WO2023135888A1 - 分注器の吐出量測定方法 - Google Patents

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WO2023135888A1
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volatile liquid
measurement
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Inventor
章史 伊永
Original Assignee
株式会社島津製作所
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/10—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring the discharge amount of a dispenser.
  • piston-type pipettors such as micropipettes and automatic pipettors (hereinafter simply referred to as "pilotters") are widely used in order to accurately dispense liquid samples, reagents, and the like.
  • pilotters piston-type pipettors
  • an error in the amount dispensed by such a pipettor may greatly affect subsequent experimental results, it is necessary to periodically check whether the pipettor is functioning correctly.
  • measurement of ejection volume by a gravimetric method has been widely adopted for inspection of micropipettes (see, for example, Non-Patent Document 1).
  • a micropipette to be inspected is used to suck and discharge a standard liquid (for example, water), and the mass of the discharged standard liquid is measured by an electronic balance. Then, the volume of the standard liquid ejected from the micropipette is calculated based on the measured value at that time and the density of the standard liquid under the temperature at the time of measurement. This makes it possible to confirm whether or not the micropipette can eject the intended amount of the standard liquid (that is, the accuracy of dispensing by the micropipette).
  • a standard liquid for example, water
  • Non-Patent Document 2 When inspecting such a pipettor having a plurality of channels, discharge volume measurement using absorbance measurement is performed (see, for example, Non-Patent Document 2). Specifically, a standard liquid in which a dye is dissolved at a predetermined concentration is aspirated from each channel of an automatic pipetting device to be tested, and the standard liquid aspirated to each channel is discharged to different wells of a microtiter plate. do. After that, a certain amount of water is added to each well and mixed with the standard liquid, and the absorbance of the liquid in each well is measured using a microplate reader.
  • the concentration of the dye in the liquid in each well is obtained, and the concentration, the amount of water added, and the standard liquid , the amount of the standard liquid to be ejected from each channel is calculated based on the concentration of the dye in .
  • Water is generally used as a standard substance in measuring the amount of discharge by the above-mentioned conventional method.
  • the accuracy of the dispensing confirmed by the above method may not be guaranteed when dispensing a liquid whose properties are significantly different from those of water.
  • a highly volatile liquid such as acetonitrile or acetone with a pipettor
  • the vapor generated from the liquid after the liquid is aspirated changes the internal pressure of the pipettor, resulting in a decrease in the pipetted amount.
  • the present invention has been made in view of the above points, and its purpose is to enable accurate measurement of the amount of volatile liquid to be dispensed by a dispenser.
  • a method for measuring the discharge amount of a dispenser according to the present invention comprises: preparing a pigmented volatile liquid containing a predetermined concentration of the pigment by dissolving the pigment in the volatile liquid; Aspirating the volatile liquid containing the dye with a pipettor and discharging it into the measurement container, Drying the dye-containing volatile liquid discharged into the measurement container, After the drying, an evaluation liquid is prepared by adding a predetermined amount of a low-volatility liquid having a lower volatility than the volatile liquid to the measurement container to dissolve the dye, Optical measurement is performed on the evaluation liquid, Based on the measured value of the evaluation liquid by the optical measurement, the added amount of the low-volatility liquid, and the concentration of the dye in the dye-containing volatile liquid, the dye-containing liquid discharged into the measurement container is determined. A discharge amount, which is the volume of the volatile liquid, is obtained.
  • FIG. 4 is a flow chart showing an execution procedure of a calibration method for a dispenser according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 is a flow chart showing the execution procedure of a calibration method for a dispenser according to this embodiment.
  • a volatile liquid is sucked and discharged by a micropipette at a predetermined set volume, the discharge volume at that time is measured, and the discharge volume and the set volume are compared. By doing so, the accuracy of the ejection volume by the micropipette is evaluated. Further, if necessary, the micropipette is adjusted so that the volatile liquid can be dispensed with sufficient accuracy.
  • the volatile liquid in the present invention is a substance that has a boiling point in the range of 50 to 95° C. at 1 atm and is liquid at room temperature (20° C. ⁇ 15° C.), or contains 10% or more of such a substance. means liquid.
  • Substances that have a boiling point in the range of 50 to 95° C. at 1 atm and are liquid at room temperature (20° C. ⁇ 15° C.) include, for example, acetonitrile, methanol, ethanol, acetone, toluene, isopropanol, hexane, and butanol.
  • cyclohexane ethylene glycol, benzene, chloroform, acetaldehyde, triethylamine, phenol, naphthalene, formaldehyde, tetrahydrofuran, or ethyl acetate.
  • a liquid containing a predetermined concentration of a dye is prepared by adding and dissolving the dye in a volatile liquid (step 11).
  • this liquid will be referred to as "volatile liquid containing pigment”.
