001; 8: 16-23）、この欠失領域を含むPCRプライマーを2種類作成し、偽遺伝子が増幅されないようにした。すなわち、5'半分の増幅には推定転写開始部位の上流にある25個のオリゴヌクレオチド（tgctctgtgacgcgcggcccgaggc：配列番号３）と770番から745番までの26個のオリゴヌクレオチド（cctccacgatctcttccacctccacc：配列番号４）、741番から764番までの24子のオリゴヌクレオチド（cggtggaggtggaagagatcgtgg：配列番号５）、そしてh-Scot-t遺伝子の推定転写ユニットの下流にある25個のオリゴヌクレオチド（tccattcctcaccactgcacacctg：配列番号６）（図1参照）を用いた。
1-2. ヒトScot-tゲノムDNA中の変異同定
ヒトScot-tにはコーディング領域の中央部に19bpの欠失（745番から762番までの18個のヌクレオチドと、15個のヌクレオチドをはさんで778番の1個のヌクレオチド）を持つ偽遺伝子があるため（Tanaka H, et al. Mol Human Reprod 2001; 8: 16-23）、この欠失領域を含むPCRプライマーを2種類作成し、偽遺伝子が増幅されないようにした。すなわち、5'半分の増幅には推定転写開始部位の上流にある25個のオリゴヌクレオチド（tgctctgtgacgcgcggcccgaggc：配列番号３）と770番から745番までの26個のオリゴヌクレオチド（cctccacgatctcttccacctccacc：配列番号４）、741番から764番までの24子のオリゴヌクレオチド（cggtggaggtggaagagatcgtgg：配列番号５）、そしてh-Scot-t遺伝子の推定転写ユニットの下流にある25個のオリゴヌクレオチド（tccattcctcaccactgcacacctg：配列番号６）（図1参照）を用いた。
中央部周辺の内部プライマー配列（730-764）周辺に位置する35個のヌクレオチドを除く、h-Scot-tのDNAの全配列決定を、h-Scot-t遺伝子の左半分および右半分をカバーする2種類のPCR増幅断片を用いて行うことが可能であった（図1）。
1-3. 組換えh-Scot-t cDNAの各種SNPタイプの遺伝子導入とスクシニルCoAトランスフェラーゼ活性分析
CaPO4を用いて各cDNAをトランスフェクションした72時間後に、HEK293細胞を溶解し、それぞれの細胞溶解液（5mgタンパク質）をHPLCを用いたクロマトグラフ処理に供して外因性SCOT-tと内因性SCOT-sを分離し、酵素活性分析を行った。スクシニルCoAトランスフェラーゼ活性の標準化は、抗SCOT-t抗体を用いたウェスタンブロッティングシグナルから濃度計により評価したh-SCOT-tタンパク質の相対量を用いて行った。
1-3. 組換えh-Scot-t cDNAの各種SNPタイプの遺伝子導入とスクシニルCoAトランスフェラーゼ活性分析
CaPO4を用いて各cDNAをトランスフェクションした72時間後に、HEK293細胞を溶解し、それぞれの細胞溶解液（5mgタンパク質）をHPLCを用いたクロマトグラフ処理に供して外因性SCOT-tと内因性SCOT-sを分離し、酵素活性分析を行った。スクシニルCoAトランスフェラーゼ活性の標準化は、抗SCOT-t抗体を用いたウェスタンブロッティングシグナルから濃度計により評価したh-SCOT-tタンパク質の相対量を用いて行った。
SCOT酵素活性は、文献（Marcondes, S., et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 7146-7151）の記載に若干の修正を加えた方法で行った。すなわち、分析混合液の内容を、50mM Tris-HCl（pH8.5）、0.2mMスクシニルCoA、5mMアセト酢酸リチウム、5mM MgCl2、5mM ヨードアセトアミド、およびh-SCOT-t分画とした。SCOT活性の分光光度分析による測定は、アセトアセチル-CoA吸収の形成を313nmで測定することにより行った。タンパク質濃度の測定はBradfordの方法により、標準物質としてウシ血清アルブミンを用いて行った。
2. 結果
2-1. ヒトScot-t DNAの配列分析
前記1-2に記載したPCRプライマーの設定により、偽遺伝子DNAを増幅せず、真のScot-tゲノムDNAのみを増幅することによって、不妊の危険性がある男性と生殖能力の証明された対照男性との比較を行った。
2. 結果
2-1. ヒトScot-t DNAの配列分析
前記1-2に記載したPCRプライマーの設定により、偽遺伝子DNAを増幅せず、真のScot-tゲノムDNAのみを増幅することによって、不妊の危険性がある男性と生殖能力の証明された対照男性との比較を行った。
その結果、表１に示した4箇所の一塩基多型（single nucleotide polymorphism: SNP）が見られたが、不妊患者255例と対照となる生殖能力の証明されたボランティア261例との合計516例の男性において、1箇所は3'非コーディング領域に存在し（t1667c）、他の箇所はコーディング領域に存在して第38、285および352番のアミノ酸変化を誘導していた（図１）。コンセンサスミトコンドリア標的シーケンスドメイン内部の38番アミノ酸（L38P）に位置するt129c SNPは、生殖可能な対照群と不妊患者において、それぞれ94%（246例）および96%（246例）がメジャーのホモ接合ロイシンタイプであり（t/t）、5.4%（14例）および2.7%（7例）がヘテロ接合（t/c）、そして0.4%（1例）および0.8%（2例）がマイナーのホモ接合でありプロリン（c/c）へのアミノ酸変化の原因となっていることが観察された。285番アミノ酸（L285R）に位置するt870g SNPは、生殖可能な対照群と不妊患者において、それぞれ80%（208例）および80%（204例）がメジャーのホモ接合ロイシンタイプであり（t/t）、19%（50例）および15%（39例）がヘテロ接合（t/g）、そして1.1%（3例）および4.7%（12例）がSNPのマイナー型のホモ接合（g/g）、でありアルギニン（g/g）へのアミノ酸変化の原因となっていることが観察された。