JP5635971B2 - 多数の吸光度スペクトル特性を有する溶液を用いた液体供給量評価のためのシステム及び方法 - Google Patents

Description

本発明は、液体供給の体積を判定するためのシステムに関する。より詳細には、本発明は、関心のある体積範囲、又は希釈度範囲をカバーするために、１つ又は複数の染料を用いた多数の異なる検出可能な吸光度スペクトル特性を有するサンプル溶液を用いる、液体供給装置を試験又は較正するためのシステム及び関連する方法に関する。

液体供給装置を試験又は較正するための現在製造されているすべての比色分析システム（たとえば、共に本発明及び出願の譲受人であるメイン州ウエストブルックのＡｒｔｅｌ，Ｉｎｃ．によって提供されるＰＣＳ（登録商標）システム及びＭＶＳ（登録商標）システム、並びにニューヨーク州マウントキスコのＶｉｓｔａＬａｂによって提供されるＰｉｐｅｔｔｅ Ｖｏｌｕｍｅ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）は、広い範囲の供給可能な溶液量を試験するために、非常に多数のサンプル溶液を用いる。サンプル溶液は、試験中の装置によって測定容器内の希釈剤に供給され、混合物の吸光度が測定される前に溶液が混合される。少ない液体供給量を試験するには濃縮されたサンプル溶液が用いられ、大きな液体供給量を試験するにはより薄いサンプル溶液が用いられる。本明細書で用いられる「容器」とは、容器が封止されているかどうかに関わらず、任意の小瓶、セル、瓶、マイクロタイタープレート、又はその中に流体を保持するための任意のタイプの入れ物である。また容器は、水平ビーム分光光度計（カリフォルニア州パロアルトのＶａｒｉａｎ，Ｉｎｃ．のＣａｒｙ ５０００のような通常のＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計など）、又は垂直ビーム分光光度計（バーモント州ウィヌースキのＢｉｏＴｅｋ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓのＥＬｘ８００のようなマイクロタイタープレートリーダなど）を用いることによる吸光度測定値を収集するように設計することができる。

簡単に言えば、ＰＣＳ（登録商標）システムは、１つ又は複数の装置と、単一流路液体分注装置を較正するために用いられる１つ又は複数の溶液とを含む。一方、ＭＶＳ（登録商標）システムは、１つ又は複数の装置と、複数流路液体分注装置を較正するために用いられる１つ又は複数の溶液とを含む。２つのシステムの違いは、溶液（１つ又は複数）のスペクトルに存在する特性に対応する１つ又は複数の波長での吸光度測定を実施した後に行われる計算に関する。

Ａｒｔｅｌ ＰＣＳ（登録商標）システムの一商用形態の場合は、たとえば、２マイクロリットル（μｌ）から５０００μｌまでの体積範囲をカバーするために、それぞれが同じスペクトル特性を目標とする、４つの異なる濃度のサンプル溶液が用意される。同じサンプル溶液の２つの追加の濃度により、０．１μｌの低い範囲まで拡大される。異なる濃度を用いる理由は、測定可能な信号レベル（サンプル溶液又は希釈剤のアリコートの供給の結果生じる吸光度変化）を、液体供給量の全範囲にわたって規定された信号範囲内に維持するためである。すなわちサンプル溶液の各濃度は、そのために溶液が設計された体積範囲内の任意の供給された量に対して、規定された吸光度範囲内の最終の測定可能な吸光度を生じるように製造される。ＰＣＳ（登録商標）システムのサンプル溶液のすべての濃度は、同じ吸光度範囲にわたる測定可能な吸光度値を生じるように設計される。多数の溶液を用いることの欠点は、ユーザがそれらを在庫し、溶液が使用期限内であることを確実にするために在庫を回転させ、次いでどれを用いるかを選び、供給装置が正しい溶液をそれから吸引できる１つ又は複数の容器に、正しい溶液（１つ又は複数）を分注する必要があることである。多くの間違いの機会、容器からの未使用溶液の無駄、時間の無駄、及び供給装置を試験する仕事からの不必要な注意散漫が存在する。したがって液体供給装置によって供給できる全体積範囲を試験するのに必要な、サンプル溶液の数を低減し得る方法を考案することが望ましい。

体積供給試験に加えて、多数の濃度の同じサンプル溶液を用いた比色分析測定システムは、ライフサイエンス試験室にて一般に使用される希釈プロトコルを試験するために用いることができる。このような希釈プロトコルはしばしば創薬試験において使用され、そこでは関心のある化合物がマイクロタイタープレートにわたって順次希釈される。たとえばユーザは、２００μｌのサンプル溶液をマイクロタイタープレートの第１の列に分注し、次いで第１の列から１００μｌを吸引し、それを第２の列の１００μｌの希釈剤に分注して、それにより第２の列内に１：２の希釈率のサンプル溶液を生じる。プレート内のすべての列にわたってこのプロセスを順次繰り返すことにより、１：１の比率から１：２０４８の比率までの範囲の希釈を生じる。効果的な希釈プロトコルシステムは、本出願の譲受人を譲受人とする２００７年９月１３日に出願された係属中の米国特許出願第１１／８５４，５９４号に記載されている。参照する第１１／８５４，５９４号の係属中の出願の全内容を、参照により本明細書に組み込む。ＭＶＳ（登録商標）システムが、この例で行われた希釈を試験するために用いられた場合は、サンプル溶液の単一のスペクトル特性の吸光度信号がマイクロタイタープレートリーダによって測定するには低くなり過ぎるまでに、各サンプル溶液は４倍から５倍の希釈率の範囲しか試験できないので、希釈率の全範囲をカバーするには５つのサンプル溶液が必要となる。したがってこのプロセスのすべての希釈ステップを測定するには、各サンプル溶液を用いて限られた範囲の希釈率の系列が試験されるように、５つのサンプル溶液のそれぞれに対して順次希釈プロトコルを繰り返さなければならない。すなわち、５つのサンプル溶液のそれぞれは、規定されたプロトコルを用いて順次希釈される。サンプル溶液のそれぞれに対して、生成された希釈の一部分だけが測定可能な吸光度範囲内となるが、すべてのサンプル溶液からのデータの組み合わせが全プロセスのあらゆるステップに対して測定値をもたらすことになる。その結果として、関心のある全希釈度範囲をカバーするために多くの試験容器がサンプル溶液で満たされるが、一部分だけが実際に用いられる。したがって溶液及び時間の無駄がある。

順次希釈プロトコルを試験するための代替の方法は、蛍光を含み、これは信号が測定するには低くなり過ぎるまでに、ずっと大きな範囲（１，０００〜１０，０００倍大きな範囲）の希釈率をカバーする。しかし蛍光法は、光退色、消光などによる蛍光染料の不安定性による変動性を生じ、また吸光度をベースとする測光手法の国際標準に対するトレーサビリティがない。したがってまた、ここで述べたような希釈処理の蛍光試験の代替として、それぞれが一意の４倍又は５倍の希釈率の範囲を試験することができる、多数のスペクトル特性を含む１つのサンプル溶液を用いて、拡大された範囲の希釈率を測定し得る吸光度をベースとする測光方法を考案することが望まれる。

較正精度を向上するための他のシステムが述べられている。たとえば、参照により本明細書に組み込まれるＣｕｒｔｉｓらの「Ｐｉｐｅｔｔｅ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ」に対する米国特許第５，２９８，９７８号、参照により本明細書に組み込まれるＧｒｅｅｎｆｉｅｌｄの「Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｎｇ Ｐｉｐｅｔｔｅｓ」に対する米国特許第４，３５４，３７６号、並びにＣｕｒｔｉｓの「Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｑｕｉｄ Ｖｏｌｕｍｅｓ」に対する米国特許第６，７４１，３６５号及び第７，１８７，４５５号を参照されたい。これらのシステムは、より小さな１組のサンプル溶液内に多数の異なる検出可能な吸光度スペクトル特性を生じることが可能であり、それぞれの異なる検出可能な吸光度スペクトル特性が特定の体積範囲にわたって較正又は試験を可能にする染料又は複数の染料の本発明における使用によって解決される制約を有する。染料は、溶液の吸光度スペクトルに１つ又は複数の特性を与える任意の分子又は化合物でよい。この定義は、特性をスペクトルの可視領域に限定するものではなく、スペクトル特性を染料又は複数の染料のみに限定するものでもない。溶媒も、本発明で述べられるように用いることができるスペクトル特性を与え得る。当業者なら、染料は機能的に発色団と等価とし得ることが理解されよう。本明細書で用いられる「異なる検出可能な吸光度スペクトル特性」とは、試験用の溶液の吸光度スペクトルにおける、互いに異なり、検出可能なピーク、谷、平坦域、又はピーク及び谷及び平坦域の任意の組み合わせである。Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄの米国特許第４，３５４，３７６号の場合は、１つの異なる検出可能な吸光度スペクトル特性しかない。Ｃｕｒｔｉｓらの米国特許第５，２９８，９７８号の場合は、容器寸法の不確かさによる結果の不確かさを最小にするように、サンプル溶液が容器に加えられる前に、容器を通る光の経路長を決定する目的のためだけに、希釈剤のスペクトルに存在する第２の特性がある。この第２のスペクトル特性は、試験用の液体供給装置によって分注されるサンプル溶液には含まれない。Ｃｕｒｔｉｓへの米国特許第６，７４１，３６５号及び第７，１８７，４５５号の場合は、測定容器として用いられるマイクロタイタープレートの先細りのくぼみに加えられた希釈剤の体積の不確かさによって生じ得る結果の不確かさを除去するために、２つのスペクトル特性が用いられる。両方のスペクトル特性は、サンプル溶液に含まれるが、第２のスペクトル特性（この特定の場合は、ＣｕＣｌ_２）の機能は、希釈剤の未知の体積に対して補正することであり、広い範囲の分注量をカバーすることではない。

米国特許出願第１１／８５４，５９４号 米国特許第５，２９８，９７８号 米国特許第４，３５４，３７６号 米国特許第６，７４１，３６５号 米国特許第７，１８７，４５５号

必要とされるのは、液体供給装置又はプロトコルを評価するための比色分析手法の使用が、関心のある体積及び希釈度範囲に対して過大な数のサンプル溶液の使用を必要とする、既存の液体供給測定システムの制約を解決するためのシステム及び関連する方法である。

