JP5299916B2 - Metabolic syndrome prevention agent - Google Patents
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Description
本発明は、脂肪組織量を減少・適正化させることができ、肥満の解消・抑制、延いてはメタボリックシンドロームを予防し得る剤に関する。 The present invention relates to an agent that can reduce and optimize the amount of adipose tissue, and can eliminate or suppress obesity and, in turn, prevent metabolic syndrome.
近年のライフスタイルの変化によって過栄養、運動不足を来たし、肥満や代謝異常が問題となっている。肥満、すなわち、脂肪組織における脂肪細胞の増加並びに肥大化は、インスリン抵抗性（血中のインスリン濃度に見合ったインスリン作用が得られない状態）が高くなり、また脂肪組織における炎症を引き起こし、さらには、アディポサイトカイン（脂肪細胞からの内分泌因子）の生産・分泌異常を招き、糖尿病、高血圧症、高脂血症、ひいては動脈硬化症の危険因子につながる（図１を参照）。
このようなリスクファクターの複数重なった状態は、メタボリックシンドロームとして定義されており、今日、その予防・対策が重要視されている。従って、メタボリックシンドロームに対する根本的な対策として、重要な病態である内臓脂肪蓄積の減少などを中心とした肥満の予防・解消の意義は極めて大きいと言える。
Recent changes in lifestyle have led to overnutrition and lack of exercise, and obesity and metabolic disorders have become problems. Obesity, ie, an increase in fat cells and enlargement in adipose tissue, increases insulin resistance (a state in which insulin action is not achieved in accordance with blood insulin concentration), causes inflammation in adipose tissue, and This leads to abnormal production and secretion of adipocytokine (endocrine factor from adipocytes), leading to risk factors for diabetes, hypertension, hyperlipidemia, and eventually arteriosclerosis (see FIG. 1).
Such a state in which multiple risk factors overlap is defined as a metabolic syndrome, and today, prevention and countermeasures are regarded as important. Therefore, as a fundamental measure against metabolic syndrome, it can be said that the significance of prevention and elimination of obesity centering on the reduction of visceral fat accumulation, which is an important disease state, is extremely large.
特に近来、細胞増殖に相反して作用するｐ２７とＳｋｐ２の二種類のノックアウトマウスを用いた解析により、脂肪細胞数の増加が脂肪組織の肥大化を通してメタボリックシンドロームの一因となり得ることが報告されている（例えば、非特許文献１を参照）。このことからも、脂肪細胞の肥大化の抑制、数の増加の抑制を行うことがメタボリックシンドローム予防に有用であると考えられる。 In particular, an analysis using two types of knockout mice, p27 and Skp2, that act in opposition to cell proliferation, has recently reported that an increase in the number of adipocytes can contribute to metabolic syndrome through hypertrophy of adipose tissue. (For example, see Non-Patent Document 1). From this fact, it is considered useful to prevent metabolic syndrome by suppressing the enlargement of fat cells and the increase of the number.
一般に、抗肥満作用のある医薬品での治療は他の医薬品との併用上の制約があり、副作用を招くなどの危険を伴うため、日常的に摂取している天然物由来の抽出物で脂肪細胞の数をコントロールし、メタボリックシンドロームを予防できるものが望まれている。 In general, treatment with drugs that have anti-obesity action has limitations in combination with other drugs and involves risks such as causing side effects. It is desirable to be able to control the number of metabolic syndrome and prevent metabolic syndrome.
上記状況に鑑みて、本発明は、日常的に摂取している天然物であるコーヒーの、生豆抽出物を用いて、脂肪細胞の数をコントロールし、脂肪組織を大きくしないようにすることができるメタボリックシンドローム予防剤を提供することを目的とする。
特に、コーヒー生豆の抽出物において、インスリン抵抗性を助長し得るカフェイン未含有のコーヒー生豆の抽出物を用いたメタボリックシンドローム予防剤を提供することを目的とする。
In view of the above situation, the present invention is to control the number of adipocytes and prevent adipose tissue from becoming large by using a green bean extract of coffee, which is a natural product taken daily. An object of the present invention is to provide a preventive agent for metabolic syndrome.
In particular, an object of the present invention is to provide a metabolic syndrome preventive agent using an extract of green coffee beans that does not contain caffeine and can promote insulin resistance in an extract of green coffee beans.
上記目的を達成すべく、本発明のメタボリックシンドローム予防剤は、超臨界流体処理工程を経て得られたカフェイン未含有のコーヒー生豆抽出物を含有する剤であって、アポトーシス誘導による脂肪組織量減少促進作用を有することを特徴とする。コーヒー生豆抽出物中の関与成分は、３−ＣＱＡ、４−ＣＱＡ、５−ＣＱＡ、３，４−ｄｉＣＱＡ、３，５−ｄｉＣＱＡ、４，５−ｄｉＣＱＡ、３−ＦＱＡ、４−ＦＱＡ、５−ＦＱＡからなる群から選ばれた少なくとも１種の成分である。
ここで、コーヒー生豆抽出物は、超臨界流体処理工程を経て得られたカフェイン未含有のコーヒー生豆抽出物であるのは、インスリン抵抗性を助長しないからである。
In order to achieve the above object, the metabolic syndrome preventive agent of the present invention is an agent containing a caffeine-free raw coffee bean extract obtained through a supercritical fluid treatment step, and the amount of adipose tissue by induction of apoptosis. It has a reduction promoting action. Involvement component of green coffee beans extract is, 3-CQA, 4-CQA , 5-CQA, 3,4-diCQA, 3,5-diCQA, 4,5-diCQA, 3-FQA, 4-FQA, 5 -At least one component selected from the group consisting of FQA .
