JP4127999B2

JP4127999B2 - 液体試料体積の決定法

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Publication number: JP4127999B2
Application number: JP2001350178A
Authority: JP
Inventors: ヴェルナー・ヘルク; ニコラウス・インゲンホーフェン; ミヒャエル・トレッシュ
Original assignee: Tecan Trading AG
Current assignee: Tecan Trading AG
Priority date: 2000-11-17
Filing date: 2001-11-15
Publication date: 2008-07-30
Anticipated expiration: 2021-11-15
Also published as: CA2363475A1; AU2001295361A1; WO2002040161A1; EP1221341A1; JP2002228587A; EP1221341B8; EP1221341B1; DE50108157D1; US7247483B2; ATE310582T1; US20020149772A1

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定濃度の発色性指示薬を被測定液体（A）に加えて該液体を染色させ、該染色液体から試料を分離させ、該分離試料の光学的吸収度を測定し、次いで、測定された光学的吸収度と液体（A）中の指示薬の濃度とを相関させることによって分離試料の体積を決定することを含む該液体の試料体積の決定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
体積が10μｌよりも大きな小滴を空気中で非常に容易に計量分配させることができる。即ち、ピペットを的確に操作するならば、該小滴はピペットの先端から自発的に離脱する。従って、小滴のサイズは試料液体の物理的特性、例えば、表面張力または粘度等によって決定することができる。このため、小滴のサイズは、計量分配されるべき液体の定量度を制限する。
【０００３】
これに対して、吸引と計量分配、即ち、体積が10μｌよりも少ない液体試料のピペット秤量においては、このような少量の試料の計量分配を保証する装置と技術が一般に必要である。ピペットの先端（ピペットチップ）、即ち、試料液体の吸引および/または計量分配用装置の先端を用いる計量分配は空気中から（「フロム・エア（from air)」）おこなわれるか、または表面との接触によっておこなわれる。この表面は、液体試料が計量分配されるべき容器の固体状表面（「オン・チップ・タッチ(on tip touch)」）であってもよい。また、該表面は該容器中の液体の表面（「オン・リキッド・サーフェイス(on liquid surface)」）であってもよい。計量分配後は混合操作をおこなうことが推奨されており（特に、試料の体積がナノリットルまたはピコリットルのオーダーの場合）、これによって試料が希釈液中に均一に分散されるようにする。
【０００４】
液体から試料を分離させるシステムはピペッターとして知られている。この種のシステムは、例えば、「スタンダード・マイクロタイトレーション・プレーツ」（商標）（ベックマン・クールター社；4300 N. ハーバー・ブールバード、P.O.ボックス3100 フュラートン、カリフォルニア、米国 92834）のウェルおよび/または96個のウェルを有するマイクロプレートへ液体を計量分配させる場合に使用される。試料体積の低減化は、例えば、384個、864個、1536個またはそれ以上のウェルを有する高密度マイクロプレートに試料を充填する場合等においてますます重要になっており、計量分配される試料体積の精度は非常に重要である。試料数の増加に伴って、一般に実験装置の小型化が要求されるので、ピペッターの使用が必要となり、また、試料体積の精度、並びにピペッターの移動制御および/または計量分配の正確さに関する特別な要件が必要となる。