本発明の目的は、液体供給装置の試験又は較正を簡単にすることによって、上記の制約を解決することである。この大きな簡略化により、コストは低減し、ユーザがより効率的に作業を行うことを可能にし、間違いの可能性を低減する。本発明は、この大きな簡略化を、大きな範囲の体積、又は大きな範囲の希釈度を試験するのに必要な異なるサンプル溶液の数を、通常の４つから最小数に、理想的には１つに減らすことによって達成する。本発明は、国際標準化機構（ＩＳＯ）標準８６５５パート７に適合するように設計され、さらに国際標準に対してトレーサブルな結果を生じるように設計され、それにより蛍光技術より有利となる。最後に、本発明は、サンプル溶液のスペクトル特性の数を増加することにより、試験可能な希釈度範囲又はサンプル溶液の体積範囲を拡大するように設計される。具体的には、拡大された試験可能な体積範囲は、最適には、単一のサンプル溶液の使用が、約２μｌから約５０００μｌの体積範囲にて最も一般的に試験され又は較正されるピペット（又は他の関連する供給装置）をカバーすることを可能にする。同様に、最適には１：１から１：２５００までの範囲に対して単一のサンプル溶液を用いて、拡大された範囲の希釈度を試験することができる。所望の体積又は希釈度範囲に対して単一のサンプル溶液が使えない場合は、本発明はそれでもなお、これまで必要であったよりも少ないサンプル溶液のセットの使用を可能にする。

本発明は、組み合わせて又は個々に、多数の異なる検出可能な吸光度スペクトル特性を示す１つ又は複数の染料又は他の吸光化合物又は化学物質を含む溶液を用い、各溶液は関心のある広い体積範囲又は希釈度範囲にわたって較正又は試験することができる、改良された液体供給量評価のためのシステム及び関連する方法である。システムは、多数の波長にて吸光度を測定することができる測光機器と、性能が試験又は較正される液体供給システムを用いて分注される１つ又は複数のサンプル溶液を含む１つ又は複数の試薬と、オプションとして希釈剤溶液で予め満たされた容器とを含む。サンプル溶液は、関心のある体積範囲内の任意の量が容器に分注されたときに、測光機器のダイナミックレンジ内の波長及び吸光度レベルにて異なる検出可能な吸光度スペクトル特性が存在するように選択された少なくとも１つの染料を含む。多数の染料を含む溶液では、たとえば、異なる染料の濃度は、液体供給装置によって供給された比較的大きな量は、単位経路長当たりの吸光度が低い溶液のスペクトル特性を用いて較正され、一方、比較的少ない量の供給は、同じサンプル溶液であるが単位経路長当たりの吸光度が高い異なるスペクトル特性を用いて較正されるように選択される。

多数の異なる検出可能な吸光度スペクトル特性による、拡大された体積範囲又は拡大された希釈度範囲にわたる較正又は試験に適した最小数のサンプル溶液の使用は、ユーザの間違いの確率が低く、利便性が高い、より簡単なユーザプロトコルをもたらす。これは、様々なピペットサイズによって一般に供給される広範な体積又は希釈度範囲をカバーするために４つの異なる濃度のサンプル溶液が用いられる、先に参照したシステムの少なくとも１つに関して述べた問題を解決する。これはまた、１：１から１：２０４８までの広範な希釈度範囲をカバーするために、かなりの数の異なる濃度のサンプル溶液を用いなければならない、ＭＶＳ（登録商標）システムに対して述べた問題を解決する。

上記のように、多数の異なる検出可能な吸光度スペクトル特性をもたらす１つ又は複数の染料を最小数のサンプル溶液に加える目的は、システムの運用を簡単にすることである。具体的には、操作者は、少ない数の溶液が供給量又は希釈率の全範囲に役立つので、関心のある各供給量範囲又は希釈度範囲に対して、対応する溶液中の染料の濃度を選択する必要はない。システムは垂直ビーム光度計又は水平ビーム光度計のいずれも用いることができ、固定又は取り外し可能測定容器のいずれも用いることができる。希釈剤は、染料を含んでも含まなくてもよい。システムは、一時に単一の供給量、又は複数流路供給装置の場合のように同時に多数の供給量を試験又は較正するように構成することができる。

本発明の上記その他の目的及び利点は、以下の詳細な説明、添付の図面及び添付の特許請求の範囲に鑑みて、より容易に理解されるであろう。

分光光度計及び計算システムを含む、本発明の方法を実行するために用いることができる１組の装置の実施例の簡略図である。 本発明のサンプル溶液を用いて較正される分注装置の簡略図である。 染料タートラジンの場合の吸光度スペクトルのグラフである。 異なる濃度の４つの染料を含んだ実例の単一溶液の全吸光度範囲にわたる理想的な吸光度スペクトルのグラフである。 ２つの染料を含んだ実例の単一溶液の全吸光度範囲にわたる実際の吸光度スペクトルのグラフである。 特定の限られた吸光度範囲にわたる、４つの異なる濃度での図５の実例の単一溶液の実際の吸光度スペクトルのグラフである。

本発明の方法のステップを実施するために適したシステムに関連する１組の装置の実施例は、図１に示される。図１に示された装置の意図した機能から逸脱せずに同じ機能を行う他の装置を使用し得ることが理解されるべきであり、図１では体積判定装置１０は、主要構成要素として液体ホルダ２０、分光光度計３０、及びコンピュータ実行可能なソフトウェア及び／又はファームウェアを通じて規定される計算を実行することができる計算システム４０を含み、このソフトウェア又はファームウェアは、計算システム４０又は代替として図２に示されるタイプなどの液体ディスペンサに関連付けることができる。計算システム４０及び関連するプログラムは、たとえば分光光度計３０を含むシステムの他の装置内にあってもよいことを理解されたい。さらに本明細書で述べられる実例の装置の任意の１つ又は複数は、本発明の主要な態様から逸脱せずに単一の装置に統合することができる。

液体ホルダ２０は、分析されるべき液体２１を保持するために用いることができる容器である。液体ホルダ２０は、分光光度計３０内に置くことができる。分光光度計３０には、液体ホルダ２０内の液体２１の吸光度測定を開始するように命令することができる。これらの命令は、分光光度計３０の１つ又は複数の入力装置を通じて、又は計算システム４０を通じて実行することができる。計算システム４０は、分光光度計３０を制御し且つ／又は吸光度測定に基づいて体積判定の計算を行うために用いることができる、キーボード４１、マウス４２、又はそれらの組み合わせなどの１つ又は複数の入力装置を含む。コンピュータプロセッサ４３及び記憶装置を含む計算システム４０は、体積判定のための実行可能なシステム命令を実行するように構成される。入力情報及び出力情報は、コンピュータディスプレイ４４上で見ることができる。オプションとして、入力情報及び／又は出力情報をプリントアウトするために、ローカル又はリモートプリンタ４５を用いることができ、又は情報は単にディスプレイ４４上で観察することができる。

図２に示されるような液体ディスペンサ１００は、液体ホルダ２０内へ諸量の液体を吸引し、分注するために用いることができる。液体ディスペンサは、流路部材１１０、及び液体保持先端部２００又は単に先端部２００を含む。液体ディスペンサ１００は、当業者によって用いられる任意の液体保持装置でよい。したがって液体ディスペンサ１００は、１つの流路部材１１０を含むことができ、又は複数の流路部材１１０を有することもでき、含まれる流路部材１１０の数に関わらず各流路部材１１０は、それ自体の先端部２００をもち得ることを理解されたい。さらに液体ディスペンサ１００は、液体ホルダ２０内へ又はそれから液体２１を分注及び吸引するのに手動又は自動で動作し得る。

システムの一部として用いるのに適した測光機器の一形態は、図１ではデスクトップ分光光度計３０装置として示されるが、代替として液体２１を含んだ液体ホルダ２０などの容器を通して吸光度を測定する小型のハンドヘルド装置でもよい。このような装置はまた、マイクロタイタプレートのくぼみなどの容器を通して吸光度を測定する垂直ビーム分光光度計でもよい。しかしシステム及び関連する方法は、このような特定の測光機器に限定されず、システムの基本機能から逸脱せずに吸光度測定値を取得する固定経路長を有するフローセル、又は光ファイバプローブを含む他のタイプのこのような機器を使用できることを理解されたい。

この説明では全体にわたって、溶液を含むための液体ホルダ２０として表される、１．８センチメートル（ｃｍ）の経路長（内径）を有する特定の容器が説明のために用いられる。しかしこれは単に例であり、本発明は特定の容器サイズ又は経路長に限定されないことを理解されたい。本発明の測光システムは、好ましくは、吸光度が測定できる４つの波長を選択するための４つのフィルタを有する光サブシステムを含む。システムは異なる波長での測定のために、より多くの又はより少ないフィルタを用いることができ、又は他の波長選択の手段を用い得ることを理解されたい。システムは、体積測定が行われるたびにすべての必要な波長にて吸光度を測定するようにプログラムされた測光機器内に実施されたファームウェアを含む。プログラムはソフトウェアでもよく、ハードウェアに埋め込まれてもよいことを理解されたい。これは局部的に測光機器内に、他の装置内に、又は遠隔的に含まれてもよい。

システムはさらに、既知の量の希釈剤、又はユーザが希釈剤を加えるための充填マークを含む既知の経路長（内径）の１つ又は複数の容器、試験用のディスペンサによって分注されることになる１つ又は複数のサンプル溶液の瓶、及び較正溶液を含んだ容器を有するキットを含む。１つ又は複数の容器は、キャップ付でないか、及び／又はキャップ付で封止されていてもよい。

ここで説明する、操作者がキットを有する実例ではシステムの操作者は、試薬のキットから希釈剤を含んだ容器を取り出し、測光機器に挿入し、「ゼロ」キー又は他の開始又は活動化機構を押す。機器は、４つすべての波長での吸光度を読み取り、４つすべての波長での吸光度をゼロに設定する。本発明の最も簡単な実装形態では、希釈剤は染料を含まず、緩衝剤と保存剤のみを含む。