Here, green coffee bean extract, a is the coffee raw bean extract caffeine Not containing obtained through supercritical fluid treatment process, since not promote insulin resistance.
また、超臨界流体処理工程を経て得られたカフェイン未含有のコーヒー生豆抽出物であれば、カフェインが含まれず、かつ、クロロゲン酸（５−ＣＱＡ等）が十分に含まれており、好適にメタボリックシンドローム予防剤として利用できる。これらのメタボリックシンドローム予防剤は、前駆脂肪細胞から脂肪細胞に至るまでの脂肪細胞分化抑制による脂肪組織量の減少促進作用を有する。また、脂肪蓄積抑制作用や、脂肪細胞増殖抑制による脂肪組織量の減少促進作用を有する。さらに、アポトーシス誘導による脂肪組織量の減少促進作用を有する。 Moreover, if it is a caffeine-free raw coffee bean extract obtained through a supercritical fluid treatment step, caffeine is not contained, and chlorogenic acid (5-CQA etc.) is sufficiently contained, It can be suitably used as an agent for preventing metabolic syndrome. These preventive agents for metabolic syndrome have the effect of promoting a decrease in the amount of adipose tissue by inhibiting adipocyte differentiation from preadipocytes to adipocytes. In addition, it has an action to suppress fat accumulation and an action to promote a decrease in the amount of adipose tissue by inhibiting fat cell proliferation. Furthermore, it has the effect of promoting the reduction of the amount of adipose tissue by inducing apoptosis.
また、超臨界流体処理工程を経て得られたカフェイン未含有のコーヒー生豆抽出物は、好適に、抗肥満剤、脂肪蓄積抑制剤、脂肪細胞分化抑制による脂肪組織量減少促進剤、脂肪細胞増殖抑制による脂肪組織量減少促進剤、アポトーシス誘導による脂肪組織量減少促進剤に利用できる。
ここで、脂肪は、特に、胴回り及び内臓に分布する白色脂肪に効果的である。
In addition, the caffeine-free green coffee bean extract obtained through the supercritical fluid treatment step is preferably an anti-obesity agent, a fat accumulation inhibitor, an adipose tissue amount reduction promoter by inhibiting adipocyte differentiation, an adipocyte It can be used as an adipose tissue mass reduction promoter by inhibiting growth and an adipose tissue mass reduction promoter by inducing apoptosis.
Here, fat is particularly effective for white fat distributed around the waist and internal organs.
本発明のメタボリックシンドローム予防剤における上述の超臨界流体処理工程は、超臨界流体の二酸化炭素を用いて、圧力１０ ＭＰａ 以上の高圧、６５〜８０℃の高温で、抽出処理されることを特徴とするものである。
超臨界流体の二酸化炭素を用いて、コーヒー生豆抽出物中のカフェインを溶出するときは、一般的に、超臨界流体の二酸化炭素の温度、圧力がそれぞれ高ければ高いほど抽出される。二酸化炭素は、約７．３
ＭＰａ・３１℃で、気体とも液体ともつかない状態になり（臨界点）、この臨界点を超える状態を超臨界流体の状態という。本発明の超臨界流体処理の条件としては、圧力１０
ＭＰａ以上、更に好ましくは４５ ＭＰａ以上であり、温度は６５〜８０℃である。温度が６５℃以下であるとカフェインは除去しにくく、８０℃以上にするとクロロゲン酸がコーヒー生豆から溶出、分解され始めるからである。仮に、８０℃で抽出した場合には１０％程度ロスが発生してしまう。
The above-described supercritical fluid treatment step in the metabolic syndrome preventive agent of the present invention is characterized in that the supercritical fluid carbon dioxide is extracted and treated at a high pressure of 10 MPa or higher and a high temperature of 65 to 80 ° C. To do.
When caffeine in a green coffee bean extract is eluted using carbon dioxide, which is a supercritical fluid, generally, the higher the temperature and pressure of carbon dioxide in the supercritical fluid, the higher the extraction. Carbon dioxide is about 7.3
At 31 ° C., neither gas nor liquid is attached (critical point), and a state exceeding this critical point is called a supercritical fluid state. The supercritical fluid treatment conditions of the present invention include a pressure of 10
The pressure is 65 MPa or more, more preferably 45 MPa or more, and the temperature is 65 to 80 ° C. Caffeine is difficult to remove when the temperature is 65 ° C. or lower, and chlorogenic acid starts to be eluted and decomposed from green coffee beans when the temperature is 80 ° C. or higher. If it is extracted at 80 ° C., a loss of about 10% occurs.
また、コーヒー生豆抽出物にカフェインが含まれないようにすべく、超臨界流体処理工程の前処理として、コーヒー生豆を浸水（調湿）し、コーヒー生豆に水分量を与える。この調湿をしない場合、コーヒー生豆からカフェインは抽出されないことになる。水分を５０％程度まで多くすると、機械に負担をかけることとなり、また、湿ったコーヒー生豆に微生物が増殖しやすい条件となり、その後のクロロゲン酸類抽出に影響を及ぼすので好ましくなく、調湿のための水分量は５０％未満とするのが好ましい。 Moreover, in order to prevent caffeine from being contained in the green coffee bean extract, the green coffee beans are soaked (humidified) as a pre-treatment in the supercritical fluid treatment step, and a moisture content is given to the green coffee beans. Without this humidity control, caffeine is not extracted from green coffee beans. Increasing the water content to about 50% is not preferable because it imposes a load on the machine, and conditions that allow microorganisms to grow easily on wet coffee beans and affect the subsequent extraction of chlorogenic acids. The amount of water is preferably less than 50%.
