JPWO2006118313A1 - 新規ポリペプチドおよびその用途 - Google Patents
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Abstract
本発明は種々の有用なポリペプチドなどを提供するもので、特に、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、上記ポリペプチドの活性を促進する化合物またはその塩などは、腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群、高血圧などの予防・治療剤などとして利用することができる。また、上記ポリペプチドの活性を阻害する化合物またはその塩は、例えば蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング症候群などの予防・治療剤などとして有用である。さらに、配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドなどは、拒食症などの予防・治療剤、摂食(食欲)促進剤などとして利用することもできる。
Description
本発明は、新規ポリペプチドまたはその塩、これをコードするポリヌクレオチド、これらの用途等に関する。
VGFはニューロンおよび内分泌細胞に見られる分泌ポリペプチドである。vgf遺伝子は、元来、NGF処理時、ラットの褐色細胞腫PC12細胞株に速やかに誘導される遺伝子として単離された(Nat.Cell Biol.2,703−708(2000))。VGFは、神経細胞および神経内分泌細胞の中で合成され、有芯小胞(dense core vesicle)に輸送され、調節された分泌経路を介して分泌される(EMBO J.8,2217−2223(1989))。VGFの特異的除去(targeted ablation)により、VGFがエネルギー恒常性に関与することが報告されている(Neuron 23,537−548(1999))、(Mt.Sinai J.Med.70,93−100(2003))。さらに、ヒトおよびラットVGFのヌクレオチドおよびアミノ酸配列、ならびにVGFは代謝、長期記憶への関与などの生理活性を有することが報告されている(国際公開第2001/07074号パンフレット、国際公開第2001/07477号パンフレット、国際公開第2000/70042号パンフレット、国際公開第2001/22920号パンフレット、国際公開第2001/64835号パンフレット、国際公開第2001/74298号パンフレット、国際公開第2003/062395号パンフレット、国際公開第2004/030615号パンフレットおよび国際公開第2004/048938号パンフレット)。
また、ラットPC12細胞においてNGF刺激によってVGF遺伝子のmRNA発現量が上昇すること(Science 229(4711),393−395(1985))、VGFタンパク質がラットの視交叉上核において強く発現していること(J.Neurosci.9(12),4122−4137(1989))、ゴールデンハムスターの視交叉上核において照明点灯後3−9時間のVGF遺伝子のmRNA発現量が亢進することおよびVGFが概日リズムの制御に関与していること(J.Comp.Neurol.378(2),229−238(1997))、VGF遺伝子のホモ欠失体は体型が小さくなり、代謝が亢進し、過活動で不稔であることおよび野生型マウスにおいて絶食によって視床下部の弓状核におけるVGF遺伝子のmRNAの発現が亢進されることおよびVGFが摂食およびエネルギー代謝に関与する可能性があること(Neuron 23(3),537−548(1999))が報告されている。
さらに、ウシ下垂体後葉からVGFの部分ペプチドを単離したこと(Endocrinology 135(6),2742−2748(1994))、ラット脳抽出物からVGFの部分ペプチドを単離したこと(J.Neurochem.81(3),565−574(2002))が報告されている。また、VGFのC末側の部分ペプチドが、雄性ラットの視床下部室傍核への投与によって濃度依存的に勃起を促進したこと(Eur.J.Neurosci.20(11),3035−3040(2004))が報告されている。
また、ラットPC12細胞においてNGF刺激によってVGF遺伝子のmRNA発現量が上昇すること(Science 229(4711),393−395(1985))、VGFタンパク質がラットの視交叉上核において強く発現していること(J.Neurosci.9(12),4122−4137(1989))、ゴールデンハムスターの視交叉上核において照明点灯後3−9時間のVGF遺伝子のmRNA発現量が亢進することおよびVGFが概日リズムの制御に関与していること(J.Comp.Neurol.378(2),229−238(1997))、VGF遺伝子のホモ欠失体は体型が小さくなり、代謝が亢進し、過活動で不稔であることおよび野生型マウスにおいて絶食によって視床下部の弓状核におけるVGF遺伝子のmRNAの発現が亢進されることおよびVGFが摂食およびエネルギー代謝に関与する可能性があること(Neuron 23(3),537−548(1999))が報告されている。
さらに、ウシ下垂体後葉からVGFの部分ペプチドを単離したこと(Endocrinology 135(6),2742−2748(1994))、ラット脳抽出物からVGFの部分ペプチドを単離したこと(J.Neurochem.81(3),565−574(2002))が報告されている。また、VGFのC末側の部分ペプチドが、雄性ラットの視床下部室傍核への投与によって濃度依存的に勃起を促進したこと(Eur.J.Neurosci.20(11),3035−3040(2004))が報告されている。
現在、尿排出障害、高血圧、拒食症、蓄尿障害、尿崩症、肥満症などの予防・治療剤は種々知られているが、より優れたこれら疾患の予防・治療剤が望まれている。
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドがバソプレシン分泌抑制活性を有することを見出した。さらに、本発明者らは、配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドがバソプレシン分泌抑制活性に加え、摂食促進活性を有することを見出した。これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
(1)配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド(但し、配列番号:1、配列番号:2または配列番号:3で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを除く)、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩;
(2)配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなる上記(1)記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩;
(3)配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列からなる上記(1)記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩;
(3a)配列番号:4で表されるアミノ酸配列からなる上記(1)記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩;
(3b)配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列からなる上記(1)記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩;
(4)上記(1)記載のポリペプチドの部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩;
(5)配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド(但し、配列番号:1、配列番号:2または配列番号:3で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを除く)、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩;
(6)配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなる上記(5)記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩;
(7)配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列からなる上記(5)記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩;
(7a)配列番号:7で表されるアミノ酸配列からなる上記(5)記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩;
(7b)配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列からなる上記(5)記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩;
(8)上記(5)記載のポリペプチドの部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩;
(9)上記(1)記載のポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(10)DNAである上記(9)記載のポリヌクレオチド;
(11)配列番号:12または配列番号:13で表される塩基配列を含有する上記(10)記載のDNA;
(11a)配列番号:12、配列番号:13または配列番号:17で表される塩基配列を含有する上記(10)記載のDNA;
(11b)配列番号:12で表される塩基配列を含有する上記(10)記載のDNA;
(11c)配列番号:13または配列番号:17で表される塩基配列を含有する上記(10)記載のDNA;
(12)配列番号:12または配列番号:13で表される塩基配列からなる上記(10)記載のDNA;
(12a)配列番号:12、配列番号:13または配列番号:17で表される塩基配列からなる上記(10)記載のDNA;
(12b)配列番号:12で表される塩基配列からなる上記(10)記載のDNA;
(12c)配列番号:13または配列番号:17で表される塩基配列からなる上記(10)記載のDNA;
(13)上記(5)記載のポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(14)DNAである上記(13)記載のポリヌクレオチド;
(15)配列番号:14または配列番号:15で表される塩基配列を含有する上記(14)記載のDNA;
(15a)配列番号:14、配列番号:15または配列番号:18で表される塩基配列を含有する上記(14)記載のDNA;
(15b)配列番号:14で表される塩基配列を含有する上記(14)記載のDNA;
(15c)配列番号:15または配列番号:18で表される塩基配列を含有する上記(14)記載のDNA;
(16)配列番号:14または配列番号:15で表される塩基配列からなる上記(14)記載のDNA;
(16a)配列番号:14、配列番号:15または配列番号:18で表される塩基配列からなる上記(14)記載のDNA;
(16b)配列番号:14で表される塩基配列からなる上記(14)記載のDNA;
(16c)配列番号:15または配列番号:18で表される塩基配列からなる上記(14)記載のDNA;
(17)上記(9)または(13)記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター;
(18)上記(17)記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体;
(19)上記(18)記載の形質転換体を培養し、上記(1)または(5)記載のポリペプチドまたはその部分ペプチドを生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする上記(1)または(5)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩の製造法;
(20)上記(1)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体;
(21)上記(20)記載の抗体を用いることを特徴とする上記(1)記載のポリペプチドの定量方法;
(22)上記(21)記載の定量方法を用いることを特徴とする上記(1)記載のポリペプチドの機能が関連する疾患の診断法;
(23)上記(5)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体;
(24)上記(23)記載の抗体を用いることを特徴とする上記(5)記載のポリペプチドの定量方法;
(25)上記(24)記載の定量方法を用いることを特徴とする上記(5)記載のポリペプチドの機能が関連する疾患の診断法;
(26)上記(9)記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチド;
(27)上記(13)記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチド;
(28)上記(1)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする、該ポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法;
(29)上記(1)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有することを特徴とする、該ポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット;
(30)上記(5)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする、該ポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法;
(31)上記(5)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有することを特徴とする、該ポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット;
(32)上記(1)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる医薬;
(33)上記(9)記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬;
(34)上記(1)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる医薬;
(35)腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群または高血圧の予防・治療剤である上記(32)〜(34)のいずれかに記載の医薬;
(36)上記(1)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる医薬;
(37)上記(20)記載の抗体を含有してなる医薬;
(38)上記(26)記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医薬;
(39)蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症またはクッシング症候群の予防・治療剤である上記(36)〜(38)のいずれかに記載の医薬;
(40)上記(5)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる医薬;
(41)上記(13)記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬;
(42)上記(5)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる医薬;
(43)腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群、高血圧もしくは拒食症の予防・治療剤または摂食促進剤である上記(40)〜(42)のいずれかに記載の医薬;
(44)上記(5)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる医薬;
(45)上記(23)記載の抗体を含有してなる医薬;
(46)上記(27)記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医薬;
(47)蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング症候群、肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤である上記(44)〜(46)のいずれかに記載の医薬;
(48)外来性の、上記(9)または上記(13)記載のポリヌクレオチドを有する非ヒトトランスジェニック動物;
(49)上記(1)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進することを特徴とする腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群または高血圧の予防・治療方法;
(50)上記(1)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、上記(9)記載のポリヌクレオチド、または該ポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に対して投与することを特徴とする腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群または高血圧の予防・治療方法;
(51)腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群または高血圧の予防・治療剤の製造のための上記(1)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、上記(9)記載のポリヌクレオチド、または該ポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の使用;
(52)上記(1)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害することを特徴とする蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症またはクッシング症候群の予防・治療方法;
(53)上記(1)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、上記(20)記載の抗体または上記(26)記載のアンチセンスポリヌクレオチドの有効量を哺乳動物に対して投与することを特徴とする蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症またはクッシング症候群の予防・治療方法;
(54)蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症またはクッシング症候群の予防・治療剤を製造するための、上記(1)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、上記(20)記載の抗体または上記(26)記載のアンチセンスポリヌクレオチドの使用;
(55)上記(5)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進することを特徴とする腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群、高血圧もしくは拒食症の予防・治療方法または摂食促進方法;
(56)上記(5)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、上記(13)記載のポリヌクレオチド、または該ポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に対して投与することを特徴とする腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群、高血圧もしくは拒食症の予防・治療方法または摂食促進方法;
(57)腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群、高血圧もしくは拒食症の予防・治療剤または摂食促進剤の製造のための上記(5)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、上記(13)記載のポリヌクレオチド、または該ポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の使用;
(58)上記(5)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害することを特徴とする蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング症候群、肥満症または摂食亢進症の予防・治療方法;
(59)上記(5)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、上記(23)記載の抗体または上記(27)記載のアンチセンスポリヌクレオチドの有効量を哺乳動物に対して投与することを特徴とする蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング症候群、肥満症または摂食亢進症の予防・治療方法;
(60)蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング症候群、肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤を製造するための、上記(5)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、上記(23)記載の抗体または上記(27)記載のアンチセンスポリヌクレオチドの使用
等を提供する。
さらに、本発明は、
(I)配列番号:4、配列番号:5、または配列番号:6で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表わされるアミノ酸配列と約50%以上、好ましくは約60%以上、さらに好ましくは約70%以上、より好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアミノ酸配列である上記(1)記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩;
(II)配列番号:4、配列番号:5、または配列番号:6で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、(i)配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列中の1または2個以上(例えば1〜15個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(ii)配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列に1または2個以上(例えば1〜15個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、(iii)配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列中の1または2個以上(例えば1〜15個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、(iv)配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列中の1または2個以上(例えば1〜15個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、または(v)それらを組み合わせたアミノ酸配列である上記(1)記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩;
(III)上記(9)記載のポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;
(IV)配列番号:7、配列番号:8、または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表わされるアミノ酸配列と約50%以上、好ましくは約60%以上、さらに好ましくは約70%以上、より好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアミノ酸配列である上記(5)記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩;
(v)配列番号:7、配列番号:8、または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、(i)配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列中の1または2個以上(例えば1〜15個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(ii)配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列に1または2個以上(例えば1〜15個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、(iii)配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列中の1または2個以上(例えば1〜15個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、(iv)配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列中の1または2個以上(例えば1〜15個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、または(v)それらを組み合わせたアミノ酸配列である上記(5)記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩;および
(VI)上記(13)記載のポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドから選択されるポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルもしくはその塩またはポリヌクレオチドであって、かつ、バソプレシン分泌抑制活性もしくは摂食促進活性など本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルもしくはその塩またはポリヌクレオチドなども提供する。
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドがバソプレシン分泌抑制活性を有することを見出した。さらに、本発明者らは、配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドがバソプレシン分泌抑制活性に加え、摂食促進活性を有することを見出した。これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
(1)配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド(但し、配列番号:1、配列番号:2または配列番号:3で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを除く)、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩;
(2)配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなる上記(1)記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩;
(3)配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列からなる上記(1)記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩;
(3a)配列番号:4で表されるアミノ酸配列からなる上記(1)記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩;
(3b)配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列からなる上記(1)記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩;
(4)上記(1)記載のポリペプチドの部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩;
(5)配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド(但し、配列番号:1、配列番号:2または配列番号:3で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを除く)、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩;
(6)配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなる上記(5)記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩;
(7)配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列からなる上記(5)記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩;
(7a)配列番号:7で表されるアミノ酸配列からなる上記(5)記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩;
(7b)配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列からなる上記(5)記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩;
(8)上記(5)記載のポリペプチドの部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩;
(9)上記(1)記載のポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(10)DNAである上記(9)記載のポリヌクレオチド;
(11)配列番号:12または配列番号:13で表される塩基配列を含有する上記(10)記載のDNA;
(11a)配列番号:12、配列番号:13または配列番号:17で表される塩基配列を含有する上記(10)記載のDNA;
(11b)配列番号:12で表される塩基配列を含有する上記(10)記載のDNA;
(11c)配列番号:13または配列番号:17で表される塩基配列を含有する上記(10)記載のDNA;
(12)配列番号:12または配列番号:13で表される塩基配列からなる上記(10)記載のDNA;
(12a)配列番号:12、配列番号:13または配列番号:17で表される塩基配列からなる上記(10)記載のDNA;
(12b)配列番号:12で表される塩基配列からなる上記(10)記載のDNA;
(12c)配列番号:13または配列番号:17で表される塩基配列からなる上記(10)記載のDNA;
(13)上記(5)記載のポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド;
(14)DNAである上記(13)記載のポリヌクレオチド;
(15)配列番号:14または配列番号:15で表される塩基配列を含有する上記(14)記載のDNA;
(15a)配列番号:14、配列番号:15または配列番号:18で表される塩基配列を含有する上記(14)記載のDNA;
(15b)配列番号:14で表される塩基配列を含有する上記(14)記載のDNA;
(15c)配列番号:15または配列番号:18で表される塩基配列を含有する上記(14)記載のDNA;
(16)配列番号:14または配列番号:15で表される塩基配列からなる上記(14)記載のDNA;
(16a)配列番号:14、配列番号:15または配列番号:18で表される塩基配列からなる上記(14)記載のDNA;
(16b)配列番号:14で表される塩基配列からなる上記(14)記載のDNA;
(16c)配列番号:15または配列番号:18で表される塩基配列からなる上記(14)記載のDNA;
(17)上記(9)または(13)記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター;
(18)上記(17)記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体;
(19)上記(18)記載の形質転換体を培養し、上記(1)または(5)記載のポリペプチドまたはその部分ペプチドを生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする上記(1)または(5)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩の製造法;
(20)上記(1)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体;
(21)上記(20)記載の抗体を用いることを特徴とする上記(1)記載のポリペプチドの定量方法;
(22)上記(21)記載の定量方法を用いることを特徴とする上記(1)記載のポリペプチドの機能が関連する疾患の診断法;
(23)上記(5)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体;
(24)上記(23)記載の抗体を用いることを特徴とする上記(5)記載のポリペプチドの定量方法;
(25)上記(24)記載の定量方法を用いることを特徴とする上記(5)記載のポリペプチドの機能が関連する疾患の診断法;
(26)上記(9)記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチド;
(27)上記(13)記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチド;
(28)上記(1)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする、該ポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法;
(29)上記(1)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有することを特徴とする、該ポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット;
(30)上記(5)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする、該ポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法;
(31)上記(5)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有することを特徴とする、該ポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット;
(32)上記(1)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる医薬;
(33)上記(9)記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬;
(34)上記(1)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる医薬;
(35)腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群または高血圧の予防・治療剤である上記(32)〜(34)のいずれかに記載の医薬;
(36)上記(1)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる医薬;
(37)上記(20)記載の抗体を含有してなる医薬;
(38)上記(26)記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医薬;
(39)蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症またはクッシング症候群の予防・治療剤である上記(36)〜(38)のいずれかに記載の医薬;
(40)上記(5)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる医薬;
(41)上記(13)記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬;
(42)上記(5)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる医薬;
(43)腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群、高血圧もしくは拒食症の予防・治療剤または摂食促進剤である上記(40)〜(42)のいずれかに記載の医薬;
(44)上記(5)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる医薬;
(45)上記(23)記載の抗体を含有してなる医薬;
(46)上記(27)記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医薬;
(47)蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング症候群、肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤である上記(44)〜(46)のいずれかに記載の医薬;
(48)外来性の、上記(9)または上記(13)記載のポリヌクレオチドを有する非ヒトトランスジェニック動物;
(49)上記(1)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進することを特徴とする腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群または高血圧の予防・治療方法;
(50)上記(1)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、上記(9)記載のポリヌクレオチド、または該ポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に対して投与することを特徴とする腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群または高血圧の予防・治療方法;
(51)腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群または高血圧の予防・治療剤の製造のための上記(1)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、上記(9)記載のポリヌクレオチド、または該ポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の使用;
(52)上記(1)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害することを特徴とする蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症またはクッシング症候群の予防・治療方法;
(53)上記(1)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、上記(20)記載の抗体または上記(26)記載のアンチセンスポリヌクレオチドの有効量を哺乳動物に対して投与することを特徴とする蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症またはクッシング症候群の予防・治療方法;
(54)蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症またはクッシング症候群の予防・治療剤を製造するための、上記(1)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、上記(20)記載の抗体または上記(26)記載のアンチセンスポリヌクレオチドの使用;
(55)上記(5)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進することを特徴とする腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群、高血圧もしくは拒食症の予防・治療方法または摂食促進方法;
(56)上記(5)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、上記(13)記載のポリヌクレオチド、または該ポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に対して投与することを特徴とする腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群、高血圧もしくは拒食症の予防・治療方法または摂食促進方法;
(57)腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群、高血圧もしくは拒食症の予防・治療剤または摂食促進剤の製造のための上記(5)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、上記(13)記載のポリヌクレオチド、または該ポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の使用;
(58)上記(5)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害することを特徴とする蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング症候群、肥満症または摂食亢進症の予防・治療方法;
(59)上記(5)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、上記(23)記載の抗体または上記(27)記載のアンチセンスポリヌクレオチドの有効量を哺乳動物に対して投与することを特徴とする蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング症候群、肥満症または摂食亢進症の予防・治療方法;
(60)蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング症候群、肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤を製造するための、上記(5)記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、上記(23)記載の抗体または上記(27)記載のアンチセンスポリヌクレオチドの使用
等を提供する。
さらに、本発明は、
(I)配列番号:4、配列番号:5、または配列番号:6で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表わされるアミノ酸配列と約50%以上、好ましくは約60%以上、さらに好ましくは約70%以上、より好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアミノ酸配列である上記(1)記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩;
(II)配列番号:4、配列番号:5、または配列番号:6で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、(i)配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列中の1または2個以上(例えば1〜15個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(ii)配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列に1または2個以上(例えば1〜15個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、(iii)配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列中の1または2個以上(例えば1〜15個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、(iv)配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列中の1または2個以上(例えば1〜15個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、または(v)それらを組み合わせたアミノ酸配列である上記(1)記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩;
(III)上記(9)記載のポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド;
(IV)配列番号:7、配列番号:8、または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表わされるアミノ酸配列と約50%以上、好ましくは約60%以上、さらに好ましくは約70%以上、より好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアミノ酸配列である上記(5)記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩;
(v)配列番号:7、配列番号:8、または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、(i)配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列中の1または2個以上(例えば1〜15個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(ii)配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列に1または2個以上(例えば1〜15個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、(iii)配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列中の1または2個以上(例えば1〜15個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、(iv)配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列中の1または2個以上(例えば1〜15個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、または(v)それらを組み合わせたアミノ酸配列である上記(5)記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩;および
(VI)上記(13)記載のポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドから選択されるポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルもしくはその塩またはポリヌクレオチドであって、かつ、バソプレシン分泌抑制活性もしくは摂食促進活性など本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルもしくはその塩またはポリヌクレオチドなども提供する。
図1は、NERPの内因的存在を示す図である。図中、aからdは、それぞれヒト血漿(a)、ラット視床下部(b)、ラット下垂体前葉(c)およびラット下垂体後葉(d)における免疫反応性NERP−1(白丸)およびNERP−2(黒丸)のRP−HPLCによる解析結果を示す。矢印1と矢印2は、それぞれ合成NERP−1および合成NERP−2の溶出位置を示す。
図2は、ラット内分泌組織におけるNERP免疫反応性細胞の局在を示す図である。
図3は、SONにおけるNERP1(赤)およびNERP−2(赤)とAVP(緑)およびオキシトシン(緑)との共局在を示す図である。目盛は50μmを示す。挿入された図は、ラットSONニューロンにおけるNERPの代表的な免疫電子顕微鏡写真であり、SONにおけるNERP(10nmの金粒子、赤の矢印)とAVPおよびオキシトニン(5nm金粒子、緑の矢印)の共局在を示す。目盛は1μmを示す。
図4は、PVN(矢印)およびSON(矢先印)における48時間絶水によるVGF遺伝子発現の増加を示す図である。
図5は、PVNおよびSONにおけるフィルムオートラジオグラフィー(図4)のデンシトメトリーによる定量的密度解析の結果を示す図である。*はP<0.001(対照群と比較)を示す。
図6は、in vivoでのNERPのAVP分泌に対する作用を示す図である。*はP<0.05、**はP<0.01を示す。
図7は、in vitroでのPVNおよびSONの静的培養からのAVP分泌に対するNERPの作用を示す図である。黒、白および斜線は、各々NERP−1、AT−IIおよびKClの投与期間を示す。*はP<0.05、**はP<0.01を示す。
図8は、in vitroでの下垂体後葉の静的培養からのAVP分泌に対するNERP−1の作用を示す図である。黒、白および斜線は、各々NERP−1、AT−IIおよびKClの投与期間を示す。*はp<0.05、**はp<0.01を示す。
図9は、in vitroでの切片試料における、NERP−1に反応したIPSC周波数の増加を示す図である。時間1、2、3から得られる、NERP−2を適用する前、適用している間および適用した後における典型的な自然発生するIPSCを時間軸において拡大したものを四角に囲んで示す。
図10は、SONニューロンにおけるIPSCおよびEPSCの周波数に対するNERP−1の作用を示す図である。*はP<0.05(対照群と比較)を示す。
図11は、NERP−1で誘導されたIPSCの増強に対するテトロドトキシン(TTX、10−6M)の作用を示す図である。TTXは、NERP−1投与5分後に添加された。
図12は、NERP−1で誘導されたIPSCの増強に対するヘモグロビン(Hb、10−6M)の作用を示す図である。HbはNERP−1投与の5分後に添加された。
図13は、NERP−1(グレー)、NERP−2(黒)、およびNERP−2−Gly(網掛け)のICV投与を受けた自由摂食ラットの摂食を示す図である。*はP<0.05、**はP<0.001を示す。
図14は、視床下部外側野におけるNERP−2(赤)およびオレキシン(緑)またはMCH(緑)の免疫組織化学的二重染色の結果を示す図である。fxは、脳弓(fornix)を示す。棒は、100μmを示す。NERP−2とオレキシンの共染色は黄色で示されている(中央)。
図15は、NERP−2で誘導されたラットの摂食に対する抗オレキシン−A IgG(0.25μg)と抗オレキシン−B IgG(0.25μg/10μl)または抗MCH IgG(0.5μg/10μl)の作用を示す図である。*はP<0.01を示す。
図16は、NERP−2(1nmol/2μl)またはMCH(1nmol/2μl)のICV投与を受けたオレキシン・ノックアウトマウスおよび野生型の同腹子の1時間の摂食を示す図である。*はP<0.05を示す。
図17は、NERP−2(1nmol)のICV投与を受けたオレキシン・ノックアウトマウスおよび野生型の同腹子の自発運動を示す図である。*はP<0.01を示す。
図2は、ラット内分泌組織におけるNERP免疫反応性細胞の局在を示す図である。
図3は、SONにおけるNERP1(赤)およびNERP−2(赤)とAVP(緑)およびオキシトシン(緑)との共局在を示す図である。目盛は50μmを示す。挿入された図は、ラットSONニューロンにおけるNERPの代表的な免疫電子顕微鏡写真であり、SONにおけるNERP(10nmの金粒子、赤の矢印)とAVPおよびオキシトニン(5nm金粒子、緑の矢印)の共局在を示す。目盛は1μmを示す。
図4は、PVN(矢印)およびSON(矢先印)における48時間絶水によるVGF遺伝子発現の増加を示す図である。
図5は、PVNおよびSONにおけるフィルムオートラジオグラフィー(図4)のデンシトメトリーによる定量的密度解析の結果を示す図である。*はP<0.001(対照群と比較)を示す。
図6は、in vivoでのNERPのAVP分泌に対する作用を示す図である。*はP<0.05、**はP<0.01を示す。
図7は、in vitroでのPVNおよびSONの静的培養からのAVP分泌に対するNERPの作用を示す図である。黒、白および斜線は、各々NERP−1、AT−IIおよびKClの投与期間を示す。*はP<0.05、**はP<0.01を示す。
図8は、in vitroでの下垂体後葉の静的培養からのAVP分泌に対するNERP−1の作用を示す図である。黒、白および斜線は、各々NERP−1、AT−IIおよびKClの投与期間を示す。*はp<0.05、**はp<0.01を示す。
図9は、in vitroでの切片試料における、NERP−1に反応したIPSC周波数の増加を示す図である。時間1、2、3から得られる、NERP−2を適用する前、適用している間および適用した後における典型的な自然発生するIPSCを時間軸において拡大したものを四角に囲んで示す。
図10は、SONニューロンにおけるIPSCおよびEPSCの周波数に対するNERP−1の作用を示す図である。*はP<0.05(対照群と比較)を示す。
図11は、NERP−1で誘導されたIPSCの増強に対するテトロドトキシン(TTX、10−6M)の作用を示す図である。TTXは、NERP−1投与5分後に添加された。
図12は、NERP−1で誘導されたIPSCの増強に対するヘモグロビン(Hb、10−6M)の作用を示す図である。HbはNERP−1投与の5分後に添加された。
図13は、NERP−1(グレー)、NERP−2(黒)、およびNERP−2−Gly(網掛け)のICV投与を受けた自由摂食ラットの摂食を示す図である。*はP<0.05、**はP<0.001を示す。
図14は、視床下部外側野におけるNERP−2(赤)およびオレキシン(緑)またはMCH(緑)の免疫組織化学的二重染色の結果を示す図である。fxは、脳弓(fornix)を示す。棒は、100μmを示す。NERP−2とオレキシンの共染色は黄色で示されている(中央)。
図15は、NERP−2で誘導されたラットの摂食に対する抗オレキシン−A IgG(0.25μg)と抗オレキシン−B IgG(0.25μg/10μl)または抗MCH IgG(0.5μg/10μl)の作用を示す図である。*はP<0.01を示す。
図16は、NERP−2(1nmol/2μl)またはMCH(1nmol/2μl)のICV投与を受けたオレキシン・ノックアウトマウスおよび野生型の同腹子の1時間の摂食を示す図である。*はP<0.05を示す。
図17は、NERP−2(1nmol)のICV投与を受けたオレキシン・ノックアウトマウスおよび野生型の同腹子の自発運動を示す図である。*はP<0.01を示す。
本明細書中、配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を、「NERP−1」と略称することがある。また、配列番号:7、配列番号:8、または配列番号:9で表されるアミノ酸配列を有するポリペチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を、「NERP−2」と略称することがある。
配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド(以下、「本発明のポリペプチドA」と略称する場合がある)および配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド(以下、「本発明のポリペプチドB」と略称する場合がある)は、例えば、ヒト、哺乳動物(例えば、モルモット、ラット、マウス、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル、イヌ)などのあらゆる細胞(例えば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、膵臓ランゲルハンス島、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞(例、マクロファージ、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球)、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など)や血球系の細胞、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位(例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質)、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管(例、大腸、小腸)、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するポリペプチドであってもよく、合成ペプチドであってもよい。
配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表わされるアミノ酸配列と約50%以上、好ましくは約60%以上、さらに好ましくは約70%以上、より好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用いて計算することができる。
配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドとしては、例えば、前記の配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドなどが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、本発明のポリペプチドの有する活性、例えば、バソプレシン分泌抑制活性、レセプターとの結合活性、レセプター発現細胞に対する細胞刺激活性(例、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ca2+遊離、細胞内cAMP生成、細胞内cAMP生成抑制、細胞内cGMP生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、c−fosの活性化、pHの低下、GTPγS結合活性、cAMP依存性プロテインキナーゼの活性化、cGMP依存性プロテインキナーゼの活性化、リン脂質依存性プロテインキナーゼの活性化、またはマイトジェン活性化タンパク質リン酸化酵素(MAPキナーゼ)の活性化などを促進する活性など)、前述の疾患の予防・治療活性などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的(例、生理学的に、または薬理学的に)に同質であることを示す。したがって、バソプレシン分泌抑制活性、レセプターとの結合活性、レセプター発現細胞に対する細胞刺激活性または疾患の予防・治療活性などの活性が同等(例、約0.01〜100倍、好ましくは約0.5〜20倍、より好ましくは約0.5〜2倍)であることが好ましいが、これらの活性の程度やポリペプチドの分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
バソプレシン分泌抑制活性、レセプターとの結合活性、レセプター発現細胞に対する細胞刺激活性または疾患の予防・治療活性などの活性の測定は、公知の方法に準じて行なうことができる。例えば、バソプレシン分泌抑制活性については、後述の実施例3に記載の方法などに従って測定することができる。
また、本発明のポリペプチドAとしては、(i)配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列中の1または2個以上(例えば1〜15個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(ii)配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列に1または2個以上(例えば1〜15個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、(iii)配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列中の1または2個以上(例えば1〜15個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、(iv)配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列中の1または2個以上(例えば1〜15個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、または(v)それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するポリペプチドなども用いられる。
本発明のポリペプチドAの具体例としては、配列番号:4で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、配列番号:5で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、配列番号:6で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩などがあげられる。
本発明のポリペプチドAの部分ペプチドとしては、本発明のポリペプチドAと実質的に同質の活性を有していればよく、特に制限されない。該部分ペプチドのアミノ酸の数は、本発明のポリペプチドAの構成アミノ酸配列のうち少なくとも5個以上、好ましくは10個以上、好ましくは15個以上、好ましくは20個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどがあげられる。
ここで、「実質的に同質の活性」とは、上記と同意義を示す。「実質的に同質の活性」の測定は上記と同様に行なうことができる。
該部分ペプチドとしては、(i)上記アミノ酸配列中の1または2個以上(好ましくは数個(1〜4個))のアミノ酸が欠失し、(ii)上記アミノ酸配列に1または2個以上(好ましくは、1〜15個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸が付加し、または(iii)上記アミノ酸配列中の1または2個以上(好ましくは数個(1〜4個))のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