次に操作者は、希釈剤を含んだ容器を機器から取り出し、試験中の供給装置を用いてサンプル溶液のアリコートを容器に分注し、容器に蓋をし、容器を数回反転させることによって内容物を混合し、測光機器に戻す。別法として測光機器は、組み込みの混合手段を有し、この場合は、操作者は容器を測光機器から取り出す必要はない。混合が装置によって行われる場合は、容器は設計の一部として、混合ステップの間に回転又は他の形で動かされるときに、より大きな擾乱を発生することによって混合を補助するための構造体を容器内に含むことができ又は含まなくてもよい。次いで操作者は、「読み出し」キー又は他の、混合に続く光度測定を開始するための開始又は活動化機構を押す。

図示の構成要素を用いた特定の実例では、サンプル溶液は、それぞれが異なる濃度の４つの染料を含む。より具体的には、各染料は、分注された量の特有の範囲に対して適切になるように選択される。機器は、最も低い単位経路長当たりの吸光度を有する特性に対応する波長から始めて、サンプル溶液に対する吸光度値を読み取り、その値が範囲外の場合は、機器は、次に最も低い単位経路長当たりの吸光度を有する特性に対応する波長にて吸光度を測定する。吸光度値の任意の１つ又は複数が測光機器に対して範囲外となる場合があるので、測定は、使用可能な値が得られるまで各波長で行われるべきであることに留意されたい。測定は関心のある任意の波長から開始して、所望の吸光度の読み取りが得られるまで任意のパターンで続けることもできるので、この実例は測定が行われるやり方を限定するものではないことに留意されたい。

オプションとして、本発明のソフトウェア又はファームウェアのプログラムは、最も高い吸光度を有するけれども範囲外ではない波長を自動的に選択するように構成する。吸光度Ａが染料モル吸光係数ε、染料濃度Ｃ、及び経路長ｌの積であることを示すランベルト・ベールの法則
Ａ＝εＣｌ （０．１）
を用いて、プログラムは、本明細書に組み込まれた参考文献の任意の１つ又は複数ですべて述べられているように、選択された波長でのサンプル及び希釈剤溶液の光学特性、容器の寸法、吸光度測定の結果、及び開始時の容器内の希釈剤の体積に基づいて、体積測定結果を計算する。話を簡単にするために、項εとＣは組み合わされて、関心のある波長での単位経路長当たりの吸光度を表す。式に使用される容器の適切な寸法は、用いられる分光光度計のタイプに依存することを理解されたい。水平ビーム測定の場合は、溶液を通る光の経路長に関連する容器寸法は、容器の内径である。垂直ビーム測定の場合は、やはり組み込まれた参考文献の任意の１つ又は複数で述べられているように、光の経路長の決定は、容器内の溶液の高さに依存する。

操作者は、同じ容器への分注操作を何回か繰り返すことができる。回数の上限は、プログラム内で設定することができ、１）容器の最大体積容量、２）機器に対する最大吸光度限界、３）許容し得る結果のために必要な最小吸光度変化、４）プログラムされた制限数、に依存し得る。

操作者が所与の体積の試験を完了した後に、結果は、プリンタ４５、ディスプレイ４４、及び／又は別にリンクされた計算装置に送ることができる。平均体積、標準偏差、及び変動係数が、プリンタ４５、ディスプレイ４４、及び／又は別にリンクされた計算装置に送ることができる情報のタイプに含まれる。

操作者は望むなら、分注に関する上記の制約を条件として、好ましくは最初に少量が分注され、順次大きな量が分注される限り、上記のような容器に同じサンプル溶液を分注して、いくつかの異なる体積にて供給装置を試験することができる。この制限の理由は、少量を正確に測定するためには、正確に測定するのに十分大きな吸光度の変化を得るように、溶液のスペクトル特性は十分高い単位経路長当たりの吸光度をもたなければならないためである。しかし、操作者がすでに大量のサンプル溶液を加えたために吸光度が光度計の範囲外となる場合は、システムはその少ない量の正確な測定値を得ることはできない。先に述べたように、単位経路長当たりの吸光度の項は、染料のモル吸光係数と染料の濃度の積である。この応用例では単位経路長当たりの吸光度は、染料の組み合わせから生じる又は生じないスペクトル特性に関連する。

Ａｒｔｅｌ ＰＣＳ（登録商標）システムでは、サンプル溶液の各濃度は、液体供給量のおよそ４倍又は５倍の範囲をカバーする。したがって、単一の吸光度スペクトル特性を有する単一のサンプル溶液は、体積の４倍又は５倍の範囲にわたる機器の較正のためには十分である。しかし、より大きな体積範囲にわたる較正が望まれる場合は、より大きな範囲をカバーするには２つ以上の溶液が必要になる。たとえば、所与の比較的大きな量に適した比較的薄い濃度の溶液を用いて、大きな範囲の体積が試験される場合は、少ない体積は、正確に測定するには小さ過ぎる吸光度の変化を生じることになり、結果に許容できないほど大きな不確かさを生じる。又は代替として、少量に対して信号を増強するように溶液がより濃縮された場合は、比較的大きな体積は、全体として高過ぎる吸光度を生じることになり、非線形な又は再現性のない結果を生じる。この体積範囲制限の例外は、最も大きな体積を測定するのに用いられる、最も薄い溶液の場合である。この場合は、測定される溶液の体積は非常に大きくなるので、制限は吸光度によって設定される代わりに、溶液を受け取る容器の容量によって設定される。

吸光度又は体積範囲の制約に対処するために、本発明のシステム及び関連する方法によってもたらされる簡略化は、サンプル溶液に多数の異なる検出可能な吸光度スペクトル特性を生じる染料又は複数の染料を用意するものであり、それにより溶液の検出可能な吸光度スペクトル特性の組み合わせが、単一のスペクトル特性を用いて可能となるよりも、より大きな、関心のある体積範囲又は希釈度範囲にわたる較正及び試験を可能にする。比較的大きな量が分注されたときは、システムは、分注された体積を計算するための基準として、低い単位経路長当たりの吸光度を有するスペクトル特性を用いる。少量が分注されたときは、システムは、分注された体積を計算するための基準として、高い単位経路長当たりの吸光度を有するスペクトル特性を用いる。各スペクトル特性が、約４：１又は５：１の体積又は希釈度範囲をカバーでき、吸光度スペクトル内に４つの重ならない、異なるスペクトル特性が存在する場合は、４つすべてのこのようなスペクトル特性を含む１つのサンプル溶液のみを用いて、２μｌから５０００μｌの体積範囲、又は１：１から１：２５００の希釈度範囲を供給装置に対して評価することができる。１つのサンプル溶液に多数のスペクトル特性を組み入れることによって、試験可能な体積範囲は、ＰＣＳ（登録商標）又はＭＶＳ（登録商標）システムによって用いられるサンプル溶液に比べて大幅に拡張される。

吸光度測定を行うためには、わずかな波長の誤差は吸光度値に、対応する小さい誤差を生じるか又は誤差を生じないように、スペクトルがゼロの傾斜を有する波長にて常に測定することが望ましい。ゼロの傾斜は、吸光度スペクトルの最小値又は最大値又は平坦域にて生じる。染料又は複数の染料を用いて本システムを通じて生成された単一のサンプル溶液は、各スペクトル特性での傾斜がゼロとなる、少なくとも４つの異なる検出可能な吸光度スペクトル特性（すなわち、ピーク及び／又は谷及び／又は平坦域の組み合わせ）を有する完全な吸光度スペクトルをもたらす。ピーク又は谷又は平坦域に対する吸光度値は、指定された体積の範囲を測定するのに適した、規定された吸光度範囲内に含まれなければならない。４つの異なる染料の組み合わせが選択された場合は、４つすべてのピーク及び／又は谷及び／又は平坦域での吸光度の大きさに対して完全に制御できる。一方、たまたま適当な大きさを有する２つ以上の異なる検出可能な吸光度スペクトル特性を有する単一の染料を用いることも可能な場合があるが、各特性の大きさの間の関係をユーザが制御することはできない。

例示として、非限定的に、表１は、４つの吸光度ピーク、１．８ｃｍの経路長、１．５光学濃度（ＯＤ）の最大吸光度、及び５０００μｌの希釈剤体積を用いたシステムに基づく設計パラメータを要約したものである。当業者なら、光学濃度（ＯＤ）という用語は、吸光度単位（ＡＵ）又は吸光率（Ｅ）とも呼ばれることが理解されよう。

最も簡単で手ごろ価格の測光機器は、スペクトルの可視及び近赤外領域において測定することができる。ガラスは紫外波長の光を吸収し、シリコン光ダイオードはスペクトルのその部分では感度が低い。ＵＶ波長に対しては特別な光源、通常は重水素放電管が必要であり、システムのコストが高くなる。最も基本的なシステムは、３４０から８００ナノメートル（ｎｍ）の波長範囲内に留まることになる。本開示に示された実例の場合に選択された染料は、この範囲内に主ピークを有するが、拡大された範囲で測定し得る機器と関連して用いられることを条件として、この範囲外のピーク又は谷又は平坦域を有する染料が使用できないという理由はない。

多くの有機染料は、主ピークを１つの波長に有し、染料を組み合わせるときに考慮する必要がある、より小さなピーク及び谷をより短い波長に有する吸光度スペクトルを有する。しばしば吸光度は、主ピークより長い波長にて急激にゼロに減少する。このようなスペクトルの一例は図３の吸光度曲線によって表されるタートラジンの場合のものであり、主ピークは約４２５ｎｍにある。この特性は、最も濃縮された染料が波長範囲の短い端にあるものとなるように選択されるとき、より長い波長に主な吸光度ピークを有して追加される染料のスペクトルと干渉しないので、１つのサンプル溶液中に多数の染料を組み合わせるときに有用である。このようにして、多数の染料を、それらのスペクトルの互いの干渉が比較的小さくなるように組み合わせることができる。

ここでは多数の異なる検出可能な吸光度スペクトル特性を有するサンプル溶液の、一方は４つの染料を用い、他方は２つの染料を用いる、２つの実例について述べる。これらは例示のみであって、多数の異なる検出可能な吸光度スペクトル特性を確立するために、単一のサンプル溶液内に１つ又は複数の染料を用いるためのすべての選択肢を示すものではない。

