JP4080746B2 - 最適化されたt−dna転移およびそのためのベクター - Google Patents
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Description
(発明の分野)
本発明は分子生物学の分野に関する。より具体的には本発明は外来のDNAの真核細胞のゲノム、例えば植物細胞への組み込みの方法について記載する。本発明の特性は、左T−DNAボーダーを通る読み合わせが著明に低下し、および/または組み込まれたベクターバックボーンDNAを容易に除去できるように、アグロバクテリウム的に転移されたT−DNAを隣接するボーダー反復を設計することに在る。従って、T−DNAのみを含有するトランスジェニック真核細胞を得る頻度が増す。
【0002】
(発明の背景)
人類が遊牧生活から定住生活に移って以来、「古典的な」交雑育種により改良された植物変種が得られている。さらに近年では科学者が交雑の間の遺伝物質の挙動を解明し始め、植物の育種家は交雑の子孫の所定の遺伝的特色の分布を予測するメンデルの法則に含まれる知識から利を得ることができ、依然そうしている。植物分子生物学の出現で植物の育種家はかなり精密さを増して新規キメラ遺伝子を植物ゲノムに挿入することができる。今日では、植物の遺伝的形質転換を媒介するためにアグロリスティック、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、遺伝子直接転移およびDNAコーティングした粒子を用いるボンバードメントなど種々の技術を利用できる。好ましい、広く用いられている植物形質転換系では土壌細菌アグロバクテリウム(ZupanおよびZambryski(1995)、Gelvin(1998a)、Gheysenら(1998))を使用する。今日、アグロバクテリウムは植物の形質転換に使用するのみならず、酵母、カビおよび糸状菌の形質転換にも使用されている(Bundockら(1995)、de Grootら(1998)、Goukaら(1999)、国際公開公報第98/45455号)。さらに、T−DNA産生の構成要素およびアグロバクテリウムの転移メカニズムは哺乳動物細胞の核へのDNAの移入に有用であることが示されており、遺伝子治療におけるこれらの構成要素の使用に展望が開かれた(Ziemienowiczら(1999))。アグロバクテリウムはT−DNAに位置するいずれかのDNAを真核細胞核へ移す。このT−DNAは野生型Ti−(アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)の場合)またはRi−プラスミド(A.リゾゲネスの場合)の一部である。野生型T−DNAは植物ゲノムに組み込まれた後、A.ツメファシエンスまたはA.リゾゲネスの場合、各々クラウンゴール腫瘍または毛状根症候群を引き起こす遺伝子を担持する。vir遺伝子(有毒遺伝子)もまた野生型Ti−またはRi−プラスミドに位置し、これは植物フェノール類により活性化される。vir遺伝子の産生物はT−DNAの真核細胞ゲノムへの転移に寄与する。形質転換目的では、T−DNAを無毒化(すなわち全ての疾患原因となる遺伝子を除去する)し、vir遺伝子はヘルパープラスミドのトランス((複数の)異種性遺伝子を取り囲むT−DNAは次いで第2のバイナリー植物形質転換ベクターに位置する)か、または同時組み込み植物形質転換ベクターの場合シスのいずれかで供給される。2個のT−DNA 22塩基対(オクトピンTiプラスミドの場合)または25塩基対(ノパリンTiプラスミドの場合)の右ボーダー(RB)および左ボーダー(LB)を構成する不完全なボーダーコア配列間に目的の異種性遺伝子をクローニングし、これはT−DNAプロセシングを指示するのに必要なシスエレメントのみである。RBおよびLBのボーダーコア配列は不完全な反復として構成される。
【0003】
VirD1およびVirD2タンパク質は各ボーダー反復のボトム鎖の第3および第4塩基間で一本鎖ニックを作る(Yanofskyら(1986))。VirD1およびVirD2のレベル増加によりアグロバクテリウム内のT−DNA複合体の産生が増強され、その結果、植物形質転換効率が上昇する(Wangら(1990))。
【0004】
何年もの間、反復間のDNA、すなわちT−DNAのみが真核細胞に転移し、T−DNAの外側のベクターDNAは転移しないと考えられていた。しかしながら、近年、トランスジェニック植物のDNAインサートのより詳細な特徴づけにより、ベクターバックボーン配列もまた非常に高頻度で植物ゲノムに組み込まれることが示されている(Martineauら(1994)、RamanathanおよびVeluthambi(1995)、Clusterら(1996)、van der Graaffら(1996)、Kononovら(1997)、Wenckら(1997)、Woltersら(1998))。
【0005】
本発明の著者は以前にベクター配列の組み込み頻度が植物種または用いる形質転換法により影響されないことを見出した。これはベクターバックボーン配列の転移がLBを通り過ぎた読み合わせの結果であり、その過程はアグロバクテリウム細胞内で生じており、恐らくこれらの細胞内の因子により決定されるという見解に合致する。しかしながら、他の研究者による根形質転換により得られるアラビドプシス(Arabidopsis)形質転換体の33%で、および真空浸透により得られる形質転換体の62%まで、ベクターバックボーンが組み込まれるとう報告に注目すべきである(Wenckら(1997))。これは用いられる形質転換法がベクターバックボーンの組み込みの頻度に影響する別の因子であり得ることを意味している。ベクターバックボーン配列の組み込みはペチュニア(Petunia)(VirtsおよびGelvin(1985)、Clusterら(1996))、アラビドプシス(Arabidopsis)(Van der Graaffら(1996)、Wenckら(1997)、タバコ(RamanathanおよびVeluthambi(1995))、Kononovら(1997)、Wenckら(1997))およびジャガイモ(Woltersら(1998))などの多くの植物種で生じることが報告されている。ベクターバックボーンの組み込みは明らかに植物形質転換に用いたアグロバクテリウム株の型とは独立している(Kononvら(1997))。
【0006】
発明者らは以前に、特異的PCR反応およびDNAゲルブロット分析を用いてベクターバックボーン配列の存在に関して異なるシリーズの形質転換体を分析した。2つの異なる植物種において、すなわちアラビドプシス・タリアナ(Arabidopsis thaliana)根および葉形質転換体並びにニコチアナ・タバクム(Nicotiana tabacum)プロトプラストおよび葉形質転換体において3つの異なる形質転換法を評価した。最終的にレプリコン型、ColE1およびpVS1レプリコンの影響を評価した。結果は形質転換に使用した植物種も外植体の型、レプリコン型または選択もベクター配列の組み込みを生じる頻度に大きく影響することはなかった。従来はT−DNAに属さないベクターDNAのこの転移は左ボーダーでの読み合わせの結果であり、これはT−DNA転移の正常な終止を妨害すると仮定されていた。または、DNA転移は左ボーダーで出発し、右ボーダーに向かって進み得る(RamanathanおよびVeluthambi(1995); van der Graaffら(1996))。しかしながら前記のトランスジェニク植物では、多くが左ボーダーに結合したベクターバックボーン配列および、右T−DNAボーダーとのベクター接合を含有することが観察された。DNAゲルブロットはこれらの植物のほとんどで、完全なベクター配列が組み込まれていることを示している。従って、完全なベクターバックボーン配列の植物ゲノムにおける組み込みは右ボーダーで開始される接合転移、続いて読み合わせと称する左および右ボーダーでの連続複製の結果である。このモデルは左ボーダーがDNA転移の開始部位としてはあまり認識されなく、右ボーダーはDNA転移の終止部位としては効率よく認識されないことを意味している。これらの観察は、T−DNA形質転換の促進において右ボーダー領域が左ボーダー領域よりも本質的により活性であることを示す以前の研究結果に準じている(JenおよびChilton(1986、a,b), Caplanら(1985))。利用できる全てのデータより、T鎖形成は左ボーダー領域よりも右ボーダー領域でより高頻度で出発すると結論づけることができる。
【0007】
将来、アグロバクテリウム媒介の形質転換の結果、ベクターバックボーンの組み込みを防御するか、または修復することが最も重要になろう。第1に、監督機関は、一般の市場に放出されるトランスジェニック植物はベクターバックボーン配列を含まないことを要求する。かかるバックボーン配列は細菌性複製起点、細菌性抗生物質抵抗性遺伝子および可能な多くのその他の(外来)遺伝子を担持している可能性がある。また植物バイオテクノロジーに関係するこのような潜在する危険性に徐々に気付いてきている消費者によっても同じ厳しい懸念があげられる。第2に科学的な観点からも、植物のゲノムにベクターバックボーンが組み込まれているのは望ましくない。かかる配列は導入遺伝子発現に影響し得る(Iglesiasら(1997)、MatzkeおよびMatzke(1998)、Jakowitschら(1999))。ベクターバックボーンの組み込みはまたT−DNAタグ化実験に影響を及ぼす可能性が高い。タグは予期していたものよりかなり長く(Martineauら(1994))、ベクターバックボーンの組み込みはまた、T−DNAタグ化アラビドプシス植物では多くの割合でT−DNAが変異表現型と同時分離されないという事実を説明することもできる(Errampaliら(1991)、Feldmann(1991)、Konczら(1992)、Van Lijsebettensら(1991))。
