JP4179765B2

JP4179765B2 - Lipid metabolism improver

Info

Publication number: JP4179765B2
Application number: JP2001219687A
Authority: JP
Inventors: 孝利村瀬; 智仁水野; 正長谷; 一郎時光; 守中村
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2001-07-19
Filing date: 2001-07-19
Publication date: 2008-11-12
Anticipated expiration: 2021-07-19
Also published as: JP2003034636A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血糖値上昇抑制剤、高レプチン血症予防・改善剤、高インスリン血症予防・改善剤、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体(PPAR:Peroxisome Proliferator Activated Receptor)依存的遺伝子転写活性化剤、脂肪代謝促進剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
日本人の糖尿病患者は近年増加の一途をたどっており、大きな社会問題となってきている。糖尿病の９０％以上を占める２型糖尿病は、膵β細胞からのインスリンの分泌低下とインスリン標的臓器である骨格筋、肝臓、脂肪組織でのインスリン感受性の低下（インスリン抵抗性）が様々な程度合わさってインスリン作用の低下が起こり、高血糖をきたした状態と言える。インスリン分泌低下は主に遺伝的に規定されている可能性が高く、インスリン抵抗性には遺伝素因と共に過食、高脂肪食、運動不足などの環境因子に起因する肥満、特に内臓に脂肪が多く蓄積した内臓脂肪型肥満が大きく関与すると考えられている。肥満に伴うインスリン抵抗性の存在は、その代償として高インスリン血症を招くことになる。生体は肥満によって生じるインスリン抵抗性に対してインスリンを過剰分泌することにより対応するが、インスリン抵抗性が持続すると膵β細胞が疲弊し、インスリン分泌能が徐々に低下し、糖尿病状態に進行する。高血糖状態が持続すると、ブドウ糖自身が膵β細胞のインスリン分泌、末梢でのインスリン抵抗性を増大させ、ブドウ糖毒性が発揮される。ここに悪循環が形成され、障害の程度が更に悪化する。従って、インスリン抵抗性を改善する薬剤は糖尿病の治療薬として極めて有用であると考えられる（生化学：７１巻１１号，pp1281-1298, 1999、化学と生物：３７巻２号，pp120-125、臨床検査：４２巻４号，pp395-403, 1998、Mebio別冊：Multiple risk factor syndrome 2, 1999）。
一方、レプチンは脂肪細胞から分泌されるペプチドホルモンで、食欲調節やエネルギー代謝に深く関与する事が明らかになりつつある。ヒトでは一般に肥満者ほど血中レプチン値が高く、体格指数(Body mass index; BMI)や体脂肪率と正の相関を示す。従って、ヒトにおける肥満の病態はレプチンの分泌不全ではなく、中枢あるいは末梢におけるレプチン感受性の低下（レプチン抵抗性）であり、それにより代償的に血中レプチン濃度が上昇するものと考えられている（Diabetes & Metabolism,23,16-24,1997、別冊医学の歩み：脂肪細胞：49-53, 1999）。
【０００３】
PPAR(Peroxisome Proliferator Activated Receptor：ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体)は核内受容体の１種であり、1990年に脂肪分解に関与する細胞内小器官であるペルオキシソームを増加させる作用を仲介する蛋白として同定され、ペルオキシソーム増殖剤により活性化を受けるレセプターという意味でPeroxisome Proliferator Activated Receptorα(ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体:PPARα)と名付けられた。その後α型と構造上類似したアイソフォーム遺伝子としてβ／δ型及びγ型が同定され、合計３つのサブタイプから成ることが知られている。ヒトとマウスのγ型遺伝子には２つのプロモーターが存在するため、スプライシングの違いによってＮ末端の異なるPPARγ1とPPARγ2の２種類の蛋白質がある。PPARの各サブタイプはリガンド依存的に活性化され、９−シスレチノイン酸をリガンドとするRXR(Retinoid X Receptor)とヘテロ２量体を形成することで、プロモーター領域（転写制御領域）にPPAR応答配列(PPAR responsive element; PPRE)を有する種々の遺伝子の発現を制御している。近年PPARは非常に多くの生理、病理現象に関わっていることが明らかになってきた。中でもPPARαの機能は脂肪酸の合成・輸送・分泌、脂肪消費臓器におけるATP産生、細胞周期の調節等幅広く生体のエネルギー代謝や恒常性の維持に関わるものと考えられている。特にβ-酸化など脂肪酸代謝に重要な酵素(Acyl-CoA oxidase, HMG-CoA synthase, Acyl-CoA synthase, Medium chain acyl dehydrogenase, Fatty acid binding protein, Lipoprotein lipase等)の遺伝子発現はPPARの活性化に強く依存していることが明らかになってきている。言い換えれば、PPAR活性化剤は生体の脂質代謝を活性化する作用を有することが明らかになってきている。生体脂質代謝の活性化は高脂血症の改善や抗肥満にもつながる有用な作用である。また、PPARγ、特にPPARγ2は脂肪細胞に比較的強い特異性を持って発現しており、脂肪細胞分化の中心的役割を果たしていることが明らかになっている。（細胞：31(6), 218-234, 1999、J.Lipid Res. 37,907-925, 1996、Curr.Opin.Lipidol. 10, 151-159, 1999）
【０００４】
高脂血症治療薬であるフィブラート系化合物がPPARαのアゴニストであること、糖尿病治療薬として知られるチアゾリジン誘導体がPPARγのアゴニストであることが明らかにされて以来、これらの化合物に続くPPARアゴニストの探索が進められ、高脂血症やインスリン抵抗性、糖尿病の改善薬として開発が試みられている。そしてこれまでにPPARアゴニストとして、チアゾリジン誘導体、フィブラート系化合物の他、脂肪酸、ロイコトリエンＢ４、インドメタシン、イブプロフェン、フェノプロフェン、15-deoxy-Δ-12,14-PGJ2 など(Cell.83,813-819,1995、J.Biol.Chem. 272(6),3406-3410, 1997、Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 94,4321- ,1997、J.Biol.Chem. 274(10),6718-6725,1999、Mebio別冊;Multiple Risk Factor Syndrome 2,88-96, 1999)が報告されている。
【０００５】
【発明を解決しようとする課題】
しかしこれらの化合物には長期摂取による副作用などの問題がある。上記のような状況に鑑み、抗糖尿病、抗インスリン抵抗性薬剤の探索が進められ、これまでにトログリタゾンやピオグリタゾンなどのいわゆるチアゾリジン系薬剤が開発され、その有効性が確認されている。その一方で、死亡例を伴う重篤な肝障害も報告されており、安全性に優れた薬剤の開発が望まれている。
水溶性物質の抗肥満効果に関しては、カワラヨモギ、ヤマヨモギからの抽出物およびその中に含まれるカフェ酸、クロロゲン酸、3,5-ジカフェオイルキナ酸、4,5-ジカフェオイルキナ酸、クロロゲニン酸メチルについて、抗肥満効果および脂質代謝に関する効果が報告されている（特開昭61-40763）しかしながら、味、臭いの関係から、ヨモギ由来のものを連用することは難しい。
【０００６】
本発明の目的は、一度に大量の摂取が可能で、日常的に摂取しても負担にならず、かつ安全性に優れ、より高い血糖値上昇抑制効果、高レプチン血症予防・改善効果、高インスリン血症予防・改善効果、脂質代謝改善効果を有する薬剤、食品等を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、クロロゲン酸類を食餌依存的に肥満・２型糖尿病を発症するＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスに投与すると、肥満を抑制し、血糖値の上昇を抑制して糖尿病の予防・改善に有効であって、更に血中インスリン及びレプチン量の増加抑制作用を有することを見出した。
また、本発明者は、クロロゲン酸類はPPAR依存的遺伝子転写活性化作用、脂質代謝関連遺伝子転写活性作用を有し、特定物質と併用すると優れた脂質代謝促進効果が得られることを見出した。
【０００８】
本発明は、クロロゲン酸類からなる血糖値上昇抑制剤、高レプチン血症予防・改善剤、高インスリン血症予防・改善剤、PPAR依存的遺伝子転写活性化剤を提供するものである。
また、本発明は、モノカフェオイルキナ酸／ジカフェオイルキナ酸の重量比が１２０／１〜１／１であるクロロゲン酸類からなる脂質代謝促進剤を提供するものである。