第１の実例の４つの染料は、以下の基準に基づいて選択される。
染料が組み合わせられたとき、ピークはほぼ等間隔になり、可視領域内にある。
ピークは、適度の波長精度（たとえば、±５ｎｍ）の機器を用いて容易に測定されるように十分幅が広い。
それらはすべて、水溶液に十分に可溶性である。
水溶液中のそれらの物理特性は、結果としての溶液を正確に分注するための液体供給装置の能力に悪影響を及ぼさない（たとえば、溶液の表面張力が減少すると、小さな液滴が供給装置の先端部に残る傾向を生じることになる）。
それらは、溶液内で不安定（たとえば、露光により）、又はｐＨ依存性（たとえば、指示薬）ではない。
１つの染料の主ピークの長波長側のテール部分は、次の染料のピークと重ならない。これは、次のピークが実際にピークであり、その下のピークのテール部分上の単なる隆起ではないことを確実にするのに役立つ。

４つの染料を含んだ単一溶液の概念的に最も簡単な実例では、４つのピークがあり、各ピークは隣接するピークと干渉しない。この４染料の実例に対する吸光度スペクトル特性は、図４に表される。この図では、Ｃｕ（ＥＤＴＡ）^２−に対するピークである特性１は、４つの染料のうち最も低い単位経路長当たりの吸光度を有し、試験される最も大きな体積（２００〜５０００μｌ）に対して用いることができる。メチルグリーンに対するピークである特性２は、低い次の体積範囲（５０〜２００μｌ）に対して用いることができる。ポンソーＳに対するピークである特性３は、低い次の体積範囲（１０〜５０μｌ）に対して用いることができる。タートラジンに対すピークであり、４つの染料のうち最も高い単位経路長当たりの吸光度を有する特性４は、試験される最も小さな体積（２〜１０μｌ）に対して用いることができる。
この実例にて用いられた、上記に示した基準を満たす４つの染料は、表２に示される。

各染料を目標とするこのサンプル溶液の濃度の希釈率は、Ｃｕ（ＥＤＴＡ）^２−に対して０．５、メチルグリーンに対して０．１７、ポンソーＳに対して０．０５、及びタートラジンに対して０．０１である。本発明の意図する結果を達成するためには、他の染料を用いてもよく、他の又は同じ染料を異なる濃度で用いることもでき、表に示される実例は全く限定するものではないことを理解されたい。

図４に示される４染料の関係を達成するのが、利用できる分光光度計又は染料の制約などにより難しい場合は、それらの特性が関心のある体積範囲をカバーするための所望の数の異なる検出可能な吸光度スペクトル特性をもたらすことを条件として、より少ない数の染料を用いることもできる。その目的のための例示の代替形態は、図５及び６に示される２染料の組み合わせである。図５は、対数スケールを用いて全吸光度範囲に対する２染料のサンプル溶液の場合の吸光度曲線を表し、図６は、スペクトル特性の１つが商用測光機器を用いて通常に使用可能な吸光度範囲内になるように、各希釈度が選択された２染料サンプル溶液の４つの異なる希釈度を表す。この代替の実例では、分注された体積をそれから計算するための、異なるスペクトル特性をもたらすように、２つの染料は２つのピークと２つの谷を生じる。Ｃｕ（ＥＤＴＡ）^２−のピークとポンソーＳの主ピークの間の谷である特性１は、最も大きな体積（２００〜５０００μｌ）のために用いることができる。Ｃｕ（ＥＤＴＡ）^２−のピークである特性２は、低い次の体積範囲（５０〜２００μｌ）のために用いることができる。主ピークと第２ピークの間のポンソーＳの最小値からの谷である特性３は、次の範囲（１０〜５０μｌ）のために用いることができる。ポンソーＳの主ピークである特性４は、最も小さい体積（２〜１０μｌ）のために用いることができる。

この実例のために用いられた２つの染料は、表３に示される特性を有する。

この実例では、Ｃｕ（ＥＤＴＡ）^２−とポンソーＳの間の谷に対する望ましいｃｍ当たりの吸光度は、溶液内の２つの染料の比率に基づいて決定される。また、ポンソーＳの谷に対するｃｍ当たりの吸光度は、その染料の特性であるのでピークのｃｍ当たりの吸光度に関係する。

本発明の複数染料溶液を用いた体積測定の結果は、本明細書の式（０．１）に示されたランベルト・ベールの法則を用いて計算される。具体的には、体積Ｖ_１のサンプル溶液の最初の供給の場合は、波長ｉでの予想される吸光度は、

である。
ただし、Ａ_１ ^ｉは波長ｉで測定された最初の供給の後の吸光度、ε_ｉＣ_ｉは波長ｉでのサンプル溶液の単位経路長当たりの吸光度、及びＶ_Ｄは容器に元々あった希釈剤の体積である。
これは、供給量Ｖ_１に対して解くことができる。

この式は、すべての波長でのすべての吸光度測定値に対して成り立つ。しかし、吸光度測定値の一部は使用には不適当であり、それらが小さ過ぎてそれらに過大な不確かさが伴うか、それらが機器が正確に測定するには大き過ぎるかである。異なる染料の濃度が正しく選択された場合は、吸光度測定値の少なくとも１つが、測定可能な吸光度範囲にあり、体積の正確な値を計算するために用いることができる。

サンプル溶液のｎ回目の供給の後には、ｎ回目を含みｎ回目までに供給されたサンプル溶液の総体積は、同様にして計算することができる。

本発明のシステムは、たとえば、非限定的に、ファームウェアに関連するなどのプログラムを通じて手動で又は自動でｎ−１番目の供給までにどれだけのサンプルが加えられたかの実行時の集計を記録し、それにより単にそれを減算してｎ番目の供給にて加えられた値が求められるようにするオプションを含む。

Ｖ_ｎの値は、ｎ番目とｎ−１番目の吸光度測定値のみに依存し、これら２つの連続する測定は、同じ波長で行われたものでなくてもよいことに留意されたい。式（０．５）において、ｎ番目の測定は波長ｉで行われ、ｎ−１番目の測定は波長ｊで行われている。

上記の４つの染料の実例の場合に対して、どのように体積測定結果を計算することができるかの実例について続いて述べる。この実例ではユーザは、５μｌのアリコートを１つ、２０μｌを１つ、１００μｌを１つ、１０００μｌを１つ分注する。希釈剤の初期体積は５０００μｌである。容器の経路長は１．８ｃｍである。４つの波長での予想される吸光度値、及び計算された体積は、表４に示される。

表４は、各供給の後の４つの波長のそれぞれでの吸光度値を示す。各体積判定に対して、計算に用いるために選択された吸光度は、可能な限り大きく、且つ測定可能な吸光度範囲内（この実例では、１．５未満）のものである。これらの値は、表に示される。計算を行うときには、上記の式中には、測定波長でのスペクトル特性に対するｃｍ当たりの吸光度が用いられる。

上述のシナリオは、試験装置からの体積供給の正確さを判定するために、サンプル溶液に存在する多数の吸光度スペクトル特性を用いて述べられた。示された実例は、サンプル溶液の多数の吸光度スペクトル特性を用いることによって、１つの吸光度スペクトル特性だけを有する個々の溶液に比べて、大幅に増大された試験可能な体積範囲を達成することができることを実証する。試験可能な体積範囲をさらに拡張する他の方法は、１つ又は複数の異なる吸光度スペクトル特性をもたらし、これらの特性が希釈剤溶液に特有である、希釈剤溶液中に１つ又は複数の染料を含むことである。これらの吸光度スペクトル特性は、希釈剤溶液に特有であるので、これらはサンプル溶液のどの吸光度スペクトル特性又は複数の特性とも共通でなく、著しく重ならない。希釈剤の吸光度スペクトル特性はまた、体積追加量を定量化するのにも用いることができる。

この代替手法の実例として、希釈剤の吸光度スペクトル特性の吸光度値は、サンプル体積が追加される前に測定される。上記の実例のように、これらの特性の一部は過度に吸光性となるが、他は範囲内となる。次いで、サンプル溶液の所望の試験量が希釈剤に加えられ、混合され、サンプルと希釈剤の混合物の吸光度スペクトル特性の吸光度値が測定される。サンプル溶液を加えることにより希釈剤中の染料の濃度は希釈され、希釈剤染料の吸光度スペクトル特性に対する吸光度値は減少される。混合物の希釈剤スペクトル特性の吸光度の減少は、加えられたサンプル溶液の体積に直接関係する。したがって上記のサンプル溶液の場合に説明したのと同じ概念を適用することによって、希釈剤の多数の吸光度スペクトル特性を、サンプル体積の測定に用いることができる。

上記の実例の明らかな拡張は、多数の吸光度スペクトル特性を有するサンプル溶液、並びに希釈剤に特有でありサンプルとは異なる多数の吸光度スペクトル特性を有する希釈剤を用いることである。サンプル及び希釈剤の多数の吸光度スペクトル特性の吸光度を監視することにより、試験可能な体積範囲のさらなる拡張を達成することができる。希釈剤の吸光度スペクトル特性は、それらの希釈度によって測定されるので、これらの特性への測定可能な変化は、典型的には大きなサンプル体積の追加によって生じる。したがって、希釈剤の特性は、大きなサンプル体積の追加に最も適用可能であり、小さなサンプル体積の追加は、サンプル溶液の吸光度スペクトル特性によってより適切に測定されることになる。

この代替の実例から、本発明は、容器に加えられたサンプル溶液の体積を計算するために用いることができることが分かり、サンプル溶液は１つ又は複数の異なる吸光度スペクトル特性をもたらす１つ又は複数の染料を含むことができ、希釈剤はまたすべて任意の組み合わせでこれまで使用可能であったよりも広い体積の範囲をカバーするように、サンプル溶液の特性とはさらに異なる１つ又は複数の異なる吸光度スペクトル特性をもたらす１つ又は複数の染料を含むことができる。

ユーザが機器の正しく正確な機能について定期的に試験することを可能にする手段を用意することが望ましい。それを行うための１つの方法は、試薬キットに較正溶液を含んだ容器を用意することである。この較正溶液は、好ましくはサンプル溶液（１つ又は複数）中に存在するのと同じ染料のすべてを含むが、少なくとも４染料の実例に関して、濃度は、希釈なしですべての波長にて吸光度値が測定可能範囲内となるようにする。ユーザは、容器を機器に挿入し、較正を確認するように機器に指示する。すべての波長で読み取りが行われ、国際標準に対してその結果がトレーサブルとなる機器を用いてキット製造業者の試験室にて測定された値と比較される。合格／不合格の基準は、システムの製造業者によって提供される。較正容器は、このプロセスでは消耗又は改変されないので、較正は望むだけ頻繁に実行することができる。４つより少ない染料が用いられる場合は、それぞれの使用される波長に対して較正ポイントを測定可能な吸光度範囲内にもたらすために、２つ以上の較正標準が必要となり得る。