また、上記の超臨界流体処理工程において、原料となるコーヒー生豆は、粉砕径３〜５ ｍｍとされることが好ましい態様である。一般的に、コーヒー生豆を超臨界流体処理してカフェインを取り除く場合、コーヒー生豆そのものが商品になるため粉砕はしないのが普通である。
本発明では、コーヒー生豆の抽出成分が商品（メタボリックシンドローム予防剤）になるため、抽出効率の向上を目的として豆を粉砕する方が好ましいのである。コーヒー生豆の粉砕径が３〜５ ｍｍとされるのは、３
ｍｍ未満とあまり細かくしすぎるとアルコール抽出工程、濾過工程で目詰りを起こすため好ましくなく、また５ ｍｍより大きいと抽出効率の向上の観点から好ましくない。特に、好ましくは、コーヒー生豆の粉砕径は４ ｍｍである。
In the supercritical fluid treatment step, the green coffee beans used as a raw material is preferably a pulverized diameter of 3 to 5 mm. Generally, when caffeine is removed by supercritical fluid processing of green coffee beans, it is normal that the green coffee beans themselves become commodities and are not crushed.
In the present invention, since the extracted component of green coffee beans becomes a product (metabolic syndrome preventive agent), it is preferable to grind the beans for the purpose of improving the extraction efficiency. The ground coffee beans have a pulverized diameter of 3 to 5 mm.
If it is less than mm, it is not preferable because it causes clogging in the alcohol extraction step and filtration step, and if it is more than 5 mm, it is not preferable from the viewpoint of improving extraction efficiency. Particularly preferably, the ground coffee beans have a pulverized diameter of 4 mm.
上記のメタボリックシンドローム予防剤は、好適に、医薬品や医薬部外品などの医薬組成物、化粧品、飲食品（特に、コーヒー飲料）に利用される。
本発明のメタボリックシンドローム予防剤は、上記の超臨界流体処理工程を経て得られた抽出物をそのまま直接使用することもできるし、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤等の添加剤を用いて周知の方法で製造し、使用することもできる。また、医薬品として用いる場合、投与形態としては、例えば錠剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤などによる経口投与、粉末飲料、液体飲料（ドリンク剤など）などの食品の形態、注射剤、坐剤などによる非経口投与を挙げることができる。
Said metabolic syndrome preventive agent is suitably used for pharmaceutical compositions such as pharmaceuticals and quasi-drugs, cosmetics, and food and drink (particularly coffee drinks).
The metabolic syndrome preventive agent of the present invention can directly use the extract obtained through the above supercritical fluid treatment step as it is, and can be used as an excipient, binder, disintegrant, lubricant, stabilizer, etc. It can also be produced and used by a known method using these additives. In addition, when used as a pharmaceutical, the dosage form is, for example, oral administration using tablets, capsules, granules, syrups, etc., food forms such as powdered drinks and liquid drinks (drinks, etc.), injections, suppositories, etc. Parenteral administration.
本発明のメタボリックシンドローム予防剤によれば、前駆脂肪細胞から脂肪細胞への分化抑制、脂肪細胞増殖抑制、アポトーシスの誘導による内臓や皮下の脂肪組織量の減少促進に繋がるといった効果を有する。
また、本発明のメタボリックシンドローム予防剤によれば、分化抑制効果やＴＧ（トリアシルグリセロール）蓄積抑制効果により、脂肪細胞や脂肪組織の大型化、さらにはそれらの機能破綻を防ぎ、アディポサイトカイン作用の増悪化を防ぎ得るといった効果を有する。
The preventive agent for metabolic syndrome of the present invention has effects such as suppression of differentiation from preadipocytes to adipocytes, suppression of adipocyte proliferation, and promotion of reduction of visceral and subcutaneous adipose tissue amounts by induction of apoptosis.
Further, according to the preventive agent for metabolic syndrome of the present invention, the effect of suppressing adipocytokines can be prevented by preventing the enlargement of adipocytes and adipose tissue and their functional breakdown by the effect of suppressing differentiation and the effect of suppressing TG (triacylglycerol) accumulation. It has the effect of preventing deterioration.
以下、本発明の実施形態について、図面を参照しながら詳細に説明していく。なお、以下の実施例や参照する図中の説明では、超臨界流体処理工程を経て得られたカフェイン未含有のコーヒー生豆抽出物（Ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ ｄｅｃａｆｆｅｉｎａｔｅｄ ｇｒｅｅｎ ｃｏｆｆｅｅ ｂｅａｎｓ）をＥＤＧＣＢと略記する。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the drawings. In the following examples and explanations in the drawings to be referred to, the caffeine-free raw coffee bean extract (Extract of decaffeinated green beans) obtained through the supercritical fluid treatment step is abbreviated as EDGCB.
