JP4166811B2 - カルシウム非依存性である新規なホスホリパーゼａ２、その遺伝子及びそのプロモーター - Google Patents
カルシウム非依存性である新規なホスホリパーゼａ２、その遺伝子及びそのプロモーター Download PDFInfo
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Description
本発明は、カルシム非依存性である新規なホスホリパーゼＡ２、より詳細には、カルシウム非依存性のホスホリパーゼＡ２であって、カイニン酸又は電気刺激などの外的刺激により海馬特異的に発現するホスホリパーゼＡ２であって、配列表の配列番号１、５若しくは８に記載されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列の中の１個以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換され、欠失され、１個以上のアミノ酸が付加されてなるアミノ酸配列を有する新規なホスホリパーゼＡ２に関する。
また、本発明は、イントロン中に存在する塩基配列であって、カイニン酸刺激又は電気刺激などの外的刺激によりＲＮＡの転写開始を可能にし得る塩基配列を有する遺伝子、それを用いた発現を調節する方法、及びそれを導入した生物に関する。さらに、本発明は、本発明のホスホリパーゼＡ２を含有してなる医薬組成物に関する。
また、本発明は、イントロン中に存在する塩基配列であって、カイニン酸刺激又は電気刺激などの外的刺激によりＲＮＡの転写開始を可能にし得る塩基配列を有する遺伝子、それを用いた発現を調節する方法、及びそれを導入した生物に関する。さらに、本発明は、本発明のホスホリパーゼＡ２を含有してなる医薬組成物に関する。
真核生物の遺伝子においては、タンパク質のアミノ酸配列を規定する遺伝情報が文壇されている場合が多い。タンパク質のアミノ酸配列の遺伝情報を有する部分をエキソンといい、アミノ酸配列の遺伝情報を持たない部分はイントロンと言われている。遺伝子ＤＮＡが転写されてｍＲＮＡ前駆体が形成された後、スプライシングされて、イントロン部分が切り取られ、成熟したｍＲＮＡとなる。
このようなイントロン部分が真核生物に何故存在しているのかという理由は未だ明らかにされていない。しかし、多くの場合はひとつのエキソンが、タンパク質の特定のドメイン（機能領域）としてコードされており、進化の過程で同じような機能を有する新たなタンパク質が必要とされる場合に、異なるエキソンの組み合わせにより必要なタンパク質を生成させることができるようになったとも考えられている。
このようなイントロン部分が真核生物に何故存在しているのかという理由は未だ明らかにされていない。しかし、多くの場合はひとつのエキソンが、タンパク質の特定のドメイン（機能領域）としてコードされており、進化の過程で同じような機能を有する新たなタンパク質が必要とされる場合に、異なるエキソンの組み合わせにより必要なタンパク質を生成させることができるようになったとも考えられている。
スプライシングを受ける前のｍＲＮＡ前駆体のスプライシングは、イントロンを切り取るだけでなく、エキソン部分も切り取り同種の機能を有する異なるタンパク質をコードするｍＲＮＡとする場合も知られている。
例えば、カルシトニン遺伝しは、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、カルシトニンＣＣＰ、ＣＧＲＰ（Calcitonin gene related peptide）の６個のエキソンを有している。エキソンＡ及びエキソンＢは非翻訳領域であり、翻訳領域はのこりの４個のエキソンである。細胞の核内で転写されたときは、全てのエキソンを含んでいるが、スプライシングの過程は、器官によって異なってきている。例えば、甲状腺Ｃ細胞では、６個目のＣＧＲＰのエキソンもスプライシングされて、その結果翻訳産物のタンパク質はＣ−Ｄ−カルシトニンＣＣＰからなるペプチドとなり、主として血清Ｃａの低下作用をするものとなる。また、視床下部の細胞では５個目のカルシトニンＣＣＰのエキソンもスプライシングされて、その結果翻訳産物のタンパク質はＣ−Ｄ−ＣＧＲＰからなるペプチドとなり、主として疼痛、自律神経活動の制御を担うペプチドとなる。
例えば、カルシトニン遺伝しは、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、カルシトニンＣＣＰ、ＣＧＲＰ（Calcitonin gene related peptide）の６個のエキソンを有している。エキソンＡ及びエキソンＢは非翻訳領域であり、翻訳領域はのこりの４個のエキソンである。細胞の核内で転写されたときは、全てのエキソンを含んでいるが、スプライシングの過程は、器官によって異なってきている。例えば、甲状腺Ｃ細胞では、６個目のＣＧＲＰのエキソンもスプライシングされて、その結果翻訳産物のタンパク質はＣ−Ｄ−カルシトニンＣＣＰからなるペプチドとなり、主として血清Ｃａの低下作用をするものとなる。また、視床下部の細胞では５個目のカルシトニンＣＣＰのエキソンもスプライシングされて、その結果翻訳産物のタンパク質はＣ−Ｄ−ＣＧＲＰからなるペプチドとなり、主として疼痛、自律神経活動の制御を担うペプチドとなる。
このように、エキソン部分をいくつかに分けておくことにより、必要に応じていくつかのエキソンを結合した異なるタンパク質を生成させることができるようになる。このような目的のために、エキソンを分けることは説明されているが、イントロンの必要性については、エキソン部分を作ること以外には殆ど解明されていない。イントロンの多くはその末端に５’−ＧＴ及びＡＧ−３’の配列を有し、中間にピリミジンに富む領域があることが知られており、この両末端の配列を認識してスプライシングが行われると考えられている。
ホスホリパーゼＡ２は、哺乳類や微生物などに広く分布しており、その多くは膜結合の酵素であり、膜リン脂質の代謝に関与している。８５ｋＤａ細胞質型ホスホリパーゼＡ２（ｃＰＬＡ２α）は、ホスホリパーゼＡ２の１種であり、主として膜リン脂質からアラキドン酸を切り出し、アラキドン酸から誘導されるプロスタグランジン、トロンボキサン、ロイコトリエンなどのアラキドン酸カスケードによる生理活性物質を産生する。また、脳内においても遊離されたアラキドン酸が種々の神経機能に関与することが知られており、本発明者らはこれまでに、ノーザンプロット法とin situハイブリダイゼーション法を用いて、ｃＰＬＡ２αが脳神経細胞に豊富に発現していることを示してきた。
一方、カイニン酸（Kainic acid）アミノ酸の１種であり、カイニンソウの中の駆虫成分として単離されてきたものである。カイニン酸はグルタミン酸に類似した化学構造を有するために、動物の脳や神経細胞のグルタミン酸受容体に結合し、ニューロン興奮作用を起こさせる物質として知られている。
本発明者らは、脳におけるホスホリパーゼＡ２の機能を調べるために、カイニン酸刺激や電気刺激を与えたところ、海馬の歯状回に限局して一過性に発現する新規ホスホリパーゼＡ２（アミノ酸４５５、分子量約５０Ｋ）を発見した。本酵素は細胞質型ホスホリパーゼＡ２α（８５Ｋ）の３０８番目のメチオニンから開始する部分タンパクであるが、同酵素の遺伝的欠損マウスでも出現するため、刺激に応じ、部位特異的に発現させる固有のプロモーターを含むものであった。本酵素は無刺激状態では存在しないが、電気刺激やカイニン酸刺激で発現し、従来のホスホリパーゼＡ２とは異なりカルシウム非依存性であって、エイコサノイドを産生し、脳機能を調節、また、神経細胞の変性やアポトーシス、再生に関与していることから、これらの脳機能の鍵を握る分子と考えられる。
また、この新規なホスホリパーゼＡ２（アミノ酸４５５、分子量約５０Ｋ）は、公知の細胞質型ホスホリパーゼＡ２α（８５Ｋ）の３０８番目のメチオニンから翻訳された部分タンパク質であり、その直前のイントロン部分にこのタンパク質を発現させるための固有のプロモーター領域が存在しており、本発明者らは、イントロンの中にＲＮＡの転写開始を可能にする機能を有するイントロンがあることを見出した。このイントロンは通常の状態では、ＲＮＡの転写開始の機能を有していないが、ある条件を設定することにより本来の転写位置からではなく、このイントロンの塩基配列の部分からＲＮＡの転写を開始する機能を有するものである。
本発明は、カルシウム非依存性の新規なホスホリパーゼＡ２（アミノ酸４５５、分子量約５０Ｋ）、それをコードする遺伝子、それに対する抗体を提供する。
また、本発明は、イントロンの中に存在する塩基配列からなる、外的刺激に応じ、部位特異的に発現させる固有のプロモーター又は調節遺伝子を提供するものである。さらに、本発明は、外的刺激に応じて目的のタンパク質を発現させる方法、及びそれを導入した生物を提供するものである。
さらに、本発明は、本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２が神経幹細胞に特異的に発現することから、神経幹細胞を特異的に探索する方法を提供する。
また、本発明は、イントロンの中に存在する塩基配列からなる、外的刺激に応じ、部位特異的に発現させる固有のプロモーター又は調節遺伝子を提供するものである。さらに、本発明は、外的刺激に応じて目的のタンパク質を発現させる方法、及びそれを導入した生物を提供するものである。
さらに、本発明は、本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２が神経幹細胞に特異的に発現することから、神経幹細胞を特異的に探索する方法を提供する。
本発明は、カルシウム非依存性の新規なホスホリパーゼＡ２、より詳細には、カルシウム非依存性で海馬特異的のホスホリパーゼＡ２であって、配列表の配列番号１、５若しくは８に記載されるアミノ酸配列、又はそれらのアミノ酸配列の中の１個以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換され、欠失され、１個以上のアミノ酸が付加されてなるアミノ酸配列を有するホスホリパーゼＡ２、それらをコードする遺伝子、及びその全長又は断片を抗原とする抗体に関する。
また、本発明はイントロン中に存在する塩基配列であって、カイニン酸刺激又は電気刺激などの外的刺激によりＲＮＡの転写開始を可能にし得る塩基配列を有する遺伝子、より詳細には、部位特異的にＲＮＡの転写開始を可能にし得る遺伝子に関する。好ましい本発明の遺伝子の例としては、配列表の配列番号１２、１３若しくは１４に記載される塩基配列、又はその一部が欠失、付加、置換されてなる部分配列からなる塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。
また、本発明はイントロン中に存在する塩基配列であって、カイニン酸刺激又は電気刺激などの外的刺激によりＲＮＡの転写開始を可能にし得る塩基配列を有する遺伝子、より詳細には、部位特異的にＲＮＡの転写開始を可能にし得る遺伝子に関する。好ましい本発明の遺伝子の例としては、配列表の配列番号１２、１３若しくは１４に記載される塩基配列、又はその一部が欠失、付加、置換されてなる部分配列からなる塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。
また、本発明は、イントロン中に存在する塩基配列であって、カイニン酸刺激又は電気刺激などの外的刺激によりＲＮＡの転写開始を可能にし得るプロモーター、より詳細には、ＲＮＡの転写開始が部位特異的である前記のプロモーター、及び当該プロモーターの上流に調節エレメントを有する調節遺伝子に関する。