【０００５】
使い捨てチップは、試料の意図しない部分的移送（汚染）の危険性を著しく低減させる。簡単な使い捨てチップ知られており（所謂「空気置換チップ」）、その幾何学的形態と材質は、非常に少量の試料の吸引および/または計量分配が正確におこなわれるように最適化されている。内部にポンププランジャーを有する所謂「容量形チップ」が知られている。
【０００６】
オートメーション化のためには、２つの操作、即ち液状試料の規定された吸引とその後の計量分配は相互に区別されなければならない。これらの操作の間においては、一般に実験者またはロボットによってピペットの先端が移動されるので、液状試料の吸引位置と計量分配位置は相違する。計量分配および/または吸引/計量分配を正確におこなうためには、ポンプ（例えば、シリンジポンプとして機能するダイリューター）、チューブおよび先端（ピペットチップ）を具有する液体システムのみが重要である。
【０００７】
液体試料の計量および/または吸引/計量分配の精度（ACC）および再現性（変動係数：CV）は種々のパラメーターによって大きな影響を受ける。計量分配の速度は、例えば、小滴がピペットチップからどのようにして離反するかを主として決定する。
【０００８】
原則的には、ピペット秤量においては２種類の基本的な方法、即ち単一ピペット秤量と多重ピペット秤量が区別される。単一ピペット秤量法においては、液体試料は異なった位置において吸引されて計量分配される。多重ピペット秤量法においては、多容量の液体を一回で吸引し、次いで、１または複数の異なる位置、例えば、「スタンダード・マイクロタイトレーション・プレーツ」の種々のウェル内において、一般的には等容量の試料（アリコート）を数回に分けて計量分配する。
【０００９】
しかしながら、液体試料の流動体積の測定においては、小滴の分離方法については全く考慮されていない。ヨーロッパにおいては、スイスのジュネーブに本拠のある国際標準機構（ISO）による規準ISO/DIS 8655-1が少なくともドラフトフォームとして1990年以来入手可能である。この規準は、計量分配装置、例えば、ピペット、ディスペンサーおよびビュレット等を用いて実験室的規模での操作をおこなうための基本的条件を規定している。既知の国内的規準、例えば、ASTM（米国）、英国標準（英国）または最新のドラフトDIN 12650（ドイツ）はISOの規準ISODIS 8655-1のシステムに適合されていなければならない。
【００１０】
規準DIN 12650は、1996年から第４回目のドラフトにおいて、ディスペンサーの測定精度を試験するために２種の上記方法を実質上区別している。これらは重力法と非重力法である。重力的測定法を実施するために、全ての実験室において十分にバランスのとれた秤量ステーションおよび必要な精度（小数第６位）を示す高価な秤量計があるわけではないので、例えば、体積が0.2〜1μlの範囲の試料を測定するためのハンドピペット用測光試験は産業界（例えば、エッペンドルフ社；バルクハウゼンウェーク 1、D-22339 ハンブルク、ドイツ）から提供されている。
【００１１】
別の方法が次の文献から知られている：リチャード H. クルチス、「小容量用機械作用ピペットの性能検定」（Cal. Lab、5月/6月、1996年）。この場合には、マイクロリットルのオーダーの液体試料に重力法を適用する場合の問題点（例えば、試料の静的変化、蒸発、振動）を考慮して、発色性物質の使用に基づく集積システムが提案されている。しかしながら、この方法においては、測定されるべき光学濃度を有する指示薬の濃度が正確に知られていることが必要である。この光学濃度はlog₁₀(1/T)（式中、Tは透過率を示す）で計算される。この透過率はI/Io（即ち、試料を透過する光線の出力強度と入力強度との比）に対応する。
【００１２】