先ず、超臨界流体二酸化炭素による処理工程を経て、カフェイン未含有のコーヒー生豆抽出物を製造する処理について、図２のフローを参照しながら各々の工程の説明を行う。
（１）コーヒー生豆を粉砕する工程（ステップＳ０１）
コーヒー生豆を平均粒子径が約４．０
ｍｍになるよう粉砕する。粉砕は、通常の機械的粉砕や凍結粉砕処理などで行うが、この粉砕する手段は特に限定されるものではない。
First, each process is demonstrated, referring the flow of FIG. 2 about the process which manufactures a caffeine-free raw coffee bean extract through the process process by supercritical fluid carbon dioxide.
(1) Step of crushing green coffee beans (step S01)
The average particle size of green coffee beans is about 4.0
Grind to mm. The pulverization is performed by ordinary mechanical pulverization or freeze pulverization, but the means for pulverization is not particularly limited.
（２）コーヒー生豆を浸水（調湿）する工程（ステップＳ０２）
コーヒー生豆を粉砕したものに対し、水を添加し調湿を行う。カフェインを除くための条件としてコーヒー生豆の水分量を４３％（増減２％）にしている。
(2) Step of immersing green coffee beans (conditioning humidity) (step S02)
Water is added to the crushed coffee beans to adjust the humidity. As a condition for removing caffeine, the water content of green coffee beans is 43% (2% increase or decrease).
（３）コーヒー生豆を超臨界流体処理する工程（ステップＳ０３）
コーヒー生豆を７０℃以上、４５ ＭＰａ以上の状態にある超臨界流体二酸化炭素を用いて、Ｓ／Ｆ５０の条件の超臨界流体処理を施すことにより、所定時間、接触抽出を行い、コーヒー生豆からカフェインやその他の物質を抽出除去する。ここで、Ｓ／Ｆとは原料（コーヒー生豆）に対して流す二酸化炭素の重量比のことで、例えば、Ｓ／Ｆ＝５０であれば、コーヒー量が１（重量）に対して、二酸化炭素重量は、５０（重量）となる。
(3) Process of supercritical fluid treatment of green coffee beans (step S03)
By using supercritical fluid carbon dioxide in a state of 70 ° C. or higher and 45 MPa or higher, supercritical fluid treatment under the condition of S / F 50 is performed for a predetermined time, and green coffee beans are subjected to contact extraction. Extract and remove caffeine and other substances from the Here, S / F is the weight ratio of carbon dioxide to flow with respect to the raw material (raw coffee beans). For example, if S / F = 50, the amount of coffee is 1 (weight) with respect to carbon dioxide. The carbon weight is 50 (weight).
（４）含水アルコールにて抽出する工程（ステップＳ０４）
上記の超臨界流体処理する工程により、コーヒー生豆からカフェインやその他の物質を抽出除去した後、除去後のコーヒー生豆から、更に含水アルコールにて抽出、濃縮、乾燥して抽出物を得る。
なお、抽出溶媒としては、極性溶媒を使用できる。極性溶媒としては、水、または、アルコール類（例えば、エタノール、メタノールの低級アルコール、あるいは、プロピレングリコールなどの多価アルコール）などの極性有機溶媒が挙げられる。これらを単独あるいは２種以上を任意に組み合わせて使用することが可能である。好ましくは、水単独または水と極性有機溶媒の混合溶媒である。水と極性有機溶媒との混合溶媒の場合、水と極性有機溶媒の混合比は特に制限されないが、極性有機溶媒の容量比が５０％以上であるのが好ましい。水と混合する極性有機溶媒としては、低級アルコールが好ましく、メタノールまたはエタノールがより好ましい。また、抽出時間は特に制限されない。
(4) Step of extracting with hydrous alcohol (step S04)
After the caffeine and other substances are extracted and removed from the green coffee beans by the above-mentioned supercritical fluid treatment step, the extract is obtained by extracting, concentrating and drying from the green coffee beans after the removal with water-containing alcohol. .
In addition, a polar solvent can be used as an extraction solvent. Examples of the polar solvent include polar organic solvents such as water or alcohols (for example, a lower alcohol such as ethanol, methanol, or a polyhydric alcohol such as propylene glycol). These can be used alone or in any combination of two or more. Preferably, it is water alone or a mixed solvent of water and a polar organic solvent. In the case of a mixed solvent of water and a polar organic solvent, the mixing ratio of water and the polar organic solvent is not particularly limited, but the volume ratio of the polar organic solvent is preferably 50% or more. The polar organic solvent to be mixed with water is preferably a lower alcohol, and more preferably methanol or ethanol. Further, the extraction time is not particularly limited.
（５）濃縮・乾燥する工程（ステップＳ０５）
抽出した液は、減圧下で加熱することなどにより溶媒を除去して濃縮した後、スプレードライ、フリーズドライなどの手法を用いて乾燥することでコーヒー生豆粉末を得る方法等が挙げられる。あるいは、抽出液に賦形剤等を添加して乾燥してもよい。
(5) Step of concentration and drying (Step S05)
For example, the extracted liquid may be concentrated by removing the solvent by heating under reduced pressure, and then dried using a technique such as spray drying or freeze drying to obtain green coffee bean powder. Alternatively, an excipient or the like may be added to the extract and dried.