さらに、本発明は、タンパク質をコードしている遺伝子の上流に前記の遺伝子、前記のプロモーター、又は前記の調節遺伝子のいずれかを導入して、カイニン酸刺激又は電気刺激などの外的刺激により、好ましくは部位特異的にＲＮＡの転写を開始させて、当該タンパク質を外的刺激に応じて発現させる方法、及びタンパク質をコードしている遺伝子の上流に前記の遺伝子、前記のプロモーター、又は前記の調節遺伝子のいずれかを導入してなる生物に関する。
また、本発明は、本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２の発現により神経幹細胞を特異的に探索する方法に関する。即ち、本発明は、神経細胞を外的刺激により刺激して、請求項１〜３のいずれかに記載のホスホリパーゼＡ２をコードしているｍＲＮＡの発現を検出又は同定することからなる神経幹細胞を検出又は同定する方法に関する。
さらに、本発明は、本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２及び製薬上許容される担体とからなる医薬組成物に関する。より詳細には、本発明は、本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２を含有してなるリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）などのリン脂質のレベル調節剤に関する。
さらに、本発明は、タンパク質をコードしている遺伝子の上流に前記の遺伝子、前記のプロモーター、又は前記の調節遺伝子のいずれかを導入して、カイニン酸刺激又は電気刺激などの外的刺激により、好ましくは部位特異的にＲＮＡの転写を開始させて、当該タンパク質を外的刺激に応じて発現させる方法、及びタンパク質をコードしている遺伝子の上流に前記の遺伝子、前記のプロモーター、又は前記の調節遺伝子のいずれかを導入してなる生物に関する。
また、本発明は、本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２の発現により神経幹細胞を特異的に探索する方法に関する。即ち、本発明は、神経細胞を外的刺激により刺激して、請求項１〜３のいずれかに記載のホスホリパーゼＡ２をコードしているｍＲＮＡの発現を検出又は同定することからなる神経幹細胞を検出又は同定する方法に関する。
さらに、本発明は、本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２及び製薬上許容される担体とからなる医薬組成物に関する。より詳細には、本発明は、本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２を含有してなるリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）などのリン脂質のレベル調節剤に関する。
本発明者らは、脳におけるホスホリパーゼＡ２の機能を調べる研究の一環で、カイニン酸を腹腔注入したラットの脳切片を作成し、ｃＰＬＡ２をプローブ（探索子）として、組織化学的にｍＲＮＡの発現を検討してきた。プローブの選定のために、通常、ｃＰＬＡ２の異なる部位を用いて、ノーザンブロットで確かめたところ、特定の部位（５’端）を用いたときに、ｃＰＬＡ２より短い長さ（１．８キロ塩基対程度）のｍＲＮＡが誘導されることを見出した。
このノーザンブロットの結果を図１に図面に代わる写真で示す。図１の上段は、ｃＰＬＡ２の塩基配列を示している。左端が翻訳開始コドン（ＡＴＧ）であり、プローブとして用いた部分をＡ、Ｂ、Ｃ及びＤで示している。即ち、プローブＡはＢａｍＨＩからＢａｌＩの部分で、プローブＢはＲｓａＩからＲｓａＩＢａｌＩの部分で、プローブＣはＲｓａＩからＢａｌＩの部分であり、プローブＤはＲｓａＩから終止コドン（ＴＧＡ）までの部分である。
図１の中段は、カイニン酸処理をしていない場合（ＫＡ（−））のものである。図１の下段は、カイニン酸処理をしたときの処理後３時間の場合（ＫＡ（＋）、３ｈ）のものである。カイニン酸処理をしていない場合（ＫＡ（−））には（図１の中段）、ｃＰＬＡ２αの位置のみにプロットがみられるが、カイニン酸処理をしたときの処理後３時間の場合（ＫＡ（＋））には、５’末端側のプローブＢ、Ｃ及びＤにはｃＰＬＡ２αの位置のみならずその下側により短い鎖長のプロットを観察することができた。
図１の中段は、カイニン酸処理をしていない場合（ＫＡ（−））のものである。図１の下段は、カイニン酸処理をしたときの処理後３時間の場合（ＫＡ（＋）、３ｈ）のものである。カイニン酸処理をしていない場合（ＫＡ（−））には（図１の中段）、ｃＰＬＡ２αの位置のみにプロットがみられるが、カイニン酸処理をしたときの処理後３時間の場合（ＫＡ（＋））には、５’末端側のプローブＢ、Ｃ及びＤにはｃＰＬＡ２αの位置のみならずその下側により短い鎖長のプロットを観察することができた。
次に海馬及び小脳について、経時的なノーザンブロットを行った。その結果を図２に図面に代わる写真で示す。図２の左側は海馬で、右側は小脳である。各々カイニン酸処理後から（０時間）、０．５時間後、３時間後、８時間後、１４時間後、１８時間後のブロットを示している。図２のいずれのところにもｃＰＬＡ２αの位置にプロットがみられるが、海馬（図２の左側）におけるカイニン酸処理３時間後の箇所にのみｃＰＬＡ２αの位置のみならずその下側により短い鎖長のプロットを観察することができた。
さらに、インサイチュハイブリダイゼーション（in situ hybridization）を行うと、海馬の歯状回に特異的な発現が認められた。この結果を図３に図面に代わる写真で示す。図３の左側は、脳の断面のものであり、図３の右側は脳の縦断面からのものである。図３において黒く見える部分が発色している部分である。発色している場所は、海馬の歯状回である。
この結果を拡大して示したものが図４の図面に代わる写真である。図４の左側はカイニン酸処理をしていないものであり、右側はカイニン酸処理３時間後のものである。海馬の歯状回に沿って発色を観察することができる。この発色は海馬の歯状回の外側において強く発色しており、また、海馬の歯状回には神経幹細胞が多数存在することから、これは海馬の歯状回に存在する神経幹細胞によるものと推定される。
この結果を拡大して示したものが図４の図面に代わる写真である。図４の左側はカイニン酸処理をしていないものであり、右側はカイニン酸処理３時間後のものである。海馬の歯状回に沿って発色を観察することができる。この発色は海馬の歯状回の外側において強く発色しており、また、海馬の歯状回には神経幹細胞が多数存在することから、これは海馬の歯状回に存在する神経幹細胞によるものと推定される。
そこで、ｃＰＬＡ２の全長をプローブとして、海馬歯状回のライブラリーより、目的ｃＤＮＡを得た。このｃＤＮＡをタンパクに翻訳し、酵素活性を見ると、ホスホリパーゼＡ２活性が認められた。
この構造解析より、細胞質型ホスホリパーゼＡ２（cytosolic phospholipase A2,ｃＰＬＡ２と略記）の短縮型ホスホリパーゼＡ２分子であることがわかった。ラットのｃＤＮＡは１，８４２塩基対、翻訳領域は１，３３５塩基対で、４４５のアミノ酸からなる分子量５０８１０．６のタンパクであった。この短縮型ホスホリパーゼＡ２は、カイニン酸で刺激した後の、脳の海馬歯状回に特異的に発現するので、kainate-inducible dentate gyrus specific ｃＰＬＡ２（ＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２）と名付けた。
この構造解析より、細胞質型ホスホリパーゼＡ２（cytosolic phospholipase A2,ｃＰＬＡ２と略記）の短縮型ホスホリパーゼＡ２分子であることがわかった。ラットのｃＤＮＡは１，８４２塩基対、翻訳領域は１，３３５塩基対で、４４５のアミノ酸からなる分子量５０８１０．６のタンパクであった。この短縮型ホスホリパーゼＡ２は、カイニン酸で刺激した後の、脳の海馬歯状回に特異的に発現するので、kainate-inducible dentate gyrus specific ｃＰＬＡ２（ＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２）と名付けた。
得られたＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２のアミノ酸配列をアミノ酸の１文字コードで次に示す。
ヒトのＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２は、
ヒトのＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２は、
ＭＮＴＴＬＳＳＬＫＥＫＶＮＴＡＱＣＰＬＰ ２０
ＬＦＴＣＬＨＶＫＰＤＶＳＥＬＭＦＡＤＷＶ ４０
ＥＦＳＰＹＥＩＧＭＡＫＹＧＴＦＭＡＰＤＬ ６０
ＦＧＳＫＦＦＭＧＴＶＶＫＫＹＥＥＮＰＬＨ ８０
ＦＬＭＧＶＷＧＳＡＦＳＩＬＦＮＲＶＬＧＶ １００
ＳＧＳＱＳＲＧＳＴＭＥＥＥＬＥＮＩＴＴＫ １２０
ＨＩＶＳＮＤＳＳＤＳＤＤＥＳＨＥＰＫＧＴ １４０
ＥＮＥＤＡＧＳＤＹＱＳＤＮＱＡＳＷＩＨＲ １６０
ＭＩＭＡＬＶＳＤＳＡＬＦＮＴＲＥＧＲＡＧ １８０
ＫＶＨＮＦＭＬＧＬＮＬＮＴＳＹＰＬＳＰＬ ２００
ＳＤＦＡＴＱＤＳＦＤＤＤＥＬＤＡＡＶＡＤ ２２０
ＰＤＥＦＥＲＩＹＥＰＬＤＶＫＳＫＫＩＨＶ ２４０
ＶＤＳＧＬＴＦＮＬＰＹＰＬＩＬＲＰＱＲＧ ２６０
ＶＤＬＩＩＳＦＤＦＳＡＲＰＳＤＳＳＰＰＦ ２８０
ＫＥＬＬＬＡＥＫＷＡＫＭＮＫＬＰＦＰＫＩ ３００
ＤＰＹＶＦＤＲＥＧＬＫＥＣＹＶＦＫＰＫＮ ３２０
ＰＤＭＥＫＤＣＰＴＩＩＨＦＶＬＡＮＩＮＦ ３４０
ＲＫＹＫＡＰＧＶＰＲＥＴＥＥＥＫＥＩＡＤ ３６０
ＦＤＩＦＤＤＰＥＳＰＦＳＴＦＮＦＱＹＰＮ ３８０
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ＩＫＥＡＭＶＥＳＩＥＹＲＲＱＮＰＳＲＣＳ ４２０
ＶＳＬＳＮＶＥＡＲＲＦＦＮＫＥＦＬＳＫＰ ４４０
ＫＡ ４４２
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ＱＡＦＫＲＬＨＤＬＭＨＦＮＴＬＮＮＩＤＶ ４００
ＩＫＥＡＭＶＥＳＩＥＹＲＲＱＮＰＳＲＣＳ ４２０
ＶＳＬＳＮＶＥＡＲＲＦＦＮＫＥＦＬＳＫＰ ４４０
ＫＡ ４４２
ラットのＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２は、
ＭＳＴＴＬＳＳＬＫＥＫＶＳＡＡＲＣＰＬＰ ２０
ＬＦＴＣＬＨＶＫＰＤＶＳＥＬＭＦＡＤＷＶ ４０
ＥＦＳＰＹＥＩＧＭＡＫＹＧＴＦＭＴＰＤＬ ６０
ＦＧＳＫＦＦＭＧＴＶＶＫＫＹＥＥＮＰＬＨ ８０
ＦＬＭＧＶＷＧＳＡＦＳＩＬＦＮＲＶＬＧＶ １００
ＳＧＳＱＮＫＧＳＴＭＥＥＥＬＥＮＩＴＡＫ １２０
ＨＩＶＳＮＤＳＳＤＳＤＤＥＡＱＧＰＫＧＴ １４０
ＥＮＥＤＡＥＲＥＹＱＮＤＮＱＡＳＷＶＨＲ １６０
ＭＬＭＡＬＶＳＤＳＡＬＦＮＴＲＥＧＲＡＧ １８０
ＫＥＨＮＦＭＬＧＬＮＬＮＴＳＹＰＬＳＰＬ ２００
ＲＤＦＳＰＱＤＳＦＤＤＤＥＬＤＡＡＶＡＤ ２２０
ＰＤＥＦＥＲＩＹＥＰＬＤＶＫＳＫＫＩＨＶ ２４０
ＶＤＳＧＬＴＦＮＬＰＹＰＬＩＬＲＰＱＲＧ ２６０
ＶＤＬＩＩＳＦＤＦＳＡＲＰＳＤＴＳＰＰＦ ２８０
ＫＥＬＬＬＡＥＫＷＡＫＭＮＫＬＰＦＰＫＩ ３００
ＤＰＹＶＦＤＲＥＧＬＫＥＣＹＶＦＫＰＫＮ ３２０
ＰＤＶＥＫＤＣＰＴＩＩＨＦＶＬＡＮＩＮＦ ３４０
ＲＫＹＫＡＰＧＶＬＲＥＴＫＥＥＫＥＩＡＤ ３６０
ＦＤＩＦＤＤＰＥＳＰＦＳＴＦＮＦＱＹＰＮ ３８０
ＱＡＦＫＲＬＨＤＬＭＹＦＮＴＬＮＮＩＤＶ ４００
ＩＫＤＡＩＶＥＳＩＥＹＲＲＱＮＰＳＲＣＳ ４２０
ＶＳＬＳＮＶＥＡＲＫＦＦＮＫＥＦＬＳＫＰ ４４０
ＴＡＥＳＩ ４４５
ＭＳＴＴＬＳＳＬＫＥＫＶＳＡＡＲＣＰＬＰ ２０
ＬＦＴＣＬＨＶＫＰＤＶＳＥＬＭＦＡＤＷＶ ４０
ＥＦＳＰＹＥＩＧＭＡＫＹＧＴＦＭＴＰＤＬ ６０