さらに、光学濃度測定用装置は国際規準に適合しなければならない。また、種々の問題点、例えば、試料温度に対する測定の依存性、溶液の変化および測定キュベットの磨耗等を考慮しなければならない。アルテル社（25 ブラッドレイ・ドライブ・ウェストブルーク、メーン、米国）はこの種のシステム「アルテル PSC （商標）ピペット検定システム」を提供している。このシステムは、正確に規定された濃度を有する塩化銅溶液4.75mlを充填した後で封止した試験管および該溶液の波長730nmにおける光学吸収度（A）（Io/I＝1/T）の測定装置から主として構成される。該試験管を該測定装置内へ挿入し、検定プロセス中は該試験管を該装置内に保持する。実験者は試験管を開封し、所望の測定精度に対応する試料を、被検定ピペットを用いてガラス内へ添加し、次いで試験管を再び封止する。添加する試料は試験有機物質「ポンシュー（Ponceau) S」である。該有機物質は、高濃度においても、水のように長時間の安定性と良好なピペット適合能（pipettability）を有すると共に、520nmにおいて十分に確認されている幅広い吸収ピークを示すために、特に選定されるものである。塩化銅溶液の吸収ピークと「ポンシュー S」の試験溶液の吸収ピークは重ならない。
【００１３】
さらにまた、該試験溶液は、微生物の増殖を防ぐための殺生物剤および pH 安定化用緩衝液を含有する。連続ミキサーを用いて２種類の溶液を混合し、520nmにおける吸収度（ポンシュー S )と730nmにおける吸収度（塩化銅）を測定する。添加した試料の体積は、これらの２つの測定値と既知の初期濃度に基づいて計算される。このシステムは、光学的吸収度を経路の長さや試験管の不規則性に影響されずに測定できるという利点を有するが、多流路を有するピペット秤量ロボットにおいて合理的な費用で使用するのに不適合であるという難点を有する。
【００１４】
さらに別のこの種の検定法においては、試験物質として、高感度の吸収測定を可能にする「オレンジ G」を使用する。しかしながら、この場合には、この試験物質はフラットな分子構造を有するために、ピペット先端の内壁および/またはマイクロプレートのチューブ、トラフおよび/またはウェルに対して高い付着性を示すという欠点を有する。従って、試験液中において「オレンジ G」の制御できない濃度低下が発生するので、試験の信頼性が損なわれる。
【００１５】
さらにまた別のこの種の方法がBE 761537号明細書に開示されている。この明細書には、種々の物質の高い精度での自動的分析法、特に、該物質の試料体積に依存する自動分析法が記載されている。この発明によれば、指示薬としてのクロムをCr₂(SO₄)₃・10 H₂Oの形態で試料と混合し、試料中においてクロム（III)を特定の濃度にする。測定されるクロム（III)の濃度に基づいて、試料の有効体積が計算される。試料体積はミリリットルのオーダーである。
【００１６】
Cr₂(SO₄)₃・10 H₂Oは水溶液中では、［Cr(H₂O)₆］³⁺として存在する。次の文献によれば、水性錯体［Cr(H₂O)₆］³⁺は約13のモル吸光係数（ε）を有するが、100よりも小さいεは平均的な値に比べて低い：ワルター・シュナイダー、「配位化学入門」、第115〜117 頁（シュプリンガー・フェアラーク、ベルリン、ハイデルベルク、ニューヨーク、1968年）。純粋な水性錯体においては、吸光係数は約50である。顔料の濃度と光学的吸収度は、ベール−ランベルトの法則によって関係付けられる：
Ａ＝ｃ*ε*ｌ
Ａ＝光学的吸収度
ｃ＝溶解物質の濃度（M＝Mol/L)
ε＝溶解物質の吸収光係数［l/(M cm)］
ｌ＝光が透過する液層の厚さ（cm)
【００１７】
測定装置に起因する理由から、測定は0.1〜1の吸収範囲において実施することが推奨されている。この点に関しては、次の文献を参照されたい：ブルノ・ランゲら、「光分析」、第21頁、VCHフェアラークスゲゼルシャフト社、ウァインハイム、1987年。吸光係数が高いほど、より高い感度の測定システムの設計可能となる。光学的吸収度が0.1のときに１μlの体積（最終体積：200μl)を測定するためには、ベール−ランベルトの法則によれば、［Cr(H₂O)₆］³⁺ の濃度は少なくとも15Mol/Lでなければならない。しかしながら、試料の物理的特性は、望ましくないこのような高濃度によって著しく変化する。