該部分ペプチドの具体例としては、配列番号:4で表されるアミノ酸配列において、例えば第10番目〜第26番目のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号:5で表されるアミノ酸配列において、例えば第10番目〜第25番目のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号:6で表されるアミノ酸配列において、例えば第10番目〜第25番目のアミノ酸配列を有するペプチドなどがあげられる。なかでも、好ましくは、配列番号:4で表されるアミノ酸配列において、第12番目〜第26番目、第13番目〜第26番目、第14番目〜第26番目、第15番目〜第26番目、第16番目〜第26番目、第17番目〜第26番目、第18番目〜第26番目、第19番目〜第26番目、第20番目〜第26番目、第21番目〜第26番目のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列において、第11番目〜第25番目、第12番目〜第25番目、第13番目〜第25番目、第14番目〜第25番目、第15番目〜第25番目、第16番目〜第25番目、第17番目〜第25番目、第18番目〜第25番目、第19番目〜第25番目、第20番目〜第25番目のアミノ酸配列を有するペプチドなどがあげられる。
以下、本発明のポリペプチドAとその部分ペプチドとをまとめて「本発明のポリペプチドA」と称することもある。
配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表わされるアミノ酸配列と約50%以上、好ましくは約60%以上、さらに好ましくは約70%以上、より好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用いて計算することができる。
配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドとしては、例えば、前記の配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドなどが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、本発明のポリペプチドの有する活性、例えば、バソプレシン分泌抑制活性、摂食促進活性、レセプターとの結合活性、レセプター発現細胞に対する細胞刺激活性(例、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ca2+遊離、細胞内cAMP生成、細胞内cAMP生成抑制、細胞内cGMP生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、c−fosの活性化、pHの低下、GTPγS結合活性、cAMP依存性プロテインキナーゼの活性化、cGMP依存性プロテインキナーゼの活性化、リン脂質依存性プロテインキナーゼの活性化、またはマイトジェン活性化タンパク質リン酸化酵素(MAPキナーゼ)の活性化などを促進する活性など)、前述の疾患の予防・治療活性などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的(例、生理学的に、または薬理学的に)に同質であることを示す。したがって、バソプレシン分泌抑制活性、摂食促進活性、レセプターとの結合活性、レセプター発現細胞に対する細胞刺激活性、疾患の予防・治療活性などの活性が同等(例、約0.01〜100倍、好ましくは約0.5〜20倍、より好ましくは約0.5〜2倍)であることが好ましいが、これらの活性の程度やポリペプチドの分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
バソプレシン分泌抑制活性、摂食促進活性、レセプターとの結合活性、レセプター発現細胞に対する細胞刺激活性、疾患の予防・治療活性などの活性の測定は、公知の方法に準じて行なうことができる。例えば、バソプレシン分泌抑制活性は、後述の実施例3に記載の方法などに従って測定することができ、摂食促進活性は、後述の実施例5に記載の方法などに従って測定することができる。
また、本発明のポリペプチドBとしては、(i)配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列中の1または2個以上(例えば1〜15個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(ii)配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列に1または2個以上(例えば1〜15個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、(iii)配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列中の1または2個以上(例えば1〜15個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、(iv)配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列中の1または2個以上(例えば1〜15個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、または(v)それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するポリペプチドなども用いられる。
本発明のポリペプチドBの具体例としては、配列番号:7で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号:8で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号:9で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドなどがあげられる。
本発明のポリペプチドBの部分ペプチドとしては、本発明のポリペプチドBと実質的に同質の活性を有していればよく、特に制限されない。該部分ペプチドのアミノ酸の数は、本発明のポリペプチドBの構成アミノ酸配列のうち少なくとも5個以上、好ましくは10個以上、好ましくは15個以上、好ましくは20個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどがあげられる。
ここで、「実質的に同質の活性」とは、上記と同意義を示す。「実質的に同質の活性」の測定は上記と同様に行なうことができる。
該部分ペプチドとしては、(i)上記アミノ酸配列中の1または2個以上(好ましくは数個(1〜4個))のアミノ酸が欠失し、(ii)上記アミノ酸配列に1または2個以上(好ましくは、1〜15個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸が付加し、または(iii)上記アミノ酸配列中の1または2個以上(好ましくは数個(1〜4個))のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
該部分ペプチドの具体例としては、配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列において、例えば第20番目〜第38番目のアミノ酸配列を有するペプチドなどがあげられる。なかでも、好ましくは、第24番目〜第38番目、第25番目〜第38番目、第26番目〜第38番目、第27番目〜第38番目、第28番目〜第38番目、第29番目〜第38番目、第30番目〜第38番目、第31番目〜第38番目、第32番目〜第38番目、第33番目〜第38番目のアミノ酸配列を有するペプチドなどがあげられる。
以下、本発明のポリペプチドBとその部分ペプチドとをまとめて本発明のポリペプチドBと称することがある。
さらに、「本発明のポリペプチドA」と「本発明のポリペプチドB」とを、まとめて「本発明のポリペプチド」と称することもある。
本発明のポリペプチドまたはその部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸(例、無機酸、有機酸)や塩基(例、アルカリ金属塩)などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば無機酸(例、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸)との塩、あるいは有機酸(例、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸)との塩などが用いられる。
本明細書におけるポリペプチドおよびタンパク質はペプチド標記の慣例に従って左端がN末端(アミノ末端)、右端がC末端(カルボキシル末端)である。例えば、配列番号:1で表されるアミノ酸配列などを含有するポリペプチドはC末端が通常カルボキシル基(−COOH)またはカルボキシレート(−COO−)であるが、C末端がアミド(−CONH2)またはエステル(−COOR)であってもよい。エステルのRとしては、例えばメチル、エチル、n−プロピル、イソプロピルもしくはn−ブチルなどのC1−6アルキル基、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのC3−8シクロアルキル基、フェニル、α−ナフチルなどのC6−12アリール基、ベンジル、フェネチル、ベンズヒドリルなどのフェニル−C1−2アルキル、もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−C1−2アルキルなどのC7−14アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などがあげられる。
本発明のポリペプチドとしてはC末端のカルボキシル基(−COOH)がアミド(−CONH2)であるものが好ましい。
具体的には、例えば、C末端のアミノ酸残基がアミド化されている配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドなどが好ましく用いられる。
本発明のポリペプチドがC末端以外にカルボキシル基(またはカルボキシレート)を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のポリペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したC末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明のポリペプチドには、上記したポリペプチドにおいて、N末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基(例えば、ホルミル基、アセチル基などのC2−6アルカノイル基などのC1−6アシル基など)で保護されているもの、N末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、N端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基(例、−OH、−SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など)が適当な保護基(例えば、ホルミル基、アセチル基などのC2−6アルカノイル基などのC1−6アシル基など)で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明のポリペプチドBとしては、N末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したものが好ましく、この場合、さらに上記したようにC末端のアミノ酸残基がアミドまたはエステルであってもよく、アミドであるのがより好ましい。
具体的には、例えば、N末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化されている配列番号:7、配列番号:8もしくは配列番号:9で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、C末端のアミノ酸残基がアミド化されており、かつN末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化されている配列番号:7、配列番号:8もしくは配列番号:9で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドなどが好ましく用いられる。また、本発明の部分ペプチドはC末端が、カルボキシル基(−COOH)、カルボキシレート(−COO−)、アミド(−CONH2)またはエステル(−COOR)であってもよい。本発明の部分ペプチドがC末端以外にカルボキシル基(またはカルボキシレート)を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したC末端のエステルなどが用いられる。
本発明の部分ペプチドとしてはC末端のカルボキシル基(−COOH)がアミド(−CONH2)であるものが好ましい。
さらに、本発明の部分ペプチドには、前記した本発明のポリペプチドと同様に、N末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、N末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、N端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明のポリペプチドまたはその塩は、前述したヒトや哺乳動物の細胞または組織から自体公知のペプチド・タンパク質の精製方法によって製造することもできるし、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするDNAを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド・タンパク質合成法またはこれに準じて製造することもできる。
本発明のポリペプチドまたはその塩をヒト、哺乳動物などの組織または細胞から製造する場合、ヒト、哺乳動物などの組織または細胞をホモジナイズした後、酸、有機溶媒などで抽出を行い、該抽出液を、塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
上記したように本発明のポリペプチドは、公知のポリペプチドの合成法に従って、あるいは本発明のポリペプチドを含有するポリペプチドを適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ポリペプチドの合成法としては、例えば固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明のポリペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のポリペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては例えば、以下の(1)〜(5)に記載された方法があげられる。
(1)M.BodanszkyおよびM.A.Ondetti、ペプチド シンセシス(Peptide Synthesis),Interscience Publishers,New York(1966年);
(2)SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide),Academic Press,New York(1965年);
(3)泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善(株)(1975年);
(4)矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座1、タンパク質の化学IV、205、(1977年);
(5)矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成 広川書店。
また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明のポリペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる本発明のポリペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
本発明のポリペプチドのアミド体は、アミド形成に適した市販のペプチド合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、4−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、4−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、PAM樹脂、4−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、4−(2’,4’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル)フェノキシ樹脂、4−(2’,4’−ジメトキシフェニル−Fmocアミノエチル)フェノキシ樹脂などをあげることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするペプチドの配列通りに、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からポリペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、必要に応じて高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のポリペプチドを取得する。
上記した保護されたアミノ酸の縮合に関しては、ポリペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としてはDCC、N,N’−ジイソプロピルカルボジイミド、N−エチル−N’−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドなどがあげられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤(例えば、HOBT、HOOBTなど)とともに保護されたアミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはHOBTエステルあるいはHOOBTエステルとしてあらかじめ保護されたアミノ酸の活性化を行ったのちに樹脂に添加することができる。保護されたアミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ポリペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。たとえばN,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド、N−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジンなどの三級アミン類、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−20℃〜50℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常1.5ないし4倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化して、後の反応に影響を及ぼさないようにすることができる。
原料アミノ酸のアミノ基の保護基としては、たとえば、Z、Boc、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、4−メトキシベンジルオキシカルボニル、Cl−Z、Br−Z、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、2−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Fmocなどがあげられる。カルボキシル基の保護基としては、たとえばRとして上記したC1−6アルキル基、C3−8シクロアルキル基、C7−14アラルキル基の他、2−アダマンチル、4−ニトロベンジル、4−メトキシベンジル、4−クロロベンジル、フェナシル基およびベンジルオキシカルボニルヒドラジド、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド、トリチルヒドラジドなどがあげられる。
セリンおよびスレオニンの水酸基は、たとえばエステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては例えばアセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭素から誘導される基などがあげられる。また、エーテル化に適する基としては、たとえばベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ターシャリーブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、たとえばBzl、Cl2−Bzl、2−ニトロベンジル、Br−Z、ターシャリーブチルなどがあげられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、Tos、4−メトキシ−2,3,6−トリメチルベンゼンスルホニル、DNP、ベンジルオキシメチル、Bum、Boc、Trt、Fmocなどがあげられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、たとえば対応する酸無水物、アジド、活性エステル[アルコール(たとえば、ペンタクロロフェノール、2,4,5−トリクロロフェノール、2,4−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、HONB、N−ヒドロキシスクシミド、N−ヒドロキシフタルイミド、HOBT)とのエステル]などがあげられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、たとえば対応するリン酸アミドなどがあげられる。
保護基の除去(脱離)方法としては、たとえばPd黒あるいはPd炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元などもあげられる。上記酸処理による脱離反応は一般に−20℃〜40℃の温度で行われるが、酸処理においてはアニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、1,4−ブタンジチオール、1,2−エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる2,4−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の1,2−エタンジチオール、1,4−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、ならびにその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知の手段から適宜選択しうる。
本発明のポリペプチドのアミド体を得る別の方法としては、まず、カルボキシル末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化した後、アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のN末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたペプチドとC末端のカルボキシル基の保護基のみを除いたペプチド(またはアミノ酸)とを製造し、この両ペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護ペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗ポリペプチドを得ることができる。この粗ポリペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のポリペプチドのアミド体を得ることができる。
本発明のポリペプチドのエステル体を得るにはカルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、ポリペプチドのアミド体と同様にして所望のポリペプチドのエステル体を得ることができる。
本発明のポリペプチドの部分ペプチドは、本発明のポリペプチドを適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができるし、上記のポリペプチドの合成法に従って製造することができる。本発明のポリペプチドの部分ペプチドのアミドまたはエステルも上述のアミド体またはエステル体の製造方法に準じて製造することができる。さらに本発明のポリペプチドの部分ペプチドの塩としては、上記の本発明のポリペプチドの塩と同様のものなどがあげられる。
該アミノ酸配列中のアミノ酸の実質的に同一な置換物としては、たとえばそのアミノ酸が属するクラスの他のアミノ酸類から選ぶことができる。非極性(疎水性)アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニンなどがあげられる。極性(中性)アミノ酸としてはグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンなどがあげられる。陽電荷をもつ(塩基性)アミノ酸としてはアルギニン、リジン、ヒスチジンなどがあげられる。負電荷をもつ(酸性)アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などがあげられる。
本発明のポリペプチドまたは部分ペプチドが標識化されたものとしては、公知の方法で、アイソトープラベル化されたもの、蛍光標識されたもの(例えば、フルオレセインなどによる蛍光標識)、ビオチン化されたもの、酵素標識されたものなどがあげられる。
具体的には、例えば公知の方法によって、〔3H〕、〔125I〕、〔14C〕、〔35S〕などで標識された本発明のポリペプチドなどを利用することができる。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、前述した本発明のポリペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。好ましくはDNAである。DNAとしては、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするDNAを含有するDNAであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムDNA、ゲノムDNAライブラリー、前記した組織・細胞由来のcDNA、前記した組織・細胞由来のcDNAライブラリー、合成DNAのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターはバクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した組織・細胞よりRNA画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction(以下、RT−PCR法と略称する)によって増幅することもできる。
本発明のポリペプチドをコードするDNAとしては、例えば、配列番号:12、配列番号:13もしくは配列番号:17で表される塩基配列を含有するDNA、または配列番号:12、配列番号:13もしくは配列番号:17で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号:4、配列番号:5もしくは配列番号:6で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドと実質的に同質の性質を有するポリペプチドをコードするDNA、または配列番号:14、配列番号:15もしくは配列番号:18で表される塩基配列を含有するDNA、または配列番号:14、配列番号:15もしくは配列番号:18で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号:7、配列番号:8もしくは配列番号:9で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドと実質的に同質の性質を有するポリペプチドをコードするDNAであれば何れのものでもよい。
配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:17または配列番号:18で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるDNAとしては、例えば、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:17または配列番号:18で表される塩基配列と約85%以上、好ましくは約90%以上、好ましくは約95%以上、好ましくは約98%以上の相同性を有する塩基配列を含有するDNAなどが用いられる。
塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、以下の条件(期待値=10;ギャップを許す;フィルタリング=ON;マッチスコア=1;ミスマッチスコア=−3)にて計算することができる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)2nd(J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab.Press,1989)に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約19〜40mM、好ましくは約19〜20mMで、温度が約50〜70℃、好ましくは約60〜65℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約19mMで温度が約65℃の場合が最も好ましい。より具体的には、配列番号:4で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするDNAとしては、配列番号:12で表される塩基配列を含有するDNAなどが、配列番号:5で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするDNAとしては、配列番号:13で表される塩基配列を含有するDNAなどが、配列番号:6で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするDNAとしては、配列番号:17で表される塩基配列を含有するDNAなどが、配列番号:7で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするDNAとしては、配列番号:14で表される塩基配列を含有するDNAなどが、配列番号:8で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするDNAとしては、配列番号:15で表される塩基配列を含有するDNAなどが、配列番号:9で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするDNAとしては、配列番号:18で表される塩基配列を含有するDNAなどが用いられる。
本発明の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド(例、DNA)としては、前述した本発明の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムDNA、ゲノムDNAライブラリー、前記した細胞・組織由来のcDNA、前記した細胞・組織由来のcDNAライブラリー、合成DNAのいずれでもよい。
本発明の部分ペプチドをコードするDNAとしては、例えば、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:17もしくは配列番号:18で表される塩基配列を含有するDNAの一部分を含有するDNA、または配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:17もしくは配列番号:18で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、本発明のポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドをコードするDNAの一部分を含有するDNAなどが用いられる。
配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:17もしくは配列番号:18で表される塩基配列とハイブリダイズできるDNAは、前記と同意義を示す。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。
(DNAのクローニング)
本発明のポリペプチドをコードするDNAは以下の遺伝子工学的手法によっても製造することができる。
本発明のポリペプチドを完全にコードするDNAのクローニングの手段としては、本発明のポリペプチドの部分塩基配列を有する合成DNAプライマーを用いて公知のPCR法によって前記DNAライブラリー等から目的とするDNAを増幅する方法、または適当なベクターに組み込んだDNAを本発明のポリペプチドをコードする塩基配列の一部あるいは全領域を有するDNA断片もしくは合成DNAを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別する方法があげられる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えばMolecular Cloning(2nd ed.;J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab.Press,1989)に記載の方法などに従って行われる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行う。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。該ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約19〜40mM、好ましくは約19〜20mMで、温度が約50〜70℃、好ましくは約60〜65℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約19mMで温度が約65℃の場合が最も好ましい。
DNAの塩基配列の変換は、公知のキット、例えば、MutanTM−super Express Km(宝酒造(株))、MutanTM−K(宝酒造(株))等を用いて、ODA−LA PCR法やGapped duplex法やKunkel法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化された本発明のポリペプチドをコードするDNAは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該DNAはその5’末端側に翻訳開始コドンとしてのATGを有し、また3’末端側には翻訳終止コドンとしてのTAA、TGAまたはTAGを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成DNAアダプターを用いて付加することもできる。
(発現ベクター)
本発明のポリペプチドの発現ベクターは、例えば、(i)本発明のポリペプチドまたは本発明のタンパク質をコードするDNAから目的とするDNA断片を切り出し、(ii)該DNA断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド(例、pBR322,pBR325,pUC12,pUC13)、枯草菌由来のプラスミド(例、pUB110,pTP5,pC194)、酵母由来プラスミド(例、pSH19,pSH15)、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス,ワクシニアウイルス,バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
形質転換する際の宿主が動物細胞である場合には、SV40由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、SRαプロモーターなどが利用できる。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、Trpプロモーター、T7プロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、lppプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADH1プロモーター、GALプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、SV40複製オリジン(以下、SV40oriと略称する場合がある)などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素(以下、dhfrと略称する場合がある)遺伝子〔メソトレキセート(MTX)耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子(以下、Amprと略称する場合がある)、ネオマイシン耐性遺伝子(以下、Neoと略称する場合がある、G418耐性)等があげられる。特に、CHO(dhfr−)細胞を用いてDHFR遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、ポリペプチドまたはその部分ペプチドのN端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、phoA・シグナル配列、OmpA・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、メイテイングファクターα(MFα)・シグナル配列、インベルターゼ・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、例えばインシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
(形質転換体)
このようにして構築された本発明のポリペプチドをコードするDNAを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
宿主としては、たとえばエシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫または昆虫細胞、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌としては、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)K12・DH1〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),60巻,160(1968)〕,JM103〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ,(Nucleic Acids Research),9巻,309(1981)〕,JA221〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journal of Molecular Biology)〕,120巻,517(1978)〕,HB101〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー,41巻,459(1969)〕,C600〔ジェネティックス(Genetics),39巻,440(1954)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サチルス(Bacillus subtilis)MI114〔ジーン,24巻,255(1983)〕,207−21〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(Journal of Biochemistry),95巻,87(1984)〕などが用いられる。
酵母としては、たとえばサッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)AH22,AH22R−,NA87−11A,DKD−5D,20B−12などが用いられる。
昆虫としては、例えばカイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー(Nature),315巻,592(1985)〕。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがAcNPVの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞(Spodoptera frugiperda cell;Sf細胞)、Trichoplusia niの中腸由来のMG1細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがBmNPVの場合は、蚕由来株化細胞(Bombyx mori N;BmN細胞)などが用いられる。該Sf細胞としては、例えば、Sf9細胞(ATCC CRL1711)、Sf21細胞〔以上、Vaughn,J.L.ら、イン・ヴィトロ(in Vitro),13巻,213−217頁(1977年)〕などが用いられる。
動物細胞としては、たとえばサルCOS−7細胞,Vero細胞,チャイニーズハムスター細胞CHO,DHFR遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞CHO(dhfr− CHO細胞),マウスL細胞,マウス3T3細胞、マウスミエローマ細胞,ヒトHEK293細胞、ヒトFL細胞、293細胞、C127細胞、BALB3T3細胞、Sp−2/O細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、たとえばプロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),69巻,2110(1972)やジーン(Gene),17巻,107(1982)などに記載の方法に従って行なわれる。
バチルス属菌を形質転換するには、たとえばモレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス(Molecular & General Genetics),168巻,111(1979)などに記載の方法に従って行われる。
酵母を形質転換するには、たとえばプロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc.Natl.Acad.Sci,USA),75巻,1929(1978)に記載の方法に従って行なわれる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、たとえばバイオ/テクノロジー(Bio/Technology),6巻,47−55頁(1988年)などに記載の方法に従って行なわれる。
動物細胞を形質転換するには、たとえばヴィロロジー(Virology),52巻,456(1973)に記載の方法に従って行なわれる。
発現ベクターの細胞への導入方法としては、例えば、リポフェクション法〔Felgner,P.L.et al.プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America),84巻,7413頁(1987年)〕、リン酸カルシウム法〔Graham,F.L.and van der Eb,A.J.ヴィロロジー(Virology),52巻,456−467頁(1973年)〕、電気穿孔法〔Nuemann,E.et al.エンボ・ジャーナル(EMBO J.),1巻,841−845頁(1982年)〕等があげられる。
このようにして、本発明のポリペプチドをコードするDNAを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。
なお、動物細胞を用いて、本発明のポリペプチドを安定に発現させる方法としては、上記の動物細胞に導入された発現ベクターが染色体に組み込まれた細胞をクローン選択によって選択する方法がある。具体的には、上記の選択マーカーを指標にして形質転換体を選択する。さらに、このように選択マーカーを用いて得られた動物細胞に対して、繰り返しクローン選択を行なうことにより本発明のポリペプチドの高発現能を有する安定な動物細胞株を得ることができる。また、dhfr遺伝子を選択マーカーとして用いた場合、MTX濃度を徐々に上げて培養し、耐性株を選択することにより、dhfr遺伝子とともに、本発明のポリペプチドをコードするDNAを細胞内で増幅させて、さらに高発現の動物細胞株を得ることもできる。
上記の形質転換体を本発明のポリペプチドをコードするDNAが発現可能な条件下で培養し、本発明のポリペプチドを生成、蓄積せしめることによって、本発明のポリペプチドを製造することができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、たとえばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としてはたとえば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがあげられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のpHは約5〜8が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えばグルコース、カザミノ酸を含むM9培地〔ミラー(Miller),ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス(Journal of Experiments in Molecular Genetics),431−433,Cold Spring Harbor Laboratory,New York 1972〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、たとえば3β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約15〜43℃で約3〜24時間行い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約30〜40℃で約6〜24時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、たとえばバークホールダー(Burkholder)最小培地〔Bostian,K.L.ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),77巻,4505(1980)」や0.5%カザミノ酸を含有するSD培地〔Bitter,G.A.ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),81巻,5330(1984)〕があげられる。培地のpHは約5〜8に調整するのが好ましい。培養は通常約20℃〜35℃で約24〜72時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace’s Insect Medium(Grace,T.C.C.,ネイチャー(Nature),195,788(1962))に非働化した10%ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のpHは約6.2〜6.4に調整するのが好ましい。培養は通常約27℃で約3〜5日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、たとえば約5〜20%の胎児牛血清を含むMEM培地〔サイエンス(Science),122巻,501(1952)〕,DMEM培地〔ヴィロロジー(Virology),8巻,396(1959)〕,RPMI 1640培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション(The Journal of The American Medical Association)199巻,519(1967)〕,199培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン(Proceeding of The Society for The Biological Medicine),73巻,1(1950)〕などが用いられる。pHは約6〜8であるのが好ましい。培養は通常約30℃〜40℃で約15〜60時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
特にCHO(dhfr−)細胞およびdhfr遺伝子を選択マーカーとして用いる場合には、チミジンをほとんど含まない透析ウシ胎児血清を含むDMEM培地を用いるのが好ましい。
(本発明のポリペプチドの分離精製)
上記培養物から本発明のポリペプチドを分離精製するには、例えば下記の方法により行なうことができる。
本発明のポリペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび/または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により本発明のポリペプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用い得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク変性剤や、トリトン(登録商標)X−100などの界面活性剤が含まれていてもよい。
培養液中に本発明のポリペプチドが分泌される場合には、培養終了後、自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる本発明のポリペプチドの精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法やクロマトフォーカシングなどの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
このようにして得られる本発明のポリペプチドが遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生する本発明のポリペプチドを、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、(ポリ)ペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。またN末端アミノ酸を欠失させるためには、エドマン(Edman)試薬(フェニルイソチオシアネート)を用いた公知のエドマン法を用いることが可能である。
このようにして生成する本発明のポリペプチドの存在は特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定することができる。
(抗体)
本発明は、さらに本発明のポリペプチドに対する抗体を提供する。
本発明のポリペプチドに対する抗体は、本発明のポリペプチドを認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明のポリペプチドに対する抗体は、本発明のポリペプチドを抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
(a)モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のポリペプチドは、哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常2〜6週毎に1回ずつ、計2〜10回程度行なわれる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギがあげられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の2〜5日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化本発明のポリペプチドと抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー(Nature)、256巻、495頁(1975年)〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはPEGが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、NS−1、P3U1、SP2/0などが挙げられるが、P3U1が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞(脾臓細胞)数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は1:1〜20:1程度であり、PEG(好ましくは、PEG1000〜PEG6000)が10〜80%程度の濃度で添加され、約20〜40℃、好ましくは約30〜37℃で約1〜10分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、本発明のポリペプチドの抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相(例、マイクロプレート)にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体(細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる)またはプロテインAを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインAを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識した本発明のポリペプチドを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができるが、通常はHAT(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン)を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、1〜20%、好ましくは10〜20%の牛胎児血清を含むRPMI1640培地、1〜10%の牛胎児血清を含むGIT培地(和光純薬工業(株))またはハイブリドーマ培養用無血清培地(SFM−101、日水製薬(株))などを用いることができる。培養温度は、通常20〜40℃、好ましくは約37℃である。培養時間は、通常5日〜3週間、好ましくは1週間〜2週間である。培養は、通常5%炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
(b)モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体(例、DEAE)による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテインAあるいはプロテインGなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原(本発明のポリペプチド抗原)とキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のポリペプチドに対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等を重量比でハプテン1に対し、約0.1〜20、好ましくは約1〜5の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約2〜6週毎に1回ずつ、計約3〜10回程度行なうことができる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
上記の本発明の抗体は、本発明のポリペプチドを特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のポリペプチドの定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。すなわち、本発明は、例えば、(i)本発明の抗体と、被検液および標識化本発明のポリペプチドとを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化本発明のポリペプチドの割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のポリペプチドの定量法、
(ii)被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のポリペプチドの定量法を提供する。
上記(ii)においては、一方の抗体が本発明のポリペプチドのN端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のポリペプチドのC端部に反応する抗体であることが好ましい。
本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体(以下、本発明のモノクローナル抗体と称する場合がある)を用いて本発明のポリペプチドの測定を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のF(ab’)2、Fab’、あるいはFab画分を用いてもよい。
本発明のポリペプチドに対する抗体を用いる測定法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量(例えば、本発明のポリペプチド量)に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常、タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、例えば、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が用いられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ(1次反応)、さらに標識化した本発明のモノクローナル抗体を反応させ(2次反応)たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のポリペプチド量を定量することができる。1次反応と2次反応は逆の順序に行なっても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は上記のそれらに準じることができる。
また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも1種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明のポリペプチドの測定法においては、1次反応と2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は本発明のポリペプチドの結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。即ち、1次反応および2次反応に用いられる抗体は、例えば、2次反応で用いられる抗体が、本発明のポリペプチドのC端部を認識する場合、1次反応で用いられる抗体は、好ましくはC端部以外、例えばN端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原と(F)と抗体と結合した標識抗原(B)とを分離し(B/F分離)、B,Fいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、B/F分離をポリエチレングリコール、上記抗体に対する第2抗体などを用いる液相法、および、第1抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第1抗体は可溶性のものを用い第2抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果、生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のポリペプチドの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる〔例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」(講談社、昭和49年発行)、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」(講談社、昭和54年発行)、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」(医学書院、昭和53年発行)、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」(第2版)(医学書院、昭和57年発行)、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」(第3版)(医学書院、昭和62年発行)、「メソッズ・イン・エンジモロジー(Methods in ENZYMOLOGY)」Vol.70(Immunochemical Techniques(Part A))、同書 Vol.73(Immunochemical Techniques(Part B))、同書 Vol.74(Immunochemical Techniques(Part C))、同書 Vol.84(Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、同書 Vol.92(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、同書 Vol.121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)など参照〕。
以上のように、本発明の抗体を用いることによって、本発明のポリペプチドを感度良く定量することができる。
さらに、本発明の抗体を用いて、生体内での本発明のポリペプチドを定量することによって、本発明のポリペプチドの機能不全に関連する各種疾患の診断をすることができる。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のポリペプチドを特異的に検出するために使用することができる。また、本発明のポリペプチドを精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のポリペプチドの検出、被検細胞内における本発明のポリペプチドの挙動の分析などのために使用することができる。
(アンチセンスポリヌクレオチド)
本発明のポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド(例、DNA(以下、アンチセンスポリヌクレオチドの説明においては、これらのDNAを本発明のDNAと略記する場合がある))の塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列を含有するアンチセンスポリヌクレオチドとしては、本発明のDNAの塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列を含有し、該DNAの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスポリヌクレオチドであってもよいが、アンチセンスDNAが好ましい。