  • the dye include tartrazine and Coomassie Brilliant Blue (CBB), but the dye in the present invention is not limited thereto.
  • the dye it is desirable to use a dye having a viscosity similar to that of the volatile liquid used for measuring the discharge amount. Specifically, the viscosity is ⁇ 30% (preferably ⁇ 15%) of that of the volatile liquid. Although it is desirable to use a thing, it is not limited to this.
  • the volatile liquid containing the dye is aspirated at a predetermined volume and discharged into the measurement container (step 12).
  • the measurement container for example, a cuvette for spectroscopic measurement, a microtiter plate, or the like can be used, but any container that can be used for optical measurement may be used.
  • the dye-containing volatile liquid discharged into the measurement container is completely dried (step 13).
  • the drying method is not particularly limited, natural drying is desirable in order to eliminate the possibility of sublimation of the dye due to heating.
  • evaluation liquid aqueous solution of dye thus obtained is hereinafter referred to as "evaluation liquid”.
  • the measurement container is set in a spectrophotometer, and the absorbance of the evaluation liquid at the absorption wavelength of the dye is measured (step 15).
  • a microtiter plate is used as the measurement container, a microplate reader is used as the spectrophotometer.
  • a plurality of liquids for creating a calibration curve which are aqueous solutions each containing the same dye as the dye contained in the liquid for evaluation, at different concentrations, are prepared (step 21), and the absorbance of each liquid for creating a calibration curve is measured in the same manner. Measure (step 22).
  • the evaluation liquid and the plurality of calibration curve preparation liquids are set in the spectrophotometer, and the absorbance measurement of the evaluation liquid and the absorbance measurement of the plurality of calibration curve preparation liquids are continuously performed. You can also do it on purpose.
  • a calibration curve showing the relationship between the concentration of the dye and the absorbance is created, and the concentration of the dye in the volatile liquid containing the dye and the step Based on the amount of water added in 14, the concentration of the dye in the calibration curve is converted to the volume of the volatile liquid containing dye (i.e., the theoretical value of the discharge amount of the volatile liquid containing dye from a micropipette). .
  • a calibration curve showing the relationship between the absorbance and the discharge amount (theoretical value) is obtained (step 23).
  • step 16 the discharge amount of the dye-containing volatile liquid by the micropipette is specified (step 16).
  • step 23 a calibration curve showing the relationship between absorbance and dye concentration is created, and the calibration curve is converted into a calibration curve showing the relationship between absorbance and ejection volume.
  • step 23 only a calibration curve showing the relationship between absorbance and dye concentration may be created.
  • the concentration of the dye in the evaluation liquid is specified based on the calibration curve and the absorbance of the evaluation liquid measured in step 15, and the value and the dye-containing volatile liquid and the amount of water added in step 14, the discharge amount of the dye-containing volatile liquid is calculated.
  • the method according to the present embodiment includes the step of drying the pigment-containing volatile liquid discharged by the dispenser, thereby eliminating fluctuations in the measured value due to the degree of volatilization of the volatile liquid. . Therefore, according to the method according to the present embodiment, even if the amount of volatile liquid is very small, the ejection amount can always be accurately measured.
  • step 17 the set volume of the micropipette in step 12 is compared with the discharge amount obtained in step 16, and it is determined whether or not the difference between the two is equal to or greater than a predetermined threshold (step 17). If the difference between the two is smaller than the threshold (that is, if No in step 17), the series of operations is terminated.
  • step 18 the micropipette is prepared so that the difference becomes small. Specifically, steps 12 to 18 are repeatedly executed while finely adjusting an adjustment dial or the like provided on the micropipette.
  • the discharge amount of the micropipette is measured, but instead of this, the discharge amount may be measured by another pipetting device, for example, an automatic pipetting device.
  • the pipettor may be of single channel type having only one set of a cylinder, a piston operating within the cylinder, and a tip mounting portion provided at the tip of the cylinder; There is a multi-channel type with a plurality of sets of chip mounting portions, but the present invention can be applied to any of them.
  • the dispenser includes a manual type in which the piston is operated by the user, an automatic type in which the piston is driven by a motor, an air replacement type in which a certain amount of air exists between the piston and the liquid, and a piston
  • a forced displacement type that directly contacts the liquid
  • a fixed volume type in which the dispensing amount (set volume) is constant
  • a variable volume type in which the dispensing amount can be changed.
  • the ejection amount measuring method and the calibration method according to the present invention can be applied to any of them.
  • the set volume and the The dispenser shall be adjusted by changing the relationship with the drive amount of the motor.
  • the absorbance of the evaluation liquid is measured in step 15, but the "optical measurement” in the present invention is not limited to absorbance measurement, fluorescence measurement, transmittance measurement, or the like. , can be anything.
  • a dye that emits fluorescence is used as the dye.
  • "absorbance" should be read as "fluorescence intensity”.