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、当該分野における従来技術の前記の諸問題を解決すると共に、サブマイクロリットルの範囲においても検量を可能にする液体試料体積の測定法と測定装置を提供するためになされたものである。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
即ち本発明は、（ｉ）特定濃度の発色性指示薬を被測定液体（Ａ）に加えて該液体を染色させ、該染色液体から試料を分離させ、該分離試料の光学的吸収度を測定し、次いで、測定された光学的吸収度と液体（Ａ）中の指示薬の濃度とを相関させることによって分離試料の体積を決定することを含む該液体の試料体積の決定法において、特定のリガンドとの錯化によって該試料を染色させるイオン（例えば、金属イオン、特にＦｅ^＋＋、Ｆｅ^＋＋＋もしくはＣｕ^＋＋、またはアニオン、特にＦ⁻、Ｃｌ⁻もしくはＨ_２ＰＯ_４ ⁻）を、該液体（Ａ）を染色させるための指示薬として使用することを特徴とする該決定法、
および
（ii）計量分配および／またはピッペト秤量する装置、分離された試料を保有するための試料ホルダー、該試料ホルダー内の試料の光学的吸収度を測定するための装置、および分離された試料の体積を計算するためのコンピュータを具備する該システムに関する。
上記の試料体積の決定法および残存試料体積の決定法においては、発色性リガンドと定量的に錯化しない金属イオン、特にＦｅ^＋＋＋を指示薬として使用することができる。この場合、発色性リガンドと定量的に錯化しない金属イオンを還元または酸化させて、リガンドとの錯化の前に錯化されるイオンを生成させることができる。
【００２０】
【発明の実施の形態】
本発明において使用する金属錯体顔料は10000よりも大きな吸光係数を有するので、従来技術の場合に比べて、著しく高い感度を示す測定システムの使用が可能となる。例えば、鉄−トリス−バソフェナントロリン−ジスルホン酸二ナトリウム錯体［Fe(C₂₄H₁₆N₂O₆S₂)₃］^4-、鉄−トリス−フェロジン錯体［Fe(C₂₀H₁₂N₄O₆S₂)₃］^4-、銅クロマズロール S 錯体［Cu(C₂₃H₁₃Cl₂O₉S)］^-および銅−ビス−バソフェナントロリン−ジスルホン酸二ナトリウム錯体［Cu(C₂₄H₁₆N₂O₆S₂)₂］^3-の吸光係数はそれぞれ約18700(532nm)、約22000(560nm)、約16000(522nm)および約13800(481nm)である。
【００２１】
従来技術において知られている強く着色した有機顔料（一般的には、大きな共役Π−系）は原則的には平面状である（例えば、オレンジ G）。この平面性に起因して、この種の有機顔料は、ピペットの先端、チューブまたはウェルの内壁のような無極性表面に対して不都合な高い親和性を示す（該親和性はファンデルワールス力によってもたらされる）。
【００２２】
従来技術において知られている分子の例を図１に示す。また、本発明方法によって、液体試料の体積を決定するために使用される金属錯体顔料の２種の例を図２および図３に示す。
【００２３】
図１はオレンジ Gを示し、図１の（a）、（b）および（c）はそれぞれ構造式、空間充填状態を示す水平投影図および空間充填状態を示す側面図である。
【００２４】
図２は銅（Ｉ)−ビス−（バソフェナントロリン−ジスルホン酸二ナトリウム）錯体を示し、図２の（a）および（b）はそれぞれ構造式および空間充填図である。
【００２５】
図３は鉄（II)−トリス（フェロジン）錯体を示し、図３の（a）および（b）はそれぞれ構造式および空間充填図である。
【００２６】
ピペット秤量に関係する液体特性の測定プロセス中の変化はできるだけ小さいのが望ましい。マイクロプレートのウェル中においてクロモゲンリガンドと反応する指示薬塩をピペット秤量溶液へ添加することによって、該塩の良好な溶解性に起因して液体特性はわずかな影響を受けるだけである。物性に対する影響は、得られる錯体の高い吸光係数に起因してさらに低減されるので、初期濃度が非常に低い指示薬塩を使用することができる。