本発明のDNAに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のDNAに相補的な塩基配列(すなわち、本発明のDNAの相補鎖)の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約70%以上、好ましくは約80%以上、より好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。特に、本発明のDNAの相補鎖の全塩基配列うち、本発明のポリペプチドのN末端部位をコードする部分の塩基配列(例えば、開始コドン付近の塩基配列など)の相補鎖と約70%以上、好ましくは約80%以上、より好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドが好適である。
具体的には、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:17または配列番号:18で表される塩基配列を含有するDNAの塩基配列に相補的な、もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチドなどが挙げられる。
アンチセンスポリヌクレオチドは通常、10〜40個程度、好ましくは15〜30個程度の塩基から構成される。
ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンスDNAを構成する各ヌクレオチドのリン酸残基(ホスフェート)は、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾リン酸残基に置換されていてもよい。これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、公知のDNA合成装置などを用いて製造することができる。
本発明に従えば、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の複製または発現を阻害することのできるアンチセンスポリヌクレオチドを、クローン化した、あるいは決定されたポリペプチドをコードするDNAの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。このようなポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子のRNAとハイブリダイズすることができ、該RNAの合成または機能を阻害することができるか、あるいは本発明のポリペプチド関連RNAとの相互作用を介して本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を調節・制御することができる。本発明のポリペプチド関連RNAの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、および本発明のポリペプチド関連RNAと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内および生体外で本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。
用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列または核酸とポリペプチドとの間で「対応する」とは、ヌクレオチド(核酸)の配列またはその相補体から誘導される指令にあるポリペプチドのアミノ酸を通常指している。ポリペプチドをコードする遺伝子の5’端ヘアピンループ、5’端6−ベースペア・リピート、5’端非翻訳領域、翻訳開始コドン、ポリペプチドコード領域、翻訳終止コドン、3’端非翻訳領域、3’端パリンドローム領域、および3’端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、ポリペプチドをコードする遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係は、「アンチセンス」であるということができる。アンチセンスポリヌクレオチドは、2−デオキシ−D−リボースを含有しているポリヌクレオチド、D−リボースを含有しているポリヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のN−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマまたは特殊な結合を含有するその他のポリマー(但し、該ポリマーはDNAやRNA中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する)などが挙げられる。それらは、2本鎖DNA、1本鎖DNA、2本鎖RNA、1本鎖RNA、さらにDNA:RNAハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド(または非修飾オリゴヌクレオチド)、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、1個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合(例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど)を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど)を持つもの、例えばタンパク質(ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−L−リジンなど)や糖(例えば、モノサッカライドなど)などの側鎖基を有しているもの、インターカレート化合物(例えば、アクリジン、ソラレンなど)を持つもの、キレート化合物(例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など)を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの(例えば、αアノマー型の核酸など)であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、1個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、RNA、DNA、あるいは修飾された核酸(RNA、DNA)である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは次のような方針:(1)細胞内でのアンチセンスポリヌクレオチドをより安定なものにする、(2)アンチセンスポリヌクレオチドの細胞透過性をより高める、(3)目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、(4)もし毒性があるならアンチセンスポリヌクレオチドの毒性をより小さなものにする、で好ましく設計されうる。
こうした修飾は当該分野で数多く知られており、例えばJ.Kawakami et al.,Pharm Tech Japan,Vol.8,pp.247,1992;Vol.8,pp.395,1992;S.T.Crooke et al.ed.,Antisense Research and Applications,CRC Press,1993などに開示がある。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質(例えば、ホスホリピド、コレステロールなど)といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体(例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など)が挙げられる。こうしたものは、核酸の3’端あるいは5’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の3’端あるいは5’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、RNaseなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンスポリヌクレオチドの阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいは本発明のポリペプチドの生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸は公知の各種の方法で細胞に適用できる。
以下に、(a)本発明のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩(以下、本発明のポリペプチドと略記する場合がある)、(b)本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩、(c)本発明のポリペプチドに対する抗体、(d)本発明のポリヌクレオチド、(e)本発明のアンチセンスポリヌクレオチドなどの用途を説明する。
本発明のポリペプチドAもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩(以下、本発明のポリペプチドAと略記する場合がある)はバソプレシン分泌抑制活性を有していることから、本発明のポリペプチドA、本発明のポリペプチドAの活性を促進する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドAまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドなどは、例えば、バソプレシン分泌抑制剤などとして、例えば、腎性浮腫、尿排出障害(例、膀胱収縮障害、尿道通過障害、排尿困難、排尿痛、尿路閉塞など)、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群(SIADH)、高血圧などの予防・治療剤として用いることができる。
また、本発明のポリペプチドAの活性を阻害する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドAに対する抗体、本発明のポリペプチドAをコードする遺伝子のアンチセンスポリヌクレオチド、本発明のポリペプチドAをコードする遺伝子に対するsiRNAまたはshRNA、本発明のポリペプチドAをコードするRNAの一部を含有するリボザイム、本発明のポリペプチドAに対するアプタマーなどは、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁(例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など)など〕、多尿症、尿崩症(例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など)、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング(Cushing)症候群などの予防・治療剤などとして使用することができる。
本発明のポリペプチドBもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩(以下、本発明のポリペプチドBと略記する場合がある)はバソプレシン分泌抑制活性および摂食促進活性を有していることから、本発明のポリペプチドB、本発明のポリペプチドBの活性を促進する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドBまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドなどは、例えば、バソプレシン分泌抑制剤などとして、例えば、腎性浮腫、尿排出障害(例、膀胱収縮障害、尿道通過障害、排尿困難、排尿痛、尿路閉塞など)、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群(SIADH)、高血圧などの予防・治療剤、拒食症などの予防・治療剤、摂食(食欲)促進剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害(例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群(時差ボケ)など)〕などの予防・治療剤などとして用いることができる。
また、本発明のポリペプチドBの活性を阻害する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドBに対する抗体、本発明のポリペプチドBをコードする遺伝子のアンチセンスポリヌクレオチド、本発明のポリペプチドBをコードする遺伝子に対するsiRNAまたはshRNA、本発明のポリペプチドBをコードするRNAの一部を含有するリボザイム、本発明のポリペプチドBに対するアプタマーなどは、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁(例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など)など〕、多尿症、尿崩症(例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など)、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング(Cushing)症候群などの予防・治療剤、肥満症(例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など)、摂食亢進症などの予防・治療剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害(例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群(時差ボケ)など)〕などの予防・治療剤などとして使用することができる。
また、本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング用試薬としても有用である。
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチド遺伝子の発現を促進または阻害する化合物のスクリーニング用試薬としても有用である。
(1)本発明のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有する医薬
本発明のポリペプチドAもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩はバソプレシン分泌抑制活性を有していることから、本発明のポリペプチドAもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩は、例えば、バソプレシン分泌抑制剤などとして、例えば、腎性浮腫、尿排出障害(例、膀胱収縮障害、尿道通過障害、排尿困難、排尿痛、尿路閉塞など)、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群(SIADH)、高血圧などの予防・治療剤として用いることができる。
本発明のポリペプチドBもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩はバソプレシン分泌抑制活性および摂食促進活性を有しているので、本発明のポリペプチドBもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩は、例えば、バソプレシン分泌抑制剤などとして、例えば、腎性浮腫、尿排出障害(例、膀胱収縮障害、尿道通過障害、排尿困難、排尿痛、尿路閉塞など)、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群(SIADH)、高血圧などの予防・治療剤、拒食症などの予防・治療剤、摂食(食欲)促進剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害(例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群(時差ボケ)など)〕などの予防・治療剤などとして用いることができる。
本発明のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルの塩としては、例えば、薬学的に許容可能な塩などが用いられる。例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などがあげられる。
無機塩基との塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩などがあげられる。
有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、2,6−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、N,N’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩あげられる。
無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などとの塩があげられる。
有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸などとの塩があげられる。
塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルチニンなどとの塩があげられ、酸性アミノ酸との好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩があげられる。
本発明のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を上述の医薬として使用する場合には、常套手段に従って実施することができる。具体的には、以下に記載するとおりに使用することができる。
例えば、必要に応じて糖衣や腸溶性被膜を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたがって処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液(例えば、D−ソルビトール、D−マンニトール、塩化ナトリウムなど)などがあげられ、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール(たとえばエタノール)、ポリアルコール(たとえばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール)、非イオン性界面活性剤(たとえばポリソルベート80(TM)、HCO−50)などと併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、緩衝剤(例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液)、無痛化剤(例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど)、安定剤(例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど)、保存剤(例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど)、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば温血動物(例えば、ヒト、モルモット、ラット、マウス、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル、イヌ、ニワトリ)などに対して投与することができる。
本発明のポリペプチドAもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に、例えば、腎性浮腫患者(体重60kgとして)においては、一日につき約0.1〜1000mg、好ましくは約1.0〜300mg、より好ましくは約3.0〜50mgである。非経口的に投与する場合は、その投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では、一般的に、例えば、腎性浮腫患者(体重60kgとして)への投与においては、一日につき約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、60kg当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のポリペプチドBもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に、例えば、腎性浮腫患者(体重60kgとして)においては、一日につき約0.1〜1000mg、好ましくは約1.0〜300mg、より好ましくは約3.0〜50mgである。非経口的に投与する場合は、その投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では、一般的に、例えば、腎性浮腫患者(体重60kgとして)への投与においては、一日につき約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、60kg当たりに換算した量を投与することができる。
(2)本発明のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩を含有する医薬
本発明のポリペプチドAもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩はバソプレシン分泌抑制活性を有していることから、本発明のポリペプチドAもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩は、例えば、バソプレシン分泌抑制剤などとして、例えば、腎性浮腫、尿排出障害(例、膀胱収縮障害、尿道通過障害、排尿困難、排尿痛、尿路閉塞など)、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群(SIADH)、高血圧などの予防・治療剤として用いることができる。
また、本発明のポリペプチドAもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩は、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁(例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など)など〕、多尿症、尿崩症(例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など)、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング(Cushing)症候群などの予防・治療剤として有用である。
本発明のポリペプチドBもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩はバソプレシン分泌抑制活性および摂食促進活性を有しているので、本発明のポリペプチドBもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩は、例えば、バソプレシン分泌抑制剤などとして、例えば、腎性浮腫、尿排出障害(例、膀胱収縮障害、尿道通過障害、排尿困難、排尿痛、尿路閉塞など)、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群(SIADH)、高血圧などの予防・治療剤、拒食症などの予防・治療剤、摂食(食欲)促進剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害(例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群(時差ボケ)など)〕などの予防・治療剤などとして用いることができる。
また、本発明のポリペプチドBもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩は、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁(例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など)など〕、多尿症、尿崩症(例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など)、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング(Cushing)症候群などの予防・治療剤、肥満症(例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など)、摂食亢進症などの予防・治療剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害(例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群(時差ボケ)など)〕などの予防・治療剤などとして有用である。
本発明のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物の塩としては、例えば、薬学的に許容可能な塩などが用いられる。例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などがあげられる。
無機塩基との塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩などがあげられる。
有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、2,6−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、N,N’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩あげられる。
無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などとの塩があげられる。
有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸などとの塩があげられる。
塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルチニンなどとの塩があげられ、酸性アミノ酸との好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩があげられる。
本発明のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、該ポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を上述の医薬として使用する場合には、常套手段に従って実施することができる。具体的には、以下に記載するとおりに使用することができる。
例えば、必要に応じて糖衣や腸溶性被膜を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたがって処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液(例えば、D−ソルビトール、D−マンニトール、塩化ナトリウムなど)などがあげられ、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール(たとえばエタノール)、ポリアルコール(たとえばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール)、非イオン性界面活性剤(たとえばポリソルベート80(TM)、HCO−50)などと併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、緩衝剤(例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液)、無痛化剤(例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど)、安定剤(例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど)、保存剤(例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど)、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば温血動物(例えば、ヒト、モルモット、ラット、マウス、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル、イヌ、ニワトリ)などに対して投与することができる。
本発明のポリペプチドAもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、腎性浮腫患者(体重60kgとして)においては、一日につき約0.1〜1000mg、好ましくは約1.0〜300mg、より好ましくは約3.0〜50mgである。非経口的に投与する場合は、その投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では、一般的に例えば、腎性浮腫患者(体重60kgとして)への投与においては、一日につき約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、60kg当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のポリペプチドAもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、尿崩症患者(体重60kgとして)においては、一日につき約0.1〜1000mg、好ましくは約1.0〜300mg、より好ましくは約3.0〜50mgである。非経口的に投与する場合は、その投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では、一般的に例えば、尿崩症患者(体重60kgとして)への投与においては、一日につき約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、60kg当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のポリペプチドBもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、腎性浮腫患者(体重60kgとして)においては、一日につき約0.1〜1000mg、好ましくは約1.0〜300mg、より好ましくは約3.0〜50mgである。非経口的に投与する場合は、その投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では、一般的に例えば、腎性浮腫患者(体重60kgとして)への投与においては、一日につき約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、60kg当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のポリペプチドBもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、尿崩症患者(体重60kgとして)においては、一日につき約0.1〜1000mg、好ましくは約1.0〜300mg、より好ましくは約3.0〜50mgである。非経口的に投与する場合は、その投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では、一般的に例えば、尿崩症患者(体重60kgとして)への投与においては、一日につき約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、60kg当たりに換算した量を投与することができる。
(3)本発明のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体を含有する医薬
本発明のポリペプチドAもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩はバソプレシン分泌抑制活性を有していることから、本発明のポリペプチドAもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体は、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁(例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など)など〕、多尿症、尿崩症(例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など)、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング(Cushing)症候群などの予防・治療剤などとして有用である。
本発明のポリペプチドBもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩はバソプレシン分泌抑制活性および摂食促進活性を有しているので、本発明のポリペプチドBもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体は、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁(例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など)など〕、多尿症、尿崩症(例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など)、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング(Cushing)症候群などの予防・治療剤、肥満症(例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など)、摂食亢進症などの予防・治療剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害(例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群(時差ボケ)など)〕などの予防・治療剤などとして有用である。
本発明のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体を上述の医薬として使用する場合には、常套手段に従って実施することができる。具体的には、以下に記載するとおりに使用することができる。
例えば、必要に応じて糖衣や腸溶性被膜を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたがって処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液(例えば、D−ソルビトール、D−マンニトール、塩化ナトリウムなど)などがあげられ、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール(たとえばエタノール)、ポリアルコール(たとえばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール)、非イオン性界面活性剤(たとえばポリソルベート80(TM)、HCO−50)などと併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、緩衝剤(例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液)、無痛化剤(例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど)、安定剤(例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど)、保存剤(例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど)、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば温血動物(例えば、ヒト、モルモット、ラット、マウス、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル、イヌ、ニワトリ)などに対して投与することができる。
本発明のポリペプチドAもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、尿崩症患者(体重60kgとして)においては、一日につき約0.1〜1000mg、好ましくは約1.0〜300mg、より好ましくは約3.0〜50mgである。非経口的に投与する場合は、その投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では、一般的に例えば、尿崩症患者(体重60kgとして)への投与においては、一日につき約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、60kg当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のポリペプチドBもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、尿崩症患者(体重60kgとして)においては、一日につき約0.1〜1000mg、好ましくは約1.0〜300mg、より好ましくは約3.0〜50mgである。非経口的に投与する場合は、その投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では、一般的に例えば、尿崩症患者(体重60kgとして)への投与においては、一日につき約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、60kg当たりに換算した量を投与することができる。
(4)本発明のポリヌクレオチドを含有する医薬
本発明のポリペプチドAもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩はバソプレシン分泌抑制活性を有していることから、本発明のポリペプチドAまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドは、例えばバソプレシン分泌抑制剤などとして、例えば、腎性浮腫、尿排出障害(例、膀胱収縮障害、尿道通過障害、排尿困難、排尿痛、尿路閉塞など)、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群(SIADH)、高血圧などの予防・治療剤として用いることができる。
本発明のポリペプチドBもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩はバソプレシン分泌抑制活性および摂食促進活性を有しているので、本発明のポリペプチドBまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドは、例えば、バソプレシン分泌抑制剤などとして、例えば、腎性浮腫、尿排出障害(例、膀胱収縮障害、尿道通過障害、排尿困難、排尿痛、尿路閉塞など)、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群(SIADH)、高血圧などの予防・治療剤、拒食症などの予防・治療剤、摂食(食欲)促進剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害(例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群(時差ボケ)など)〕などの予防・治療剤などとして用いることができる。
本発明のポリヌクレオチドを上記の予防・治療剤として使用する場合、公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。
例えば、該ポリヌクレオチドを用いる場合、該ポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたはその他の哺乳動物(例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど)に対して経口的または非経口的に投与することができる。該ポリヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
本発明のポリペプチドAまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドの投与量は、症状などにより差異はあるが、一般的に例えば、腎性浮腫患者(体重60kgとして)においては、一日につき約0.1〜100mgである。
本発明のポリペプチドBまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドの投与量は、症状などにより差異はあるが、一般的に例えば、腎性浮腫患者(体重60kgとして)においては、一日につき約0.1〜100mgである。
(5)本発明のアンチセンスポリヌクレオチド、二重鎖RNA、リボザイムなどを含有する医薬および診断薬
本発明のポリペプチドAをコードするDNA(以下「本発明のDNA(A)」という)に相補的に結合し、該DNAの発現を抑制することができる本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは低毒性であり、生体内における本発明のポリペプチドAまたは本発明のDNA(A)の機能を抑制することができるので、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁(例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など)など〕、多尿症、尿崩症(例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など)、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング(Cushing)症候群などの予防・治療剤などとして使用できる。
本発明のポリペプチドBをコードするDNA(以下「本発明のDNA(B)」という)に相補的に結合し、該DNAの発現を抑制することができる本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは低毒性であり、生体内における本発明のポリペプチドBまたは本発明のDNA(B)の機能を抑制することができるので、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁(例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など)など〕、多尿症、尿崩症(例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など)、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング(Cushing)症候群などの予防・治療剤、肥満症(例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など)、摂食亢進症などの予防・治療剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害(例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群(時差ボケ)など)〕などの予防・治療剤などとして使用できる。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを上記の予防・治療剤として使用する場合、公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。
例えば、該アンチセンスポリヌクレオチドを用いる場合、該アンチセンスポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたはその他の哺乳動物(例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど)に対して経口的または非経口的に投与することができる。該アンチセンスポリヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
該アンチセンスポリヌクレオチドの投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、尿崩症の治療の目的で本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを投与する場合、一般的に成人(体重60kg)においては、一日につき該アンチセンスポリヌクレオチドを約0.1〜100mg投与する。
さらに、該アンチセンスポリヌクレオチドは、組織や細胞における本発明のDNAの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
本発明は、さらに
(1)本発明のポリペプチドAをコードするRNAの一部を含有する二重鎖RNA;
(2)前記(1)記載の二重鎖RNAを含有してなる医薬;
(3)本発明のポリペプチドAをコードするRNAの一部を含有するリボザイム;
(4)前記(3)記載のリボザイムを含有してなる医薬;
(5)本発明のポリペプチドBをコードするRNAの一部を含有する二重鎖RNA;
(6)前記(5)記載の二重鎖RNAを含有してなる医薬;
(7)本発明のポリペプチドBをコードするRNAの一部を含有するリボザイム;
(8)前記(7)記載のリボザイムを含有してなる医薬なども提供する。
これらの二重鎖RNA(本発明のポリヌクレオチドに対するsiRNA(small(short)interfering RNA)、shRNA(small(short)hairpin RNA)など)、リボザイムなどは、上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、本発明のポリヌクレオチド(例、DNA)の発現を抑制することができ、生体内における本発明のポリペプチドまたは本発明のポリヌクレオチド(例、DNA)の活性や機能を阻害することができる。
前記(1)記載の二重鎖RNAおよび前記(3)記載のリボザイムは、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁(例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など)など〕、多尿症、尿崩症(例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など)、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング(Cushing)症候群などの予防・治療剤などとして使用できる。
前記(5)記載の二重鎖RNAおよび前記(7)記載のリボザイムは、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁(例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など)など〕、多尿症、尿崩症(例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など)、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング(Cushing)症候群などの予防・治療剤、肥満症(例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など)、摂食亢進症などの予防・治療剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害(例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群(時差ボケ)など)〕などの予防・治療剤などとして使用できる。
二重鎖RNAは、公知の方法(例、Nature,411巻,494頁,2001年)に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
リボザイムは、公知の方法(例、TRENDS in Molecular Medicine,7巻,221頁,2001年)に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。例えば、本発明のペプチドをコードするRNAの一部に公知のリボザイムを連結することによって製造することができる。本発明のペプチドをコードするRNAの一部としては、公知のリボザイムによって切断され得る本発明のRNA上の切断部位に近接した部分(RNA断片)が挙げられる。
上記の二重鎖RNAまたはリボザイムを上記予防・治療剤として使用する場合、アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、投与することができる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、本発明のポリペプチドに対するアプタマーなども、本発明で用いられるタンパク質の活性や機能を抑制することができる。よって、本発明のポリペプチドAに対するアプタマーなどは、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁(例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など)など〕、多尿症、尿崩症(例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など)、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング(Cushing)症候群などの予防・治療剤などの医薬として使用することができる。
本発明のポリペプチドBに対するアプタマーなどは、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁(例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など)など〕、多尿症、尿崩症(例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など)、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング(Cushing)症候群などの予防・治療剤、肥満症(例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など)、摂食亢進症などの予防・治療剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害(例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群(時差ボケ)など)〕などの予防・治療剤などの医薬として使用することができる。
アプタマーは、公知の方法、例えばSELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)法(Annual Review of Medicine 56巻,555−583頁,2005年)を用いて取得する。アプタマーの構造は、公知の方法を用いて決定することができ、その構造を基に、公知の方法に従いアプタマーを製造する。
上記のアプタマーを医薬として使用する場合、アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、投与することができる。
(6)医薬候補化合物のスクリーニング方法及びスクリーニングキット
本発明のポリペプチドを用いることを特徴とする医薬候補化合物のスクリーニング方法および本発明のポリペプチドを含有することを特徴とする医薬候補化合物のスクリーニング用キット(以下、「本発明のスクリーニング方法」および「本発明のスクリーニング用キット」とそれぞれ略記する場合がある)について以下に説明する。
〔本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング〕
本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドの機能を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。すなわち、本発明は、(1)本発明のポリペプチドを用いることを特徴とする本発明のポリペプチドの活性(機能)を促進または阻害する化合物またはその塩(以下、促進剤または阻害剤と略記する場合がある)のスクリーニング方法を提供する。具体的には、例えば、(2)(i)本発明のポリペプチドを細胞に接触させた場合と、(ii)本発明のポリペプチドおよび試験化合物を細胞に接触させた場合との、該細胞のバソプレシン分泌抑制活性など本発明のポリペプチドの活性の比較を行うことを特徴とする促進剤または阻害剤のスクリーニング方法を提供する。具体的には、上記スクリーニング方法においては、例えば、(i)と(ii)の場合において、上記細胞を培養し、そのバソプレシン分泌量を測定する。上記細胞としては、バソプレシン分泌が誘発されるものなどが好ましく用いられる。例えば、ラット視索上核組織(例、後述の実施例に記載のラット視索上核の静的培養など)、ラット室傍核組織(例、後述の実施例に記載のラット室傍核の静的培養など)、ラット視索上核神経細胞(ニューロン)、ラット室傍核神経細胞(ニューロン)などが用いられる。培地は、本発明のポリペプチドの有するバソプレシン分泌抑制作用などの活性を阻害しない培地であればいずれのものでもよく、例えばDMEM(Dulbecco modified Eagle’s medium)などが用いられる。バソプレシン分泌量は、公知の方法、例えば、AVP RIA(放射免疫測定)キット(三菱化学ヤトロン製など)を用いた放射免疫測定法などにより測定することができる。試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、生理学的に許容される金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。金属塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩;カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩などのアルカリ土類金属塩;アルミニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、2,6−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、N,N’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、安息香酸、ベンゼンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
例えば、上記(ii)の場合における本発明のポリペプチドの活性(例、バソプレシン分泌抑制活性)を、上記(i)の場合に比べて、約20%以上、好ましくは30%以上、より好ましくは約50%以上促進する試験化合物を、本発明のポリペプチドの活性を促進する化合物またはその塩として選択することができる。例えば、上記(ii)の場合における本発明のポリペプチドの活性(例、バソプレシン分泌抑制活性)を、上記(i)の場合に比べて、約20%以上、好ましくは30%以上、より好ましくは約50%以上阻害する試験化合物を、本発明のポリペプチドの活性を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチド遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。本発明は、(3)本発明のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする本発明のポリペプチド遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩(以下、それぞれ促進剤、阻害剤と略記する場合がある)のスクリーニング方法を提供し、より具体的には、例えば、(4)(iii)本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞を培養した場合と(iv)本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物を培養した場合との比較を行うことを特徴とする促進剤または阻害剤のスクリーニング方法を提供する。上記スクリーニング方法においては、例えば、(iii)と(iv)の場合における、本発明のポリペプチド遺伝子の発現量(例、本発明のポリペプチド遺伝子のプロモーター下流に挿入したアルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼなどの酵素活性、本発明のポリペプチドをコードするmRNA量など)を測定して、比較する。本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞としては、例えば、前述した本発明のポリペプチドをコードするDNAを含有するベクターで形質転換された宿主(形質転換体)が用いられる。宿主としては、例えば、CHO細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。該スクリーニングには、例えば、前述の方法で培養することによって、本発明のポリペプチドを細胞内または培養上清中に産生する形質転換体が好ましく用いられる。さらに好ましくは、本発明のポリペプチド遺伝子のプロモーター下流に、分泌型アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼなどの遺伝子を挿入した形質転換体などが用いられる。試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、前記と同様のものなどが挙げられる。上記のスクリーニング方法を実施するには、本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞をスクリーニングに適した培地で培養して調製する。培地は、本発明のポリペプチドの産生を阻害しない培地であればいずれのものでもよく、例えばDMEM培地などが用いられる。本発明のポリペプチド遺伝子の発現量は、本発明のポリペプチド遺伝子のプロモーター下流に挿入したアルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼなどの酵素活性を、公知の方法に従い、測定することができる。本発明のポリペプチド遺伝子の発現量は、さらに、公知の方法、例えば、ノーザンブロッティングやReverse transcription−polymerase chain reaction(RT−PCR)、リアルタイムPCR解析システム(ABI社製、TaqMan polymerase chain reaction)などの方法あるいはそれに準じる方法にしたがって測定することもできる。例えば、上記(iv)の場合における本発明のポリペプチド遺伝子の発現を、上記(iii)の場合に比べて、約20%以上、好ましくは30%以上、より好ましくは約50%以上促進する試験化合物を本発明のポリペプチド遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩として選択することができる。例えば、上記(iv)の場合における本発明のポリペプチド遺伝子の発現を、上記(iii)の場合に比べて、約20%以上、好ましくは30%以上、より好ましくは約50%以上阻害する試験化合物を本発明のポリペプチド遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬としても有用である。すなわち、本発明は、(5)本発明のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩(以下、促進剤または阻害剤と略記する場合がある)のスクリーニング方法を提供する。具体的には、例えば、(6)(v)本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞を、別の細胞に接触させて培養した場合と(vi)本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物を、別の細胞に接触させて培養した場合との、該別の細胞の本発明のポリペプチドの活性(例、バソプレシン分泌抑制活性)の比較を行うことを特徴とする本発明のポリペプチドの有する活性の促進剤または阻害剤のスクリーニング方法を提供する。具体的には、上記スクリーニング方法においては、例えば、(v)と(vi)の場合において、上記細胞(および組織)を培養し、そのバソプレシン分泌量を測定する。本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞としては、上記(4)に記載の細胞が用いられる。別の細胞としては、上記(2)に記載の細胞が用いられる。試験化合物、培養法、バソプレシン分泌抑制活性の測定法などは、上記(2)に準じる。例えば、上記(vi)の場合における本発明のポリペプチドの活性(例、バソプレシン分泌抑制活性)を、上記(v)の場合に比べて、約20%以上、好ましくは30%以上、より好ましくは約50%以上促進する試験化合物を、本発明のポリペプチドの活性を促進する化合物またはその塩として選択することができる。例えば、上記(vi)の場合における本発明のポリペプチドの活性(例、バソプレシン分泌抑制活性)を、上記(v)の場合に比べて、約20%以上、好ましくは30%以上、より好ましくは約50%以上阻害する試験化合物を、本発明のポリペプチドの活性を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。
本発明は、(7)本発明の抗体を用いることを特徴とする本発明のポリペプチドの発現(産生)を促進または阻害する化合物またはその塩(以下、それぞれ促進剤、阻害剤と略記する場合がある)のスクリーニング方法を提供する。具体的には、例えば、(8)(vii)本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞を培養した場合と(viii)本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物を培養した場合との比較を、本発明の抗体を用いて行うことを特徴とする促進剤または阻害剤のスクリーニング方法を提供する。上記スクリーニング方法においては、例えば、本発明の抗体を用いて(vii)と(viii)の場合における、本発明のポリペプチドの産生量(具体的には、本発明のポリペプチド量)を測定して、比較する。
上記のスクリーニング方法を実施するには、本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞をスクリーニングに適した培地で培養して行う。培地は、本発明のポリペプチドの産生を阻害しない培地であればいずれのものでもよく、例えばDMEM培地などが用いられる。本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞としては、例えば、前述した本発明のポリペプチドをコードするDNAを含有するベクターで形質転換された宿主(形質転換体)が用いられる。宿主としては、例えば、CHO細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。該スクリーニングには、例えば、前述の方法で培養することによって、本発明のポリペプチドを細胞内または培養上清中に産生する形質転換体が好ましく用いられる。本発明のポリペプチド量の測定は、公知の方法、例えば、本発明のポリペプチドを認識する抗体を用いて、細胞抽出液中などに存在する前記ポリペプチドを、ウェスタン解析、ELISA法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。例えば、上記(viii)の場合における本発明のポリペプチドの産生量(発現量)を、上記(vii)の場合に比べて、約20%以上、好ましくは30%以上、より好ましくは約50%以上促進する試験化合物を本発明のポリペプチドの発現を促進する化合物またはその塩として選択することができる。例えば、上記(viii)の場合における本発明のポリペプチドの産生量(発現量)を、上記(vii)の場合に比べて、約20%以上、好ましくは30%以上、より好ましくは約50%以上阻害する試験化合物を本発明のポリペプチドの発現を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。本発明のスクリーニング用キットは、本発明のポリペプチドまたはその塩を含有するものである。