  • water is used as the low volatility liquid in the present invention (that is, water is added to the evaluation container in step 14 to dissolve the dye), but instead of water, other A low volatility liquid may be used.
  • the low volatility liquid in the present invention means a substance that has a boiling point higher than 95° C. at 1 atmosphere and is liquid at room temperature (20° C. ⁇ 15° C.).
  • Such low volatility liquids include water as well as, for example, dimethylsulfoxide, glycerin, or phenol.
  • the discharge amount in each channel (48 channels) of the multi-channel automatic pipetting device was measured.
  • the microtiter plate was set in a microplate reader, and the absorbance at the absorption wavelength (426 nm) of the dye was measured. (6) The average value of the blank measurements was subtracted from the measured values (absorbance) for each well obtained by the absorbance measurement. (7) Based on the dye concentration (mg/L) in each calibration curve preparation liquid and the values obtained in (6) above, a calibration curve showing the relationship between absorbance and dye concentration (Fig. 2) was created. (8) By converting the dye concentration (mg/L) into theoretical ejection volume ( ⁇ L) using the following formula, the calibration curve is converted into a calibration curve (Fig. 3) showing the relationship between absorbance and theoretical ejection volume. Converted.
  • Theoretical ejection volume ( ⁇ L) ⁇ Dye concentration (mg/L) x Liquid volume in well (100 ⁇ L) ⁇ / Dye concentration in dye-containing volatile liquid (6000 mg/L) (9) From the measured value (absorbance) of the evaluation liquid in the absorbance measurement, the theoretical discharge amount of the dye-containing volatile liquid from each channel was calculated using the calibration curve of (8) above.
  • Table 1 shows the measured values (absorbances N1 and N2) for each of the calibration curve preparation liquids described above, and the inverse regression values and accuracy calculated from the calibration curve (FIG. 2) prepared based on the measured values.
  • Table 2 shows the measured absorbance of the liquid for evaluation in each well of the microtiter plate ("Ch number" in the table is the channel number of the automatic dispensing device that ejects the dye-containing volatile liquid into each well. ).
  • Table 3 shows the result of converting each absorbance measurement value in Table 2 into a theoretical dispensing amount using the calibration curve in FIG.
  • the numerical value in each cell of this table corresponds to the theoretical discharge amount of the dye-containing volatile liquid from each channel of the automatic pipetting device (that is, the discharge amount measured by the method according to the present invention).
  • a method for measuring a discharge amount of a dispenser comprises: preparing a pigmented volatile liquid containing a predetermined concentration of the pigment by dissolving the pigment in the volatile liquid; Aspirating the volatile liquid containing the dye with a pipettor and discharging it into the measurement container, Drying the dye-containing volatile liquid discharged into the measurement container, After the drying, an evaluation liquid is prepared by adding a predetermined amount of a low-volatility liquid having a lower volatility than the volatile liquid to the measurement container to dissolve the dye, Optical measurement is performed on the evaluation liquid, Based on the measured value of the evaluation liquid by the optical measurement, the added amount of the low-volatility liquid, and the concentration of the dye in the dye-containing volatile liquid, the dye-containing liquid discharged into the measurement container is determined. A discharge amount, which is the volume of the volatile liquid, is obtained.
  • (Section 2) The method for measuring the discharge amount of the dispenser according to Section 1, preparing a plurality of calibration curve preparation liquids by dissolving the dye at different concentrations in the low volatility liquid; performing the optical measurement for each of the plurality of calibration curve preparation liquids; creating a calibration curve based on the measurement results of the plurality of calibration curve creation liquids by the optical measurement; Using the calibration curve, the discharge amount may be obtained from the measured value of the liquid for evaluation in the optical measurement.
  • the dispenser may be a multi-channel dispenser.
  • the discharge amount of a pipetter since the discharge amount can be measured for each channel of the multi-channel pipettor at once, it takes time and effort to measure the discharge amount. can be reduced.
  • a calibration method for a dispenser comprises: preparing a pigmented volatile liquid containing a predetermined concentration of the pigment by dissolving the pigment in the volatile liquid; Aspirating the pigment-containing volatile liquid at a predetermined set volume with a pipetting device and discharging it into the measurement container; Drying the dye-containing volatile liquid discharged into the measurement container, After the drying, an evaluation liquid is prepared by adding a predetermined amount of a low-volatility liquid having a lower volatility than the volatile liquid to the measurement container to dissolve the dye, Optical measurement is performed on the evaluation liquid, Based on the measured value of the evaluation liquid by the optical measurement, the added amount of the low-volatility liquid, and the concentration of the dye in the dye-containing volatile liquid, the dye-containing liquid discharged into the measurement container is determined. Obtain the discharge amount, which is the volume of the volatile liquid, Identifying the difference between the calculated discharge amount and the set volume, The dispenser is adjusted so that the difference becomes small.