【0008】
偶発的なベクターバックボーンの組み込み現象はすでに早くも1982年にOomsらにより遭遇されているが、これは1995年になってまず第1の解決としてRamanathanおよびVeluthambi(1995)により:「...左ボーダーに隣接して『転移停止』シグナル調整を有する新規バイナリーベクターを構築できる」ことが示唆された。それ以来、研究者はベクターバックボーン組み込みのメカニズムを理解しようとしてきた。可能な理由がWenckら(1997)により論じられた:「...効率の悪いニッキングは有毒タンパク質、主にVirD2が低量であるためであろう」。しかしながら、極最近、Hansonら(1999)によりT−DNAボーダーで読み合わせを防御する方法が開示された(国際公開公報第99/01563号)。これらの方法はボーダーの外側の配列を含むことに基づく。これらの配列は毒性化合物をコードする遺伝子またはDNA結合タンパク質と相互作用できる配列またはG+Cヌクレオチドに富む配列のいずれかである。国際公開公報第99/01563号およびHansonら(1999)に記載された方法の主要な欠点はゲノムにT−DNA領域以上の領域を担持する植物形質転換体の再生が防御されることである。かかる方法は全形質転換効率を損なう、すなわち所定の形質転換実験から得られる形質転換体の数が少なくなると考えられる。まさにHansonら(1999)によりタバコ形質転換効率が30%も低下することが報告された。それにもかかわらず、Hansonら(1999)は彼らの研究を「トランスジェニック体から非T−DNA配列を排除するため」の有用な手段として報告している。
【0009】
本発明は望ましくないベクターバックボーンの組み込みの技術的な問題に対する解決について記載し、既存の方法に対する利点を提供する。
【0010】
(発明の要旨)
本発明はT−DNAボーダーで隣接しているT−DNAを含む、形質転換ベクターについて記載する。T−DNAベクターは真核細胞の遺伝子形質転換がT−DNAでのみ可能であり、ベクターバックボーン配列では不可能であるように修飾されているという特徴を有する。これはベクターバックボーン配列の真核細胞のゲノムへの転移を防御することによるか、または真核細胞のゲノムに転移したベクターバックボーン配列を修復することにより達成される。該修飾T−DANベクターにより、少なくともVirD1およびVirD2を含むニッキング複合体による左ボーダーの効率のよいプロセシングが可能になるか、または転移したベクターバックボーン配列の切除が可能になる。
【0011】
本発明の第1の態様は右ボーダーの外側の領域により隣接する単一の右ボーダーコア配列を含む、T−DNA右ボーダーの修飾および/または:
a)10〜100塩基対の長さの、好ましくは20〜100塩基対の天然の左ボーダー外側領域および内側のT−DNA左ボーダー隣接領域により隣接した単一の左ボーダーコア配列であって、これはAおよびT残基の数に富み、AT残基のパーセンテージが60〜85%であるのが好ましく、64〜80%であるのがより好ましく、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、78または79%が最も好ましく、ただし該内側のT−DNA左ボーダー隣接領域が天然のオクトピン型左ボーダー内側領域ではない場合である、または
b)天然の左ボーダー内側領域によってのみ隣接した単一の左ボーダーコア配列;または
c)単一の左ボーダーコア配列;または
d)天然の左ボーダー外側領域によってのみ隣接したいくつかの左ボーダーコア配列の縦列反復であって、好ましくは2〜3個の左ボーダーコア配列を含有するが、高コピー数の左ボーダーコアの不完全な反復を排除していない縦列反復を有し、該縦列反復の該反復左ボーダーコア配列は3つの読み枠および両方向で停止コドンを選択的に担持する少なくとも10〜20塩基対の配列により分けられている;または
e)完全なオクトピン型左ボーダー領域に隣接してその下流もしくは上流の完全なノパリン型左ボーダー領域;
として設計された左T−DNAボーダーの倍増などの修飾を含む最適化T−DNAベクターからなる。
【0012】
本発明の別の態様は、組み込まれたベクターバックボーン配列の形質転換後の除去を可能にする、T−DNAボーダーコア反復の外側に追加のDNA配列を有する最適化T−DNA形質転換ベクターからなる。該追加のDNA配列はT−DNAボーダー領域またはその一部に倍増などの修飾を行い:
f)左ボーダーコア配列の下流および右ボーダーコア配列の上流を反復するように構成された組換え部位;または
g)単一の右ボーダー外側領域の上流、および好ましくはそれに隣接して位置する左ボーダー領域の第2のコピーおよび該第2の左ボーダー領域のコア配列の上流の該組換え部位を付加することによりさらに修飾された(f)の該DNA配列;または
h)好ましくは、存在する場合、左ボーダーの外側領域に隣接し、およびその下流に左ボーダーコア配列の下流の該組替え部位の下流にリコンビナーゼ遺伝子を有する(f)の該組換え部位;または
i)左ボーダー領域の下流に位置するDNA配列であって、該DNA配列は(h)で定義される組換え部位の反復により隣接したリコンビナーゼ遺伝子を含んでなり、さらに該リコンビナーゼの下流に左ボーダー領域の第2のコーピーを含む、;または
j)第2の左ボーダーコア配列の下流および単一の右ボーダーコア配列の上流に反復として構成された追加の組換え部位を有する(i)のDNA配列;
を含む、。
【0013】
該修飾(f)、(g)、(h)、(i)または(j)のいずれかでは、該組換え部位は左および/または右ボーダーコア配列に隣接して、並びにその下流および/または上流に位置し、3つの読み枠で両方向の停止コドンを選択的に担持する少なくとも10〜20塩基対の長さの配列により左および/または右ボーダーコア配列から分けられている。
【0014】
該修飾(f)、(g)、(h)、(i)または(j)のいずれかでは、該組換え部位は、直列反復として配列された部位特異的組換え部位または逆反復として配列されたトランスポゾンボーダー配列のいずれかであり、該リコンビナーゼ遺伝子は各々部位特異的リコンビナーゼ遺伝子かまたはトランスポザーゼ遺伝子のいずれかである。
【0015】
本発明の別の態様は(a)〜(j)で定義される該修飾のいずれかが適用されるか、または組み合わせて適用される形質転換ベクターを含む。これらの形質転換ベクターはアグロバクテリウム媒介の形質転換に用いられるベクターを含んでなり、オクトピン型バイナリー形質転換ベクター、ノパリン型バイナリー形質転換ベクター、同時組み込み型形質転換ベクター、スーパー・バイナリー型形質転換ベクター、Ri誘導形質転換ベクターおよびアグロリスティック形質転換または遺伝子治療で使用されるベクターを担持するT−DNAなどがある。
【0016】
本発明は該修飾(a)〜(j)のいずれかを含む該最適化形質転換ベクターを用いてベクターバックボーン配列の転移を防御することによりT−DNAのみで形質転換されたトランスジェニック真核細胞を得る方法を含む、。
【0017】
さらに本発明は部位特異的リコンビナーゼもしくはトランスポザーゼの供給と組み合わせた(f)もしくは(g)の該DNA配列、または実際には部位特異的リコンビナーゼもしくはトランスポザーゼの供給と組み合わせた(h)、(i)もしくは(j)の該DNA配列を含有する該最適化形質転換ベクターを用いてベクターバックボーン配列を含有する該形質転換された細胞の修復を可能にすることによりT−DNAのみで形質転換されたトランスジェニック真核細胞を得る方法を包含する。修復とはT−DNA形質転換事象を廃することなく該ベクターに由来し得る形質転換ベクターバックボーン配列を除去することを意味する。
【0018】
本発明の方法に従っておよび/または本発明の方法を意味して修飾された形質転換ベクターで植物、酵母、カビまたは糸状菌を形質転換することによりベクターバックボーン配列を含まないトランスジェニック植物、酵母、カビまたは糸状菌を得る方法もまた本発明の一部である。
【0019】
本発明はさらに、アグロバクテリウムによる、少なくともVirD1およびVirD2を含むニッキング複合体の産生を増加させる方法を包含する。該ニッキング複合体成分は、アグロバクテリウム株に含まれ、保持されている染色体および/または染色体外DNA単位に少なくとも1つの余分なコピーが組み込まれているvirDオペロン(オクトピン型またはノパリン型)によりコードされる。T−DNA左ボーダーの読み合わせを低下させるために、該方法を単独でまたは修飾T−DNAボーダーを含有する形質転換ベクターと組み合わせて適用することができる。
【0020】
さらに本発明は、いずれかのその他の方法および/またはベクターバックボーン配列の組み込みを防御または修復するために適用されるT−DNAベクター修飾でベクターバックボーン配列の組み込みを防御または修復するための、方法のいずれかの組み合わせおよび/または本発明のT−DNAベクター修飾を包含する。
【0021】
本発明に従って修飾された該形質転換ベクターを含有する細菌、好ましくはアグロバクテリウム・ツメファシエンスのような宿主もまた本発明に寄与する。
【0022】
ベクターバックボーン配列の組み込みを修復するための本発明の部位特異的組換え系もしくはトランスポゾン媒介組換え系と、同一物またはいずれかその他の目的で用いられるいずれかその他の部位特異的組換え系もしくはトランスポゾン媒介組換え系とのいずれかの組み合わせもまた本発明に包含される。
【0023】
前記するベクターで定義される変更に従って修飾されたT−DNAベクターを用いるアグロリスティック基盤の真核細胞の形質転換のための方法もまた本発明に含まれる。
【0024】