上記各スクリーニングで用いられる試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、前記と同様のものなどが挙げられる。
(7)本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩を含有する医薬など
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿等から選ばれた化合物であり、本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物、本発明のポリペプチド遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドの発現を促進または阻害する化合物またはその塩である。該化合物の塩としては、前記した本発明のポリペプチドの塩と同様のものが用いられる。本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる、本発明のポリペプチドAの活性を促進する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドAの遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドAの発現を促進する化合物またはその塩は、例えば、バソプレシン分泌抑制剤などとして、例えば、腎性浮腫、尿排出障害(例、膀胱収縮障害、尿道通過障害、排尿困難、排尿痛、尿路閉塞など)、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群(SIADH)、高血圧などの予防・治療剤などとして、低毒性で安全な医薬として使用できる。一方、本発明のポリペプチドAの活性を阻害する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドAの遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドAの発現を阻害する化合物またはその塩は、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁(例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など)など〕、多尿症、尿崩症(例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など)、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング(Cushing)症候群などの予防・治療剤等の医薬として使用できる。
さらに、本発明のポリペプチドBの活性を促進する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドBの遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドBの発現を促進する化合物またはその塩は、例えば、バソプレシン分泌抑制剤などとして、例えば、腎性浮腫、尿排出障害(例、膀胱収縮障害、尿道通過障害、排尿困難、排尿痛、尿路閉塞など)、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群(SIADH)、高血圧などの予防・治療剤、拒食症などの予防・治療剤、摂食(食欲)促進剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害(例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群(時差ボケ)など)〕などの予防・治療剤などとして、低毒性で安全な医薬として使用できる。一方、本発明のポリペプチドBの活性を阻害する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドBの遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドBの発現を阻害する化合物またはその塩は、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁(例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など)など〕、多尿症、尿崩症(例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など)、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング(Cushing)症候群などの予防・治療剤、肥満症(例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など)、摂食亢進症など)の予防・治療剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害(例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群(時差ボケ)など)〕などの予防・治療剤等の医薬として使用できる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩を上述の予防・治療剤として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。例えば、前記した本発明のポリペプチドを含有する医薬と同様にして、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤等とすることができる。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物(例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル等)に対して投与することができる。
本発明のポリペプチドAの活性を促進する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドAの遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩、および本発明のポリペプチドAの発現を促進する化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルート等により差異はあるが、例えば、経口投与の場合、一般的に例えば腎性浮腫患者(体重60kgとして)においては、一日につき約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mgである。非経口的に投与する場合は、該化合物の投与量は投与対象、対象疾患等によっても異なるが、例えば、注射剤の形では、−般的に例えば腎性浮腫患者(60kgとして)においては、一日につき約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、60kg当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のポリペプチドAの活性を阻害する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドAの遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、および本発明のポリペプチドAの発現を阻害する化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルート等により差異はあるが、例えば、経口投与の場合、一般的に例えば尿崩症患者(体重60kgとして)においては、一日につき約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mgである。非経口的に投与する場合は、該化合物の投与量は投与対象、対象疾患等によっても異なるが、例えば、注射剤の形では、一般的に例えば尿崩症患者(60kgとして)においては、一日につき約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、60kg当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のポリペプチドBの活性を促進する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドBの遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩、および本発明のポリペプチドBの発現を促進する化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルート等により差異はあるが、例えば、経口投与の場合、一般的に例えば腎性浮腫患者(体重60kgとして)においては、一日につき約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mgである。非経口的に投与する場合は、該化合物の投与量は投与対象、対象疾患等によっても異なるが、例えば、注射剤の形では、一般的に例えば腎性浮腫患者(60kgとして)においては、一日につき約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、60kg当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のポリペプチドBの活性を阻害する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドBの遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、および本発明のポリペプチドBの発現を阻害する化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルート等により差異はあるが、例えば、経口投与の場合、一般的に例えば尿崩症患者(体重60kgとして)においては、一日につき約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mgである。非経口的に投与する場合は、該化合物の投与量は投与対象、対象疾患等によっても異なるが、例えば、注射剤の形では、一般的に例えば尿崩症患者(60kgとして)においては、一日につき約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、60kg当たりに換算した量を投与することができる。
(8)本発明の抗体を用いる診断方法
本発明のポリペプチドに対する抗体(以下、「本発明の抗体」という)は、本発明のポリペプチドを特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のポリペプチドの検出や中和に使用することができる。
すなわち、本発明は、
(i)本発明の抗体と、被検液および標識化された本発明のポリペプチドとを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明のポリペプチドの割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のポリペプチドの定量法、および
(ii)被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のポリペプチドの定量法を提供する。
上記(ii)の定量法においては、一方の抗体が本発明のポリペプチドのN端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のポリペプチドのC端部に反応する抗体であることが望ましい。
また、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を用いて本発明のポリペプチドの定量を行うことができるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のF(ab’)2、Fab’、あるいはFab画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のポリペプチドの定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量(例えば、本発明のポリペプチド量)に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常本発明のポリペプチドあるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ(1次反応)、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ(2次反応)たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のポリペプチド量を定量することができる。1次反応と2次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも1種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明のポリペプチドの測定法においては、1次反応と2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、本発明のポリペプチドの結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、1次反応および2次反応に用いられる抗体は、例えば、2次反応で用いられる抗体が、本発明のポリペプチドのC端部を認識する場合、1次反応で用いられる抗体は、好ましくはC端部以外、例えばN端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原(F)と、抗体と結合した標識抗原(B)とを分離し(B/F分離)、B,Fいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、B/F分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第2抗体などを用いる液相法、および、第1抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第1抗体は可溶性のものを用い第2抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のポリペプチドの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」(講談社、昭和49年発行)、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」(講談社、昭和54年発行)、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」(医学書院、昭和53年発行)、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」(第2版)(医学書院、昭和57年発行)、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」(第3版)(医学書院、昭和62年発行)、「Methods in ENZYMOLOGY」Vol.70(Immunochemical Techniques(Part A))、同書 Vol.73(Immunochemical Techniques(Part B))、同書 Vol.74(Immunochemical Techniques(Part C))、同書 Vol.84(Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、同書 Vol.92(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、同書 Vol.121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、本発明のポリペプチドを感度良く定量することができる。
さらには、本発明の抗体を用いて本発明のポリペプチドの濃度を定量することによって、本発明のポリペプチドの濃度の変化が検出された場合、それらのポリペプチドが関与する上記疾患に罹患している、あるいは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
(9)本発明のDNA導入動物の作製
本発明は、外来性の本発明のDNA(以下、本発明の外来性DNAと略記する)またはその変異DNA(本発明の外来性変異DNAと略記する場合がある)を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
〔1〕本発明の外来性DNAまたはその変異DNAを有する非ヒト哺乳動物、
〔2〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔1〕記載の動物、
〔3〕ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第〔2〕記載の動物、および
〔4〕本発明の外来性DNAまたはその変異DNAを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性DNAまたはその変異DNAを有する非ヒト哺乳動物(以下、本発明の非ヒトトランスジェニック動物と略記する)は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階(さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に8細胞期以前)に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、DEAE−デキストラン法などにより目的とするDNAを転移することによって作出することができる。また、該DNA転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性DNAを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と公知の細胞融合法により融合させることにより本発明の非ヒトトランスジェニック動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス(例えば、純系として、C57BL/6系統,DBA2系統など、交雑系として、B6C3F1系統,BDF1系統,B6D2F1系統,BALB/c系統,ICR系統など)またはラット(例えば、Wistar,SDなど)などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
本発明の外来性DNAとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のDNAではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のDNAをいう。
本発明の変異DNAとしては、元の本発明のDNAの塩基配列に変異(例えば、突然変異など)が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたDNAなどが用いられ、また、異常DNAも含まれる。
該異常DNAとしては、異常な本発明のポリペプチドを発現させるDNAを意味し、例えば、正常な本発明のポリペプチドの機能を抑制するポリペプチドを発現させるDNAなどが用いられる。
本発明の外来性DNAは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のDNAを対象動物に転移させるにあたっては、該DNAを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したDNAコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトDNAを転移させる場合、これと相同性が高い本発明のDNAを有する各種哺乳動物(ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど)由来のDNAを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトDNAを結合したDNAコンストラクト(例えば、ベクター)を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のDNAを高発現するDNA転移哺乳動物を作出することができる。
本発明のポリペプチドの発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記のDNA発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、(i)ウイルス(例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、JCウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルスなど)に由来するDNAのプロモーター、(ii)各種哺乳動物(ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど)由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンII、ウロプラキンII、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性タンパク質、グルタチオンS−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンK1,K10およびK14、コラーゲンI型およびII型、サイクリックAMP依存タンパク質キナーゼβIサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ(一般にTie2と略される)、ナトリウムカリウムアデノシン三リン酸化酵素(Na,K−ATPase)、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインIおよびIIA、メタロプロティナーゼ1組織インヒビター、MHCクラスI抗原(H−2L)、H−ras、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ(TPO)、ペプチド鎖延長囚子1α(EF−1α)、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖1および2、ミエリン基礎タンパク質、チログロブリン、Thy−1、免疫グロブリン、H鎖可変部(VNP)、血清アミロイドPコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンC、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンA、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトペプチド鎖延長因子1α(EF−1α)のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、DNA転移哺乳動物において目的とするmRNAの転写を終結する配列(一般にターミネーターと呼ばれる)を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各DNAの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウイルスのSV40ターミネーターなどが用いられる。
その他、目的とする外来性DNAをさらに高発現させる目的で各DNAのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核DNAのイントロンの一部などをプロモーター領域の5’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の3’下流に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のポリペプチドの翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物(ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど)由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来DNAおよび市販の各種ゲノムDNAライブラリーよりゲノムDNAの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来RNAより公知の方法により調製された相補DNAを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常DNAは、上記の細胞または組織より得られた正常なポリペプチドの翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうるDNAコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のDNA工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性DNAの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。DNA転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性DNAが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性DNAを保持することを意味する。本発明の外来性DNAを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性DNAを有する。
本発明の外来性正常DNAを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性DNAを安定に保持することを確認して、該DNA保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性DNAの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。DNA転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性DNAが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性DNAを過剰に有することを意味する。本発明の外来性DNAを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性DNAを過剰に有する。
導入DNAを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該DNAを過剰に有するように繁殖継代することができる。
本発明の正常DNAを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常DNAが高発現させられており、内在性の正常DNAの機能を促進することにより最終的に本発明のポリペプチドの機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常非ヒトトランスジェニック動物を用いて、本発明のポリペプチドの機能亢進症や、本発明のポリペプチドが関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。また、本発明の外来性正常DNAを転移させた哺乳動物は、本発明のポリペプチドの増加症状を有することから、本発明のポリペプチドに関連する疾患に対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、本発明の外来性異常DNAを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性DNAを安定に保持することを確認して該DNA保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来DNAを前述のプラスミドに組み込んで原料として用いることができる。プロモーターとのDNAコンストラクトは、通常のDNA工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常DNAの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。DNA転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常DNAが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常DNAを有することを意味する。本発明の外来性DNAを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常DNAを有する。導入DNAを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該DNAを有するように繁殖継代することができる。
本発明の異常DNAを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常DNAが高発現させられており、内在性の正常DNAの機能を阻害することにより最終的に本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常非ヒトトランスジェニック動物を用いて、本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常DNA高発現動物は、本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症における本発明の異常ポリペプチドによる正常ポリペプチドの機能阻害(dominant negative作用)を解明するモデルとなる。
また、本発明の外来異常DNAを転移させた哺乳動物は、本発明のポリペプチドの増加症状を有することから、本発明のポリペプチドまたはの機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記2種類の本発明の非ヒトトランスジェニック動物のその他の利用可能性として、例えば、
(i)組織培養のための細胞源としての使用、
(ii)本発明の非ヒトトランスジェニック動物の組織中のDNAもしくはRNAを直接分析するか、またはDNAにより発現されたポリペプチド組織を分析することによる、本発明のポリペプチドにより特異的に発現あるいは活性化するポリペプチドとの関連性についての解析、
(iii)DNAを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
(iv)上記(iii)記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
(v)本発明の変異ポリペプチドを単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
さらに、本発明の非ヒトトランスジェニック動物を用いて、本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症などを含む、本発明のポリペプチドに関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、本発明のポリペプチドに関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、本発明の非ヒトトランスジェニック動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどのタンパク質分解酵素により、遊離したDNA転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、本発明のポリペプチド産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明のポリペプチドおよびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明の非ヒトトランスジェニック動物を用いて、本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症を含む、本発明のポリペプチドに関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明の非ヒトトランスジェニック動物または本発明の外来性DNA発現ベクターを用いて、本発明のポリペプチドが関連する疾患のDNA治療法を検討、開発することが可能である。
(10)ノックアウト動物
本発明は、本発明のDNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
1)本発明のDNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
2)該DNAがレポーター遺伝子(例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子)を導入することにより不活性化された第1)項記載の胚幹細胞、
3)ネオマイシン耐性である第1)項記載の胚幹細胞、
4)非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第1)項記載の胚幹細胞、
5)ゲッ歯動物がマウスである第4)項記載の胚幹細胞、
6)本発明のDNAが不活性化された該DNA発現不全非ヒト哺乳動物、
7)該DNAがレポーター遺伝子(例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子)を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のDNAに対するプロモーターの制御下で発現しうる第6)項記載の非ヒト哺乳動物、
8)非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第6)項記載の非ヒト哺乳動物、
9)ゲッ歯動物がマウスである第8)項記載の非ヒト哺乳動物、および
10)第7)項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のDNAに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法などを提供する。
本発明のDNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のDNAに人為的に変異を加えることにより、DNAの発現能を抑制するか、もしくは該DNAがコードしている本発明のポリペプチドの活性を実質的に喪失させることにより、DNAが実質的に本発明のポリペプチドの発現能を有さない(以下、本発明のノックアウトDNAと称することがある)非ヒト哺乳動物の胚幹細胞(以下、ES細胞と略記する)をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のDNAに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該DNA配列の一部又は全部の削除、他DNAを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエクソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトDNAを作製すればよい。
本発明のDNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞(以下、本発明のDNA不活性化ES細胞または本発明のノックアウトES細胞と略記する)の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のDNAを単離し、そのエクソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはlacZ(β−ガラクトシダーゼ遺伝子)、cat(クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子)を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエクソンの機能を破壊するか、あるいはエクソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるDNA配列(例えば、polyA付加シグナルなど)を挿入し、完全なmRNAを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したDNA配列を有するDNA鎖(以下、ターゲッティングベクターと略記する)を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたES細胞について本発明のDNA上あるいはその近傍のDNA配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のDNA配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のDNA以外の近傍領域のDNA配列をプライマーとしたPCR法により解析し、本発明のノックアウトES細胞を選別することにより得ることができる。
また、相同組換え法等により本発明のDNAを不活化させる元のES細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知のEvansとKaufmanの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのES細胞の場合、現在、一般的には129系のES細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなES細胞を取得するなどの目的で例えば、C57BL/6マウスやC57BL/6の採卵数の少なさをDBA/2との交雑により改善したBDF1マウス(C57BL/6とDBA/2とのF1)を用いて樹立したものなども良好に用いうる。BDF1マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、C57BL/6マウスを背景に持つので、これを用いて得られたES細胞は病態モデルマウスを作出したとき、C57BL/6マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をC57BL/6マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ES細胞を樹立する場合、一般には受精後3.5日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に8細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのES細胞を用いてもよいが、通常雄のES細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ES細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、PCR法によりY染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その1例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約106個の細胞数を要していたのに対して、1コロニー程度のES細胞数(約50個)で済むので、培養初期におけるES細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、第二次セレクションとしては、例えば、G−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるES細胞の染色体数は正常数の100%が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ES細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞(例えば、マウスでは染色体数が2n=40である細胞)に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、STO繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でLIF(1−10000U/ml)存在下に炭酸ガス培養器内(好ましくは、5%炭酸ガス、95%空気または5%酸素、5%炭酸ガス、90%空気)で約37℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン/EDTA溶液(通常0.001−0.5%トリプシン/0.1−5mM EDTA、好ましくは約0.1%トリプシン/1mM EDTA)処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常1−3日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ES細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M.J.Evans及びM.H.Kaufman,ネイチャー(Nature)第292巻、154頁、1981年;G.R.Martin プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)第78巻、7634頁、1981年;T.C.Doetschmanら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発明のES細胞を分化させて得られる本発明のDNA発現不全細胞は、インビトロにおけ本発明のポリペプチドの細胞生物学的検討において有用である。
本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のmRNA量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のDNAが不活性化されたDNA配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のDNAと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のDNAをノックアウトさせることができる。
本発明のDNAがノックアウトされた細胞は、本発明のDNA上またはその近傍のDNA配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のDNA配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のDNA以外の近傍領域のDNA配列とをプライマーとしたPCR法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のDNAが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、8細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のDNA座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のDNA座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のDNA座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のDNA座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明のポリペプチドのヘテロ発現不全個体であり、本発明のポリペプチドのヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明のポリペプチドのホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でDNA溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のDNA座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明のDNAがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該DNAがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化DNAの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化DNAを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体1,ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化DNAを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のDNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のポリペプチドにより誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のポリペプチドの生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
(a)本発明のDNAの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のDNAの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のDNAの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、前記した医薬候補化合物のスクリーニング方法などで用いられる試験化合物の塩と同様の物が用いられる。
具体的には、本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のポリペプチドの欠損や損傷などによって引き起こされる疾患に対して治療・予防効果を有するので、該疾患に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、前記した試験化合物の塩と同様の物が用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のポリペプチドを含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたはその他の哺乳動物(例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど)に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、該化合物を経口投与する場合、一般的に成人(体重60kgとして)の腎性浮腫患者においては、一日につき該化合物を約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mg投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、該化合物を注射剤の形で通常成人(60kgとして)の腎性浮腫患者に投与する場合、一日につき該化合物を約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、60kg当たりに換算した量を投与することができる。
(b)本発明のDNAに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法
本発明は、本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のDNAに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のDNAがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のDNAに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、前記した医薬候補化合物のスクリーニング方法などで用いられる試験化合物の塩と同様の物が用いられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子(lacZ)、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明のDNAをレポーター遺伝子で置換された本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のDNAに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、本発明のポリペプチドをコードするDNA領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子(lacZ)で置換している場合、本来、本発明のポリペプチドの発現する組織で、本発明のポリペプチドの代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−ガラクトピラノシド(X−gal)のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明のポリペプチドの動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明のポリペプチド欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液(PBS)で洗浄後、X−galを含む染色液で、室温または37℃付近で、約30分ないし1時間反応させた後、組織標本を1mM EDTA/PBS溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、lacZをコードするmRNAを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のDNAに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、前記した試験化合物の塩と同様の物が用いられる。
本発明のDNAに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、本発明のポリペプチドの発現を促進し、該ポリペプチドの機能を促進することができるので、例えば、バソプレシン分泌抑制剤などとして、例えば、腎性浮腫、尿排出障害(例、膀胱収縮障害、尿道通過障害、排尿困難、排尿痛、尿路閉塞など)、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群(SIADH)、高血圧などの予防・治療剤、拒食症などの予防・治療剤、摂食(食欲)促進剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害(例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群(時差ボケ)など)〕などの予防・治療剤などの医薬として有用である。
また、本発明のDNAに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明のポリペプチドの発現を阻害し、該ポリペプチドの機能を阻害することができるので、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁(例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など)など〕、多尿症、尿崩症(例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など)、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング(Cushing)症候群などの予防・治療剤、肥満症(例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など)、摂食亢進症などの予防・治療剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害(例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群(時差ボケ)など)〕などの予防・治療剤などの低毒性で安全な医薬として有用である。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のポリペプチドまたはその塩などを含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたはその他の哺乳動物(例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど)に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、本発明のDNAに対するプロモーター活性を促進する化合物を経口投与する場合、一般的に成人(体重60kgとして)の腎性浮腫患者においては、一日につき該化合物を約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mg投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のDNAに対するプロモーター活性を促進する化合物を注射剤の形で通常成人(60kgとして)の腎性浮腫患者に投与する場合、一日につき該化合物を約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、60kg当たりに換算した量を投与することができる。
一方、例えば、本発明のDNAに対するプロモーター活性を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人(体重60kgとして)の尿崩症患者においては、一日につき該化合物を約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mg投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のDNAに対するプロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人(60kgとして)の尿崩症患者に投与する場合、一日につき該化合物を約0.01〜30mg程度、好ましくは約0.1〜20mg程度、より好ましくは約0.1〜10mg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、60kg当たりに換算した量を投与することができる。
このように、本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のDNAに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のDNA発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療剤の開発に大きく貢献することができる。
また、本発明のポリペプチドのプロモーター領域を含有するDNAを使って、その下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物(遺伝子導入動物)を作成すれば、特異的にそのポリペプチドを合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、本発明のポリペプチドそのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC−IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければL体を示すものとする。
DNA :デオキシリボ核酸
cDNA :相補的デオキシリボ核酸
A :アデニン
T :チミン
G :グアニン
C :シトシン
Y :チミンまたはシトシン
N :チミン、シトシン、アデニンまたはグアニン
R :アデニンまたはグアニン
M :シトシンまたはアデニン
W :チミンまたはアデニン
S :シトシンまたはグアニン
RNA :リボ核酸
mRNA :メッセンジャーリボ核酸
dATP :デオキシアデノシン三リン酸
dTTP :デオキシチミジン三リン酸
dGTP :デオキシグアノシン三リン酸
dCTP :デオキシシチジン三リン酸
ATP :アデノシン三リン酸
EDTA :エチレンジアミン四酢酸
SDS :ドデシル硫酸ナトリウム
TFA :トリフルオロ酢酸
EIA :エンザイムイムノアッセイ
GlyまたはG :グリシン
AlaまたはA :アラニン
ValまたはV :バリン
LeuまたはL :ロイシン
IleまたはI :イソロイシン
SerまたはS :セリン
ThrまたはT :スレオニン
CysまたはC :システイン
MetまたはM :メチオニン
GluまたはE :グルタミン酸
AspまたはD :アスパラギン酸
LysまたはK :リジン
ArgまたはR :アルギニン
HisまたはH :ヒスチジン
PheまたはF :フェニルアラニン
TyrまたはY :チロシン
TrpまたはW :トリプトファン
ProまたはP :プロリン
AsnまたはN :アスパラギン
GlnまたはQ :グルタミン
pGluまたはpE :ピログルタミン酸
Me :メチル基
Et :エチル基
Bu :ブチル基
Ph :フェニル基
TC :チアゾリジン−4(R)−カルボキサミド基
Bom :ベンジルオキシメチル
NMP :N−メチルピロリドン
PAM :フェニルアセトアミドメチル
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Tos :p−トルエンスルフォニル
HONB :N−ヒドロキシ−5−ノルボルネンー2,3−ジカルボキシイミド
Bzl :ベンジル
Z :ベンジルオキシカルボニル
Br−Z :2−ブロモベンジルオキシカルボニル
Cl−Z :2−クロルベンジルオキシカルボニル
Boc :t−ブチルオキシカルボニル
HOBt :1−ヒドロキシベンズトリアゾール
DCC :N、N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
TFA :トリフルオロ酢酸
Fmoc :N−9−フルオレニルメトキシカルボニル
DNP :ジニトロフェニル
Bum :ターシャリーブトキシメチル
Trt :トリチル
BSA :ウシ血清アルブミン
CHAPS :3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−1−プロパンスルホナート
PMSF :フェニルメチルスルホニルフルオリド
E64 :(L−3−trans−カルボキオキシラン−2−カルボニル)L−ロイシル−アグマチン
GDP :グアノシン−5’−二リン酸
MEMα :ミニマムエッセンシャルメジウムアルファ
Fura−2AM :1−[6−アミノ−2−(5−カルボキシ−2−オキサゾリル)−5−ベンゾフラニロキシ]−2−(2−アミノ−5メチルフェノキシ)−エタン−N,N,N’,N’−四酢酸ペンタアセトキシメチルエステル
HBSS :ハンクス平衡塩液
Fluo−3AM :1−[2−アミノ−5−(2,7−ジクロロ−6−ヒドロキシ−3−オキシ−9−キサンテニル)フェノキシ]−2−(2−アミノ−5−メチルフェノキシ)エタン−N,N,N’,N’−四酢酸ペンタアセトキシメチルエステル
HEPES :2−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]エタンスルホン酸
MeBzl :4−メチルベンジル
NMP :N−メチルピロリドン
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号:1〕
ヒトVGFのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:2〕
ラットVGFのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:3〕
マウスVGFのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:4〕
ヒトNERP−1のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:5〕
ラットNERP−1のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:6〕
マウスNERP−1のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:7〕
ヒトNERP−2のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:8〕
ラットNERP−2のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:9〕
マウスNERP−2のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:10〕
ヒトVGFをコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:11〕
ラットVGFをコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:12〕
ヒトNERP−1をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:13〕
ラットNERP−1をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:14〕
ヒトNERP−2をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:15〕
ラットNERP−2をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:16〕
マウスVGFをコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:17〕
マウスNERP−1をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:18〕
マウスNERP−2をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:19〕
以下の実施例2における抗原として用いられたポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:20〕
以下の実施例2における抗原として用いられたポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:21〕
以下の実施例2における抗原として用いられたポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:22〕
以下の実施例2におけるRIAに用いられた125Iで放射性標識したポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:23〕
以下の実施例2におけるRIAに用いられた125Iで放射性標識したポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:24〕