１．コーヒー生豆抽出物の作製方法の具体例
本発明のメタボリックシンドローム予防剤におけるコーヒー生豆抽出物の作製方法について、以下の（ａ）〜（ｆ）に具体的に説明する。
（ａ）コーヒー生豆（Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ ＡＰ−１／カフェイン含有量１．９４％）を平均粒子径４．０
ｍｍになるよう粉砕した。
（ｂ）コーヒー生豆を粉砕したもの８７．３
ｋｇに対し、水４３．２ ｋｇを添加し調湿を行った。
（ｃ）その後、このコーヒー生豆を８０℃、４５ＭＰａの状態にある超臨界流体二酸化炭素を用いて、Ｓ／Ｆ５０の条件にて２００分間接触抽出を行った。
（ｄ）次に、超臨界流体二酸化炭素処理後のコーヒー生豆１６０．０ ｋｇに対し、５６％（ｗ／ｖ）エタノール１６００
Ｌを添加し、バブリングを行いつつ、５０℃で１時間抽出を行った。
（ｅ）抽出物に対して固液分離を行なった後、５６％（ｗ／ｖ）エタノール８００
Ｌを添加し、バブリングを行いつつ、再度５０℃で１時間抽出を行った。
（ｆ）上記の２回の抽出で得られた抽出液を濾過、１２５℃、１分間殺菌した後、５０℃で減圧濃縮し、１８０℃でスプレードライを行ない、２７．８
ｋｇのコーヒー生豆抽出物を得た。
1. Specific Example of Method for Producing Green Coffee Bean Extract A method for preparing a coffee green bean extract in the metabolic syndrome preventive agent of the present invention will be specifically described in the following (a) to (f).
(A) Green coffee beans (Indonesia AP-1 / caffeine content 1.94%) with an average particle size of 4.0
It grind | pulverized so that it might become mm.
(B) Crushed coffee beans 87.3
Humidity was adjusted by adding 43.2 kg of water to kg.
(C) Thereafter, this green coffee bean was subjected to contact extraction for 200 minutes under the condition of S / F50 using supercritical fluid carbon dioxide at 80 ° C. and 45 MPa.
(D) Next, with respect to 160.0 kg of coffee beans after supercritical fluid carbon dioxide treatment, 56% (w / v) ethanol 1600
Extraction was performed at 50 ° C. for 1 hour while adding L and bubbling.
(E) After performing solid-liquid separation on the extract, 56% (w / v) ethanol 800
L was added and extraction was performed again at 50 ° C. for 1 hour while bubbling.
(F) The extract obtained by the above two extractions was filtered, sterilized at 125 ° C. for 1 minute, concentrated under reduced pressure at 50 ° C., spray-dried at 180 ° C., and 27.8.
kg of coffee green bean extract was obtained.
２．アポトーシス誘導効果について
先ず、マウス由来前駆脂肪細胞（３Ｔ３−Ｌ１）の培養について説明する。前培養として、３Ｔ３−Ｌ１細胞を１×１０５
細胞／ｍＬの密度で播種し、１０％子牛血清、１００ Ｕ／１００ ｎｇ ペニシリンストレプトマイシンを含むＤ−ＭＥＭ培地中で、３７℃・５％ＣＯ２の条件下で培養を行った。
2. Apoptosis Inducing Effect First, the culture of mouse-derived preadipocytes (3T3-L1) will be described. As preculture, 1 × 10 5 3T3-L1 cells
The cells were seeded at a density of cells / mL, and cultured in a D-MEM medium containing 10% calf serum and 100 U / 100 ng penicillin streptomycin under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 .
次に、分化誘導について説明する。分化誘導は、３〜４日間の前培養によってコンフルエントにした後、１０％牛胎児血清を含むＤ−ＭＥＭに、インスリン，３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ，ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅをそれぞれ最終濃度２
μＭ、０．２５ ｍＭ、１ μＭで溶解し、３Ｔ３−Ｌ１の分化誘導に供した。
Next, differentiation induction will be described. Differentiation induction was confluent by pre-culture for 3 to 4 days, and then D-MEM containing 10% fetal bovine serum was added with insulin, 3-isobutyl-methylxanthine, and dexamethasone at a final concentration of 2 respectively.
It melt | dissolved in (micro | micron | mu) M, 0.25 mM, and 1 micromol, and used for the differentiation induction of 3T3-L1.
そして、サンプルとして、ＥＤＧＣＢを０．５、１．０
ｍｇ／ｍＬ、５−ＣＱＡを０．５、１．０ ｍＭ、３，４−ｄｉＣＱＡ、３，５−ｄｉＣＱＡ、４、５−ｄｉＣＱＡを０．５ ｍＭの最終濃度で分化誘導試薬を含むＤ‐ＭＥＭに溶解した後、孔径０．２２
μｍの滅菌フィルターユニット（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）に通し、分化誘導と同じタイミングで添加培養に供した。
なお、コントロール試験区では分化誘導試薬を含むＤ‐ＭＥＭのみで、陰性対照試験区ではＣａｓｐａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫを最終濃度５０μＭで添加し、培養を行った。
And, as a sample, EDGCB is 0.5, 1.0
D- containing a differentiation-inducing reagent at a final concentration of mg / mL, 5-CQA 0.5, 1.0 mM, 3,4-diCQA, 3,5-diCQA, 4, 5-diCQA 0.5 mM After dissolving in MEM, pore size 0.22
It was passed through a μm sterile filter unit (MILLIPORE) and subjected to addition culture at the same timing as differentiation induction.
In the control test group, only D-MEM containing a differentiation-inducing reagent was used, and in the negative control test group, Caspase Inhibitor Z-VAD-FMK was added at a final concentration of 50 μM and cultured.