前記するベクターで定義される変更に従って修飾されたT−DNAベクターを用いる遺伝子治療のための方法もまた本発明に含まれる。
【0025】
前記で定義されるアグロバクテリウム媒介形質転換法により得られるトランスジェニック植物細胞または植物、かかる植物の一部、またはその子孫もまた本発明の構成要素である。
【0026】
前記で定義されるアグロバクテリウム媒介形質転換法により得られるトランスジェニック酵母、カビまたは糸状菌もまた本発明の構成要素である。
【0027】
前記のおよびその他の目的、本明細書の後記で明らかになる本発明の利点および特徴、本発明の本質は以下の本発明の好ましい態様の詳細な説明および添付の請求の範囲を参考にすることにより、より明確に理解されよう。
【0028】
(発明の詳細な説明)
植物、酵母、カビまたは糸状菌のアグロバクテリウム媒介形質転換またはアグロリスティック形質転換はT−DNAと称する形質転換ベクター配列の一部の核への転移および該真核細胞のゲノムにおける該T−DNAの組み込みに基づく。
【0029】
「アグロバクテリウム」とはアグロバクテリア科の一員、より好ましくはアグロバクテリウムまたはリゾバクテリウム、最も好ましくはアグロバクテリウム・ツメファシエンスを意味する。「T−DNA」または転移DNAとはT−DNAにより隣接した形質転換ベクターの一部を意味し、これはアグロバクテリウムvir遺伝子の活性化の後T−DNAボーダーでニックが入り、一本鎖DNAとして真核細胞の核に転移する。T−DNA鎖の産生は二本鎖分子で部位特異的ニックにより開始されるDNAプロセシング事象の結果である。相関するDNAプロセシング反応のファミリーは異なる真核細胞系に存在する。各々の場合、基質は超らせん環状DNA分子であり、ニッキングタンパク質は短い配列を認識し、保存部位(保存ニック部位の位置およびニックの3’に位置するコンセンサス領域)で切断し、ニックの入った鎖の5’末端に共有結合する。このファミリーに属するDNAプロセシング系には、真核細胞でのT−DNA形成およびアグロバクテリウムによる真核細胞へのT−DNAの転移に加えて、(1)接合DNA複製の開始およびそれに続くグラム陰性細菌のプラスミドの転移、(2)φX174−関連ファージのローリングサークル複製の間のプラス鎖合成の開始、並びに(3)グラム陽性細菌の特定のプラスミドにおけるローリングサークル複製の開始(WatersおよびGuiney(1993))などがある。DNAプロセシング事象はオリゴタンパク質レラクソソーム複合体により触媒される。この複合体のタンパク質の1つであるレラキサーゼは部位および鎖特異的DNA切断を触媒する重要な酵素である(PansegrauおよびLanka(1996))。プラスミドの接合転移の場合、レラキサーゼはDNAの5’末端に共有結合して転移し、DNAの単一のコピーの転移に必要な第2のニックを作ることはできない。少なくともレラキサーゼ二量体が単一のDNAコピーの転移に必要であると考えられている(PansegrauおよびLanka(1996))。
【0030】
アグロバクテリウムの場合、最低限2つのタンパク質が、ニッキングおよびそれに続くT−DNA転移に必要である。これらのレラクソソームタンパク質はVirD1およびVirD2である。VirD1は配列特異性のないI型トポイソメラーゼである(GhaiおよびDas(1989))。また配列相同性に基づいても、VirD2タンパク質はアグロバクテリウムのレラキサーゼであり、ニッキングエンドヌクレアーゼとして作用する(Pansegrauら(1994))。ニッキング過程ではVirD2は右ボーダーのプロセシングされたT−DNAの両5’末端および左ボーダーのT−DNAプラスミドの残りに共有結合する(Durrenbergerら(1989)、YoungおよびNester(1988))。T−DNA左および右ボーダーの双方はVirD1およびVirD2によって認識される。VirD1およびVirD2間およびVirD2タンパク質間の強い相互作用が示され、T−DNA鎖置換(DNA複製による)はVirD2−VirD2相互作用に依存して第2のニックを作ることにより終止することが示唆された。これは少なくともVirD1およびVirD2を含む別個のレラクソソーム複合体が2つのT−DNAボーダーの各々のプロセシングに関与し得ることを意味しいている(Relicら(1998))。
【0031】
「T−DNAボーダー」、「T−DNAボーダー領域」または「ボーダー領域」とは「右ボーダー」とも称する右T−DNAボーダー(RB)、または「左ボーダー」とも称する左T−DNAボーダー(LB)のいずれかを意味する。かかるボーダーには、ボーダーを隣接するT−DNAの一部であるボーダー内側領域および/またはボーダーを隣接するベクターバックボーンの一部であるボーダー外側領域により隣接するコア配列が含まれる。コア配列はオクトピン型ベクターの場合22塩基対、ノパリン型ベクターの場合25塩基対からなる。右ボーダー領域および左ボーダー領域のコア配列は不完全な反復形態を成す。ボーダーコア配列は少なくともVirD1およびVirD2からなるアグロバクテリウムニッキング複合体による認識およびプロセシングに欠くことができない。T−DNAを隣接するコア配列は該T−DNAの転移を促進するのに十分である。しかしながら、該コア配列により単独で隣接する該T−DNAを担持する形質転換ベクターを用いる形質転換の効率は悪い。ボーダーの内側および外側領域はT−DNA転移の効率を変調することが知られている(Wangら(1987))。T−DNA転移を増強する1つのエレメントが特徴づけされ、右ボーダー外側領域に存在し、オーバードライブと称される(Peraltaら(1986)、van Haarenら(1987))。コア配列は以下のとおりである(inn:T−DNA配列の一部;out:ベクターバックボーン配列の一部;コア配列は太字および下線付き太字で示す;Gielenら(1984,1999)):
【0032】
【表1】
【0033】
「完全なボーダー領域」とはボーダーコア配列並びにボーダーの内側および外側の双方を含む、天然発生T−DNAボーダーを意味する。
【0034】
「T−DNA形質転換ベクター」または「T−DNAベクター」とは各々少なくとも右および左ボーダーコア配列からなる右および左T−DNAボーダーに隣接し、いずれかの真核細胞の形質転換に用いられるT−DNA配列を含むいずれかのベクターを意味する。
【0035】
「ベクターバックボーン配列」または「(複数の)ベクターバックボーン配列」とはT−DNAボーダーの外側、より具体的にはボーダーコア不完全反復のニッキング部位の外側に在るベクターを含むT−DNAの全DNAを意味する。「ベクター」とは細菌培養、例えば大腸菌(Escherichia coli)培養またはアグロバクテリウム培養において安定して保持される形質転換ベクターまたはT−DNAベクターを意味する。
【0036】
本発明は真核細胞のゲノムにおけるベクターバックボーンの組み込みが最小化されるか、もしくは組み込まれないように、または真核細胞に組み込まれたベクターバックボーン配列の修復が可能であるように最適化されたT−DNAベクターの構築物を包含する。次いで該ベクター、それらのいずれかの誘導体または本発明のいずれかの修飾もしくはいずれかの修飾の組み合わせを利用するいずれかのベクターを、2つのボーダー反復間での目的のDNA配列のクローニングのため、および例えば農作物用植物、酵母または菌類の例えば形質転換、および例えば遺伝子治療など続いて適用するための出発物質として使用できる。
【0037】
「最適化T−DNAベクター」とは真核細胞のゲノムへのベクターバックボーン配列の転移を低減するかもしくは廃するか、または真核細胞のゲノムに転移したベクターバックボーン配列を修復できように設計されたT−DNAベクターを意味する。
【0038】
本発明の枠内で実施される分析(実施例1〜3)では、ベクターバックボーン転移の頻度を、天然オクトピン配列の前後関係においてボーダー反復を有するT−DNAで、およびボーダー配列の内側のボーダー領域のないT−DNAベクターで形質転換されたトランスジェニック植物において比較した。実質的には、内側のボーダー反復配列を有さないT−DNAベクターを用いた一連の形質転換植物では、完全な内側および外側のボーダー領域を用いた一連の形質転換植物よりも、より多くのベクターバックボーンの組み込みが見出された。さらに多くのトランスジェニック植物が左T−DNAボーダーに結合したベクターバックボーン配列および右T−DNAボーダーとのベクター接合を含むことが観察された(実施例2参照)。DNAゲルブロット分析により、たいていのこれらの植物では完全なベクター配列が組み込まれていることが示された(実施例3参照)。さらに、完全なベクターバクボーン配列の組み込み頻度はボーダー内側領域の存在または不在に影響されなかった。これらのデータは右ボーダー内側領域がたいてい左T−DNAボーダーでの有効なニッキングに重要な決定基を含有しないことを示唆している。この結果はさらにRB内側領域の欠失が植物形質転換の効率に影響しないことを示す、Shawら(1984)により早期に得られた結果により実証される。従って、左T−DNAボーダーでの有効なニッキングのための決定基はLBそのものに在る可能性が最も高い。完全なベクターバックボーン配列の植物ゲノムへの組み込みは、右ボーダーで接合転移を開始し、続いて左および右ボーダーでコピーを続ける、所謂読み合わせの結果である。ベクターバックボーン転移はまたDNA転移の出発点としてLBを認識し、RBでLBまでコピーを続ける結果でも在り得る(van der Graaffら(1996))。従ってLBコア反復で有効なニッキングに関与するLBエレメントを同定することが重要である。