以下の実施例2におけるRIAに用いられた125Iで放射性標識したポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド(以下、「本発明のポリペプチドA」と略称する場合がある)および配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド(以下、「本発明のポリペプチドB」と略称する場合がある)は、例えば、ヒト、哺乳動物(例えば、モルモット、ラット、マウス、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル、イヌ)などのあらゆる細胞(例えば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、膵臓ランゲルハンス島、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞(例、マクロファージ、T細胞、B細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球)、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など)や血球系の細胞、またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位(例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質)、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管(例、大腸、小腸)、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、精巣、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するポリペプチドであってもよく、合成ペプチドであってもよい。
配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表わされるアミノ酸配列と約50%以上、好ましくは約60%以上、さらに好ましくは約70%以上、より好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用いて計算することができる。
配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドとしては、例えば、前記の配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドなどが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、本発明のポリペプチドの有する活性、例えば、バソプレシン分泌抑制活性、レセプターとの結合活性、レセプター発現細胞に対する細胞刺激活性(例、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ca2+遊離、細胞内cAMP生成、細胞内cAMP生成抑制、細胞内cGMP生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、c−fosの活性化、pHの低下、GTPγS結合活性、cAMP依存性プロテインキナーゼの活性化、cGMP依存性プロテインキナーゼの活性化、リン脂質依存性プロテインキナーゼの活性化、またはマイトジェン活性化タンパク質リン酸化酵素(MAPキナーゼ)の活性化などを促進する活性など)、前述の疾患の予防・治療活性などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的(例、生理学的に、または薬理学的に)に同質であることを示す。したがって、バソプレシン分泌抑制活性、レセプターとの結合活性、レセプター発現細胞に対する細胞刺激活性または疾患の予防・治療活性などの活性が同等(例、約0.01〜100倍、好ましくは約0.5〜20倍、より好ましくは約0.5〜2倍)であることが好ましいが、これらの活性の程度やポリペプチドの分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
バソプレシン分泌抑制活性、レセプターとの結合活性、レセプター発現細胞に対する細胞刺激活性または疾患の予防・治療活性などの活性の測定は、公知の方法に準じて行なうことができる。例えば、バソプレシン分泌抑制活性については、後述の実施例3に記載の方法などに従って測定することができる。
また、本発明のポリペプチドAとしては、(i)配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列中の1または2個以上(例えば1〜15個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(ii)配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列に1または2個以上(例えば1〜15個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、(iii)配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列中の1または2個以上(例えば1〜15個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、(iv)配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列中の1または2個以上(例えば1〜15個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、または(v)それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するポリペプチドなども用いられる。
本発明のポリペプチドAの具体例としては、配列番号:4で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、配列番号:5で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、配列番号:6で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩などがあげられる。
本発明のポリペプチドAの部分ペプチドとしては、本発明のポリペプチドAと実質的に同質の活性を有していればよく、特に制限されない。該部分ペプチドのアミノ酸の数は、本発明のポリペプチドAの構成アミノ酸配列のうち少なくとも5個以上、好ましくは10個以上、好ましくは15個以上、好ましくは20個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどがあげられる。
ここで、「実質的に同質の活性」とは、上記と同意義を示す。「実質的に同質の活性」の測定は上記と同様に行なうことができる。
該部分ペプチドとしては、(i)上記アミノ酸配列中の1または2個以上(好ましくは数個(1〜4個))のアミノ酸が欠失し、(ii)上記アミノ酸配列に1または2個以上(好ましくは、1〜15個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸が付加し、または(iii)上記アミノ酸配列中の1または2個以上(好ましくは数個(1〜4個))のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
該部分ペプチドの具体例としては、配列番号:4で表されるアミノ酸配列において、例えば第10番目〜第26番目のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号:5で表されるアミノ酸配列において、例えば第10番目〜第25番目のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号:6で表されるアミノ酸配列において、例えば第10番目〜第25番目のアミノ酸配列を有するペプチドなどがあげられる。なかでも、好ましくは、配列番号:4で表されるアミノ酸配列において、第12番目〜第26番目、第13番目〜第26番目、第14番目〜第26番目、第15番目〜第26番目、第16番目〜第26番目、第17番目〜第26番目、第18番目〜第26番目、第19番目〜第26番目、第20番目〜第26番目、第21番目〜第26番目のアミノ酸配列を有するペプチド、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列において、第11番目〜第25番目、第12番目〜第25番目、第13番目〜第25番目、第14番目〜第25番目、第15番目〜第25番目、第16番目〜第25番目、第17番目〜第25番目、第18番目〜第25番目、第19番目〜第25番目、第20番目〜第25番目のアミノ酸配列を有するペプチドなどがあげられる。
以下、本発明のポリペプチドAとその部分ペプチドとをまとめて「本発明のポリペプチドA」と称することもある。
配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表わされるアミノ酸配列と約50%以上、好ましくは約60%以上、さらに好ましくは約70%以上、より好ましくは約80%以上、特に好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用いて計算することができる。
配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチドとしては、例えば、前記の配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドなどが好ましい。
実質的に同質の活性としては、例えば、本発明のポリペプチドの有する活性、例えば、バソプレシン分泌抑制活性、摂食促進活性、レセプターとの結合活性、レセプター発現細胞に対する細胞刺激活性(例、アラキドン酸遊離、アセチルコリン遊離、細胞内Ca2+遊離、細胞内cAMP生成、細胞内cAMP生成抑制、細胞内cGMP生成、イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内タンパク質のリン酸化、c−fosの活性化、pHの低下、GTPγS結合活性、cAMP依存性プロテインキナーゼの活性化、cGMP依存性プロテインキナーゼの活性化、リン脂質依存性プロテインキナーゼの活性化、またはマイトジェン活性化タンパク質リン酸化酵素(MAPキナーゼ)の活性化などを促進する活性など)、前述の疾患の予防・治療活性などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの活性が性質的(例、生理学的に、または薬理学的に)に同質であることを示す。したがって、バソプレシン分泌抑制活性、摂食促進活性、レセプターとの結合活性、レセプター発現細胞に対する細胞刺激活性、疾患の予防・治療活性などの活性が同等(例、約0.01〜100倍、好ましくは約0.5〜20倍、より好ましくは約0.5〜2倍)であることが好ましいが、これらの活性の程度やポリペプチドの分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
バソプレシン分泌抑制活性、摂食促進活性、レセプターとの結合活性、レセプター発現細胞に対する細胞刺激活性、疾患の予防・治療活性などの活性の測定は、公知の方法に準じて行なうことができる。例えば、バソプレシン分泌抑制活性は、後述の実施例3に記載の方法などに従って測定することができ、摂食促進活性は、後述の実施例5に記載の方法などに従って測定することができる。
また、本発明のポリペプチドBとしては、(i)配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列中の1または2個以上(例えば1〜15個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、(ii)配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列に1または2個以上(例えば1〜15個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、(iii)配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列中の1または2個以上(例えば1〜15個程度、好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、(iv)配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列中の1または2個以上(例えば1〜15個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、または(v)それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するポリペプチドなども用いられる。
本発明のポリペプチドBの具体例としては、配列番号:7で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号:8で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、配列番号:9で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドなどがあげられる。
本発明のポリペプチドBの部分ペプチドとしては、本発明のポリペプチドBと実質的に同質の活性を有していればよく、特に制限されない。該部分ペプチドのアミノ酸の数は、本発明のポリペプチドBの構成アミノ酸配列のうち少なくとも5個以上、好ましくは10個以上、好ましくは15個以上、好ましくは20個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどがあげられる。
ここで、「実質的に同質の活性」とは、上記と同意義を示す。「実質的に同質の活性」の測定は上記と同様に行なうことができる。
該部分ペプチドとしては、(i)上記アミノ酸配列中の1または2個以上(好ましくは数個(1〜4個))のアミノ酸が欠失し、(ii)上記アミノ酸配列に1または2個以上(好ましくは、1〜15個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは数個(1〜5個))のアミノ酸が付加し、または(iii)上記アミノ酸配列中の1または2個以上(好ましくは数個(1〜4個))のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
該部分ペプチドの具体例としては、配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列において、例えば第20番目〜第38番目のアミノ酸配列を有するペプチドなどがあげられる。なかでも、好ましくは、第24番目〜第38番目、第25番目〜第38番目、第26番目〜第38番目、第27番目〜第38番目、第28番目〜第38番目、第29番目〜第38番目、第30番目〜第38番目、第31番目〜第38番目、第32番目〜第38番目、第33番目〜第38番目のアミノ酸配列を有するペプチドなどがあげられる。
以下、本発明のポリペプチドBとその部分ペプチドとをまとめて本発明のポリペプチドBと称することがある。
さらに、「本発明のポリペプチドA」と「本発明のポリペプチドB」とを、まとめて「本発明のポリペプチド」と称することもある。
本発明のポリペプチドまたはその部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸(例、無機酸、有機酸)や塩基(例、アルカリ金属塩)などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば無機酸(例、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸)との塩、あるいは有機酸(例、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸)との塩などが用いられる。
本明細書におけるポリペプチドおよびタンパク質はペプチド標記の慣例に従って左端がN末端(アミノ末端)、右端がC末端(カルボキシル末端)である。例えば、配列番号:1で表されるアミノ酸配列などを含有するポリペプチドはC末端が通常カルボキシル基(−COOH)またはカルボキシレート(−COO−)であるが、C末端がアミド(−CONH2)またはエステル(−COOR)であってもよい。エステルのRとしては、例えばメチル、エチル、n−プロピル、イソプロピルもしくはn−ブチルなどのC1−6アルキル基、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのC3−8シクロアルキル基、フェニル、α−ナフチルなどのC6−12アリール基、ベンジル、フェネチル、ベンズヒドリルなどのフェニル−C1−2アルキル、もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−C1−2アルキルなどのC7−14アラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロイルオキシメチル基などがあげられる。
本発明のポリペプチドとしてはC末端のカルボキシル基(−COOH)がアミド(−CONH2)であるものが好ましい。
具体的には、例えば、C末端のアミノ酸残基がアミド化されている配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドなどが好ましく用いられる。
本発明のポリペプチドがC末端以外にカルボキシル基(またはカルボキシレート)を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のポリペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したC末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明のポリペプチドには、上記したポリペプチドにおいて、N末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基(例えば、ホルミル基、アセチル基などのC2−6アルカノイル基などのC1−6アシル基など)で保護されているもの、N末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、N端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基(例、−OH、−SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など)が適当な保護基(例えば、ホルミル基、アセチル基などのC2−6アルカノイル基などのC1−6アシル基など)で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明のポリペプチドBとしては、N末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したものが好ましく、この場合、さらに上記したようにC末端のアミノ酸残基がアミドまたはエステルであってもよく、アミドであるのがより好ましい。
具体的には、例えば、N末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化されている配列番号:7、配列番号:8もしくは配列番号:9で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、または、C末端のアミノ酸残基がアミド化されており、かつN末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化されている配列番号:7、配列番号:8もしくは配列番号:9で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドなどが好ましく用いられる。また、本発明の部分ペプチドはC末端が、カルボキシル基(−COOH)、カルボキシレート(−COO−)、アミド(−CONH2)またはエステル(−COOR)であってもよい。本発明の部分ペプチドがC末端以外にカルボキシル基(またはカルボキシレート)を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したC末端のエステルなどが用いられる。
本発明の部分ペプチドとしてはC末端のカルボキシル基(−COOH)がアミド(−CONH2)であるものが好ましい。
さらに、本発明の部分ペプチドには、前記した本発明のポリペプチドと同様に、N末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、N末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、N端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明のポリペプチドまたはその塩は、前述したヒトや哺乳動物の細胞または組織から自体公知のペプチド・タンパク質の精製方法によって製造することもできるし、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするDNAを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド・タンパク質合成法またはこれに準じて製造することもできる。
本発明のポリペプチドまたはその塩をヒト、哺乳動物などの組織または細胞から製造する場合、ヒト、哺乳動物などの組織または細胞をホモジナイズした後、酸、有機溶媒などで抽出を行い、該抽出液を、塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
上記したように本発明のポリペプチドは、公知のポリペプチドの合成法に従って、あるいは本発明のポリペプチドを含有するポリペプチドを適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ポリペプチドの合成法としては、例えば固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明のポリペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のポリペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては例えば、以下の(1)〜(5)に記載された方法があげられる。
(1)M.BodanszkyおよびM.A.Ondetti、ペプチド シンセシス(Peptide Synthesis),Interscience Publishers,New York(1966年);
(2)SchroederおよびLuebke、ザ ペプチド(The Peptide),Academic Press,New York(1965年);
(3)泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善(株)(1975年);
(4)矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座1、タンパク質の化学IV、205、(1977年);
(5)矢島治明監修、続医薬品の開発 第14巻 ペプチド合成 広川書店。
また、反応後は通常の精製法、たとえば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明のポリペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる本発明のポリペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
本発明のポリペプチドのアミド体は、アミド形成に適した市販のペプチド合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、4−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、4−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、PAM樹脂、4−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、4−(2’,4’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル)フェノキシ樹脂、4−(2’,4’−ジメトキシフェニル−Fmocアミノエチル)フェノキシ樹脂などをあげることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするペプチドの配列通りに、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からポリペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、必要に応じて高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のポリペプチドを取得する。
上記した保護されたアミノ酸の縮合に関しては、ポリペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としてはDCC、N,N’−ジイソプロピルカルボジイミド、N−エチル−N’−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミドなどがあげられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤(例えば、HOBT、HOOBTなど)とともに保護されたアミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはHOBTエステルあるいはHOOBTエステルとしてあらかじめ保護されたアミノ酸の活性化を行ったのちに樹脂に添加することができる。保護されたアミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ポリペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。たとえばN,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド、N−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジンなどの三級アミン類、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−20℃〜50℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常1.5ないし4倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化して、後の反応に影響を及ぼさないようにすることができる。
原料アミノ酸のアミノ基の保護基としては、たとえば、Z、Boc、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、4−メトキシベンジルオキシカルボニル、Cl−Z、Br−Z、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、2−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Fmocなどがあげられる。カルボキシル基の保護基としては、たとえばRとして上記したC1−6アルキル基、C3−8シクロアルキル基、C7−14アラルキル基の他、2−アダマンチル、4−ニトロベンジル、4−メトキシベンジル、4−クロロベンジル、フェナシル基およびベンジルオキシカルボニルヒドラジド、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド、トリチルヒドラジドなどがあげられる。
セリンおよびスレオニンの水酸基は、たとえばエステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては例えばアセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭素から誘導される基などがあげられる。また、エーテル化に適する基としては、たとえばベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ターシャリーブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、たとえばBzl、Cl2−Bzl、2−ニトロベンジル、Br−Z、ターシャリーブチルなどがあげられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、Tos、4−メトキシ−2,3,6−トリメチルベンゼンスルホニル、DNP、ベンジルオキシメチル、Bum、Boc、Trt、Fmocなどがあげられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、たとえば対応する酸無水物、アジド、活性エステル[アルコール(たとえば、ペンタクロロフェノール、2,4,5−トリクロロフェノール、2,4−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、HONB、N−ヒドロキシスクシミド、N−ヒドロキシフタルイミド、HOBT)とのエステル]などがあげられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、たとえば対応するリン酸アミドなどがあげられる。
保護基の除去(脱離)方法としては、たとえばPd黒あるいはPd炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元などもあげられる。上記酸処理による脱離反応は一般に−20℃〜40℃の温度で行われるが、酸処理においてはアニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、1,4−ブタンジチオール、1,2−エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる2,4−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の1,2−エタンジチオール、1,4−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、ならびにその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知の手段から適宜選択しうる。
本発明のポリペプチドのアミド体を得る別の方法としては、まず、カルボキシル末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化した後、アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のN末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたペプチドとC末端のカルボキシル基の保護基のみを除いたペプチド(またはアミノ酸)とを製造し、この両ペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護ペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗ポリペプチドを得ることができる。この粗ポリペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のポリペプチドのアミド体を得ることができる。
本発明のポリペプチドのエステル体を得るにはカルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、ポリペプチドのアミド体と同様にして所望のポリペプチドのエステル体を得ることができる。
本発明のポリペプチドの部分ペプチドは、本発明のポリペプチドを適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができるし、上記のポリペプチドの合成法に従って製造することができる。本発明のポリペプチドの部分ペプチドのアミドまたはエステルも上述のアミド体またはエステル体の製造方法に準じて製造することができる。さらに本発明のポリペプチドの部分ペプチドの塩としては、上記の本発明のポリペプチドの塩と同様のものなどがあげられる。
該アミノ酸配列中のアミノ酸の実質的に同一な置換物としては、たとえばそのアミノ酸が属するクラスの他のアミノ酸類から選ぶことができる。非極性(疎水性)アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニンなどがあげられる。極性(中性)アミノ酸としてはグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンなどがあげられる。陽電荷をもつ(塩基性)アミノ酸としてはアルギニン、リジン、ヒスチジンなどがあげられる。負電荷をもつ(酸性)アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などがあげられる。
本発明のポリペプチドまたは部分ペプチドが標識化されたものとしては、公知の方法で、アイソトープラベル化されたもの、蛍光標識されたもの(例えば、フルオレセインなどによる蛍光標識)、ビオチン化されたもの、酵素標識されたものなどがあげられる。
具体的には、例えば公知の方法によって、〔3H〕、〔125I〕、〔14C〕、〔35S〕などで標識された本発明のポリペプチドなどを利用することができる。
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、前述した本発明のポリペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。好ましくはDNAである。DNAとしては、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するペプチドをコードするDNAを含有するDNAであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムDNA、ゲノムDNAライブラリー、前記した組織・細胞由来のcDNA、前記した組織・細胞由来のcDNAライブラリー、合成DNAのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターはバクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した組織・細胞よりRNA画分を調製したものを用いて直接Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction(以下、RT−PCR法と略称する)によって増幅することもできる。
本発明のポリペプチドをコードするDNAとしては、例えば、配列番号:12、配列番号:13もしくは配列番号:17で表される塩基配列を含有するDNA、または配列番号:12、配列番号:13もしくは配列番号:17で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号:4、配列番号:5もしくは配列番号:6で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドと実質的に同質の性質を有するポリペプチドをコードするDNA、または配列番号:14、配列番号:15もしくは配列番号:18で表される塩基配列を含有するDNA、または配列番号:14、配列番号:15もしくは配列番号:18で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号:7、配列番号:8もしくは配列番号:9で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドと実質的に同質の性質を有するポリペプチドをコードするDNAであれば何れのものでもよい。
配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:17または配列番号:18で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるDNAとしては、例えば、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:17または配列番号:18で表される塩基配列と約85%以上、好ましくは約90%以上、好ましくは約95%以上、好ましくは約98%以上の相同性を有する塩基配列を含有するDNAなどが用いられる。
塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST(National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool)を用い、以下の条件(期待値=10;ギャップを許す;フィルタリング=ON;マッチスコア=1;ミスマッチスコア=−3)にて計算することができる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning)2nd(J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab.Press,1989)に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約19〜40mM、好ましくは約19〜20mMで、温度が約50〜70℃、好ましくは約60〜65℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約19mMで温度が約65℃の場合が最も好ましい。より具体的には、配列番号:4で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするDNAとしては、配列番号:12で表される塩基配列を含有するDNAなどが、配列番号:5で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするDNAとしては、配列番号:13で表される塩基配列を含有するDNAなどが、配列番号:6で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするDNAとしては、配列番号:17で表される塩基配列を含有するDNAなどが、配列番号:7で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするDNAとしては、配列番号:14で表される塩基配列を含有するDNAなどが、配列番号:8で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするDNAとしては、配列番号:15で表される塩基配列を含有するDNAなどが、配列番号:9で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをコードするDNAとしては、配列番号:18で表される塩基配列を含有するDNAなどが用いられる。
本発明の部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド(例、DNA)としては、前述した本発明の部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムDNA、ゲノムDNAライブラリー、前記した細胞・組織由来のcDNA、前記した細胞・組織由来のcDNAライブラリー、合成DNAのいずれでもよい。
本発明の部分ペプチドをコードするDNAとしては、例えば、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:17もしくは配列番号:18で表される塩基配列を含有するDNAの一部分を含有するDNA、または配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:17もしくは配列番号:18で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、本発明のポリペプチドと実質的に同質の活性を有するポリペプチドをコードするDNAの一部分を含有するDNAなどが用いられる。
配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:17もしくは配列番号:18で表される塩基配列とハイブリダイズできるDNAは、前記と同意義を示す。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。
(DNAのクローニング)
本発明のポリペプチドをコードするDNAは以下の遺伝子工学的手法によっても製造することができる。
本発明のポリペプチドを完全にコードするDNAのクローニングの手段としては、本発明のポリペプチドの部分塩基配列を有する合成DNAプライマーを用いて公知のPCR法によって前記DNAライブラリー等から目的とするDNAを増幅する方法、または適当なベクターに組み込んだDNAを本発明のポリペプチドをコードする塩基配列の一部あるいは全領域を有するDNA断片もしくは合成DNAを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別する方法があげられる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えばMolecular Cloning(2nd ed.;J.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Lab.Press,1989)に記載の方法などに従って行われる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行う。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。該ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約19〜40mM、好ましくは約19〜20mMで、温度が約50〜70℃、好ましくは約60〜65℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約19mMで温度が約65℃の場合が最も好ましい。
DNAの塩基配列の変換は、公知のキット、例えば、MutanTM−super Express Km(宝酒造(株))、MutanTM−K(宝酒造(株))等を用いて、ODA−LA PCR法やGapped duplex法やKunkel法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化された本発明のポリペプチドをコードするDNAは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該DNAはその5’末端側に翻訳開始コドンとしてのATGを有し、また3’末端側には翻訳終止コドンとしてのTAA、TGAまたはTAGを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成DNAアダプターを用いて付加することもできる。
(発現ベクター)
本発明のポリペプチドの発現ベクターは、例えば、(i)本発明のポリペプチドまたは本発明のタンパク質をコードするDNAから目的とするDNA断片を切り出し、(ii)該DNA断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド(例、pBR322,pBR325,pUC12,pUC13)、枯草菌由来のプラスミド(例、pUB110,pTP5,pC194)、酵母由来プラスミド(例、pSH19,pSH15)、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス,ワクシニアウイルス,バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
形質転換する際の宿主が動物細胞である場合には、SV40由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、SRαプロモーターなどが利用できる。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、Trpプロモーター、T7プロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、lppプロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADH1プロモーター、GALプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、SV40複製オリジン(以下、SV40oriと略称する場合がある)などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素(以下、dhfrと略称する場合がある)遺伝子〔メソトレキセート(MTX)耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子(以下、Amprと略称する場合がある)、ネオマイシン耐性遺伝子(以下、Neoと略称する場合がある、G418耐性)等があげられる。特に、CHO(dhfr−)細胞を用いてDHFR遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、チミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、ポリペプチドまたはその部分ペプチドのN端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、phoA・シグナル配列、OmpA・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、メイテイングファクターα(MFα)・シグナル配列、インベルターゼ・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、例えばインシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
(形質転換体)
このようにして構築された本発明のポリペプチドをコードするDNAを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
宿主としては、たとえばエシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫または昆虫細胞、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌としては、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)K12・DH1〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),60巻,160(1968)〕,JM103〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ,(Nucleic Acids Research),9巻,309(1981)〕,JA221〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journal of Molecular Biology)〕,120巻,517(1978)〕,HB101〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー,41巻,459(1969)〕,C600〔ジェネティックス(Genetics),39巻,440(1954)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サチルス(Bacillus subtilis)MI114〔ジーン,24巻,255(1983)〕,207−21〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(Journal of Biochemistry),95巻,87(1984)〕などが用いられる。
酵母としては、たとえばサッカロマイセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)AH22,AH22R−,NA87−11A,DKD−5D,20B−12などが用いられる。
昆虫としては、例えばカイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー(Nature),315巻,592(1985)〕。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがAcNPVの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞(Spodoptera frugiperda cell;Sf細胞)、Trichoplusia niの中腸由来のMG1細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがBmNPVの場合は、蚕由来株化細胞(Bombyx mori N;BmN細胞)などが用いられる。該Sf細胞としては、例えば、Sf9細胞(ATCC CRL1711)、Sf21細胞〔以上、Vaughn,J.L.ら、イン・ヴィトロ(in Vitro),13巻,213−217頁(1977年)〕などが用いられる。
動物細胞としては、たとえばサルCOS−7細胞,Vero細胞,チャイニーズハムスター細胞CHO,DHFR遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞CHO(dhfr− CHO細胞),マウスL細胞,マウス3T3細胞、マウスミエローマ細胞,ヒトHEK293細胞、ヒトFL細胞、293細胞、C127細胞、BALB3T3細胞、Sp−2/O細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、たとえばプロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),69巻,2110(1972)やジーン(Gene),17巻,107(1982)などに記載の方法に従って行なわれる。
バチルス属菌を形質転換するには、たとえばモレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス(Molecular & General Genetics),168巻,111(1979)などに記載の方法に従って行われる。
酵母を形質転換するには、たとえばプロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc.Natl.Acad.Sci,USA),75巻,1929(1978)に記載の方法に従って行なわれる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、たとえばバイオ/テクノロジー(Bio/Technology),6巻,47−55頁(1988年)などに記載の方法に従って行なわれる。
動物細胞を形質転換するには、たとえばヴィロロジー(Virology),52巻,456(1973)に記載の方法に従って行なわれる。
発現ベクターの細胞への導入方法としては、例えば、リポフェクション法〔Felgner,P.L.et al.プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proceedings of The National Academy of Sciences of The United States of America),84巻,7413頁(1987年)〕、リン酸カルシウム法〔Graham,F.L.and van der Eb,A.J.ヴィロロジー(Virology),52巻,456−467頁(1973年)〕、電気穿孔法〔Nuemann,E.et al.エンボ・ジャーナル(EMBO J.),1巻,841−845頁(1982年)〕等があげられる。
このようにして、本発明のポリペプチドをコードするDNAを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体が得られる。
なお、動物細胞を用いて、本発明のポリペプチドを安定に発現させる方法としては、上記の動物細胞に導入された発現ベクターが染色体に組み込まれた細胞をクローン選択によって選択する方法がある。具体的には、上記の選択マーカーを指標にして形質転換体を選択する。さらに、このように選択マーカーを用いて得られた動物細胞に対して、繰り返しクローン選択を行なうことにより本発明のポリペプチドの高発現能を有する安定な動物細胞株を得ることができる。また、dhfr遺伝子を選択マーカーとして用いた場合、MTX濃度を徐々に上げて培養し、耐性株を選択することにより、dhfr遺伝子とともに、本発明のポリペプチドをコードするDNAを細胞内で増幅させて、さらに高発現の動物細胞株を得ることもできる。
上記の形質転換体を本発明のポリペプチドをコードするDNAが発現可能な条件下で培養し、本発明のポリペプチドを生成、蓄積せしめることによって、本発明のポリペプチドを製造することができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、たとえばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としてはたとえば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがあげられる。また、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のpHは約5〜8が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えばグルコース、カザミノ酸を含むM9培地〔ミラー(Miller),ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス(Journal of Experiments in Molecular Genetics),431−433,Cold Spring Harbor Laboratory,New York 1972〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、たとえば3β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約15〜43℃で約3〜24時間行い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約30〜40℃で約6〜24時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、たとえばバークホールダー(Burkholder)最小培地〔Bostian,K.L.ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),77巻,4505(1980)」や0.5%カザミノ酸を含有するSD培地〔Bitter,G.A.ら、「プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),81巻,5330(1984)〕があげられる。培地のpHは約5〜8に調整するのが好ましい。培養は通常約20℃〜35℃で約24〜72時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、Grace’s Insect Medium(Grace,T.C.C.,ネイチャー(Nature),195,788(1962))に非働化した10%ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のpHは約6.2〜6.4に調整するのが好ましい。培養は通常約27℃で約3〜5日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、たとえば約5〜20%の胎児牛血清を含むMEM培地〔サイエンス(Science),122巻,501(1952)〕,DMEM培地〔ヴィロロジー(Virology),8巻,396(1959)〕,RPMI 1640培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション(The Journal of The American Medical Association)199巻,519(1967)〕,199培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン(Proceeding of The Society for The Biological Medicine),73巻,1(1950)〕などが用いられる。pHは約6〜8であるのが好ましい。培養は通常約30℃〜40℃で約15〜60時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
特にCHO(dhfr−)細胞およびdhfr遺伝子を選択マーカーとして用いる場合には、チミジンをほとんど含まない透析ウシ胎児血清を含むDMEM培地を用いるのが好ましい。
(本発明のポリペプチドの分離精製)
上記培養物から本発明のポリペプチドを分離精製するには、例えば下記の方法により行なうことができる。
本発明のポリペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび/または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過により本発明のポリペプチドの粗抽出液を得る方法などが適宜用い得る。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク変性剤や、トリトン(登録商標)X−100などの界面活性剤が含まれていてもよい。
培養液中に本発明のポリペプチドが分泌される場合には、培養終了後、自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれる本発明のポリペプチドの精製は、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法やクロマトフォーカシングなどの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
このようにして得られる本発明のポリペプチドが遊離体で得られた場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生する本発明のポリペプチドを、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、(ポリ)ペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。またN末端アミノ酸を欠失させるためには、エドマン(Edman)試薬(フェニルイソチオシアネート)を用いた公知のエドマン法を用いることが可能である。
このようにして生成する本発明のポリペプチドの存在は特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイなどにより測定することができる。
(抗体)
本発明は、さらに本発明のポリペプチドに対する抗体を提供する。
本発明のポリペプチドに対する抗体は、本発明のポリペプチドを認識し得る抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明のポリペプチドに対する抗体は、本発明のポリペプチドを抗原として用い、公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作製〕
(a)モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のポリペプチドは、哺乳動物に対して投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常2〜6週毎に1回ずつ、計2〜10回程度行なわれる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギがあげられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の2〜5日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化本発明のポリペプチドと抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行なうことができる。融合操作は既知の方法、例えば、ケーラーとミルスタインの方法〔ネイチャー(Nature)、256巻、495頁(1975年)〕に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはPEGが用いられる。
骨髄腫細胞としては、例えば、NS−1、P3U1、SP2/0などが挙げられるが、P3U1が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞(脾臓細胞)数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は1:1〜20:1程度であり、PEG(好ましくは、PEG1000〜PEG6000)が10〜80%程度の濃度で添加され、約20〜40℃、好ましくは約30〜37℃で約1〜10分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、本発明のポリペプチドの抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相(例、マイクロプレート)にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体(細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる)またはプロテインAを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインAを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識した本発明のポリペプチドを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができるが、通常はHAT(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン)を添加した動物細胞用培地などで行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、1〜20%、好ましくは10〜20%の牛胎児血清を含むRPMI1640培地、1〜10%の牛胎児血清を含むGIT培地(和光純薬工業(株))またはハイブリドーマ培養用無血清培地(SFM−101、日水製薬(株))などを用いることができる。培養温度は、通常20〜40℃、好ましくは約37℃である。培養時間は、通常5日〜3週間、好ましくは1週間〜2週間である。培養は、通常5%炭酸ガス下で行なうことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
(b)モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体(例、DEAE)による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテインAあるいはプロテインGなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原(本発明のポリペプチド抗原)とキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明のポリペプチドに対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造できる。
哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等を重量比でハプテン1に対し、約0.1〜20、好ましくは約1〜5の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約2〜6週毎に1回ずつ、計約3〜10回程度行なうことができる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