更に、本発明は、クロロゲン酸類及びカフェインからなりクロロゲン酸類／カフェインの重量比が４／１〜２／５である脂質代謝促進剤を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明で使用するクロロゲン酸類としては、３−カフェオイルキナ酸（ネオクロロゲン酸）、４−カフェオイルキナ酸（クリプトクロロゲン酸）、５−カフェオイルキナ酸、３，４−ジカフェオイルキナ酸、３，５−ジカフェオイルキナ酸、４，５−ジカフェオイルキナ酸、３−フェルロイルキナ酸、４−フェルロイルキナ酸、５−フェルロイルキナ酸、３−フェルロイル−４−カフェオイルキナ酸等が挙げられる。
【００１０】
また、他の植物体からの抽出されるこれらの物質及びそれら誘導体を使用してもよく、その抽出物として、カフェ酸ジメチルエーテル、２−Ｏ−カフェオイル−アルブチン、カフェオイル−カレリヤニン、３−Ｏ−カフェオイル−シキミ酸、カフェ酸ドコサノールエステル、カフェ酸エイコサノールエステル、カフェ酸ヘネイコサノールエステル、カフェ酸トリコサノールエステル、カフェ酸テトラコサノールエステル、カフェ酸ペンタコサノールエステル、カフェ酸ヘキサコサノールエステル、フェルラ酸ドコサノールエステル、フェルラ酸エイコサノールエステル、フェルラ酸ヘネイコサノールエステル、フェルラ酸トリコサノールエステル、フェルラ酸テトラコサノールエステル、フェルラ酸ペンタコサノールエステル、フェルラ酸ヘキサコサノールエステル、エイコシル−フェルラ酸エステル、フキノール酸、エキナコシド（Echinacoside）、１，３−ジカフェオイルキナ酸、シコリック酸（Cichoric acid）、コニフェリルアルコール、クルクミン、リグナン類、リグニン等が挙げられる。
【００１１】
これらを含有する植物抽出物としては、例えば、コーヒー、リンゴ、ブドウ、タマネギ、ダイコン、レモン、センキュウ、トウキ、マツ、オウレン、ウコン、アギ、カンショ、ヒマワリの葉、ヒマワリの種子、モロヘイヤ、トウモロコシ、大麦、小麦、コメ等が好ましく、特にコメが好ましい。ここで、コメとは、イネ科イネ（Oryza sativa LINNE）の種実等の生又は乾燥物を意味する。特に、コーヒー生豆、南天の葉、リンゴ未熟果などのクロロゲン酸を多く含む植物体から抽出したものでもよく、例えば、アカネ科コーヒー（Coffea arabica LINNE）の種子より、温時アスコルビン酸又はクエン酸酸性水溶液で抽出して得られる生コーヒー豆の抽出物をこれらに置き換えて利用することができる。
植物抽出液中、好ましいものとしては、コーヒー、リンゴ、ブドウ、タマネギ、ダイコン、レモン、センキュウ、トウキ、マツ、オウレン、ウコン、アギ、カンショ、ヒマワリの葉、ヒマワリの種子、モロヘイヤ、トウモロコシ、大麦、小麦、コメ等が好ましく、特にコメが好ましい。ここで、コメとは、イネ科イネ（Oryza sativa LINNE）の種実等の生又は乾燥物が挙げられ、更に好ましくは、コーヒー、リンゴ、ブドウが挙げられる。
【００１２】
クロロゲン酸類の骨格であるフェルラ酸は、上記工程より得られたフェルラ酸エステルを加圧下熱時硫酸で加水分解し、精製して得るか、又は細菌（Pseudomonas）を、フトモモ科チョウジノキ（Syzygium aromaticum MERRILL et PERRY）のつぼみ及び葉より水蒸気蒸留で得られた丁子油、又は丁子油から精製して得られたオイゲノールを含む培養液で培養し、その培養液を、分離、精製して得ることができる。また、化学合成によってフェルラ酸を調製する場合は、例えば、バニリンとマロン酸との縮合反応による方法を挙げることができる（Journal of American Chemical Society,74,5346,1952）。なお、フェルラ酸等には立体異性体が存在するがいずれの異性体も使用することができ、また異性体の混合物であってもよい。
【００１３】
本発明で使用するクロロゲン酸類は、そのカルボキシル基が遊離のものの他に、ナトリウム塩、カリウム塩なような塩の状態の物及びその混合物でも良い。
このような塩の塩形成用の塩基物質としては、例えば、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属の水酸化物；水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム等のアルカリ土類金属の水酸化物；水酸化アンモニウム等の無機塩基、アルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチン等の塩基性アミノ酸；モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン等の有機塩基が用いられるが、特にアルカリ金属又はアルカリ土類金属の水酸化物が好ましい。
【００１４】
更にクロロゲン酸類を血糖値上昇抑制剤、高レプチン血症予防・改善剤、高インスリン血症予防・改善剤、PPAR依存的遺伝子転写活性剤として使用する場合、クロロゲン酸類中の、モノカフェオイルキナ酸とジカフェオイルキナ酸の含有重量比率モノカフェオイルキナ酸／ジカフェオイルキナ酸が１２０／１〜１／１であることが好ましい。更に、好ましくは１００／１〜２／１、特に好ましくは１００／１〜５／１である。モノカフェオイルキナ酸としては、３−カフェオイルキナ酸、４−カフェオイルキナ酸、５−カフェオイルキナ酸また、ジカフェオイルキナ酸としては、３，４−ジカフェオイルキナ酸、３，５−ジカフェオイルキナ酸、４，５−ジカフェオイルキナ酸、３−フェルロイルキナ酸、４−フェルロイルキナ酸、５−フェルロイルキナ酸、３−フェルロイル−４−カフェオイルキナ酸が挙げられる。
【００１５】
クロロゲン酸類中のモノカフェオイルキナ酸とジカフェオイルキナ酸の含有量の重量比モノカフェオイルキナ酸／ジカフェオイルキナ酸が１２０／１〜１／１の範囲で摂取すると脂質代謝促進効果が優れ好ましい。またこのモノカフェオイルキナ酸／ジカフェオイルキナ酸の重量比は、更に好ましくは２５／１〜１／１、特に２５／１〜２／１が好ましい。
【００１６】
また、クロロゲン酸類は、一定量比でカフェインと組み合せて摂取すると優れた脂質代謝改質効果が得られる。
クロロゲン酸類とカフェインの含有量の重量比率クロロゲン酸類／カフェインが２０／１〜１／１０、更に好ましくは１０／１〜２／５、特に４／１〜２／５が好ましい。この場合のクロロゲン酸類中のモノカフェオイルキナ酸とジカフェオイルキナ酸の含有量の重量比率は、モノカフェオイルキナ酸／ジカフェオイルキナ酸が１２０／１〜１／１、更に好ましくは１００／１〜２／１、特に２５／１〜２／１であるのが好ましい。
【００１７】
本発明のクロロゲン酸類は賦形剤及びその他の添加剤とともに任意の形態に製剤化される。かかる賦形剤、添加剤の例として、固形状のものとしては乳糖、カオリン、ショ糖、結晶セルロース、コーンスターチ、タルク、寒天、ペクチン、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、レシチン、塩化ナトリウム等が挙げられ、液状のものとしてはグリセリン、落花生油、ポリビニルピロリドン、オリーブ油、エタノール、ベンジルアルコール、プロピレングリコール、水等が挙げられる。
【００１８】
本発明のクロロゲン酸及びそれを含有する組成物は、その剤型に応じて経口、経腸、注射、経粘膜、経皮等いずれの経路によってもヒトに投与あるいは摂取することができる。
またその量は、年齢、体重、性別、投与方法等の種々の要因によって異なるが、経口投与の場合は通常大人１人当たり１回に１００〜５０００mgが望ましい。血糖値上昇抑制剤として使用する場合には、３００〜５０００mg、特に４００〜１０００mgの範囲を１日１回〜数回に分けて投与することが好ましい。
また、高レプチン血症予防・改善剤、高インスリン血症予防・改善剤として使用する場合には、３００〜５０００mg、特に４００〜１０００mgの範囲を１日１回〜数回に分けて投与することが好ましい。
PPAR依存的遺伝子転写活性剤として、使用する場合にも、３００〜５０００mg、特に４００〜１０００mgの範囲を１日１回〜数回に分けて投与することが好ましい。
脂肪代謝促進剤として、使用する場合には、３００〜５０００mg、特に４００〜１０００mgの範囲を１日１回〜数回に分けて投与することが好ましい。
【００１９】
本発明の剤型としては、例えば錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、トローチ剤、シロップ剤、乳液、軟ゼラチンカプセル、ゲル、ペースト、注射剤、クリーム、ジェル、ローション、貼付剤等が挙げられる。また、種々の形態の飲料、スナック類、乳製品、調味料、でんぷん加工製品、加工肉製品等あらゆる食品に適宜配合することができる。特に脂質代謝促進剤として使用する場合は、容器詰飲料とするのが好ましい。
【００２０】
本発明のクロロゲン酸類は、摂取、投与のしやすさから通常製剤中０．０１〜１００重量％であるのが好ましく、特に好ましくは、０．０５〜９５重量％、更に好ましくは、０．１〜９０重量％である。
【００２１】
【実施例】
実施例１
食餌誘導性肥満・２型糖尿病モデルであるＣ５７ＢＬ／６Ｊ系マウスを使用した肥満、血糖、血中インスリン、血中レプチンに対する効果試験
７週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ系雄性マウスを各群５匹ずつ３群に分け、表１記載の組成の各食餌で飼育する。４ヶ月後体重を測定するとともに、１２時間絶食後エーテル麻酔下で腹部大動脈より採血を行い空腹時血清グルコース、インスリン、レプチン値を測定する。結果を表２に示す。
【００２２】
【表１】