アポトーシス誘導効果を確認するために、Ｃａｓｐａｓｅ−３活性の測定を行った。測定は、４８時間の添加培養の後、ＣａｓｐＡＣＥ Ａｓｓａｙ
Ｓｙｓｔｅｍ， Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＣａｓｐａｓｅ−３活性の測定を行った。なお、試験区間のＣａｓｐａｓｅ−３活性は４０５ ｎｍの吸光度をもとにコントロールを１．０として吸光度比率を算出し、比較を行った。
In order to confirm the apoptosis-inducing effect, caspase-3 activity was measured. The measurement was performed after 48 hours of addition culture, and then CaspACE Assay.
Caspase-3 activity was measured using System, Colorimetric (Promega). The Caspase-3 activity in the test section was compared by calculating the absorbance ratio based on the absorbance at 405 nm and setting the control to 1.0.
測定結果を図３に示す。図３は、分化誘導済３Ｔ３‐Ｌ１細胞の添加培養４８時間後におけるＣａｓｐａｓｅ−３活性について、コントロールを１．０とした時の各吸光度比率を示したグラフである。 The measurement results are shown in FIG. FIG. 3 is a graph showing the absorbance ratio when the control is 1.0 with respect to Caspase-3 activity after 48 hours of addition-induced culture of differentiated 3T3-L1 cells.
測定結果は、コントロールに対してＥＤＧＣＢ
０．５ ｍｇ／ｍＬ、３，４−ｄｉＣＱＡ、３，５−ｄｉＣＱＡ、４，５−ｄｉＣＱＡ ０．５ ｍＭ添加区において、有意な脂肪細胞のＣａｓｐａｓｅ−３活性亢進効果が認められた。また、繰り返し行った実験においても同様に、有意な脂肪細胞のＣａｓｐａｓｅ−３活性亢進効果が認められた。
The measurement result is EDGCB against the control.
In the 0.5 mg / mL, 3,4-diCQA, 3,5-diCQA, and 4,5-diCQA 0.5 mM addition groups, a significant adipocyte Caspase-3 activity enhancing effect was observed. Similarly, in repeated experiments, a significant adipocyte Caspase-3 activity enhancement effect was also observed.
３．脂肪細胞増殖抑制効果について
先ず、マウス由来前駆脂肪細胞（３Ｔ３−Ｌ１）の培養について説明する。
前培養として、３Ｔ３−Ｌ１細胞を５０
細胞／ｍＬの密度で播種し、１０％牛胎児血清、１００ Ｕ／１００ ｎｇ ペニシリンストレプトマイシンを含むＤ−ＭＥＭ培地中で、３７℃・５％ＣＯ２の条件下で培養を行った。
3. About an adipocyte growth inhibitory effect First, culture | cultivation of a mouse-derived preadipocyte (3T3-L1) is demonstrated.
As a preculture, 50 3T3-L1 cells were used.
The cells were seeded at a density of cells / mL, and cultured in a D-MEM medium containing 10% fetal bovine serum and 100 U / 100 ng penicillin streptomycin under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 .
次に、分化誘導について説明する。分化誘導は、２〜３日間の前培養によってコンフルエントにした後、１０％牛胎児血清を含むＤ−ＭＥＭに、インスリン，３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ，ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅをそれぞれ最終濃度２
μＭ、０．２５ ｍＭ、１ μＭで溶解し、３Ｔ３−Ｌ１の分化誘導に供した。
Next, differentiation induction will be described. Induction of differentiation was confluent by pre-culture for 2 to 3 days, then D-MEM containing 10% fetal bovine serum was added with insulin, 3-isobutyl-methylxanthine, and dexamethasone at a final concentration of 2 respectively.
It melt | dissolved in (micro | micron | mu) M, 0.25 mM, and 1 micromol, and used for the differentiation induction of 3T3-L1.
そして、サンプルとして、ＥＤＧＣＢを０．５、１．０
ｍｇ／ｍＬ、５−ＣＱＡを０．５、１．０ ｍＭ、３，４−ｄｉＣＱＡ、３，５−ｄｉＣＱＡ、４、５−ｄｉＣＱＡを０．５ ｍＭの最終濃度で分化誘導試薬を含むＤ‐ＭＥＭに溶解した後、孔径０．２２
μｍの滅菌フィルターユニット（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）に通し、分化誘導と同じタイミングで添加培養に供した。
なお、コントロール試験区では分化誘導試薬を含むＤ‐ＭＥＭのみで培養を行った。
And, as a sample, EDGCB is 0.5, 1.0
D- containing a differentiation-inducing reagent at a final concentration of mg / mL, 5-CQA 0.5, 1.0 mM, 3,4-diCQA, 3,5-diCQA, 4, 5-diCQA 0.5 mM After dissolving in MEM, pore size 0.22
It was passed through a μm sterile filter unit (MILLIPORE) and subjected to addition culture at the same timing as differentiation induction.
In the control test group, culture was performed only with D-MEM containing a differentiation-inducing reagent.
脂肪細胞増殖活性を確認するために、２４時間の添加培養の後、Ｐｒｅｍｉｘ ＷＳＴ−１ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（タカラバイオ）を用いて増殖活性の測定を行った。なお、脂肪細胞増殖活性は、マイクロプレートリーダー（測定波長４５０
ｎｍ）の吸光度として間接的に測定した。
In order to confirm the adipocyte proliferation activity, the proliferation activity was measured using Premix WST-1 Cell Proliferation Assay System (Takara Bio) after 24 hours of addition culture. The adipocyte proliferation activity was measured using a microplate reader (measurement wavelength 450).
nm) was measured indirectly.