このように、例えば左ボーダー領域内側領域および/または外側領域の部分的または完全な欠失を、VirD1およびVirD2に対するその親和性および認識を増強する状況で左ボーダーコア反復に入れることができる。これに関して驚くべき観察が実施例2および3に記載される実験で用いられた形質転換ベクターの左(および右)ボーダー配列の分析から得られる。図1では、天然のボーダー内側領域の前後関係を含むか、または含まない双方の形質転換ベクターに関してLBおよびRBコア反復の周囲(含まれない)の100塩基対の広がりでのAおよびT残基のパーセンテージが描かれている。天然の内側領域(図1のK T−DNAベクター)のLB隣接の100塩基対のAT残基のパーセンテージが、天然の内側領域が欠失しているベクター(図1のHsb T−DNAベクター)のLB隣接の100塩基対のAT残基のパーセンテージよりもかなり高い、すなわち各々56%に比して64%という事実からなる観察が顕著である。前記したように、K T−DNAベクターで植物を形質転換した場合に比して、Hsb T−DNAベクターで植物を形質転換した場合、LB読み合わせおよび部分的ベクターバックボーン転移を生じる頻度がより高くなる。機械論的には、このAT残基のパーセンテージが低いことは少なくともVirD1およびVirD2を含むLB結合レラクソソームのニッキング活性を減じる可能性がある。同時に、T−DNA置換に影響するDNA複製の機構は比較的高い頻度で、ニックを実現する前にLBからレラクソソームを置換することができる。LBでの読み合わせ頻度の増加はかかる過程の結果であろう。従って、LBおよびT−DNAの一部に隣接する10〜100塩基対(または好ましくは20〜100塩基対)のAT残基のパーセンテージはLBコア反復でのニッキング効率を決定するLBの候補要素である。ニッキング効率を十分に高くするために、該LB隣接領域のAT残基のパーセンテージを十分に高くする、すなわち少なくとも約60〜85%、より好ましくは少なくとも約64〜80%にすべきである。T−DNA RBコア反復の外側の隣接の100塩基対はT−DNA LBコア反復の内側の隣接の100塩基対と類似のAT残基パーセンテージを有する、すなわち各々56%に比して58%である(図1参照)が、RBでの正確で高い効率のプロセシングは問題ない。これはRB外側領域に存在するオーバードライブ配列の正の影響による可能性が最も高い(Peraltaら(1986)、van Haarenら(1987))。レラクソソーム複合体に対するタンパク質補助物質がオーバードライブ配列に結合し、RBニッキングを増強することは除外できない。これはまたかかる補助タンパク質が同定された細菌間での接合プラスミド転移の状況に類似している(WatersおよびGuiney(1993))。また、現在まだ同定されていない補助タンパク質がLBの効率のよいプロセシングに関与していることも除外できない。
【0039】
前記したベクターバックボーン転移を防御するための第1の修飾T−DNAベクター構築物はAおよびT残基に富む内側T−DNA LB隣接領域を含む。しかしながらかかる研究法は全てのT−DNA構築物には現実的ではない。従って、図2では多くのさらなる最適化T−DNAベクター構築物が図式的に描かれている。図2の第1の構築物を用いる植物形質転換の結果は本発明に包含される(実施例1〜3参照)。その他の構築物は最適化T−DNAベクターを得るためのいくつかの研究法の基礎となる。最適化は、LBニッキングの効率を上げ、真核細胞のゲノムへのベクターバックボーンの組み込みが高度に最小化されるか全く欠如する結果に至ることを目標とする左ボーダーの設計の修飾に在る。該最適化T−DNAベクター構築物では、RB領域が一定である、すなわち右ボーダー外側領域を含む、が、右ボーダー内側領域は欠失している。該右ボーダー領域は25塩基対RBコア配列およびpTiAch5に由来する右ボーダー外側領域の上流146塩基対を含有する(Gielenら(1984))。この外側領域はオーバードライブ配列を含有する。天然の前後関係、すなわち右ボーダー内側領域を含む、右ボーダー領域を同様に本発明で使用することができる。しかしながらボーダー内側領域が除去されている右ボーダーは、明確な機能を有さず、T−DNAの一部である「外来の」DNAの植物への転移はさらに限定されているという利点を有する。さらに前記では、RB内側領域の欠如はLBプロセシングの効率に影響する可能性は非常に低いことを論じた。例示した最適化T−DNAベクターのLB領域は一般にオクトピン型Tiプラスミドに由来し、全て天然の左ボーダーコア配列を含有する。ノパリン型T−DNAボーダーは通常Tiプラスミド、例えばpTiC58に由来する(Gielenら(1999))。本発明の最適化T−DNAベクターの実例に用いられるボーダー領域の実例についてより詳細には図2および実施例4に記載する。
【0040】
本発明の第1の態様は図2に例示する、右ボーダーの外側の領域に隣接する単一の右ボーダーコア配列を含む、T−DNA右ボーダーの修飾および/または:
a)10〜100塩基対の長さの、好ましくは20〜100塩基対の天然の左ボーダー外側領域および内側のT−DNA左ボーダー隣接領域に隣接した単一の左ボーダーコア配列であって、これはAおよびT残基の数に富み、AT残基のパーセンテージが60〜85%であるのが好ましく、64〜80%であるのがより好ましく、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、78または79%が最も好ましく、ただし該内側のT−DNA左ボーダー隣接領域が天然のオクトピン型左ボーダー内側領域ではない場合である、または
b)天然の左ボーダー内側領域にのみ隣接した単一の左ボーダーコア配列;または
c)単一の左ボーダーコア配列;または
d)天然の左ボーダー外側領域にのみ隣接したいくつかの左ボーダーコア配列の縦列反復であって、好ましくは2〜3個の左ボーダーコア配列を含有するが、高コピー数の左ボーダーコアの不完全な反復を排除していない縦列反復を有し、該縦列反復の該反復左ボーダーコア配列は3つの読み枠および両方向で停止コドンを選択的に担持する少なくとも10〜20塩基対の配列により分けられている;または
e)完全なオクトピン型左ボーダー領域に隣接してその下流もしくは上流の完全なノパリン型左ボーダー領域;
として設計された左T−DNAボーダーの倍増などの修飾を含む最適化T−DNAベクターからなる。
【0041】
一般に使用される形質転換ベクターにLBコア配列で有効なニッキングを表示する修飾左ボーダー領域の組み込みはLB読み合わせを防御する。LBコア配列の縦列配置の、または完全左ボーダーの別の利点は偶発的な読み合わせまたは該LBコア配列または完全LB領域の第1のコピーで開始するDNA転移が該縦列の該LBコア配列または完全LB領域の隣接コピーで終止するという事実に在る。本発明に含まれる双方の場合に、ベクターバックボーン配列の転移頻度および真核細胞ゲノムの該配列の組み込みは低減する。
【0042】
「下流」および「上流」とはいずれか他の配列の各々5’および3’に位置するいずれかの配列を意味する。参考として、RBのその5’末端で出発し、LBのその3’末端で終止するT−DNA鎖を取り上げる。
【0043】
左ボーダー内側および/または外側領域がベクターバックボーンの組み込みを避けるのに必要であるかどうかが解れば、さらなるT−DNA転移ベクターの最適化が考慮される。該内側および/または外側ボーダー領域の(複数の)特異的配列がT−DNA転移の終止の決定に重要であることを決定するために該内側および/または外側領域のいくつかの欠失誘導体を作ることができる。一度この/これらの配列が解れば、それをLB反復の周囲のより多くのコピーに含めることができ、より有効なニッキングを得るに至る。T−DNA形質転換ベクターおよび該さらに修飾された左ボーダーを含有する該ベクターをさらに最適化することができる、かかる左ボーダーもまた本発明の対象である。
【0044】
本発明はまたバイナリー形質転換ベクター、スーパーバイナリー形質転換ベクター、同時組み込み形質転換ベクター、Ri誘導形質転換ベクターを含む、いずれかのT−DNAベクターにおける、およびアグロリスティック形質転換または遺伝子治療に用いられるT−DNA担持ベクターにおける該修飾左ボーダーのいずれかの組み込みを含む。
【0045】
「バイナリー形質転換ベクター」とは:
a)形質転換すべき真核細胞に少なくとも1個の目的のおよび/または少なくとも1個の選択マーカー活性を含む、T−DNA領域;並びに
b)大腸菌およびアグロバクテリウムに少なくとも複製活性の起点および大腸菌およびアグロバクテリウムにおける選択マーカーを含む、ベクターバックボーン領域;
を含む、T−DNA形質転換ベクターを意味する。
【0046】
または、アグロバクテリウムにおけるバイナリー形質転換ベクターの複製は別個のヘルパープラスミドの存在に依存する。バイナリーベクターpGreenおよびヘルパープラスミドpSoupは、例えばHellensら、Plant Mol.Biol.42、819-832(2000)に記載されるか、またはインターネットサイト http://www.pgreen.ac.ukで利用できるような系の実例である。
【0047】
バイナリー形質転換ベクターのT−DNAボーダーをオクトピン型またはノパリン型Tiプラスミドまたは双方から誘導できる。バイナリーベクターのT−DNAのみがヘルパープラスミドと組み合わせて真核細胞に転移される。
【0048】
「ヘルパープラスミド」とは安定してアグロバクテリウムに保持され、少なくともT−DNAの転移を可能にするのに必要なvir遺伝子セットを担持するプラスミドを意味する。該vir遺伝子セットをオクトピン型またはノパリン型のいずれかのTiプラスミドからまたは双方から誘導できる。
【0049】
