JP2007532127A - 新規のＡＣｈＥ変異体 - Google Patents

Abstract

膜貫通ドメインを有するアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）の新規の形のＮ−ＡＣｈＥを提供する。この新規の形をコードするエキソン、膜貫通ドメインを含むペプチド、ならびにこの新規の形を認識する抗体も提供する。海馬におけるＮ−ＡＣｈＥ発現はアルツハイマー病と相関し、抗Ｎ−ＡＣｈＥ抗体を用いるその検出はこの疾患の新規の診断方法である可能性がある。
【選択図】 なし

Description

発明の分野

本発明は、コリン作動性シグナリングの分野に関する。より具体的には、本発明は、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）の新規の変異体に関する。

連邦政府による資金提供を受けた研究についての陳述
本研究は、米軍医療研究および物資司令部ＤＡＭＤ１７−９９−９５４７（１９９９年７月〜２００４年８月）による支援を受けた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。

発明の背景

本明細書で引用するすべての参考文献を含む、本願書をとおして言及するすべての刊行物は、参照により本明細書に完全に組み込まれている。これらの刊行物の完全なリストは、本明細書の末尾の特許請求の範囲の直前に含める。

アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）は、コリン作動性シナプスにおける神経伝達物質アセチルコリンを加水分解することにより、シナプス伝達を終結させる（Ｍａｓｓｏｕｌｉｅ Ｊ．（２００２）Ｎｅｕｒｏｓｉｇｎａｌｓ １１、１３０〜１４３頁）。脊椎動物に存在する特有なＡＣＨＥ遺伝子からの選択的スプライシングにより、別個の３’領域を有する少なくとも３種のｍＲＮＡが生成される（Ｓｏｒｅｑ，Ｈ．およびＳｅｉｄｍａｎ，Ｓ．（２００１）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２、２９４〜３０２頁）。これらは、別個の細胞接着および非触媒特性の原因となる異なるＣ末端を有するＡＣｈＥアイソフォーム、すなわち、「シナプス性」ＡＣｈＥ−Ｓ（別名、「テイル型」ＡＣｈＥ−Ｔ）、「赤血球」ＡＣｈＥ−Ｅ（別名、「疎水性」ＡＣｈＥ−Ｈ）および「読み過ごし」ＡＣｈＥ−Ｒをコードする。ＡＣｈＥ−Ｓ ｍＲＮＡは、遍在的に発現し、転写および転写後発生関連調節を受ける（ＣｏｌｅｍａｎおよびＴａｙｌｏｒ、（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（８）：４４１０〜６頁、ＦｕｅｎｔｅｓおよびＴａｙｌｏｒ（１９９８）Ｎｅｕｒｏｎ １０（４）：６７９〜８７頁、Ｒｏｔｕｎｄｏら（１９９８）Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐａｒｉｓ．９２（３〜４）：１９５〜８頁）。ＡＣｈＥ−Ｒはストレスにより誘導されるアイソフォームであり、成人組織の基礎条件下おいて見出されることはまれである（Ｍｅｓｈｏｒｅｒ Ｅ．ら、（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９５、５０８〜５１２頁）、ＡＣｈＥ−Ｅは、主として赤血球前駆細胞において発現する（Ｃｈａｎら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（１６）：９７２７〜３３頁）。

ＡＣＨＥ遺伝子は、コリン作動性または神経系組織に限定されない、複雑な発現パターンを示す。むしろ、それは、例えば網膜色素上皮（ＭａｒｔｅｌｌｙおよびＧａｕｔｒｏｎ（１９８８）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．４６０（２）：２０５〜１３頁）、脾臓（Ｂｅｌｌｉｎｇｅｒら（１９９３）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．３２（５）：５４９〜５４頁）および肝臓（Ｓａｔｌｅｒら（１９７４）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３９（１）：６５〜７０頁）などの非コリン作動性非コリン受容組織に及ぶ。これが、ＡＣｈＥタンパク質が更なる役割を果たすという作業仮説につながった。神経突起生成（Ｇｒｉｆｍａｎ Ｍ．ら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：１３９３５〜１３９４０頁）、筋発生（Ｂｅｈｒａら（２００２）Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５（２）：１１１〜８頁）、細胞間相互作用（Ｄａｒｂｏｕｘら（１９９６）ＥＭＢＯ Ｊ．１５（１８）：４８３５〜４３頁）、アルツハイマー原線維へのベータアミロイドペプチド集合の促進（Ｉｎｅｓｔｒｏｓａ Ｎ．ら（１９９６）Ｎｅｕｒｏｎ．１６：８８１〜８９１頁、Ｒｅｅｓら（２００３）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ．２４（６）：７７７〜８７頁）、造血（Ｐａｏｌｅｔｔｉ Ｆ．ら（１９９２）Ｂｌｏｏｄ．７９（１１）：２８７３〜２８７９頁、Ｇｒｉｓａｒｕ Ｄ．ら（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７（２）：９３〜１０５頁）およびアポトーシス（Ｚｈａｎｇら（２００２）Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．９（８）：７９０〜８００頁）を含む非酵素活性が実証された。

ＡＣＨＥ遺伝子の機構を理解するための努力の大部分はＡＣｈＥ ｍＲＮＡの３’末端に向けられたが、５’末端も注目を集めた。マウス、ラットおよびヒト遺伝子のＡＣＨＥプロモーター領域が研究された（Ｍｕｔｅｒｏ Ａ．ら（１９９５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７０、１８６６〜１８７２頁、Ｃｈａｎら（１９９９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９６（８）：４６２７〜３２頁、Ｇｅｔｍａｎら（１９９５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７０（４０）：２３５１１〜９頁）。マウスにおいては、Ｓｐ１およびＥｇｒ−１転写因子に対する結合部位を含む５つのＥボックスおよびＧＣリッチ配列は、ＡＣＨＥの上流領域で同定された（Ｍｕｔｅｒｏ（１９９５）、同上）。これらの結合部位は、ムスカリン様アセチルコリン受容体活性化に対する反応に特に重要であった（ｖｏｎ ｄｅｒ Ｋａｍｍｅｒら、１９９８）。エキソン２における転写開始部位から約２ｋｂ上流にある第２のプロモーターがマウスＡＣＨＥ遺伝子座において報告された（Ａｔａｎａｓｏｖａ Ｅ．ら（１９９９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４、２１０７８〜２１０８４頁）。ヒトＡＣＨＥ遺伝子においては、Ｓｐ１、Ｅｇｒ−１およびＡＰ２に対する機能的結合部位を含むキャップ部位の上流にＧＣリッチ配列が同定された（Ｇｅｔｍａｎ（１９９５）、同上）。より最近、ヒトＡＣＨＥの上流にある２２ｋｂ領域が配列決定され、解析された（Ｇｒｉｓａｒｕら（１９９９）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、１９（１）：７８８〜９５、Ｓｈａｐｉｒａ Ｍ．ら（２０００）Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ９、１２７３〜１２８１頁）。骨原性転写因子、例えば、Ｋｒｏｘ−２０／Ｅｇｒ−２、ビタミンＤ受容体およびエストロゲン受容体に対する結合部位のいくつかのクラスターが確認された（Ｇｒｉｓａｒｕら（１９９９）、同上）。さらに、抗コリンエステラーゼに対する発現の増強および過敏性の亢進に関連する４ｂｐの欠失が転写開始部位の約１７ｋｂ上流に認められた。興味深いことに、この欠失は、グルココルチコイド反応性エレメント（ＧＲＥ）を崩壊させる（Ｓｈａｐｉｒａ（２０００）、同上）。最後に、ラットにおいては、骨格筋線維におけるＡＣｈＥ発現に必須のＮボックスモチーフを含むＡＣＨＥの第１イントロン内に筋特異的エンハンサーが同定された（Ｃｈａｎ（１９９９）、同上）。

ストレス応答におけるＡＣＨＥ遺伝子の制御をより十分に理解するために、発明者らは、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ法と分子生物学アプローチを組合わせてそのプロモーターの機構を検討した。種々の新規の５’選択的転写物がマウスおよびヒトＡＣＨＥ遺伝子に同定され、それらのうちの１つは伸長Ｎ末端を有する新規のヒト膜ＡＣｈＥタンパク質変異体をコードした。この研究において、発明者らは、それらの組織および細胞型分布ならびにストレスおよびグルココルチコイド受容体（ＧＲ）による調節を報告し、対応するプロモーターの機構について述べている。

さらに、発明者らは、アルツハイマー病検体の海馬における新規の５’選択的転写物ならびにそのタンパク質産物（Ｎ末端膜貫通ドメインを有するＡＣｈＥ分子）の発現を調べた。

アルツハイマー海馬における新規Ｎ−ＡＣｈＥの発現、ならびにＡＣｈＥの種々の型の過剰発現が、神経系細胞における遺伝子の発現、特にスプライシングおよびアポトーシス事象に関与する遺伝子の発現を変化させる可能性があるという知見は、ＡＣｈＥとアルツハイマー病との因果関係の仮説を補強している。

したがって、５’末端が異なる新規のＡＣｈＥ ｃＤＮＡ変異体を提供することが本発明の目的である。したがって、本発明はまた、伸長Ｎ末端を有する新規のＡＣｈＥタンパク質ならびに新規のＡＣｈＥ Ｎ末端からなる新規のヒトおよびマウスペプチドを提供する。新規のＮ−ＡｃｈＥタンパク質を特異的に認識する抗体ならびに診断処置におけるその使用も提供する。本発明の他の使用および目的は、説明が進行するにつれて明らかになるであろう。

発明の概要

第１の態様において、本発明は、マウスまたはヒト由来であってよい変異体５’領域を含むＡＣＨＥ遺伝子由来のｃＤＮＡ配列を提供する。

言い換えれば、本発明はその５’末端にＡＣｈＥ変異体を含むｃＤＮＡ配列を提供する。前記変異体配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０（図１および表３を参照）のいずれか１つならびにその機能類似体および誘導体により実質的に表わされる。

第２の態様において、本発明は、マウスまたはヒト由来であってよいＡＣＨＥ遺伝子由来の核酸配列によりコードされ、ＡＣｈＥ膜貫通および細胞内ドメインを含むペプチドを提供する。

１つの実施形態において、前記ペプチドは、配列番号１１および１２（図６および表３を参照）のいずれか１つならびにその機能類似体および誘導体により表わされる。

他の実施形態において、前記ペプチドは、ヒトＡＣＨＥ遺伝子由来であり、配列番号１２、１３および１４（表３を参照）のいずれか１つならびにその機能類似体および誘導体により実質的に表わされる配列を含む。

さらなる実施形態において、前記ペプチドは、マウスＡＣＨＥ遺伝子由来であり、配列番号１１（表３を参照）ならびにその機能類似体および誘導体により表される配列を含む。

さらなる実施形態において、本発明は、新規のヒトＡＣｈＥ膜貫通および細胞内ドメイン由来であり、配列番号１３および１４（表３を参照）のいずれか１つならびにその機能類似体および誘導体により実質的に表わされるペプチドを提供する。

第３の態様において、本発明は、膜貫通ドメインを含むＡＣｈＥタンパク質を提供する。したがって、新規のＡＣｈＥタンパク質は細胞外、膜貫通および細胞内ドメインから構成される。

１つの実施形態において、前記新規ＡＣｈＥタンパク質は、それぞれ配列番号１５、１６および１７（表１３および図４）ならびにその機能類似体および誘導体により表される−Ｓ、−Ｒまたは−Ｅ型であってよい。

他の態様において、本発明は、少なくとも１つの制御エレメントに機能するように連結された配列番号１〜１０および３６〜３８により表わされる配列のいずれか１つを含む核酸コンストラクトを提供する。

１つの実施形態において、前記コンストラクトは、発現ベクターであってよい。さらなる態様において、本発明は、本発明のコンストラクトまたは本明細書に記載する新規５’ＡＣｈＥ変異体に対応する配列のいずれか１つを形質導入した、外因性配列を含む形質導入細胞を提供する。

したがって、さらなる態様において、本発明は、変異体５’領域を含むＡＣｈＥ ｍＲＮＡからなる、ストレス、コリン作動性平衡およびアルツハイマー病のいずれか１つのマーカーを提供する。新たなエキソンのグルココルチコイドおよびストレス依存性は、ホルモンおよびストレス誘発性疾患を特定するためにそのようなマーカーが使用できることを示唆するものである。

１つの実施形態において、前記変異体５’領域は、配列番号３、４および５（表３を参照）のいずれか１つならびにその機能類似体および誘導体により本質的に表わされる。

他の実施形態において、前記マーカーはコルチゾール治療に反応せず、前記変異体５’領域は、配列番号３ならびにその機能類似体および誘導体により本質的に表わされる。

さらなる実施形態において、前記マーカーはコルチゾール治療に反応し、前記変異体５’領域は、配列番号４および５のいずれか１つならびにその機能類似体および誘導体により本質的に表わされる。

したがって、さらなる態様において、本発明は、Ｎ末端ＡＣｈＥ細胞内ドメインを認識する抗体を提供する。前記抗体は、配列番号１３および１４（表３および図４を参照）のいずれか１つならびにその変異体、断片または誘導体により本質的に表わされる合成ペプチドに対して作製されたものである。

本発明はまた、上で定義したような抗Ｎ−ＡＣｈＥ抗体を活性薬剤として含む薬剤組成物を提供する。

さらに、本発明は、抗ＡＣｈＥ、ならびにＡＣｈＥ膜貫通ドメイン（配列番号３４により表わされる）を発現する細胞における細胞内シグナリングのための上述の抗体の使用を提供する。前記抗体および阻害剤は、ＡＣｈＥのリガンドとしても用いることができる。したがって、この変異体を発現する細胞は、極めて感度の高いバイオセンサーとしての役割を果たす可能性があり、Ｎ−ＡＣｈＥのキナーゼ結合ドメインを介して細胞内シグナリングを変化させることによって阻害剤または抗体の結合に反応すると思われる。これに関して、本発明により提供される他の態様は、配列番号１１および１２（表３）のいずれか１つにより表わされるＡＣｈＥの細胞外、膜貫通および細胞内ドメインを含む、コリン作動性シグナルに対するセンサーである。

異なる態様において、ストレスおよびコリン作動性非平衡のセンサーは、上述のようなＡＣｈＥ膜貫通ドメインを発現する細胞の使用により提供することができる。

さらなる態様において、本発明はまた、適切な固体マトリックスに埋め込んだ（または付着させた）コリン作動性シグナリングの複数のセンサーを提供する。これらのセンサーは、有機リン酸または抗コリンエステラーゼで阻害されたとき、Ｎ−ＡＣｈＥの細胞内領域におけるキナーゼ結合ドメインを活性化するシグナルを送り、このＮ−ＡＣｈＥ変異体のみに対して選択的であるシグナル伝達カスケードを誘導するであろう。新規の変異体が図４Ｃに示すように発生の特定の段階にある種々のリンパ系統に検出されたという事実は、これらの新規の変異体が、配列番号１１および１２（表３を参照）のいずれか１つならびにその断片、誘導体および類似体により表わされ、発現のレベルの低下はリンパ系の分化のより進展した段階を表わす、リンパ系細胞系統分化のマーカーであり得ることを示唆するものであった。

本発明の１つのさらなる態様は、検出可能なマーカーで標識された新規の変異体Ｎ−ＡＣｈＥを認識する本発明で述べる抗体を診断する対象に投与し、撮像技術により海馬における抗体の存在を検出することを含む、アルツハイマー病の診断の方法に関する。