【００２３】
【表２】

【００２４】
第２群では第１群に比較し、有意な体重の上昇が認められたのに対して、第３群においては第１群に対して体重の上昇は少なく、また第２群に対して体重は低値を示した。本発明のクロロゲン酸は抗肥満効果が優れていた。
第２群では第１群に比較し、有意な血糖値（グルコース）の上昇が認められたのに対して、第３群においては第１群に対しての血糖値上昇は少なく、また第２群に対して血糖値は低値を示した。本発明のクロロゲン酸は、血糖値上昇抑制効果に優れ、更に糖尿病に有効であった。
第２群では第１群に比較し、有意なインスリン値の上昇が認められたのに対して、第３群においては第１群に対してのインスリン値の上昇は少なく、また第２群に対してインスリン値は低値を示した。本発明のクロロゲン酸は、血中インスリン値上昇抑制に優れ、更にインスリン抵抗性に有効であった。
第２群では第１群に比較し、有意なレプチン値の上昇が認められたのに対して、第３群においては第１群に対してのレプチン値の上昇は少なく、また第２群に対してレプチン値は低値を示した。本発明のクロロゲン酸は、血中レプチン値上昇抑制に優れ、更にレプチン抵抗性に有効であった。
【００２５】
実施例２
PPAR依存的遺伝子転写活性化試験
小腸上皮細胞株IEC-6を12well plateにまき、DMEM(1%FCS)中で１日培養する。PPAR応答配列（下線）(AACgTgACCTTTgTCCTggTC AACgTgACCTTTgTCCTggTC AACgTgACCTTTgTCCTggTC)を含むDNA鎖、SV40プロモター遺伝子、蛍ルシフェラーゼ遺伝子を含むPPARレポータープラスミド(PPAR-Luc)及び、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の上流にチミジンキナーゼプロモーター遺伝子を連結したコントロールプラスミド(TK-Luc:Promega)を同時に各々0.5μg/wellとなるようトランスフェクション試薬(Superfect transfection reagent; QIAGEN)を用いて導入した。その後培養液を被験物質を含むDMEM(-FCS)培地に交換し、さらに24時間培養した。PBSにて洗浄後デュアルルシフェラーゼアッセイシステム(Promega)を用いて細胞を溶解、溶解液にルシフェリンを含む基質溶液を加え、ルミノメーターにて蛍及びウミシイタケルシフェラーゼ活性を各々測定した。本実験系でPPAR依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性１）を測定することにより、PPAR活性能の評価を行った。尚、PPAR依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性１）は以下のように定義した。
【００２６】
PPAR依存的な遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性１）＝（PPAR-Lucによる蛍ルシフェラーゼ活性）／（TK-Lucによるウミシイタケルシフェラーゼ活性）
【００２７】
IEC-6細胞における各被験物質によるPPAR活性化能を表３に示す。尚、コントロールにおけるPPAR依存的転写活性を100とし、それに対する相対値を示す。
【００２８】
【表３】

【００２９】
クロロゲン及びクロロゲン酸を含有するコーヒー抽出物はPPAR依存的遺伝子転写活性化に優れていた。
【００３０】
実施例３
HMG-CoA synthase遺伝子活性化試験
小腸上皮細胞株IEC-6を12well plateにまき、DMEM(1%FCS)中で１日培養する。ラットHMG-CoA synthase遺伝子の転写制御領域(-1081/+21)、SV40プロモター遺伝子、蛍ルシフェラーゼ遺伝子を含むPPARレポータープラスミド(HMGS-Luc)及び、ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の上流にチミジンキナーゼプロモーター遺伝子を連結したコントロールプラスミド(TK-Luc:Promega)を同時に各々0.5μg/wellとなるようトランスフェクション試薬(Superfect transfection reagent; QIAGEN)を用いて導入した。その後培養液を被験物質を含むDMEM(-FCS)培地に交換し、さらに24時間培養した。PBSにて洗浄後デュアルルシフェラーゼアッセイシステム(Promega)を用いて細胞を溶解、溶解液にルシフェリンを含む基質溶液を加え、ルミノメーターにて蛍及びウミシイタケルシフェラーゼ活性を各々測定した。本実験系でHMG-CoA synthaseの転写活性（ルシフェラーゼ活性２）を測定することにより、脂質代謝遺伝子活性能の評価を行った。尚、遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性２）は以下のように定義した。
【００３１】
遺伝子の転写活性（ルシフェラーゼ活性２）＝（HMGS-Lucによる蛍ルシフェラーゼ活性）／（TK-Lucによるウミシイタケルシフェラーゼ活性）
【００３２】
IEC-6細胞における各被験物質によるHMG-CoA synthase遺伝子活性化能を表４に示す。尚、コントロールにおける転写活性を100とし、それに対する相対値を示す。
【００３３】
【表４】