「スーパーバイナリー形質転換ベクター」とはさらにベクターバックボーン領域に猛毒性アグロバクテリウム・ツメファシエンスA281株(欧州特許第0604662号、欧州特許第0687730号)のTiプラスミドpTiBo542のvir領域を担持するバイナリー形質転換ベクターを意味する。スーパーバイナリー形質転換ベクターはヘルパープラスミドと組み合わせて使用される。
【0050】
「同時組み込み形質転換ベクター」とは少なくとも:
a)少なくとも1個の目的の遺伝子および/または植物において活性な少なくとも1個の選択マーカーを含む、T−DNA領域;および
b)少なくとも大腸菌およびアグロバクテリウムにおいて活性な複製起点、および大腸菌およびアグロバクテリウムにおける選択マーカーを含む、ベクターバックボーン領域;
を含む、T−DNAベクターを意味する。
【0051】
T−DNAボーダーおよび該T−DNAベクターの該vir遺伝子セットをオクトピン型またはノパリン型のいずれかのTiプラスミドまたは双方から誘導できる。
【0052】
「Ri由来植物形質転換ベクター」とはT−DNAボーダーがTiプラスミドおよび必要なvir遺伝子セットを担持する「ヘルパー」Riプラスミドとの接合に用いられるバイナリー形質転換ベクターに由来する該バイナリー形質転換ベクターを意味する。
【0053】
「アグロリスティック」、「アグロリスティック形質転換」または「アグロリスティック転移」とは本明細書ではアグロバクテリウム媒介の形質転換およびバイオリスティックなDNA転移の特徴を組み合わせた形質転換方法を意味する。このように、標的プラスミドを含有するT−DNAはVirE2を含むまたは含まないVirD1およびVirD2の植物産生を可能にするDNA/RNAと同時に分配される(HansenおよびChilton(1996); Hansenら(1997);国際公開公報第97/12046号)。
【0054】
真核細胞ゲノムのベクターバックボーン配列の転移および組み込みを先導する2つの可能なメカニズムが認識されている。第1のメカニズムでは、T−DNA転移は合理的に右T−DNAボーダーで出発するが、続いて左T−DNAボーダーで停止せず、ベクターバックボーン配列のコピーが続く。このメカニズムは左ボーダー読み合わせとして知られている。第2のメカニズムではDNA転移が不合理に左T−DNAボーダーで開始し、再度左T−DNAボーダーに至るまでコピーが続く。どのメカニズムで行われても、トランスジェニック植物の分析によりそれらの多くがそのゲノムに組み込まれた完全なベクターバックボーン配列を有することが示されている。本発明はさらにリコンビナーゼおよび組換え部位に関与する組換えによりベクターバックボーン配列を含有する形質転換細胞を修復するための研究法についてさらに記載する。
【0055】
「修復」とは本明細書ではT−DNA組み込み事象を廃することなく形質転換ベクターバックボーン配列を除去することを意味する。トランスジェニック個体から非T−DNA配列を排除するための別の手段はHansonら(1999)に記載されている。しかしながらこの手段は困難で、本発明で記載する修復方法とは関連しない。前記するように、Hansonら(1999)または国際公開公報第99/01563号の方法による非T−DNA配列の排除は形質転換効率を減じるという欠点を有する(Hansonら(1999))。
【0056】
従って、本発明の別の態様では、不合理に組み込まれたベクターバックボーン配列を除去するための方法として、組換え事象により形質転換された細胞を修復する。結果的に形質転換された細胞はゲノムにT−DNAを保持する形質転換細胞が得られる。Hansonら(1999)または国際公開公報第99/01563号の方法と対照的に、本発明の修復法は、以前不合理に組み込まれたベクターバックボーン配列を担持したトランスジェニック細胞を含有するT−DNAを救済する。従って形質転換効率はほとんど影響を受けない。
【0057】
「組換え事象」とは部位特異的組換え事象またはトランスポゾン「ジャンピング」により行われる組換え事象のいずれかを意味する。
「リコンビナーゼ」とは部位特異的リコンビナーゼまたはトランスポザーゼのいずれかを意味する。
「組換え部位」とは部位特異的組換え部位またはトランスポゾンボーダー配列のいずれかを意味する。
【0058】
「部位特異的組換え事象」とは一般的に3つの要素からなる系により触媒される事象を意味する:1対のDNA配列(部位特異的組換え配列または部位)および特異的酵素(部位特異的リコンビナーゼ)。部位特異的リコンビナーゼは2つの部位特異的組換え配列間のみで部位特異的組換え配列の配向に依存して組換え反応を触媒する。部位特異的組換え配列が互いに相対して反対の方向に配向する場合、部位特異的リコンビナーゼの存在下、2つの部位特異的組換え部位間に介在する配列は逆転する(すなわち逆方向反復)。部位特異的組換え配列が互いに相対して同一の方向に配向する場合(すなわち直列反復)、次いでいずれかの介在配列は部位特異的リコンビナーゼと相互作用したときに欠失する。従って、部位特異的組換え配列が真核細胞ゲノムに組み込まれたベクターバックボーン配列の両末端で直列反復として存在する場合、該配列のかかる組み込みは続いて部位特異的組換え配列と対応する部位特異的リコンビナーゼとの相互作用により除去され得る。
【0059】
使用できる多くの異なる部位特異性リコンビナーゼ系には、非限定例としてはバクテリオファージP1のCre/lox系、酵母のFLP/FRT系、ファージMuのGinリコンビナーゼ、大腸菌のPinリコンビナーゼ、シゲラ(Shigella)のPinB、PinDおよびPinF、並びにジゴサッカロミセス・ルークシー(Zygosaccharomyces rouxii)のR/RS系などがある。リコンビナーゼは一般的にインテグラーゼ、レソルバーゼまたはフリッパーゼである。また二重特異的リコンビナーゼを二重特異的リコンビナーゼに対応する2つの異なる部位特異的リコンビナーゼ部位の直列または非直列反復と組み合わせて使用することができる(国際公開公報第99/25840号)。好ましい部位特異的リコンビナーゼ系はバクテリオファージP1 Cre/loxおよび酵母FLP/FRTおよびZ.ルークシーR/RS系である。これらの系でリコンビナーゼ(各々Cre、FLPまたはR)はその各々の部位特異的組替え配列(各々lox、FRT、RS)と相互作用して介在配列を逆転または切除する。これらの2つの系の部位特異的組換え配列は比較的短い(loxで34塩基対およびFRTで47塩基対)。これらの系のいくつかは既に植物例えばタバコ(Daleら(1990)Onouchiら(19919、Sugitaら(2000))およびArabidopsis(Osbornら(1995)、Onouchiら(1995))で高い効率で使用されている。部位特異的組換え系は相同的組換え(例えば米国特許第5527695号)を調節する方法、標的挿入、遺伝子スタッキング等の方法(国際公開公報第99/25821号)および複合T−DNA組み込みパターンの解析方法または選択マーカーの切除方法(国際公開公報第99/23202号)などの植物分子生物学における多くの適用がある。これらの適用において、部位特異的組換え部位は典型的にはT−DNAとしてまたは相同的組換えにより真核細胞ゲノムに組み込まれたDNAの一部であり、従ってベクターバックボーン配列には存在しない。
【0060】
部位特異的組換え配列は切除または逆転されるDNAの末端に結合しなければならないが、部位特異的リコンビナーゼをコードする遺伝子はその他の場所に位置し得る。例えば、リコンビナーゼ遺伝子はすでに真核細胞のDNAに存在し得るか、または後ほど、直接細胞に、交雑また交差受粉のいずれかで導入されたDNAフラグメントにより提供され得る。または、例えばマイクロインジェクションまたは粒子ボンバードメントにより実質的に精製されたリコンビナーゼタンパク質を直接真核細胞に導入できる。典型的には、真核細胞における部位特異的リコンビナーゼの発現を可能にする制御配列に部位特異的リコンビナーゼコーディング領域を機能的に結合させる。
【0061】
本発明の一部として、部位特異的組換え部位を、T−DNAの外側に在るが、該T−DNAベクターに由来する可能性のある転移したベクターバックボーン配列またはその一部が部位特異的リコンビナーゼの作用により形質転換後に切除され得るようにT−DNAベクターに導入する。
【0062】
「トランスポゾンジャンピングにより生じる組換え事象」または「トランスポゾン媒介組換え」とは3つの要素からなる系により触媒される組換えを意味する:一対のDNA配列(トランスポゾンボーダー配列)および特異的酵素(トランスポザーゼ)。トランスポザーゼは逆反復として配置された2つのトランスポゾンボーダー配列間でのみ組換え反応を触媒する。
【0063】
非限定例としてはDs/Ac系、Spm系およびMu系などの多くの異なるトランスポゾン/トランスポナーゼ系を使用できる。これらの系はトウモロコシに由来するが、少なくともDs/AsおよびSpm系はその他の植物においてもまた機能することが示されている(Fedoroffら(1993)、Schlappiら(1993)Van Sluysら(1987))。各々11塩基対および13塩基対ボーダー配列により示されるDs−およびSpm型トランスポゾンが好ましい。
【0064】
トランスポゾンボーダー配列は切除されるDNAの末端に結合しなければならないが、トランスポゾンをコードする遺伝子は別の場所に位置し得る。例えば、リコンビナーゼ遺伝子はすでに真核細胞のDNAに存在し得るか、または後ほど細胞に直接導入、交雑、または交雑受粉のいずれかにより導入されたDNAフラグメントにより提供され得る。または、例えばマイクロインジェクションまたは粒子ボンバードメントにより実質的に純粋なトランスポゾンタンパク質を直接細胞に導入できる。
【0065】