発明の詳細な説明

本研究において、発明者らは、ヒトおよびマウスＡＣＨＥ遺伝子は、その少なくとも１つが伸長Ｎ末端をコードする少なくとも４つの選択的第１エキソンをそれぞれ含むことを示している。伸長ＡＣｈＥタンパク質は、ｈＮ−ＡＣｈＥと命名され、それらの発生の種々の段階において神経系および血球に発現することが見いだされた。

選択的新規第１ＡＣｈＥエキソンは、以前に記載された３’エキソン（ＳｏｒｅｑおよびＳｅｉｄｍａｎ（２００１）、同上）のそれと異なる発現プロファイルを示す。これは、特定の第１エキソンが所与の３’エキソンと厳密に関連するという可能性を排除する。したがって、マウスおよびヒトのＡＣｈＥの３’スプライシングオプション（ＡＣｈＥ−Ｓ、ＡＣｈＥ−Ｒ、ＡＣｈＥ−Ｅ）は、それぞれ最大１５および１２種のｍＲＮＡ転写物を生成させる可能性がある。

言い換えれば、本発明はその５’末端にＡＣｈＥ変異体を含むｃＤＮＡ配列を提供する。前記変異体配列は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０（図１および表３を参照）のいずれか１つならびにその機能類似体および誘導体により実質的に表わされる。

５’ＵＴＲレベルでの多様化された調節は、５’変異体の未だ説明されていない役割を反映していると思われる。例えば、ヒト胎児において、ｈＥ１ｄ ｍＲＮＡ（対応するｃＤＮＡは本明細書では配列番号１０により表わされる）は神経系および胸腺において発生依存的に発現した。胎児脳において、ｈＥ１ｄ ｍＲＮＡは細胞体および神経突起における移動ニューロンにおいて発現し、ｈＥ１ｄ陽性ニューロンの数は１６週目の約０から３４週目のニューロンの約５０％に増加しており、これは、これらのニューロンにおけるシナプスの形成と一致している。

「類似体および誘導体」は、前記核酸分子の「断片」、「変異体」、「類似体」または「誘導体」を意味する。本発明のｃＤＮＡ配列のいずれかのような分子の「断片」は、分子のあらゆるヌクレオチドサブセットを意味する。そのような分子の「変異体」は、分子全体またはその断片と実質的に類似した天然に存在する分子を意味する。分子の「類似体」は、無制限にパラロガスまたはオーソロガス分子、例えば、それぞれ同じ種または異なる種の相同分子であり得る。機能類似体および誘導体は、天然分子と同じ活性を発揮する。

本明細書で用いる「遺伝コードの同義性の範囲内」という用語は、同じアミノ酸をコードするコドンとしてあらゆる核酸の組合せが使用可能であることを意味する。言い換えると、コードされたタンパク質のアミノ酸配列に反映されない核酸配列のそのような変化である。

具体的には、本発明の核酸配列の類似体または誘導体は、少なくとも１つの突然変異、点突然変異、ノンセンス突然変異、ミスセンス突然変異、欠失、挿入または再配列を含んでいてよい。

本明細書で述べる新規のエキソンは、翻訳されるとき、ＡＣｈＥ膜貫通および細胞内ドメインを含むペプチドを提供する。前記ペプチドは、マウスまたはヒト由来であってよく、したがって、配列番号１１（マウス）または配列番号１２、１３および１４（ヒト）（図６および表３を参照）ならびにその機能類似体および誘導体により表わされる。

類似体または誘導体のアミノ酸配列は、少なくとも１つの残基が欠失、挿入または置換されているとき、本発明の前記ＡＣｈＥの膜貫通および／または細胞内ドメインと異なっている可能性がある。

さらに、本発明は、膜貫通ドメインを含むＡＣｈＥタンパク質を提供する。したがって、新規のＡＣｈＥタンパク質は、それぞれ配列番号１５、１６および１７（表３および図４を参照）ならびにその機能類似体または誘導体により表わされる−Ｓ、−Ｒまたは−Ｅ型であってよい細胞外、膜貫通および細胞内ドメインから構成される。

しかし、本発明は、実質的に同等もしくはより大きい活性を有する、新規の膜貫通ＡＣｈＥドメインと構造的に類似した配列を含むいずれかのペプチド、または新規のＮ−ＡＣｈＥ配列と構造的に類似した配列を含むタンパク質に関すると理解すべきである。ペプチドまたはタンパク質の構造の変化は、１つまたは複数の欠失、付加または置換を含む。ＡＣｈＥ由来配列内を含む配列におけるあらゆる点において起こり得る欠失または付加の数は、総アミノ酸数の一般的に２５％未満、好ましくは１０％未満である。

好ましい置換は、ペプチドの二次構造を変化させないと予想される変化、すなわち、保存的変化である。以下の一覧は、元のアミノ酸（右側）に対して変化し得るアミノ酸（左側）を示す。
元の残基 典型的な置換
Ａｌａ Ｇｌｙ、Ｓｅｒ
Ａｒｇ Ｌｙｓ
Ａｓｎ Ｇｌｎ、Ｈｉｓ
Ａｓｐ Ｇｌｕ
Ｃｙｓ Ｓｅｒ
Ｇｌｎ Ａｓｎ
Ｇｌｕ Ａｓｐ
Ｇｌｙ Ａｌａ、Ｐｒｏ
Ｈｉｓ Ａｓｎ、Ｇｌｎ
Ｉｌｅ Ｌｅｕ、Ｖａｌ
Ｌｅｕ Ｉｌｅ、Ｖａｌ
Ｌｙｓ Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ
Ｍｅｔ Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｉｌｅ
Ｐｈｅ Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ
Ｓｅｒ Ｔｈｒ
Ｔｈｒ Ｓｅｒ
Ｔｒｐ Ｔｙｒ
Ｔｙｒ Ｔｒｐ、Ｐｈｅ
Ｖａｌ Ｉｌｅ、Ｌｅｕ

アミノ酸は、電荷、側鎖のサイズ等の本質的な特徴によって分類することもできる。以下の一覧は、類似アミノ酸の群を示す。好ましい置換は、１つの群に存在するアミノ酸を同じ群のアミノ酸と交換することであろう。
１．小さな脂肪族、非極性：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ
２．極性で負に荷電した残基およびそれらのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ
３．極性で正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ
４．大きな脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ
５．大きな芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ

アミノ酸置換およびタンパク質の構造に関するさらなる補足説明は、Ｓｃｈｕｌｚら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１７９８およびＣｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｔ．Ｅ．、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ １９８３に見いだすことができる。

上で詳述したような好ましい保存的アミノ酸置換は、下文で詳述するように、本発明のペプチドまたはタンパク質の機能または活性を実質的に維持または増加させると予想される。もちろん、あらゆるアミノ酸置換、付加または欠失は、結果として生ずるペプチドまたはタンパク質が機能に関して実質的に同等または優れている本発明のペプチドまたはタンパク質である場合、本発明の範囲内にあるとみなされる。

本発明により提供されるペプチドおよびタンパク質は、分離、合成または組換えにより生成されたものであってよい。

他の態様において、本発明は、少なくとも１つの制御エレメントに機能するように連結された配列番号１〜１０および３６〜３８により表わされる配列のいずれか１つを含む核酸コンストラクトを提供する。

１つの実施形態において、前記コンストラクトは発現ベクターであってよい。

「発現ベクター」は、本明細書で用いているように、ＤＮＡ断片を宿主のゲノムに組み込むことを可能にするプラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、組込み可能なＤＮＡ断片および他の媒体を含む。発現ベクターは、所望の遺伝子またはその断片および適切な宿主細胞において認識され、所望の遺伝子の発現をもたらす機能するように連結されている遺伝子制御エレメントを含む一般的に自己複製ＤＮＡまたはＲＮＡコンストラクトである。これらの制御エレメントは、適切な宿主内の発現をもたらすことができる。一般的に、遺伝子制御エレメントは、原核生物プロモーター系または真核生物プロモーター発現制御系を含み得る。そのような系は、一般的に転写プロモーター、転写の開始を制御するオプションオペレーター、ＲＮＡ発現のレベルを上昇させる転写エンハンサー、適切なリボソーム結合部位をコードする配列、ＲＮＡスプライス結合、転写および翻訳を終結させる配列等を含む。発現ベクターは、通常ベクターが宿主細胞と独立に複製することを可能にする複製起点を含む。

ベクターは、さらに適切な制限部位、抗生物質耐性またはベクターを含む細胞の選択のための他のマーカーを含んでいてよい。プラスミドはベクターの最も一般的に用いられる形であるが、同等の機能を果たし、当技術分野で知られている、または知られるようになったベクターの他の形がここでの使用に適している。参照により本明細書に完全に組み込まれている、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら、Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８５および補遺）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．およびＲｏｄｒｉｇｕｅｚら（編）、Ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ、Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ（１９８８）を参照のこと。

一般的に、そのようなベクターは、形質転換細胞に表現型選択をもたらすことができる特定の遺伝子をさらに含む。本発明のポリペプチドをコードする遺伝子を発現するための原核生物および真核生物ウイルス発現ベクターの使用も企図される。

ベクターは、当業者に知られている方法により宿主細胞に導入される。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションまたは形質転換を含む、細胞内にコンストラクトを導入するいずれかの方法により達成することができる。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．、編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）を参照のこと。

さらなる態様において、本発明は、本発明のコンストラクトまたは本明細書で述べる新規の５’ＡＣｈＥ変異体に対応する配列のいずれか１つを形質導入した、外因性配列を含む形質導入細胞を提供する。

脳ニューロンにおいて、ＡＣｈＥ ｍＲＮＡはストレス関連調節および神経転座を受け、ストレス反応ニューロンは樹状突起ＡＣｈＥ−ＳのＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡによる置換を示すことが以前に記載された（Ｍｅｓｈｏｒｅｒ、２００２、同上）。選択的第１エキソンは、種々の転写物の細胞および細胞下分布におそらく影響を及ぼすと思われる。いずれか、また新たに同定された第１エキソンが同様に調節されるのかは研究されていない。研究した３種の５’マウスプローブ（ｍＥ１ａ、ｍＥ１ｂおよびｍＥ１ｄ）のいずれも対照マウスでは樹状突起発現を示さなかったが、マウスプルキンエ細胞では、ｍＥ１ｂが細胞体および軸索において異常な細胞内発現を示した。この知見は、一般的にプルキンエ細胞における、また特に軸索突起におけるＡＣｈＥの発現パターンおよび生理学的機能に関する新たな疑問を提起するものである。

したがって、本発明は、変異体５’領域（配列番号３、４および５のいずれか１つにより本質的に表わされる、表３を参照）を含むＡＣｈＥ ｍＲＮＡからなる、ストレス、コリン作動性平衡およびアルツハイマー病のマーカーを提供する。新規のエキソンのグルココルチコイドおよびストレス依存性は、ホルモンおよびストレス誘発性疾患を確認するためのそのようなマーカーの使用を示唆している。

前記変異体５’領域が配列番号３ならびにその機能類似体および誘導体により本質的に表わされる場合、前記マーカーはコルチゾール処理に反応しない可能性がある。

前記マーカーがコルチゾール処理に反応する場合、前記変異体５’領域は配列番号４および５のいずれか１つならびにその機能類似体および誘導体により本質的に表わされる。

本研究では、発明者らは、新たに述べる転写物がストレス下で差別的に調節されるかどうか、もしそうならば、ストレスによるグルココルチコイド（ＧＣｓ）の放出が関与しているかどうかを探究した。ＧＲＥ部位がエキソンｍＥ１ｄ内部に同定され、ＡＰ１部位がｍＰ２ならびにｍＰ３に認められ、２つのＧＲＥｓがｍＥ１ｂの上流に位置している。したがって、グルココルチコイド反応性およびストレス反応性エレメントの分布は、種々の新規エキソンの異なる反応を予測するものであった。したがって、発明者らは、対照およびニューロンＧＲが欠損したグルココルチコイド受容体（ＧＲ）突然変異マウスにおけるそれらの発現を研究した（Ｔｒｏｎｃｈｅ Ｆ．ら（１９９９）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２３、９９〜１０３頁）。２つの変異体ｍＥ１ｃおよびｍＥ１ｄは拘束ストレスに反応して誘導されることが認められた。これらの２つのうち、ｍＥ１ｄのみがその誘導のためにＧＲの活性化を必要とした（図５）。これに対して、ｍＥ１ｂは、ストレス下で抑制されたが、ＧＲがグルココルチコイド反応性エレメント（ＧＲＥｓ）に結合しないＧＲＮｅｓＣｒｅマウスにおいてのみであった。この反応は、ＡＣｈＥ−Ｓの反応と同様である（図５Ｂ）。１つの考え得る説明は、ストレスの後に種々の因子−とりわけＧＣ−の対照的な効果が互いに打ち消し、ｍＥ１ｂのレベルを未変化の状態に維持することであろう。しかし、ＧＲが存在しない場合、ＧＲＥｓはもはや機能し得ない。抑制因子の活性の維持により、その後ｍＥ１ｂレベルは低下する可能性がある。

ＡＣｈＥｍＲＮＡ前駆体の新規の５’選択的スプライシングパターンは、いくつかのレベルで重要である。第１に、また最も重要なことに、それらは以前に認められなかったレベルにＡＣｈＥ ｍＲＮＡ変異体の複雑度および多機能性を拡大する。さらに、本研究により、脳ニューロンおよび造血細胞におけるＡＣｈＥのＮ末端伸長膜変異体（Ｎ−ＡＣｈＥ）の存在が明らかになった。これらの変異体のＣ末端組成および膜指向性はさらなる研究を待つが、この知見により、ＡＣｈＥ研究における長年知られている特定のなぞが説明され、多くの新たな疑問が開かれる。げっ歯類および霊長類においてこの伸長ドメインが明らかに保存されていることは、その重要性の概念の補強となるものであり、その特有な発現パターンおよびストレス関連調節は、その機能の重要性を探究することを必要とするものである。

Ｎ−ＡＣｈＥのＮ末端アミノ酸（配列ＭＬＧＬＶＭＳＣ、配列番号３９に対応する）は、短いシグナルペプチドの特性を示し、このタンパク質が分泌性であることも示唆される。

ＡＣｈＥの新たなアイソフォームを特徴づけることにより、発明者らは、新規の５’領域によりコードされる配列由来の２つの合成ペプチド（配列番号１３および１４により表わされる）を抗原として用いて抗体を産生した。この抗体は、組織における新規のＮ末端伸長ＡＣｈＥの発現を確認することができた（図６Ｃ、図９Ａ〜９Ｂ、図１２Ａ〜１２Ｂ）。

したがって、さらなる態様において、本発明は、Ｎ末端ＡＣｈＥ細胞内ドメインを認識する抗体を提供する。前記抗体は、配列番号１３および１４（表３および図４を参照）のいずれか１つならびにその変異体、断片または誘導体により本質的に表わされる合成ペプチドに対して作製されたものである。

本発明の抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであってよい。これは、例えば、配列番号１３もしくは配列番号１４などの合成ペプチドに対して調製するか、または本発明の発現ベクターのいずれかを用いてクローニング技術により組換えにより調製することができ、あるいは膜貫通ドメインを含む天然に存在するＡＣｈＥ変異体を分離し、免疫原として用いることができる。本発明のポリペプチドは、当業者によく知られている標準抗体生産技術により抗体を生産するのに用いることができる。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）に一般的に記載されているとおりである。

ポリクローナル抗体を生産するために、タンパク質またはポリペプチドで、一般的にアジュバントで、また必要な場合、担体に結合させてウサギまたはヤギなどの宿主を免疫化する。抗体は、宿主の血清から収集する。タンパク質に対するポリクローナル抗体の生成は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃの２章に記載されている。