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Abstract

揮発性液体に色素を溶解することによって、該色素を所定の濃度で含有する色素入り揮発性液体を調製し（ステップ１１）、分注器によって該色素入り揮発性液体を吸引して測定用容器内に吐出し（ステップ１２）、測定用容器内に吐出された色素入り揮発性液体の乾燥を行い（ステップ１３）、乾燥後に、測定用容器に予め定められた量の、前記揮発性液体よりも揮発性の低い低揮発性液体を添加して色素を溶解させることで評価用液体を調製し（ステップ１４）、評価用液体に対して光学測定を行い（ステップ１５）、該光学測定による評価用液体の測定値と、前記低揮発性液体の添加量と、前記色素入り揮発性液体における色素の濃度とに基づいて、測定用容器に吐出された色素入り揮発性液体の体積である吐出量を求める（ステップ１６）。これにより、マイクロピペット等の分注器による揮発性液体の分注量を、正確に測定できるようになる。

Description

分注器の吐出量測定方法
　本発明は、分注器の吐出量測定方法に関する。
　理化学実験では、液状の試料又は試薬等を正確に分注するために、マイクロピペット又は自動分注装置等のピストン式分注器（以下、単に「分注器」とよぶ）が広く用いられている。こうした分注器による分注量の誤差は、その後の実験結果に大きく影響する可能性があるため、分注器が正確に機能しているか否かを定期的に検査する必要がある。従来、マイクロピペットの検査には、重量法による吐出量測定が広く採用されている（例えば、非特許文献１を参照）。重量法では、検査対象とするマイクロピペットを用いて標準液体（例えば水）を吸引及び吐出し、吐出した標準液体の質量を電子天秤で測定する。そして、そのときの測定値と、測定時の温度下における標準液体の密度とに基づいて、前記マイクロピペットから吐出された標準液体の体積を算出する。これにより、該マイクロピペットが、意図した量の標準液体を吐出できているか否か（すなわち当該マイクロピペットによる分注の正確性）を確認することができる。
　但し、マルチチャンネル型の自動分注装置のような、複数のチャンネルを有する分注器をこのような重量法で検査しようとすると、上記のような標準液体の吸引、吐出、及び質量の測定を１チャンネルずつ行う必要があり、非常に手間が掛かるという問題があった。
　そこで、このような複数のチャンネルを有する分注器を検査する際には、吸光度測定を利用した吐出量測定が行われている（例えば、非特許文献２を参照）。具体的には、所定濃度で色素を溶解した標準液体を、検査対象とする自動分注装置の各チャンネルで吸引し、各チャンネルに吸引された該標準液体をマイクロタイタープレートの互いに異なるウェルに吐出する。その後、各ウェルに一定量の水を添加して前記標準液体と混合した上で、マイクロプレートリーダを用いて各ウェル中の液体の吸光度を測定する。そして、該吸光度の測定値を、予め作成しておいた検量線に当てはめることによって、各ウェル内の液体における前記色素の濃度を求め、該濃度と、前記水の添加量と、前記標準液体中における当該色素の濃度とに基づいて、各チャンネルによる前記標準液体の吐出量を算出する。
高尾明寿,"マイクロピペットの校正と不確かさ評価事例",[online],2018年9月5日,一般財団法人日本品質保証機構,[令和3年11月8日検索],インターネット<URL:https://unit.aist.go.jp/riem/ds-rg/uncertainty/download_file/2018_JAIMA01_06.pdf> "Agilent Bravo Automated Liquid Handling Platform: 96-Channel 250 μL Tip Accuracy and Precision Technical Overview",2010年6月24日,米国,Agilent Technologies, Inc.,[令和4年1月12日検索],インターネット<URL:https://www.agilent.com/cs/library/technicaloverviews/public/5990-3650en_lo%20CMS.pdf>