【００３４】
クロロゲンは脂質代謝酵素遺伝子の転写活性化が優れていた。
【００３５】
実施例４
食餌誘導性肥満マウスを用いた体重及び内蔵脂肪に対する抗肥満効果試験／クロロゲン酸＋カフェイン
７週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ系雄性マウスを各群５匹ずつ６群に分け、表５記載の組成の各食餌で飼育する。１ヶ月後体重を測定するとともに、内臓脂肪量（副睾丸脂肪、腸間膜脂肪、後腹膜脂肪および腎周囲脂肪）を測定した。
【００３６】
【表５】

【００３７】
【表６】

【００３８】
【表７】

【００３９】
第２群では第１群に比し、有意な体重の上昇及び内臓脂肪量増加が認められたのに対して、第３群では第２群に比し、体重増加量及び全内臓脂肪量は有意な低減を示した。さらに第４群では第３群に比し、クロロゲン酸単独よりもカフェインを添加することにより、クロロゲン酸の効力が増加し、体重増加抑制効果及び内臓脂肪量増加抑制効果は強くなった。
【００４０】
実施例５
食餌誘導性肥満マウスを用いた体重及び内蔵脂肪に対する抗肥満効果試験／クロロゲン酸単独とコーヒー豆抽出物の抗肥満効果試験
７週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ系雄性マウスを各群５匹ずつ４群に分け、表８記載の組成の各食餌で飼育する。５週間後体重を測定するとともに、内臓脂肪量（副睾丸脂肪、腸間膜脂肪、後腹膜脂肪および腎周囲脂肪）を測定した。
【００４１】
【表８】

【００４２】
【表９】

【００４３】
【表１０】

【００４４】
第２群では第１群に比し、有意な体重の上昇及び内臓脂肪量増加が認められたのに対して、第３群及び第４群では第２群に比し、体重増加量及び全内臓脂肪量は低下した。
【００４５】
実施例６
生活習慣病予防・改善用カプセル剤
カプセル化剤中に下記組成物（４００mg）を封入した。
クロロゲン酸６８重量％
コーンスターチ１０
セルロース１０
トコフェロール２
乳糖１０
【００４６】
実施例７
次法によりコーヒー豆抽出物水を用いて容器詰飲料を製造し、その飲料中のモノカフェオイルキナ酸、ジカフェオイルキナ酸、クロロゲン酸類及びカフェインの分析を行った。
・モノカフェオイルキナ酸及びジカフェオイルキナ酸の分析
＜分析機器＞
ＨＰＬＣ（日立製作所製）を使用した。装置の構成ユニットの型番は次の通り。
プロッター：Ｄ−２５００
ディテクター：Ｌ−４２００
ポンプ：Ｌ−７１００
オートサンプラー：Ｌ−７２００
カラム：lnertsil ODS-2、内径２．１mm×長さ２５０mm
＜分析条件＞
サンプル注入量：１０μＬ
流量：０．３mL／min
紫外部吸光光度計検出波長：３２５nm
溶離液Ａ：０．０５Ｍ酢酸３％アセトニトリル溶液
溶離液Ｂ：０．０５Ｍ酢酸１００％アセトニトリル溶液
濃度勾配条件
時間溶離液Ａ溶離液Ｂ
０分１００％０％
５分１００％０％
２０分８０％２０％
３５分８０％２０％
４５分０％１００％
６０分０％１００％
７０分１００％０％
１２０分１００％０％
＜モノカフェオイルキナ酸及びジカフェオイルキナ酸のリテンションタイム＞
（単位：分）
モノカフェオイルキナ酸：１９．７、２２．４、２３．５の計３点
ジカフェオイルキナ酸：３２．２、３２．８の計２点
ここで求めたエリア％の合計値を求め、モノ体とジ体の比率を算出した。
【００４７】
・クロロゲン酸類の分析
分析機器、分析条件はモノ体及びジ体の場合と同様である。
＜クロロゲン酸類のリテンションタイム＞
（単位：分）
モノカフェオイルキナ酸：１９．７、２２．４、２３．５の計３点
ジカフェオイルキナ酸：３２．２、３２．８の計２点
フェルラキナ酸：２６．４、２７．１の計２点
ここで求めたエリア％から５位のカフェオイルキナ酸を標準物質とし、重量％を求めた。
【００４８】
・カフェイン分析方法及び定義
＜分析機器＞
モノ及びジカフェオイルキナ酸の分析の場合と同じ機器を用いた。
＜分析条件＞
サンプル注入量：１０μＬ
流量：１．０mL／min
紫外部吸光光度計検出波長：２８０nm
溶離液Ａ：０．１Ｍ酢酸水溶液
溶離液Ｂ：０．１Ｍ酢酸アセトニトリル溶液
濃度勾配条件（％は体積％）
時間溶離液Ａ溶離液Ｂ
０分９７％３％
５分９７％３％
３７分８０％２０％
４３分８０％２０％
４３．５分０％１００％
４８．５分０％１００％
４９分９７％３％
６２分９７％３％
＜カフェインのリテンションタイム＞
（単位：分）
カフェイン：２７．２の計１点
ここで求めたエリア％から標準物質により、重量％を求めた。
【００４９】
容器詰飲料の製造：
（１）製造例１
タンザニアＡＡ（ユニカフェ社製、Ｌ値２６）のコーヒー豆２００ｇに対し、抽出液２００ｇを加え抽出液を得た。この時抽出液のブリックス値は９．９５であった。
表１１の組成の容器詰飲料を製造した。なお、飲料は１９０mLスチール缶に充填後、レトルト殺菌試験機（日阪製作所製）を用いて、１２３．５℃で２５分間保持し、Ｆ値（殺菌指標）４３となるような条件で熱処理を行った。Ｆ値３．１でボツリヌス菌を死滅できるレベルとなる。
（２）製造例２
タンザニアＡＡ（ユニカフェ社製、Ｌ値２６）のコーヒー豆２００ｇに対し、抽出液２０００ｇを加えたのち、更に２００ｇを加えた最後の２００ｇのみを採取し抽出液を得た。この時抽出液のブリックス値は０．３８であった。
表１１の組成の容器詰飲料を製造した。なお、飲料は１９０mLスチール缶に充填後、レトルト殺菌試験機（日阪製作所製）を用いて、１２１．５℃で１０分間保持し、Ｆ値（殺菌指標）１０となるような条件で熱処理を行った。尚、Ｆ値３．１でボツリヌス菌を死滅できるレベルとなる。
【００５０】
０．０５Ｍ酢酸を用いて、滅菌後容器詰飲料の飲料濃度を１５重量％に希釈した。次いで１００００r／minで５分間、遠心分離機（久保田商事（株）ＫＲ−１５００）にかけ、上澄液を採取し、注入量１０μＬでＨＰＬＣで分析を行った。結果を表１１に示す。
【００５１】
【表１１】