ＦＧＳＫＦＦＭＧＴＶＶＫＫＹＥＥＮＰＬＨ ８０
ＦＬＭＧＶＷＧＳＡＦＳＩＬＦＮＲＶＬＧＶ １００
ＳＧＳＱＮＫＧＳＴＭＥＥＥＬＥＮＩＴＡＫ １２０
ＨＩＶＳＮＤＳＳＤＳＤＤＥＡＱＧＰＫＧＴ １４０
ＥＮＥＤＡＥＲＥＹＱＮＤＮＱＡＳＷＶＨＲ １６０
ＭＬＭＡＬＶＳＤＳＡＬＦＮＴＲＥＧＲＡＧ １８０
ＫＥＨＮＦＭＬＧＬＮＬＮＴＳＹＰＬＳＰＬ ２００
ＲＤＦＳＰＱＤＳＦＤＤＤＥＬＤＡＡＶＡＤ ２２０
ＰＤＥＦＥＲＩＹＥＰＬＤＶＫＳＫＫＩＨＶ ２４０
ＶＤＳＧＬＴＦＮＬＰＹＰＬＩＬＲＰＱＲＧ ２６０
ＶＤＬＩＩＳＦＤＦＳＡＲＰＳＤＴＳＰＰＦ ２８０
ＫＥＬＬＬＡＥＫＷＡＫＭＮＫＬＰＦＰＫＩ ３００
ＤＰＹＶＦＤＲＥＧＬＫＥＣＹＶＦＫＰＫＮ ３２０
ＰＤＶＥＫＤＣＰＴＩＩＨＦＶＬＡＮＩＮＦ ３４０
ＲＫＹＫＡＰＧＶＬＲＥＴＫＥＥＫＥＩＡＤ ３６０
ＦＤＩＦＤＤＰＥＳＰＦＳＴＦＮＦＱＹＰＮ ３８０
ＱＡＦＫＲＬＨＤＬＭＹＦＮＴＬＮＮＩＤＶ ４００
ＩＫＤＡＩＶＥＳＩＥＹＲＲＱＮＰＳＲＣＳ ４２０
ＶＳＬＳＮＶＥＡＲＫＦＦＮＫＥＦＬＳＫＰ ４４０
ＴＡＥＳＩ ４４５
マウスのＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２は、
ＭＳＭＴＬＳＳＬＫＥＫＶＮＡＡＲＣＰＬＰ ２０
ＬＦＴＣＬＨＶＫＰＤＶＳＥＬＭ ＦＡＤＷ ４０
ＶＥＦＳＰＹＥＩＧＭＡＫＹＧＴＦＭＡＰＤ ６０
ＬＦＧＳＫＦＦＭＧＴＶＶＫＫＹＥＥＮＰＬ ８０
ＨＦＬＭＧＶＷＧＳＡＦＳＩＬＦＮＲＶＬＧ １００
ＶＳＧＳＱＮＫＧＳＴＭＥＥＥＬＥＮＩＴＡ １２０
ＫＨＩＶＳＮＤＳＳＤＳＤＤＥＡＱＧＰＫＧ １４０
ＴＥＮＥＥＡＥＫＥＹＱＳＤＮＱＡＳＷＶＨ １６０
ＲＭＬＭＡＬＶＳＤＳＡＬＦＮＴＲＥＧＲＡ １８０
ＧＫＶＨＮＦＭＬＧＬＮＬＮＴＳＹＰＬＳＰ ２００
ＬＲＤＦＳＳＱＤＳＦＤＤＥＬＤＡＡＶＡＤ ２２０
ＰＤＥＦＥＲＩＹＥＰＬＤＶＫＳＫＫＩＨＶ ２４０
ＶＤＳＧＬＴＦＮＬＰＹＰＬＩＬＲＰＱＲＧ ２６０
ＶＤＬＩＩＳＦＤＦＳＡＲＰＳＤＴＳＰＰＦ ２８０
ＫＥＬＬＬＡＥＫＷＡＫＭＮＫＬＰＦＰＫＩ ３００
ＤＰＹＶＦＤＲＥＧＬＫＥＣＹＶＦＫＰＫＮ ３２０
ＰＤＶＥＫＤＣＰＴＩＩＨＦＶＬＡＮＩＮＦ ３４０
ＲＫＹＫＡＰＧＶＬＲＥＴＫＥＥＫＥＩＡＤ ３６０
ＦＤＩＦＤＤＰＥＳＰＦＳＴＦＮＦＱＹＰＮ ３８０
ＱＡＦＫＲＬＨＤＬＭＹＦＮＴＬＮＮＩＤＶ ４００
ＩＫＤＡＩＶＥＳＩＥＹＲＲＱＮＰＳＲＣＳ ４２０
ＶＳＬＳＮＶＥＡＲＫＦＦＮＫＥＦＬＳＫＰ ４４０
ＴＶ ４４２
ＭＳＭＴＬＳＳＬＫＥＫＶＮＡＡＲＣＰＬＰ ２０
ＬＦＴＣＬＨＶＫＰＤＶＳＥＬＭ ＦＡＤＷ ４０
ＶＥＦＳＰＹＥＩＧＭＡＫＹＧＴＦＭＡＰＤ ６０
ＬＦＧＳＫＦＦＭＧＴＶＶＫＫＹＥＥＮＰＬ ８０
ＨＦＬＭＧＶＷＧＳＡＦＳＩＬＦＮＲＶＬＧ １００
ＶＳＧＳＱＮＫＧＳＴＭＥＥＥＬＥＮＩＴＡ １２０
ＫＨＩＶＳＮＤＳＳＤＳＤＤＥＡＱＧＰＫＧ １４０
ＴＥＮＥＥＡＥＫＥＹＱＳＤＮＱＡＳＷＶＨ １６０
ＲＭＬＭＡＬＶＳＤＳＡＬＦＮＴＲＥＧＲＡ １８０
ＧＫＶＨＮＦＭＬＧＬＮＬＮＴＳＹＰＬＳＰ ２００
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ＰＤＥＦＥＲＩＹＥＰＬＤＶＫＳＫＫＩＨＶ ２４０
ＶＤＳＧＬＴＦＮＬＰＹＰＬＩＬＲＰＱＲＧ ２６０
ＶＤＬＩＩＳＦＤＦＳＡＲＰＳＤＴＳＰＰＦ ２８０
ＫＥＬＬＬＡＥＫＷＡＫＭＮＫＬＰＦＰＫＩ ３００
ＤＰＹＶＦＤＲＥＧＬＫＥＣＹＶＦＫＰＫＮ ３２０
ＰＤＶＥＫＤＣＰＴＩＩＨＦＶＬＡＮＩＮＦ ３４０
ＲＫＹＫＡＰＧＶＬＲＥＴＫＥＥＫＥＩＡＤ ３６０
ＦＤＩＦＤＤＰＥＳＰＦＳＴＦＮＦＱＹＰＮ ３８０
ＱＡＦＫＲＬＨＤＬＭＹＦＮＴＬＮＮＩＤＶ ４００
ＩＫＤＡＩＶＥＳＩＥＹＲＲＱＮＰＳＲＣＳ ４２０
ＶＳＬＳＮＶＥＡＲＫＦＦＮＫＥＦＬＳＫＰ ４４０
ＴＶ ４４２
ヒトのＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。ヒトのＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２のｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列を配列表の配列番号２、３及び４に示す。配列番号２は５’ＵＴＲの配列をタイプＩにしたものであり、配列番号３は５’ＵＴＲの配列をタイプIIにしたものであり、配列番号４は５’ＵＴＲの配列をタイプＩ、タイプIIに分けない場合のものである。
ラットのＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２のアミノ酸配列を配列表の配列番号５に示す。ラットのＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２のｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列を配列表の配列番号６及び７に示す。配列番号６はタイプＩのものであり、配列番号７はタイプIIのものである。
マウスのＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２のアミノ酸配列を配列表の配列番号８に示す。マウスのＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２のｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列を配列表の配列番号９、１０及び１１に示す。配列番号９は５’ＵＴＲの配列をタイプＩにしたものであり、配列番号１０は５’ＵＴＲの配列をタイプIIにしたものであり、配列番号１１は５’ＵＴＲの配列をタイプＩ、タイプIIに分けない場合のものである。
ラットのＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２のアミノ酸配列を配列表の配列番号５に示す。ラットのＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２のｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列を配列表の配列番号６及び７に示す。配列番号６はタイプＩのものであり、配列番号７はタイプIIのものである。
マウスのＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２のアミノ酸配列を配列表の配列番号８に示す。マウスのＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２のｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列を配列表の配列番号９、１０及び１１に示す。配列番号９は５’ＵＴＲの配列をタイプＩにしたものであり、配列番号１０は５’ＵＴＲの配列をタイプIIにしたものであり、配列番号１１は５’ＵＴＲの配列をタイプＩ、タイプIIに分けない場合のものである。
本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２を特異的に認識するポリクローン抗体（断端抗体）を作成した。この抗体を用いて免疫組織化学分析による目的タンパクの発現を確認した。結果を図５に図面に代わる写真で示す。図５の上段の左側は、カイニン酸未処理の場合で、上段の右側はカイニン酸処理後３時間のものである。抗体による発色を確認することができる。図５の下段の左側は抗ＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２抗体（ＩｇＧ）未処理の場合の対照である。図５の下段の右側は、カイニン酸処理後３時間の抗ＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２抗体（ＩｇＧ）不存在下（図５の下段右側の左側の（−））及び存在下（その右側の（＋））でのクロマトの結果である。
次に、ｃＰＬＡ２及び本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２をコードするｃＤＮＡを発現ベクターｐＴｒａｃｅｒＥＦに組み込み、その発現を検討した。結果を図６に図面に代わる写真で示す。図６のレーン１はコントロールベクターの場合であり、レーン２はｃＰＬＡ２α／ｐＴｒａｃｅｒＥＦの場合であり、レーン３はＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２／ｐＴｒａｃｅｒＥＦの場合である。図６に左側は、抗Ｖ５エピトープＩｇＧを用いた場合であり、真ん中は抗ｃＰＬＡ２αＩｇＹを用いた倍委であり、右側は抗ＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２ＩｇＧを用いた場合である。
抗Ｖ５エピトープＩｇＧによる各スポット、及び抗ＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２ＩｇＧによるＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２のスポットが確認され、ＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２の発現が確認された。
抗Ｖ５エピトープＩｇＧによる各スポット、及び抗ＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２ＩｇＧによるＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２のスポットが確認され、ＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２の発現が確認された。
次に、ｃＰＬＡ２α及び本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２の酵素活性を検討した。基質として、１−Ｐａｍ−２−［１４Ｃ］アラキドノイル−ＰＣ（図７中における黒丸印（●））、１−Ｐａｍ−２−［１４Ｃ］リノレオイル−ＰＣ（図７中における黒三角印（▲））、１−Ｐａｍ−２−［１４Ｃ］オレオイル−ＰＣ（図７中における黒四角印（■））、及び１−Ｐａｍ−２−［１４Ｃ］パルミトイル−ＰＣ（図７中におけるアスタリスク印（＊））を用いて、それぞれの酵素活性を試験した。結果を図７に示す。図７の左側は、本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２のものであり、右側はｃＰＬＡ２αのものである。いずれの酵素もアラキドン酸リン脂質に対する酵素活性が極めて高く、ホスホリパーゼＡ２としてはほぼ同等の活性をゆうしていることがわかる。
これらの酵素活性の値（ｐｍｏｌ／分）を次の表１に示す。
これらの酵素活性の値（ｐｍｏｌ／分）を次の表１に示す。
表１ ＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２とｃＰＬＡ２αの酵素活性
────────────────────────────────
ホスホリパーゼＡ２活性(pmol/min)
─────────────────
基 質 KIDS cPLA2 ｃＰＬＡ２α
─────────────────────────────────
1-Pam-2-[１４C]アラキト゛ノイル-PC 35.6±3.8 24.4±1.4
1-Pam-2-[１４C]リノレオイル-PC 20.1±1.7 11.9±1.8
1-Pam-2-[１４C]オレオイル-PC 14.3±1.5 9.1±1.1
1-Pam-2-[１４C]ハ゜ルミトイル-PC 9.4±1.0 9.8±1.