　上記従来の方法による吐出量の測定では、標準物質として水を使用するのが一般的である。しかし、その場合、水とは特性が大きく異なる液体の分注においては、上記方法で確認した分注の正確性が保証されない場合がある。例えば、アセトニトリル又はアセトンなどの揮発性の高い液体を分注器で分注する場合、該液体を吸引した後に該液体から生じた蒸気によって、分注器の内圧が変化することにより分注量が変化する場合がある。そのため、水を標準物質とする測定によって十分な正確性で分注ができることが確認された分注器であっても、揮発性液体を同様の正確性で分注できるとは限らない。そのため、こうした揮発性液体を正確に分注するためには、分注しようとする液体と同様の特性の液体を用いて吐出量の測定を行う必要がある。しかし、重量法では、揮発性液体の揮発によって電子天秤の測定値が変動するため、分注器によって吐出された該揮発性液体の質量を正しく量ることが困難である。また、上記のような吸光度測定を利用する方法においても、色素を添加した揮発性液体をウェルに吐出してから各ウェルに水を添加するまでの間における該揮発性液体の揮発度合いによって、算出される吐出量の値が変動する。特に、サブマイクロリットル～マイクロリットルオーダの微量分注においては、こうした揮発による測定値の誤差が顕著となる。
　本発明は上記の点に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、分注器による揮発性液体の分注量を正確に測定できるようにすることである。
　上記課題を解決するためになされた本発明に係る分注器の吐出量測定方法は、
　揮発性液体に色素を溶解することによって、前記色素を予め定められた濃度で含有する色素入り揮発性液体を調製し、
　分注器によって前記色素入り揮発性液体を吸引して測定用容器内に吐出し、
　前記測定用容器内に吐出された前記色素入り揮発性液体の乾燥を行い、
　前記乾燥後に、該測定用容器に予め定められた量の、前記揮発性液体よりも揮発性の低い低揮発性液体を添加して前記色素を溶解させることで評価用液体を調製し、
　前記評価用液体に対して光学測定を行い、
　該光学測定による前記評価用液体の測定値と、前記低揮発性液体の添加量と、前記色素入り揮発性液体における前記色素の濃度とに基づいて、前記測定用容器に吐出された前記色素入り揮発性液体の体積である吐出量を求めるものである。
　上記本発明に係る分注器の吐出量測定方法によれば、分注器による揮発性液体の分注量を正確に測定することが可能となる。
本発明の一実施形態に係る分注器のキャリブレーション方法の実行手順を示すフローチャート。 本発明の一実施例における第１の検量線を示すグラフ。 本発明の一実施例における第２の検量線を示すグラフ。
　以下、本発明を実施するための形態について図面を参照しつつ説明する。図１は、本実施形態に係る分注器のキャリブレーション方法の実行手順を示すフローチャートである。本実施形態に係るキャリブレーション方法では、揮発性液体をマイクロピペットによって予め定められた設定容量で吸引及び吐出し、そのときの吐出量を測定すると共に、該吐出量と前記設定容量とを比較することによって、該マイクロピペットによる吐出量の正確性を評価する。更に、必要に応じて、十分な正確性で前記揮発性液体の分注が行えるように、前記マイクロピペットの調整を行う。
　本発明における揮発性液体とは、１気圧における沸点が５０～９５℃の範囲内であり、常温（２０℃±１５℃）で液体の状態である物質、又はそのような物質を１０％以上含む液体のことを意味する。１気圧における沸点が５０～９５℃の範囲内であり、常温（２０℃±１５℃）で液体の状態である物質としては、例えば、アセトニトリル、メタノール、エタノール、アセトン、トルエン、イソプロパノール、ヘキサン、ブタノール、シクロヘキサン、エチレングリコール、ベンゼン、クロロホルム、アセトアルデヒド、トリエチルアミン、フェノール、ナフタレン、ホルムアルデヒド、テトラヒドロフラン、又は酢酸エチルが挙げられる。
　本実施形態に係る方法では、まず、揮発性液体に色素を添加して溶解することによって、該色素を予め定められた濃度で含有する液体を調製する（ステップ１１）。以下、この液体を「色素入り揮発性液体」とよぶ。前記色素としては、例えば、タートラジン又はクマシーブリリアントブルー（Coomassie Brilliant Blue；ＣＢＢ）等が挙げられるが、本発明における色素はこれに限定されるものではない。なお、前記色素としては、吐出量の測定に用いる揮発性液体と粘性が近いものを用いることが望ましく、具体的には粘度が前記揮発性液体の±３０％（望ましくは±１５％）であるものを用いることが望ましいが、これに限定されるものではない。
　評価対象とするマイクロピペットを用いて、前記色素入り揮発性液体を予め定められた設定容量で吸引して測定用容器内に吐出する（ステップ１２）。測定用容器としては、例えば、分光測定用のキュベット、又はマイクロタイタープレートなどを用いることができるが、光学測定に使用可能な容器であれば、いかなるものを用いてもよい。
　続いて、前記測定用容器内に吐出された前記色素入り揮発性液体を完全に乾燥させる（ステップ１３）。乾燥方法は特に限定されるものではないが、加熱によって色素が昇華する可能性を排除するため、自然乾燥を行うことが望ましい。
　次に、前記測定用容器に予め定められた量の水を添加し、前記色素を当該水に溶解させる（ステップ１４）。これにより得られる色素の水溶液を、以下、「評価用液体」とよぶ。