352番アミノ酸（T352M）に位置するc1071t SNPは、正常対照群と不妊男性において、それぞれ96%（250例）および93%（238例）がメジャーのホモ接合ロイシンタイプであり（c/c）、3.1%（8例）および4.3%（11例）がヘテロ接合（c/t）、そして0.8%（2例）および2.4%（6例）がマイナー型のホモ接合（c/c）でありスレオニン（c/c）からメチオニン（t/t）へのアミノ酸変化の原因となっていることが観察された。3箇所の領域でアミノ酸変化を引き起こすホモ接合SNPsの発現率は、生殖可能な対照群と比べて不妊患者母集団のほうが2から4倍有意な高値を示した。さらにここでは、3'非コーディング領域中に非常に興味深いSNP（t1667c）が見出された。正常対照群と不妊男性母集団において、それぞれ80%（206例）および80%（200例）がメジャーのt型ホモ接合であり（t/t）、19%（49例）および15%（38例）がヘテロ接合（c/t）、そして1.2%（3例）および4.8%（12例）がc型のマイナーホモ接合（t/t）であった。これらのマイナーのホモ接合の事例は全て二重SNPsであり、正常な生殖可能対照群（3例の男性）と不妊患者（12例の男性）の両方において、それぞれt870gにおける遺伝子型がマイナーg型ホモ接合であったが、不妊事例において1例の例外が見られた（以上、表２、表３）。
2-2. SNPsを有する組換えh-SCOT-tのスクシニルCoAトランスフェラーゼ活性
h-SCOT-t酵素活性に対するSNPsの影響を調べるため、アミノ酸置換を生じる3箇所のSNPsを保有する組換えタンパク質をHEK293細胞中で発現させ、スクシニルCoAトランスフェラーゼ活性の分析をin vitroで行った。t129c（L38P）とc1392t（T352M）に位置するマイナー型のSNPsは、いずれもメジャー型SNPsと同様なレベルの酵素活性を示した。対照的にT870G（L285R）に位置するマイナー型（g/g）のSNPは、メジャー型と比較してin vitroで約半分ほど酵素活性を減少させた（表４）。この結果から、h-SCOT-tのスクシニルCoAトランスフェラーゼ活性が男性不妊の前提条件であり、酵素活性を減少させるSNPsの中には男性不妊の原因となるものが存在することが示される。
h-SCOT-t酵素活性に対するSNPsの影響を調べるため、アミノ酸置換を生じる3箇所のSNPsを保有する組換えタンパク質をHEK293細胞中で発現させ、スクシニルCoAトランスフェラーゼ活性の分析をin vitroで行った。t129c（L38P）とc1392t（T352M）に位置するマイナー型のSNPsは、いずれもメジャー型SNPsと同様なレベルの酵素活性を示した。対照的にT870G（L285R）に位置するマイナー型（g/g）のSNPは、メジャー型と比較してin vitroで約半分ほど酵素活性を減少させた（表４）。この結果から、h-SCOT-tのスクシニルCoAトランスフェラーゼ活性が男性不妊の前提条件であり、酵素活性を減少させるSNPsの中には男性不妊の原因となるものが存在することが示される。
Claims (14)
- 男性不妊関連遺伝子Scot-tから転写されるmRNAに相補的なポリヌクレオチドであって、配列番号１のDNA配列において、以下の群：
第870位tがgに置換；および
第1667位tがcに置換
より選択される１以上の変異を有するポリヌクレオチドまたはその相補配列からなるポリヌクレオチド。 - 請求項１のポリヌクレオチドの一部であって、その変異箇所を含む20〜100の連続したDNA配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補配列からなるオリゴヌクレオチド。
- 請求項１のポリヌクレオチドをPCR増幅するためのプライマーセットであって、一方のプライマーが、変異箇所を含む15〜30の連続したDNA配列またはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドであるプライマーセット。
- 請求項１のポリヌクレオチドの発現産物であって、配列番号２のアミノ酸配列において、第285位LeuがArgに置換された変位を有するポリペプチド。
- 請求項４のポリペプチドの一部であって、変異箇所を含む5〜30の連続したアミノ酸配列からなるオリゴペプチド。
- 請求項５のオリゴペプチドを抗原として作製された抗体。
- 男性不妊の検査方法であって、被験者から単離した染色体DNA中に請求項１のポリヌクレオチドが存在するか否かを検出することを特徴とする方法。
- 被験者から単離した染色体DNAまたはそのmRNAと、請求項１のポリヌクレオチド、または請求項２のオリゴヌクレオチド、もしくはそれらの相補配列からなるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドがストリンジェントな条件下でハイブリダイズするか否かを検出する請求項７の方法。
- 被験者から単離した染色体DNAまたはmRNAを鋳型とし、請求項３のプライマーセットを用いてPCRを行った場合のPCR産物の有無を検出する請求項７の方法。
- 男性不妊の検査方法であって、被験者から単離した生体試料中に請求項４のポリペプチドが存在するか否かを検出することを特徴とする方法。
- 被験者から単離した生体試料中に、請求項６の抗体と反応するポリペプチドが存在するか否かを検出する請求項１０の方法。
- 請求項２のオリゴヌクレオチドを標識化したことを特徴とする男性不妊検査用DNAプローブ。
- 請求項２のオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする男性不妊検査用DNAチップ。
- 請求項６の抗体を標識化したことを特徴とする標識化抗体。
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