本発明の一部として、トランスポゾンボーダー配列を、それらがT−DNAの外側に在り、ベクターバックボーンまたはその一部を、トランスポザーゼの作用により移動できるトランスポゾン様単位に形質転換するようにT−DNAベクターに導入する。従って本発明ではトランスポゾンとしてベクターバックボーンまたはその一部を宿主のゲノムの別の位置に再度組み込み、T−DNAのみを含有する形質転換された宿主およびベクターバックボーンまたはその一部を含有する形質転換された宿主を分けるために、トランスポザーゼが作用できる宿主の子孫の分離が必要であろう。
【0066】
本発明の別の態様は、組み込まれたベクターバックボーン配列の形質転換後の除去を可能にする、図3に例示するT−DNAボーダーコア反復の外側にさらなるDNA配列を有する最適化T−DNA形質転換ベクターからなる。さらなるこのDNA配列はT−DNAボーダー領域またはその一部に倍増などの修飾を行い:
f)左ボーダーコア配列の下流および右ボーダーコア配列の上流を反復するように構成された組換え部位;または
g)単一の右ボーダー外側領域の上流、および好ましくはそれに隣接して位置する左ボーダー領域の第2のコピーおよび該第2の左ボーダー領域のコア配列の上流の該組換え部位を付加することによりさらに修飾された(f)の該DNA配列;または
h)好ましくは、存在する場合、左ボーダーの外側領域に隣接し、およびその下流に左ボーダーコア配列の下流の該組替え部位の下流にリコンビナーゼ遺伝子を有する(f)の該組換え部位;または
i)左ボーダー領域の下流に位置するDNA配列であって、該DNA配列は(h)で定義される組換え部位の反復により隣接したリコンビナーゼ遺伝子を含んでなり、さらに該リコンビナーゼの下流に左ボーダー領域の第2のコーピーを含む、;または
j)第2の左ボーダーコア配列の下流および単一の右ボーダーコア配列の上流に反復として構成されたさらなる組換え部位を有する(i)のDNA配列;
を含む、。
【0067】
該修飾(f)、(g)、(h)、(i)または(j)のいずれかでは、該組換え部位は左および/または右ボーダーコア配列に隣接して、並びにその下流および/または上流に位置し、3つの読み枠で両方向の停止コドンを選択的に担持する少なくとも10〜20塩基対の長さの配列により左および/または右ボーダーコア配列から分けられている。
【0068】
該修飾(f)、(g)、(h)、(i)または(j)のいずれかでは、該組換え部位は、直列反復として配列された部位特異的組換え部位または逆反復として配列されたトランスポゾンボーダー配列のいずれかであり、該リコンビナーゼ遺伝子は各々部位特異的リコンビナーゼ遺伝子かまたはトランスポザーゼ遺伝子のいずれかである。
【0069】
該T−DNA形質転換ベクターにおいて該修飾(f)または(g)が、T−DNAボーダー領域またはその一部の、倍増などの単一の修飾として考えられるのは明らかである。
【0070】
左ボーダー読み合わせを防御する(国際公開公報第99/01563号)かまたは非T−DNA配列を排除する(Hansonら(1999))ためのT−DNA左ボーダーコア反復の下流のさらなるDNA配列の導入について記載されており、これらの配列はベクターバックボーン配列が組み込まれた形質転換体の成長を防御する。該修飾(f)に加えて、T−DNAベクターの該修飾(g)は第1のLBコア配列での読み合わせを第2のLBコア配列で停止できる利点を有し、従ってT−DNAフラグメントの重複が防御される。続いて挿入されたベクターバックボーン配列が適当なリコンビナーゼの作用により実質的に除去される。該修飾(f)に加えて、該修飾(h)はT−DNAベクターに左ボーダーコア配列の下流でリコンビナーゼ遺伝子配列を導入し、それにより該修飾T−DNAボーダーに導入された組換え部位で該T−DNAベクターに由来する可能性のある組み込まれたベクターバックボーン配列を解析できる。このように、国際公開公報第99/01563号とは対照的に、修復後、すなわち該T−DNAボーダーに導入された組換え部位に隣接したベクターバックボーン配列の除去後、組み込まれたベクターバックボーン配列を有する形質転換体を救済できる。同時にリコンビナーゼ遺伝子は切除される。
【0071】
該修飾(i)はさらに左ボーダー領域の設計を変化させる、すなわち左ボーダー領域のさらなるコピーが加えられる。しかしながら双方のコピーは、ベクターバックボーン組み込みを防御するための最初の研究法で前記されるように縦列には配置されないが、リコンビナーゼ遺伝子により分離され、ボーダーコア配列はより広範なボーダーの前後関係において生じる。従って、該修飾(i)は、単一のLB領域がLBコア配列の縦列配列を含む、前記されるT−DNAベクター構築物の修飾として考えられる。左T−DNAボーダー領域の第2のコピーの存在は第1のボーダーコア配列で出発するかまたは読み合わせする不合理なDNA転移を第2のボーダーコア配列で停止することができる。従って、ベクターバックボーン配列の一部のみが真核細胞の核に転移する。このベクターバックボーン領域が組換え部位に隣接しているので、リコンビナーゼの作用によリ容易にそれを除去できる。しかしながら左ボーダーコア配列の第2のコピーで出発するかまたは読み合わせする不合理なDNA転移は依然生じ得る。
【0072】
従って、該修飾(j)はさらに左ボーダーコア配列の第2のコピーの下流および単一の右ボーダー領域の上流に1対の組換え部位を加える。組み込まれたベクターバックボーン配列を、再度組換え部位におけるリコンビナーゼの作用により容易に除去できる。左ボーダーコア配列の第2のコピーの不合理なDNA転移の場合、リコンビナーゼはT−DNA形質転換ベクターバックボーンにより供給されない。従って、それはどこかから、例えばすでにそのゲノムにリコンビナーゼ遺伝子を含有する植物との有性交雑により供給されなければならない。
【0073】
該修飾(f)、(g)、(h)、(i)または(j)のいずれかはまたT−DNAとは独立して、すなわち物理的にT−DNAに結合していない真核細胞のゲノムに組み込まれたベクターバックボーン配列からトランスジェニック細胞を修復するのにも適用される。
【0074】
さらに本発明は(f)または(g)の該DNA配列を含有する該T−DNA形質転換ベクターをリコンビナーゼの供給と組み合わせて使用する方法か、または該ベクターバックボーン配列のバックボーン配列を含有する形質転換された細胞をリコンビナーゼの供給と選択的に組み合わせて修復するために該DNA配列(h)(i)または(j)を含むが該T−DNA形質転換ベクターを使用する方法からなる。
【0075】
続いて組換えを生じることができた形質転換された宿主の子孫を分離することにより、組換えを可能にするために宿主ゲノムに導入した部位特異的リコンビナーゼまたはトランスポザーゼを除去できる。該子孫の分離はまたT−DNAのみを含有する形質転換された宿主およびベクターバックボーン配列またはその一部のみを含有する形質転換された宿主を分ける方法でもある。
【0076】
本発明はさらにバイナリー形質転換ベクター、スーパーバイナリー形質転換ベクター、同時組み込み形質転換ベクター、Ri誘導形質転換ベクターを含んでいるいずれかのT−DNAベクターにおける、およびアグロリスティック形質転換または遺伝子治療に用いられるT−DNA担持ベクターにおけるいずれかのさらなるDNA配列組み込みからなる。
【0077】
本発明の1つの態様では、そのゲノムにリコンビナーゼ遺伝子を含有する植物との有性交雑により、組換え部位で隣接したベクターバックボーン配列を含有するトランスジェニック植物にリコンビナーゼ遺伝子を供給する。該リコンビナーゼを構成または誘導プロモーターのいずれかに機能的に結合させることができる。また宿主細胞も対応するRNAポリメラーゼを活性形態で含む、場合、リコンビナーゼ遺伝子を単一のサブユニットバクテリオファージRNAポリメラーゼ特異的プロモーター、例えばT7またはT3特異的プロモーターの調節下に置くことができる。リコンビナーゼを発現するためのさらに別の方法は、宿主細胞が転写因子と共に適当な方法で供給される場合、トランス活性下転写因子例えばGAL4もしくは誘導体(米国特許第5801027号、国際公開公報第97/30164号、国際公開公報第98/59062号)またはLacレプレッサー(欧州特許第0823480号)により奮起する上流活性化配列をリコンビナーゼオープン・リーディング・フレームと機能的に結合させることからなる。
【0078】
本発明の別の態様では、リコンビナーゼ遺伝子は形質転換ベクターバックボーンで供給され、該リコンビナーゼ遺伝子のプロモーターは好ましくは誘導プロモーターである。かかるプロモーターは当該分野で公知であり、例えば熱ショック応答プロモーター、糖質コルチコイド誘導プロモーターまたは別の化学物質により誘導されるプロモーター(例えば欧州特許第0332104号および国際公開公報第90/08826号に記載されるように)などがある。
【0079】
好ましい態様では、細菌宿主におけるリコンビナーゼ遺伝子の発現は該リコンビナーゼ遺伝子のコーディング領域に(1つまたは複数の)イントロン配列が含まれることにより妨げられる。
【0080】
当業界ではアグロバクテリウムにおけるVirD1およびVirD2のレベル上昇により植物形質転換のレベルが高くなることが知られている(Wangら(1990))。VirD1およびVirD2はまた、該真核細胞をキメラvirD1および/またはvirD2遺伝子(国際公開公報第97/12046号)で形質転換する手段により真核細胞に分配される外来性DNAの組み込みを改善する方法においても組み込まれた。しかしながらそれはVirD1および/またはVirD2の産生増加がベクターバックボーン配列の組み込みを防御できることは今まで示されてはいなかった。
【0081】