先に示したように、各サンプル溶液が多数の吸光度スペクトル特性を含む、１つ又は複数のサンプル溶液を用いる概念は、希釈プロトコルの評価にも応用することができる。本明細書に組み込まれる米国特許出願第１１／８５４，５９４号は、実行された希釈プロトコルに基づいて体積又は希釈率を判定する異なる計算機構の使用を含む３つの希釈関連の方法の詳細を示している。この参考文献は、判定を実行するのに用いられる溶液の単一の吸光度スペクトル特性に使用に基づく希釈度評価について述べている。本発明は、サンプル溶液が希釈剤と１つ又は複数の回数組み合わせられる希釈度評価において、多数の吸光度スペクトル特性を有する溶液が用いられる方法を含む。

第１の希釈関連の方法は、容器寸法の変動性による不確かさを除去しながら、単一の吸光度スペクトル特性成分を使用したときに測定できるよりも広い体積範囲にわたって、容器内のサンプル溶液の体積を測定する能力をもたらす。具体的には、底面と既知の寸法を有する容器を用いた使用のための第１の希釈関連の方法は、ａ）容器に既知の濃度の希釈剤染料を含む希釈剤を加え、その結果として希釈剤に特有の波長に吸光度スペクトル特性を有し、サンプル溶液に対して関心のある波長では測定可能な吸光度をもたない希釈剤を生じるステップと、ｂ）希釈剤に特有の波長にて吸光度を測定するステップと、ｃ）ある体積のサンプル溶液を容器に加えるステップであって、サンプル溶液は、希釈剤に特有の波長には測定可能な吸光度をもたず、対応する複数の波長で多数の吸光度スペクトル特性を確立するように既知の濃度（１つ又は複数）にて１つ又は複数の染料を含む、ステップと、ｄ）サンプル溶液と希釈剤の混合物を生成するために、容器内の希釈剤とサンプル溶液を混合するステップと、ｅ）すべての波長にてサンプル溶液と希釈剤の混合物の吸光度を測定するステップと、ｆ）測定された吸光度値に基づいて、容器に加えられたサンプル溶液の体積を計算するステップと、を含む。

第１の希釈関連の方法において体積を計算するには、容器に加えられた希釈剤の体積が既知であることが必要である。既知でない場合はそれは、希釈剤に特有の波長での希釈剤の単位経路長当たりの吸光度と、サンプル溶液を容器に加える前のその波長での希釈剤染料の測定された吸光度を用いて決定される希釈剤を通る光の経路長、及び容器の寸法から計算される。第１の希釈関連の方法は、体積を計算するために以下の式を用いることを含む。

ただし、（Ｖ_ｓ）は容器に加えられたサンプル溶液の体積、（Ｖ_ｄ）は容器に加えられた希釈剤の体積、（ａ_ｄ）は希釈剤のスペクトル特性の単位経路長当たりの吸光度、（ａ_ｓ）はある体積範囲に対して測定可能な吸光度を有するサンプル溶液のスペクトル特性の単位経路長当たりの吸光度、（Ａ_λ１）は測定可能である波長でのサンプル溶液のスペクトル特性の吸光度、及び（Ａ_λ２）はサンプル溶液のスペクトル特性の測定可能な波長とは異なる波長での希釈剤のスペクトル特性の吸光度である。すなわち、体積範囲のサブセット当たりに少なくとも１つの異なる吸光度スペクトル特性をもたらすことによって広い体積範囲にわたって単一のサンプル溶液を用いることができ、１つの既知の染料濃度を有する第１のサンプル溶液を、第２の濃度が第１のサンプル溶液の既知の濃度より大きく又は小さい、同じ染料の第２の既知の濃度を有する第２のサンプル溶液に置き換える必要はない。４つの染料を有するサンプル溶液に関して先に述べた実例では、サンプル溶液は、以前はそれぞれが単一の異なる吸光度スペクトル特性を有する４つの別々のサンプル溶液を用いてしか達成できなかった体積範囲にわたる体積測定に対して、第１の希釈関連の方法において使用することができる。同様に、上記からの２染料サンプル溶液も同じ体積範囲をカバーすることができ、なぜなら各染料は、結果として２つの異なる検出可能な吸光度特性、溶液中に合計で４つの異なるスペクトル特性を生じ、それぞれの異なる特性が異なる体積範囲をカバーするからである。

この第１の希釈関連の方法に追加することができる追加の手法は、希釈剤に特有でありサンプル溶液に存在する吸光度スペクトル特性とは異なる希釈剤に多数の吸光度スペクトル特性をもたらす希釈剤に、多数の染料を組み入れることである。希釈剤の追加された吸光度スペクトル特性は、サンプルの吸光度スペクトル特性のみを用いたときに測定できるよりも広い体積範囲にわたって容器内のサンプル溶液の体積を測定する能力をもたらす。この手法は、ａ）既知の濃度又は複数の濃度の１つ又は複数の希釈剤染料を含む希釈剤を容器に加えるステップであって、結果として希釈剤に特有の波長での複数の吸光度スペクトル特性を有し、サンプル溶液に対して関心のある波長では測定可能な吸光度をもたない希釈剤を生じる、ステップと、ｂ）希釈剤に特有の波長にて吸光度を測定するステップと、ｃ）ある体積のサンプル溶液を容器に加えるステップであって、サンプル溶液は、希釈剤に特有の波長には測定可能な吸光度をもたず、対応する複数の波長で多数の吸光度スペクトル特性を確立するように既知の濃度（１つ又は複数）にて１つ又は複数の染料を含む、ステップと、ｄ）サンプル溶液と希釈剤の混合物を生成するために、容器内の希釈剤とサンプル溶液を混合するステップと、ｅ）すべての波長にてサンプル溶液と希釈剤の混合物の吸光度を測定するステップと、ｆ）測定された吸光度値に基づいて、容器に加えられたサンプル溶液の体積を計算するステップと、を含む。

本発明の第２の希釈関連の方法は、単一の吸光度スペクトル特性のみが測定できるときに、同様な体積又は希釈度判定において使用可能であるよりも広い体積範囲又は希釈度範囲にわたってサンプル溶液の希釈度を判定する能力を提供する。サンプル溶液は複数の染料を含み、希釈剤はサンプル溶液の複数の染料の１つと同じで、その共通の染料に対するサンプル溶液内とほぼ同じ濃度で含まれる染料を含む。具体的には、第２の希釈関連の方法は、ａ）サンプル溶液において、測定可能な吸光度値が得られるそれぞれの独立な波長にて複数のスペクトル特性のそれぞれの吸光度値を測定するステップであって、サンプル溶液は複数の容器の第１の容器に含まれる、ステップと、ｂ）目標体積のサンプル溶液を第１の容器から、複数の容器の第２の容器へ移動するステップと、ｃ）第２の容器内のサンプル溶液に、目標体積の希釈剤を混合するステップと、ｄ）第２の容器内で、測定可能な吸光度値が得られるが、共通の染料に対して測定可能な吸光度が得られなければならない、スペクトル特性の吸光度値を測定するステップと、ｅ）第２の容器に含まれるサンプル溶液の希釈率を計算するステップであって、希釈率は、第２の容器に混合された希釈剤によってサンプル溶液が希釈された程度を表す、ステップとを含む。

第１の容器から第２の容器へのサンプル溶液の移動、及び次いでその混合物を希釈することに関連する希釈率の計算は、次の式を用いるものである。

ただし、（Ａ_１，λ１）は、規定された測定可能な吸光度範囲内の吸光度を生じ、第１の容器内で測定された、サンプル溶液のみの複数のスペクトル特性のいずれかの吸光度、（Ａ_２，λ１）は、規定された測定可能な吸光度範囲内の吸光度を生じ、第２の容器内で測定された、サンプル溶液のみの複数のスペクトル特性のいずれかの吸光度、（Ａ_１，λ２）は、サンプル溶液のみを含んだ第１の容器内で測定された、サンプル溶液と希釈剤の両方に共通なスペクトル特性の吸光度、（Ａ_２，λ２）は、第２の容器内で測定された、サンプル溶液と希釈剤の両方に共通なスペクトル特性の吸光度、（Ｒ_１２）は、希釈率である。

第２の希釈関連の方法は、ａ）以下のステップ、すなわち、ｉ）目標体積のサンプル溶液と希釈剤の混合物を、後続の容器に移動するステップと、ｉｉ）目標体積の希釈剤を、後続の容器内へ混合するステップと、ｉｉｉ）測定可能な吸光度値が得られるすべてのスペクトル特性に対する吸光度値を測定するステップと、をさらにＸ回繰り返すステップであって、Ｘ≧１であり、それによりサンプル溶液と希釈剤の混合物と、加えられた希釈剤とを有する複数の容器の最後の容器は容器ｎであり、先行する容器は容器ｍである、ステップと、ｂ）容器ｎに含まれるサンプル溶液と希釈剤の混合物の希釈率を計算するステップであって、希釈率は、サンプル溶液と希釈剤の混合物が、容器ｎ内へ混合された希釈剤によって希釈された程度を表す、ステップと、によって第１の容器から第２の容器への移動を超えたさらなる希釈ステップにわたって拡大することができる。希釈率に基づいてｎ番目の供給を通じて、どれだけの希釈されたサンプルが先行する容器から特定の容器に加えられたかの実行時の集計を記録することができる。本発明の第２の希釈関連の方法を用いた比較的大きな体積範囲にわたる希釈プロトコルの任意の数の希釈ステップに対する希釈率は、次の式を用いて計算することができる。

ただし、（Ｒ_ｍｎ）は、容器ｎ内の希釈剤と混合された後の、容器ｍ内のサンプル溶液と希釈剤の混合物に対する希釈率、（Ａ_ｍ，λ１）は、容器ｍ内で測定されたサンプル溶液のみの、複数のスペクトル特性のいずれかの測定可能な吸光度、（Ａ_ｎ，λ１）は、容器ｎ内で測定されたサンプル溶液のみの、複数のスペクトル特性のいずれかの測定可能な吸光度、（Ａ_ｍ，λ２）は、容器ｍ内で測定されたサンプル溶液と希釈剤の両方に共通なスペクトル特性の吸光度、（Ａ_ｎ，λ２）は、容器ｎ内で測定されたサンプル溶液と希釈剤の両方に共通なスペクトル特性の吸光度である。