【００２７】
指示薬塩溶液のピペット秤量の前または後においては、化学量論量のクロモゲンリガンドがウェル中に存在していなければならない。信頼性の高い迅速な定量反応をおこなうためには、過剰のリガンドを使用することができる。指示薬イオンを適当な酸化段階まで変化させるのに必要ないずれかの緩衝塩またはレッドックス活性物質もウェル中に存在させる。従って、実際的なピペット秤量法はいずれにしても影響を受けないので、この測定システムは広範囲に変化させることができる。
【００２８】
大部分の顔料は溶解度による制約があるために、特定の種類の溶媒に対してのみ適している。指示薬イオンを適当な補助リガンドと錯化させることによって、指示薬イオンは、望ましい溶剤または溶剤混合物を含む溶液中へ適当な濃度で添加することができる。例えば，鉄（III)イオンは、［Fe(C₅H₇O₂)₃］錯体として、2,4−ペンタンジオンと共に無極性溶媒を含む溶液中へ添加することができる。多様な誘導体が2,4−ペンタンジオンと共に利用可能であり、これによって、所望の溶剤中における鉄錯体の溶解度を調整することができる。ウェル内においては、補助リガンドがより発色性の強いリガンドによって定量的に抑制され、および/または錯化指示薬イオンの酸化数がレドックス反応によって減少し、これによって、クロモゲンリガンドとのより強い錯体が定量的に形成される。補助リガンドの吸収スペクトルが発色団錯体の吸収スペクトルと重なり合わないということに留意すべきである。
【００２９】
ELISA（酵素結合免疫溶剤アッセイ）試験は現在の臨床診断法と生活科学研究においては不可欠な要素となっている。該試験に関しては次の文献を参照されたい：「プシー−レンベル臨床辞典」、ワルター・ド・グルイター社、ベルリン、1999年、第258版。該試験においては、試験過程中に１回または複数回の洗浄処理を必要とすることが多い。この点に関しては次の文献を参照されたい：ルベルト・ストライヤー、「生化学」（第３版）、第63頁、ニューヨーク、1988年。実際は、反応液は被覆マイクロプレートから吸引され、次いで緩衝溶液または試験試薬がウェル中へ計量分配される。これらの２種の操作はマイクロプレートウォッシャーによっておこなわれる。この装置は、第一段階においては、吸引具として機能し、第二段階においては、ディスペンサーとして機能する。市販されている新製品、例えば、TECAN オーストリア社（ウンタースベルクシュトラーセ 1a 、5082 グレディグ、オーストリア）製の製品を使用することによって、別々または一緒に使用することができる数種の異なる緩衝溶液を計量分配することができる。マイクロプレートウォッシャーは、計量分配に関する既知の規準のほかに、吸引後にウェル内に残存する液体の体積（多くて、例えば2μl）に関する付加的な要求を満たさなければならない。
【００３０】
マイクロプレートは光学的に完全な材料から製造されているのが好ましい。さもなければ、ブランク値の測定が避けられない。平坦な底部と平行な壁部を有するマイクロプレートを使用するのが特に好ましい。マイクロプレート、特に３８４個またはそれ以上のウェルを有するマイクロプレートにおいては、表面張力および液体／壁部相互作用に起因して、拡大されたメニスカスが形成される。ウェルによってメニスカスが不規則になると、光学的測定において経路長が相違し、これによって、再現性に負の影響がもたらされる。従って、低い結合特性を有するマイクロプレートまたは拡大メニスカスの形成を抑制する変性表面を有するマイクロプレートを使用することが推奨される。
【００３１】
実施例１
定量的測定に関するこの実施例においては、「フェロジン（FerroZine)」を含有するFeSO₄水溶液系を使用した。「フェロジン」はハッチ社（P.O.ボックス389、ラブランド、コロラド80539、米国）の登録商標である。試料は単一ピペット秤量法（各々12回のピペット秤量をおこなう）および多重ピペット秤量法（12アリコート）においてピペット秤量した。20、100、200または1000の液滴を計量分配した（意図された液滴の体積：500pl）