モノクローナル抗体を生産するために、一般的にマウスをポリペプチドまたはペプチド断片で免疫化し、次いで、脾臓抗体産生細胞を分離する。これらの細胞を融合させて、必要な抗体を分泌するハイブリドーマを作る。抗体は、宿主の腹水または前記ハイブリドーマの組織培地から収集する。モノクローナル抗体を生成させる技術は、多くの論文および上記のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙの２章などの教科書に記載されている。

パパイン（Ｆａｂ断片を生成するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）_２断片を生成するため）などの酵素を用いてタンパク質分解的切断により一般的に生産される抗Ｎ−ＡＣｈＥ抗体のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）_２断片ならびに他の断片も本発明により提供される。

臨床適用のために、下記のように本発明の抗Ｎ−ＡＣｈＥ抗体は、ヒト抗体がマウス（またはウサギまたはラット）抗体反応を克服するために、ヒト化法により改良することができる。そのような抗体に適用できる抗体のヒト化の迅速な新たな戦略が最近開発された。これらの技術は、最初の抗体の親和力を維持し、抗原およびエピトープ特異性を保持する（Ｒａｄｅｒ Ｃ．ら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：８９１０〜８９１５頁、Ｍａｔｅｏ Ｃ．ら（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３：７１〜８１頁）。例えば、動物由来抗体と異なり、「ヒト化」抗体はしばしば対象の免疫系との望ましくない反応を受けない。

したがって、本明細書で用いるように、「ヒト化」およびその誘導体という用語は、ヒトに投与したとき、そのような抗体を免疫原性である可能性を少なくさせるに十分な量および組成で０％を超え、１００％までのヒト抗体材料を含む抗体を指す。「ヒト化」という用語はまた、ヒト由来抗体、または、遺伝子工学により改良したヒト免疫系コーディング遺伝子の機能部分を含む非ヒト細胞由来の抗体、したがって十分にヒトである抗体を産生する、を指すと理解される。

さらに、本発明の抗体は、当技術分野でよく知られているように、固体支持基質と結合、および／または検出可能な部分と結合させることができる。本発明の範囲内にあると考えられる検出可能な部分は、ビオチン、金、フェリチン、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、フルオレセイン、ローダミン、トリチウム、^１４Ｃおよびヨウ素などの蛍光、発光、金属、酵素および放射性マーカーを含み得るが、これらに限定されない。

本発明の抗体はまた、組成物の形態で提供される。薬剤組成物の調製は、当技術分野でよく知られており、多くの論文および教科書に記載されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｎｎａｒｏ Ａ．Ｒ．編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ，１９９０および特に本書の１５２１〜１７１２頁を参照のこと。

さらに、本発明は、抗ＡＣｈＥｓの使用ならびにＡＣｈＥ膜貫通ドメイン（配列番号３４により表わされる）を発現する細胞における細胞内シグナリングのための上記の抗体を提供する。前記抗体および阻害剤は、ＡＣｈＥのリガンドとしても用いることができる。したがって、この変異体を発現する細胞は、極めて感度の高いバイオセンサーとしての役割を果たす可能性があり、Ｎ−ＡＣｈＥのキナーゼ結合ドメインを介して細胞内シグナリングを変化させることによって阻害剤または抗体の結合に反応すると思われる。

ｈＮ−ＡＣｈＥペプチドに対して生成させた抗体は、ＡＣｈＥと類似した電気泳動特性を有する脳発現タンパク質と相互作用した（図６）。さらに、市販の抗ＡＣｈＥ抗体の一部は約６６〜７０ｋＤａの二重バンドを生ずる（例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒら（２００３）ＦＡＳＥＢ Ｊ．１７（２）：２１４〜２２頁を参照）。これは、脳ＡＣｈＥタンパク質の少なくとも一部は知られているようにＮ末端が伸長しているという概念を支持している。

本発明により提供される他の態様は、配列番号１１および１２（表３）のいずれか１つにより表わされるＡＣｈＥ細胞外、膜貫通および細胞内ドメインを含むコリン作動性シグナルのセンサーである。

したがって、ｈＮ−ＡＣｈＥのＮ末端は、単量体ＡＣｈＥ−ＳまたはＡＣｈＥ−Ｒが膜を横断することを可能にし、その細胞質ドメインにより未だ未定義の生理機能を付与する可能性がある。シナプス膜へのＡＣｈＥの直接ドッキングは、シナプスにＡＣｈＥ−Ｓ四量体を固定するのに必要なＰＲｉＭＡサブユニットを欠く脳領域におけるその存在を説明するものと思われる（Ｐｅｒｒｉｅｒら）（２００３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８（７）：１８３７〜４７頁）。これは、大量の単量体ＡＣｈＥが速やかに産生されるストレス後状況において特に重要な成果をもたらす可能性がある。産生された酵素の膜ターゲティングはＡＣｈのシナプスレベルを速やかに減少させるために費用対効果が高いと思われ、一方、その推定上のＮ末端リン酸化およびファルシネル化はおそらく細胞質シグナルを伝達することができる。

異なる態様において、ストレスおよびコリン作動性非平衡のセンサーは、上述のようなＡＣｈＥ膜貫通ドメインを発現する細胞の使用により提供することができる。

さらなる態様において、本発明はまた、適切な固体マトリックスに埋め込んだ（または付着させた）コリン作動性シグナリングの複数のセンサーを提供する。これらのセンサーは、有機リン酸またはいずれかの抗コリンエステラーゼで阻害されたとき、Ｎ−ＡＣｈＥの細胞内領域におけるキナーゼ結合ドメインを活性化するシグナルを送り、このＮ−ＡＣｈＥ変異体のみに対して選択的であるシグナル伝達カスケードを誘導するであろう。

フローサイトメトリ分析により、ｈＮ−ＡＣｈＥは主として血球膜に存在することが示された。単球、顆粒球、リンパ球およびＣＤ３４＋前駆細胞は、程度は異なるが、すべて陽性であった。リンパ球において、ｈＮ−ＡＣｈＥレベルは初期から成熟Ｔリンパ球まで増加しており、これはおそらく脾臓での発達をとおしての異なる発現パターンの説明となると思われる。ＴおよびＢリンパ球におけるｈＮ−ＡＣｈＥ発現は、リンパ球の機能のコリン作動性調節の報告（ＫａｗａｓｈｉｍａおよびＦｕｊｉｉ（２０００）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．８６：２９〜４８頁）と矛盾しない。

新規の変異体が図４Ｃに示すように発生の特定の段階にある種々のリンパ系統に検出されたということは、これらの新規の変異体が、配列番号１１および１２（表３を参照）のいずれか１つならびにその断片、誘導体および類似体により実質的に表わされ、発現のレベルの低下はリンパ系の分化のより進展した段階を表わす配列を含む、リンパ系細胞系統分化のマーカーであることを示唆するものであった。

本明細書で述べた新規のＡＣｈＥアイソフォーム（Ｎ−ＡＣｈＥ）に関する他の所見は、アルツハイマー病とのその相関に関するものである。コリン作動性神経伝達の障害がアルツハイマー病の主要な顕著な特徴である。しかし、この特徴の基礎をなす分子的メカニズムは未だ知られていない。実施例１１において、発明者らは、非痴呆対照と比較してアルツハイマー病患者の海馬歯状回（ＤＧ）におけるアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）ｍＲＮＡの伸長５’変異体が増加するが、ＣＡ３ニューロンでは増加しないことを報告する（ｐ＜０．０１、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）（図１０Ａ〜１０Ｃおよび１１Ａ〜１１Ｃ）。Ｎ−ＡＣｈＥに対する抗体により、歯状回をＣＡ３領域に接続する苔状線維系におけるＮ−ＡＣｈＥ変異体の蓄積が明らかになった（図１２Ａ）。シナプス性ＡＣｈＥ変異体、すなわちＡＣｈＥ−Ｓの平行した蓄積が認められた（図１２Ｂ）ことは、アルツハイマー病脳が歯状回においてＮ末端伸長Ｎ−ＡＣｈＥ−Ｓタンパク質を過剰発現するが、ＣＡ３ニューロンではそうでないことが示唆される。「シナプス性」ＡＣｈＥ（ＡＣｈＥ−Ｓ、ｐ＜０．０１）ｍＲＮＡレベルの平行した低下と「読み過ごし」ＡＣｈＥ（ＡＣｈＥ−Ｒ、ｐ＜０．０５）ｍＲＮＡレベルの増加は、ＡＣｈＥ−Ｓタンパク質の多くがＮ−ＡＣｈＥ−Ｓおよび／またはＮ−ＡＣｈＥ−Ｒにより置換されたことを示唆している。Ｎ末端伸長の特有の生化学的組成は、ＡＣｈＥ−ＳのＣ末端の膜接着能と合わせて、アルツハイマー病海馬におけるＮ−ＡＣｈＥ−Ｓの蓄積の生理学的結果を探究することを要求するものである。

したがって、Ｎ−ＡＣｈＥアイソフォームのニューロン蓄積はアルツハイマー病に原因として関与している可能性があり、したがって、診断目的にかなう。抗Ｎ−ＡＣｈＥ抗体は、診断ツールとして、あるいは、Ｎ−ＡＣｈＥを阻害しながら正常な酵素を温存するような治療のために用いることができる。

ポジトロン放射断層法（ＰＥＴ）ならびに単一光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）は、脳撮像に用いられている技術である（Ｋｉｌｂｏｕｒｎｅら（１９９６）Ｓｙｎａｐｓｅ ２２：１２３頁）。両技術は、ポジトロンβ＋またはγカメラを用いて、それぞれβ＋またはγフォトン放射性の放射性核種で標識した化合物の投与後の局所組織放射能濃度の時間経過を非侵襲的にモニターすることができる。

現在までのところ、アルツハイマー病は確実に診断することができるが、Ｎ−ＡＣｈＥは正常に老化した脳においても発現し（図３Ａ〜３Ｂ）、それが疾患過程を促進するニューロン過程を誘発する可能性がある。したがって、本発明は、本発明の抗Ｎ−ＡＣｈＥ抗体を放射性トレーサー（検出可能なマーカー）で標識し、必要とする対象に投与することによる診断の方法を提供する。次いで、対象はＰＥＴまたはＳＰＥＣＴスキャンを受け、海馬のＮ−ＡＣｈＥへの抗体の結合がアルツハイマー病の証拠を提供する。アルツハイマー病では血液脳関門が破壊されており、用いる放射性同位元素は短い半減期を有し、したがって、刺激性が弱いため、この方法は安全かつ非侵襲性である。さらに、診断ツール（抗体）はその標的であるＮ−ＡＣｈＥアイソフォームと選択的かつ特異的に相互作用することが知られており、その超過した量はアルツハイマー病と相関づけられた（下の実施例１１で述べるように）。この方法は、Ｎ−ＡＣｈＥの位置および相対量を示すヒト脳の像を提供する。

ＰＥＴスキャンの場合、抗体を標識するために用いた主なポジトロン放射体放射性核種は、２０．４分の半減期を有する炭素１１（^１１Ｃ）、１１０分の半減期を有するフッ素１８（^１８Ｆ）および１６時間の半減期を有する臭素７６（^７６Ｂｒ）である。これらの放射性核種のすべては、サイクロトロンで非常に高い比放射能を有するものとして調製する必要がある。ＳＰＥＣＴスキャンの場合、３１．２時間の半減期を有するヨウ素１２３（^１２３Ｉ）を用いることができる。この放射性同位元素は、非常に高い比放射能を有するものが市販されている。

発明者らの現在の知見からのさらなる推論は、アルツハイマー病海馬におけるＮ−ＡＣｈＥの過剰発現とこの状態における基底核ニューロンのアポトーシス運命との相関に関するものである。興味深いことに、本明細書および発明者らの以前の報告書（ＳｏｒｅｑおよびＳｅｉｄｍａｎ（２００１）、同上）で示したように、ＡＣＨＥ ｍＲＮＡ転写物はさらに３’選択的スプライシングを受ける。これらの２つの現象が原因として関連しているかどうかを見いだすために、発明者らはＡＣｈＥ−ＲまたはＡＣｈＥ−Ｓを過剰発現するｐ１９細胞を作製し、実施例１２に述べるように、これらの２つのタンパク質のそれぞれの過剰発現がどのようにこれらの細胞（ニューロン系統に既に分化した）における遺伝子発現のパターンに影響を及ぼし、スプライシング装置、アポトーシスおよびヘリカーゼに関連する遺伝子の発現を変化させるかを示す。さらに、アポトーシスも例えば、Ｂｃｌ−２遺伝子などの他の遺伝子の選択的スプライシングによって誘発される可能性があるプロセスである（Ｓｔａｍｍら（２００５）Ｇｅｎｅ、３４４：１〜２０頁、Ｅｐｕｂ２００４年１２月１０日）。

本発明は特許請求の範囲により定義されており、その内容は本明細書の開示の範囲内に含まれると解釈すべきである。

開示され、記述された本発明は、開示した特定の実施例、工程段階および材料に限定されるものでないことを理解すべきである。その理由は、そのような工程段階および材料はいくぶん変化することがあるからである。また、本明細書で用いた用語は、特定の実施形態のみを記述する目的のために用い、限定することを意図するものでないことを理解すべきである。その理由は、本発明の範囲は付属する特許請求の範囲およびその同等物によってのみ限定されるからである。

本明細書および付属する特許請求の範囲で用いるように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他の状態を指示しない限り、複数の事項を含むことを注意しなければならない。

本明細書および続く特許請求の範囲をとおして、文脈が他の意味を要求しない限り、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」ならびに「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などの変形形態は、記載された整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群の包含を意味するが、他の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群の除外を意味しないと理解されるであろう。

以下の実施例は、本発明の態様を実施する際に発明者らが用いた技術を代表するものである。これらの技術は本発明の実施のための好ましい実施形態の具体例であるが、当業者は本開示に照らして、本発明の意図する範囲から逸脱することなく、多くの修正を行うことができることを認識すると理解すべきである。

実験手順
ヒト組織：本研究におけるヒト胚、臍帯血および成人組織の使用は、ヘルシンキ宣言の規則に従ってＴｅｌ−Ａｖｉｖ Ｓｏｕｒａｓｋｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅにより承認された。ヒト胚は、直ちに４％ＰＦＡに移し、パラフィンに包埋し、薄切した（７μｍ）。臍帯ＣＢ細胞の新鮮な試料は、正常分娩後に得た。成人脳試料は、７０歳の心不整脈患者から死後４時間以内に採取した。組織は直ちに液体窒素で凍結した。脳ホモジネート（０．１Ｍリン酸緩衝液、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中）を標準的方法を用いてイムノブロットした。

動物：中枢神経系特異的ＧＲ突然変異体（ＧＲ^{ＮｅｓＣｒｅ}）、対照同腹子（ＧＲ^{ｌｏｘＰ／ｌｏｘＰ}）（Ｔｒｏｎｃｈｅ（１９９９）、同上）およびＦＶＢ／Ｎ雄マウスを１２時間暗／１２時間明日周スケジュール下で飼料を自由に摂取させて飼育した。ストレス実験には、５０ｍｌコニカルチューブ中での３０分間の拘束を含めた。拘束の２時間後に断頭によりマウスを屠殺し、脳を氷上で切開し、液体窒素で凍結するか、または４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で２４時間固定し、パラフィンに包埋し、５〜７μｍの切片に薄切し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ（登録商標）−Ｐｌｕｓスライド（Ｍｅｎｚｅｌ−Ｇｌａｓｅｒ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）への付着により収集した。すべての実験において、無処置の年齢一致雄を対照とした。これらの実験は、Ｈｅｂｒｅｗ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙおよびＣｏｌｌｅｇｅ ｄｅ Ｆｒａｎｃｅにおける動物委員会により承認された。