上記の本発明の抗体は、本発明のポリペプチドを特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のポリペプチドの定量、特にサンドイッチ免疫測定法による定量などに使用することができる。すなわち、本発明は、例えば、(i)本発明の抗体と、被検液および標識化本発明のポリペプチドとを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化本発明のポリペプチドの割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のポリペプチドの定量法、
(ii)被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のポリペプチドの定量法を提供する。
上記(ii)においては、一方の抗体が本発明のポリペプチドのN端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のポリペプチドのC端部に反応する抗体であることが好ましい。
本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体(以下、本発明のモノクローナル抗体と称する場合がある)を用いて本発明のポリペプチドの測定を行なえるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のF(ab’)2、Fab’、あるいはFab画分を用いてもよい。
本発明のポリペプチドに対する抗体を用いる測定法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量(例えば、本発明のポリペプチド量)に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常、タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、例えば、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等が用いられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ(1次反応)、さらに標識化した本発明のモノクローナル抗体を反応させ(2次反応)たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のポリペプチド量を定量することができる。1次反応と2次反応は逆の順序に行なっても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は上記のそれらに準じることができる。
また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも1種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明のポリペプチドの測定法においては、1次反応と2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は本発明のポリペプチドの結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。即ち、1次反応および2次反応に用いられる抗体は、例えば、2次反応で用いられる抗体が、本発明のポリペプチドのC端部を認識する場合、1次反応で用いられる抗体は、好ましくはC端部以外、例えばN端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原と(F)と抗体と結合した標識抗原(B)とを分離し(B/F分離)、B,Fいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、B/F分離をポリエチレングリコール、上記抗体に対する第2抗体などを用いる液相法、および、第1抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第1抗体は可溶性のものを用い第2抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果、生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の測定方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のポリペプチドの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる〔例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」(講談社、昭和49年発行)、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」(講談社、昭和54年発行)、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」(医学書院、昭和53年発行)、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」(第2版)(医学書院、昭和57年発行)、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」(第3版)(医学書院、昭和62年発行)、「メソッズ・イン・エンジモロジー(Methods in ENZYMOLOGY)」Vol.70(Immunochemical Techniques(Part A))、同書 Vol.73(Immunochemical Techniques(Part B))、同書 Vol.74(Immunochemical Techniques(Part C))、同書 Vol.84(Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、同書 Vol.92(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、同書 Vol.121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)など参照〕。
以上のように、本発明の抗体を用いることによって、本発明のポリペプチドを感度良く定量することができる。
さらに、本発明の抗体を用いて、生体内での本発明のポリペプチドを定量することによって、本発明のポリペプチドの機能不全に関連する各種疾患の診断をすることができる。
また、本発明の抗体は、体液や組織などの被検体中に存在する本発明のポリペプチドを特異的に検出するために使用することができる。また、本発明のポリペプチドを精製するために使用する抗体カラムの作製、精製時の各分画中の本発明のポリペプチドの検出、被検細胞内における本発明のポリペプチドの挙動の分析などのために使用することができる。
(アンチセンスポリヌクレオチド)
本発明のポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド(例、DNA(以下、アンチセンスポリヌクレオチドの説明においては、これらのDNAを本発明のDNAと略記する場合がある))の塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列を含有するアンチセンスポリヌクレオチドとしては、本発明のDNAの塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列を含有し、該DNAの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスポリヌクレオチドであってもよいが、アンチセンスDNAが好ましい。
本発明のDNAに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のDNAに相補的な塩基配列(すなわち、本発明のDNAの相補鎖)の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約70%以上、好ましくは約80%以上、より好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。特に、本発明のDNAの相補鎖の全塩基配列うち、本発明のポリペプチドのN末端部位をコードする部分の塩基配列(例えば、開始コドン付近の塩基配列など)の相補鎖と約70%以上、好ましくは約80%以上、より好ましくは約90%以上、最も好ましくは約95%以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドが好適である。
具体的には、配列番号:12、配列番号:13、配列番号:14、配列番号:15、配列番号:17または配列番号:18で表される塩基配列を含有するDNAの塩基配列に相補的な、もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチドなどが挙げられる。
アンチセンスポリヌクレオチドは通常、10〜40個程度、好ましくは15〜30個程度の塩基から構成される。
ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンスDNAを構成する各ヌクレオチドのリン酸残基(ホスフェート)は、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾リン酸残基に置換されていてもよい。これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、公知のDNA合成装置などを用いて製造することができる。
本発明に従えば、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の複製または発現を阻害することのできるアンチセンスポリヌクレオチドを、クローン化した、あるいは決定されたポリペプチドをコードするDNAの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。このようなポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子のRNAとハイブリダイズすることができ、該RNAの合成または機能を阻害することができるか、あるいは本発明のポリペプチド関連RNAとの相互作用を介して本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を調節・制御することができる。本発明のポリペプチド関連RNAの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、および本発明のポリペプチド関連RNAと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内および生体外で本発明のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。
用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列または核酸とポリペプチドとの間で「対応する」とは、ヌクレオチド(核酸)の配列またはその相補体から誘導される指令にあるポリペプチドのアミノ酸を通常指している。ポリペプチドをコードする遺伝子の5’端ヘアピンループ、5’端6−ベースペア・リピート、5’端非翻訳領域、翻訳開始コドン、ポリペプチドコード領域、翻訳終止コドン、3’端非翻訳領域、3’端パリンドローム領域、および3’端ヘアピンループは好ましい対象領域として選択しうるが、ポリペプチドをコードする遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係は、「アンチセンス」であるということができる。アンチセンスポリヌクレオチドは、2−デオキシ−D−リボースを含有しているポリヌクレオチド、D−リボースを含有しているポリヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のN−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、あるいは非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマまたは特殊な結合を含有するその他のポリマー(但し、該ポリマーはDNAやRNA中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する)などが挙げられる。それらは、2本鎖DNA、1本鎖DNA、2本鎖RNA、1本鎖RNA、さらにDNA:RNAハイブリッドであることができ、さらに非修飾ポリヌクレオチド(または非修飾オリゴヌクレオチド)、さらには公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、1個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合(例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど)を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど)を持つもの、例えばタンパク質(ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−L−リジンなど)や糖(例えば、モノサッカライドなど)などの側鎖基を有しているもの、インターカレート化合物(例えば、アクリジン、ソラレンなど)を持つもの、キレート化合物(例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など)を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの(例えば、αアノマー型の核酸など)であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。こうした修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、1個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、あるいはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、RNA、DNA、あるいは修飾された核酸(RNA、DNA)である。修飾された核酸の具体例としては核酸の硫黄誘導体やチオホスフェート誘導体、そしてポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものが挙げられるが、それに限定されるものではない。本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは次のような方針:(1)細胞内でのアンチセンスポリヌクレオチドをより安定なものにする、(2)アンチセンスポリヌクレオチドの細胞透過性をより高める、(3)目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、(4)もし毒性があるならアンチセンスポリヌクレオチドの毒性をより小さなものにする、で好ましく設計されうる。
こうした修飾は当該分野で数多く知られており、例えばJ.Kawakami et al.,Pharm Tech Japan,Vol.8,pp.247,1992;Vol.8,pp.395,1992;S.T.Crooke et al.ed.,Antisense Research and Applications,CRC Press,1993などに開示がある。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質(例えば、ホスホリピド、コレステロールなど)といった疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体(例えば、コレステリルクロロホルメート、コール酸など)が挙げられる。こうしたものは、核酸の3’端あるいは5’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の3’端あるいは5’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、RNaseなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンスポリヌクレオチドの阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、あるいは本発明のポリペプチドの生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。該核酸は公知の各種の方法で細胞に適用できる。
以下に、(a)本発明のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩(以下、本発明のポリペプチドと略記する場合がある)、(b)本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩、(c)本発明のポリペプチドに対する抗体、(d)本発明のポリヌクレオチド、(e)本発明のアンチセンスポリヌクレオチドなどの用途を説明する。
本発明のポリペプチドAもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩(以下、本発明のポリペプチドAと略記する場合がある)はバソプレシン分泌抑制活性を有していることから、本発明のポリペプチドA、本発明のポリペプチドAの活性を促進する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドAまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドなどは、例えば、バソプレシン分泌抑制剤などとして、例えば、腎性浮腫、尿排出障害(例、膀胱収縮障害、尿道通過障害、排尿困難、排尿痛、尿路閉塞など)、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群(SIADH)、高血圧などの予防・治療剤として用いることができる。
また、本発明のポリペプチドAの活性を阻害する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドAに対する抗体、本発明のポリペプチドAをコードする遺伝子のアンチセンスポリヌクレオチド、本発明のポリペプチドAをコードする遺伝子に対するsiRNAまたはshRNA、本発明のポリペプチドAをコードするRNAの一部を含有するリボザイム、本発明のポリペプチドAに対するアプタマーなどは、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁(例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など)など〕、多尿症、尿崩症(例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など)、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング(Cushing)症候群などの予防・治療剤などとして使用することができる。
本発明のポリペプチドBもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩(以下、本発明のポリペプチドBと略記する場合がある)はバソプレシン分泌抑制活性および摂食促進活性を有していることから、本発明のポリペプチドB、本発明のポリペプチドBの活性を促進する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドBまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドなどは、例えば、バソプレシン分泌抑制剤などとして、例えば、腎性浮腫、尿排出障害(例、膀胱収縮障害、尿道通過障害、排尿困難、排尿痛、尿路閉塞など)、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群(SIADH)、高血圧などの予防・治療剤、拒食症などの予防・治療剤、摂食(食欲)促進剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害(例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群(時差ボケ)など)〕などの予防・治療剤などとして用いることができる。
また、本発明のポリペプチドBの活性を阻害する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドBに対する抗体、本発明のポリペプチドBをコードする遺伝子のアンチセンスポリヌクレオチド、本発明のポリペプチドBをコードする遺伝子に対するsiRNAまたはshRNA、本発明のポリペプチドBをコードするRNAの一部を含有するリボザイム、本発明のポリペプチドBに対するアプタマーなどは、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁(例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など)など〕、多尿症、尿崩症(例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など)、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング(Cushing)症候群などの予防・治療剤、肥満症(例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など)、摂食亢進症などの予防・治療剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害(例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群(時差ボケ)など)〕などの予防・治療剤などとして使用することができる。
また、本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング用試薬としても有用である。
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチド遺伝子の発現を促進または阻害する化合物のスクリーニング用試薬としても有用である。
(1)本発明のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有する医薬
本発明のポリペプチドAもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩はバソプレシン分泌抑制活性を有していることから、本発明のポリペプチドAもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩は、例えば、バソプレシン分泌抑制剤などとして、例えば、腎性浮腫、尿排出障害(例、膀胱収縮障害、尿道通過障害、排尿困難、排尿痛、尿路閉塞など)、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群(SIADH)、高血圧などの予防・治療剤として用いることができる。
本発明のポリペプチドBもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩はバソプレシン分泌抑制活性および摂食促進活性を有しているので、本発明のポリペプチドBもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩は、例えば、バソプレシン分泌抑制剤などとして、例えば、腎性浮腫、尿排出障害(例、膀胱収縮障害、尿道通過障害、排尿困難、排尿痛、尿路閉塞など)、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群(SIADH)、高血圧などの予防・治療剤、拒食症などの予防・治療剤、摂食(食欲)促進剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害(例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群(時差ボケ)など)〕などの予防・治療剤などとして用いることができる。
本発明のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルの塩としては、例えば、薬学的に許容可能な塩などが用いられる。例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などがあげられる。
無機塩基との塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩などがあげられる。
有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、2,6−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、N,N’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩あげられる。
無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などとの塩があげられる。
有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸などとの塩があげられる。
塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルチニンなどとの塩があげられ、酸性アミノ酸との好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩があげられる。
本発明のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を上述の医薬として使用する場合には、常套手段に従って実施することができる。具体的には、以下に記載するとおりに使用することができる。
例えば、必要に応じて糖衣や腸溶性被膜を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたがって処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液(例えば、D−ソルビトール、D−マンニトール、塩化ナトリウムなど)などがあげられ、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール(たとえばエタノール)、ポリアルコール(たとえばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール)、非イオン性界面活性剤(たとえばポリソルベート80(TM)、HCO−50)などと併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、緩衝剤(例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液)、無痛化剤(例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど)、安定剤(例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど)、保存剤(例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど)、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば温血動物(例えば、ヒト、モルモット、ラット、マウス、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル、イヌ、ニワトリ)などに対して投与することができる。
本発明のポリペプチドAもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に、例えば、腎性浮腫患者(体重60kgとして)においては、一日につき約0.1〜1000mg、好ましくは約1.0〜300mg、より好ましくは約3.0〜50mgである。非経口的に投与する場合は、その投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では、一般的に、例えば、腎性浮腫患者(体重60kgとして)への投与においては、一日につき約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、60kg当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のポリペプチドBもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に、例えば、腎性浮腫患者(体重60kgとして)においては、一日につき約0.1〜1000mg、好ましくは約1.0〜300mg、より好ましくは約3.0〜50mgである。非経口的に投与する場合は、その投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では、一般的に、例えば、腎性浮腫患者(体重60kgとして)への投与においては、一日につき約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、60kg当たりに換算した量を投与することができる。
(2)本発明のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩を含有する医薬
本発明のポリペプチドAもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩はバソプレシン分泌抑制活性を有していることから、本発明のポリペプチドAもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩は、例えば、バソプレシン分泌抑制剤などとして、例えば、腎性浮腫、尿排出障害(例、膀胱収縮障害、尿道通過障害、排尿困難、排尿痛、尿路閉塞など)、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群(SIADH)、高血圧などの予防・治療剤として用いることができる。
また、本発明のポリペプチドAもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩は、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁(例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など)など〕、多尿症、尿崩症(例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など)、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング(Cushing)症候群などの予防・治療剤として有用である。
本発明のポリペプチドBもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩はバソプレシン分泌抑制活性および摂食促進活性を有しているので、本発明のポリペプチドBもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩は、例えば、バソプレシン分泌抑制剤などとして、例えば、腎性浮腫、尿排出障害(例、膀胱収縮障害、尿道通過障害、排尿困難、排尿痛、尿路閉塞など)、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群(SIADH)、高血圧などの予防・治療剤、拒食症などの予防・治療剤、摂食(食欲)促進剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害(例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群(時差ボケ)など)〕などの予防・治療剤などとして用いることができる。
また、本発明のポリペプチドBもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩は、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁(例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など)など〕、多尿症、尿崩症(例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など)、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング(Cushing)症候群などの予防・治療剤、肥満症(例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など)、摂食亢進症などの予防・治療剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害(例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群(時差ボケ)など)〕などの予防・治療剤などとして有用である。
本発明のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物の塩としては、例えば、薬学的に許容可能な塩などが用いられる。例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などがあげられる。
無機塩基との塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、アンモニウム塩などがあげられる。
有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、2,6−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、N,N’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩あげられる。
無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などとの塩があげられる。
有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸などとの塩があげられる。
塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルチニンなどとの塩があげられ、酸性アミノ酸との好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩があげられる。
本発明のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、該ポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を上述の医薬として使用する場合には、常套手段に従って実施することができる。具体的には、以下に記載するとおりに使用することができる。
例えば、必要に応じて糖衣や腸溶性被膜を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたがって処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液(例えば、D−ソルビトール、D−マンニトール、塩化ナトリウムなど)などがあげられ、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール(たとえばエタノール)、ポリアルコール(たとえばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール)、非イオン性界面活性剤(たとえばポリソルベート80(TM)、HCO−50)などと併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、緩衝剤(例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液)、無痛化剤(例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど)、安定剤(例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど)、保存剤(例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど)、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば温血動物(例えば、ヒト、モルモット、ラット、マウス、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル、イヌ、ニワトリ)などに対して投与することができる。
本発明のポリペプチドAもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、腎性浮腫患者(体重60kgとして)においては、一日につき約0.1〜1000mg、好ましくは約1.0〜300mg、より好ましくは約3.0〜50mgである。非経口的に投与する場合は、その投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では、一般的に例えば、腎性浮腫患者(体重60kgとして)への投与においては、一日につき約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、60kg当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のポリペプチドAもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、尿崩症患者(体重60kgとして)においては、一日につき約0.1〜1000mg、好ましくは約1.0〜300mg、より好ましくは約3.0〜50mgである。非経口的に投与する場合は、その投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では、一般的に例えば、尿崩症患者(体重60kgとして)への投与においては、一日につき約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、60kg当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のポリペプチドBもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、腎性浮腫患者(体重60kgとして)においては、一日につき約0.1〜1000mg、好ましくは約1.0〜300mg、より好ましくは約3.0〜50mgである。非経口的に投与する場合は、その投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では、一般的に例えば、腎性浮腫患者(体重60kgとして)への投与においては、一日につき約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、60kg当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のポリペプチドBもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、尿崩症患者(体重60kgとして)においては、一日につき約0.1〜1000mg、好ましくは約1.0〜300mg、より好ましくは約3.0〜50mgである。非経口的に投与する場合は、その投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では、一般的に例えば、尿崩症患者(体重60kgとして)への投与においては、一日につき約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、60kg当たりに換算した量を投与することができる。
(3)本発明のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体を含有する医薬
本発明のポリペプチドAもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩はバソプレシン分泌抑制活性を有していることから、本発明のポリペプチドAもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体は、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁(例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など)など〕、多尿症、尿崩症(例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など)、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング(Cushing)症候群などの予防・治療剤などとして有用である。
本発明のポリペプチドBもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩はバソプレシン分泌抑制活性および摂食促進活性を有しているので、本発明のポリペプチドBもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体は、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁(例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など)など〕、多尿症、尿崩症(例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など)、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング(Cushing)症候群などの予防・治療剤、肥満症(例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など)、摂食亢進症などの予防・治療剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害(例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群(時差ボケ)など)〕などの予防・治療剤などとして有用である。
本発明のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体を上述の医薬として使用する場合には、常套手段に従って実施することができる。具体的には、以下に記載するとおりに使用することができる。
例えば、必要に応じて糖衣や腸溶性被膜を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該化合物またはその塩を生理学的に認められる担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えばゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油、椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にしたがって処方することができる。
注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液(例えば、D−ソルビトール、D−マンニトール、塩化ナトリウムなど)などがあげられ、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール(たとえばエタノール)、ポリアルコール(たとえばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール)、非イオン性界面活性剤(たとえばポリソルベート80(TM)、HCO−50)などと併用してもよい。油性液としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、緩衝剤(例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液)、無痛化剤(例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど)、安定剤(例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど)、保存剤(例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど)、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば温血動物(例えば、ヒト、モルモット、ラット、マウス、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル、イヌ、ニワトリ)などに対して投与することができる。
本発明のポリペプチドAもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、尿崩症患者(体重60kgとして)においては、一日につき約0.1〜1000mg、好ましくは約1.0〜300mg、より好ましくは約3.0〜50mgである。非経口的に投与する場合は、その投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では、一般的に例えば、尿崩症患者(体重60kgとして)への投与においては、一日につき約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、60kg当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のポリペプチドBもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体の投与量は、症状などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、尿崩症患者(体重60kgとして)においては、一日につき約0.1〜1000mg、好ましくは約1.0〜300mg、より好ましくは約3.0〜50mgである。非経口的に投与する場合は、その投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、たとえば注射剤の形では、一般的に例えば、尿崩症患者(体重60kgとして)への投与においては、一日につき約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、60kg当たりに換算した量を投与することができる。
(4)本発明のポリヌクレオチドを含有する医薬
本発明のポリペプチドAもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩はバソプレシン分泌抑制活性を有していることから、本発明のポリペプチドAまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドは、例えばバソプレシン分泌抑制剤などとして、例えば、腎性浮腫、尿排出障害(例、膀胱収縮障害、尿道通過障害、排尿困難、排尿痛、尿路閉塞など)、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群(SIADH)、高血圧などの予防・治療剤として用いることができる。
本発明のポリペプチドBもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩はバソプレシン分泌抑制活性および摂食促進活性を有しているので、本発明のポリペプチドBまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドは、例えば、バソプレシン分泌抑制剤などとして、例えば、腎性浮腫、尿排出障害(例、膀胱収縮障害、尿道通過障害、排尿困難、排尿痛、尿路閉塞など)、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群(SIADH)、高血圧などの予防・治療剤、拒食症などの予防・治療剤、摂食(食欲)促進剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害(例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群(時差ボケ)など)〕などの予防・治療剤などとして用いることができる。
本発明のポリヌクレオチドを上記の予防・治療剤として使用する場合、公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。
例えば、該ポリヌクレオチドを用いる場合、該ポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたはその他の哺乳動物(例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど)に対して経口的または非経口的に投与することができる。該ポリヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
本発明のポリペプチドAまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドの投与量は、症状などにより差異はあるが、一般的に例えば、腎性浮腫患者(体重60kgとして)においては、一日につき約0.1〜100mgである。
本発明のポリペプチドBまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドの投与量は、症状などにより差異はあるが、一般的に例えば、腎性浮腫患者(体重60kgとして)においては、一日につき約0.1〜100mgである。
(5)本発明のアンチセンスポリヌクレオチド、二重鎖RNA、リボザイムなどを含有する医薬および診断薬
本発明のポリペプチドAをコードするDNA(以下「本発明のDNA(A)」という)に相補的に結合し、該DNAの発現を抑制することができる本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは低毒性であり、生体内における本発明のポリペプチドAまたは本発明のDNA(A)の機能を抑制することができるので、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁(例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など)など〕、多尿症、尿崩症(例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など)、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング(Cushing)症候群などの予防・治療剤などとして使用できる。
本発明のポリペプチドBをコードするDNA(以下「本発明のDNA(B)」という)に相補的に結合し、該DNAの発現を抑制することができる本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは低毒性であり、生体内における本発明のポリペプチドBまたは本発明のDNA(B)の機能を抑制することができるので、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁(例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など)など〕、多尿症、尿崩症(例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など)、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング(Cushing)症候群などの予防・治療剤、肥満症(例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など)、摂食亢進症などの予防・治療剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害(例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群(時差ボケ)など)〕などの予防・治療剤などとして使用できる。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを上記の予防・治療剤として使用する場合、公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。
例えば、該アンチセンスポリヌクレオチドを用いる場合、該アンチセンスポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたはその他の哺乳動物(例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど)に対して経口的または非経口的に投与することができる。該アンチセンスポリヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。
該アンチセンスポリヌクレオチドの投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、尿崩症の治療の目的で本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを投与する場合、一般的に成人(体重60kg)においては、一日につき該アンチセンスポリヌクレオチドを約0.1〜100mg投与する。
さらに、該アンチセンスポリヌクレオチドは、組織や細胞における本発明のDNAの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
本発明は、さらに
(1)本発明のポリペプチドAをコードするRNAの一部を含有する二重鎖RNA;
(2)前記(1)記載の二重鎖RNAを含有してなる医薬;
(3)本発明のポリペプチドAをコードするRNAの一部を含有するリボザイム;
(4)前記(3)記載のリボザイムを含有してなる医薬;
(5)本発明のポリペプチドBをコードするRNAの一部を含有する二重鎖RNA;
(6)前記(5)記載の二重鎖RNAを含有してなる医薬;
(7)本発明のポリペプチドBをコードするRNAの一部を含有するリボザイム;
(8)前記(7)記載のリボザイムを含有してなる医薬なども提供する。
これらの二重鎖RNA(本発明のポリヌクレオチドに対するsiRNA(small(short)interfering RNA)、shRNA(small(short)hairpin RNA)など)、リボザイムなどは、上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、本発明のポリヌクレオチド(例、DNA)の発現を抑制することができ、生体内における本発明のポリペプチドまたは本発明のポリヌクレオチド(例、DNA)の活性や機能を阻害することができる。
前記(1)記載の二重鎖RNAおよび前記(3)記載のリボザイムは、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁(例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など)など〕、多尿症、尿崩症(例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など)、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング(Cushing)症候群などの予防・治療剤などとして使用できる。
前記(5)記載の二重鎖RNAおよび前記(7)記載のリボザイムは、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁(例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など)など〕、多尿症、尿崩症(例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など)、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング(Cushing)症候群などの予防・治療剤、肥満症(例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など)、摂食亢進症などの予防・治療剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害(例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群(時差ボケ)など)〕などの予防・治療剤などとして使用できる。
二重鎖RNAは、公知の方法(例、Nature,411巻,494頁,2001年)に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
リボザイムは、公知の方法(例、TRENDS in Molecular Medicine,7巻,221頁,2001年)に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。例えば、本発明のペプチドをコードするRNAの一部に公知のリボザイムを連結することによって製造することができる。本発明のペプチドをコードするRNAの一部としては、公知のリボザイムによって切断され得る本発明のRNA上の切断部位に近接した部分(RNA断片)が挙げられる。
上記の二重鎖RNAまたはリボザイムを上記予防・治療剤として使用する場合、アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、投与することができる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、本発明のポリペプチドに対するアプタマーなども、本発明で用いられるタンパク質の活性や機能を抑制することができる。よって、本発明のポリペプチドAに対するアプタマーなどは、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁(例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など)など〕、多尿症、尿崩症(例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など)、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング(Cushing)症候群などの予防・治療剤などの医薬として使用することができる。
本発明のポリペプチドBに対するアプタマーなどは、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁(例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など)など〕、多尿症、尿崩症(例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など)、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング(Cushing)症候群などの予防・治療剤、肥満症(例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など)、摂食亢進症などの予防・治療剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害(例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群(時差ボケ)など)〕などの予防・治療剤などの医薬として使用することができる。
アプタマーは、公知の方法、例えばSELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)法(Annual Review of Medicine 56巻,555−583頁,2005年)を用いて取得する。アプタマーの構造は、公知の方法を用いて決定することができ、その構造を基に、公知の方法に従いアプタマーを製造する。
上記のアプタマーを医薬として使用する場合、アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、投与することができる。
(6)医薬候補化合物のスクリーニング方法及びスクリーニングキット
本発明のポリペプチドを用いることを特徴とする医薬候補化合物のスクリーニング方法および本発明のポリペプチドを含有することを特徴とする医薬候補化合物のスクリーニング用キット(以下、「本発明のスクリーニング方法」および「本発明のスクリーニング用キット」とそれぞれ略記する場合がある)について以下に説明する。
〔本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング〕
本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドの機能を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。すなわち、本発明は、(1)本発明のポリペプチドを用いることを特徴とする本発明のポリペプチドの活性(機能)を促進または阻害する化合物またはその塩(以下、促進剤または阻害剤と略記する場合がある)のスクリーニング方法を提供する。具体的には、例えば、(2)(i)本発明のポリペプチドを細胞に接触させた場合と、(ii)本発明のポリペプチドおよび試験化合物を細胞に接触させた場合との、該細胞のバソプレシン分泌抑制活性など本発明のポリペプチドの活性の比較を行うことを特徴とする促進剤または阻害剤のスクリーニング方法を提供する。具体的には、上記スクリーニング方法においては、例えば、(i)と(ii)の場合において、上記細胞を培養し、そのバソプレシン分泌量を測定する。上記細胞としては、バソプレシン分泌が誘発されるものなどが好ましく用いられる。例えば、ラット視索上核組織(例、後述の実施例に記載のラット視索上核の静的培養など)、ラット室傍核組織(例、後述の実施例に記載のラット室傍核の静的培養など)、ラット視索上核神経細胞(ニューロン)、ラット室傍核神経細胞(ニューロン)などが用いられる。培地は、本発明のポリペプチドの有するバソプレシン分泌抑制作用などの活性を阻害しない培地であればいずれのものでもよく、例えばDMEM(Dulbecco modified Eagle’s medium)などが用いられる。バソプレシン分泌量は、公知の方法、例えば、AVP RIA(放射免疫測定)キット(三菱化学ヤトロン製など)を用いた放射免疫測定法などにより測定することができる。試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、生理学的に許容される金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。金属塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩;カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩などのアルカリ土類金属塩;アルミニウム塩などが挙げられる。有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、2,6−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、N,N’−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩が挙げられる。無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩が挙げられる。有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、安息香酸、ベンゼンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オルニチンなどとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