　前記測定用容器を分光光度計にセットし、前記色素の吸収波長における前記評価用液体の吸光度を測定する（ステップ１５）。なお、測定用容器としてマイクロタイタープレートを用いた場合には、前記分光光度計としてマイクロプレートリーダを使用する。
　また、前記評価用液体に含まれる色素と同じ色素を各々異なる濃度で含む水溶液である複数の検量線作成用液体を調製し（ステップ２１）、各検量線作成用液体についても同様にして吸光度を測定する（ステップ２２）。なお、上述のステップ１５において、前記評価用液体と共に前記複数の検量線作成用液体を分光光度計にセットし、該評価用液体の吸光度測定と前記複数の検量線作成用液体の吸光度測定を連続的に行うようにしてもよい。
　そして、前記複数の検量線作成用液体の測定結果に基づいて、前記色素の濃度と吸光度との関係を示す検量線を作成し、更に、前記色素入り揮発性液体における前記色素の濃度と、ステップ１４における水の添加量とに基づいて、前記検量線における前記色素の濃度を、前記色素入り揮発性液体の体積（すなわちマイクロピペットによる該色素入り揮発性液体の吐出量の理論値）に換算する。これにより、吸光度と吐出量（理論値）との関係を示す検量線が得られる（ステップ２３）。
　続いて、ステップ１５で測定された前記評価用液体の吸光度を、ステップ２３で作成された検量線に当てはめることによって、前記マイクロピペットによる前記色素入り揮発性液体の吐出量を特定する（ステップ１６）。
　なお、ここでは、ステップ２３において吸光度と色素の濃度との関係を示す検量線を作成すると共に、該検量線を、吸光度と吐出量との関係を示す検量線に変換するものとしたが、これに限らず、ステップ２３では、吸光度と色素の濃度との関係を示す検量線のみを作成するようにしてもよい。この場合、ステップ１６では、該検量線とステップ１５で測定された評価用液体の吸光度とに基づいて該評価用液体中における前記色素の濃度を特定し、その値と、前記色素入り揮発性液体における該色素の濃度、及びステップ１４における水の添加量に基づいて、前記色素入り揮発性液体の吐出量を算出する。
　このように、本実施形態に係る方法においては、分注器によって吐出された色素入り揮発性液体を乾燥させる工程を含むことにより、揮発性液体の揮発度合いによる測定値の変動をなくすことができる。そのため、本実施形態に係る方法によれば、微量の揮発性液体であっても、その吐出量を常に正確に測定することができる。
　続いて、ステップ１２におけるマイクロピペットの設定容量と、ステップ１６で求められた吐出量とを比較し、両者の差が予め定めた閾値以上であるか否かを判断する（ステップ１７）。そして、両者の差が該閾値よりも小さい場合（すなわちステップ１７でＮｏの場合）には、そのまま一連の操作を終了する。
　一方、両者の差が予め定められた閾値以上であった場合（すなわちステップ１７でＹｅｓの場合）には、前記差が小さくなるように、マイクロピペットを調製する（ステップ１８）。具体的には、マイクロピペットに設けられた調整用のダイアル等を微調整しつつ、ステップ１２～ステップ１８を繰り返し実行し、ステップ１７でＮｏになった時点で、一連の操作を終了する。
　以上、本発明を実施するための形態について説明を行ったが、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨の範囲で適宜変更が許容される。
　例えば、上記実施形態では、マイクロピペットの吐出量を測定するものとしたが、これに代えて、その他の分注器、例えば、自動分注装置による吐出量の測定を行うものとしてもよい。また、分注器には、シリンダと、該シリンダ内で動作するピストンと、シリンダの先端に設けられたチップ取付部とを１セットのみ備えたシングルチャンネル型のものと、前記シリンダ、ピストン、及びチップ取付部を複数セット備えたマルチチャンネル型のものがあるが、本発明は、そのいずれにも適用することができる。更に、分注器には、ピストンがユーザによって操作される手動式のもの及びモータで駆動される自動式のもの、ピストンと液体の間に一定量の空気が存在する空気置換方式のもの及びピストンが直接液体に接触する強制置換方式のもの、並びに分注量（設定容量）が一定である容量固定式のもの及び分注量が変更可能な容量可変式のもの、といった様々なタイプのものがあるが、本発明に係る吐出量測定方法及びキャリブレーション方法は、そのいずれにも適用することができる。なお、本発明に係るキャリブレーション方法を、自動式の分注器に適用する場合、ステップ１８では、該分注器又は該分注器を制御するためのコンピュータに記憶されている、設定容量とモータの駆動量との関係を変更することによって、該分注器の調整を行うものとする。