計算リソース：ＧｅｎＢａｎｋならびにＢｌａｓｔ、Ｅｎｔｒｅｚ、Ｌｏｃｕｓ Ｌｉｎｋ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、ＰｒｏｔｅｉｎおよびＯＭＩＭデータベースリソースへのアクセスのために、ヒト（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号ＡＦ００２９９３）およびマウス（ＡＦ３１２０３３）ＡＣＨＥ遺伝子座をＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）により解析した。種々のデータ操作プログラムおよびタンパク質データベースへのアクセスのために、Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ ＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓにおけるＥｘｐｅｒｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／）を用いた。Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＢＣＭ）Ｓｅａｒｃｈ Ｌａｕｎｃｈｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｓｅａｒｃｈｌａｕｎｃｈｅｒ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ）により、データ操作およびディスプレイプログラムの導出を推進した。Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ（ｇｅｎｏｍａｔｉｘ．ｇｓｆ．ｄｅ）のＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒプログラムまたはＣｉｓｔｅｒソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｚｌａｂ．ｂｕ．ｅｄｕ／〜ｍｆｒｉｔｈ／ｃｉｓｔｅｒ．ｓｈｔｍｌ）を用いて転写因子結合部位を発見した。

ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ調製：ＥＺ−ＲＮＡ全ＲＮＡ分離キット（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ Ｈａｅｍｅｋ、Ｉｓｒａｅｌ）を用いて説明書どおりに動物およびヒト組織から全ＲＮＡを抽出し、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理水で濃度１００ｎｇ／μｌに希釈し、使用時まで−７０℃で保存した。白血病性Ｔリンパ球、肝臓および精巣からのヒトＲＮＡをＡｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ、ＵＳＡ）から入手した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）によりｐｏｌｙ−ｄＴまたはランダム六量体を用いた逆転写を促進した。遺伝子特異的プライマー（下を参照）をｏｎｅ−ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に用いた。

ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成）：パラフィン包埋切片（マウス水平全脳切片、ヒト全胚矢状切片およびヒト成人ＰＦＣ）をキシレンによる脱パラフィン処理（２×５分洗浄）に続いて脱脂エタノール洗浄（１００、７５、５０および２５％）にかけた後、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＴ）で洗浄し、１０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫと共にインキュベートした（８分、室温）。加湿チャンバー内でのハイブリッド形成には１０ｍｇ／ｍｌのプローブを含めた（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、１０ｍｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ、１０ｍｇ／ｍｌヘパリン中、９０分、５２℃）。次いで、切片を５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣおよび０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で６０℃で２回、５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣで６０℃で２回、トリス緩衝生理食塩水＋０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）で室温で２回洗浄し、１％スキムミルク（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）中で３０分間ブロックした。

ビオチン標識プローブ（表１）は、切片をストレプトアビジン−Ｃｙ３複合体（ＣｙＤｙｅ（商標）、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｌｉｔｔｌｅ Ｃｈａｌｆｏｎｔ、ＵＫ）と共に３０分間インキュベートした後、ＴＢＳＴで３回洗浄して検出した。切片はＩＭＭＵ−ＭＯＵＮＴ（Ｓｈａｎｄｏｎ Ｉｎｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ、ＵＳＡ）を用いて装着した。

ポリメラーゼ連鎖反応：種々の組織中の種々の転写物を検出し、配列を確認するためにＰＣＲを用いた。ＰＣＲ反応混合物は、２ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、デオキシヌクレオチドミックス（各０．２ｍＭ）（Ｓｉｇｍａ）、順方向／逆方向プライマー（各０．５μＭ、下の表２）および３００ｎｇの鋳型（ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）を含んでいた。３５サイクルの各々が変性（１分、９５℃）、アニーリング（１分、６０℃）および伸長（７２℃、１分）を含んでいた。

抗体：ヒトｈＥ１ｄコードＮ末端ドメインに対する高親和力ポリクローナルウサギＩｇＧ抗体は目的に合わせて作製された（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、Ｓｅｒａｉｎｇ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）。ヒトエキソンｈＥ１ｄ（ｈＮ−ＡＣｈＥ）のコーディング配列からの２つの１６アミノ酸長ペプチドを合成し、混合し、共に２匹のウサギに注射した。その後２、４および８週目にさらなるブースト注射を行った。１６週後に最終採血を行った。合成ぺプチドのＥＬＩＳＡスクリーニングにより、抗体産生の成功を確認した。合成ペプチドは、さらに抗体のアフィニティ精製に用いた。１：５００の希釈度のアフィニティ精製抗血清をウエスタンブロッティングに用いた。免疫化に用いた２つの合成ペプチドは次の配列により表わされるものである。すなわち、ＫＶＲＳＨＰＳＧＮＱＨＲＰＴＲＧ（ペプチド４３７としても知られている、配列番号１３）およびＧＳＲＳＦＨＣＲＲＧＶＲＰＲＰＡ（ペプチド４３８としても知られている、配列番号１４）。

フローサイトメトリ：臍帯血球の単核画分を、記載された（Ｇｒｉｓａｒｕら、２００１）とおりにＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅグラジェント１．０７７ｇ／ｃｍ３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で分離した。細胞を透過化し、７分間固定し（Ｆｉｘ ａｎｄ Ｐｅｒｍ Ｋｉｔ、Ｃａｌｔａｇ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）、ＰｅｒＣＰ結合抗ＣＤ３４（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ［ＢＤ］、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ）または他の認められている抗体で染色した。アイソタイプ制御により特定の標識を区別した。これらの細胞上のウサギ抗ｈＮ−ＡＣｈＥ抗体をフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ヤギ抗ウサギＦａｂ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔｇｒｏｖｅ、ＰＡ、ＵＳＡ）を用いて検出した。ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（ＢＤ）およびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ）を用いてマルチパラメーターフローサイトメトリを行った。新鮮なＣＤ３４＋細胞におけるｈＮ−ＡＣｈＥ発現を、３０００ゲートイベントを解析して評価した。陽性染色集団は、ＦＩＴＣ、ＰＥおよびｐｅｒＣＰアイソタイプ対照（ＢＤ）を用いて定義した。

マイクロアレイスライド標本の作製：
１．オリゴヌクレオチドの選択
実施例１２で用いるマイクロアレイは、本研究の対象分野に適合するように特に設計された小型の社内構築ＤＮＡオリゴヌクレオチドマイクロアレイである。より詳細には、これは主として２つの主なカテゴリーのオリゴヌクレオチド、すなわち、スプライセオソーム成分をコードする遺伝子および選択的スプライシングを受けるアポトーシス関連遺伝子を含む。

スプライセオソーム成分をコードするヒト遺伝子の推定上の完全な組のマウス相同体（Ｚｈｏｕ Ｚ．ら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ、４１９：１８２〜５頁）をオンラインデータベースを用いて特定し（Ｓｔａｍｍ（２００５）、同上）、これらの遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドを選択した。これらの遺伝子の一部は、スプライシング装置に関連することが以前に知られていなかった。このカテゴリーの遺伝子は、とりわけＳＲタンパク質、ｓｎＲＮＰ、スプライシング因子、リン酸化タンパク質およびスプライセオソームアセンブリメディエーターを含む。

アポトーシスに関与する遺伝子の多くは選択的スプライシングを受ける。場合によって、結果として生ずる変異体は細胞の運命に対して反対の効果を有する（すなわち、あるものは催アポトーシス性であり、他のものは抗アポトーシス性である）。したがって、発明者らはそのような遺伝子を探し、それらをマイクロアレイに含めた。

上のカテゴリーに加えて、上のカテゴリーのいずれにも属さない遺伝子のいくつかのプローブをマイクロアレイに含めた。

種々の機能グループおよびマイクロアレイにおけるそれらの相対表示を図１５に示す。

ＲＮＡ試料、増幅、標識、断片化、前ハイブリッド形成およびハイブリッド形成：
ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｕｉａｇｅｎ（登録商標））を用いて製造業者の説明書に従って形質導入細胞から抽出した。Ａｍｂｉｏｎ製のＡｍｉｎｏ Ａｌｌｙｌ ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ（商標）ａＲＮＡ増幅キット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｐｒｏｔ／ｆｍ＿１７５２．ｐｄｆ）を用いてＲＮＡを増幅した。Ｃｙ３（緑、吸収極大：５５０ｎｍ、放射極大：５７０ｎｍ）およびＣｙ５（赤、６４９／６７０ｎｍ）蛍光色素を標識に用いた。ＲＮＡ試料を断片化緩衝液と共に７０℃で１５分間インキュベートして、ＲＮＡを約７０〜１５０ｂｐの長さに断片化した。試料を前ハイブリッド形成緩衝液（５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、１％ＢＳＡ）で前ハイブリッド形成し、乾燥して、６５℃で一夜ハイブリッド形成した（３×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、１０μｇ ｐｏｌｙＡ、２０μｇ ｔＲＮＡ）。次いで、スライド標本を洗浄し、乾燥し、分析した。

画像処理は専用のスキャナ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、４２８アレイスキャナ）で行った。ＩｍａＧｅｎｅソフトウェアを用いて基本シグナル処理を検討した。データ解析は、Ｄｒ．Ｙｏｒａｍ Ｂｅｎ−Ｓｈａｕｌ（Ｈｅｂｒｅｗ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、Ｉｓｒａｅｌ）により作成されたＭａｔＬａｂプログラムを用いて行った。

実施例１
マウスＡＣｈＥ ｍＲＮＡの５’多様性
マウス（ｍ）ＡＣＨＥ遺伝子の５’領域を用いたＥＳＴデータベース検索により、５つの推定上の選択的第１エキソンの存在が明らかになった（表４Ａ、図１Ａ）。最も近位のエキソンは、ｍＥ１ａと名付けた。この配列を含むＥＳＴクローン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＢ６０６３４９、マウス眼球）は、位置−７８７から−６８０（マウスエキソン２に存在する翻訳ＡＴＧ開始部位を基準）に及び、エキソン２（図１Ａ、１Ｂ）に連続し、コンセンサスＧＴ−ＡＧスプライス部位を有する６５７ヌクレオチド長イントロン（マウスｍＩ１ａと呼ぶ）にわたってスキップする。ＲＴ−ＰＣＲおよび配列決定により、この転写物（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ３８９９８２）の存在が確認された。

ｍＥ１ｂと命名した第２の第１エキソンは、−９４５〜−９２３領域に位置する順方向プライマーとエキソン２上の逆方向プライマー（表２）を用いたＲＴ−ＰＣＲにより見いだされた。得られる産物はこのプライマーから位置−７３３に及び、コンセンサスＧＴ−ＡＧスプライス部位を含む７１０ヌクレオチド長イントロン（ｍＩ１ｂ）にわたってスキップする（図１Ａ、１Ｂ）。このエキソンも配列決定により確認された（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ３８９９８１）。

ｍＥ１ｂ上流の−１７６２〜−１６７１に、１８種の報告された相同ＥＳＴクローンにおける「古典的」エキソン１（Ｌｉ Ｙ．ら（１９９１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６６、２３０８３〜２３０９０頁）を発明者らは見いだし、ここでｍＥ１ｃと再命名した（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＢ６３９２３４、表４Ａ）。この第１エキソンをエキソン２に融合させると、コンセンサスＧＴ−ＡＧスプライス部位を含む１６４８ヌクレオチドイントロン（ｍＩ１ｃ）がスプライシングにより切り出される。ＲＴ−ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片の配列決定により、ｍＥ１ｃの存在が確認された。

ｍＥ１ｃを含むが、ゲノム配列を経て前進するさらなるｍＲＮＡ転写物は、ｍＥ１ｃ−ｌｏｎｇであった。２つのより長いＥＳＴは実際ｍＥ１ｃにおいて始まり（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＢ６２９３４２およびＣＡ３２７７０１、それぞれ成体骨および全脳胚）、全ゲノム配列を経てエキソン２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＫ０３６４４３、成体雄骨）に及ぶ。これらのＥＳＴにおいて、エキソン２がエキソン３に融合している。イントロン２のスプライシングは、このｍＥ１ｃ−ｌｏｎｇ変異体の源としてのゲノムＤＮＡの混入の可能性を排除する。

さらに上流に、１９５７ヌクレオチド長のイントロン（ｍＩ１ｄ）に続く位置−２２７１〜−１９８０に、選択的第１エキソン（Ａｔａｎａｓｏｖａ Ｅ．ら（１９９９）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、２７４、２１０７８〜２１０８４頁）が以前に見いだされた。この第１エキソンはエキソン２に融合していることが見いだされた。発明者らは、ＲＴ−ＰＣＲおよび配列決定により、前頭葉前部皮質（ＰＦＣ）における対応する転写物の発現を確認した。２９ヌクレオチド異なる２つの選択的スプライスドナーが認められた。より短い形態をｍＥ１ｄ’と命名した（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ３８９９８０）。

ｍＥ１ｄの上流に、推定上の３種のＯＲＦｓ（位置−２５１８〜−２４０２、−２９２５〜−２５２２および−３１２９〜−２９３３）が古典的タンパク質のそれを含む連続読み枠内に見いだされた。これらは、エキソン２に始まる共通ＯＲＦに４６、１４２または７３アミノ酸（それぞれ）を加える可能性があった。これらのうち、ｍＥ１ｅ ＯＲＦはヒトＡＣＨＥ遺伝子およびその翻訳配列（下を参照）における対応する領域と７９％の配列類似度を共有し、したがって、潜在的候補とみなされた。図１Ａ〜１Ｂに種々のマウス５’エキソンを示す。

実施例２
ヒトＡＣｈＥ ｍＲＮＡｓの５’多様性
ヒト（ｈ）ＡＣＨＥ遺伝子の５’領域を用いたＥＳＴデータベース検索により、少なくとも４つの選択的第１エキソンの存在が明らかになった（表４Ｂ）。以前に特定されたマウスＥＳＴクローン（ｍＥ１ａ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＢ６０６３４９、上を参照）は、ｈＥ１ａと命名した選択的第１エキソンの存在を示唆している。

以前に記載された−１６８１〜−１５７６（ヒトエキソン２に存在する翻訳開始部位ＡＴＧを基準）の第１エキソン（Ｂｅｎ Ａｚｉｚ−Ａｌｏｙａ Ｒ．ら（１９９３）Ｐｒｏｇ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ ９８、１４７〜１５３頁）は、ここではｈＥ１ｂと命名する（ＥＳＴクローンＢＧ７０７８９２により表わされる、ヒト脳海馬）。１５４３ヌクレオチドのイントロン（ｈＩ１ｂ）がｈＥ１ｂとエキソン２を分離している。発明者らは、ＲＴ−ＰＣＲおよび配列決定によりｈＥ１ｂの存在を確認した。

さらなるＥＳＴクローンは位置−１８５９〜−１８２４に位置するゲノム配列を含んでいた（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＩ６６７７１２、ヒト脳海馬）。この推定上の第１エキソンを、ｈＥ１ｃと命名した。それは、１８０３ヌクレオチドのイントロン（ｈＩ１ｃ）が後続し、位置−２０のエキソン２（ＡＣＧ）に融合している。対応するイントロンは、ドナーおよびアクセプタースプライス部位（ＧＴ−ＡＧ）を含む。この場合、エキソン２は異なる位置で始まる。これは、エキソン２は３ヌクレオチド離れて位置する２つの任意のアクセプタースプライス部位で始まるということにより説明できる（両方がＡＧヌクレオチド、図１Ｃ、Ｄ）。この転写物の存在を確認する我々の試みは失敗した。