【００５２】
製造例１、２の飲料を飲用した結果、良好な味と共に脂質代謝が促進された。
【００５３】
【発明の効果】
本発明のクロロゲン酸類は優れたPPAR依存的遺伝子転写活性化作用を有し、遺伝子の転写調節領域にPPAR responsive element (PPRE)を有する遺伝子を活性化することにより、特に脂質代謝を活性化し、それにより種々の生活習慣病に対する効果を有する。特に、クロロゲン酸を摂取することにより肥満の予防・改善、血糖上昇抑制あるいは血糖低下、高レプチン血症予防・改善、高インスリン血症予防・改善効果が得られ、その結果、糖尿病の予防・改善効果が得られる。また、クロロゲン酸類は長年にわたり日常的に食品として摂取しているものであり安全性も高いので、飲食品又は薬剤として摂取しても副作用の心配は少ない。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a blood glucose level increase inhibitor, a hyperleptinemia preventive / ameliorating agent, a hyperinsulinemia preventive / ameliorating agent, a peroxisome proliferator activated receptor (PPAR) -dependent gene transcription activator. , Relating to fat metabolism promoters.
[0002]
[Prior art]
The number of Japanese diabetic patients has been increasing in recent years and has become a major social problem. Type 2 diabetes, which accounts for more than 90% of diabetes, is combined with various degrees of decrease in insulin secretion from pancreatic β-cells and decreased insulin sensitivity (insulin resistance) in the skeletal muscle, liver and adipose tissues that are insulin target organs. It can be said that the insulin action is reduced and hyperglycemia occurs. Low insulin secretion is likely genetically regulated, and insulin resistance is associated with genetic predisposition as well as obesity caused by environmental factors such as overeating, high-fat diet, lack of exercise, and a lot of fat accumulated in the internal organs Visceral fat type obesity is considered to be greatly involved. The presence of insulin resistance associated with obesity results in hyperinsulinemia as a compensation. The living body responds to the insulin resistance caused by obesity by oversecreting insulin, but if insulin resistance persists, the pancreatic β cells are exhausted, the insulin secretory ability gradually decreases, and progresses to a diabetic state. When the hyperglycemic state persists, glucose itself increases insulin secretion of pancreatic β cells and insulin resistance in the periphery, and glucose toxicity is exhibited. A vicious circle is formed here, and the degree of failure gets worse. Therefore, it is considered that a drug that improves insulin resistance is extremely useful as a therapeutic agent for diabetes (Biochemistry: Vol. 71, No. 11, pp 1281-1298, 1999, Chemistry and Biology: Vol. 37, No. 2, pp 120-125, Clinical examination: 42 vol.4, pp395-403, 1998, Mebio separate volume: Multiple risk factor syndrome 2, 1999).
On the other hand, leptin is a peptide hormone secreted from adipocytes, and it is becoming clear that it is deeply involved in appetite regulation and energy metabolism. In humans, generally obese people have higher blood leptin levels, which are positively correlated with body mass index (BMI) and body fat percentage. Therefore, the pathological condition of obesity in humans is not a leptin secretion deficiency but a decrease in leptin sensitivity (leptin resistance) in the center or periphery, which is thought to increase blood leptin concentration in a compensatory manner ( Diabetes & Metabolism, 23 , 16-24, 1997, History of Separate Medicine: Adipocytes: 49-53, 1999).
[0003]
PPAR (Peroxisome Proliferator Activated Receptor) is a type of nuclear receptor that mediates the action of increasing peroxisomes, which are organelles involved in lipolysis in 1990. It was identified and named Peroxisome Proliferator Activated Receptor α (peroxisome proliferator-activated receptor: PPARα) in the sense of a receptor that is activated by a peroxisome proliferator. Subsequently, β / δ type and γ type were identified as isoform genes structurally similar to α type, and it is known that it consists of a total of three subtypes. Since there are two promoters in human and mouse γ-type genes, there are two types of proteins, PPARγ1 and PPARγ2, which differ in N-terminus due to differences in splicing. Each subtype of PPAR is activated in a ligand-dependent manner, and forms a heterodimer with RXR (Retinoid X Receptor) with 9-cis retinoic acid as a ligand, thereby responding to the PPAR response in the promoter region (transcriptional control region). It regulates the expression of various genes having sequences (PPAR responsive element; PPRE). In recent years, it has become clear that PPAR is involved in numerous physiological and pathological phenomena. In particular, the function of PPARα is thought to be related to the maintenance of energy metabolism and homeostasis in a wide range, including fatty acid synthesis, transport and secretion, ATP production in fat-consuming organs, and regulation of the cell cycle. In particular, gene expression of enzymes important for fatty acid metabolism such as β-oxidation (Acyl-CoA oxidase, HMG-CoA synthase, Acyl-CoA synthase, Medium chain acyl dehydrogenase, Fatty acid binding protein, Lipoprotein lipase, etc.) It is becoming clear that there is a strong dependence. In other words, it has become clear that a PPAR activator has an action of activating lipid metabolism in a living body. Activation of biological lipid metabolism is a useful action that leads to improvement of hyperlipidemia and anti-obesity. In addition, PPARγ, particularly PPARγ2, is expressed with relatively strong specificity in adipocytes, and has been shown to play a central role in adipocyte differentiation. (Cells: 31 (6), 218-234, 1999, J. Lipid Res. 37 , 907-925, 1996, Curr. Opin. Lipidol. 10 , 151-159, 1999)
[0004]
Since the discovery that fibrate compounds, which are antihyperlipidemic agents, are agonists of PPARα, and that thiazolidine derivatives, known as antidiabetic agents, are agonists of PPARγ, the search for PPAR agonists following these compounds As a result, it is being developed as a drug for improving hyperlipidemia, insulin resistance, and diabetes. So far, as PPAR agonists, in addition to thiazolidine derivatives and fibrate compounds, fatty acids, leukotriene B4, indomethacin, ibuprofen, fenoprofen, 15-deoxy-Δ-12,14-PGJ2, etc. (Cell. 83 , 813-819) 1995, J. Biol. Chem. 272 (6), 3406-3410, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 , 4321-, 1997, J. Biol. Chem. 274 (10), 6718- 6725, 1999, Mebio separate volume; Multiple Risk Factor Syndrome 2 , 88-96, 1999) has been reported.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
However, these compounds have problems such as side effects due to long-term intake. In view of the above situation, search for antidiabetic and anti-insulin resistance drugs has been advanced, and so-called thiazolidine drugs such as troglitazone and pioglitazone have been developed and their effectiveness has been confirmed. On the other hand, serious liver disorders accompanied by death cases have been reported, and the development of drugs with excellent safety is desired.
With regard to the anti-obesity effect of water-soluble substances, extracts from Kawara mugwort and porcupine and caffeic acid, chlorogenic acid, 3,5-dicaffeoylquinic acid, 4,5-dicaffeoylquinic acid, and chlorogenin contained therein Methyl acid has been reported to have an anti-obesity effect and an effect on lipid metabolism (Japanese Patent Laid-Open No. 61-40763). However, it is difficult to continuously use those derived from mugwort because of the relationship between taste and smell.
[0006]
The object of the present invention is that a large amount can be ingested at a time, it does not become a burden even if it is ingested on a daily basis, and is excellent in safety, has a higher blood sugar level increase inhibitory effect, a high leptinemia preventive / improving effect, The object is to provide drugs, foods and the like having the effect of preventing / ameliorating hyperinsulinemia and the effect of improving lipid metabolism.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
When the present inventors administered chlorogenic acids to C57B1 / 6J mice that develop obesity / type 2 diabetes in a diet-dependent manner, the present inventors suppressed obesity and suppressed blood glucose elevation and were effective in preventing and improving diabetes. Furthermore, it has been found that it has an inhibitory effect on the increase in blood insulin and leptin levels.
Further, the present inventor has found that chlorogenic acids have a PPAR-dependent gene transcription activation action and a lipid metabolism-related gene transcription activation action, and an excellent lipid metabolism promoting effect can be obtained when used in combination with a specific substance.
[0008]
The present invention provides a blood sugar level increase inhibitor comprising chlorogenic acids, a hyperleptinemia preventive / ameliorating agent, a hyperinsulinemia preventive / ameliorating agent, and a PPAR-dependent gene transcription activator.
The present invention also provides a lipid metabolism promoter comprising a chlorogenic acid having a weight ratio of monocaffeoylquinic acid / dicaffeoylquinic acid of 120/1 to 1/1.