吸光度の測定結果を図４に示す。図４は、分化誘導済３Ｔ３‐Ｌ１細胞の添加培養２４時間後における増殖活性（ＯＤ４５０）を示したグラフである。 The measurement results of absorbance are shown in FIG. FIG. 4 is a graph showing the proliferation activity (OD450) after 24 hours of addition culture of differentiation-induced 3T3-L1 cells.
測定結果は、コントロールに対してＥＤＧＣＢ
１．０ ｍｇ／ｍＬ、５−ＣＱＡ １．０ ｍＭ、３，４−ｄｉＣＱＡ、３，５−ｄｉＣＱＡ、４，５−ｄｉＣＱＡ ０．５ ｍＭ添加区において有意な脂肪細胞の増殖抑制効果が認められた。また、繰り返し行った実験においても同様に有意な脂肪細胞の増殖抑制効果が認められた。
The measurement result is EDGCB against the control.
1.0 mg / mL, 5-CQA 1.0 mM, 3,4-diCQA, 3,5-diCQA, 4,5-diCQA 0.5 mM Significant inhibitory effect on adipocyte proliferation was observed in the 0.5 mM addition group. It was. Further, in a repeated experiment, a significant adipocyte proliferation inhibitory effect was similarly recognized.
４．脂肪細胞分化抑制効果について
先ず、マウス由来前駆脂肪細胞（３Ｔ３−Ｌ１）の培養について説明する。
前培養として、３Ｔ３−Ｌ１細胞を１×１０４
細胞／ｍＬの密度で播種し、１０％牛胎児血清、１００ Ｕ／１００ ｎｇ ペニシリンストレプトマイシンを含むＤ−ＭＥＭ培地中で、３７℃・５％ＣＯ２の条件下で培養を行った。
4). About an adipocyte differentiation inhibitory effect First, culture | cultivation of a mouse-derived preadipocyte (3T3-L1) is demonstrated.
As preculture, 1 × 10 4 3T3-L1 cells
The cells were seeded at a density of cells / mL, and cultured in a D-MEM medium containing 10% fetal bovine serum and 100 U / 100 ng penicillin streptomycin under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 .
次に、分化誘導について説明する。分化誘導は、４〜５日間の前培養によってコンフルエントにした後、１０％牛胎児血清を含むＤ−ＭＥＭにインスリン，３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ，ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅをそれぞれ最終濃度２
μＭ、０．２５ ｍＭ、１ μＭで溶解し、３Ｔ３−Ｌ１の分化誘導に供した。
Next, differentiation induction will be described. Induction of differentiation was confluent by pre-culture for 4 to 5 days, and then D-MEM containing 10% fetal bovine serum was added with insulin, 3-isobutyl-methylxanthine, and dexamethasone at a final concentration of 2 respectively.
It melt | dissolved in (micro | micron | mu) M, 0.25 mM, and 1 micromol, and used for the differentiation induction of 3T3-L1.
そして、サンプルとして、ＥＤＧＣＢを０．２５、０．５０
ｍｇ／ｍＬ、５−ＣＱＡを０．５、１．０ ｍＭの濃度で分化誘導試薬を含むＤ‐ＭＥＭに溶解した後、孔径０．２２ μｍの滅菌フィルターユニット（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）に通し、分化誘導と同じタイミングで添加培養に供した。
なお、コントロール試験区では分化誘導試薬を含むＤ‐ＭＥＭのみで培養を行った。
And as a sample, EDGCB is 0.25, 0.50
After dissolving mg / mL, 5-CQA in D-MEM containing a differentiation-inducing reagent at concentrations of 0.5 and 1.0 mM, it was passed through a sterile filter unit (MILLIPORE) having a pore size of 0.22 μm to induce differentiation. It was subjected to addition culture at the same timing.
In the control test group, culture was performed only with D-MEM containing a differentiation-inducing reagent.
脂肪細胞分化抑制効果を確認するために、ＧＰＤＨ活性の測定を行った。測定は、１１日間の添加培養の後、２回のＰＢＳでの洗浄を経て、グリセロール
３−リン酸脱水素酵素（ＧＰＤＨ）活性測定キット（タカラバイオ)を用いてＧＰＤＨ活性の測定を行った。得られた測定結果は上清のタンパク量で補正を行った。なお、タンパクの定量には、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ （Ｐｉｅｒｃｅ) を使用した。
ＧＰＤＨ活性の測定結果を下記の表１と表２に示す。
In order to confirm the adipocyte differentiation inhibitory effect, GPDH activity was measured. The measurement was performed after 11 days of addition culture, washed twice with PBS, and then measured for GPDH activity using a glycerol 3-phosphate dehydrogenase (GPDH) activity measurement kit (Takara Bio). The obtained measurement results were corrected by the amount of protein in the supernatant. For protein quantification, BCA Protein Assay Kit (Pierce) was used.
The measurement results of GPDH activity are shown in Tables 1 and 2 below.
ＧＰＤＨ活性の測定結果は、ＥＤＧＣＢ
０．５０ ｍｇ／ｍＬ、５−ＣＱＡ １．０ ｍＭ添加区において、コントロールに対する有意な脂肪細胞のＧＰＤＨ活性抑制効果が認められ、この結果は繰り返し行った実験においても同様であった。
The measurement result of GPDH activity is EDGCB
In the 0.50 mg / mL, 5-CQA 1.0 mM addition group, a significant adipocyte GPDH activity inhibitory effect on the control was observed, and this result was the same in repeated experiments.