【００３２】
フェロジンと酢酸アンモニウムを含有する0.25MのFeSO₄水溶液を検量線を得るために使用した。得られた錯体溶液はアスコルビン酸を用いて安定化させた。この初期溶液を使用して測定溶液を調製した。即ち、ピペット秤量体積が200μl中に2.5nl、5.0nl、10.0nl、20.0nl、40.0nlまたは80.0nlになるように希釈することによって測定溶液を調製した。これらの測定溶液の各々について12のアリコート（200μl）を手動操作でマイクロプレート内へ秤量し、光学的吸収度および/または光学濃度（OD）を、マイクロプレート測光リーダーを用いて測定した。検量線は測定点の線形回帰分析によって計算した。
【００３３】
体積測定のために、アスコルビン酸を含有する3.25 mM のフェロジン溶液であって、酢酸アンモニウムで緩衝化した該溶液 100μlをマイクロプレートのウェル内へ移した。アスコルビン酸で安定化させた0.25MのFeSO₄溶液10nlまたは50nlを、ピペット秤量ロボットを用いて該ウェル内へ移した。また、アスコルビン酸で安定化させた0.025MのFeSO₄溶液100nlまたは500nlをピペット秤量した。
【００３４】
ピペット秤量操作をおこなった後、各々のウェル内において、脱イオン水を注ぎ足すことによって液体の全体積を200μlにし、得られた溶液を、マイクロプレートの機械的振動によって十分に混合させた。マイクロプレートのウェル中に存在する着色錯体溶液の光学的吸収度はマイクロプレート測光リーダーを用いて測定し、体積は検量線に基づいて計算した。フェロジンを含有するFeSO₄水溶液系を用いて得られた結果を以下の表１および表２に示す。
【００３５】
【表１】

【００３６】
【表２】

【００３７】
実施例２
定量的測定に関するこの実施例においては、100%ジメチルスルホキシド（DMSO)を溶剤としてフェロジンを含有する鉄−トリス（アセチルアセトネート）系を使用した。試料は単一ピペット秤量法（各々12回のピペット秤量をおこなう）および多重ピペット秤量法（12アリコート）においてピペット秤量した。20、100、200または1000の液滴を計量分配した（液滴の体積：400pl）。純粋なDMSOを溶媒とする鉄−トリス（アセチルアセトネート）の0.063M溶液を用いて検量線を求めた。
【００３８】
この初期溶液を使用して測定溶液を調製した。即ち、ピペット秤量体積が200μl中に2.5nl、5.0nl、10.0nl、20.0nl、40.0nlまたは80.0nlになるように、酢酸アンモニウム緩衝液、アスコルビン酸およびフェロジンを含有する溶液で希釈することによって測定溶液を調製した。これらの測定溶液の各々について12のアリコート（200μl）を手動操作でマイクロプレート内へ秤量し、光学的吸収度および/または光学濃度（OD）を、マイクロプレート測光リーダーを用いて測定した。検量線は測定点の線形回帰分析によって計算した。体積測定のために、アスコルビン酸を含有する3.25mMのフェロジン溶液であって、酢酸アンモニウムで緩衝化した該溶液100μlをマイクロプレートのウェル内へ移した。純粋なDMSOを溶媒とする0.063Mの鉄−トリス（アセチルアセトネート）溶液8nl、40nl、80nlまたは400nlを、ピペッターを用いて該ウェル内へ移した。
【００３９】
ピペット秤量操作をおこなった後、各々のウェル内において、脱イオン水を注ぎ足すことによって液体の全体積を200μlにし、得られた溶液を、マイクロプレートの機械的振動によって十分に混合させた。マイクロプレートのウェル中に存在する着色錯体溶液の光学的吸収度はマイクロプレート測光リーダーを用いて測定し、体積は検量線に基づいて計算した。純粋なDMSOを溶媒としてフェロジンを含有する鉄−トリス（アセチルアセトネート）溶液系を用いて得られた結果を以下の表３および表４に示す。
【００４０】
【表３】

【００４１】
【表４】

【００４２】