─────────────────────────────────
なお、ホスホリパーゼＡ２活性はコントロールとの差によるものである。
────────────────────────────────
ホスホリパーゼＡ２活性(pmol/min)
─────────────────
基 質 KIDS cPLA2 ｃＰＬＡ２α
─────────────────────────────────
1-Pam-2-[１４C]アラキト゛ノイル-PC 35.6±3.8 24.4±1.4
1-Pam-2-[１４C]リノレオイル-PC 20.1±1.7 11.9±1.8
1-Pam-2-[１４C]オレオイル-PC 14.3±1.5 9.1±1.1
1-Pam-2-[１４C]ハ゜ルミトイル-PC 9.4±1.0 9.8±1.
─────────────────────────────────
なお、ホスホリパーゼＡ２活性はコントロールとの差によるものである。
次に、基質として１−Ｐａｍ−２−［１４Ｃ］アラキドノイル−ＰＣを用いて、ｃＰＬＡ２α及び本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２の酵素活性に及ぼすカルシウム依存性を検討した。
結果を図８及び図９に示す。図８の実線は本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２の場合であり、破線はｃＰＬＡ２αの場合である。それぞれ、黒丸印（●）はＥＤＴＡの不存在下のものであり、白丸印（○）はＥＤＴＡ存在下のものである。ｃＰＬＡ２αの場合の場合には、ＥＤＴＡによるカルシウムの非存在により急激な活性の低下がみられるが、本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２の場合にはそれほどの活性の低下はみられないことがわかる。
図９は前記の結果を相対比で表したものである。本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２の場合には、カルシウムの非存在下であっても４０％程度の活性を維持しているが、ｃＰＬＡ２αの場合の場合には、カルシウムの非存在下ではその活性は１０〜１５％程度に低下していることがわかる。
このように、本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２は、従来のｃＰＬＡ２αに比べてカルシウム非依存性であることを特徴とするものである。
結果を図８及び図９に示す。図８の実線は本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２の場合であり、破線はｃＰＬＡ２αの場合である。それぞれ、黒丸印（●）はＥＤＴＡの不存在下のものであり、白丸印（○）はＥＤＴＡ存在下のものである。ｃＰＬＡ２αの場合の場合には、ＥＤＴＡによるカルシウムの非存在により急激な活性の低下がみられるが、本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２の場合にはそれほどの活性の低下はみられないことがわかる。
図９は前記の結果を相対比で表したものである。本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２の場合には、カルシウムの非存在下であっても４０％程度の活性を維持しているが、ｃＰＬＡ２αの場合の場合には、カルシウムの非存在下ではその活性は１０〜１５％程度に低下していることがわかる。
このように、本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２は、従来のｃＰＬＡ２αに比べてカルシウム非依存性であることを特徴とするものである。
次に、清水等の作成したｃＰＬＡ欠損マウス（Uozumi,N. et al. Nature 390, 618-622, 1997）での本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２の発現を検討した。結果を図１０の図面に代わる写真に示す。図１０の上段はノックアウトマウスの（＋／＋）のもので、下段はノックアウトマウスの（−／−）のものである。図１０の左側はカイニン酸未処理（ＫＡ（−））を、右側はカイニン酸処理後３時間（ＫＡ（＋））のものを示す。いずれのノックアウトマウスにおいてもカイニン酸処理により本酵素の発現を確認することができた。
このことは、本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２は、その全長であるｃＰＬＡ２とは異なるプロモーターを用いて発現していることを示している。
このことは、本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２は、その全長であるｃＰＬＡ２とは異なるプロモーターを用いて発現していることを示している。
図１１は、ｃＰＬＡ２とＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２の発現状況を図示したものである。図１１の上段は、ゲノム遺伝子におけるｃＰＬＡ２のエキソンとイントロンとを模式的に示している。全長のｃＰＬＡ２は全てのエキソンから生成させらたものであり、最初のエキソンの上流にプロモーター領域を含む調節遺伝子が存在している。これに対して、本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２は、図１１において「Ｍ３０８」と記された３０８番目のメチオニンから始まるタンパク質であり、このタンパク質がｃＰＬＡ欠損マウス、即ち最初のエキソンの上流にプロモーター領域を含む調節遺伝子の機能が破壊されているマウスにおいて発現が確認されたことから、本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２は、「Ｍ−３０８」の上流にプロモーター領域を含む調節遺伝子領域を持っていることがわかった。しかし、この調節遺伝子は通常の状態では機能されないようになっており、カイニン酸刺激などの刺激に応じてしか機能しないものであることもわかる。
そこで、「Ｍ−３０８」の上流のイントロンの塩基配列をラット、マウス及びヒトについて解析した。結果を並べて図１２に示す。
このイントロンのヒトの塩基配列を配列表の配列番号７に示す。ラットの塩基配列を配列表の配列番号８に示す。さらに、マウスの塩基配列を配列表の配列番号９に示す。
図１２は、ラット（上段）、マウス（中段）、及びヒト（下段）の「Ｍ−３０８」を含むエキソンの直前のイントロンの最初の塩基からの塩基配列を、全長のｃＰＬＡ２のエキソン領域が開始する塩基を１番として番号を付したものである。この番号で９２番目（ヒト）からのＡＴＧがＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２の翻訳開始コドンである。
このイントロンのヒトの塩基配列を配列表の配列番号７に示す。ラットの塩基配列を配列表の配列番号８に示す。さらに、マウスの塩基配列を配列表の配列番号９に示す。
図１２は、ラット（上段）、マウス（中段）、及びヒト（下段）の「Ｍ−３０８」を含むエキソンの直前のイントロンの最初の塩基からの塩基配列を、全長のｃＰＬＡ２のエキソン領域が開始する塩基を１番として番号を付したものである。この番号で９２番目（ヒト）からのＡＴＧがＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２の翻訳開始コドンである。
次に、脳の海馬歯状回における神経細胞を用いて、本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２の発現を検討した。結果を図１３に図面に代わる写真で示す。
図１３の上段は対照としてのネスチン（Nestin）であり、中段は神経幹細胞を用いた場合であり、下段は神経の成熟細胞を用いた場合である。左側のＡは各細胞の位置を示し、中央のＢは本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２の発現を示す発色であり、右側は左側のＡと中央のＢを重ね合わせて両者の位置を確認したものである。
この結果、本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２は神経成熟細胞では明瞭な発現は観察されず、神経幹細胞において明瞭に発現を観察することができることがわかる。これは本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２が神経幹細胞において特異的に発現する物質であること、及び神経幹細胞においては成熟細胞におけるイントロンが特異的にプロモーターの役割を担っていることを示唆するものである。
図１３の上段は対照としてのネスチン（Nestin）であり、中段は神経幹細胞を用いた場合であり、下段は神経の成熟細胞を用いた場合である。左側のＡは各細胞の位置を示し、中央のＢは本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２の発現を示す発色であり、右側は左側のＡと中央のＢを重ね合わせて両者の位置を確認したものである。
この結果、本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２は神経成熟細胞では明瞭な発現は観察されず、神経幹細胞において明瞭に発現を観察することができることがわかる。これは本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２が神経幹細胞において特異的に発現する物質であること、及び神経幹細胞においては成熟細胞におけるイントロンが特異的にプロモーターの役割を担っていることを示唆するものである。
次に神経幹細胞を用いて、カイニン酸刺激（１０μＭ）、カイニン酸とＣＮＱＸによる刺激（ＫＡ１０μＭ＋ＣＮＱＸ２０μＭ）、及びグルタミン酸（５０μＭ）による刺激その発現を検討した。
結果を図１４に図面に代わる写真で示す。図１４の上段はプローブとしてＰ９０−Ｐ２７の２５２ｂｐのもの（この配列は全長のｃＰＬＡ２と共通する部分の配列である。）、上から２段目はＰ１９−Ｐ２７の２９０ｂｐのもの（この配列は本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２に特異的な配列を含むものである。）、下の２段はコントロールのためのＧ３ＰＤＨ及びＮｅｓｔｉｎのものである。図１４はその下にＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２の５’側の転写開始位置と図１４の上２段で用いたプローブの配列位置を示している。
図１４の各レーンは、左からコントロール、カイニン酸刺激（ＫＡ（１０μＭ））、カイニン酸とＣＮＱＸによる刺激（ＫＡ（１０μＭ）＋ＣＮＱＸ（２０μＭ））、及びグルタミン酸（Ｇｌｕ（５０μＭ））を示す。
この結果、カイニン酸刺激（１０μＭ）の刺激のときに特異的に本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２の発現が確認された。
したがって、本発明は、本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２の発現により神経幹細胞を特異的に探索する方法を提供する。即ち、本発明のこの方法によれば、カイニン酸により候補となる細胞を刺激して、本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２に発現を観察することにより神経幹細胞を特異的に、且つ簡便に捜し出すことができる。
結果を図１４に図面に代わる写真で示す。図１４の上段はプローブとしてＰ９０−Ｐ２７の２５２ｂｐのもの（この配列は全長のｃＰＬＡ２と共通する部分の配列である。）、上から２段目はＰ１９−Ｐ２７の２９０ｂｐのもの（この配列は本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２に特異的な配列を含むものである。）、下の２段はコントロールのためのＧ３ＰＤＨ及びＮｅｓｔｉｎのものである。図１４はその下にＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２の５’側の転写開始位置と図１４の上２段で用いたプローブの配列位置を示している。