Furthermore, the present invention provides a lipid metabolism promoter comprising a chlorogenic acid and caffeine and having a chlorogenic acid / caffeine weight ratio of 4/1 to 2/5.
[0009]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Examples of the chlorogenic acids used in the present invention include 3-caffeoylquinic acid (neochlorogenic acid), 4-caffeoylquinic acid (cryptochlorogenic acid), 5-caffeoylquinic acid, and 3,4-dicaffeoylquinic acid. 3,5-dicaffeoylquinic acid, 4,5-dicaffeoylquinic acid, 3-feruloylquinic acid, 4-feruloylquinic acid, 5-feruloylquinic acid, 3-ferloyl-4-caffeoyl And quinic acid.
[0010]
In addition, these substances extracted from other plants and derivatives thereof may be used. As the extract, caffeic acid dimethyl ether, 2-O-caffeoyl-arbutin, caffeoyl-carrelanine, 3-O -Caffe oil-Shikimic acid, caffeic acid docosanol ester, caffeic acid eicosanol ester, caffeic acid heneicosanol ester, caffeic acid tricosanol ester, caffeic acid tetracosanol ester, caffeic acid pentacosanol ester, cafe Acid hexacosanol ester, ferulic acid docosanol ester, ferulic acid eicosanol ester, ferulic acid heneicosanol ester, ferulic acid tricosanol ester, ferulic acid tetracosanol ester, ferulic acid pentacosanol ester, ferulic acid F Sakosa Nord ester, eicosyl - ferulic acid esters, Fukinoru acid, echinacoside (Echinacoside), 1,3- dicaffeoylquinic acid, Shikorikku acid (Cichoric acid), coniferyl alcohol, curcumin, lignans, lignins and the like.
[0011]
Plant extracts containing these include, for example, coffee, apple, grape, onion, radish, lemon, cucumber, touki, pine, auren, turmeric, agi, sweet potato, sunflower leaves, sunflower seeds, morohaya, corn, Barley, wheat, rice and the like are preferable, and rice is particularly preferable. Here, rice means raw or dried products such as seeds of Oryza sativa LINNE. In particular, it may be extracted from plants containing a lot of chlorogenic acid such as green coffee beans, southern leaves, and unripe apples. For example, ascorbic acid or citric acid from warm coffee seeds (Coffea arabica LINNE) A fresh coffee bean extract obtained by extraction with an acidic aqueous solution can be used instead of these.
Among the plant extracts, preferred are coffee, apple, grape, onion, radish, lemon, cucumber, toki, pine, auren, turmeric, agi, sweet potato, sunflower leaf, sunflower seeds, morohaya, corn, barley, Wheat, rice and the like are preferable, and rice is particularly preferable. Here, the rice includes raw or dried products such as seeds of Oryza sativa LINNE, and more preferably coffee, apples, and grapes.
[0012]
Ferulic acid, which is a skeleton of chlorogenic acids, can be obtained by hydrolyzing and purifying ferulic acid ester obtained from the above step with sulfuric acid under heating under pressure, or by purifying bacteria (Pseudomonas), Syzygium aromaticum MERRILL et PERRY) It can be obtained by culturing with clove oil obtained by steam distillation from buds and leaves, or a culture solution containing eugenol obtained by purification from clove oil, and separating and purifying the culture solution. . When ferulic acid is prepared by chemical synthesis, for example, a method by a condensation reaction of vanillin and malonic acid can be mentioned (Journal of American Chemical Society, 74 , 5346, 1952). Although ferulic acid and the like have stereoisomers, any isomer can be used, and a mixture of isomers may be used.
[0013]
The chlorogenic acids used in the present invention may be in the form of a salt such as sodium salt or potassium salt or a mixture thereof, in addition to those having a free carboxyl group.
Examples of the basic substance for salt formation of such salts include alkali metal hydroxides such as lithium hydroxide, sodium hydroxide and potassium hydroxide; alkaline earth metal such as magnesium hydroxide and calcium hydroxide. Hydroxides: inorganic bases such as ammonium hydroxide, basic amino acids such as arginine, lysine, histidine, ornithine; organic bases such as monoethanolamine, diethanolamine, and triethanolamine are used, especially alkali metals or alkaline earths Metal hydroxides are preferred.
[0014]
Furthermore, monocaffeoylquinic acid in chlorogenic acids when chlorogenic acids are used as an inhibitor of blood glucose level elevation, preventive / ameliorating hyperleptinemia, preventing / ameliorating hyperinsulinemia, or PPAR-dependent gene transcription activator The ratio by weight of monocaffeoylquinic acid / dicaffeoylquinic acid is preferably 120/1 to 1/1. Furthermore, it is preferably 100/1 to 2/1, particularly preferably 100/1 to 5/1. Monocaffeoylquinic acid includes 3-caffeoylquinic acid, 4-caffeoylquinic acid, 5-caffeoylquinic acid, and dicaffeoylquinic acid includes 3,4-dicaffeoylquinic acid, 3, 5-dicaffeoylquinic acid, 4,5-dicaffeoylquinic acid, 3-feruloylquinic acid, 4-feruloylquinic acid, 5-feruloylquinic acid, 3-feruloyl-4-caffeoylquinic acid Can be mentioned.
[0015]
Weight ratio of monocaffeoylquinic acid and dicaffeoylquinic acid content in chlorogenic acids Ingesting monocaffeoylquinic acid / dicaffeoylquinic acid in the range of 120/1 to 1/1 has an effect of promoting lipid metabolism. Excellent and preferred. The weight ratio of monocaffeoylquinic acid / dicaffeoylquinic acid is more preferably 25/1 to 1/1, and particularly preferably 25/1 to 2/1.
[0016]
In addition, when chlorogenic acids are ingested in combination with caffeine at a certain ratio, an excellent lipid metabolism modification effect is obtained.
The weight ratio of the content of chlorogenic acids and caffeine is preferably 20/1 to 1/10, more preferably 10/1 to 2/5, and particularly preferably 4/1 to 2/5. In this case, the weight ratio of the content of monocaffeoylquinic acid and dicaffeoylquinic acid in the chlorogenic acids is such that monocaffeoylquinic acid / dicaffeoylquinic acid is 120/1 to 1/1, more preferably 100. / 1 to 2/1, particularly preferably 25/1 to 2/1.
[0017]
The chlorogenic acids of the present invention are formulated into an arbitrary form together with excipients and other additives. Examples of such excipients and additives include lactose, kaolin, sucrose, crystalline cellulose, corn starch, talc, agar, pectin, stearic acid, magnesium stearate, lecithin, sodium chloride and the like as solids. Examples of liquids include glycerin, peanut oil, polyvinyl pyrrolidone, olive oil, ethanol, benzyl alcohol, propylene glycol, and water.
[0018]
The chlorogenic acid of the present invention and the composition containing the same can be administered or ingested to humans by any route such as oral, enteral, injection, transmucosal and transdermal, depending on the dosage form.
The amount varies depending on various factors such as age, weight, sex, administration method, etc., but in the case of oral administration, it is usually preferably 100 to 5000 mg per adult. When used as a blood glucose level increase inhibitor, it is preferable to administer the range of 300 to 5000 mg, particularly 400 to 1000 mg, once a day to several times a day.
In addition, when used as an agent for preventing / ameliorating hyperleptinemia and an agent for preventing / ameliorating hyperinsulinemia, it should be administered in the range of 300 to 5000 mg, particularly 400 to 1000 mg, once a day to several times a day. Is preferred.
Even when used as a PPAR-dependent gene transcription activator, it is preferable to administer the range of 300 to 5000 mg, particularly 400 to 1000 mg, once a day to several times a day.
When used as a fat metabolism promoter, it is preferably administered in the range of 300 to 5000 mg, particularly 400 to 1000 mg, once a day to several times a day.
[0019]
Examples of the dosage form of the present invention include tablets, powders, granules, capsules, troches, syrups, emulsions, soft gelatin capsules, gels, pastes, injections, creams, gels, lotions, patches and the like. . Moreover, it can mix | blend suitably with various foodstuffs, such as a drink of various forms, snacks, dairy products, seasonings, starch processing products, and processed meat products. In particular, when used as a lipid metabolism promoter, it is preferably a container-packed beverage.
[0020]
The chlorogenic acids of the present invention are preferably 0.01 to 100% by weight, particularly preferably 0.05 to 95% by weight, and more preferably 0.1 to 0.1% by weight in the preparations because of ease of ingestion and administration. ~ 90% by weight.
[0021]
【Example】
Example 1
Effect test on obesity, blood glucose, blood insulin and blood leptin using diet-induced obesity / type 2 diabetes model C57BL / 6J mice 5 mice each group of 5 C57BL / 6J mice 3 Divide into groups and rear on each diet with the composition listed in Table 1. After 4 months, the body weight is measured, and after fasting for 12 hours, blood is collected from the abdominal aorta under ether anesthesia, and fasting serum glucose, insulin, and leptin levels are measured. The results are shown in Table 2.
[0022]
[Table 1]