さらなるＥＳＴクローン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＸ４２０２９４、ヒト胎児脳）は、位置−２０のエキソン２と融合した、さらに上流の位置−２７２０〜−２３１８に位置する推定上の第１エキソン（エキソンｈＥ１ｄ）を含んでいた。これは、２２９４ヌクレオチドイントロン（ｈＩ１ｄ）の存在を意味している。興味深いことに、ｈＥ１ｄは、翻訳開始コドン（ＡＴＧ、位置−２４９５）を含み、エキソン２における「古典的」ＡＴＧのそれと共に連続読み枠を作り（Ｓｏｒｅｑ Ｈ．ら（１９９９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７、９６８８〜９６９２頁）、それによりＡＣｈＥタンパク質に６６アミノ酸を加える可能性がある。同じＯＲＦにおけるさらなるＡＴＧは、より短い６１アミノ酸ドメインを生成させる可能性がある。最初のＡＴＧを欠くｍＥ１ｅとの配列相同性は、翻訳開始部位として機能する可能性がより高い第２のＡＴＧを示唆するものである。発明者らは、ＲＴ−ＰＣＲおよび配列決定により、このｍＲＮＡの存在を確認した（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ３８９９７７、図１Ｃ、Ｄ）。

実施例３
新規のエキソンの推定上のプロモーター
ルシフェラーゼアッセイを用いて、Ａｔａｎａｓｏｖａ（Ａｔａｎａｓｏｖａ（１９９９）、同上）は、ｍＥ１ｄ（彼らの研究ではエキソンＥ１ａと称した）の上流に位置するプロモーターの機能性を立証した。我々の研究では、Ｃｉｓｔｅｒ（ｚｌａｂ．ｂｕ．ｅｄｕ／〜ｍｆｒｉｔｈ／ｃｉｓｔｅｒ．ｓｈｔｍｌ）およびＣｈｉｐ２Ｐｒｏｍｏｔｅｒ（ｇｅｎｏｍａｔｉｘ．ｄｅ）プログラムによりプロモーターの予測を可能とした。これらのプログラムは、マウスおよびヒトＡＣＨＥ遺伝子について図２Ａに示すように、転写的に活性なプロモーターであるより高い確率を予測するモチーフの保存を有する領域を検索する。推定上の転写因子結合部位の密度に基づいて、プロモーターであるより高い確率を有するいくつかの領域がこの検索により明らかになった。これらは、マウスおよびヒト遺伝子の第２エキソンから上流のゲノム領域に位置していた（図２Ａ）。新規の選択的第１エキソンを含む領域のプロモーター予測解析により、新たに特定されたエキソンの各々に対する妥当と思われるプロモーターが明らかになった（図２Ａ、２Ｂ）。選択的プロモーターの確率は前述したプロモーター（マウスにおけるｍＥ１ｂおよびヒトにおけるｈＥ１ｂの上流）のそれと同様であり、それらが機能的に活性であるという概念が裏付けられていることは注目に値する。プロモーターとして機能する特に高い確率がエキソンｍＥ１ａの上流に位置するマウス領域で認められた。ヒト遺伝子においては、発明者らはマウスｍＥ１ａとの相同性に基づいてｈＥ１ａを同定した。エキソンｈＥ１ａは、コンセンサススプライス部位を欠いており、ヒト配列におけるエキソン２とエキソンｈＥ１ｂとの間の全領域にＥＳＴは認められなかったので、真のエキソンの弱い候補である。しかし、ｈＥ１ａの上流に位置する領域はプロモーターとして機能する最も高い確率を示す（図２Ａ）ことから、恐らく霊長類の進化中に機能性が失われたことが示唆される。マウス配列に適用されないＣｉｓｔｅｒおよびＣｈｉｐ２Ｐｒｏｍｏｔｅｒプログラムにより、ヒトプロモーターの同様な予測が得られた。

転写因子結合部位の分布をより綿密に検討することにより、推定上の選択的プロモーターのうちの１つに特有であり、ヒトおよびマウスにおいて進化的に保存されているわずかなものが明らかになった。種々のシグナリング経路に反応する転写因子のいくつかの推定上のＤＮＡ標的が認められた。すなわち、臓器の発達中に高度に発現する転写因子Ｄ１ｘの保存結合部位（Ｐａｎｇａｎｉｂａｎ Ｇ．およびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ Ｊ．Ｌ．Ｒ．（２００２）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２９、４３７１〜４８８６頁）がｍＰ１およびｈＰ１に、ＴＧＩＦの推定上の結合部位がｍＰ２およびｈＰ２に認められた。興味深いことに、３つの推定上のグルココルチコイド反応性エレメント（ＧＲＥｓ）がヒトＡＣＨＥ遺伝子の上流の領域で特定され（１つがｈＰ３に、１つがｈＥ１ａに隣接、図２Ａ）、１つのそのような部位がマウス遺伝子上に特定された（ｍＰ２、図２Ａ）。したがって、新たに特定された転写物のあるものが実際にグルココルチコイドおよび／またはストレス反応性であるかどうかをさらに確認する気になった。

実施例４
ヒトおよびマウスのシンテニー
上流ヒトおよびマウス配列をｂｌａｓｔ−２−ｓｅｑｕｅｎｃｅｓプログラム（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ）を用いて相同領域についてスキャンした。異なる長さのいくつかの相同領域が認められた（図２Ｃ）。これらは、エキソン２に隣接する短い領域、マウスおよびヒトｈＥ１ａ、２７０ｂｐ領域（エキソン１の上流の強いプロモーター領域に相当する）、ｍＥ１ｂの内部部分（この領域におけるヒト配列には対応するエキソンは特定されなかった）、エキソンも予測されるプロモーターも含まない１２５ｂｐ領域、２つの「古典的」エキソン（ｈＥ１ｂおよびｍＥ１ｃ）、ｈＥ１ｃおよびｍＥ１ｄに隣接する短い配列およびヒトｈＥ１ｄとマウスｍＥ１ｅとの間の相同性を示す比較的長い配列などである。この顕著な相同性、およびｈＥ１ｄとｍＥ１ｅとで類似の特徴を有するＯＲＦｓは、共通の進化的に保存された祖先配列および未確認のｍＥ１ｅのもっともらしさを補強する。

実施例５
ＳＩＮＥおよびＬＩＮＥは遠位ヒトＡＣＨＥプロモーターから５’選択的エキソンを分離する
Ａｌｕは、霊長類ゲノム内の最も豊富な短い散在反復エレメント（ＳＩＮＥ）である（Ｂａｔｚｅｒ Ｍ．Ａ．およびＤｅｉｎｉｎｇｅｒ Ｐ．Ｌ．（２００２）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ ３、３７０〜３７９頁）。ヒトにおいては、１５０万のＳＩＮＥがほぼ１３％を占め、８５００００の長い散在反復エレメント（ＬＩＮＥ）が他の２１％を占めており、共にゲノムの合計３４％を構成している（Ｗｅｉｎｅｒ Ａ．Ｍ．（２００２）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４、３４３〜３５０頁）。ＬＩＮＥは通常遺伝子に乏しく、ＡＴに富む領域に認められ、ＳＩＮＥは遺伝子に富む領域内に選択的に位置し、挿入事象に対する好ましい利用可能性を反映するが、そのような挿入が発現を妨げる可能性があるエキソン内部には通常存在しない（ＢａｔｚｅｒおよびＤｅｉｎｉｎｇｅｒ（２０００）同上）。平均的には、転写単位自体の範囲内を除き、約２〜３．５ｋｂごとに１つのＳＩＮＥおよび１つのＬＩＮＥを予想することができよう。エキソン２の翻訳開始部位の上流の現在利用可能なＧｅｎＢａｎｋ配列（ヒトの２０、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ００２９９３、およびマウスの９．５ｋｂ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ３１２０３３）についてまったく異なる結果が発生した。解析済み配列におけるＳＩＮＥおよびＬＩＮＥ分布をＥｌｄｏｒａｄｏソフトウェア（ｇｅｎｏｍａｔｉｘ．ｄｅ）およびＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒアルゴリズム（ｓｅａｒｃｈｌａｕｎｃｈｅｒ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ）を用いて解析した。密度は、ＳＩＮＥの平均より６倍高く、ＬＩＮＥの平均よりほぼ２倍高い。このことから、この領域には機能ＤＮＡが存在する余地がほとんどないことになる。これに対して、選択的第１エキソンが特定されたヒトおよびマウス３．５ｋｂ領域内に例外的に少数の反復配列が認められた（それぞれ１および３反復）ことから、ヒトおよびマウスにおけるこれらのＤＮＡ断片の機能的役割が裏付けられる。ＡＣＨＥの上流の最も近い遺伝子は約１８０ｋｂ離れて位置している（Ｗｉｌｓｏｎ Ｍ．Ｄ．ら（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２９、１３５２〜１３６５頁）。

実施例６
マウスにおける新規エキソンの組織分布
種々の選択的第１エキソンを含むｍＲＮＡのマウスにおける組織分布をＲＴ−ＰＣＲにより検討した（図３Ａ）。エキソンｍＥ１ａは、海馬、皮質、ＰＦＣ、脳幹および基底核を含む検討したすべての脳領域で発現することが認められた。エキソンｍＥ１ａは、胸腺、心臓、肝臓、腸および脾臓においても発現したが、腎臓、精巣、筋肉または脊髄では発現しなかった。エキソンｍＥ１ｂは、肝臓、腸および筋肉を除く検討した組織の大部分で検出された。エキソンｍＥ１ｃは、最も広く発現した。しかし、これは腸には存在しなかった。エキソンｍＥ１ｄは、脳（海馬、ＰＦＣ、脳幹および基底核）および心臓で検出されたが、脾臓、胸腺、腸または肝臓では検出されなかった。比較のために、発明者らは、同じ組織において種々のＡＣｈＥ ３’変異体の発現プロファイルを検討した。「シナプス性」ＡＣｈＥ−Ｓは、弱い発現が認められたにすぎなかった胸腺、肝臓および小腸を除く検討した組織のすべてにおいて強く発現した。したがって、最も一般的な５’転写物である「古典的」ｍＥ１ｃが成熟ＡＣｈＥ−Ｓ ｍＲＮＡ変異体におけるＡＣｈＥ−Ｓの主要なパートナーであると予測することができると思われる。それにもかかわらず、選択的５’転写物は、ｍＥ１ｃが発現しない腸において成熟ＡＣｈＥ−Ｓ ｍＲＮＡ変異体を形成する必要がある。「読み過ごし」ＡＣｈＥ−Ｒは、検討した脳領域のすべておよび脾臓において強く発現した。これは、心臓、筋肉、腎臓、脊髄および肝臓で中等度に発現し、精巣、胸腺および腸では非常に不十分に発現した。「赤血球」ＡＣｈＥ−Ｅは、検討した脳領域のすべて、ならびに心臓、腎臓、脊髄、肝臓、脾臓および筋肉で発現した。これは、精巣、胸腺および小腸には存在しなかった。したがって、５’変異体のいずれも単一３’変異体と同じ発現パターンを共有しておらず、成熟ｍＲＮＡにおいては５’スプライシングパターンは３’スプライシングを必ずしも決定しないことが示唆される。４種の５’および３種の３’スプライスオプションは、１２種の異なる転写物を発生させる可能性がある。

実施例７
５’マウスエキソンの異なるニューロン分布
新規エキソンの発現パターンの細胞分解レベルを達成するために、発明者らは、蛍光ｉｎ ｓｕｔｕハイブリッド形成（ＦＩＳＨ、詳細については実験手順を参照）のために４０〜５０ｍｅｒ ５’ビオチニル化完全２’−Ｏ−メチル化リボプローブを設計した。図３ＢにｍＥ１ａ、ｍＥ１ｂおよびｍＥ１ｄにおける代表的なＦＩＳＨプロファイルを示す。

これらの３種のエキソンはすべてニューロンに発現するように思われた。しかし、それらは異なる細胞型特異性および細胞内分布を示した。例えば、主としてすべての深層ＰＦＣニューロンが顕著なｍＥ１ａレベルおよびかなり低いｍＥ１ｂ標識を示した。エキソンｍＥ１ｄ ｍＲＮＡはＰＦＣニューロンの最上層に著しく濃縮され（図３ＢＩ）、ＰＦＣニューロンの特定のサブセットにおいてこの変異体のレベルが異なっていることが示唆される。これらの差は、プローブの効率を潜在的に反映している可能性があるが、各種選択的ｍＲＮＡが異なる発現パターンを有することを示している。同じまたは隣接切片内の海馬ＣＡ２ニューロンは一貫して３エキソンすべての低いレベルを示しており（図３ＢＩＩ）、これらの細胞型の差の概念が裏付けられた。種々の５’エキソンの差別的発現は小脳ニューロンにおいても顕著であった（図３ＢＩＩＩ）。ｍＥ１ａは、プルキンエ細胞核周囲部の細胞質に蓄積するが、他の小脳ニューロンにおいてはわずかに検出されるにすぎなかった。ｍＥ１ｂは、小脳において不十分に発現し、ｍＥ１ｄは、プルキンエ細胞において強く発現し、その細胞体および軸索突起において標識されていた（図３ＢＩＶ、Ｖ）。さらに、ｍＥ１ｄは、分子層に散在したより小さい細胞を含む小脳の他のニューロンにおいて転写され、非対称標識パターンを示す。これらのニューロンにおいて、軸索も標識されていた。顆粒ニューロンは、プローブｍＥ１ｄで不十分に標識されていたにすぎなかった。

実施例８
ヒトｈＥ１ｄ ｍＲＮＡ発現−胚発現
後期発生段階におけるｈＥ１ｄ ｍＲＮＡの組織分布を、１６、２５および３４週齢のヒト胚のパラフィン切片において検討した。１６週目には、ｈＥ１ｄ ｍＲＮＡは、神経系のみに弱く検出され、胸腺には存在しなかった。発生が進むにつれて、ｈＥ１ｄ発現がより顕著になり、神経系および胸腺において陽性細胞の密度が増加し、標識強度が増加した。３４週目に、ニューロンの５０±１０％までが陽性であった（図４Ａ）。これに対して、２５週目に胸腺細胞のわずか２±１．５％がｈＥ１ｄ ｍＲＮＡ陽性であったが、３４週目までに細胞の８±１．５％超が陽性であった。

ヒトｈＥ１ｄ ｍＲＮＡ発現−成人発現
パラフィン包埋ヒトＰＦＣ切片のＦＩＳＨ解析により、顕著なニューロンｈＥ１ｄ ｍＲＮＡ標識が明らかになり、ＰＦＣにおける細胞の５７±３４％がｈＥ１ｄ ｍＲＮＡ陽性であった。標識細胞の２５％までが軸索突起におけるｈＥ１ｄ ｍＲＮＡ標識を示し、長さが１４．５±７．５μｍに達した（図６Ｄ）。

実施例９
新規のエキソンのストレスおよびグルココルチコイド関連発現
ストレスは、システインを含まないＣ末端を有するＡＣｈＥをコードするＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡの速やか（Ｋａｕｆｅｒ Ｄ．ら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９３、３７３〜３７７頁）で、長時間持続する（Ｍｅｓｈｏｒｅｒ（２００２）、同上）発現を誘発し、これがストレス関連ＡＣｈＥ単量体の蓄積につながる。ＡＣＨＥ遺伝子は遠位エンハンサーにおけるＧＲＥを有し（Ｓｈａｐｉｒａ（２０００）、同上）、ＡＣＨＥ遺伝子発現はコルチコステロン投与後に増加する（Ｍｅｓｈｏｒｅｒ（２００２）、同上）。したがって、発明者らは、中枢神経系におけるＧＲ遺伝子を選択的に欠いている突然変異マウス（ＧＲ^{ＮｅｓＣｒｅ}マウス）（Ｔｒｏｎｃｈｅ（１９９９）、同上）と比較して、対照マウスにおいてストレス後に新規５’エキソンのいずれが選択的に過剰産生されるかを検討した。