図１４の各レーンは、左からコントロール、カイニン酸刺激（ＫＡ（１０μＭ））、カイニン酸とＣＮＱＸによる刺激（ＫＡ（１０μＭ）＋ＣＮＱＸ（２０μＭ））、及びグルタミン酸（Ｇｌｕ（５０μＭ））を示す。
この結果、カイニン酸刺激（１０μＭ）の刺激のときに特異的に本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２の発現が確認された。
したがって、本発明は、本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２の発現により神経幹細胞を特異的に探索する方法を提供する。即ち、本発明のこの方法によれば、カイニン酸により候補となる細胞を刺激して、本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２に発現を観察することにより神経幹細胞を特異的に、且つ簡便に捜し出すことができる。
さらに、本発明者らは、本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２がリゾホスホリパーゼA1活性を有していることを見出した。
リゾホスホリパーゼA1は、グリセロリン脂質の１位の飽和脂肪酸によるアシル基を特異的に分解する酵素である。そこで、本発明者らは、グリセロリン脂質の１位のパルミトイル基を１４Ｃでラベルしたリゾホスファチジルコリン（ｌｙｓｏＰＣ）を基質として、本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２のリゾホスホリパーゼA1活性を測定した。結果を図１５に示す。図１５の縦軸はｄｍｐで示されるリゾホスホリパーゼA1活性であり（平均値±標準偏差、ｎ＝３）、横軸は時間（分）である。各時間における活性値は左側から、ｃＰＬＡ２α（黒塗）、本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２（薄い黒）、及びｌａｃＺ（灰色）である。横軸の時間が４０分の箇所の右端（白色）は、バッファーを示している。図１５中のｐの値はｔ−テストにより本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２（薄い黒）とｌａｃＺの間に有意差があることを示している。
この結果、本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２は優れたリゾホスホリパーゼA1活性を有していることがわかった。
リゾホスホリパーゼA1は、グリセロリン脂質の１位の飽和脂肪酸によるアシル基を特異的に分解する酵素である。そこで、本発明者らは、グリセロリン脂質の１位のパルミトイル基を１４Ｃでラベルしたリゾホスファチジルコリン（ｌｙｓｏＰＣ）を基質として、本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２のリゾホスホリパーゼA1活性を測定した。結果を図１５に示す。図１５の縦軸はｄｍｐで示されるリゾホスホリパーゼA1活性であり（平均値±標準偏差、ｎ＝３）、横軸は時間（分）である。各時間における活性値は左側から、ｃＰＬＡ２α（黒塗）、本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２（薄い黒）、及びｌａｃＺ（灰色）である。横軸の時間が４０分の箇所の右端（白色）は、バッファーを示している。図１５中のｐの値はｔ−テストにより本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２（薄い黒）とｌａｃＺの間に有意差があることを示している。
この結果、本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２は優れたリゾホスホリパーゼA1活性を有していることがわかった。
次に、本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２のリゾホスホリパーゼA1活性を動力学的解析を行った。結果を図１６に示す。図１６の縦軸はｄｍｐで示されるリゾホスホリパーゼA1活性であり（平均値±標準偏差、ｎ＝３）、横軸は基質のリゾホスファチジルコリン（ｌｙｓｏＰＣ）の濃度（μＭ）を示す。図１６の黒丸印はｃＰＬＡ２αを示し、薄い黒丸印は本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２を示し、濃い灰色の丸印はｌａｃＺを示し、薄い灰色の丸印はバッファーを示している。図１６の上側の小さいグラフは、動力学的解析結果を示すものであり、上側のｙ＝８５．７８４ｘ＋０．３７８の式で示されるのが本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２であり、下側のｙ＝５９．４４１ｘ＋０．８９８の式で示されるのはｃＰＬＡ２αである。
さらに、本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２のリゾホスホリパーゼA1活性におけるカルシウムイオン及びＡＥＢＳＦ（４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスロニルフルオライド：セリンプロテアーゼの阻害剤）の影響について検討した。
カルシウムイオンの影響の試験の結果を図１７に示す。図１７の縦軸はｄｍｐで示されるリゾホスホリパーゼA1活性であり（平均値±標準偏差、ｎ＝３）、横軸は５ｍＭのＥＤＴＡの不存在（−）の場合と存在（＋）の場合を示している。各場合の活性値は左側から、ｃＰＬＡ２α（黒塗）、本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２（薄い黒）、ｌａｃＺ（灰色）、及びバッファー（白色）である。図１７中のｐの値はｔ−テストにより本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２（薄い黒）とｌａｃＺの間に有意差があることを示している。
この結果、ｃＰＬＡ２α（黒塗）は、ＥＤＴＡの存在（＋）によりカルシウムイオンが非存在となると活性が低下するのに対して、本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２（薄い黒）はカルシウムイオンの存在（ＥＤＴＡ不存在（−））の場合も、非存在（ＥＤＴＡ存在（＋））の場合もいずれの場合においても同程度の活性が維持されていることがわかる。
次に、ＡＥＢＳＦの存在による影響の結果を図１８に示す。図１８の縦軸はｄｍｐで示されるリゾホスホリパーゼA1活性であり（平均値±標準偏差、ｎ＝３）、横軸はＡＥＢＳＦの濃度（ｍＭ）を示す。図１８の黒丸印はｃＰＬＡ２αを示し、薄い黒丸印は本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２を示し、濃い灰色の丸印はｌａｃＺを示し、薄い灰色の丸印はバッファーを示している。この結果、いずれの酵素もＡＥＢＳＦの存在により活性を失うことがわかった。
カルシウムイオンの影響の試験の結果を図１７に示す。図１７の縦軸はｄｍｐで示されるリゾホスホリパーゼA1活性であり（平均値±標準偏差、ｎ＝３）、横軸は５ｍＭのＥＤＴＡの不存在（−）の場合と存在（＋）の場合を示している。各場合の活性値は左側から、ｃＰＬＡ２α（黒塗）、本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２（薄い黒）、ｌａｃＺ（灰色）、及びバッファー（白色）である。図１７中のｐの値はｔ−テストにより本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２（薄い黒）とｌａｃＺの間に有意差があることを示している。
この結果、ｃＰＬＡ２α（黒塗）は、ＥＤＴＡの存在（＋）によりカルシウムイオンが非存在となると活性が低下するのに対して、本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２（薄い黒）はカルシウムイオンの存在（ＥＤＴＡ不存在（−））の場合も、非存在（ＥＤＴＡ存在（＋））の場合もいずれの場合においても同程度の活性が維持されていることがわかる。
次に、ＡＥＢＳＦの存在による影響の結果を図１８に示す。図１８の縦軸はｄｍｐで示されるリゾホスホリパーゼA1活性であり（平均値±標準偏差、ｎ＝３）、横軸はＡＥＢＳＦの濃度（ｍＭ）を示す。図１８の黒丸印はｃＰＬＡ２αを示し、薄い黒丸印は本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２を示し、濃い灰色の丸印はｌａｃＺを示し、薄い灰色の丸印はバッファーを示している。この結果、いずれの酵素もＡＥＢＳＦの存在により活性を失うことがわかった。
最近になって、リゾホスファチジルコリン（以下ＬＰＣ）が、免疫調節受容体であるＧ２Ａのリガンドであることが見出された（Janusz H., et al., Science, 293, 702-705 (2001)）。また、免疫調節受容体Ｇ２Ａ欠損マウスにおける研究からＧ２Ａは末梢リンパ球のホメオスタシスを制御する際に重要な役割をはたしていることがわかってきている（Lu Q. Le, et al., Immunity, 14, 561-571 (2001)）。したがって、ＬＰＣは生体内、特に末梢系における免疫、細胞増殖などの調節因子と考えられ、ＬＰＣが過剰になると細胞死がおこり、また、動脈硬化、免疫能の低下などが発症することになる。本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２は、ホスホリパーゼＡ２活性及びリゾホスホリパーゼA1活性を有し、このＬＰＣのレベルを適切に調節する作用を有するものである。本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２により、過剰に存在しているＬＰＣを除去することができ、アポトーシスの抑制や免疫機能の改善、動脈硬化などの予防や治療に使用することができる。
したがって、本発明は、本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２によるリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）調節剤を提供するものである。
したがって、本発明は、本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２によるリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）調節剤を提供するものである。
本発明は、カイニン酸刺激やてんかん発作などで、海馬歯状回に特異的な細胞死がおこる原因と考えられる、新規な酵素を提供するものである。この酵素の阻害剤を作成することで、細胞死を予防することが可能となる。
また、本発明は、ホスホリパーゼＡ２活性を有し、かつカルシウム非依存性の新規な酵素を提供するものである。
さらに、本発明は、イントロン中に外的刺激によりＲＮＡの転写開始を可能する機能があることを初めて明らかにするものである。ゲノムにおけるイントロンの新たな機能を解明すると同時に、外的刺激によりプロモーターあるいは調節遺伝子として機能する新たなタイプの遺伝子を提供するものである。本発明のプロモーターあるいは調節遺伝子として機能する新たなタイプの遺伝子は、イントロンとしての機能を有するのみならず、外的刺激に応じた時期特異的な目的遺伝子の発現を可能し、また組織に応じた部位特異的な目的遺伝子の発現を可能するものである。したがって、本発明のプロモーターあるいは調節遺伝子は、遺伝子の発現調整に使用することができ、トランスジェニック動物やノックアウト動物などに応用することができる。