[0023]
[Table 2]

[0024]
In the second group, a significant increase in body weight was observed compared to the first group, whereas in the third group, the increase in body weight was less than that in the first group, and in comparison with the second group, Showed a low value. The chlorogenic acid of the present invention was excellent in anti-obesity effect.
In the second group, a significant increase in blood glucose level (glucose) was observed compared to the first group, whereas in the third group, the increase in blood glucose level relative to the first group was small, and the second group The blood glucose level was low for the group. The chlorogenic acid of the present invention was excellent in the effect of suppressing an increase in blood sugar level and was effective for diabetes.
Compared to the first group, the second group showed a significant increase in insulin level, whereas in the third group the insulin level increased less than the first group, and in the second group In contrast, the insulin level was low. The chlorogenic acid of the present invention was excellent in suppressing an increase in blood insulin level and was effective in insulin resistance.
Compared to the first group, the second group showed a significant increase in leptin levels, whereas in the third group the increase in leptin levels relative to the first group was small, and in the second group On the other hand, the leptin level was low. The chlorogenic acid of the present invention was excellent in suppressing the increase in blood leptin level and was also effective in leptin resistance.
[0025]
Example 2
PPAR-dependent gene transcription activation test Small intestinal epithelial cell line IEC-6 is seeded on a 12-well plate and cultured in DMEM (1% FCS) for 1 day. PPAR response element (underlined) (AACg TgACCTTTgTCCT ggTC AACg TgACCTTTgTCCT ggTC AACg TgACCTTTgTCCT ggTC) DNA chain, SV40 promoter gene, PPAR reporter plasmid containing firefly luciferase gene A control plasmid (TK-Luc: Promega) linked with a promoter gene was introduced at the same time using a transfection reagent (Superfect transfection reagent; QIAGEN) so as to be 0.5 μg / well each. Thereafter, the culture solution was replaced with a DMEM (-FCS) medium containing a test substance, and further cultured for 24 hours. After washing with PBS, cells were lysed using a dual luciferase assay system (Promega), a substrate solution containing luciferin was added to the lysate, and firefly and Renilla luciferase activities were measured with a luminometer. The PPAR activity ability was evaluated by measuring the transcriptional activity (luciferase activity 1) of a PPAR-dependent gene in this experimental system. The transcriptional activity of PPAR-dependent gene (luciferase activity 1) was defined as follows.
[0026]
PPAR-dependent gene transcriptional activity (luciferase activity 1) = (firefly luciferase activity by PPAR-Luc) / (renilla luciferase activity by TK-Luc)
[0027]
Table 3 shows the ability of each test substance to activate PPAR in IEC-6 cells. The PPAR-dependent transcription activity in the control is defined as 100, and the relative value is shown.
[0028]
[Table 3]

[0029]
Coffee extract containing chlorogen and chlorogenic acid was excellent in PPAR-dependent gene transcription activation.
[0030]
Example 3
HMG-CoA synthase gene activation test The small intestine epithelial cell line IEC-6 is seeded on a 12-well plate and cultured in DMEM (1% FCS) for 1 day. Rat HMG-CoA synthase gene transcription control region (-1081 / + 21), SV40 promoter gene, PPAR reporter plasmid containing firefly luciferase gene (HMGS-Luc), and thymidine kinase promoter gene upstream of the Renilla luciferase gene The control plasmid (TK-Luc: Promega) was introduced at the same time using a transfection reagent (Superfect transfection reagent; QIAGEN) so as to be 0.5 μg / well respectively. Thereafter, the culture solution was replaced with a DMEM (-FCS) medium containing a test substance, and further cultured for 24 hours. After washing with PBS, cells were lysed using a dual luciferase assay system (Promega), a substrate solution containing luciferin was added to the lysate, and firefly and Renilla luciferase activities were measured with a luminometer. Lipid metabolism gene activity was evaluated by measuring the transcriptional activity (luciferase activity 2) of HMG-CoA synthase in this experimental system. The gene transcription activity (luciferase activity 2) was defined as follows.
[0031]
Gene transcription activity (Luciferase activity 2) = (Firefly luciferase activity by HMGS-Luc) / (Renilla luciferase activity by TK-Luc)
[0032]
Table 4 shows the ability of each test substance to activate HMG-CoA synthase gene in IEC-6 cells. In addition, the transcriptional activity in control is set to 100 and the relative value is shown.
[0033]
[Table 4]

[0034]
Chlorogen was excellent in transcriptional activation of lipid metabolism enzyme gene.
[0035]
Example 4
Anti-obesity effect test on body weight and visceral fat using diet-induced obese mice / chlorogenic acid + caffeine 7-week-old C57BL / 6J male mice were divided into 6 groups of 5 mice each, and the composition described in Table 5 was used. Breed on each diet. After one month, the body weight was measured, and the visceral fat mass (cold testicular fat, mesenteric fat, retroperitoneal fat and perirenal fat) was measured.
[0036]
[Table 5]

[0037]
[Table 6]

[0038]
[Table 7]