従って、本発明の別の態様では、少なくともエンドヌクレアーゼVirD1およびVirD2を含むT−DNAニッキング複合体の産生を増加させることによりT−DNAベクターの左ボーダーコア配列でニッキング効率を増強させることによりベクターバックボーン配列の組み込みを防御する。
【0082】
本発明の好ましい態様では、オクトピン型virD遺伝子座のさらなるコピーがアグロバクテリウムのゲノムおよび/またはヘルパープラスミドおよび/またはバイナリー形質転換ベクターおよび/またはスーパーバイナリー形質転換ベクターおよび/または同時組み込み形質転換ベクターおよび/またはRi由来植物形質転換ベクターのいずれかに組み込まれる。本発明の別の態様では、ノパリン型virD遺伝子座のさらなるコピーを、記載するように供給できる。
【0083】
従って本発明は形質転換ベクターバックボーン配列の組み込みを防御するかまたは修復し:
1)左T−DNAボーダー領域で、読み合わせが防御されるかもしくは停止するかまたはこのボーダーで出発するDNA−転移が防御されるかもしくは停止するように(a)〜(e)の修飾がなされたいずれかのT−DNAベクター;
2)組換えの手段によりトランスジェニック細胞のゲノムに組み込まれた形質転換ゲクターバックボーン配列を解析できるいずれかの(f)〜(j)のT−DNAベクター;または
3)T−DNAボーダーニッキング複合体の最低限の構成成分としてVirD1およびVirD2のレベルを上昇させるためのアグロバクテリウムのvirD遺伝子座の少なくとも1つの余分なコピー;
を用いる3つの方法を提示する。
【0084】
これらのいずれかの方法またはその一部を単独で、または2つを組み合わせて、またはそれら3つを全て組み合わせて用いることができるということは当業者には明白である。かかる組み合わせのいくつかを反映するT−DNAベクター設計の実例は図3に示す。
【0085】
発明の方法(1)または(2)と発明の方法(3)との好ましい組み合わせはLBコア配列の縦列配置を含有する修飾LB領域またはLB領域の複数のコピーを含有し、およびアグロバクテリウムによりVirD1およびVirD2の産生が増加した修飾LB領域を担持する形質転換ベクターからなる。LBコア配列の縦列またはLB領域の複数のコピーが通常形質転換に用いられるアグロバクテリウム株で利用できるVirD1およびVirD2タンパク質を規定することは全く予想できることである。結果的に、これらのタンパク質はもはや単一のRBコア配列でニックを確立するために利用することはできない。
【0086】
従って本発明の別の態様は、別個にまたはいずれかの組み合わせで形質転換ベクターバックボーンの組み込みを防御または修復するための、該方法のいずれかおよび/またはT−DNAベクター修飾の使用からなる。好ましい組み合わせはアグロバクテリウムにより産生されるVirDタンパク質のレベル増強によりLBコア配列の複数のコピーまたはLB領域の複数のコピーをつなぎ止めるT−DNAベクターに作用することが可能になる組み合わせである。
【0087】
ベクターバックボーンの組み込みを防御するかまたは修復するための該方法のいずれかおよび/またはT−DNAベクター修飾をベクターバックボーンの組み込みを防御するかまたは修復するためのいずれか別の方法と組み合わせることができる。かかる方法およびT−DNAベクター修飾には左ボーダーの下流の遺伝子またはDNA配列の付加、例えば国際公開公報第99/01563号に記載されるものなどがある。かかる遺伝子/DNA配列には細胞毒性化合物をコードする遺伝子、アンチセンスハウスキーピング遺伝子、左ボーダー領域の後ろのDNAの巻き戻しを妨げる配列、例えばGC含量の高い配列またはDNA結合タンパク質と相互作用するvirボックス配列などがある。
【0088】
従って、本発明の別の態様は、形質転換ベクターバックボーン配列の組み込みを防御または修復するための本発明のいずれかの方法および/またはT−DNAベクター修飾を、形質転換ベクターバックボーン配列の組み込みを防御または修復するための本発明のいずれか別の方法および/またはT−DNAベクター修飾と組み合わせて使用することからなる。
【0089】
形質転換ベクターバックボーン配列の組み込みを防御または修復するための本発明のいずれかの方法および/またはT−DNAベクター修飾を、例えば植物において活性な選択マーカーを切除するためのいずれかの組換え系を使用するかまたは組み込むいずれか別の方法および/またはT−DNAベクター修飾と組み合わせることができるのは当業者にはさらに明白であろう。該修復方法を実際に、例えばベクターバックボーン配列が隣接するのと同一のまたは異なる組換え部位を有する例示する選択マーカーを隣接することによる選択マーカーの切除と組み合わせることができる。該修復方法では、ベクターバックボーン配列をまた2つの異なる部位特異的組換え部位に隣接することもでき、使用する部位特異的組換え部位に対応する特異性で二重特異性リコンビナーゼにより修復を実施できる。
【0090】
従って本発明のさらなる態様は、形質転換ベクターバックボーン配列の組み込みを修復するための本発明の方法および/またはT−DNAベクター修飾を、ベクターバックボーン配列の組み込みを修復する以外の目的で何れかの組換え系を使用するかまたは組み込む方法および/またはT−DNAベクター修復と組み合わせて使用することからなる。
【0091】
本発明の別の態様は、相互に異なる部位特異的組換え部位のいずれかの対を付加することによりT−DNAボーダーの修飾を意味する組み込まれた形質転換ベクターバックボーン配列を修復し、少なくとも使用した部位特異的組換え部位に対応する特異性を有する少なくとも二重特異性リコンビナーゼと組み合わせて使用することからなる。
【0092】
本発明の別の態様では、本発明によるいずれかの該T−DNAベクター構築物をアグロバクテリウム株に起動させる。得られた株もまた本発明を構成する。
【0093】
本発明のさらに別の態様では、本発明によるいずれかの該T−DNAベクターをアグロバクテリウム媒介またはアグロリスティック形質転換において使用し、かかる形質転換方法は当業者に公知である。本発明による該T−DNAベクターを用いて、異なる単子葉および双子葉植物種、非限定例としては例えばアラビドプシス、タバコ、ペチュニア、トマト、ジャガイモ、豆、米および小麦の根、プロトプラスト、葉等からなるいくつかの植物組織を形質転換できる。より一般的には好ましくは農業、木の栽培、園芸における目的の植物種に属するか、または医薬品、生化学製品、抗生物質、または香料の製造に適用される植物種に属するいずれかの単子葉または双子葉植物種でよい。かかる植物には穀物、根植物、油産生植物、木材産生植物、農業用植物、果実産生植物、かいばまたはまぐさ豆果、コンパニオン・プランツまたは園芸植物などがある。かかる植物にはさらにアプリコット、アーティチョーク、アスパラガス、リンゴ、バナナ、大麦、ブロッコリー、芽キャベツ、キャベツ、カノーラ、ニンジン、カッサバ、カリフラワー、セロリ、チェリー、チコリ、マリファナ、綿、米松、モミ(アビエス(Abies)およびピセア(Picea)種)、亜麻、ニンニク、ブドウ、ケール、レンズマメ、トウモロコシ、オーク、カラスムギ、脂肪種子ナタネ、オクラ、タマネギ、西洋ナシ、トウガラシ、ポプラ、ライ麦、モロコシ、大豆、カボチャ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリなどがある。
【0094】
本発明による該T−DNAベクターをフラワー・ディップ形質転換法(CloughおよびBent(1998))と、または植物茎頂形質転換法(in planta apical shoot transformation procedure)(国際公開公報第99/14348号)と組み合わせて使用することもできる。本発明による該T−DNAベクターを用いて酵母、カビなどのその他の真核細胞および糸状菌並びにそれに由来する分生子、菌糸またはプロトプラストを形質転換できる。該その他の真核細胞のアグロバクテリウム媒介形質転換は当業者に公知である(例えば国際公開公報第98/45455号)。本発明のいずれかのT−DNA形質転換ベクターのアグロバクテリウム媒介転移またはアグロリスティック転移により形質転換された真核細胞の重要な特徴はT−DNA配列の組換え頻度に大きく影響せずにベクターバックボーン配列の組換え頻度を著明に低下させることである。
【0095】
本発明の好ましい態様は本発明のいずれかのT−DNA形質転換ベクターアグロバクテリウム媒介転移またはアグロリスティック転移のいずれかの方法により得られるトランスジェニック植物からなる。本発明のいずれかのT−DNA形質転換ベクターのアグロバクテリウム媒介転移またはアグロスティック転移のいずれかの方法の後、いずれかの方法により得られるまたは再生されるトランスジェニック植物もまた含まれる。かかる植物はゲノムにT−DNAを含有するがベクターバックボーン配列は含有しないという特徴を有する。さらに該トランスジェニック植物の子孫およびそれに由来する、すなわち該トランスジェニック植物細胞に由来する細胞、プロトプラスト、カルス、組織、器官、種子、果実、花粉、卵細胞、接合子、接合子胚または体細胞胚が含まれる。
【0096】
遺伝子治療において本発明によるT−DNA担持ベクターを用いるための可能性を以下のように説明できる。VirD2−ssDNA−VirE2からなるインビトロで再構成された複合体はssDNAを無傷で哺乳動物核に転移させることができると記載されている(Ziemienowiczら(1999))。
【0097】