マウスＰＦＣにおいて、ｍＥ１ｂ ｍＲＮＡレベルは、ＧＲ^{ＮｅｓＣｒｅ}マウスにおいて対照と比較して変化しなかった。しかし、突然変異動物に拘束によりストレスを加えたとき、ｍＥ１ｂ ｍＲＮＡは、ＧＲ^{ＮｅｓＣｒｅ}マウスにおいてストレスを加えなかったＧＲ^{ＮｅｓＣｒｅ}マウスまたは対照マウスと比較して２時間以内に有意に減少した（図５Ａ〜５Ｂ）。これは、ストレス後のｍＥ１ｂの正常レベルの維持におけるＧＲの役割を示唆している。これに対して、ｍＥ１ｃ ｍＲＮＡレベルは、ストレスを加えた対照およびＧＲ^{ＮｅｓＣｒｅ}マウスで同様に増加した。このことは、ｍＥ１ｃエキソンの発現が拘束ストレスに応答してＧＲ転写因子に関係しないようにアップレギュレートすることを示唆している。しかし、マウスｍＥ１ｄは、対照マウスでは拘束ストレスの２時間後に著しくアップレギュレートしたが、ＧＲ^{ＮｅｓＣｒｅ}突然変異マウスでは非常にわずかにアップレギュレートした。このことは、ｍＥ１ｄの調節がストレスにより著しく誘導され、またグルココルチコイド依存性であることを示唆している。ＡＣｈＥ−Ｓ ｍＲＮＡは、ストレスを加えた野生型マウスにおいて一般的に変化せずに推移するが、これは我々の以前の知見と矛盾しない（Ｋａｕｆｅｒ（１９９８）、同上、Ｍｅｓｈｏｒｅｒ（２００２）、同上）。これに対して、ストレスを加えた突然変異マウスにおけるＡＣｈＥ−Ｓ ｍＲＮＡレベルは実質的に低下したことは、ＡＣｈＥｍＲＮＡ前駆体の３’選択的スプライシングパターンはグルココルチコイド依存性であることを示唆している。したがって、アクチンｍＲＮＡレベルは変化しないままであったが、解析した変異体エキソンの各々がストレスおよびグルココルチコイド反応の特有の組合せを示した。

実施例１０
Ｎ−ＡＣｈＥタンパク質産物およびそれらの発現
ＡＣｈＥコーディング配列とインフレームである新規のＮ末端推定ＯＲＦがマウスｍＥ１ｅおよびヒトｈＥ１ｄエキソンのオーソロガス領域に特定された。ｍＥ１ｅの推定ＯＲＦは、データベースにおける既知タンパク質との相同性を有さないドメインである追加の４６アミノ酸をコードする（図６Ａ）。これらは、正に荷電した８残基（４アルギニン、１リシンおよび３ヒスチジン）を含むが、負に荷電した残基は２つ（２グルタミン酸）だけであるので、１１．５４の極めて高いｐＩ値が得られた。ｍＥ１ｅの二次構造解析（ＧＯＲ４ソフトウェアｈｔｔｐ：／／ｎｐｓａ−ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｓｅｃｐｒｅｄ＿ｇｏｒ４．ｐｌ）により、潜在的αらせん折りたたみが明らかになった（図６Ｂ、上）。ｍＥ１ｃコードペプチドは、Ｍｏｔｉｆ Ｓｃａｎソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｈｉｔｓ．ｉｓｂ−ｓｉｂ．ｃｈ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＰＦＳＣＡＮ、利用可能ｕｓ．ＥｘＰＡＳｙ．ｏｒｇ）により解析したところ、推定上のタンパク質キナーゼリン酸化部位（位置４〜６、ＴｓＲ）およびＮ−ミリストイル化部位（位置１３〜１８、ＧＧｈｒＳＧ、図６Ｂ）が明らかになった。Ｎ末端へのこのペプチド鎖の付加は、マウスＡＣｈＥシグナルペプチド（ＭＲＰＰＷＹＰＬＨＴＰＳＬＡＦＰＬＬＦＬＬＳＬＬＧＧＧＡＲＡ、位置１〜３１、配列番号３３）の切断を防止する可能性が高い。これにより、ｍＮ−ＡＣｈＥタンパク質の７７（４４＋３１）アミノ酸の伸長が得られ（ｍＡＣｈＥ−Ｓの５７４残基と比べて１３．４％増加）（Ｒａｃｈｉｎｓｋｙ Ｔ．Ｌ．ら（１９９０）Ｎｅｕｒｏｎ ５、３１７〜３２７頁）、シグナルペプチドが膜貫通性になると予測された（例えば、アシアロ糖タンパク質受容体変異体）（Ｓｐｉｅｓｓ Ｍ．およびＬｏｄｉｓｈ Ｈ．Ｆ．（１９８６）Ｃｅｌｌ ４４、１７７〜１８５頁）。

対応するヒトエキソンｈＥ１ｄは、ｈＡＣｈＥタンパク質とインフレームである６６アミノ酸のＮ末端伸長をコードする（図６Ｂ）。このペプチドも、成熟中に通常切り離されるヒトＡＣｈＥシグナルペプチド（ＭＲＰＰＱＣＬＬＨＴＰＳＬＡＳＰＬＬＬＬＬＬＷＬＬＧＧＧＶＧＡ、位置１〜３１、配列番号３４）に先行する。発明者らは、ＡＣｈＥ−Ｓの５７４残基と比べて１６から１７％増加する９２（６１＋３１）または９７（６６＋３１）アミノ酸のより大きいタンパク質をもたらす、ＡＣｈＥ切断を防止するその存在を予測した（Ｓｏｒｅｑ（１９９０）、同上）。

ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにはｈＮ−ＡＣｈＥペプチド配列に対する有意な相同性は認められなかった。ｍＮ−ＡＣｈＥと同様に、該ペプチドは推定上のリン酸化部位（カゼインキナーゼＩＩ、位置７〜１０、ＳｃｐＤ）ならびにＮ−ミリストイル化部位（位置３１〜３６、ＧＧｓｒＳＦ、図６Ａ）を含む。さらに、ｍＮ−ＡＣｈＥと同様に、ｈＮ−ＡＣｈＥは、ヒストンおよび他の核酸結合タンパク質と同様な極めて高い予測ｐＩ（１１．７６）を示す（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｔａｇｉｄｅｎｔ．ｈｔｍｌ）。

神経膠芽腫タンパク質抽出物のイムノブロットにおいて抗ｈＮ−ＡＣｈＥ抗体が認識した６６Ｋｄダブルバンドは、Ｎ１９抗ＡＣｈＥ抗体を用いて認められた標識パターンと同等である（図６Ｃ、挿入図、左上）。ヒト脳の種々の領域（図６Ｅに概略図で示す）からのタンパク質抽出物は、ｉｎ ｖｉｖｏでのｈＮ−ＡＣｈＥタンパク質について同様なサイズを示した（図６Ｃ、下）。発現は、最も顕著であったＰＦＣおよび後頭皮質を含む種々の皮質ドメインに及んでいた。海馬、線条および扁桃も陽性であったが、小脳発現は非常に低かった。これらの結果は、実施例８で述べたｍＲＮＡ発現解析と共に、有意な割合のストレス反応性ＰＦＣニューロンがそれらの細胞体および軸索においてｈＮ−ＡＣｈＥを発現することを示している。

ｈＮ−ＡＣｈＥ ＯＲＦ（図４Ｂ）からの２つの短い内部ペプチドに対するウサギポリクローナル抗体を産生させ、ｈＮ−ＡＣｈＥを発現する造血細胞を特定するためのフローサイトメトリ分析に用いた。パラフィン包埋切片上の免疫組織化学については不十分であったが、抗ｈＮ−ＡＣｈＥ抗体はヒト臍帯血の細胞をうまく標識した。細胞系統は、それらの側方散乱および血球マーカーＣＤ４５の発現レベルに従って分類した。５種類の明確に区別できる集団、すなわち、リンパ球（Ｌ）、単球（Ｍ）、顆粒球（Ｇ）、血球前駆細胞（Ｐ）および有核赤血球（ＮＥ、図４ＣＩ）が検出された。単球および顆粒球は、最も顕著な標識を示し、アイソタイプ対照と比較して、細胞の６７±１９および５７±２１％がｈＮ−ＡＣｈＥを発現した。さらに、リンパ球の１７±７％およびＣＤ＋３４前駆細胞の７．５±４％がｈＮ−ＡＣｈＥ陽性であったが、有核赤血球は完全に陰性であった（図４ＣＩＩ）。ｈＮ−ＡＣｈＥを発現するリンパ球をさらに下位分類するために、幹細胞（ＣＤ３４）、初期リンパ球（ＩＬ７）、成熟Ｔ細胞（ＣＤ３）および成熟Ｂ細胞（ＣＤ１９）の特異的マーカーを用いた。これらのマーカーの一部は複数の細胞系統に出現する可能性があるが、Ｔ細胞が最も顕著であり、ＣＤ＋３４リンパ球が９±３％で、初期Ｔ細胞が１０±３％に上昇し、成熟Ｔ細胞が１４±９％に増加した。Ｂ細胞も７．５±６．５％ｈＮ−ＡＣｈＥ陽性であった。

一次構造から予測されるように、ｈＮ−ＡＣｈＥが膜において発現するかどうかを検討するために、細胞の透過化の後にフローサイトメトリ試験を繰り返した。透過化の後に増加は認められず、むしろ単球および顆粒球標識がそれぞれ７±１％および２０±７．５％に低下し、ｈＮ−ＡＣｈＥが膜において発現することが示唆される。

実施例１１
Ｎ−ＡＣｈＥはアルツハイマー病において過剰発現する
ＡＣｈＥ活性はアルツハイマー病（ＡＤ）の経過における後期に低下することが知られており、これがこの疾患の病因に寄与している可能性がある。しかし、ＡＤにおける特異的ＡＣｈＥ変異体の組成は不明のままである。この問題を解決するために、発明者らは、ＡＣｈＥ−Ｓ、ＡＣｈＥ−ＲおよびＮ−ＡＣｈＥ転写物を検出するためのエキソン６、ポソイドイントロン４および新規５’エキソンＥ１ｄに相補的なｃＲＮＡプローブを用いて蛍光ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）を実施した。

すべての既知の変異体に共通するＡＣｈＥのコアドメインに対する抗体は、歯状回ニューロンにおける総ＡＣｈＥレベルの著しいダウンレギュレーションを示し（ｐ＜０．０５）（図９Ａ〜９Ｃ）、通常優勢なＡＣｈＥ−Ｓタンパク質の著しい減少が示唆される。

歯状回ニューロンにおけるＦＩＳＨ ｍＲＮＡ標識は、「シナプス性」（ＡＣｈＥ−Ｓ）変異体のレベルの明らかな低下（図１０Ａおよび１０Ｃ）と「読み過ごし」（ＡＣｈＥ−Ｒ）変異体のレベルのわずかであるが、有意な増加（＊ｐ＜０．０１、＊＊ｐ＜０．０５ Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）（図１０Ｂおよび１０Ｃ）を示し、これらの２つの変異体の比が変化し、通常まれなＡＣｈＥ−Ｒ型の産生が増加した。ＡＣｈＥ−Ｒ ｍＲＮＡのレベルの同様な増加が突然変異ＡＰＰとヒトＡＣｈＥ−Ｓとを過剰に発現した二重トランスジェニックマウスで認められた（Ｒｅｅｓ Ｔ．Ｍ．ら（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、印刷中）。

Ｅ１ｄに特異的なプローブを用いて、対応するｍＲＮＡ転写物の有意な増加が、対照またはアルツハイマー病の老化ヒト海馬のＣＡ３ニューロン（図１１Ｂおよび１１Ｃ）と比較してアルツハイマー病試料の歯状回に認められた（図１１Ａおよび１１Ｃ）。

図１２Ａおよび１２ＢにＮ末端（Ｎ−ＡＣｈＥ変異体を検出する）またはＣ末端（ＡＣｈＥ−Ｓ変異体を検出する）に対して特異的な抗体を用いた海馬の免疫標識を示す。アルツハイマー病において、標識領域は、歯状回をＣＡ３ニューロン領域に結合する苔状線維系におけるＮ−ＡＣｈＥ−Ｓ変異体のアップレギュレーションを示した。

海馬におけるすべてのＡＣｈＥアイソフォーム（ＡＣｈＥ−Ｓ、ＡＣｈＥ−ＲおよびＮ−ＡＣｈＥ）の発現をＲＴ−ＰＣＲにより確認した（図１３）。

したがって、ＡＣｈＥ変異体の組成の重大な変化がヒトアルツハイマー病海馬に認められた。これらの変化はｍＲＮＡおよびタンパク質レベルで検出されたことから、ＡＣＨＥ遺伝子発現の調節の変化がヒトアルツハイマー病の重要な特徴であることが示唆される。変化は、ＡＤ脳におけるプロモーターの使用の変化、選択的スプライシングの変化およびＡＣｈＥの位置の変化を含む。ＡＣｈＥはアポトーシス（Ｚｈａｎｇ（２００４）、同上）またはベータアミロイド凝集を誘発することが報告され、ＡＣｈＥはアミロイドプラーク成分の１つであり、ベータアミロイド原線維形成を促進する（Ｉｎｅｓｔｒｏｓａ（１９９６））、同上）ことが示されたので、これらの変化はおそらくシナプス伝達またはニューロン細胞死にかなりの影響を及ぼすと考えられる。

実施例１２
遺伝子発現プロファイルの変化をもたらすＡＣｈＥ−ＲまたはＡＣｈＥ−Ｓの過剰発現
発明者らは、特定のＡＣｈＥ変異体を過剰発現する形質導入細胞に発生する選択的スプライシングおよび／またはアポトーシスに関与する転写および転写後変化を特定することに着手した。社内マイクロアレイを用いてｐ１９胚癌細胞系におけるＡＣｈＥ−ＲまたはＡＣｈＥ−Ｓの過剰発現の影響を受ける候補遺伝子の特定が可能となった。

Ｐ１９細胞を、これらの細胞のニューロン系統への分化を誘発することが知られている０．５μＭのレチノイン酸（Ｊｏｎｅｓ−Ｖｉｌｌｅｎｅｕｖｅ Ｅ．Ｍ．ら（１９８２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ９４（２）：２５３〜６２頁）で３日間処理した。４日目に、細胞に次のベクターのうち１つ１μｇを形質導入した。すなわち、ＡＣｈＥ−Ｓを過剰発現するベクター（Ｂｅｎ−Ａｚｉｚ Ａｌｏｙａ Ｒ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ ９０：２４７１〜２４７５頁）、ＡＣｈＥ−Ｒを過剰発現するベクター（Ｓｅｉｄｍａｎ Ｓ．ら（１９９５）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１５：２９９３〜３００２頁）または対照のための空ベクター。細胞を部分的に分化させたところ、比較的高いレベルの形質導入ＤＮＡを示すと同時にコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）の高いレベルを示した。５日目に、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｕｉａｇｅｎ（商標登録））を用い、製造業者の説明書に従ってＲＮＡを形質導入細胞から抽出した。各ベクターを過剰発現した細胞からのＲＮＡを空ベクターを形質導入した細胞からのＲＮＡと比較した。さらに、用いた色素が異なることに起因する標識の差を除去することを目的とした、色素スワッピング試験を実施した。そのような比較は、各実験試料について、以下に従った４種類のスライド標本からなっていた。
スライド標本 試料
１ Ｃｙ３で標識した実験／Ｃｙ５で標識した対照
２ Ｃｙ３で標識した実験／Ｃｙ５で標識した対照
３ Ｃｙ５で標識した実験／Ｃｙ３で標識した対照
４ Ｃｙ５で標識した実験／Ｃｙ３で標識した対照