また、本発明のＫＩＤＳｃＰＬＡ２は、カルシウム非依存的にリゾホスホリパーゼＡ１活性を有し、リン脂質のレベル調節剤として有用であり、免疫性疾患や動脈硬化などの予防・治療に有用である。
また、本発明は、ホスホリパーゼＡ２活性を有し、かつカルシウム非依存性の新規な酵素を提供するものである。
さらに、本発明は、イントロン中に外的刺激によりＲＮＡの転写開始を可能する機能があることを初めて明らかにするものである。ゲノムにおけるイントロンの新たな機能を解明すると同時に、外的刺激によりプロモーターあるいは調節遺伝子として機能する新たなタイプの遺伝子を提供するものである。本発明のプロモーターあるいは調節遺伝子として機能する新たなタイプの遺伝子は、イントロンとしての機能を有するのみならず、外的刺激に応じた時期特異的な目的遺伝子の発現を可能し、また組織に応じた部位特異的な目的遺伝子の発現を可能するものである。したがって、本発明のプロモーターあるいは調節遺伝子は、遺伝子の発現調整に使用することができ、トランスジェニック動物やノックアウト動物などに応用することができる。
また、本発明のＫＩＤＳｃＰＬＡ２は、カルシウム非依存的にリゾホスホリパーゼＡ１活性を有し、リン脂質のレベル調節剤として有用であり、免疫性疾患や動脈硬化などの予防・治療に有用である。
本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２は、全長のｃＰＬＡ２の部分長のものであるが、このものがホスホリパーゼＡ２を活性を保持し、かつカルシウム非依存性であることを特徴するものであり、必ずしも配列表の配列番号１、３又は５に記載されているアミノ酸配列を有するものに限定されるものではない。ホスホリパーゼＡ２を活性を保持し、かつカルシウム非依存性であれば、配列表の配列番号１、３又は５に記載されているアミノ酸配列のうちの１〜２０個程度のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されていてもよいし、欠失していてもよいし、また付加されていてもよい。又は、これらの置換、欠失、及び付加が同時に組み合わされて行われたものであってもよい。
本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２は本明細書において開示した方法にしたがって発現させて製造することもできるが、本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２のｃＤＮＡを用いて通常の遺伝子組換え技術により製造することができる。
本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２は、その全長又は一部、好ましくは５アミノ酸以上、又は１０アミノ酸以上からなる部分長のペプチドを抗原として、それに対する抗体を製造することができる。本発明の抗体は通常の方法で製造することができ、必要に応じてポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体とすることができる。
また、カイニン酸刺激やてんかん発作などで、海馬歯状回に特異的な細胞死がおこることが知られている。本発明はカイニン酸刺激やてんかん発作などにより海馬歯状回にＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２が発現していることを見出した。してみれば、本酵素の阻害剤を作成することで、海馬歯状回における細胞死を予防することが可能であり、本酵素はその阻害剤の開発のためにも有用なものである。
また、カイニン酸刺激やてんかん発作などで、海馬歯状回に特異的な細胞死がおこることが知られている。本発明はカイニン酸刺激やてんかん発作などにより海馬歯状回にＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２が発現していることを見出した。してみれば、本酵素の阻害剤を作成することで、海馬歯状回における細胞死を予防することが可能であり、本酵素はその阻害剤の開発のためにも有用なものである。
また、本発明は、イントロンの中に外的刺激に応じて活性化される調節遺伝子としての機能を有するものがあることを初めて見出したものであり、イントロンの塩基配列中に外的刺激に応じてプロモーターとしても機能を有する塩基配列が少なくとも存在していることを明らかにしたものである。
したがって、本発明は、イントロン中に存在する塩基配列であって、外的刺激によりＲＮＡの転写開始を可能にし得る塩基配列を有する遺伝子を提供するものである。本発明の当該遺伝子は少なくとも６塩基からなる、好ましくは配列表の配列番号７、８又は９に示される塩基配列の中の少なくとも４塩基以上、好ましくは６塩基以上からなる、イントロン中に存在する塩基配列であって、外的刺激によりＲＮＡの転写開始を可能にし得る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。
したがって、本発明は、イントロン中に存在する塩基配列であって、外的刺激によりＲＮＡの転写開始を可能にし得る塩基配列を有する遺伝子を提供するものである。本発明の当該遺伝子は少なくとも６塩基からなる、好ましくは配列表の配列番号７、８又は９に示される塩基配列の中の少なくとも４塩基以上、好ましくは６塩基以上からなる、イントロン中に存在する塩基配列であって、外的刺激によりＲＮＡの転写開始を可能にし得る塩基配列を有するオリゴヌクレオチドである。
また、本発明の当該遺伝子は少なくともＲＮＡの転写開始に関与するプロモーターとしての機能を有するものであるから、本発明は当該遺伝子又はその部分長からなる外的刺激によりＲＮＡの転写開始を可能にし得るプロモーターを提供するものである。本発明のプロモーターは、成熟した細胞の通常の条件下ではＲＮＡの転写開始を生起させることは無く、特定の外的刺激により初めてＲＮＡの転写開始を生起させ得るものであることを特徴とするものである。さらに、本発明のプロモーターは、その塩基配列がイントロン中に存在している塩基配列であることを特徴とするものである。さらに好ましくは、ＲＮＡの転写開始を可能にする部位が特異的であることを特徴とするものである。本発明のプロモーターは、４〜２０塩基以上、好ましくは６〜２０塩基以上の長さを有するものが好ましいが、これに限定されるものではない。
本発明のプロモーターは、これを単独で使用することもできるが、エンハンサーなどの調節エレメントと一緒にして使用するのが好ましい。調節エレメントはシスに位置しているものが好ましいが、トランスであってもよい。本発明は、本発明の前記したプロモーターと調節エレメントがセットになった調節遺伝子を提供するものでもある。このような調節遺伝子は、調節エレメントがシスエレメントである場合には１本鎖であってもよく、また２本鎖であってもよい。調節エレメントがトランスエレメントの場合には２本鎖として使用される。
あるイントロンが、外的刺激によりＲＮＡの転写開始を可能にし得る塩基配列を有するものであることがわかった場合であって、そのイントロン中のどの塩基配列がプロモーターなどの役割を担っているのかと言うことが充分にわかない場合には、当該イントロンの塩基配列の全長を本発明の調節遺伝子として使用することもできる。
あるイントロンが、外的刺激によりＲＮＡの転写開始を可能にし得る塩基配列を有するものであることがわかった場合であって、そのイントロン中のどの塩基配列がプロモーターなどの役割を担っているのかと言うことが充分にわかない場合には、当該イントロンの塩基配列の全長を本発明の調節遺伝子として使用することもできる。
本発明おける「外的刺激」とは、通常の成熟細胞の生育条件においては生起しない刺激であって、好ましくはこれらの刺激により細胞死が誘発されるような刺激である。例えば、カイニン酸などの化学物質による刺激、電気ショックや温度変化などの物理的な刺激、てんかん発作などの他の器官の異常による刺激などが挙げられる。
また、本発明における「部位特異的」とは、生体における組織、器官、又は細胞の種類、状態、若しくは生育度などにより他と区別可能なもの部位に特異的であることをいう。本発明の外的刺激によりＲＮＡの転写開始を可能にし得るプロモーターや遺伝子などは、必ずしも部位特異的でなくてもよいが、部位特異的であってもよい。本明細書の配列表の配列番号７、８及び９に示されるイントロンの塩基配列は、海馬の歯状回に特異的なものと考えられるが、本発明のプロモーターや遺伝子はこれに限定されるものではない。
また、本発明における「部位特異的」とは、生体における組織、器官、又は細胞の種類、状態、若しくは生育度などにより他と区別可能なもの部位に特異的であることをいう。本発明の外的刺激によりＲＮＡの転写開始を可能にし得るプロモーターや遺伝子などは、必ずしも部位特異的でなくてもよいが、部位特異的であってもよい。本明細書の配列表の配列番号７、８及び９に示されるイントロンの塩基配列は、海馬の歯状回に特異的なものと考えられるが、本発明のプロモーターや遺伝子はこれに限定されるものではない。
本発明は、生物のイントロンにおいて外的刺激によりＲＮＡの転写開始を可能にし得る塩基配列が存在していることを明らかにするものであり、本発明のこのような遺伝子の利用範囲は極めて広い。第一の特徴に、イントロンとして存在するものであるから、この遺伝子を導入しても通常はイントロンとしてしか機能せず、生物の通常の生育に影響を与えないということである。第二の特徴は、本発明の調節遺伝子は通常の状態ではＲＮＡの転写に関しては不活性であり、その下流にコードされているタンパク質を発現しないということである。第三の特徴は、部位特異的に発現させることも可能であるということである。
本発明のプロモーター及び調節遺伝子ははこのような特徴を有しているために、その目的に応じた応用が可能である。例えば、特定の外的刺激により、有るタンパク質の部分長のものを発現させて、その生理活性を生体内で観察したい場合には、開始コドンとなるメチオニンを含むエキソンの直前に本発明の遺伝子を導入することにより、生体に特定の外的刺激を与えることにより目的の部分長のタンパク質の発現を促すことができる。また、適当なメチオニンが無い場合には、イントロン領域の中にメチオニンをコードする塩基配列を導入することも考えられる。
本発明のプロモーター及び調節遺伝子ははこのような特徴を有しているために、その目的に応じた応用が可能である。例えば、特定の外的刺激により、有るタンパク質の部分長のものを発現させて、その生理活性を生体内で観察したい場合には、開始コドンとなるメチオニンを含むエキソンの直前に本発明の遺伝子を導入することにより、生体に特定の外的刺激を与えることにより目的の部分長のタンパク質の発現を促すことができる。また、適当なメチオニンが無い場合には、イントロン領域の中にメチオニンをコードする塩基配列を導入することも考えられる。
第二の特徴によれば、目的のタンパク質の上流に本発明のプロモーター、調節遺伝子を結合させた遺伝子を生体に導入することにより、特定の外的刺激を与えることにより目的の導入タンパク質の発現を外的刺激を与えた時期だけに発現させることができる。例えば、本発明のプロモーターの先に生理活性タンパク質をつけ、特定の外的刺激を与えたときだけに当該生理活性タンパク質を発現させ一時的に細胞に当該生理活性を与えるということも可能である。生理活性タンパク質としてジフテリア毒素などの毒素を用いれば、一過性で細胞を殺すということも可能になる。あるいは、本発明のプロモーターの下流にＣＲＥ遺伝子をついないだ遺伝子を導入し、グルタミン酸受容体などの特定の遺伝子をｌｏｘ−Ｐ配列で取り巻いたトランスジェニックマウスを作成する。こうすることで、特定の外的刺激を与えると、ＣＲＥ遺伝子が発現し、ｌｏｘ−Ｐ配列で取り巻まかれたグルタミン酸受容体などの特定の遺伝子を相同組換えにより除去してしまうので、特定の外的刺激を与えたときからグルタミン酸受容体などの特定の遺伝子を欠失したマウスを作成することができる。このようなトランスジェニックマウスにより、成熟した生体におけるグルタミン酸受容体などの特定の遺伝子を欠失した病態を詳細に解析することが可能となる。