　また、上記実施形態では、ステップ１５において評価用液体の吸光度を測定するものとしたが、本発明における「光学測定」は、吸光度測定に限定されるものではなく、蛍光測定、又は透過率測定など、いかなるものであってもよい。なお、光学測定として蛍光測定を行う場合、前記色素としては蛍光を発する色素を使用する。また、この場合、上記実施形態におけるステップ１５～１６及びステップ２２～２３の説明においては、「吸光度」を「蛍光強度」に読み替えるものとする。
　また、上記実施形態では、本発明における低揮発性液体として水を用いる（すなわち、ステップ１４で評価用容器に水を添加して色素を溶解させる）ものとしたが、水に代えて、その他の低揮発性液体を用いるようにしてもよい。本発明における低揮発性液体とは、１気圧における沸点が９５℃よりも高く、常温（２０℃±１５℃）で液体の状態である物質のことを意味する。そのような低揮発性液体としては、水のほか、例えば、ジメチルスルホキシド、グリセリン、又はフェノール等が挙げられる。
　本発明に係る吐出量測定方法を用いてマルチチャンネル型自動分注装置の各チャンネル（48チャンネル）における吐出量を測定した。
　１．色素入り揮発性液体の調製
　水25mLに色素としてタートラジン0.5gを添加して溶解することにより、20 g/Lのタートラジン水溶液を調製し、更に、該タートラジン水溶液とアセトニトリルとを3：7の割合で混合した。これにより得られた混合液（タートラジン濃度：6000 mg/L）を、以下「色素入り揮発性液体」とよぶ。
　２．検量線作成用液体の調製
　20 g/Lのタートラジン水溶液と水とを3：7の割合で混合することにより、6 g/Lのタートラジン水溶液を調製した。更に、該タートラジン水溶液を水で30倍～360倍に希釈することにより、タートラジン（以下「色素」とよぶ）の濃度が異なる6種類の水溶液を調製した。これら6種類の水溶液を、以下、「検量線作成用液体」とよぶ。
　３．吸光度測定及び吐出量の算出
　（1）マルチチャンネル型の自動分注装置を使用し、色素入り揮発性液体を各チャンネルから吸光度測定用マイクロタイタープレートの各ウェルに同時分注し、その後、乾燥させた。
　（2）乾燥後の前記各ウェルに水を100μL添加して、シェイカーで撹拌した。これにより得られた色素の水溶液を、以下「評価用液体」とよぶ。
　（3）各検量線作成用液体を、前記評価用液体が入っているウェルとは別のウェルに100μLずつ、各2ウェルに分注した。
　（4）更に別の2つのウェルに、ブランクとして水を100μLずつ分注した。
　（5）前記マイクロタイタープレートをマイクロプレートリーダにセットして、前記色素の吸収波長（426nm）における吸光度を測定した。
　（6）前記吸光度測定により得られた各ウェルについての測定値（吸光度）から、ブランクの測定値の平均値を差し引いた。
　（7）各検量線作成用液体における色素濃度（mg/L）と、前記 (6) で得られた値とに基づいて、最小二乗法により、吸光度と色素濃度の関係を示す検量線（図２）を作成した。
　（8）以下の式により、前記色素濃度（mg/L）を理論吐出量（μL）に変換することによって、前記検量線を、吸光度と理論吐出量の関係を示す検量線（図３）に変換した。
　理論吐出量（μL）＝{色素濃度（mg/L）×ウェル中の液量（100μL）}／色素入り揮発性液体における色素濃度（6000 mg/L）
　（9）前記吸光度測定における評価用液体の測定値（吸光度）から、前記 (8)の検量線を用いて各チャンネルによる色素入り揮発性液体の理論吐出量を算出した。
　上述の各検量線作成用液体についての測定値（吸光度Ｎ１及びＮ２）と、該測定値に基づいて作成した検量線（図２）から計算した逆回帰値及び真度を表１に示す。
　前記マイクロタイタープレートの各ウェルにおける評価用液体の吸光度の測定値を表２に示す（表中の「Ch番号」は、各ウェルに色素入り揮発性液体を吐出した自動分注装置のチャンネルの番号を示している）。
　表２における各吸光度の測定値を、図３の検量線を用いて理論分注量に変換した結果を表３に示す。この表の各セル中の数値が、前記自動分注装置の各チャンネルによる前記色素入り揮発性液体の理論吐出量（すなわち本発明に係る方法で測定された吐出量）に相当する。
［態様］
　上述した複数の例示的な実施形態は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。
（第１項）本発明の一態様に係る分注器の吐出量測定方法は、
　揮発性液体に色素を溶解することによって、前記色素を予め定められた濃度で含有する色素入り揮発性液体を調製し、
　分注器によって前記色素入り揮発性液体を吸引して測定用容器内に吐出し、
　前記測定用容器内に吐出された前記色素入り揮発性液体の乾燥を行い、
　前記乾燥後に、該測定用容器に予め定められた量の、前記揮発性液体よりも揮発性の低い低揮発性液体を添加して前記色素を溶解させることで評価用液体を調製し、
　前記評価用液体に対して光学測定を行い、