スライド標本１と２および３と４は、同じ複製試料である。さらに、このデザインは「色素スワッピング」を用いた。すなわち、マイクロアレイ染色アッセイで起こることが知られている色素特異的な効果を補償するために、各試料を１つの蛍光色素で２回、他の蛍光色素で２回標識した。

Ａｍｂｉｏｎ製のＡｍｉｎｏ Ａｌｌｙｌ ＭｅｓｓａｇｅＡｍｐ（商標）ＲＮＡ増幅キット（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｍｂｉｏｎ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｌｉｂ／ｐｒｏｔ／ｆｍ＿１７５２．ｐｄｆ）を用いてＲＮＡを増幅した。Ｃｙ３（緑、吸収極大：５５０ｎｍ、放射極大：５７０ｎｍ）およびＣｙ５（赤、６４９／６７０ｎｍ）蛍光色素を標識に用いた。ＲＮＡ断片化、前ハイブリッド形成およびハイブリッド形成を実験手順で述べたように実施した。

図１６Ａ〜１６Ｃおよび１７Ａ〜１７ＩにＡＣｈＥ−ＲおよびＡＣｈＥ−Ｓを過剰発現したＰ１９細胞のマイクロアレイ分析の結果を示す。結果は本質的に次のようにまとめることができる。ＡＣｈＥ−ＲまたはＡＣｈＥ−Ｓは、遺伝子発現に対して以下の３つの主要な影響を及ぼす。
１）遺伝子の１つの群は２つのＡＣｈＥアイソフォームにより同様に調節され（誘導または阻害されたが、両処理で同じ結果が得られた）、発現パターンの変化はＡＣｈＥの共通のドメインまたは触媒活性に関連することが示唆される。
２）遺伝子の１つの群（または遺伝子ファミリー）はアイソフォームの１つによりアップまたはダウンレギュレートされ、他による反対の影響を有する。
３）個々の遺伝子の発現はアイソフォームの１つにより変化し、他により変化しない。
４）他の遺伝子は形質導入ＤＮＡのいずれによる影響も示さず、それらの影響の選択性が示された。

一般的に、次の３つの主要な遺伝子グループがＡＣｈＥ−Ｒ／Ｓの過剰発現による影響を受けた。すなわち、アポトーシス関連、ヘリカーゼならびにＳＲおよびＳＲ関連遺伝子。興味深いことに、ＳＲおよびＳＲ関連遺伝子は両アイソフォームにより主としてダウンレギュレートされ、一方、アポトーシス関連遺伝子はＡＣｈＥ−Ｒによりアップレギュレートされ、ＡＣｈＥ−Ｓによりダウンレギュレートされた（解析では催アポトーシス遺伝子と抗アポトーシス遺伝子との区別はできなかったが）。ヘリカーゼ遺伝子の発現は、ＡＣｈＥ−Ｓ発現細胞においてのみ変化した。この結果は、核内のＡＣｈＥ−Ｓの核局在化を示す発明者らの以前の結果（Ｐｅｒｒｙら（２００２）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２１（５５）：８４２８〜４１頁）と相関していると思われる。

マウス５’ゲノム領域を示す図である。マウスＡＣＨＥ遺伝子の２．６ｋｂの５’ゲノム領域を示す図である。エキソン（網掛けまたは下線部）は右側に名称を示す。スプライス部位は黄色で、翻訳開始部位は赤色で示す。最下行はエキソン２の開始を示す。 ヒト５’ゲノム領域を示す図である。ヒトＡＣＨＥ遺伝子の２．６５ｋｂの５’領域および対応するスキームを示す図である。ｈＥ１ｄの２つの可能な開始ＡＴＧｓをピンク色と赤色で示す。第２のＡＴＧはｍＥ１ｅのＡＴＧに対応する。 マウス５’ゲノム領域および５’転写物を示す図である。変異体エキソンを含むＡＣＨＥ遺伝子の全５’領域を模式的に図示した図である。すべての模式図は一定の比例に縮小して描かれている。配列決定により確認されたエキソンは、アクアマリーン色に塗られ、直線でつながれている。括弧内の未確認のものは、白色であり、赤色の破線でつながれている。長ｃＤＮＡクローン（ＡＫ０３６４４３、ｍＥ１ｃ−ｌｏｎｇ）は、灰色で示されている。ｍＥ１ｅのＯＲＦは赤色で、Ｅ２のそれはオレンジ色である。略語：Ｃｏｎｆ．：確認済み、ｅｖｉｄ．：証拠、Ｎ．−ｖａｌ．：未確認、ｃｏｎｖ．：従来の、ｎｏｖ．：新規の ヒト５’ゲノム領域および５’転写物を示す図である。変異体エキソンを含むＡＣＨＥ遺伝子の全５’領域を模式的に図示した図である。すべての模式図は一定の比例に縮小して描かれている。配列決定により確認されたエキソンは、アクアマリーン色に塗られ、直線でつながれている。括弧内の未確認のものは、白色であり、赤色の破線でつながれている。 マウスおよびヒトＡＣＨＥ遺伝子のプロモーターおよびシンテニー解析を示す図である。特定の領域がプロモーターとして機能する全体的な確率を表わす、３．５５ｋｂの上流配列および３．５５ｋｂのコーディング領域を含む７．１ｋｂのマウス（上）およびヒト（下）ＡＣＨＥ遺伝子のＣｉｓｔｅｒソフトウェア解析を示す図である。着色した直線は、以下に詳述する選択した転写因子結合部位を表わす。赤色の三角形は、推定上のグルココルチコイド反応エレメント（ＧＲＥｓ）を表わす。種々の選択的５’エキソン（灰色ボックス）は、マウスについてはａ−ｅで、ヒトについてはａ−ｄで示す。開始ＡＴＧ（＋１）からの塩基数は、上に示す（破線）。比較のために、ヒト配列をＣｈｉｐ２Ｐｒｏｍｏｔｅｒソフトウェア（Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ）を用いて解析した。ヒトプロモーター予測をオレンジ色ボックス（ｈＰ１、ｈＰ２およびｈＰ３）として示し、遺伝子関連プロモーター（ｈＰ２、第１エキソンに対する近位プロモーターとしてプログラムにより定義）は黄色ボックスとして示す。Ｃｈｉｐ２Ｐｒｏｍｏｔｅｒはマウス配列サポートせず、したがって、プロモーター領域をＣｉｓｔｅｒに従って決定し、空のレンガ色ボックス（ｍＰ１、ｍＰ２およびｍＰ３、上）として示す。略語：Ｓｅ．ｂｉｎｄ．ｓｉ．：選択した結合部位 マウスおよびヒトＡＣＨＥ遺伝子のプロモーターおよびシンテニー解析を示す図である。転写因子の予測結合部位のＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒ解析を示す図である。因子は、左に示す異なる色および形状により示した構造、機能、モチーフ認識またはその他に従って分類した。マウス（上）対ヒト（下）ＡＣＨＥの５’領域のＢｌａｓｔ−２−ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ解析（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ）。相同配列は、色分けにより対応付けたボックスとして示す。エキソンは、下の空のボックスとして示す。 マウスおよびヒトＡＣＨＥ遺伝子のプロモーターおよびシンテニー解析を示す図である。ＳＩＮＥ（青丸）およびＬＩＮＥ（緑丸）についてスクリーニングしたマウス（Ｍｏ、９．５ｋｂ、上）およびヒト（Ｈｕ、２０ｋｂ、下）遺伝子の上流領域におけるＳＩＮＥおよびＬＩＮＥ分布を示す図である。遠位ＡＣＨＥプロモーター（Ｓｈａｐｉｒａ（２０００）、同上）は、赤色で示す。 マウスおよびヒトＡＣＨＥ遺伝子のプロモーターおよびシンテニー解析を示す図である。ＳＩＮＥ（青丸）およびＬＩＮＥ（緑丸）についてスクリーニングしたマウス（Ｍｏ、９．５ｋｂ、上）およびヒト（Ｈｕ、２０ｋｂ、下）遺伝子の上流領域におけるＳＩＮＥおよびＬＩＮＥ分布の解析において、５００ｂｐの反復回数（Ｒｅｐ．／５００ｂｐ）をマウス（左）およびヒト（右）について示す。 ＡＣｈＥの選択的にスプライスされた転写物の組織および細胞型発現パターンを示す図である。マウスＡＣｈＥの５’（４つの上部レーン：ｍＥ１ａ、ｍＥ１ｂ、ｍＥ１ｃおよびｍＥ１ｄ）および３’（３つの下部レーン：ＡＣｈＥ−Ｓ、ＡＣｈＥ−ＲおよびＡＣｈＥ−Ｒ）選択的転写物のＲＴ−ＰＣＲ生成物およびそれらの対応する分子サイズ（右）を示す図である。各転写物のプライマーの位置は、左図（三角）に示す（プライマー配列については、材料および方法を参照のこと）。略語：ｈｅ．：心臓、ｍｕ．：筋肉、ｔｅ．：精巣、ｋｉ．：腎臓、ａｐ．Ｃｏ．：脊髄、ｌｉｖ．：肝臓、ｓｐｌ．：脾臓、ｔｈｙ．：胸腺、ｉｎｔ．：腸、ｂａｓ．Ｎｕ．：基底核、ＰＦＣ：前頭葉前部皮質、ｈｉｐｐ：海馬、ｃｏｒｔ．：皮質、ｂｒ．Ｓｔ．：脳幹 ＡＣｈＥの選択的にスプライスされた転写物の組織および細胞型発現パターンを示す図である。無処置ＦＶＢ／ＮマウスのＰＦＣ（Ｉ）、ｈｉｐｐ（ＩＩ）および小脳（ｃｅｒ、ＩＩＩ）におけるｍＥ１ａ、ｍＥ１ｂおよびｍＥ１ｄを含む転写物の代表的蛍光像である。右の漫画は拡大部位（赤色ボックス）を示す図である。小脳部位の拡大は、プルキンエ細胞におけるｍＥ１ａ（ＩＶ）の強い細胞質標識ならびにｍＥ１ｄ（Ｖ）の細胞質および核標識を示す。単一プルキンエ細胞の拡大を右の略図と共に右下パネル（ＶＩ）に示す。バー＝５０μｍ。略語：ｃｅ．ｂｏ．：細胞質体、ｄｅｎｄ．：樹状突起、ａｘ．：軸索。 ｈＮ−ＡＣｈＥのヒト胚発現を示す図である。１６（左）、２７（中央）および３４（右）週齢ヒト胚脳（ｂｒ．、上）および胸腺（ｔｈｙ．、下）からの切片におけるｈＥ１ｄ ｍＲＮＡのＦＩＳＨ検出である。右の棒グラフは、標識細胞（ｌａｂ．ｃｅ．）の発生を有する割合の増加を示している（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０００５、両側Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。 ｈＮ−ＡＣｈＥのヒト胚発現を示す図である。Ｔ細胞白血病におけるｈＥ１ｄ発現を示す図である。 ＡＣｈＥタンパク質組成および用いた抗体のエピトープ位置を示す図（Ｎ：Ｎ末端、ＳＰ：シグナルペプチド、Ｃｏｒｅ：ＡＣｈＥコアドメイン）である。３種類のオプションＣ末端を右に示す。 膜ｈＮ−ＡＣｈＥの造血発現を示す図である。ｈＮ−ＡＣｈＥ標識（紫）とイソタイプ対照（緑）との比較により、単球（Ｍｏｎ．）、顆粒球（Ｇｒａｎ．）、リンパ球（ｌｙｍｐ．）および血球前駆細胞（ｐｒｏｇ．）におけるより小さい程度でのその発現が示された図である。細胞の透過化の後（右）に増加は認められず、膜において発現することがわかった。略語：ｂｅｆ．Ｐｅｒｍｅ：透過化の前、ａｆｔ．Ｐｅｒｍｅ：透過化の後 細胞集団のＦＡＣＳ分離を示す図である。フローサイトメトリによりＣＤ４５検出対側方散布図を用いて４種類の細胞集団が識別されたことを示す図（Ｍ：単球、Ｇ：顆粒球、Ｐ：前駆細胞、Ｌ：リンパ球）である。 細胞集団のＦＡＣＳ分離を示す図である。認められたＣＤ＋４５細胞系統の透過化の前（−）および後（＋）の陽性（ｐｏｓ．）細胞の割合を示す図である。４種類の臍帯血標本の平均。 リンパ球の下位分類を示す図である。特異的マーカー（ＣＤ３４、幹細胞；ＩＬ７、初期リンパ球；ＣＤ３、成熟Ｔリンパ球；ＣＤ１９、成熟Ｂリンパ球）は、成熟Ｔリンパ球におけるｈＮ−ＡＣｈＥ発現の上昇を示している。 マウス５’選択的エキソンのストレスおよびグルココルチコイド関連調節を示す図である。 ３０分間の拘束ストレスの２時間後のニューロン特異的グルココルチコイド受容体（ＧＲ）ノックアウト（ＧＲ^{ＮｅｓＣｒｅ}）および野生型（ｗｔ）マウスの皮質におけるｍＥ１ｂ、ｍＥ１ｃ、ｍＥ１ｄ、ｍＡＣｈＥ−ＳおよびアクチンのＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。ＧＲ^{ＮｅｓＣｒｅ}ではストレスの後にｍＥ１ｂおよびｍＡＣｈＥ−Ｓがダウンレギュレートされたが、ｗｔマウスでは認められなかったことに注意すること。エキソンｍＥ１ｃは、ＧＲの存在（ｗｔ）または非存在（ＧＲ^{ＮｅｓＣｒｅ}）にかかわりなく、ストレスの後に過剰発現した。また、ｍＥ１ｄもストレスの後に過剰発現したが、ｗｔと比較してＧＲ^{ＮｅｓＣｒｅ}マウスにおいてわずかに検出されたにすぎず、そのグルココルチコイド依存性が立証された。アクチンｍＲＮＡを対照とした。定量化（アクチンレベルに対する）を右に示す（各群の３動物の平均）。星印は、対照との統計的に有意な差を示す。Ｎａ．＝無処置、ｓｔｒ．＝ストレス。 ｍＥ１ｅ（上）とｈＥ１ｄ（下）とのＤＮＡ配列相同性を示す図である。総類似度は７９％である。インフレームＡＴＧｓは着色されている。 Ｎ−ＡＣｈＥタンパク質を示す図である。ｍＮ−ＡＣｈＥ（ｍＥ１ｅ）（上）およびｈＮ−ＡＣｈＥ（ｈＥ１ｄ）（下）のアミノ酸配列を示す図である。同一アミノ酸は枠で囲み、関連アミノ酸は線で結んだ。疎水性アミノ酸は赤色であり、正に荷電したアミノ酸は青色である（アルギニンおよびリシン、紺青色；ヒスチジン、淡青色）。推定上のリン酸化部位は緑色であり、推定上のＮミリスチン酸化部位は暗黄色である。最後のメチオニンはエキソン２上の翻訳開始部位である（ＧＥＮＥＳＴＲＥＡＭを用いた解析、ｈｔｔｐ：／／ｖｅｇａ．ｉｇｈ．ｃｎｒｓ．ｆｒ／ｂｉｎ／ａｌｉｇｎ−ｇｕｅｓｓ．ｃｇｉ）。二次構造予測（ＧＯＲ４ソフトウェア、ｈｔｔｐ：／／ｎｐｓａ−ｐｂｉｌ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｓｅｃｐｒｅｄ＿ｇｏｒ４．ｐｌ）を各配列の上および下に示す（ｃ＝ランダムコイル、ｅ＝伸長鎖、ｈ＝αらせん）。ｈＮ−ＡＣｈＥのαらせんおよびβシートの欠如に注意すること。 Ｎ−ＡＣｈＥタンパク質のヒト脳領域における発現を示す図である。挿入図、左上：培養ヒト神経膠芽細胞腫細胞の抽出物を示す図。抗ｈＮ−ＡＣｈＥおよび抗コア−ＡＣｈＥ抗体（Ｎ１９、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の標識パターンの類似性に注意すること。中央：種々のヒト脳領域におけるｈＮ−ＡＣｈＥ。後頭皮質（ｏｘｃ）における顕著なｈＮ−ＡＣｈＥ発現ならびに海馬（ｈｉｐｐ）、前頭葉前部皮質（ＰＦＣ）、皮質、線条体（ｓｔｒ）および扁桃（ａｍｇ）における有意な標識に注意すること。非常に弱いバンドが小脳（ｃｅｒｅｂ）に認められた。 ＦＩＳＨ：ｈＥ１ｄ ｍＲＮＡプローブが成人ヒトＰＦＣにおけるニューロンの細胞体および軸索を標識することを示す図である。 検査した種々の脳領域の位置を示す図である。図６Ｃの説明における略語を参照のこと。 ５’および３’ＡＣｈＥ ｍＲＮＡ変異体およびそれらのタンパク質産物の予測される組合せ複雑度を示す図である。推定上のマウスＡＣＨＥ転写物のスプライスおよび調節パターンを示す図である。 ５’および３’ＡＣｈＥ ｍＲＮＡ変異体およびそれらのタンパク質産物の予測される組合せ複雑度を示す図である。推定上のマウスＡＣＨＥ転写物の予測されるプロモーター（ｐｒｏｍ．）を示す図である。 ５’および３’ＡＣｈＥ ｍＲＮＡ変異体およびそれらのタンパク質産物の予測される組合せ複雑度を示す図である。推定上のマウスＡＣＨＥ転写物の予測されるタンパク質産物を示す図である。 矢印は増強刺激を示す（ＧＣ＝グルココルチコイド）。二重に誘導された（ｄｏｕｂ．−ｉｎｄ．）変異体（ｖａｒ．、ｍＥ１ｃ−Ｒ、ｍＥ１ｄ−Ｒ）は、ＧＣｓおよびストレスに反応する５’および３’エキソンを含む。伸長Ｎ−ＡＣｈＥタンパク質は、それらのＮ末端に１つまたは複数の膜貫通ドメインを有していてよい。Ｓｔｒ．＝ストレス。 ＡＣｈＥ変異体のレベルおよび局在化を研究した主要な海馬領域を示すヒト海馬の概略図である。 略語：Ａｍｙｇ．：扁桃、Ｈｉｐｐ．Ｆｏｒｍ．：海馬形成、ｆｏｒｎ．＆ ｍａｍｍ．Ｂｏ．：脳弓および乳頭体、Ｓ．ｃ．ｐ．：Ｓｃｈａｆｆｅｒ副行路、Ｍ．ｆ．ｐ．：苔状線維経路、Ｄ．ｇ．：歯状回、Ｐ．ｐ．：貫通枝。 アルツハイマー病脳の歯状回ニューロンにおけるＡＣｈＥ発現のダウンレギュレーションを示す図である。ＡＣｈＥのコアドメインに対する抗体を用いた対照およびアルツハイマー病（ＡＤ）脳の免疫組織学的染色は歯状回ニューロンにおける総ＡＣｈＥレベルのかなりのダウンレギュレーションを示す図である。上−ＡＣｈＥタンパク質および抗体により認識される領域を表わす概略図である。 アルツハイマー病脳の歯状回ニューロンにおけるＡＣｈＥ発現のダウンレギュレーションを示す図である。図９Ａに示した結果の定量化を示すヒストグラムを示すグラフである。Ａｒｂ．ｕ．＝任意単位。 ＡＤ脳の歯状回におけるＡＣｈＥ−Ｓ転写物の発現の変化を示す図である。ＡＣｈＥ−Ｓ転写物に特異的なプローブを用いた対照（左）およびＡＤ（右）ヒト海馬の歯状回のＦＩＳＨ染色の顕微鏡写真である。上−ＡＣｈＥ遺伝子の概略図で、矢印はプローブの特異性を示す。 ＡＤ脳の歯状回におけるＡＣｈＥ−Ｒ転写物の発現の変化を示す図である。ＡＣｈＥ−Ｒ転写物に特異的なプローブを用いた対照（左）およびＡＤ（右）ヒト海馬の歯状回のＦＩＳＨ染色の顕微鏡写真である。 ＡＤ脳の歯状回におけるＡＣｈＥ−ＳおよびＡＣｈＥ−Ｒ転写物の発現の変化を示す図である。図１０Ａおよび１０Ｂに示した結果の定量化を示すヒストグラムを示すグラフである。（＊ｐ＜０．０１、＊＊Ｐ＜０．０５、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定） ｍＲＮＡ ｅｘｐ．＝ｍＲＮＡ発現 Ｎ−ＡＣｈＥがＡＤヒト脳の歯状回に発現することを示す図である。Ｅ１ｂに特異なプローブを用いた対照（左）およびＡＤ（右）ヒト海馬の歯状回のＦＩＳＨ染色の顕微鏡写真である。上−ＡＣｈＥ遺伝子の概略図で、矢印はプローブの特異性を示す。 Ｎ−ＡＣｈＥがＡＤヒト脳の海馬のＣＡ３ニューロンに発現することを示す図である。Ｅ１ｂに特異的なプローブを用いた対照およびＡＤヒト海馬のＣＡ３ニューロンのＦＩＳＨ染色の顕微鏡写真である。 Ｎ−ＡＣｈＥがＡＤヒト脳に発現することを示す図である。図１１Ａおよび１１Ｂに示した結果の定量化を示すヒストグラムを示すグラフである。 ＊Ｐ＜０．０１、直線は写真および挿入図におけるそれぞれ５０ｍｍおよび１０ｍｍを示す。ｍＲＮＡ ｅｘｐ．＝ｍＲＮＡ発現 ＡＤヒト脳の苔状線維系におけるＮ−ＡＣｈＥ−Ｓ変異体のアップレギュレーションを示す図である。新規のＮ’末端に特異的な抗体を用いた対照（ＣＴ）およびＡＤ脳の苔状線維系の免疫組織化学を示す図である。上−Ｎ−ＡＣｈＥタンパク質および抗体により認識される領域を表わす概略図。 ＡＤヒト脳の苔状線維系におけるＮ−ＡＣｈＥ−Ｓ変異体のアップレギュレーションを示す図である。Ｃ’末端に特異的な抗体を用いた対照（ＣＴ）およびＡＤ脳の苔状線維系の免疫組織化学を示す図である。下−１２Ａおよび１２Ｂに用いた抗体濃度（Ａｂ．Ｃｏｎｃ．）の低下の表示。 ＡＣｈＥ転写物がヒトＡＤ海馬において発現することを示す図である。 左：ＡＣｈＥ遺伝子の概略図。矢印はＲＴ−ＰＣＲ反応に用いたプライマーを表わす。 右：すべてのＡＣｈＥ転写物（ＡＣｈＥ−Ｅ１ｄ、ＡＣｈＥ−Ｒ、ＡＣｈＥ−Ｓ）の発現を確認する、ヒトＡＤ海馬のＲＴ−ＰＣＲのゲル電気泳動。Ｔ．ＡＣｈＥ＝総ＡＣｈＥ ＡＤ検体におけるＡＣｈＥ染色を示すヒト海馬の概略図である。 略語：ＮＥＴ：神経原線維濃縮体、Ｔ．ＡＣｈＥ ａｓｓｏｃ．ｗ．ＮＦＴｓ＋ｐｌａｑ．：ＮＥＴｓに関連する総ＡＣｈＥおよびプラーク、Ｍｆｐ：苔状線維経路 マイクロアレイにおけるプローブの全集団における遺伝子の各機能グループの分率を示すパイ図である。 この図はチップの組成が以下のとおりであることを示している。 １７％ｓｎＲＮＰｓ、 ８％ｈｎＲＮＰｓ、 ９％ＳＲおよびＳＲ関連、 ５％ヘリカーゼ（スプライセオソーム関連）、 ６％スプライセオソームアセンブリメディエータ（ｓｐｌｉｃ．ａｓｓ．ｍｅｄ．）、 ８％スプライシング因子リン酸化（Ｓｐｌｉｃ．ｆａｃ．ｐｈｏｓ．） ６％他のｍＲＮＡ処理（例えば、ポリアデニル化、輸出）、 １１％標的（選択的スプライシングを受ける遺伝子）、 ８％他のスプライセオソーム成分、 １６％選択的スプライシングを受けるアポトーシス関連遺伝子、 ５％他の遺伝子（ｏｔｈ．ｇｅ）、 １％未知の機能（ｕｎｋ．ｆｕｎ．）。 マイクロアレイ分析の結果−アレイ上の転写物の全集団を示す図である。対照対ＡＣｈＥ−Ｓ処理細胞における遺伝子発現を示すヒストグラムである。 マイクロアレイ分析の結果−アレイ上の転写物の全集団を示す図である。対照対ＡＣｈＥ−Ｒ処理細胞における遺伝子発現を示すヒストグラムである。 １６Ａおよび１６Ｂにおける結果の対数比を示すグラフである。 略語：ｃｏｎｔ．：対照、ｃｕｍ．ｄｉｓｔ．ｆｕｎｃ．：累積分布関数、ｒａｔ．：比 ヒストグラムでのマイクロアレイ分析の結果を示す図である。マイクロアレイの写真である。 ヒストグラムでのマイクロアレイ分析の結果を示す図である。ＡＣｈＥ−Ｒ対ＡＣｈＥ−Ｓ処理における標的遺伝子の転写物の比較を示す図である。 ヒストグラムでのマイクロアレイ分析の結果を示す図である。ＡＣｈＥ−Ｒ対ＡＣｈＥ−Ｓ処理におけるＳＲおよびＳＲ関連遺伝子の転写物の比較を示す図である。 ヒストグラムでのマイクロアレイ分析の結果を示す図である。ＡＣｈＥ−Ｒ対ＡＣｈＥ−Ｓ処理におけるハウスキーピング遺伝子（ＨＫＧ）の転写物の比較を示す図である。 ヒストグラムでのマイクロアレイ分析の結果を示す図である。ＡＣｈＥ−Ｒ対ＡＣｈＥ−Ｓ処理におけるｍＲＮＡ処理遺伝子の転写物の比較を示す図である。 ヒストグラムでのマイクロアレイ分析の結果を示す図である。ＡＣｈＥ−Ｒ対ＡＣｈＥ−Ｓ処理におけるスプライシング因子リン酸化遺伝子の転写物の比較を示す図である。 ヒストグラムでのマイクロアレイ分析の結果を示す図である。ＡＣｈＥ−Ｒ対ＡＣｈＥ−Ｓ処理におけるアポトーシス遺伝子の転写物の比較を示す図である。 ヒストグラムでのマイクロアレイ分析の結果を示す図である。ＡＣｈＥ−Ｒ対ＡＣｈＥ−Ｓ処理におけるスプライセオソーム成分遺伝子の転写物の比較を示す図である。 ヒストグラムでのマイクロアレイ分析の結果を示す図である。ＡＣｈＥ−Ｒ対ＡＣｈＥ−Ｓ処理における他のカテゴリーの遺伝子の転写物の比較を示す図である。