例えば、上記(ii)の場合における本発明のポリペプチドの活性(例、バソプレシン分泌抑制活性)を、上記(i)の場合に比べて、約20%以上、好ましくは30%以上、より好ましくは約50%以上促進する試験化合物を、本発明のポリペプチドの活性を促進する化合物またはその塩として選択することができる。例えば、上記(ii)の場合における本発明のポリペプチドの活性(例、バソプレシン分泌抑制活性)を、上記(i)の場合に比べて、約20%以上、好ましくは30%以上、より好ましくは約50%以上阻害する試験化合物を、本発明のポリペプチドの活性を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチド遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。本発明は、(3)本発明のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする本発明のポリペプチド遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩(以下、それぞれ促進剤、阻害剤と略記する場合がある)のスクリーニング方法を提供し、より具体的には、例えば、(4)(iii)本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞を培養した場合と(iv)本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物を培養した場合との比較を行うことを特徴とする促進剤または阻害剤のスクリーニング方法を提供する。上記スクリーニング方法においては、例えば、(iii)と(iv)の場合における、本発明のポリペプチド遺伝子の発現量(例、本発明のポリペプチド遺伝子のプロモーター下流に挿入したアルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼなどの酵素活性、本発明のポリペプチドをコードするmRNA量など)を測定して、比較する。本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞としては、例えば、前述した本発明のポリペプチドをコードするDNAを含有するベクターで形質転換された宿主(形質転換体)が用いられる。宿主としては、例えば、CHO細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。該スクリーニングには、例えば、前述の方法で培養することによって、本発明のポリペプチドを細胞内または培養上清中に産生する形質転換体が好ましく用いられる。さらに好ましくは、本発明のポリペプチド遺伝子のプロモーター下流に、分泌型アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼなどの遺伝子を挿入した形質転換体などが用いられる。試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、前記と同様のものなどが挙げられる。上記のスクリーニング方法を実施するには、本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞をスクリーニングに適した培地で培養して調製する。培地は、本発明のポリペプチドの産生を阻害しない培地であればいずれのものでもよく、例えばDMEM培地などが用いられる。本発明のポリペプチド遺伝子の発現量は、本発明のポリペプチド遺伝子のプロモーター下流に挿入したアルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼなどの酵素活性を、公知の方法に従い、測定することができる。本発明のポリペプチド遺伝子の発現量は、さらに、公知の方法、例えば、ノーザンブロッティングやReverse transcription−polymerase chain reaction(RT−PCR)、リアルタイムPCR解析システム(ABI社製、TaqMan polymerase chain reaction)などの方法あるいはそれに準じる方法にしたがって測定することもできる。例えば、上記(iv)の場合における本発明のポリペプチド遺伝子の発現を、上記(iii)の場合に比べて、約20%以上、好ましくは30%以上、より好ましくは約50%以上促進する試験化合物を本発明のポリペプチド遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩として選択することができる。例えば、上記(iv)の場合における本発明のポリペプチド遺伝子の発現を、上記(iii)の場合に比べて、約20%以上、好ましくは30%以上、より好ましくは約50%以上阻害する試験化合物を本発明のポリペプチド遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬としても有用である。すなわち、本発明は、(5)本発明のポリヌクレオチドを用いることを特徴とする本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩(以下、促進剤または阻害剤と略記する場合がある)のスクリーニング方法を提供する。具体的には、例えば、(6)(v)本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞を、別の細胞に接触させて培養した場合と(vi)本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物を、別の細胞に接触させて培養した場合との、該別の細胞の本発明のポリペプチドの活性(例、バソプレシン分泌抑制活性)の比較を行うことを特徴とする本発明のポリペプチドの有する活性の促進剤または阻害剤のスクリーニング方法を提供する。具体的には、上記スクリーニング方法においては、例えば、(v)と(vi)の場合において、上記細胞(および組織)を培養し、そのバソプレシン分泌量を測定する。本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞としては、上記(4)に記載の細胞が用いられる。別の細胞としては、上記(2)に記載の細胞が用いられる。試験化合物、培養法、バソプレシン分泌抑制活性の測定法などは、上記(2)に準じる。例えば、上記(vi)の場合における本発明のポリペプチドの活性(例、バソプレシン分泌抑制活性)を、上記(v)の場合に比べて、約20%以上、好ましくは30%以上、より好ましくは約50%以上促進する試験化合物を、本発明のポリペプチドの活性を促進する化合物またはその塩として選択することができる。例えば、上記(vi)の場合における本発明のポリペプチドの活性(例、バソプレシン分泌抑制活性)を、上記(v)の場合に比べて、約20%以上、好ましくは30%以上、より好ましくは約50%以上阻害する試験化合物を、本発明のポリペプチドの活性を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。
本発明は、(7)本発明の抗体を用いることを特徴とする本発明のポリペプチドの発現(産生)を促進または阻害する化合物またはその塩(以下、それぞれ促進剤、阻害剤と略記する場合がある)のスクリーニング方法を提供する。具体的には、例えば、(8)(vii)本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞を培養した場合と(viii)本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞と試験化合物の混合物を培養した場合との比較を、本発明の抗体を用いて行うことを特徴とする促進剤または阻害剤のスクリーニング方法を提供する。上記スクリーニング方法においては、例えば、本発明の抗体を用いて(vii)と(viii)の場合における、本発明のポリペプチドの産生量(具体的には、本発明のポリペプチド量)を測定して、比較する。
上記のスクリーニング方法を実施するには、本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞をスクリーニングに適した培地で培養して行う。培地は、本発明のポリペプチドの産生を阻害しない培地であればいずれのものでもよく、例えばDMEM培地などが用いられる。本発明のポリペプチドを産生する能力を有する細胞としては、例えば、前述した本発明のポリペプチドをコードするDNAを含有するベクターで形質転換された宿主(形質転換体)が用いられる。宿主としては、例えば、CHO細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。該スクリーニングには、例えば、前述の方法で培養することによって、本発明のポリペプチドを細胞内または培養上清中に産生する形質転換体が好ましく用いられる。本発明のポリペプチド量の測定は、公知の方法、例えば、本発明のポリペプチドを認識する抗体を用いて、細胞抽出液中などに存在する前記ポリペプチドを、ウェスタン解析、ELISA法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。例えば、上記(viii)の場合における本発明のポリペプチドの産生量(発現量)を、上記(vii)の場合に比べて、約20%以上、好ましくは30%以上、より好ましくは約50%以上促進する試験化合物を本発明のポリペプチドの発現を促進する化合物またはその塩として選択することができる。例えば、上記(viii)の場合における本発明のポリペプチドの産生量(発現量)を、上記(vii)の場合に比べて、約20%以上、好ましくは30%以上、より好ましくは約50%以上阻害する試験化合物を本発明のポリペプチドの発現を阻害する化合物またはその塩として選択することができる。本発明のスクリーニング用キットは、本発明のポリペプチドまたはその塩を含有するものである。
上記各スクリーニングで用いられる試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などが挙げられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、前記と同様のものなどが挙げられる。
(7)本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩を含有する医薬など
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩は、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿等から選ばれた化合物であり、本発明のポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物、本発明のポリペプチド遺伝子の発現を促進または阻害する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドの発現を促進または阻害する化合物またはその塩である。該化合物の塩としては、前記した本発明のポリペプチドの塩と同様のものが用いられる。本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる、本発明のポリペプチドAの活性を促進する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドAの遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドAの発現を促進する化合物またはその塩は、例えば、バソプレシン分泌抑制剤などとして、例えば、腎性浮腫、尿排出障害(例、膀胱収縮障害、尿道通過障害、排尿困難、排尿痛、尿路閉塞など)、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群(SIADH)、高血圧などの予防・治療剤などとして、低毒性で安全な医薬として使用できる。一方、本発明のポリペプチドAの活性を阻害する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドAの遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドAの発現を阻害する化合物またはその塩は、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁(例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など)など〕、多尿症、尿崩症(例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など)、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング(Cushing)症候群などの予防・治療剤等の医薬として使用できる。
さらに、本発明のポリペプチドBの活性を促進する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドBの遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドBの発現を促進する化合物またはその塩は、例えば、バソプレシン分泌抑制剤などとして、例えば、腎性浮腫、尿排出障害(例、膀胱収縮障害、尿道通過障害、排尿困難、排尿痛、尿路閉塞など)、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群(SIADH)、高血圧などの予防・治療剤、拒食症などの予防・治療剤、摂食(食欲)促進剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害(例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群(時差ボケ)など)〕などの予防・治療剤などとして、低毒性で安全な医薬として使用できる。一方、本発明のポリペプチドBの活性を阻害する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドBの遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドBの発現を阻害する化合物またはその塩は、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁(例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など)など〕、多尿症、尿崩症(例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など)、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング(Cushing)症候群などの予防・治療剤、肥満症(例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など)、摂食亢進症など)の予防・治療剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害(例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群(時差ボケ)など)〕などの予防・治療剤等の医薬として使用できる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物またはその塩を上述の予防・治療剤として使用する場合、常套手段に従って実施することができる。例えば、前記した本発明のポリペプチドを含有する医薬と同様にして、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤、無菌性溶液、懸濁液剤等とすることができる。このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、哺乳動物(例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル等)に対して投与することができる。
本発明のポリペプチドAの活性を促進する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドAの遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩、および本発明のポリペプチドAの発現を促進する化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルート等により差異はあるが、例えば、経口投与の場合、一般的に例えば腎性浮腫患者(体重60kgとして)においては、一日につき約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mgである。非経口的に投与する場合は、該化合物の投与量は投与対象、対象疾患等によっても異なるが、例えば、注射剤の形では、−般的に例えば腎性浮腫患者(60kgとして)においては、一日につき約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、60kg当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のポリペプチドAの活性を阻害する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドAの遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、および本発明のポリペプチドAの発現を阻害する化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルート等により差異はあるが、例えば、経口投与の場合、一般的に例えば尿崩症患者(体重60kgとして)においては、一日につき約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mgである。非経口的に投与する場合は、該化合物の投与量は投与対象、対象疾患等によっても異なるが、例えば、注射剤の形では、一般的に例えば尿崩症患者(60kgとして)においては、一日につき約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、60kg当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のポリペプチドBの活性を促進する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドBの遺伝子の発現を促進する化合物またはその塩、および本発明のポリペプチドBの発現を促進する化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルート等により差異はあるが、例えば、経口投与の場合、一般的に例えば腎性浮腫患者(体重60kgとして)においては、一日につき約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mgである。非経口的に投与する場合は、該化合物の投与量は投与対象、対象疾患等によっても異なるが、例えば、注射剤の形では、一般的に例えば腎性浮腫患者(60kgとして)においては、一日につき約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、60kg当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のポリペプチドBの活性を阻害する化合物またはその塩、本発明のポリペプチドBの遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩、および本発明のポリペプチドBの発現を阻害する化合物またはその塩の投与量は、その作用、対象疾患、投与対象、投与ルート等により差異はあるが、例えば、経口投与の場合、一般的に例えば尿崩症患者(体重60kgとして)においては、一日につき約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mgである。非経口的に投与する場合は、該化合物の投与量は投与対象、対象疾患等によっても異なるが、例えば、注射剤の形では、一般的に例えば尿崩症患者(60kgとして)においては、一日につき約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、60kg当たりに換算した量を投与することができる。
(8)本発明の抗体を用いる診断方法
本発明のポリペプチドに対する抗体(以下、「本発明の抗体」という)は、本発明のポリペプチドを特異的に認識することができるので、被検液中の本発明のポリペプチドの検出や中和に使用することができる。
すなわち、本発明は、
(i)本発明の抗体と、被検液および標識化された本発明のポリペプチドとを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明のポリペプチドの割合を測定することを特徴とする被検液中の本発明のポリペプチドの定量法、および
(ii)被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のポリペプチドの定量法を提供する。
上記(ii)の定量法においては、一方の抗体が本発明のポリペプチドのN端部を認識する抗体で、他方の抗体が本発明のポリペプチドのC端部に反応する抗体であることが望ましい。
また、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を用いて本発明のポリペプチドの定量を行うことができるほか、組織染色等による検出を行なうこともできる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また、抗体分子のF(ab’)2、Fab’、あるいはFab画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のポリペプチドの定量法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量(例えば、本発明のポリペプチド量)に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、ネフロメトリー、競合法、イムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いられるが、感度、特異性の点で、後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔125I〕、〔131I〕、〔3H〕、〔14C〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。さらに、抗体あるいは抗原と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、物理吸着を用いてもよく、また通常本発明のポリペプチドあるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、アガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコン等の合成樹脂、あるいはガラス等があげられる。
サンドイッチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を反応させ(1次反応)、さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ(2次反応)たのち、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明のポリペプチド量を定量することができる。1次反応と2次反応は逆の順序に行っても、また、同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも1種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明のポリペプチドの測定法においては、1次反応と2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、本発明のポリペプチドの結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。すなわち、1次反応および2次反応に用いられる抗体は、例えば、2次反応で用いられる抗体が、本発明のポリペプチドのC端部を認識する場合、1次反応で用いられる抗体は、好ましくはC端部以外、例えばN端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法以外の測定システム、例えば、競合法、イムノメトリック法あるいはネフロメトリーなどに用いることができる。
競合法では、被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させたのち、未反応の標識抗原(F)と、抗体と結合した標識抗原(B)とを分離し(B/F分離)、B,Fいずれかの標識量を測定し、被検液中の抗原量を定量する。本反応法には、抗体として可溶性抗体を用い、B/F分離をポリエチレングリコール、前記抗体に対する第2抗体などを用いる液相法、および、第1抗体として固相化抗体を用いるか、あるいは、第1抗体は可溶性のものを用い第2抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは、被検液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のポリペプチドの測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。
例えば、入江 寛編「ラジオイムノアッセイ」(講談社、昭和49年発行)、入江 寛編「続ラジオイムノアッセイ」(講談社、昭和54年発行)、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」(医学書院、昭和53年発行)、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」(第2版)(医学書院、昭和57年発行)、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」(第3版)(医学書院、昭和62年発行)、「Methods in ENZYMOLOGY」Vol.70(Immunochemical Techniques(Part A))、同書 Vol.73(Immunochemical Techniques(Part B))、同書 Vol.74(Immunochemical Techniques(Part C))、同書 Vol.84(Immunochemical Techniques(Part D:Selected Immunoassays))、同書 Vol.92(Immunochemical Techniques(Part E:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、同書 Vol.121(Immunochemical Techniques(Part I:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照することができる。
以上のようにして、本発明の抗体を用いることによって、本発明のポリペプチドを感度良く定量することができる。
さらには、本発明の抗体を用いて本発明のポリペプチドの濃度を定量することによって、本発明のポリペプチドの濃度の変化が検出された場合、それらのポリペプチドが関与する上記疾患に罹患している、あるいは将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
(9)本発明のDNA導入動物の作製
本発明は、外来性の本発明のDNA(以下、本発明の外来性DNAと略記する)またはその変異DNA(本発明の外来性変異DNAと略記する場合がある)を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
〔1〕本発明の外来性DNAまたはその変異DNAを有する非ヒト哺乳動物、
〔2〕非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第〔1〕記載の動物、
〔3〕ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第〔2〕記載の動物、および
〔4〕本発明の外来性DNAまたはその変異DNAを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性DNAまたはその変異DNAを有する非ヒト哺乳動物(以下、本発明の非ヒトトランスジェニック動物と略記する)は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階(さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に8細胞期以前)に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、DEAE−デキストラン法などにより目的とするDNAを転移することによって作出することができる。また、該DNA転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性DNAを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と公知の細胞融合法により融合させることにより本発明の非ヒトトランスジェニック動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス(例えば、純系として、C57BL/6系統,DBA2系統など、交雑系として、B6C3F1系統,BDF1系統,B6D2F1系統,BALB/c系統,ICR系統など)またはラット(例えば、Wistar,SDなど)などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
本発明の外来性DNAとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のDNAではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のDNAをいう。
本発明の変異DNAとしては、元の本発明のDNAの塩基配列に変異(例えば、突然変異など)が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたDNAなどが用いられ、また、異常DNAも含まれる。
該異常DNAとしては、異常な本発明のポリペプチドを発現させるDNAを意味し、例えば、正常な本発明のポリペプチドの機能を抑制するポリペプチドを発現させるDNAなどが用いられる。
本発明の外来性DNAは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のDNAを対象動物に転移させるにあたっては、該DNAを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したDNAコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトDNAを転移させる場合、これと相同性が高い本発明のDNAを有する各種哺乳動物(ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど)由来のDNAを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトDNAを結合したDNAコンストラクト(例えば、ベクター)を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のDNAを高発現するDNA転移哺乳動物を作出することができる。
本発明のポリペプチドの発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウイルスなどのレトロウイルス、ワクシニアウイルスまたはバキュロウイルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記のDNA発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、(i)ウイルス(例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、JCウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルスなど)に由来するDNAのプロモーター、(ii)各種哺乳動物(ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど)由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンII、ウロプラキンII、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性タンパク質、グルタチオンS−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンK1,K10およびK14、コラーゲンI型およびII型、サイクリックAMP依存タンパク質キナーゼβIサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ(一般にTie2と略される)、ナトリウムカリウムアデノシン三リン酸化酵素(Na,K−ATPase)、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインIおよびIIA、メタロプロティナーゼ1組織インヒビター、MHCクラスI抗原(H−2L)、H−ras、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ(TPO)、ペプチド鎖延長囚子1α(EF−1α)、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖1および2、ミエリン基礎タンパク質、チログロブリン、Thy−1、免疫グロブリン、H鎖可変部(VNP)、血清アミロイドPコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンC、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンA、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトペプチド鎖延長因子1α(EF−1α)のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、DNA転移哺乳動物において目的とするmRNAの転写を終結する配列(一般にターミネーターと呼ばれる)を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各DNAの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウイルスのSV40ターミネーターなどが用いられる。
その他、目的とする外来性DNAをさらに高発現させる目的で各DNAのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核DNAのイントロンの一部などをプロモーター領域の5’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の3’下流に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のポリペプチドの翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物(ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど)由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来DNAおよび市販の各種ゲノムDNAライブラリーよりゲノムDNAの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来RNAより公知の方法により調製された相補DNAを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常DNAは、上記の細胞または組織より得られた正常なポリペプチドの翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうるDNAコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のDNA工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性DNAの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。DNA転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性DNAが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性DNAを保持することを意味する。本発明の外来性DNAを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性DNAを有する。
本発明の外来性正常DNAを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性DNAを安定に保持することを確認して、該DNA保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性DNAの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。DNA転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性DNAが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性DNAを過剰に有することを意味する。本発明の外来性DNAを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性DNAを過剰に有する。
導入DNAを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該DNAを過剰に有するように繁殖継代することができる。
本発明の正常DNAを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常DNAが高発現させられており、内在性の正常DNAの機能を促進することにより最終的に本発明のポリペプチドの機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常非ヒトトランスジェニック動物を用いて、本発明のポリペプチドの機能亢進症や、本発明のポリペプチドが関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。また、本発明の外来性正常DNAを転移させた哺乳動物は、本発明のポリペプチドの増加症状を有することから、本発明のポリペプチドに関連する疾患に対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、本発明の外来性異常DNAを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性DNAを安定に保持することを確認して該DNA保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来DNAを前述のプラスミドに組み込んで原料として用いることができる。プロモーターとのDNAコンストラクトは、通常のDNA工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常DNAの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。DNA転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常DNAが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常DNAを有することを意味する。本発明の外来性DNAを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常DNAを有する。導入DNAを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該DNAを有するように繁殖継代することができる。
本発明の異常DNAを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常DNAが高発現させられており、内在性の正常DNAの機能を阻害することにより最終的に本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常非ヒトトランスジェニック動物を用いて、本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常DNA高発現動物は、本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症における本発明の異常ポリペプチドによる正常ポリペプチドの機能阻害(dominant negative作用)を解明するモデルとなる。
また、本発明の外来異常DNAを転移させた哺乳動物は、本発明のポリペプチドの増加症状を有することから、本発明のポリペプチドまたはの機能不活性型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記2種類の本発明の非ヒトトランスジェニック動物のその他の利用可能性として、例えば、
(i)組織培養のための細胞源としての使用、
(ii)本発明の非ヒトトランスジェニック動物の組織中のDNAもしくはRNAを直接分析するか、またはDNAにより発現されたポリペプチド組織を分析することによる、本発明のポリペプチドにより特異的に発現あるいは活性化するポリペプチドとの関連性についての解析、
(iii)DNAを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
(iv)上記(iii)記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
(v)本発明の変異ポリペプチドを単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
さらに、本発明の非ヒトトランスジェニック動物を用いて、本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症などを含む、本発明のポリペプチドに関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、本発明のポリペプチドに関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、本発明の非ヒトトランスジェニック動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどのタンパク質分解酵素により、遊離したDNA転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、本発明のポリペプチド産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明のポリペプチドおよびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明の非ヒトトランスジェニック動物を用いて、本発明のポリペプチドの機能不活性型不応症を含む、本発明のポリペプチドに関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明の非ヒトトランスジェニック動物または本発明の外来性DNA発現ベクターを用いて、本発明のポリペプチドが関連する疾患のDNA治療法を検討、開発することが可能である。
(10)ノックアウト動物
本発明は、本発明のDNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
1)本発明のDNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
2)該DNAがレポーター遺伝子(例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子)を導入することにより不活性化された第1)項記載の胚幹細胞、
3)ネオマイシン耐性である第1)項記載の胚幹細胞、
4)非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第1)項記載の胚幹細胞、
5)ゲッ歯動物がマウスである第4)項記載の胚幹細胞、
6)本発明のDNAが不活性化された該DNA発現不全非ヒト哺乳動物、
7)該DNAがレポーター遺伝子(例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子)を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のDNAに対するプロモーターの制御下で発現しうる第6)項記載の非ヒト哺乳動物、
8)非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第6)項記載の非ヒト哺乳動物、
9)ゲッ歯動物がマウスである第8)項記載の非ヒト哺乳動物、および
10)第7)項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のDNAに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法などを提供する。
本発明のDNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のDNAに人為的に変異を加えることにより、DNAの発現能を抑制するか、もしくは該DNAがコードしている本発明のポリペプチドの活性を実質的に喪失させることにより、DNAが実質的に本発明のポリペプチドの発現能を有さない(以下、本発明のノックアウトDNAと称することがある)非ヒト哺乳動物の胚幹細胞(以下、ES細胞と略記する)をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のDNAに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該DNA配列の一部又は全部の削除、他DNAを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエクソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトDNAを作製すればよい。
本発明のDNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞(以下、本発明のDNA不活性化ES細胞または本発明のノックアウトES細胞と略記する)の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のDNAを単離し、そのエクソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはlacZ(β−ガラクトシダーゼ遺伝子)、cat(クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子)を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエクソンの機能を破壊するか、あるいはエクソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるDNA配列(例えば、polyA付加シグナルなど)を挿入し、完全なmRNAを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したDNA配列を有するDNA鎖(以下、ターゲッティングベクターと略記する)を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたES細胞について本発明のDNA上あるいはその近傍のDNA配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のDNA配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のDNA以外の近傍領域のDNA配列をプライマーとしたPCR法により解析し、本発明のノックアウトES細胞を選別することにより得ることができる。
また、相同組換え法等により本発明のDNAを不活化させる元のES細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知のEvansとKaufmanの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのES細胞の場合、現在、一般的には129系のES細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなES細胞を取得するなどの目的で例えば、C57BL/6マウスやC57BL/6の採卵数の少なさをDBA/2との交雑により改善したBDF1マウス(C57BL/6とDBA/2とのF1)を用いて樹立したものなども良好に用いうる。BDF1マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、C57BL/6マウスを背景に持つので、これを用いて得られたES細胞は病態モデルマウスを作出したとき、C57BL/6マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をC57BL/6マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ES細胞を樹立する場合、一般には受精後3.5日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に8細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのES細胞を用いてもよいが、通常雄のES細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ES細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、PCR法によりY染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その1例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約106個の細胞数を要していたのに対して、1コロニー程度のES細胞数(約50個)で済むので、培養初期におけるES細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、第二次セレクションとしては、例えば、G−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるES細胞の染色体数は正常数の100%が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ES細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞(例えば、マウスでは染色体数が2n=40である細胞)に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、STO繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でLIF(1−10000U/ml)存在下に炭酸ガス培養器内(好ましくは、5%炭酸ガス、95%空気または5%酸素、5%炭酸ガス、90%空気)で約37℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン/EDTA溶液(通常0.001−0.5%トリプシン/0.1−5mM EDTA、好ましくは約0.1%トリプシン/1mM EDTA)処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常1−3日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ES細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔M.J.Evans及びM.H.Kaufman,ネイチャー(Nature)第292巻、154頁、1981年;G.R.Martin プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)第78巻、7634頁、1981年;T.C.Doetschmanら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第87巻、27頁、1985年〕、本発明のES細胞を分化させて得られる本発明のDNA発現不全細胞は、インビトロにおけ本発明のポリペプチドの細胞生物学的検討において有用である。
本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のmRNA量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のDNAが不活性化されたDNA配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のDNAと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のDNAをノックアウトさせることができる。
本発明のDNAがノックアウトされた細胞は、本発明のDNA上またはその近傍のDNA配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のDNA配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のDNA以外の近傍領域のDNA配列とをプライマーとしたPCR法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のDNAが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、8細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のDNA座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のDNA座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のDNA座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のDNA座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明のポリペプチドのヘテロ発現不全個体であり、本発明のポリペプチドのヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明のポリペプチドのホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でDNA溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のDNA座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明のDNAがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該DNAがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化DNAの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化DNAを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体1,ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化DNAを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のDNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のポリペプチドにより誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のポリペプチドの生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
(a)本発明のDNAの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のDNAの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のDNAの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、前記した医薬候補化合物のスクリーニング方法などで用いられる試験化合物の塩と同様の物が用いられる。
具体的には、本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のポリペプチドの欠損や損傷などによって引き起こされる疾患に対して治療・予防効果を有するので、該疾患に対する安全で低毒性な治療・予防剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、前記した試験化合物の塩と同様の物が用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のポリペプチドを含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたはその他の哺乳動物(例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど)に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、該化合物を経口投与する場合、一般的に成人(体重60kgとして)の腎性浮腫患者においては、一日につき該化合物を約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mg投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、該化合物を注射剤の形で通常成人(60kgとして)の腎性浮腫患者に投与する場合、一日につき該化合物を約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、60kg当たりに換算した量を投与することができる。
(b)本発明のDNAに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法
本発明は、本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のDNAに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のDNAがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のDNAに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。試験化合物は塩を形成していてもよく、試験化合物の塩としては、前記した医薬候補化合物のスクリーニング方法などで用いられる試験化合物の塩と同様の物が用いられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子(lacZ)、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明のDNAをレポーター遺伝子で置換された本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のDNAに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、本発明のポリペプチドをコードするDNA領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子(lacZ)で置換している場合、本来、本発明のポリペプチドの発現する組織で、本発明のポリペプチドの代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−ガラクトピラノシド(X−gal)のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明のポリペプチドの動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明のポリペプチド欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液(PBS)で洗浄後、X−galを含む染色液で、室温または37℃付近で、約30分ないし1時間反応させた後、組織標本を1mM EDTA/PBS溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、lacZをコードするmRNAを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のDNAに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、前記した試験化合物の塩と同様の物が用いられる。
本発明のDNAに対するプロモーター活性を促進する化合物またはその塩は、本発明のポリペプチドの発現を促進し、該ポリペプチドの機能を促進することができるので、例えば、バソプレシン分泌抑制剤などとして、例えば、腎性浮腫、尿排出障害(例、膀胱収縮障害、尿道通過障害、排尿困難、排尿痛、尿路閉塞など)、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群(SIADH)、高血圧などの予防・治療剤、拒食症などの予防・治療剤、摂食(食欲)促進剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害(例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群(時差ボケ)など)〕などの予防・治療剤などの医薬として有用である。
また、本発明のDNAに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明のポリペプチドの発現を阻害し、該ポリペプチドの機能を阻害することができるので、例えば、蓄尿障害〔例、頻尿、尿失禁(例、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁、機能性尿失禁など)など〕、多尿症、尿崩症(例、下垂体性尿崩症、腎性尿崩症など)、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング(Cushing)症候群などの予防・治療剤、肥満症(例、悪性肥満細胞症、外因性肥満、過インシュリン性肥満症、過血漿性肥満、下垂体性肥満、減血漿性肥満症、甲状腺機能低下肥満症、視床下部性肥満、症候性肥満症、小児肥満、上半身肥満、食事性肥満症、性機能低下性肥満、全身性肥満細胞症、単純性肥満、中心性肥満など)、摂食亢進症などの予防・治療剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害(例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群(時差ボケ)など)〕などの予防・治療剤などの低毒性で安全な医薬として有用である。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のポリペプチドまたはその塩などを含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたはその他の哺乳動物(例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど)に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、本発明のDNAに対するプロモーター活性を促進する化合物を経口投与する場合、一般的に成人(体重60kgとして)の腎性浮腫患者においては、一日につき該化合物を約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mg投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のDNAに対するプロモーター活性を促進する化合物を注射剤の形で通常成人(60kgとして)の腎性浮腫患者に投与する場合、一日につき該化合物を約0.01〜30mg、好ましくは約0.1〜20mg、より好ましくは約0.1〜10mgを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、60kg当たりに換算した量を投与することができる。