５．脂肪蓄積抑制効果について
先ず、マウス由来前駆脂肪細胞（３Ｔ３−Ｌ１）の培養について説明する。前培養として、３Ｔ３−Ｌ１細胞を３×１０４
細胞／ｍＬの密度で播種し、１０％子牛血清、１００ Ｕ／１００ ｎｇ ペニシリンストレプトマイシンを含むＤ−ＭＥＭ培地中で、３７℃・５％ＣＯ２の条件下で培養を行った。
5. About fat accumulation inhibitory effect First, culture of mouse-derived preadipocytes (3T3-L1) will be described. As preculture, 3T3-L1 cells were used at 3 × 10 4
The cells were seeded at a density of cells / mL, and cultured in a D-MEM medium containing 10% calf serum and 100 U / 100 ng penicillin streptomycin under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 .
次に、分化誘導について説明する。分化誘導は、３〜４日間の前培養によってコンフルエントにした後、１０％牛胎児血清を含むＤ−ＭＥＭにインスリン，３−ｉｓｏｂｕｔｙｌ−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ，ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅをそれぞれ最終濃度２
μＭ，０．２５ ｍＭ，１ μＭで溶解し、３Ｔ３−Ｌ１の分化誘導に供した。
Next, differentiation induction will be described. Differentiation induction was confluent by pre-culture for 3 to 4 days, and then D-MEM containing 10% fetal bovine serum was added with insulin, 3-isobutyl-methylxanthine, and dexamethasone at a final concentration of 2 respectively.
It melt | dissolved at (micro | micron | mu) M, 0.25 mM, and 1 micromol, and used for the differentiation induction of 3T3-L1.
そして、サンプルとして、ＥＤＧＣＢを１
ｍｇ／ｍＬの濃度で分化誘導試薬を含むＤ‐ＭＥＭに溶解した後、孔径０．２２ μｍの滅菌フィルターユニット（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）に通し、分化誘導と同じタイミングで添加培養に供した。
なお、コントロール試験区では分化誘導試薬を含むＤ‐ＭＥＭのみで培養を行った。
And as a sample, EDGCB is 1
After being dissolved in D-MEM containing a differentiation-inducing reagent at a concentration of mg / mL, it was passed through a sterile filter unit (MILLIPORE) having a pore size of 0.22 μm and subjected to addition culture at the same timing as differentiation induction.
In the control test group, culture was performed only with D-MEM containing a differentiation-inducing reagent.
脂肪蓄積抑制効果を確認するために、ＴＧ蓄積量の測定を行った。測定は、８日間の添加培養の後、ＰＢＳで２回洗浄し、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０液中でセルスクレーパーを用いて細胞を回収した。３０分静置後、２回の凍結融解処理を行い、遠心分離後の上清に含まれるＴＧ蓄積量についてトリグリセライド
Ｅ−テストワコー（和光純薬工業）を用いて定量を行った後、上清のタンパク量で補正を行った。タンパクの定量にはＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ （Ｐｉｅｒｃｅ) を使用した。
In order to confirm the effect of suppressing fat accumulation, the amount of accumulated TG was measured. For the measurement, after 8 days of addition culture, the cells were washed twice with PBS, and the cells were recovered in a 0.5% Tween 20 solution using a cell scraper. After standing for 30 minutes, freeze-thaw treatment was performed twice, and the amount of TG accumulated in the supernatant after centrifugation was quantified using Triglyceride E-Test Wako (Wako Pure Chemical Industries), and then the supernatant The amount of protein was corrected. BCA Protein Assay Kit (Pierce) was used for protein quantification.
ＴＧ蓄積量の測定結果を図５に示す。図５は、分化誘導済３Ｔ３‐Ｌ１細胞の添加培養８日目におけるＴＧ蓄積量を示したグラフである。 The measurement result of the TG accumulation amount is shown in FIG. FIG. 5 is a graph showing the amount of TG accumulated on the 8th day of addition culture of differentiation-induced 3T3-L1 cells.
測定結果は、コントロールに対してＥＤＧＣＢ添加区において有意な脂肪細胞のＴＧ蓄積抑制効果が認められた。また、繰り返し行った実験においても同様、有意な脂肪細胞のＴＧ蓄積抑制効果が認められた。 As a result of the measurement, a significant adipocyte TG accumulation inhibitory effect was observed in the EDGCB-added group compared to the control. Similarly, in repeated experiments, a significant adipocyte TG accumulation inhibitory effect was observed.
本発明は、脂肪細胞分化抑制、脂肪蓄積抑制、脂肪細胞増殖抑制、アポトーシス誘導による脂肪組織量の減少促進の効果を有し、医薬品、医薬部外品、化粧品、飲食品に有用である。
The present invention has effects of inhibiting adipocyte differentiation, inhibiting fat accumulation, inhibiting adipocyte proliferation, and promoting the reduction of adipose tissue volume by inducing apoptosis, and is useful for pharmaceuticals, quasi drugs, cosmetics, and foods and drinks.
Claims (6)
ＭＰａ以上の高圧、６５〜８０℃の高温で、抽出処理されることを特徴とする請求項１に記載のメタボリックシンドローム予防剤。 The supercritical fluid treatment step uses supercritical fluid carbon dioxide and has a pressure of 10
The metabolic syndrome preventive agent according to claim 1, which is extracted at a high pressure of MPa or higher and a high temperature of 65 to 80 ° C.
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