[0039]
In the second group, a significant increase in body weight and an increase in visceral fat mass were observed compared to the first group, whereas in the third group, the weight gain and total visceral fat mass were as compared to the second group. It showed a significant reduction. Furthermore, compared with the 3rd group, the 4th group added the caffeine rather than the chlorogenic acid alone, the efficacy of the chlorogenic acid increased, and the body weight gain inhibitory effect and the visceral fat mass increase inhibitory effect became strong.
[0040]
Example 5
Anti-obesity effect test on body weight and visceral fat using diet-induced obese mice / Anti-obesity effect test of chlorogenic acid alone and coffee bean extract 7-week-old C57BL / 6J male mice were divided into 4 groups of 5 each Divide and raise each diet with the composition described in Table 8. After 5 weeks, the body weight was measured and the visceral fat mass (cold testicular fat, mesenteric fat, retroperitoneal fat and perirenal fat) was measured.
[0041]
[Table 8]

[0042]
[Table 9]

[0043]
[Table 10]

[0044]
In the second group, a significant increase in body weight and increase in visceral fat mass was observed compared to the first group, whereas in the third group and the fourth group, the weight gain and total weight were increased compared to the second group. Visceral fat mass decreased.
[0045]
Example 6
Capsules for preventing / ameliorating lifestyle-related diseases The following composition (400 mg) was encapsulated in an encapsulating agent.
Chlorogenic acid 68% by weight
Cornstarch 10
Cellulose 10
Tocopherol 2
Lactose 10
[0046]
Example 7
Container-packed beverages were produced using coffee bean extract water by the following method, and monocaffeoylquinic acid, dicaffeoylquinic acid, chlorogenic acids and caffeine in the beverage were analyzed.
・ Analysis of monocaffeoylquinic acid and dicaffeoylquinic acid
HPLC (manufactured by Hitachi, Ltd.) was used. The model numbers of the unit units are as follows.
Plotter: D-2500
Detector: L-4200
Pump: L-7100
Auto sampler: L-7200
Column: lnertsil ODS-2, inner diameter 2.1 mm x length 250 mm
<Analysis conditions>
Sample injection volume: 10 μL
Flow rate: 0.3mL / min
Ultraviolet spectrophotometer detection wavelength: 325 nm
Eluent A: 0.05M acetic acid 3% acetonitrile solution eluent B: 0.05M acetic acid 100% acetonitrile solution concentration gradient condition time Eluent A eluent B
0 minutes 100% 0%
5 minutes 100% 0%
20 minutes 80% 20%
35 minutes 80% 20%
45 minutes 0% 100%
60 minutes 0% 100%
70 minutes 100% 0%
120 minutes 100% 0%
<Retention time of monocaffeoylquinic acid and dicaffeoylquinic acid>
(Unit: minutes)
Monocaffeoylquinic acid: 19.7, 22.4, 23.5, total 3 points Dicaffeoylquinic acid: 32.2, 32.8, total 2 points The ratio of the mono-form and the di-form was calculated.
[0047]
-Analytical analysis equipment and analytical conditions for chlorogenic acids are the same as those for mono- and di-forms.
<Retention time of chlorogenic acids>
(Unit: minutes)
Monocaffeoylquinic acid: 19.7, 22.4, 23.5 in total 3 points Dicaffeoylquinic acid: 32.2, 32.8 in total 2 points Ferlaquinic acid: 26.4, 27.1 in total Two points Caffeoylquinic acid at the fifth position was used as a standard substance from the area% obtained here, and the weight% was obtained.
[0048]
・ Caffeine analysis method and definition <Analytical equipment>
The same equipment was used for the analysis of mono and dicaffeoylquinic acid.
<Analysis conditions>
Sample injection volume: 10 μL
Flow rate: 1.0mL / min
Ultraviolet absorption spectrophotometer detection wavelength: 280 nm
Eluent A: 0.1M acetic acid aqueous solution Eluent B: 0.1M acetic acid acetonitrile solution concentration gradient condition (% is volume%)
Time Eluent A Eluent B
0 minutes 97% 3%
5 minutes 97% 3%
37 minutes 80% 20%
43 minutes 80% 20%
43.5 minutes 0% 100%
48.5 minutes 0% 100%
49 minutes 97% 3%
62 minutes 97% 3%
<Retention time of caffeine>
(Unit: minutes)
Caffeine: 17.2 in total 27.2% by weight was determined from the area% determined here using a standard substance.
[0049]
Manufacture of packaged beverages:
(1) Production Example 1
200 g of extract was added to 200 g of coffee beans of Tanzania AA (Unicafe, L value 26) to obtain an extract. At this time, the Brix value of the extract was 9.95.
A packaged beverage having the composition shown in Table 11 was produced. In addition, after filling the beverage into a 190 mL steel can, using a retort sterilization tester (manufactured by Nisaka Seisakusho), hold the beverage at 123.5 ° C. for 25 minutes and heat-treat it under the condition that the F value (sterilization index) is 43. went. An F value of 3.1 is enough to kill botulinum.
(2) Production Example 2
After adding 2000 g of extract to 200 g of coffee beans of Tanzania AA (Unicafe, L value 26), only the last 200 g with 200 g added was collected to obtain an extract. At this time, the Brix value of the extract was 0.38.
A packaged beverage having the composition shown in Table 11 was produced. In addition, after filling the beverage into a 190 mL steel can, using a retort sterilization tester (manufactured by Nisaka Seisakusho), hold it at 121.5 ° C. for 10 minutes, and heat-treat it under the condition that F value (sterilization index) is 10. went. In addition, it becomes the level which can kill botulinum bacteria by F value 3.1.
[0050]
0.05M acetic acid was used to dilute the beverage concentration of the packaged beverage to 15% by weight after sterilization. Next, the mixture was centrifuged at 10,000 r / min for 5 minutes using a centrifuge (Kubota Corporation KR-1500), and the supernatant was collected and analyzed by HPLC with an injection volume of 10 μL. The results are shown in Table 11.
[0051]
[Table 11]

[0052]
As a result of drinking the beverages of Production Examples 1 and 2, lipid metabolism was promoted with good taste.
[0053]
【The invention's effect】
The chlorogenic acids of the present invention have an excellent PPAR-dependent gene transcription activation action, and in particular activate lipid metabolism by activating a gene having a PPAR responsive element (PPRE) in the transcriptional regulatory region of the gene. It has an effect on various lifestyle-related diseases. In particular, taking chlorogenic acid can prevent and improve obesity, suppress or increase blood sugar, prevent and improve hyperleptinemia, and prevent and improve hyperinsulinemia. As a result, prevent and improve diabetes An effect is obtained. Moreover, since chlorogenic acids have been taken as food on a daily basis for many years and have high safety, there is little concern about side effects even when taken as food or drink or drugs.

Claims

3-caffeoylquinic acid, 4-caffeoylquinic acid, 5-caffeoylquinic acid, 3,4-dicaffeoylquinic acid, 3,5-dicaffeoylquinic acid, 4,5-dicaffeoylquinic acid Prevention or amelioration of hyperinsulinemia comprising at least one chlorogenic acid selected from 3-feruloylquinic acid, 4-feruloylquinic acid, 5-feruloylquinic acid and 3-feruloyl-4-caffeoylquinic acid Agent.

Chlorogenic acids, mono- caffeoylquinic acid / di café hyperinsulinemia prophylaxis or improvement agent weight ratio of claim 1, wherein Ru 120 / 1-1 / 1 der oil quinic acid.

A hyperinsulinemia preventive / ameliorating agent comprising the chlorogenic acids and caffeine according to claim 1 or 2 and having a weight ratio of chlorogenic acids / caffeine of 4/1 to 2/5.