体積範囲のサブセット当たりに少なくとも１つの異なる吸光度スペクトル特性をもたらすことによって、１つの既知の染料濃度を有する第１のサンプル溶液を、第２の濃度が第１のサンプル溶液の既知の濃度より大きい又は小さい、同じ染料の第２の既知の濃度を有する第２のサンプル溶液に置き換えることを必要とせずに、広い体積範囲にわたって単一のサンプル溶液を希釈できることが分かる。４つの染料を有するサンプル溶液に関して先に述べた実例において、サンプル溶液は、それがまた、それぞれが単一の異なる吸光度スペクトル特性（やはり、それぞれは希釈剤の染料と共通の染料の吸光度スペクトル特性とは異なる）を有する、４つの別々のサンプル溶液を用いてのみ以前に達成できた体積範囲にわたって希釈度を評価するために、希釈剤の染料と共通の異なる測定可能な吸光度スペクトル特性を有する第５の染料を含むことを条件として第２の希釈関連の方法で使用することができる。同様に、上記の２染料サンプル溶液の実例も、サンプル溶液と希釈剤の両方にほぼ等しい濃度で存在するようになる第３の染料が加えられれば、同じ体積範囲をカバーすることができる。本発明の４染料又は２染料バージョンの使用において、この第２の希釈関連の方法は、たとえば垂直ビーム分光光度計を用いて測定されるマイクロタイタープレートでの試験に用いられるときに、変動する希釈体積、又は変動する容器経路長による不確かさを低減するために用いることができる。

第２の希釈関連の方法の実例では、単一のサンプル溶液と単一の希釈剤とを一緒に混合し、全体積範囲にわたって希釈剤によるサンプル溶液の希釈度を計算するために用いることができる。

本発明の第３の希釈関連の方法は、単一の吸光度スペクトル特性のみが測定できるときに、同様な対応する希釈度判定において得られるよりも広い体積範囲及び希釈度範囲にわたってサンプル溶液の希釈度を判定するために、第２の希釈関連の方法の能力と同様な能力を提供する。サンプル溶液は複数の染料を含み、希釈剤は、サンプル溶液の複数の染料の１つと同じであり、その共通な染料に対してサンプル溶液内とほぼ同じ濃度で含まれる染料を含む。具体的には第３の希釈関連の方法は、ａ）目標体積のサンプル溶液を液源から容器へ移動するステップと、ｂ）目標体積の希釈剤を容器内のサンプル溶液に混合するステップと、ｃ）容器内の溶液のスペクトル特性の吸光度値を測定するステップと、ｄ）液源からのサンプル溶液の希釈率を計算するステップであって、希釈率は、容器内へ混合された希釈剤によって液源のサンプル溶液が希釈された程度を表す、ステップとを含む。

第３の希釈関連の方法は、ａ）以下のステップ、すなわち、ｉ）目標体積のサンプル溶液と希釈剤の混合物を後続の容器へ移動するステップと、ｉｉ）既知の濃度の共通の染料を有する目標体積の希釈剤を、後続の容器内のサンプル溶液と希釈剤の混合物に加えるステップと、ｉｉｉ）吸光度値を測定するステップと、をさらにＸ回繰り返すステップであって、Ｘ≧１であり、それにより液源以外の容器は容器ｍであり、液源は容器０として表される、ステップと、ｂ）液源からのサンプル溶液の希釈率を計算するステップであって、希釈率は、すべての混合ステップを通じて希釈剤によって液源のサンプル溶液が希釈された程度を表す、ステップと、によって液源から単一の容器への移動を超えたさらなる希釈ステップにわたって拡大することができる。本発明の第３の希釈関連の方法を用いた比較的大きな体積範囲にわたる希釈プロトコルの任意の数の希釈ステップに対する希釈率は、次の式を用いて計算することができる。

ただし、（Ｒ_０ｍ）は、すべての希釈剤追加の後の、容器０のサンプル溶液の希釈率、（ａ_ｄ）は、共通スペクトル特性の単位経路長当たりの吸光度、（ａ_ｓ）は、サンプル溶液に特有のスペクトル特性の単位経路長当たりの吸光度、（Ａ_ｍ，λ１）は、容器ｍ内で測定されたサンプル溶液に特有のスペクトル特性の測定可能な吸光度、（Ａ_ｍ，λ２）は、容器ｍ内で測定された共通スペクトル特性の測定可能な吸光度である。

体積範囲のサブセット当たりに少なくとも１つの異なる吸光度スペクトル特性をもたらすことによって、１つの既知の染料濃度を有する第１のサンプル溶液を、第２の濃度が第１のサンプル溶液の既知の濃度より大きい又は小さい、同じ染料の第２の既知の濃度を有する第２のサンプル溶液に置き換えることを必要とせずに、広い体積範囲にわたって単一のサンプル溶液を希釈できることが分かる。４つの染料を有するサンプル溶液に関して先に述べた実例において、サンプル溶液は、それがまた、それぞれが単一の異なる吸光度スペクトル特性（やはり、それぞれは希釈剤の染料と共通の染料の吸光度スペクトル特性とは異なる）を有する、４つの別々のサンプル溶液を用いてのみ以前に達成できた体積範囲にわたって希釈度を評価するために、希釈剤のスペクトル特性と共通の異なる測定可能な吸光度特性を有する第５の染料を含むことを条件として第３の希釈関連の方法で使用することができる。

第３の希釈関連の方法の実例では、単一のサンプル溶液と単一の希釈剤とを一緒に混合し、全体積範囲にわたって希釈剤によるサンプル溶液の希釈度を計算するために用いることができる。

本発明の第４の希釈関連の方法は、単一の吸光度スペクトル特性のみが測定できるときに、同様な対応する希釈度判定において得られるよりも広い体積範囲及び希釈度範囲にわたってサンプル溶液の希釈度を判定するために、第２及び第３の希釈関連の方法の能力と同様な能力を提供する。この第４の希釈関連の方法は、多数の希釈ステッププロトコルにおける任意の２つのステップの間の希釈率を判定するために用いられるという点で、第２の希釈関連の方法と同様である。しかし、式（０．８）を用いて希釈率の正確な判定を可能にするには希釈ステップが大きくなり過ぎるので、この第４の手法が必要となる。この第４の希釈関連の方法では、複数ステップの希釈プロトコルが行われる。サンプル溶液は複数の染料を含み、希釈剤は、サンプル溶液の複数の染料の１つと同じであり、サンプル溶液内とほぼ同じ濃度で含まれる染料を含む。具体的には、第４の希釈関連の方法は、ａ）目標体積のサンプル溶液を液源から第１の容器へ移動するステップと、ｂ）目標体積の希釈剤を第１の容器内のサンプル溶液に混合するステップと、ｃ）目標体積の混合されたサンプルと希釈剤を、第１の容器から第２の容器へ移動するステップと、ｄ）目標体積の希釈剤を第２の容器内の溶液に混合するステップと、ｅ）第１及び第２の容器内の溶液のスペクトル特性の吸光度値を測定するステップと、ｆ）第２の容器内に含まれるサンプル溶液の希釈率を計算するステップであって、希釈率は、第２の容器内へ混合された希釈剤によって、第１の容器からの混合されたサンプル及び希釈剤が希釈された程度を表す。

この第４の希釈関連の方法は、式（０．８）も式（０．９）も、すべての条件下で記述された希釈プロトコルを判定することはできないので、異なる計算を必要とする。たとえば、第１の容器から第２の容器への溶液の供給が、いずれの１つの吸光度スペクトル特性によって測定できるより大きな希釈ステップを含むと仮定する。吸光度ベースの染料を用いるときは、測定可能な線形の吸光度は、通常２〜３桁の規模の濃度変化にわたってしか達成できない。したがって、液源から第１の容器への供給が大きいシナリオを仮定する。この場合は、ｓと呼ぶ１つの吸光度スペクトル特性が解析のために選択される。ｓの単位経路長当たりの吸光度は、液源容器内の希釈されていない溶液に対しては既知であり、ａ_ｓによって与えられる。液源容器から第１の容器へのサンプル溶液の希釈度は十分大きいので、液源容器内のサンプル溶液に対して直接測定するにはｓに関連する吸光度が高過ぎるため、実行された希釈を判定するには式（０．８）は使用できない。しかし、希釈ステップの結果、第１の容器内でｓに関連する測定可能な吸光度を生じると仮定すると、生じた希釈を判定するのに式（０．９）を用いることができる。次に、希釈プロトコルが第１の容器から第２の容器へ行われ、この希釈ステップも大きいと仮定する。このシナリオでは、ｓに関連する吸光度は第１の容器では測定可能であるが、希釈プロトコルにより、第２の容器内で正確に測定するには、ｓに関連する吸光度が小さ過ぎるようになり得る。

ｓに関連する吸光度は、第２の容器では正確に測定できないので、これまでに示されたいずれの式を用いても希釈度は判定できない。このようなシナリオに対しては、新しい式を考察する必要があり、これはｓ’と呼ぶ第２の吸光度スペクトル特性を使用するものである。液源容器でのサンプル溶液に対するｓ及びｓ’の単位経路長当たりの吸光度は既知であるが、十分大きく、それによりｓ及びｓ’の吸光度値は、希釈されていないサンプル溶液に対してだけは直接測定できない。述べたように、液源容器から第１の容器へのサンプル溶液の移動において生じる希釈は、結果として、ｓに関連する測定可能な吸光度を生じる。しかしこの場合は、ｓ’に関連する吸光度は依然として測定可能となるには大き過ぎる。第１の容器と第２の容器の間のプロトコルを続けることにより、正確に測定するには小さ過ぎるｓに関連する吸光度を生じるが、ｓ’に関連する測定可能な吸光度を生じる。このシナリオの場合は、第１の容器と第２の容器の間で生じるサンプル溶液の希釈度は、以下の式で表されるように、液源容器と第２の容器の間の全体的な希釈度を、液源容器と第１の容器の間の全体的な希釈度で除算することによって判定することができる。