さらに、前記した第三の特徴によれば、前記した特徴を生体の部位特異的におこすことが可能になる。例えば、海馬歯状回で特異的に、特定の遺伝子を破壊するということも可能となる。
したがって、本発明は、本発明のプロモーター、調節遺伝子を用いて生体に導入したタンパク質をコードしている遺伝子の発現を、特定の外的刺激により調節する方法を提供するものである。前述してきたように、本発明のこの方法によれば、導入したタンパク質の発現の長さ、発現の時期、発現の部位を調節することが可能となる。
本発明のこの方法において導入されるタンパク質としては、何らかの生理活性を有するタンパク質であれば特に制限はなく、ゲノムの状態又はｃＤＮＡの状態で導入することができる。生理活性を有するタンパク質としては、例えば、ホルモンやサイトカインのようにいわゆる生理活性を有するものであってもよいし、ジフテリア毒素のように毒素であってもよいし、ＣＲＥ遺伝子のように相同組換えを誘発するようなものであってもよい。
本発明のこの方法において導入されるタンパク質としては、何らかの生理活性を有するタンパク質であれば特に制限はなく、ゲノムの状態又はｃＤＮＡの状態で導入することができる。生理活性を有するタンパク質としては、例えば、ホルモンやサイトカインのようにいわゆる生理活性を有するものであってもよいし、ジフテリア毒素のように毒素であってもよいし、ＣＲＥ遺伝子のように相同組換えを誘発するようなものであってもよい。
また、本発明は、タンパク質をコードしている遺伝子の上流に本発明のプロモーター、調節遺伝子を導入してなる生物を提供するものである。本発明の生物は、試験動物として有用であり、例えば、マウス、ラット、ウサギ、サルなどに適用することができる。また、植物に適用することも可能である。
従来、このような試験動物としては、トランスジェニックマウスやノックアウトマウスなどが開発されてきている。ノックアウトマウスについては、コンディショナルターゲティング法の開発が求められており、組織特異的に発現するプロモーターやテトラサイクリン感受性のプロモーターなども開発されてきているように組織特異的で時期特異的なプロモーターの開発が求められている。本発明のプロモーターや調節遺伝子はこのような要求を満たすものであり、しかもイントロンとしての機能も有するものであるから、試験動物に本発明のプロモーターや調節遺伝子は広く適用されることができる。
従来、このような試験動物としては、トランスジェニックマウスやノックアウトマウスなどが開発されてきている。ノックアウトマウスについては、コンディショナルターゲティング法の開発が求められており、組織特異的に発現するプロモーターやテトラサイクリン感受性のプロモーターなども開発されてきているように組織特異的で時期特異的なプロモーターの開発が求められている。本発明のプロモーターや調節遺伝子はこのような要求を満たすものであり、しかもイントロンとしての機能も有するものであるから、試験動物に本発明のプロモーターや調節遺伝子は広く適用されることができる。
本発明のＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２をリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）などのリン脂質のレベル調節剤として使用する場合には、静脈投与、筋肉投与、粘膜投与などの方法により投与することができる。投与量は、患者の状態や疾患の症状にもよるが、１０ｎＭ−１００ｍＭを数回に分けて投与する。本発明の医薬組成物としては、通常使用される製薬上の担体を用いて、静脈投与製剤や筋肉投与製剤に製剤化することができる。また、凍結乾燥製剤とすることもできる。
本発明のリン脂質のレベル調節剤用の医薬組成物は、アポトーシスの抑制や免疫機能の改善、動脈硬化などの予防や治療に使用することができる。
本発明のリン脂質のレベル調節剤用の医薬組成物は、アポトーシスの抑制や免疫機能の改善、動脈硬化などの予防や治療に使用することができる。
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１ （ｃＰＬＡ２の種々のプローブを用いたノーザンブロット）
ラットｃＰＬＡ２ａのｃＤＮＡを５’末端から大きく４つの領域Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄに分けた。それぞれの領域の長さは３００−５００ｂｐ程度の長さとし、これらのｃＤＮＡフラグメントをリボプローブ合成ベクターに組み込んだ後、インヴィトロトランスクリプション（in vitro transcription）法により放射標識リボプローブを合成した。カイニン酸刺激を行ったラットの海馬、および海馬歯状回のｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡをブロットしたメンブレンと、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄそれぞれのリボプローブを用いてハイブリダイゼーション反応を行い、いずれのプローブがＫＩＤＳｃＰＬＡ２を検出しうるか確かめた。その結果、ＫＩＤＳｃＰＬＡ２ ｍＲＮＡはＡをのぞく、Ｂ、Ｃ、Ｄのリボプローブで検出されることがわかった。
結果を図１及び図２に示す。
ラットｃＰＬＡ２ａのｃＤＮＡを５’末端から大きく４つの領域Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄに分けた。それぞれの領域の長さは３００−５００ｂｐ程度の長さとし、これらのｃＤＮＡフラグメントをリボプローブ合成ベクターに組み込んだ後、インヴィトロトランスクリプション（in vitro transcription）法により放射標識リボプローブを合成した。カイニン酸刺激を行ったラットの海馬、および海馬歯状回のｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡをブロットしたメンブレンと、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄそれぞれのリボプローブを用いてハイブリダイゼーション反応を行い、いずれのプローブがＫＩＤＳｃＰＬＡ２を検出しうるか確かめた。その結果、ＫＩＤＳｃＰＬＡ２ ｍＲＮＡはＡをのぞく、Ｂ、Ｃ、Ｄのリボプローブで検出されることがわかった。
結果を図１及び図２に示す。
実施例２ （インサイチュハイブリダイゼーション）
カイニン酸刺激を行った３週令ウイスターラットの脳を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、凍結切片を作成した。放射標識リボプローブＢ、Ｃ、Ｄを別々に凍結切片とハイブリダイゼーション反応させ、それぞれのプローブによる切片の標識像が同じであることを確認した。次にリボプローブＣを用いてカイニン酸刺激の有無で再び脳凍結切片を作成し、ＫＩＤＳｃＰＬＡ２ ｍＲＮＡの発現パターンを調べた。その結果、ＫＩＤＳｃＰＬＡ２ ｍＲＮＡは海馬歯状回に劇的に誘導されることがわかった。顕微鏡による強拡像を観察すると、ＫＩＤＳｃＰＬＡ２ ｍＲＮＡはなかでも歯状回の最内層に豊富に発現していることがわかった。
結果を図３及び図４に示す。
カイニン酸刺激を行った３週令ウイスターラットの脳を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、凍結切片を作成した。放射標識リボプローブＢ、Ｃ、Ｄを別々に凍結切片とハイブリダイゼーション反応させ、それぞれのプローブによる切片の標識像が同じであることを確認した。次にリボプローブＣを用いてカイニン酸刺激の有無で再び脳凍結切片を作成し、ＫＩＤＳｃＰＬＡ２ ｍＲＮＡの発現パターンを調べた。その結果、ＫＩＤＳｃＰＬＡ２ ｍＲＮＡは海馬歯状回に劇的に誘導されることがわかった。顕微鏡による強拡像を観察すると、ＫＩＤＳｃＰＬＡ２ ｍＲＮＡはなかでも歯状回の最内層に豊富に発現していることがわかった。
結果を図３及び図４に示す。
実施例３ （免疫組織化学的染色）
カイニン酸刺激を行った３週令ウイスターラット、および６−１０週のＣ５７／Black６Ｊマウス、ｃＰＬＡ２ａノックアウトマウスの脳を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、凍結切片を作成した。抗ＫＩＤＳｃＰＬＡ２特異的断端抗体と脳切片の免疫反応を４度で一晩行った後、金コロイド標識二次抗体で ＫＩＤＳｃＰＬＡ２蛋白の発現を確認した。その結果、ＫＩＤＳｃＰＬＡ２はｍＲＮＡと同様、海馬歯状回に劇的に誘導され、しかも、その発現はｃＰＬＡ２ａノックアウトマウスの海馬歯状回にも観られることがわかった。このことから、ＫＩＤＳｃＰＬＡ２のプロモーターがｃＰＬＡ２ａノックアウトマウスで破壊をしたｃＰＬＡ２ａの第８エクソンの下流に存在することが示唆され、急性の神経刺激により、ｃＰＬＡ２ａのアイソフォームが誘導されてくることがわかった。
結果を図５に示す。
カイニン酸刺激を行った３週令ウイスターラット、および６−１０週のＣ５７／Black６Ｊマウス、ｃＰＬＡ２ａノックアウトマウスの脳を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、凍結切片を作成した。抗ＫＩＤＳｃＰＬＡ２特異的断端抗体と脳切片の免疫反応を４度で一晩行った後、金コロイド標識二次抗体で ＫＩＤＳｃＰＬＡ２蛋白の発現を確認した。その結果、ＫＩＤＳｃＰＬＡ２はｍＲＮＡと同様、海馬歯状回に劇的に誘導され、しかも、その発現はｃＰＬＡ２ａノックアウトマウスの海馬歯状回にも観られることがわかった。このことから、ＫＩＤＳｃＰＬＡ２のプロモーターがｃＰＬＡ２ａノックアウトマウスで破壊をしたｃＰＬＡ２ａの第８エクソンの下流に存在することが示唆され、急性の神経刺激により、ｃＰＬＡ２ａのアイソフォームが誘導されてくることがわかった。
結果を図５に示す。
実施例４ （ラットのＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２のｃＤＮＡのクローニング）
２種類の方法でその存在を確認し、クローンを単離した。
（１）カイニン酸刺激後のラット海馬から精製したｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡライブラリーを作成し、ＫＩＤＳｃＰＬＡ２を検出しうるｃＰＬＡ２ａの翻訳開始点から１，３６５（Ｒｓａ Ｉ）−１，９２５（Ｂａｌ Ｉ）のｃＤＮＡ配列をプローブとしてポジティブクローンを選択した。
４００万個のクローンより１２個のポジティブクローンを選択した。そのうちの２個は全長のホスホリパーゼＡ２のものであり、残り１０個のうちの６個と４個はタイプが異なり、前者をタイプIIとし、後者をタイプＩとした。
２種類の方法でその存在を確認し、クローンを単離した。
（１）カイニン酸刺激後のラット海馬から精製したｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡライブラリーを作成し、ＫＩＤＳｃＰＬＡ２を検出しうるｃＰＬＡ２ａの翻訳開始点から１，３６５（Ｒｓａ Ｉ）−１，９２５（Ｂａｌ Ｉ）のｃＤＮＡ配列をプローブとしてポジティブクローンを選択した。
４００万個のクローンより１２個のポジティブクローンを選択した。そのうちの２個は全長のホスホリパーゼＡ２のものであり、残り１０個のうちの６個と４個はタイプが異なり、前者をタイプIIとし、後者をタイプＩとした。
（２）ラットＫＩＤＳｃＰＬＡ２ ｃＤＮＡの５’末端を確認するために、カイニン酸刺激後のラット海馬から精製したポリ（Ａ）＋ＲＮＡを用いて５’ＲＡＣＥ法（5'-rapid amplification of cDNA ends）を行った。上記、１，３６５ （Ｒｓａ Ｉ）−１，９２５（Ｂａｌ Ｉ）の配列内に存在するプライマーから５’上流に増幅させた配列は、ｃＤＮＡライブラリーから選択したクローンの配列と一致した。
以上のことから、ＫＩＤＳｃＰＬＡ２はカイニン酸刺激後の海馬に誘導される新規遺伝子であることがわかった。
得られたラットのＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２のアミノ酸配列を配列表の配列番号５に示す。ラットのＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２のｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列を配列表の配列番号６（タイプＩ）及び配列番号７（タイプII）に示す。
以上のことから、ＫＩＤＳｃＰＬＡ２はカイニン酸刺激後の海馬に誘導される新規遺伝子であることがわかった。
得られたラットのＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２のアミノ酸配列を配列表の配列番号５に示す。ラットのＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２のｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列を配列表の配列番号６（タイプＩ）及び配列番号７（タイプII）に示す。
また、マウスのＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２のアミノ酸配列を配列表の配列番号８に示す。マウスのＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２のｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列を配列表の配列番号９（５’ＵＴＲをタイプＩにした場合）、配列番号１０（５’ＵＴＲをタイプIIにした場合）及び配列番号１１（５’ＵＴＲをタイプＩ、タイプIIに分けない場合）に示す。
ヒトのＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。ヒトのＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２のｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列を配列表の配列番号２（５’ＵＴＲをタイプＩにした場合）、配列番号３（５’ＵＴＲをタイプIIにした場合）及び配列番号４（５’ＵＴＲをタイプＩ、タイプIIに分けない場合）に示す。
これらの配列は、ヒト、マウス及びラットのｃＤＮＡ配列を同時にアライメントプログラムにかけ、転写開始位置、タイプＩ、タイプIIそれぞれの転写開始位置と推定されるヌクレオチドの一、タイプＩの配列とタイプIIの配列を結ぶジャンクション配列、総合的な配列ホモロジーなどの条件を当てはめて最も妥当な配列から選択してきたものである。
ヒトのＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。ヒトのＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２のｃＤＮＡの翻訳領域の塩基配列を配列表の配列番号２（５’ＵＴＲをタイプＩにした場合）、配列番号３（５’ＵＴＲをタイプIIにした場合）及び配列番号４（５’ＵＴＲをタイプＩ、タイプIIに分けない場合）に示す。
これらの配列は、ヒト、マウス及びラットのｃＤＮＡ配列を同時にアライメントプログラムにかけ、転写開始位置、タイプＩ、タイプIIそれぞれの転写開始位置と推定されるヌクレオチドの一、タイプＩの配列とタイプIIの配列を結ぶジャンクション配列、総合的な配列ホモロジーなどの条件を当てはめて最も妥当な配列から選択してきたものである。
実施例５（ＫＩＤＳ ｃＰＬＡ２の抗体の製造）
ラットｃＰＬＡ２ａのＭｅｔ−３０８の配列から全く同一の配列をもつＫＩＤＳｃＰＬＡ２を特異的に検出するために、このＭｅｔ−３０８から始まる７個のアミノ酸配列（ＭＳＴＴＬＳＳ）をもつ合成ペプチドをウサギに免疫し、その血清画分を調整した。さらにこの画分より、免疫グロブリン（ＩｇＧ）を精製し、最終標品とした。なお、この断端抗体はラットＫＩＤＳｃＰＬＡ２ばかりでなく、マウスＫＩＤＳｃＰＬＡ２も特異的に認識することを確認している。
ラットｃＰＬＡ２ａのＭｅｔ−３０８の配列から全く同一の配列をもつＫＩＤＳｃＰＬＡ２を特異的に検出するために、このＭｅｔ−３０８から始まる７個のアミノ酸配列（ＭＳＴＴＬＳＳ）をもつ合成ペプチドをウサギに免疫し、その血清画分を調整した。さらにこの画分より、免疫グロブリン（ＩｇＧ）を精製し、最終標品とした。なお、この断端抗体はラットＫＩＤＳｃＰＬＡ２ばかりでなく、マウスＫＩＤＳｃＰＬＡ２も特異的に認識することを確認している。
実施例６ （イントロンの塩基配列の解析）
ラット、およびマウスＫＩＤＳｃＰＬＡ２のイントロン配列（推定されるプロモーター領域）の解析を次の方法により行った。
ラット、およびマウスＫＩＤＳｃＰＬＡ２の５’ＵＴＲを含む上流約９ｋｂにわたる領域（ｃＰＬＡαのノックアウトマウスで破壊されているエクソンまでの領域）に関して、基本的な転写活性が存在するかどうか検討した。まず、この領域の約９ｋｂの配列、および５’ＵＴＲの上流約１，０００ｂｐを含む配列、ヒト・ラット・マウス間でホモロジーの高い約５００ｂｐを含む配列、５’ＵＴＲを含む約７００ｂｐの配列のそれぞれをルシフェラーゼ遺伝子の上流に組み込んだレポーターベクターを構築した。これらのレポーターベクターを培養細胞株に導入後、その細胞上清を調整し、基本転写活性の指標としてそのルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、５’ＵＴＲを含む約７００ｂｐの配列が特に高い転写活性をもっていることがわかった。
結果を図１２に示す。また、各動物の塩基配列を配列表の配列番号１２（ヒト）、１３（ラット）及び１４（マウス）に示す。
ラット、およびマウスＫＩＤＳｃＰＬＡ２のイントロン配列（推定されるプロモーター領域）の解析を次の方法により行った。
ラット、およびマウスＫＩＤＳｃＰＬＡ２の５’ＵＴＲを含む上流約９ｋｂにわたる領域（ｃＰＬＡαのノックアウトマウスで破壊されているエクソンまでの領域）に関して、基本的な転写活性が存在するかどうか検討した。まず、この領域の約９ｋｂの配列、および５’ＵＴＲの上流約１，０００ｂｐを含む配列、ヒト・ラット・マウス間でホモロジーの高い約５００ｂｐを含む配列、５’ＵＴＲを含む約７００ｂｐの配列のそれぞれをルシフェラーゼ遺伝子の上流に組み込んだレポーターベクターを構築した。これらのレポーターベクターを培養細胞株に導入後、その細胞上清を調整し、基本転写活性の指標としてそのルシフェラーゼ活性を測定した。その結果、５’ＵＴＲを含む約７００ｂｐの配列が特に高い転写活性をもっていることがわかった。
結果を図１２に示す。また、各動物の塩基配列を配列表の配列番号１２（ヒト）、１３（ラット）及び１４（マウス）に示す。
実施例７ （リゾホスホリパーゼＡ１活性の測定）
１−（１−１４Ｃパルミトイル）−リゾホスファチジルコリンを、標準緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｃｌ,（ＰＨ８．０）、２ｍＭ ＥＤＴＡ(ｐＨ８．０)、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、３０％グリセリン、１ｍＭ トリトンＸ−１００）で１０μＭに調整し、６１，４００ｄｐｍ／０．５ｎｍｏｌ／５０μＬで、ラット組換えＫＩＤＳｃＰＬＡ２、ｃＰＬＡ２α、及びｌａｃＺの各酵素反応を行った。反応時間は、０分、１０分、２０分、及び４０分の４点で、それぞれの時間で反応を停止させて検定を行った。
反応の停止は、５０ｍＬの反応系に対して氷冷した停止液（イソプロパノール／ｎ−ヘプタン／１Ｎ Ｈ２ＳＯ４：７８／２０／２）を２５０ｍＬ加え、ボルテツクスを行った。次いで１５０ｍＬのｎ−ヘプタン１００ｍＬのＨ２Ｏをカロえて、５分間激しくボルテツクスを行った。この液を１５，０００ｒｐｍで５分間、遠心を行って、上層の有機層を活性化シリカゲル（２０ｍｇ）を入れたチューブに加える。１５０ｍＬのｎ−ヘプタンを足し、再度５分間激しくポルテツクスを行った後、１５，０００ｒｐｍで５分間、遠心を行った後、各反応チューブから等量の有機層をとりカウティングした。
結果を図１５に示す。
１−（１−１４Ｃパルミトイル）−リゾホスファチジルコリンを、標準緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ Ｃｌ,（ＰＨ８．０）、２ｍＭ ＥＤＴＡ(ｐＨ８．０)、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、３０％グリセリン、１ｍＭ トリトンＸ−１００）で１０μＭに調整し、６１，４００ｄｐｍ／０．５ｎｍｏｌ／５０μＬで、ラット組換えＫＩＤＳｃＰＬＡ２、ｃＰＬＡ２α、及びｌａｃＺの各酵素反応を行った。反応時間は、０分、１０分、２０分、及び４０分の４点で、それぞれの時間で反応を停止させて検定を行った。
反応の停止は、５０ｍＬの反応系に対して氷冷した停止液（イソプロパノール／ｎ−ヘプタン／１Ｎ Ｈ２ＳＯ４：７８／２０／２）を２５０ｍＬ加え、ボルテツクスを行った。次いで１５０ｍＬのｎ−ヘプタン１００ｍＬのＨ２Ｏをカロえて、５分間激しくボルテツクスを行った。この液を１５，０００ｒｐｍで５分間、遠心を行って、上層の有機層を活性化シリカゲル（２０ｍｇ）を入れたチューブに加える。１５０ｍＬのｎ−ヘプタンを足し、再度５分間激しくポルテツクスを行った後、１５，０００ｒｐｍで５分間、遠心を行った後、各反応チューブから等量の有機層をとりカウティングした。
結果を図１５に示す。
実施例８ （リゾホスホリパーゼＡ１活性の動力学的測定）
標準緩衝液を用いて基質の１−（１−１４Ｃパルミトイル）−リゾホスファチジルコリンの濃度を、０、７μＭ、１０−１００μＭに変化させて、実施例７と同様にして各酵素の反応を行った。
結果を図１６に示す。
標準緩衝液を用いて基質の１−（１−１４Ｃパルミトイル）−リゾホスファチジルコリンの濃度を、０、７μＭ、１０−１００μＭに変化させて、実施例７と同様にして各酵素の反応を行った。
結果を図１６に示す。
実施例９（リゾホスホリパーゼＡ１活性のＣａイオンによる影響の測定）
緩衝液として５ｍＭのＣａＣｌ２を含有するものを使用して、ＥＤＴＡを添加しない場合と５ｍＭのＥＤＴＡを添加した場合を、実施例７と同様にして各酵素反応を行った。
結果を図１７に示す。
緩衝液として５ｍＭのＣａＣｌ２を含有するものを使用して、ＥＤＴＡを添加しない場合と５ｍＭのＥＤＴＡを添加した場合を、実施例７と同様にして各酵素反応を行った。
結果を図１７に示す。
実施例１０ （リゾホスホリパーゼＡ１活性のＡＥＢＳＦによる影響の測定）
緩衝液として標準緩衝液を使用して、ＡＥＢＳＦを添加しない場合と１ｍＭ、２ｍＭ、２０ｍＭ、及び５５ｍＭのＡＥＢＳＦを添加した場合を、実施例７と同様にして各酵素反応を行った。
結果を図１８に示す。
緩衝液として標準緩衝液を使用して、ＡＥＢＳＦを添加しない場合と１ｍＭ、２ｍＭ、２０ｍＭ、及び５５ｍＭのＡＥＢＳＦを添加した場合を、実施例７と同様にして各酵素反応を行った。
結果を図１８に示す。
Claims (5)
- 細胞質型ホスホリパーゼＡ２遺伝子のイントロン中に存在する塩基配列であって、かつ転写活性を有する塩基配列を含み、以下の（ａ）又は（ｂ）の塩基配列及び／又はその相補配列からなるポリヌクレオチド、
（ａ）配列表の配列番号１２、１３若しくは１４に示された塩基配列、
（ｂ）（ａ）の塩基配列の１個ないし数個が欠失、付加、置換されてなる塩基配列。 - 請求項１のポリヌクレオチドからなるプロモーター。
- 請求項２に記載のプロモーターの上流に調節エレメントを設けた調節遺伝子。
- タンパク質をコードしている遺伝子の上流に請求項２又は３に記載のプロモーター又は調節遺伝子を導入してなる生物（ヒトを除く）。
- 生物が試験動物である請求項４に記載の生物。
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