一方、例えば、本発明のDNAに対するプロモーター活性を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人(体重60kgとして)の尿崩症患者においては、一日につき該化合物を約0.1〜100mg、好ましくは約1.0〜50mg、より好ましくは約1.0〜20mg投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のDNAに対するプロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人(60kgとして)の尿崩症患者に投与する場合、一日につき該化合物を約0.01〜30mg程度、好ましくは約0.1〜20mg程度、より好ましくは約0.1〜10mg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、60kg当たりに換算した量を投与することができる。
このように、本発明のDNA発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のDNAに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のDNA発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療剤の開発に大きく貢献することができる。
また、本発明のポリペプチドのプロモーター領域を含有するDNAを使って、その下流に種々のタンパクをコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物(遺伝子導入動物)を作成すれば、特異的にそのポリペプチドを合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、本発明のポリペプチドそのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC−IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければL体を示すものとする。
DNA :デオキシリボ核酸
cDNA :相補的デオキシリボ核酸
A :アデニン
T :チミン
G :グアニン
C :シトシン
Y :チミンまたはシトシン
N :チミン、シトシン、アデニンまたはグアニン
R :アデニンまたはグアニン
M :シトシンまたはアデニン
W :チミンまたはアデニン
S :シトシンまたはグアニン
RNA :リボ核酸
mRNA :メッセンジャーリボ核酸
dATP :デオキシアデノシン三リン酸
dTTP :デオキシチミジン三リン酸
dGTP :デオキシグアノシン三リン酸
dCTP :デオキシシチジン三リン酸
ATP :アデノシン三リン酸
EDTA :エチレンジアミン四酢酸
SDS :ドデシル硫酸ナトリウム
TFA :トリフルオロ酢酸
EIA :エンザイムイムノアッセイ
GlyまたはG :グリシン
AlaまたはA :アラニン
ValまたはV :バリン
LeuまたはL :ロイシン
IleまたはI :イソロイシン
SerまたはS :セリン
ThrまたはT :スレオニン
CysまたはC :システイン
MetまたはM :メチオニン
GluまたはE :グルタミン酸
AspまたはD :アスパラギン酸
LysまたはK :リジン
ArgまたはR :アルギニン
HisまたはH :ヒスチジン
PheまたはF :フェニルアラニン
TyrまたはY :チロシン
TrpまたはW :トリプトファン
ProまたはP :プロリン
AsnまたはN :アスパラギン
GlnまたはQ :グルタミン
pGluまたはpE :ピログルタミン酸
Me :メチル基
Et :エチル基
Bu :ブチル基
Ph :フェニル基
TC :チアゾリジン−4(R)−カルボキサミド基
Bom :ベンジルオキシメチル
NMP :N−メチルピロリドン
PAM :フェニルアセトアミドメチル
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Tos :p−トルエンスルフォニル
HONB :N−ヒドロキシ−5−ノルボルネンー2,3−ジカルボキシイミド
Bzl :ベンジル
Z :ベンジルオキシカルボニル
Br−Z :2−ブロモベンジルオキシカルボニル
Cl−Z :2−クロルベンジルオキシカルボニル
Boc :t−ブチルオキシカルボニル
HOBt :1−ヒドロキシベンズトリアゾール
DCC :N、N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
TFA :トリフルオロ酢酸
Fmoc :N−9−フルオレニルメトキシカルボニル
DNP :ジニトロフェニル
Bum :ターシャリーブトキシメチル
Trt :トリチル
BSA :ウシ血清アルブミン
CHAPS :3−[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−1−プロパンスルホナート
PMSF :フェニルメチルスルホニルフルオリド
E64 :(L−3−trans−カルボキオキシラン−2−カルボニル)L−ロイシル−アグマチン
GDP :グアノシン−5’−二リン酸
MEMα :ミニマムエッセンシャルメジウムアルファ
Fura−2AM :1−[6−アミノ−2−(5−カルボキシ−2−オキサゾリル)−5−ベンゾフラニロキシ]−2−(2−アミノ−5メチルフェノキシ)−エタン−N,N,N’,N’−四酢酸ペンタアセトキシメチルエステル
HBSS :ハンクス平衡塩液
Fluo−3AM :1−[2−アミノ−5−(2,7−ジクロロ−6−ヒドロキシ−3−オキシ−9−キサンテニル)フェノキシ]−2−(2−アミノ−5−メチルフェノキシ)エタン−N,N,N’,N’−四酢酸ペンタアセトキシメチルエステル
HEPES :2−[4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジニル]エタンスルホン酸
MeBzl :4−メチルベンジル
NMP :N−メチルピロリドン
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号:1〕
ヒトVGFのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:2〕
ラットVGFのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:3〕
マウスVGFのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:4〕
ヒトNERP−1のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:5〕
ラットNERP−1のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:6〕
マウスNERP−1のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:7〕
ヒトNERP−2のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:8〕
ラットNERP−2のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:9〕
マウスNERP−2のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:10〕
ヒトVGFをコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:11〕
ラットVGFをコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:12〕
ヒトNERP−1をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:13〕
ラットNERP−1をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:14〕
ヒトNERP−2をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:15〕
ラットNERP−2をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:16〕
マウスVGFをコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:17〕
マウスNERP−1をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:18〕
マウスNERP−2をコードするDNAの塩基配列を示す。
〔配列番号:19〕
以下の実施例2における抗原として用いられたポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:20〕
以下の実施例2における抗原として用いられたポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:21〕
以下の実施例2における抗原として用いられたポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:22〕
以下の実施例2におけるRIAに用いられた125Iで放射性標識したポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:23〕
以下の実施例2におけるRIAに用いられた125Iで放射性標識したポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号:24〕
以下の実施例2におけるRIAに用いられた125Iで放射性標識したポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
以下の実施例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに制限されるものではない。
[実施例1]
ヒト甲状腺髄質腫瘍由来細胞株TTの培養上清からのNERPペプチドの単離および構造決定
無血清培養したヒト甲状腺髄質腫瘍由来細胞株TT(J.Biol.Chem.261,14386−14391(1986))の培養上清からペプチド画分を調製し、逆相HPLC(RP−HPLC)によって50分画に分離した。これらの分画をタンデム質量分析計によって分析し、282個のペプチドの配列を同定した。これらのペプチドの配列はすべて既知の分泌タンパク質または生理活性ペプチド前駆体の配列に帰属されたことから、用いられた培養上清には分泌タンパク質あるいはペプチドが豊富に含まれていることが示唆された。同定されたペプチドのうち20個はC末端がアミド化されていた。この細胞株はカルシトニン遺伝子関連ペプチドαおよびカルシトニンを産生し、アミド化ペプチドのうち16個はこれらのペプチドの全長あるいはフラグメントペプチドであったが、それら以外にさらに2つの新規ペプチドが同定された。質量分析においてこれらのペプチドのそれぞれについて、2677.4および4062.2、およびそれらのフラグメントである2522.2および3406.7にモノイソトピックマスが検出され、神経分泌タンパク質であるVGF(GenBank Accession No.NP_003369、Nat.Cell Biol.2,703−708(2000))に由来するペプチドであると同定された。これらのVGF由来ペプチドの配列はヒトと齧歯類において高い保存性を示した。これらのペプチドを本明細書に示す生理作用に基づいて神経内分泌調節ペプチド−1および−2〔neuroendocrine regulatory peptide−1(NERP−1)およびneuroendocrine regulatory peptide−2(NERP−2)〕と命名した。ヒト、ラットおよびマウスのNERP−1のアミノ酸配列を配列番号:4、配列番号:5および配列番号:6に、ヒト、ラットおよびマウスのNERP−2のアミノ酸配列を配列番号:7、配列番号:8および配列番号:9にそれぞれ示す。
[実施例2]
(1)抗NERP抗血清の調製および得られた抗血清を用いた組織及び血漿中のNERPの同定
まず、ラットのNERP−1、NERP−2およびヒトのNERP−2のC末端に対する抗体を取得した。具体的には、無処理(ラットNERP−1)またはマレイミドによって活性化されたmariculture KLH(keyhole limpet hemocyanin;Sigma and Pierce)と結合させた合成のQGLAQVEA−NH2(配列番号:19)、C+QGGARQRDLG−NH2(配列番号:20)およびGC+YLLQGGARQRGLG−NH2(配列番号:21)をウサギに免疫することによって上記ポリクローナル抗体を産生させた。ラットNERP−1に対する抗体は、そのC末端配列が一致することから、ヒトNERP−1と100%の交差反応を示した。リガンドとして、NERP−1には125Iで放射性標識したYLLQQGLAQVEA−NH2(配列番号:22)、NERP−2にはYLLQGGARQRDLG−NH2(配列番号:23)またはYLLQGGARQRGLG−NH2(配列番号:24)を用いて、RIA(放射免疫測定)を実施した。雄ウィスターラットのさまざまな組織内のペプチドを抽出した後、Sep−Pak C−18カートリッジに負荷した。カートリッジ溶出液の一部を、NERPの組織含有量を決定するためにRIAに供した。溶出液の残りの部分を、NERPペプチドを同定するためにRIAと連結されたRP−HPLCによって分離した。なお、ここでは「NERP」はアミド体を示す。
ヒト血漿およびラット組織の中の免疫反応性をもつNERPはすべて、RP−HPLCで得られる標準のNERPペプチドと一致し(図1a〜図1d)、NERPは、ヒトとラットに内因的に存在することが示された。ヒトにおける免疫反応性を有すNERP−1およびNERP−2の血漿濃度は、各々9.8±1.1fmol/mlおよび10.8±1.0fmol/mlであった。ラット脳におけるNERPの主な内因的形態は、NERP−1とNERP−2それぞれに対応するアミド化された25−および38−アミノ酸ペプチド(それぞれ、配列番号:5および配列番号:8)であることを、脳の全抽出物(whole brain extract)から得られた免疫沈降物のマススペクトロメトリー分析によって確認した。NERP−1およびNERP−2は、いずれも視床下部および下垂体においてもっとも多く、脳および胃においても多く存在し、測定された全臓器において検出された(表1および図2)。
(2)免疫組織化学によるNERPの内因的存在および局在の確認
免疫蛍光顕微鏡法用に2%パラホルムアルデヒドまたは電子顕微鏡法用に0.1%グルタルアルデヒド含有の4%パラホルムアルデヒドで灌流したコルヒチン(200μg)で処理されたラットから脳を採取した。他の臓器は、4%パラホルムアルデヒドで灌流されたラットから採取した。NERP−1(希釈率1:2,500)、NERP−2(希釈率1:5,000)、オキシトキシン(ケミコン(chemicon)、1:15,000)、バソプレシン(ペニンスラ・ラボラトリーズ(Peninsula laboratories)、1:80,000)、MCH(ケミコン(chemicon)、1:2,000)およびオレキシン−A(サンタ・クルース(Santa Cruz)、1:1,000)に対する抗体を用い、Endocrinology144,1506−1512(2003)に記載の方法に従って、二重免疫蛍光染色法を実施した。画像は、オリンパス(Olympus)AX−70蛍光顕微鏡により撮影した。二重標識された金コロイド抗体電子顕微鏡法用の超薄切片(100nm)は、Endocrinology 144,1506−1512(2003)記載の方法に従い、NERP−1(1:1,000)、NERP−2(1:3,000)、オキシトシン(1:300)に対する抗体またはバソプレシン抗血清(1:300)と共にインキュベートした後、5nmまたは10nmの金コロイドを結合させたIgG(ブリティッシュ・バイオセル(British Biocell))と共にインキュベートして調製した。この超薄切片の観察は、日立H−7000電子顕微鏡によって行った。
NERP−1およびNERP−2の免疫反応性細胞体は、ラット視床下部の視索上核(supraoptic nucleus)(SON)に存在した(図3)。また、NERPは、室傍核(paraventricular nucleus)(PVN)の大細胞部(magnocellular division)にも存在した。コロイド金免疫染色(immunogold staining)は、SONおよびPVNにおいて、NERPと、常在するホルモンであるアルギニン・バソプレシン(AVP)およびオキシトニンとの共局在を示した。
[実施例3]
In situハイブリダイゼーションによるVGFのmRNAレベルの変化の測定
PVNおよびSONを含む12μmの切片を、6匹の対照ラットと48時間絶水された6匹のラットから調製した。VGFをコードする転写産物に相補的な2つの33Pで3’末端標識されたデオキシオリゴヌクレオチド・プローブ(1741−1785および1825−1870;GenBank Accession No.M74223)を、等モル比で使用した。AVPのin situハイブリダイゼーションは、Brain Res.772,161−6(1997)記載の方法に従って行った。得られた画像は、MCID画像解析装置で解析した(Nature 409,194−198(2001))。
定量in situハイブリダイゼーション組織化学によってNERPの前駆体であるVGFのmRNAレベルの変化について評価したところ、PVNおよびSONにおけるVGF mRNAレベルが絶水(water deprivation)に対応して増加していた(図4および図5)。
[実施例4]
In vivoおよびin vitroにおけるAVP分泌の測定
ラットに、NERP−1、NERP−1−Gly、NERP−2またはNERP−2−GlyをICV投与し、5分後に高張食塩水(850mM NaCl/10μl)またはアンジオテンシンII (AT−II)(1nmol/10μl)のICV(intracerebroventricular)注射を行った。
血液サンプルは、NERPの注射の15分後に採取した。血漿AVPは、RIAキット(三菱製)により測定した。PVNおよびSONの6つの断片を、ラットの視床下部から採取した。それぞれの核は、95% O2で平衡化された培地199(25mM HEPESバッファpH7.4、2.5%ウシ胎仔血清、2.5%ウシ血清、1%ペニシリン−ストレプトマイシン)内で1時間37℃でプレインキュベートした(1群当たりn=4ウェル)。これらの核を、NERP−1(10−6M)、NERP−1(10−6M)+AT−II(10−6M)またはAT−II(10−6M)のいずれか1つを用いて、3回、各5分間刺激した。これらの刺激期間の間に、5分間の回復期間をおいた。同様に、これらの核を、NERP−2(10−6M)、NERP−2(10−6M)+AT−II(10−6M)、NERP−1−Gly(10−6M)、またはNERP−2−Gly(10−6M)のいずれかを用いて刺激した。脱分極によって誘発された分泌を確認するために、これらの刺激を加えた後、6×10−2M KClを用いてインキュベーションした。ラット下垂体後葉の2つの断片は、上記記載と同様の条件下で、NERPおよびAT−IIで刺激した。培地の一部分は、AVPの測定用にRIAに供した。本実験は、5回繰り返した。
NERP−1の脳室内ICV投与は、高塩分投与で誘導されたAVP分泌を用量依存的に抑制した(図6)。NERP−1の事前投与は、AT−IIで誘導されたAVP分泌を抑制した(図6)。また、NERP−2のICV投与も、高塩分とAT−IIで誘導されたAVP分泌を抑制した。PVNとSONのin vitro静的培養において、NERP−1およびNERP−2双方とも、基底およびAT−IIで誘導されたAVP分泌を抑制した(図7)。また、NERP−1は、下垂体後葉からのAVP分泌も抑制した(図8)。
以上の結果から、NERPはAVP分泌の調節に関与していることが示された。
[実施例5]
電気生理学によるNERPの作用機序の確認
雄ウィスター若年ラットのSONを含む薄片試料を、J.Physiol.504,113−126(1997)記載の方法に従って記録室内に固定した。灌流速度は、1.4ml/分とした。SON内の大細胞神経内分泌ニューロンは、正立顕微鏡(upright microscope)(BX50、オリンパス)によって同定した。物質の測定期間は、別段の記載のない限り5分とした。電極は、ガラス毛細管からプラー(P−87、Sutter Instrument Co.)で3重に引いて作成した。後シナプス電流の記録は、膜を破って5分後、電流が安定状態に達した時に開始された。電流と電圧は、EPC−10増幅器(HEKA)によって記録した。信号は、アナログ・デジタル・コンバータ(MacLab/v.3.5)を用いて、3kHzでフィルタ処理し、1kHzでデジタル化した。シナプス電流を定量的に分析するために、ソフトウェア(AxoGraph v.3.6.1、アクソン・インスツルメンツ(Axon Instruments))とともに1Hzのハイパスフィルタを用いたAC部品のみを使用した。
AVP分泌に関するNERPの抑制機序を明らかにするために、in vitroスライス標本上でのパッチクランプ法(J.Physiol.504,113−126(1997))を用いてSONにおけるAVPニューロンへの求心性入力(afferent input)について検討した。バソプレシンニューロンの神経活動は、興奮性グルタミン入力および抑制性GABA作動性入力によって調節される。バソプレシンニューロンからの自発性の興奮性および抑制性後シナプス電流(EPSCおよびIPSC)は、各々−70mVおよび−20mVに保持電位を設定することで選択的に記録した。NERP−1は、SONニューロンにおいて、GABA作動性IPSCを増大させたが、EPSCを増大させなかった(図9、図10)。また、NERP−2も、IPSCを増大させた。NERP−1は、IPSCの周波数を増大させたが振幅を増大させなかった(図9)。このことはNERPが前シナプスGABA作動性電流を活性化(activate)したことを示している。NERP−1によって誘導される前シナプスGABA作動性電流は、Na+チャンネル阻害剤であるテトロドトキシンによって変化しなかった。このことは、介在ニューロンがSONニューロンに対するNERPの抑制作用に関与しなかったことを示している(図11)。IPSCに対するNERP−1の興奮性作用が酸化窒素(NO)の同作用に類似していたため、NERP−1がNOを介してSONニューロンの前シナプスGABA作動性電流に影響を及ぼすかどうかについて調べた。NOスカベンジャーであるヘモグロビン(Hb)の適用によって、NERP−1に誘導されるIPSCは影響を受けなかった(図12)。上記の結果は、NERPは、SONニューロンにおけるGABA作動性活動の局所調節因子であり、NOが介在する経路とは独立して作用をもたらすことを示している。以上の結果から、NERPは、NOのようなGABA作動性入力を誘導する新規の生物活性ペプチドであることが確認された。
[実施例6]
給餌実験による摂食促進活性の測定
NERP−1、NERP−2またはNERP−2−Gly(0.1〜5nmol/10μl)を、摂食の評価のために09:30にラット(1群当たりn=15)にICV注射した。抗オレキシンA IgG(0.25μg/10μl、Santa Cruz)および抗オレキシンB IgG(0.25μg/10μl、Santa Cruz)または抗MCH IgG(0.5μg/10μl、Phoenix)は、09:00にラット(1群当たりn=12)にICV注射した。すべての場合において、IgGは、NERP−2投与3時間前に注射した。摂食は、1時間モニターした。マウス実験では、NERP−2(1nmol/2μl生理食塩水)またはMCH(1nmol/2μl生理食塩水)をオレキシン・ノックアウトマウス(Cell 92,573−585(1998))および野生型同腹子(1群当たりn=5、4ヶ月雄)にICV注射によって投与してから、1時間摂食を測定した。オレキシン・ノックアウトマウスは、ES細胞の標的変異によって作成した(Cell 92,573−585(1998))
自由給餌ラットへのNERP−2のICV注射は、最低有効用量0.1nmolで用量依存的に明期中の摂食を増大させた(図13)。NERP−2の食欲促進作用は、ICV注射後1時間を超えては持続しなかった。NERP−2のICV注射を受けるラットは、敏捷な(alert)点は変わりなく、対照群と比較して通常と異なる行動は一切示さなかった。NERP−2免疫反応性細胞は、摂食行動やエネルギー代謝の調節に重要な部位である視床下部外側野(lateral hypothalamus)(J.Physiol.504,113−126(1997))に存在していた(図14)。二重免疫染色により、NERP−2は、摂食および自発運動を刺激する神経ペプチドであるオレキシンと共局在する一方(図14)、NERP−2は、視床下部外側野において産生される別の食欲促進作用をもつペプチドであるメラニン凝集ホルモン(melanin−concentrating hormone)(MCH)とは共局在していないことが明らかになった(図14)。
NERP−2を投与する3時間前に、脳室内に抗オレキシン−A IgGおよび抗オレキシン−B IgGまたは抗MCH IgGを注射した。オレキシン抗体は、NERP−2に誘導される摂食を無効にしたが、MCH抗体は無効にしなかった(図15)。また、野生型の対照マウスではNERP−2のICV注射は摂食を刺激したが、オレキシン・ノックアウトマウスでは刺激しなかった(図16)。
[実施例7]
自発運動促進活性の測定
NERP−2(5nmol/2μl生理食塩水)または溶媒(vehicle)のICV投与が施されたマウスの運動は、前述したような赤外線検出器(Muromachi Co.Ltd.、東京、日本)を備えた耐音性、耐光性があるかごの中で、Endocrinology 144,4729−4733(2003)記載の方法に従って測定した。自発運動数は、15分ごとに測定し、投与後30分から120分の間合計した。
NERP−2のICV投与は、野生型マウスでは全自発運動(total locomotor activity)を促進したが、オレキシン・ノックアウトマウスでは促進しなかった(図17)。
以上の結果は、NERP−2がオレキシン系と相互作用して摂食および自発運動を促進することを示している。
[実施例1]
ヒト甲状腺髄質腫瘍由来細胞株TTの培養上清からのNERPペプチドの単離および構造決定
無血清培養したヒト甲状腺髄質腫瘍由来細胞株TT(J.Biol.Chem.261,14386−14391(1986))の培養上清からペプチド画分を調製し、逆相HPLC(RP−HPLC)によって50分画に分離した。これらの分画をタンデム質量分析計によって分析し、282個のペプチドの配列を同定した。これらのペプチドの配列はすべて既知の分泌タンパク質または生理活性ペプチド前駆体の配列に帰属されたことから、用いられた培養上清には分泌タンパク質あるいはペプチドが豊富に含まれていることが示唆された。同定されたペプチドのうち20個はC末端がアミド化されていた。この細胞株はカルシトニン遺伝子関連ペプチドαおよびカルシトニンを産生し、アミド化ペプチドのうち16個はこれらのペプチドの全長あるいはフラグメントペプチドであったが、それら以外にさらに2つの新規ペプチドが同定された。質量分析においてこれらのペプチドのそれぞれについて、2677.4および4062.2、およびそれらのフラグメントである2522.2および3406.7にモノイソトピックマスが検出され、神経分泌タンパク質であるVGF(GenBank Accession No.NP_003369、Nat.Cell Biol.2,703−708(2000))に由来するペプチドであると同定された。これらのVGF由来ペプチドの配列はヒトと齧歯類において高い保存性を示した。これらのペプチドを本明細書に示す生理作用に基づいて神経内分泌調節ペプチド−1および−2〔neuroendocrine regulatory peptide−1(NERP−1)およびneuroendocrine regulatory peptide−2(NERP−2)〕と命名した。ヒト、ラットおよびマウスのNERP−1のアミノ酸配列を配列番号:4、配列番号:5および配列番号:6に、ヒト、ラットおよびマウスのNERP−2のアミノ酸配列を配列番号:7、配列番号:8および配列番号:9にそれぞれ示す。
[実施例2]
(1)抗NERP抗血清の調製および得られた抗血清を用いた組織及び血漿中のNERPの同定
まず、ラットのNERP−1、NERP−2およびヒトのNERP−2のC末端に対する抗体を取得した。具体的には、無処理(ラットNERP−1)またはマレイミドによって活性化されたmariculture KLH(keyhole limpet hemocyanin;Sigma and Pierce)と結合させた合成のQGLAQVEA−NH2(配列番号:19)、C+QGGARQRDLG−NH2(配列番号:20)およびGC+YLLQGGARQRGLG−NH2(配列番号:21)をウサギに免疫することによって上記ポリクローナル抗体を産生させた。ラットNERP−1に対する抗体は、そのC末端配列が一致することから、ヒトNERP−1と100%の交差反応を示した。リガンドとして、NERP−1には125Iで放射性標識したYLLQQGLAQVEA−NH2(配列番号:22)、NERP−2にはYLLQGGARQRDLG−NH2(配列番号:23)またはYLLQGGARQRGLG−NH2(配列番号:24)を用いて、RIA(放射免疫測定)を実施した。雄ウィスターラットのさまざまな組織内のペプチドを抽出した後、Sep−Pak C−18カートリッジに負荷した。カートリッジ溶出液の一部を、NERPの組織含有量を決定するためにRIAに供した。溶出液の残りの部分を、NERPペプチドを同定するためにRIAと連結されたRP−HPLCによって分離した。なお、ここでは「NERP」はアミド体を示す。
ヒト血漿およびラット組織の中の免疫反応性をもつNERPはすべて、RP−HPLCで得られる標準のNERPペプチドと一致し(図1a〜図1d)、NERPは、ヒトとラットに内因的に存在することが示された。ヒトにおける免疫反応性を有すNERP−1およびNERP−2の血漿濃度は、各々9.8±1.1fmol/mlおよび10.8±1.0fmol/mlであった。ラット脳におけるNERPの主な内因的形態は、NERP−1とNERP−2それぞれに対応するアミド化された25−および38−アミノ酸ペプチド(それぞれ、配列番号:5および配列番号:8)であることを、脳の全抽出物(whole brain extract)から得られた免疫沈降物のマススペクトロメトリー分析によって確認した。NERP−1およびNERP−2は、いずれも視床下部および下垂体においてもっとも多く、脳および胃においても多く存在し、測定された全臓器において検出された(表1および図2)。
(2)免疫組織化学によるNERPの内因的存在および局在の確認
免疫蛍光顕微鏡法用に2%パラホルムアルデヒドまたは電子顕微鏡法用に0.1%グルタルアルデヒド含有の4%パラホルムアルデヒドで灌流したコルヒチン(200μg)で処理されたラットから脳を採取した。他の臓器は、4%パラホルムアルデヒドで灌流されたラットから採取した。NERP−1(希釈率1:2,500)、NERP−2(希釈率1:5,000)、オキシトキシン(ケミコン(chemicon)、1:15,000)、バソプレシン(ペニンスラ・ラボラトリーズ(Peninsula laboratories)、1:80,000)、MCH(ケミコン(chemicon)、1:2,000)およびオレキシン−A(サンタ・クルース(Santa Cruz)、1:1,000)に対する抗体を用い、Endocrinology144,1506−1512(2003)に記載の方法に従って、二重免疫蛍光染色法を実施した。画像は、オリンパス(Olympus)AX−70蛍光顕微鏡により撮影した。二重標識された金コロイド抗体電子顕微鏡法用の超薄切片(100nm)は、Endocrinology 144,1506−1512(2003)記載の方法に従い、NERP−1(1:1,000)、NERP−2(1:3,000)、オキシトシン(1:300)に対する抗体またはバソプレシン抗血清(1:300)と共にインキュベートした後、5nmまたは10nmの金コロイドを結合させたIgG(ブリティッシュ・バイオセル(British Biocell))と共にインキュベートして調製した。この超薄切片の観察は、日立H−7000電子顕微鏡によって行った。
NERP−1およびNERP−2の免疫反応性細胞体は、ラット視床下部の視索上核(supraoptic nucleus)(SON)に存在した(図3)。また、NERPは、室傍核(paraventricular nucleus)(PVN)の大細胞部(magnocellular division)にも存在した。コロイド金免疫染色(immunogold staining)は、SONおよびPVNにおいて、NERPと、常在するホルモンであるアルギニン・バソプレシン(AVP)およびオキシトニンとの共局在を示した。
In situハイブリダイゼーションによるVGFのmRNAレベルの変化の測定
PVNおよびSONを含む12μmの切片を、6匹の対照ラットと48時間絶水された6匹のラットから調製した。VGFをコードする転写産物に相補的な2つの33Pで3’末端標識されたデオキシオリゴヌクレオチド・プローブ(1741−1785および1825−1870;GenBank Accession No.M74223)を、等モル比で使用した。AVPのin situハイブリダイゼーションは、Brain Res.772,161−6(1997)記載の方法に従って行った。得られた画像は、MCID画像解析装置で解析した(Nature 409,194−198(2001))。
定量in situハイブリダイゼーション組織化学によってNERPの前駆体であるVGFのmRNAレベルの変化について評価したところ、PVNおよびSONにおけるVGF mRNAレベルが絶水(water deprivation)に対応して増加していた(図4および図5)。
[実施例4]
In vivoおよびin vitroにおけるAVP分泌の測定
ラットに、NERP−1、NERP−1−Gly、NERP−2またはNERP−2−GlyをICV投与し、5分後に高張食塩水(850mM NaCl/10μl)またはアンジオテンシンII (AT−II)(1nmol/10μl)のICV(intracerebroventricular)注射を行った。
血液サンプルは、NERPの注射の15分後に採取した。血漿AVPは、RIAキット(三菱製)により測定した。PVNおよびSONの6つの断片を、ラットの視床下部から採取した。それぞれの核は、95% O2で平衡化された培地199(25mM HEPESバッファpH7.4、2.5%ウシ胎仔血清、2.5%ウシ血清、1%ペニシリン−ストレプトマイシン)内で1時間37℃でプレインキュベートした(1群当たりn=4ウェル)。これらの核を、NERP−1(10−6M)、NERP−1(10−6M)+AT−II(10−6M)またはAT−II(10−6M)のいずれか1つを用いて、3回、各5分間刺激した。これらの刺激期間の間に、5分間の回復期間をおいた。同様に、これらの核を、NERP−2(10−6M)、NERP−2(10−6M)+AT−II(10−6M)、NERP−1−Gly(10−6M)、またはNERP−2−Gly(10−6M)のいずれかを用いて刺激した。脱分極によって誘発された分泌を確認するために、これらの刺激を加えた後、6×10−2M KClを用いてインキュベーションした。ラット下垂体後葉の2つの断片は、上記記載と同様の条件下で、NERPおよびAT−IIで刺激した。培地の一部分は、AVPの測定用にRIAに供した。本実験は、5回繰り返した。
NERP−1の脳室内ICV投与は、高塩分投与で誘導されたAVP分泌を用量依存的に抑制した(図6)。NERP−1の事前投与は、AT−IIで誘導されたAVP分泌を抑制した(図6)。また、NERP−2のICV投与も、高塩分とAT−IIで誘導されたAVP分泌を抑制した。PVNとSONのin vitro静的培養において、NERP−1およびNERP−2双方とも、基底およびAT−IIで誘導されたAVP分泌を抑制した(図7)。また、NERP−1は、下垂体後葉からのAVP分泌も抑制した(図8)。
以上の結果から、NERPはAVP分泌の調節に関与していることが示された。
[実施例5]
電気生理学によるNERPの作用機序の確認
雄ウィスター若年ラットのSONを含む薄片試料を、J.Physiol.504,113−126(1997)記載の方法に従って記録室内に固定した。灌流速度は、1.4ml/分とした。SON内の大細胞神経内分泌ニューロンは、正立顕微鏡(upright microscope)(BX50、オリンパス)によって同定した。物質の測定期間は、別段の記載のない限り5分とした。電極は、ガラス毛細管からプラー(P−87、Sutter Instrument Co.)で3重に引いて作成した。後シナプス電流の記録は、膜を破って5分後、電流が安定状態に達した時に開始された。電流と電圧は、EPC−10増幅器(HEKA)によって記録した。信号は、アナログ・デジタル・コンバータ(MacLab/v.3.5)を用いて、3kHzでフィルタ処理し、1kHzでデジタル化した。シナプス電流を定量的に分析するために、ソフトウェア(AxoGraph v.3.6.1、アクソン・インスツルメンツ(Axon Instruments))とともに1Hzのハイパスフィルタを用いたAC部品のみを使用した。
AVP分泌に関するNERPの抑制機序を明らかにするために、in vitroスライス標本上でのパッチクランプ法(J.Physiol.504,113−126(1997))を用いてSONにおけるAVPニューロンへの求心性入力(afferent input)について検討した。バソプレシンニューロンの神経活動は、興奮性グルタミン入力および抑制性GABA作動性入力によって調節される。バソプレシンニューロンからの自発性の興奮性および抑制性後シナプス電流(EPSCおよびIPSC)は、各々−70mVおよび−20mVに保持電位を設定することで選択的に記録した。NERP−1は、SONニューロンにおいて、GABA作動性IPSCを増大させたが、EPSCを増大させなかった(図9、図10)。また、NERP−2も、IPSCを増大させた。NERP−1は、IPSCの周波数を増大させたが振幅を増大させなかった(図9)。このことはNERPが前シナプスGABA作動性電流を活性化(activate)したことを示している。NERP−1によって誘導される前シナプスGABA作動性電流は、Na+チャンネル阻害剤であるテトロドトキシンによって変化しなかった。このことは、介在ニューロンがSONニューロンに対するNERPの抑制作用に関与しなかったことを示している(図11)。IPSCに対するNERP−1の興奮性作用が酸化窒素(NO)の同作用に類似していたため、NERP−1がNOを介してSONニューロンの前シナプスGABA作動性電流に影響を及ぼすかどうかについて調べた。NOスカベンジャーであるヘモグロビン(Hb)の適用によって、NERP−1に誘導されるIPSCは影響を受けなかった(図12)。上記の結果は、NERPは、SONニューロンにおけるGABA作動性活動の局所調節因子であり、NOが介在する経路とは独立して作用をもたらすことを示している。以上の結果から、NERPは、NOのようなGABA作動性入力を誘導する新規の生物活性ペプチドであることが確認された。
[実施例6]
給餌実験による摂食促進活性の測定
NERP−1、NERP−2またはNERP−2−Gly(0.1〜5nmol/10μl)を、摂食の評価のために09:30にラット(1群当たりn=15)にICV注射した。抗オレキシンA IgG(0.25μg/10μl、Santa Cruz)および抗オレキシンB IgG(0.25μg/10μl、Santa Cruz)または抗MCH IgG(0.5μg/10μl、Phoenix)は、09:00にラット(1群当たりn=12)にICV注射した。すべての場合において、IgGは、NERP−2投与3時間前に注射した。摂食は、1時間モニターした。マウス実験では、NERP−2(1nmol/2μl生理食塩水)またはMCH(1nmol/2μl生理食塩水)をオレキシン・ノックアウトマウス(Cell 92,573−585(1998))および野生型同腹子(1群当たりn=5、4ヶ月雄)にICV注射によって投与してから、1時間摂食を測定した。オレキシン・ノックアウトマウスは、ES細胞の標的変異によって作成した(Cell 92,573−585(1998))
自由給餌ラットへのNERP−2のICV注射は、最低有効用量0.1nmolで用量依存的に明期中の摂食を増大させた(図13)。NERP−2の食欲促進作用は、ICV注射後1時間を超えては持続しなかった。NERP−2のICV注射を受けるラットは、敏捷な(alert)点は変わりなく、対照群と比較して通常と異なる行動は一切示さなかった。NERP−2免疫反応性細胞は、摂食行動やエネルギー代謝の調節に重要な部位である視床下部外側野(lateral hypothalamus)(J.Physiol.504,113−126(1997))に存在していた(図14)。二重免疫染色により、NERP−2は、摂食および自発運動を刺激する神経ペプチドであるオレキシンと共局在する一方(図14)、NERP−2は、視床下部外側野において産生される別の食欲促進作用をもつペプチドであるメラニン凝集ホルモン(melanin−concentrating hormone)(MCH)とは共局在していないことが明らかになった(図14)。
NERP−2を投与する3時間前に、脳室内に抗オレキシン−A IgGおよび抗オレキシン−B IgGまたは抗MCH IgGを注射した。オレキシン抗体は、NERP−2に誘導される摂食を無効にしたが、MCH抗体は無効にしなかった(図15)。また、野生型の対照マウスではNERP−2のICV注射は摂食を刺激したが、オレキシン・ノックアウトマウスでは刺激しなかった(図16)。
[実施例7]
自発運動促進活性の測定
NERP−2(5nmol/2μl生理食塩水)または溶媒(vehicle)のICV投与が施されたマウスの運動は、前述したような赤外線検出器(Muromachi Co.Ltd.、東京、日本)を備えた耐音性、耐光性があるかごの中で、Endocrinology 144,4729−4733(2003)記載の方法に従って測定した。自発運動数は、15分ごとに測定し、投与後30分から120分の間合計した。
NERP−2のICV投与は、野生型マウスでは全自発運動(total locomotor activity)を促進したが、オレキシン・ノックアウトマウスでは促進しなかった(図17)。
以上の結果は、NERP−2がオレキシン系と相互作用して摂食および自発運動を促進することを示している。
本発明においては、例えば、配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、該ポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、該ポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドなどは、例えば、バソプレシン分泌抑制剤などとして、例えば、腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群(SIADH)、高血圧などの予防・治療剤などとして利用することができる。
また、例えば、配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、該ポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体、該ポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチドなどは、例えば、蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング(Cushing)症候群などの予防・治療剤などとして利用することができる。
さらに、例えば、配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、該ポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、該ポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドなどは、例えば、バソプレシン分泌抑制剤などとして、例えば、腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群(SIADH)、高血圧などの予防・治療剤、拒食症などの予防・治療剤、摂食(食欲)促進剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害(例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群(時差ボケ)など)〕などの予防・治療剤などとして利用することができる。
また、例えば、配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、該ポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体、該ポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチドなどは、例えば、蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング症候群、肥満症、摂食亢進症、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害(例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群(時差ボケ)など)〕などの予防・治療剤などの予防・治療剤などとして利用することができる。
さらに、例えば、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩などは、上記したそれらのポリペプチドなどが関与する疾患の予防・治療剤のスクリーニングなどに有用である。
また、例えば、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体などは、上記疾患の診断などに有用である。
[配列表]
また、例えば、配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、該ポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体、該ポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチドなどは、例えば、蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング(Cushing)症候群などの予防・治療剤などとして利用することができる。
さらに、例えば、配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、該ポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩、該ポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドなどは、例えば、バソプレシン分泌抑制剤などとして、例えば、腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群(SIADH)、高血圧などの予防・治療剤、拒食症などの予防・治療剤、摂食(食欲)促進剤、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害(例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群(時差ボケ)など)〕などの予防・治療剤などとして利用することができる。
また、例えば、配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、該ポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体、該ポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチドなどは、例えば、蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング症候群、肥満症、摂食亢進症、睡眠障害〔例、原発性不眠、概日リズム障害(例、三交替勤務等による体調の変調、時間帯域変化症候群(時差ボケ)など)〕などの予防・治療剤などの予防・治療剤などとして利用することができる。
さらに、例えば、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩などは、上記したそれらのポリペプチドなどが関与する疾患の予防・治療剤のスクリーニングなどに有用である。
また、例えば、配列番号:4、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体などは、上記疾患の診断などに有用である。
[配列表]
Claims (60)
- 配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド(但し、配列番号:1、配列番号:2または配列番号:3で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを除く)、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩。
- 配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなる請求項1記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩。
- 配列番号:4、配列番号:5または配列番号:6で表されるアミノ酸配列からなる請求項1記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩。
- 請求項1記載のポリペプチドの部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩。
- 配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含有するポリペプチド(但し、配列番号:1、配列番号:2または配列番号:3で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを除く)、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩。
- 配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列と同一または実質的に同一のアミノ酸配列からなる請求項5記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩。
- 配列番号:7、配列番号:8または配列番号:9で表されるアミノ酸配列からなる請求項5記載のポリペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩。
- 請求項5記載のポリペプチドの部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩。
- 請求項1記載のポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
- DNAである請求項9記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号:12または配列番号:13で表される塩基配列を含有する請求項10記載のDNA。
- 配列番号:12または配列番号:13で表される塩基配列からなる請求項10記載のDNA。
- 請求項5記載のポリペプチドまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
- DNAである請求項13記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号:14または配列番号:15で表される塩基配列を含有する請求項14記載のDNA。
- 配列番号:14または配列番号:15で表される塩基配列からなる請求項14記載のDNA。
- 請求項9または13記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
- 請求項17記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体。
- 請求項18記載の形質転換体を培養し、請求項1または5記載のポリペプチドまたはその部分ペプチドを生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする請求項1または5記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチドまたはその塩の製造法。
- 請求項1記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体。
- 請求項20記載の抗体を用いることを特徴とする請求項1記載のポリペプチドの定量方法。
- 請求項21記載の定量方法を用いることを特徴とする請求項1記載のポリペプチドの機能が関連する疾患の診断法。
- 請求項5記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体。
- 請求項23記載の抗体を用いることを特徴とする請求項5記載のポリペプチドの定量方法。
- 請求項24記載の定量方法を用いることを特徴とする請求項5記載のポリペプチドの機能が関連する疾患の診断法。
- 請求項9記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチド。
- 請求項13記載のポリヌクレオチドの塩基配列に相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列またはその一部分を含有するアンチセンスポリヌクレオチド。
- 請求項1記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする、該ポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
- 請求項1記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有することを特徴とする、該ポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
- 請求項5記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする、該ポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
- 請求項5記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有することを特徴とする、該ポリペプチドの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
- 請求項1記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる医薬。
- 請求項9記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
- 請求項1記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる医薬。
- 腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群または高血圧の予防・治療剤である請求項32〜34のいずれかに記載の医薬。
- 請求項1記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる医薬。
- 請求項20記載の抗体を含有してなる医薬。
- 請求項26記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
- 蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症またはクッシング症候群の予防・治療剤である請求項36〜38のいずれかに記載の医薬。
- 請求項5記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる医薬。
- 請求項13記載のポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
- 請求項5記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有してなる医薬。
- 腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群、高血圧もしくは拒食症の予防・治療剤または摂食促進剤である請求項40〜42のいずれかに記載の医薬。
- 請求項5記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有してなる医薬。
- 請求項23記載の抗体を含有してなる医薬。
- 請求項27記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる医薬。
- 蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング症候群、肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤である請求項44〜46のいずれかに記載の医薬。
- 外来性の、請求項9または請求項13記載のポリヌクレオチドを有する非ヒトトランスジェニック動物。
- 請求項1記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進することを特徴とする腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群または高血圧の予防・治療方法。
- 請求項1記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、請求項9記載のポリヌクレオチド、または該ポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に対して投与することを特徴とする腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群または高血圧の予防・治療方法。
- 腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群または高血圧の予防・治療剤の製造のための請求項1記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、請求項9記載のポリヌクレオチド、または該ポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の使用。
- 請求項1記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害することを特徴とする蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症またはクッシング症候群の予防・治療方法。
- 請求項1記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、請求項20記載の抗体または請求項26記載のアンチセンスポリヌクレオチドの有効量を哺乳動物に対して投与することを特徴とする蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症またはクッシング症候群の予防・治療方法。
- 蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症またはクッシング症候群の予防・治療剤を製造するための、請求項1記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、請求項20記載の抗体または請求項26記載のアンチセンスポリヌクレオチドの使用。
- 請求項5記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進することを特徴とする腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群、高血圧もしくは拒食症の予防・治療方法または摂食促進方法。
- 請求項5記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、請求項13記載のポリヌクレオチド、または該ポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の有効量を哺乳動物に対して投与することを特徴とする腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群、高血圧もしくは拒食症の予防・治療方法または摂食促進方法。
- 腎性浮腫、尿排出障害、低ナトリウム血症、抗利尿ホルモン分泌不適合症候群、高血圧もしくは拒食症の予防・治療剤または摂食促進剤の製造のための請求項5記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、請求項13記載のポリヌクレオチド、または該ポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩の使用。
- 請求項5記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害することを特徴とする蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング症候群、肥満症または摂食亢進症の予防・治療方法。
- 請求項5記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、請求項23記載の抗体または請求項27記載のアンチセンスポリヌクレオチドの有効量を哺乳動物に対して投与することを特徴とする蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング症候群、肥満症または摂食亢進症の予防・治療方法。
- 蓄尿障害、多尿症、尿崩症、高ナトリウム血症、代謝性アルカローシス、低カリウム血症、クッシング症候群、肥満症または摂食亢進症の予防・治療剤を製造するための、請求項5記載のポリペプチドもしくはその部分ペプチド、そのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩、請求項23記載の抗体または請求項27記載のアンチセンスポリヌクレオチドの使用。
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A621 | Written request for application examination |
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