　該光学測定による前記評価用液体の測定値と、前記低揮発性液体の添加量と、前記色素入り揮発性液体における前記色素の濃度とに基づいて、前記測定用容器に吐出された前記色素入り揮発性液体の体積である吐出量を求めるものである。
（第２項）第１項に記載の分注器の吐出量測定方法は、
　前記色素を各々異なる濃度で前記低揮発性液体に溶解して成る複数の検量線作成用液体を調製し、
　前記複数の検量線作成用液体の各々に対して前記光学測定を行い、
　前記光学測定による前記複数の検量線作成用液体の測定結果に基づいて検量線を作成し、
　該検量線を用いて、前記評価用液体の前記光学測定における測定値から前記吐出量を求めるものであってもよい。
　第１項又は第２項に記載の分注器の吐出量測定方法によれば、揮発性液体の揮発による影響を受けることなく常に正確な吐出量の測定を行うことができる。
（第３項）第１項又は第２項に記載の分注器の吐出量測定方法は、
　前記分注器が、マルチチャンネル型の分注器であってもよい。
　第３項に記載の分注器の吐出量測定方法によれば、マルチチャンネル型分注器の各チャンネルについて一度に吐出量の測定を行うことができるため、吐出量測定に掛かる手間と時間を低減することができる。
（第４項）本発明の一態様に係る分注器のキャリブレーション方法は、
　揮発性液体に色素を溶解することによって、前記色素を予め定められた濃度で含有する色素入り揮発性液体を調製し、
　分注器によって前記色素入り揮発性液体を予め定められた設定容量で吸引して測定用容器内に吐出し、
　前記測定用容器内に吐出された前記色素入り揮発性液体の乾燥を行い、
　前記乾燥後に、該測定用容器に予め定められた量の、前記揮発性液体よりも揮発性の低い低揮発性液体を添加して前記色素を溶解させることで評価用液体を調製し、
　前記評価用液体に対して光学測定を行い、
　該光学測定による前記評価用液体の測定値と、前記低揮発性液体の添加量と、前記色素入り揮発性液体における前記色素の濃度とに基づいて、前記測定用容器に吐出された前記色素入り揮発性液体の体積である吐出量を求め、
　算出された該吐出量と、前記設定容量との差を特定し、
　当該差が小さくなるように前記分注器を調整するものである。
　第４項に記載の分注器のキャリブレーション方法によれば、揮発性液体の揮発による影響を受けることなく、常に正確なキャリブレーションを行うことができる。

Claims (4)

  1. 　揮発性液体に色素を溶解することによって、前記色素を予め定められた濃度で含有する色素入り揮発性液体を調製し、
    　分注器によって前記色素入り揮発性液体を吸引して測定用容器内に吐出し、
    　前記測定用容器内に吐出された前記色素入り揮発性液体の乾燥を行い、
    　前記乾燥後に、該測定用容器に予め定められた量の、前記揮発性液体よりも揮発性の低い低揮発性液体を添加して前記色素を溶解させることで評価用液体を調製し、
    　前記評価用液体に対して光学測定を行い、
    　該光学測定による前記評価用液体の測定値と、前記低揮発性液体の添加量と、前記色素入り揮発性液体における前記色素の濃度とに基づいて、前記測定用容器に吐出された前記色素入り揮発性液体の体積である吐出量を求める、
    　分注器の吐出量測定方法。
  2. 　前記色素を各々異なる濃度で前記低揮発性液体に溶解して成る複数の検量線作成用液体を調製し、
    　前記複数の検量線作成用液体の各々に対して前記光学測定を行い、
    　前記光学測定による前記複数の検量線作成用液体の測定結果に基づいて検量線を作成し、
    　該検量線を用いて、前記評価用液体の前記光学測定における測定値から前記吐出量を求める、
    　請求項１に記載の分注器の吐出量測定方法。
  3. 　前記分注器が、マルチチャンネル型の分注器である請求項１に記載の分注器の吐出量測定方法。
  4. 　揮発性液体に色素を溶解することによって、前記色素を予め定められた濃度で含有する色素入り揮発性液体を調製し、
    　分注器によって前記色素入り揮発性液体を予め定められた設定容量で吸引して測定用容器内に吐出し、
    　前記測定用容器内に吐出された前記色素入り揮発性液体の乾燥を行い、
    　前記乾燥後に、該測定用容器に予め定められた量の、前記揮発性液体よりも揮発性の低い低揮発性液体を添加して前記色素を溶解させることで評価用液体を調製し、
    　前記評価用液体に対して光学測定を行い、
    　該光学測定による前記評価用液体の測定値と、前記低揮発性液体の添加量と、前記色素入り揮発性液体における前記色素の濃度とに基づいて、前記測定用容器に吐出された前記色素入り揮発性液体の体積である吐出量を求め、
    　算出された該吐出量と、前記設定容量との差を特定し、
    　当該差が小さくなるように前記分注器を調整する、
    　分注器のキャリブレーション方法。
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