上記の実施例の結果から明らかなように、前述の本発明の目的は達成されている。本発明によって提供される方法によれば、本発明によって提案される金属錯体顔料および相当する装置を使用することによって、液体試料の体積の測定とサブマイクロリットルの範囲での検定が可能となる。
【００４３】
本発明は、液体（A)を染色させるための指示薬としてアニオンを使用するときには、サブマイクロリットルの範囲における液体試料の体積測定と検定に適用することができる。また、このような場合において、特定のリガンドを用いる錯化によって、試料を染色させることができる。ジクロロメタン中において、F^-、Cl^-および/またはH₂PO₄ ^-イオンを錯化させるリガンドは次の文献に例示されている：ミヤムジ、サトーおよびセスラー、Angew.Chem.、第112巻、第10号、第1847〜1849頁（2000年）。β位が共有結合されているアントラキノン官能基化系、特に、カリックス［４］ピロール−アントラキノンはこの種のアニオンの検出に対しては非常に感度のよいセンサーになる。
【００４４】
【発明の効果】
本発明によれば、液体試料の体積測定に関する従来技術の諸問題を解決することができ、サブマイクロリットルの範囲における液体試料体積の決定と検定を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【図１】オレンジ Gを示し、（a）、（b）および（c）はそれぞれ構造式、空間充填状態を示す水平投影図および空間充填状態を示す側面図である。
【図２】銅（Ｉ)−ビス−（バソフェナントロリン−ジスルホン酸二ナトリウム）錯体を示し、（a）および（b）はそれぞれ構造式および空間充填図である。
【図３】鉄（II)−トリス（フェロジン）錯体を示し、（a）および（b）はそれぞれ構造式および空間充填図である。

Claims

特定濃度の発色性指示薬を被測定液体（Ａ）に加えて該液体を染色させ、該染色液体から試料を分離させ、該分離試料の光学的吸収度を測定し、次いで、測定された光学的吸収度と液体（Ａ）中の指示薬の濃度とを相関させることによって分離試料の体積を決定することを含む該液体の試料体積の決定法において、特定のリガンドとの錯化によって該試料を染色させるイオンを、該液体（Ａ）を染色させるための指示薬として使用することを特徴とする該決定法。
試料の分離前に、イオンを液体（Ａ）中の特定のリガンドと錯化させ、着色錯体溶液を生成させる請求項１記載の方法。
試料の分離前に、指示薬塩を液体（Ａ）に添加し、該液体の試料を特定の発色性リガンド含有反応溶液中へ計量分配して該反応溶液中で錯化によって発色させる請求項１記載の方法。
液体（Ａ）に添加する前に、発色性指示薬の液体（Ａ）中での溶解度を改善するために、該イオンを補助リガンドと錯化させた後に該液体へ添加し、液体（Ａ）の試料を特定のリガンド含有反応溶液中へ計量分配して錯化をおこなわせることによって補助リガンドの抑制と発色をもたらす請求項１記載の方法。
特定の発色性リガンドを、予想される反応量よりも過剰に反応溶液中へ添加する請求項３または４記載の方法。
試料ホルダー内の試料を十分に分離させた後、補助体積を該試料ホルダー内へ付与する請求項１記載の方法。
指示薬として、金属イオンを使用する請求項１記載の方法。
金属イオンがＦｅ^＋＋、Ｆｅ^＋＋＋またはＣｕ^＋＋である請求項７記載の方法。
指示薬としてアニオンを使用する請求項１記載の方法。
特定の発色性リガンドと非定量的に錯化するＦｅ^＋＋＋を指示薬として使用する請求項１記載の方法。
Ｆｅ^＋＋＋を還元させて、特定のリガンドと錯化されるＦｅ^＋＋を生成させる請求項１０記載の方法。
特定のリガンドとして多座リガンドを使用する請求項１記載の方法。
多座リガンドがＣ_２０Ｈ_１２Ｎ_４Ｏ_６Ｓ_２、バソフェナントロリン−ジスルホン酸二ナトリウム、バソキュプロイン−ジスルホン酸二ナトリウム及びクロマズロールＳから成る群から選択される請求項１２記載の方法。
補助リガンドとしてβ−ジケトンを使用する請求項４記載の方法。
β−ジケトンがアセチルアセトネートまたはペンタン−２，４−ジオン−１，５−ジオールである請求項１４記載の方法。