Claims (27)

1. 変異体５’領域を含むＡＣＨＥ遺伝子由来のｃＤＮＡ配列。
2. 前記ＡＣＨＥ遺伝子がマウスまたはヒト由来のものであってよい請求項１に記載のｃＤＮＡ配列。
3. その５’末端に配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０のいずれか１つならびにその機能類似体および誘導体により実質的に表わされるＡＣｈＥ変異体配列を含むｃＤＮＡ配列。
4. ＡＣＨＥ遺伝子由来の核酸配列によってコードされ、ＡＣｈＥの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含むペプチド。
5. 前記ＡＣＨＥ遺伝子がマウスまたはヒト由来のものであってよい請求項４に記載のペプチド。
6. 配列番号１１および１２のいずれか１つならびにその機能類似体および誘導体により表わされる請求項４に記載のペプチド。
7. ヒトＡＣＨＥ遺伝子由来であり、配列番号１２、１３および１４のいずれか１つならびにその機能類似体および誘導体により実質的に表わされる配列を含むペプチド。
8. マウスＡＣＨＥ遺伝子由来であり、配列番号１１ならびにその機能類似体および誘導体により表わされる配列を含むペプチド。
9. ヒトＡＣｈＥ膜貫通ドメイン由来であり、配列番号１３および１４のいずれか１つならびにその機能類似体および誘導体により実質的に表わされるペプチド。
10. 膜貫通ドメインを含むＡＣｈＥタンパク質。
11. 前記ＡＣｈＥが、それぞれ配列番号１５、１６および１７ならびにその機能類似体および誘導体により表わされる−Ｓ、−Ｒおよび−Ｅ型の１つである請求項１０に記載のＡＣｈＥタンパク質。
12. 少なくとも１つの制御エレメントに機能するように連結された配列番号１〜１０および３６〜３８により表わされる配列のいずれか１つを含む核酸コンストラクト。
13. 請求項１２に記載のコンストラクトまたは請求項１〜３のいずれかに記載の配列のいずれか１つで形質導入した、外因性配列を含む形質導入細胞。
14. ストレス、コリン作動性平衡およびアルツハイマー病などのアミロイド疾患の１つに対する、変異体５’領域を含むＡＣｈＥ ｍＲＮＡからなるマーカー。
15. 前記変異体５’領域が配列番号３、４および５の１つならびにその機能類似体および誘導体により本質的に表わされる請求項１４に記載のマーカー。
16. 前記マーカーがコルチゾール処理に対して反応せず、前記変異体５’領域が配列番号３ならびにその機能類似体および誘導体により本質的に表わされる請求項１４に記載のマーカー。
17. 前記マーカーがコルチゾール処理に対して反応し、前記変異体５’領域が配列番号４および５のいずれか１つならびにその機能類似体および誘導体により本質的に表わされる請求項１４に記載のマーカー。
18. Ｎ末端ＡｃｈＥ細胞内ドメインを認識する抗体。
19. 配列番号１３および１４のいずれか１つならびにそのいずれかの変異体、断片または誘導体により本質的に表わされるペプチドに対する抗体。
20. ＡＣｈＥ膜貫通ドメインを発現する細胞における細胞内シグナリングを誘導するための請求項１８および１９のいずれか一項に記載の抗体の使用。
21. ＡＣｈＥに対するリガンドとしての、請求項１８および１９のいずれか一項に記載の抗体の使用。
22. ＡＣｈＥの細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含む、コリン作動性シグナルに対するセンサー。
23. 前記ＡＣｈＥの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインが配列番号１１および１２のいずれか１つにより表わされる配列を含む請求項２２に記載のセンサー。
24. ストレスおよびコリン作動性不平衡のうちの１つのセンサーとしてのＡＣｈＥ膜貫通ドメインを発現する細胞の使用。
25. 配列番号１１および１２のうちの１つならびにそのいずれかの変異体、断片または誘導体により本質的に表わされる配列を含む、発現のレベルの低下がリンパ系分化の進行したステージを表わすリンパ系細胞系統の分化のマーカー。
26. Ｎ−ＡＣｈＥアイソフォームを認識する抗体を活性薬剤として含み、前記抗体が請求項１８および１９に記載される組成物。
27. 検出可能なマーカーで標識した請求項１８および１９のいずれか一項に記載の抗体またはそれを含む組成物を必要とする対象に投与し、撮像技術により海馬における前記抗体の存在を検出することを含むアルツハイマー病の診断の方法。

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