ただし、（Ｒ_０１）は、第１の容器を容器ｍとし、希釈剤の共通スペクトル特性に関連する波長をλ_２、サンプル溶液に特有のスペクトル特性ｓに関連する波長をλ_１として、式（０．９）を用いて計算される。同様に、（Ｒ_０２）は、第２の容器を容器ｍとし、希釈剤の共通スペクトル特性に関連する波長をλ_２、サンプル溶液に特有のスペクトル特性ｓ’に関連する波長をλ_１として、式（０．９）を用いて計算される。

第４の希釈関連の方法は、ａ）以下のステップ、すなわち、ｉ）目標体積のサンプル溶液と希釈剤の混合物を、後続の容器に移動するステップと、ｉｉ）目標体積の希釈剤を、後続の容器内へ混合するステップと、ｉｉｉ）測定可能な吸光度値が得られるすべてのスペクトル特性に対する吸光度値を測定するステップと、をさらにＸ回繰り返すステップであって、Ｘ≧１であり、それによりサンプル溶液と希釈剤の混合物と、加えられた希釈剤とを有する複数の容器の最後の容器は容器ｎであり、先行する容器は容器ｍである、ステップと、ｂ）容器ｎに含まれるサンプル溶液と希釈剤の混合物の希釈率を計算するステップであって、希釈率は、サンプル溶液と希釈剤の混合物が、容器ｎ内へ混合された希釈剤によって希釈された程度を表す、ステップと、によって第１の容器から第２の容器への移動を超えたさらなる希釈ステップにわたって拡大することができる。本発明の第４の希釈関連の方法を用いたある体積範囲にわたる希釈プロトコルの任意の数の希釈ステップに対する希釈率は、次の式を用いて計算することができる。

ただし、（Ｒ’_ｍｎ）は、サンプル溶液と希釈剤の混合物が容器ｍから移動され、容器ｎ内の希釈剤に混合されて生じた希釈率である。この式は、添字０によって示される液源容器から容器ｎへの全体的な希釈に対して表される式（０．９）と、液源容器から、希釈プロトコルにおいて容器ｎに直接先行する容器ｍへの全体的な希釈に対して表される式（０．９）の商である。式（１．１）のより有用な形は、式（０．９）内の項を置き換え、代数学的に簡略することによって得られる。

ただし、（ａ_ｓ）は、サンプル溶液に特有であり、結果として容器ｍ内に測定可能な吸光度を生じる、スペクトル特性ｓの単位経路長当たりの吸光度、（ａ_ｓ’）は、やはりサンプル溶液に特有であるがスペクトル特性ｓとは異なる、結果として容器ｎ内に測定可能な吸光度を生じる、スペクトル特性ｓ’の単位経路長当たりの吸光度、（Ａ_ｍ，λｓ）はサンプル溶液のスペクトル特性ｓに対応する、波長λ_ｓでの容器ｍ内での測定された吸光度、（Ａ_ｍ，λｄ）はサンプル溶液と希釈剤溶液の間で共通なスペクトル特性に対応する、波長λ_ｄでの容器ｍ内での測定された吸光度、（Ａ_ｎ，λｄ）はサンプル溶液と希釈剤溶液の間で共通なスペクトル特性に対応する、波長λ_ｄでの容器ｎ内での測定された吸光度、（Ａ_ｎ，λｓ’）はサンプル溶液のスペクトル特性ｓ’に対応する、波長λ_ｓ’での容器ｎ内での測定された吸光度である。

多数の染料及び多数の吸光度スペクトル特性を含んだ溶液を用いることにより、希釈方式のすべてのステップに対する希釈率は式（０．８）、（０．９）、及び（１．２）を用いて測定することができる。すべてのスペクトル特性が分光光度計の測定可能な吸光度範囲内とはならない。しかし、１つのスペクトル特性が最初の数回の希釈ステップ内で結果として測定可能な吸光度値を生じ得る一方で、別のスペクトル特性は、希釈方式での複数のステップが行われた後にのみ測定可能な吸光度値を生じるようになる。したがって、希釈方法が続けられ、異なるスペクトル特性が用いられる場合は、各ステップの精度を判定することができる。

本発明はさらに以下のように、希釈剤に関連する特性を通じて体積を判定するために用いることができる。底面と既知の寸法を含む容器内のサンプル溶液の液体体積を判定する本発明の方法は、ａ）容器に、既知の濃度又は複数の濃度の、１つ又は複数の希釈剤染料を含む希釈剤を加え、結果として対応する数の異なる波長にて多数の吸光度スペクトル特性を有する希釈剤を生じるステップと、ｂ）異なる波長の任意の１つ又は複数にて吸光度を測定するステップと、ｃ）ある体積のサンプル溶液を容器に加えるステップであって、サンプル溶液は、希釈剤の多数の吸光度スペクトル特性の異なる波長には測定可能な吸光度をもたない、ステップと、ｄ）サンプル溶液と希釈剤の混合物を生成するために、容器内の希釈剤とサンプル溶液を混合するステップと、ｅ）サンプル溶液と希釈剤の混合物の測定可能な吸光度を測定するステップと、ｆ）測定された吸光度に基づいて、容器に加えられたサンプル溶液の体積を計算するステップと、を含む。この方法では、サンプル溶液は、希釈剤の多数のスペクトル特性の異なる波長のいずれの波長とも異なる対応する波長にて１つの吸光度スペクトル特性を有する１つの染料を含んでもよく、含まなくてもよい。別法として、サンプル溶液は、対応する異なる波長にて複数の吸光度スペクトル特性を生じる１つ又は複数の染料を含むことができる。サンプル溶液の１つ又は複数の染料の吸光度スペクトル特性の異なる波長は、希釈剤の多数のスペクトル特性の異なる波長とはすべて異なるか、サンプル溶液の１つ又は複数の染料の吸光度スペクトル特性の異なる波長の１つが、希釈剤の多数のスペクトル特性の異なる波長の１つと同じとすることができる。

さらに本発明は、以下の、
２つ以上の波長にて吸光度を測定する光度測定手段であって、結果を外部のプリンタ又はコンピュータに通信することができる、光度測定手段と、
試験中の装置によって供給される１つ又は複数のサンプル溶液であって、各サンプル溶液は１つ又は複数の染料を含み、染料の組み合わせが２つ以上の異なる検出可能な吸光度スペクトル特性を生じる、１つ又は複数のサンプル溶液と、
染料を含まないが、一定のｐＨを維持するために緩衝剤を含むことができる、既知の体積の希釈剤溶液と、
自動的に又は手動でサンプル溶液と希釈剤溶液が混合されるようにすること、
吸光度の測定値、溶液の光学特性、サンプル溶液と希釈剤溶液の混合物を含んだ容器の寸法、及び希釈剤の体積に基づいて、試験中のディスペンサによって分注される液体の体積を計算するためのコンピュータ実行可能なファームウェアと
の少なくとも一部分を含む、液体供給量を試験又は較正するためのシステムを含むことに留意されたい。

さらに本発明は、以下の、
２つ以上の波長にて吸光度を測定する光度測定手段であって、結果を外部のプリンタ又はコンピュータに通信することができる、光度測定手段と、
試験中の装置によって供給される１つ又は複数のサンプル溶液であって、各サンプル溶液は１つ又は複数の染料を含み、染料の組み合わせが２つ以上の異なる検出可能な吸光度スペクトル特性を生じる、１つ又は複数のサンプル溶液と、
１つ又は複数の染料を含み、一定のｐＨを維持するために緩衝剤を含むことができる希釈剤溶液と、
自動的に又は手動でサンプル溶液と希釈剤溶液が混合されるようにすること、
吸光度の測定値、溶液の光学特性、サンプル溶液と希釈剤溶液の混合物を含んだ容器の寸法、及び希釈剤の体積に基づいて、試験中のディスペンサによって分注される液体の体積を計算するためのコンピュータ実行可能なファームウェアと
の少なくとも一部分を含む、液体供給量を試験又は較正するためのシステムを含むことに留意されたい。

本明細書で述べられ示された実例及び設計の他の変形形態を実施することができる。たとえば、非限定的に、染料の希釈に基づいて体積を計算するために希釈モードアルゴリズムを含めることができる。さらに、プロセス、そのステップ、及び様々な実例及びこれらのプロセス及びステップの変形形態は、個別に又は組み合わせて、コンピュータ可読媒体上で、たとえば不揮発性記録媒体、集積回路メモリ素子、又はその組み合わせ上でのコンピュータ可読信号として具体的に実施されたコンピュータプログラム製品として実施することもできる。このようなコンピュータプログラム製品は、コンピュータ可読媒体上に具体的に実施されたコンピュータ可読信号であって、このような信号がたとえば、コンピュータによって実行される結果として、本明細書で述べられた１つ又は複数のプロセス若しくは動作、及び／又は様々な実例を行うようにコンピュータに命令する１つ又は複数のプログラムの一部として命令を定義する、信号を含むことができる。このような命令は、複数のプログラミング言語、たとえばＪａｖａ（登録商標）、Ｖｉｓｕａｌ ＢＡＳＩＣ、ＸＭＬ、Ｃ又はＣ＋＋、Ｆｏｒｔｒａｎ、Ｐａｓｃａｌ、Ｅｉｆｆｅｌ、ＢＡＳＩＣ、ＣＯＢＯＬなど、又はそれらの多様な組み合わせにて書くことができる。

本発明の趣旨及び範囲から逸脱せずに、本明細書で述べられた装置、方法、及び／又はキットに様々な変更を行うことができることを理解されたい。たとえば、複数染料溶液には代替の染料を使用することができる。したがって、他の実施例は、本明細書に添付された特許請求の範囲に含まれる。

Claims (16)

1. ａ）容器内のサンプル溶液の体積、又は、ｂ）サンプル溶液の１もしくは複数の容器内での希釈剤による希釈度を判定する方法であって、
   ａ．サンプル溶液を容器に加えるステップ、
   ｂ．このサンプル溶液を希釈剤と混合し、この容器内にサンプル溶液と希釈剤との混合物を形成するステップ、
   ｃ．複数の異なる検出可能な吸光度スペクトル特性であって、各スペクトル特性は、それが隣接するスペクトル特性と干渉しない、該複数の異なる検出可能な吸光度スペクトル特性を検出できる複数の波長にてサンプル溶液と希釈剤との混合物の吸光度を測定し、吸光度測定情報を得るステップ、並びに、
   ｄ．この吸光度測定情報に基づいて、容器に加えられたサンプル溶液の体積及び／又は希釈剤によるサンプル溶液の希釈度を判定するステップであって、サンプル溶液及び希釈剤のいずれか又は両方が、その単一体積中に、ある範囲の体積及び／又はある範囲の希釈度を通じて、混合物中にて複数の異なる検出可能な吸光度スペクトル特性を生成するように選択された１又は複数の染料を含むステップ
   を含む上記方法。
2. サンプル溶液が、混合物中にて複数の異なる検出可能な吸光度スペクトル特性を生成するように選択された１又は複数の染料を含み、
   希釈剤が、その希釈剤に特有の波長で光を吸収する既知の濃度の希釈剤染料を含む、
   請求項１に記載の方法。
3. サンプル溶液が、混合物中にて複数の異なる検出可能な吸光度スペクトル特性を生成するように選択された１又は複数の染料を含み、
   希釈剤が、サンプル溶液の複数の異なる検出可能な吸光度スペクトル特性にて測定可能な吸光度を有さず、
   該方法が、容器に既知の体積の希釈剤を加える事前のステップをさらに含み、
   そして、判定ステップが、測定された吸光度、希釈剤とサンプル溶液の吸光係数、及び希釈剤体積に基づいて、容器に加えられたサンプル溶液の体積を判定することを含む、
   請求項１に記載の方法。
4. サンプル溶液が、混合物中にて複数の異なる検出可能な吸光度スペクトル特性を生成するように選択された１又は複数の染料を含み、
   希釈剤が、サンプル溶液の１又は複数の染料のうちの１つと同じ希釈剤染料を、サンプル溶液の対応する染料の濃度と実質的に等価な濃度にて含む、
   請求項１に記載の方法。
5. 容器が、複数の容器の第１の容器であり、
   サンプル溶液が、混合物中にて複数の異なる検出可能な吸光度スペクトル特性を生成するように選択された１又は複数の染料を含み、
   希釈剤が、サンプル溶液の１又は複数の染料のうちの１つと同じ希釈剤染料を、サンプル溶液の対応する染料の濃度と実質的に等価な濃度にて含み、
   該方法が、さらに
   ｉ．ステップｂの前に、サンプル溶液において、対応する波長にて検出可能な吸光度スペクトル特性の吸光度値を測定するステップ、並びに
   ｉｉ．ステップｂの前に、目標体積のサンプル溶液を第１の容器から、複数の容器の第２の容器へ移動し、次いで、この第２の容器でステップｂ、ｃ及びｄを行うステップを含み、
   そして、判定ステップが、第２の容器に含まれるサンプル溶液の希釈率を判定することを含み、この希釈率は、第２の容器内の混合物において希釈剤によってサンプル溶液が希釈された程度を表す、
   請求項１に記載の方法。
6. ａ．ｉ）目標体積のサンプル溶液と希釈剤との混合物を、後続の容器に移動するステップ、ｉｉ）既知の体積の希釈剤を、後続の容器内に混合するステップ、及び、ｉｉｉ）測定可能な吸光度値が得られうる全てのスペクトル特性について吸光度値を測定するステップを、Ｘ回繰り返すステップであって、Ｘ≧１であり、サンプル溶液と希釈剤との混合物及び加えられた希釈剤を含む複数の容器の最後の容器は容器ｎであり、先行する容器は容器ｍであるステップ、並びに、
   ｂ．容器ｎに含まれるサンプル溶液と希釈剤との混合物の希釈率を判定するステップであって、この希釈率は、容器ｍからのサンプル溶液と希釈剤との混合物が、容器ｎ内に混合された希釈剤によって希釈された程度を表すステップ
   をさらに含む、請求項５に記載の方法。
7. サンプル溶液が、混合物中にて複数の異なる検出可能な吸光度スペクトル特性を生成するように選択された１又は複数の染料を含み、
   希釈剤が、サンプル溶液の１又は複数の染料のうちの１つと同じ希釈剤染料を、サンプル溶液の対応する染料の濃度と実質的に等価な濃度にて含み、
   ｉ．サンプル溶液を容器に加えるステップが、目標体積のサンプル溶液を液源から容器へ移動することを含み、
   ｉｉ．容器内でサンプル溶液を希釈剤と混合して混合物を形成するステップが、容器内のサンプル溶液に目標体積の希釈剤を混合することを含み、かつ
   ｉｉｉ．判定ステップが、液源からのサンプル溶液の希釈率を判定することを含み、この希釈率は、混合物を形成するために容器に混合された希釈剤によって液源のサンプル溶液が希釈された程度を表す、
   請求項１に記載の方法。
8. ａ．ｉ）目標体積のサンプル溶液と希釈剤との混合物を、後続の容器に移動するステップ、ｉｉ）目標体積の希釈剤を、後続の容器内のサンプル溶液と希釈剤との混合物に加えるステップ、及びｉｉｉ）吸光度値を測定するステップを、Ｘ回繰り返すステップであって、Ｘ≧１であり、それにより液源以外の容器は容器ｍであり、液源は容器０として表されるステップ、並びに
   ｂ．液源からのサンプル溶液の希釈率を判定するステップであって、この希釈率は、すべての混合ステップを通じて、希釈剤によって液源のサンプル溶液が希釈された程度を表すステップ
   をさらに含む、請求項７に記載の方法。
9. 容器が、複数の容器の第１の容器であり、
   サンプル溶液が、混合物中にて複数の異なる検出可能な吸光度スペクトル特性を生成するように選択された１又は複数の染料を含み、
   希釈剤が、サンプル溶液の１又は複数の染料のうちの１つと同じ希釈剤染料を、サンプル溶液の対応する染料の濃度と実質的に等価な濃度にて含み、
   ｉ．サンプル溶液を第１の容器に加えるステップが、目標体積のサンプル溶液を液源から第１の容器へ移動することを含み、
   ｉｉ．容器内でサンプル溶液を希釈剤と混合して混合物を形成するステップが、第１の容器内のサンプル溶液に目標体積の希釈剤を混合することを含み、
   該方法が、さらに
   ｉｉｉ．ステップｃに先立って、目標体積の混合物を第１の容器から第２の容器へ移動するステップ、
   ｉｖ．ステップｃに先立って、第２の容器内の混合物に目標体積の希釈剤を混合するステップ、
   ｖ．ステップｃの後に、第２の容器内の溶液の検出可能な吸光度スペクトル特性の吸光度値を測定するステップを含み、
   そして、判定ステップが、第２の容器に含まれるサンプル溶液の希釈率を判定することを含み、この希釈率は、第１の容器からの混合物が、第２の容器内の混合物に混合された希釈剤によって希釈された程度を表す、
   請求項１に記載の方法。
10. ａ．ｉ）目標体積のサンプル溶液と希釈剤の混合物を後続の容器に移動するステップ、ｉｉ）目標体積の希釈剤を後続の容器内へ混合するステップ、及びｉｉｉ）測定可能な吸光度値が得られうるすべてのスペクトル特性に対する吸光度値を測定するステップを、Ｘ回繰り返すステップであって、Ｘ≧１であり、それによりサンプル溶液と希釈剤との混合物及び加えられた希釈剤を有する複数の容器の最後の容器は容器ｎであり、先行する容器は容器ｍであるステップ、並びに
    ｂ．容器ｍ及びｎ内の混合物の吸光度測定に基づいて容器ｎに含まれるサンプル溶液と希釈剤との混合物の希釈率を判定するステップであって、該希釈率は、容器ｍからのサンプル溶液と希釈剤との混合物が容器ｎ内へ混合された希釈剤によって希釈された程度を表すステップ
    をさらに含む、請求項９に記載の方法。
11. 溶液中にて複数の異なる検出可能な吸光度スペクトル特性であって、各スペクトル特性は、それが隣接するスペクトル特性と干渉しない、該複数の異なる検出可能な吸光度スペクトル特性を生成するように選択された１又は複数の染料を含み、ある範囲の体積及び／又はある範囲の希釈度を通じて、ａ）容器内の溶液の体積、又は、ｂ）１もしくは複数の容器内での溶液の希釈度を判定するための単一の溶液。
12. 複数の波長にて吸光度を測定する測光機器、容器、希釈剤、並びに、この容器に混合されたときの溶液及び希釈剤の光学特性と吸光度の測定とに基づいて、液体保持装置によって容器に分注された溶液の体積を計算するための手段と組み合わせて、この液体保持装置を較正するシステムを構成する請求項１１に記載の溶液。
13. 容器にて溶液を希釈剤と混合して溶液−希釈剤混合物を形成し、この溶液−希釈剤混合物の吸光度特性の測定に基づいて、液体保持装置によって分注された溶液の体積を計算するための器具と組み合わせて、この液体保持装置の較正に使用されるキットを形成する請求項１１に記載の溶液。
14. 溶液中で、低い体積又は希釈度の範囲を較正又は試験するために第一の異なる検出可能な吸光度スペクトル特性を確立し、かつ、高い体積又は希釈度の範囲を較正又は試験するために第二の異なる検出可能な吸光度スペクトル特性を確立する１つのみの染料を含む、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の溶液。
15. 第１の染料及び第２の染料を含む２つの染料を含み、
    溶液中にて、第１の染料が、低い体積又は希釈度の範囲を較正又は試験するために第１の異なる検出可能な吸光度スペクトル特性を確立し、かつ、
    第２の染料が、高い体積又は希釈度の範囲を較正又は試験するために第２の異なる検出可能な吸光度スペクトル特性を確立する、
    請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の溶液。
16. 第１の染料及び第２の染料を含む２つの染料を含み、
    溶液中にて、第１の染料が、第１の体積又は希釈度の範囲を較正又は試験するために第１の異なる検出可能な吸光度スペクトル特性を確立すると共に、第２の体積又は希釈度の範囲を較正又は試験するために第２の異なる検出可能な吸光度スペクトル特性を確立し、かつ、
    第２の染料が、第３の体積又は希釈度の範囲を較正又は試験するために第３の異なる検出可能な吸光度スペクトル特性を確立すると共に、第４の体積又は希釈度の範囲を較正又は試験するために第４の異なる検出可能な吸光度スペクトル特性を確立する、
    請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の溶液。

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