VirD2はssDNAの5’末端に共有結合(Durrenbergerら(1989)、YoungおよびNester(1988))し、2つの核局在配列(NLS)の手段により、ssDNAを植物細胞核に対して標的化する(Narasimhuluら(1996)、Rossiら(1993)、Shurvintonら(1992))ので、ヌクレオチド鎖分解に対してssDNAを保護する。さらにVirD2は宿主ゲノムにおけるT−DNAの効率的な組み込みに重要な「オメガ」ドメインを含有する(Narasimhuluら(1996)、Mysoreら(1998)、Tinlandら(1995))。VirD2のNLSはヒトHeLa細胞、ドロソフィラ胚およびキセノパス卵母細胞などの動物細胞において活性であることが示されている(Guralnickら(1996)、Ziemienowiczら(1999))。VirD1は哺乳動物細胞の細胞質に局在したままであるが、VirD2が関与するピギーバックメカニズムを介して核に移入できる(Ziemienowiczら(1999))。
【0098】
VirE2は内ヌクレオチド結合分解に対してssDNAを保護し、T−DNAの完全性を保護する(Gelvin(1998b)、Rossiら(1996))。VirE2タンパク質はさらにT−DNAを植物核に対して標的化するのに活発に関与する(Gelbvin(1998b))。VirE2のNLSは植物特異性であるが、VirE2 NLS内の単一のアミノ酸の位置変更によりこれらの修飾タンパク質が動物細胞の核に対して標的化される(Guralnickら(1996))。VirE2タンパク質はそれ自体で互いに相互作用するが、VirE1のVirE2との相互作用がより強力であり、VirE1はVirE2の自己相互作用を阻止する。アグロバクテリウム細胞では、VirE1はVirE2の凝集を阻止する。従ってVirE1はVirE2のシャペロンとして機能するようである(Dengら(1999))。
【0099】
Ziemienowiczら(1999)に示されるように、これらのVirタンパク質の特徴によりVirタンパク質を遺伝子治療実験の適用に関して理想的な候補物質にする。遺伝子治療における主要な問題の1つは実際に核分解および核取り込みなどの細胞内バリヤを通過するDNA分配の困難である。
【0100】
ウイルスベクターは適当な宿主においてDNA配列を発現させる遺伝子治療において科学者が使用する主要な媒体の1つである。レトロウイルスベクター(HIVおよびMMLVを含む)は組換えDNA諮問委員会(国立衛生研究所(NIH)の部門)により承認された遺伝子治療プロトコルの63%で用いられているが、一方アデノウイルスベクターはかかるプロトコルの16%で使用されている。その他のウイルスベクターにはAAV、HSVおよびワクシニアに基づくものなどがある。ウイルスベクターは遺伝子治療において絶えず新しく開発されている分野である。
【0101】
アグロバクテリウムタンパク質VirD1、VirD2およびVirE2(および実際にはVirE1)の遺伝子を動物細胞において発現できるような方法で(すなわち適合したコドン使用および適当な制御配列を含む)、好ましくは一過性で、好ましくは宿主のゲノムに該vir遺伝子が組み込まれないように、ウイルスベクターに組み込む。遺伝子治療目的で、目的の遺伝子を含有するT−DNAが同一のウイルスベクターに存在するか、または別個のウイルスベクターもしくは別の型のウイルスベクターに同時に分配される場合、次いで該T−DNAを効率よく動物細胞の核のゲノムに転移できる。しかしながら、かかる遺伝子治療計画の承認のための厳格な要件はT−DNAだけが核に転移し、いずれかその他の外来DNAは核に転移しないということである。T−DNAに属しないDNA配列の転移を防御するかまたは修復するための本発明のいずれかの修飾は、目的のDNAを分配および転移させるためのアグロバクテリウムタンパク質の使用などの遺伝子治療計画の許容性を増すために非常に価値の在るものであろう。従って、本発明のいずれかの修飾または修飾の組み合わせに従って修飾されたベクターを担持し、遺伝子治療目的で使用されるT−DNAは本発明に包含される。
【0102】
本発明による、およびLBで効率の高いニッキングが得られる修飾LBを含む、T−DNAベクターを、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、キャリヤ媒介分配および衝撃DNA注射などのその他の遺伝子治療技術において使用できる、例えばVirD2−ss−T−DNA−VirE2複合体の供給源として利用できることは当業者に明白である。例えばVirD2タンパク質を認識する抗体を用いるアフィニティクロマトグラフィーの手段により、例えばアセトシリンゴン誘導アグロバクテリウム培養または少なくともVirD1、VirD2およびVirE2タンパク質を発現する大腸菌の培養から該複合体を増やすことができる。
【0103】
本発明についてここで一般的に記載し、以下の実施例を参考にすることによりより明確に理解できようが、この実施例は単に本発明の特定の態様および具体例を説明する目的で含まれるものであり、本発明を限定することを意図するものではない。本明細書にて言及する全ての参考文献の内容は参照として本明細書に組み込まれる。
【0104】
【実施例】
実施例1
A.タリアナ(A.thaliana)(L.)ヘイン(Heynh)およびニコチアナ・タバクム(Nicotiana tabacum)(L.)の形質転換
プラスミドpK2L610(「K」T−DNAベクター;De Buckら(1998))、pSingle gus(「Ksb1」T−DNAベクター;以下参照)およびpHSB610(「Hsb」T−DNAベクター;De Buckら(1999))を植物形質転換に使用した。ベクターpSingle gus(「Ksb1」)はベクターpHSB610(「Hsb」)に類似しているが、pHSB610(「Hsb」)のPnos−hpt−3’nosフラグメントをpSingle gus(「Ksb1」)のPnos−hptll−3’nosカセットと交換する。植物形質転換の選択マーカーとしてKおよびKsb1ベクターはネオマイシンホスホトランスフェラーゼII遺伝子(nptll)を含有し、Hsbベクターはヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子(hpt)を含有する。アグロバクテリウム媒介アラビドプシス根形質転換法に従ってA.タリアナをプラスミドKおよびHsbで同時形質転換した(De Buckら(1999)、Valvekensら(1988))。アグロバクテリウム媒介アラビドプシス葉ディスク形質転換法に従ってタバコ(N.タバクム:N.tabacum)をプラスミドKsbで形質転換した(Horschら(1985))。トランスジェニック植物を適当な植物ホルモンおよび適当な選択物質を含有する培地で再生した。シリーズ1では、KおよびHsb T−DNAベクターで同時形質転換した18個のトランスジェニックA.タリアナ植物が得られた。シリーズ2では、Ksb T−DNAで形質転換した36個のN.タバクム植物が得られた。別のシリーズでは、Ksb T−DNAベクターで形質転換した26個のN.タバクム植物が得られた。
【0105】
実施例2
PCRにより評価されるベクターバックボーン配列の組み込み
PCR分析ではDNAをJonesら(1985)に記載されるようにN.タバクムの葉の素材から、およびDe Neveら(1997)に従ってA.タリアナから単離した。ベクター配列の組み込みに関してトランスジェニック植物をスクリーニングするために、異なるPCR反応を実施した。1xTaqポリメラーゼインキュベーションバッファー中、DNA(100ng)を各プライマー500ngと共にインキュベートした(Roche Diagnostics、Brussels、ベルギー)。Taqポリメラーゼ2と2分の1単位を最終容量100μLに添加した。PCRの前にサンプルを94℃で5分間加熱した。94℃で1時間変性した。57℃で2分間アニーリングを生じ、伸長反応は72℃で5分間であり、その間30サイクル行った。ベクターバックボーンの少なくとも100塩基対(表1および2の「RB100」および「LB100」)または少なくとも1000塩基対(表1および2の「LB1000」および「RB1000」)の存在が既知の大きさの診断用PCRフラグメントになるようにプライマーの組み合わせを選択した。増幅されたPCR産生物が依然植物組織に存在する夾雑アグロバクテリウム細胞に由来しないことを確認するために、各々のDNAに関して染色体A.ツメファシエンス遺伝子picAに特異的な2つのプライマーでPCR反応を実施した(Yusibovら(1994))。
【0106】
シリーズ1A.タリアナ植物はKおよびHsb T−DNAベクターで同時形質転換された18個のトランスジェニック植物を含有する。Kベクターは天然のオクトピン前後関係において各々150塩基対および255(RB)〜300(LB)塩基対の内側および外側領域を有するボーダーを含有する。Hsbベクターは外側領域のみを含有する。ベクターバックボーン配列の組み込みに関するスクリーニングにより、KおよびHsb T−DNAからのベクター配列がトランスジェニック植物の各々33%(6/18)および61%(11/18)で見出されたことが示された。1個の形質転換体においてのみベクター配列がT−DNAに結合しなかった。HsbのRB領域(6/18)およびKプラスミドのRB領域(4/18)に結合したベクターの頻度においては主要な差異は認められなかった(表1参照)。しかしながらK T−DNAよりもHsb T−DNA(11/18)のLB領域により多くのベクターが組み込まれた。全ケースで、組み込まれたT−DNAはRBでベクター配列を含有し、LBでもベクター配列が検出された。
【0107】
シリーズ2タバコ植物は36個のKsbベクターで形質転換されたトランスジェニック植物を含有する。このベクターはまた内側領域を有さないRBおよびLBを含有し、従ってHsbベクターに匹敵する。分析された形質転換体の53%(19/36)(表2参照)でベクター配列が見出された;これらはLB(8/19)のみ、右T−DNA末端(1/19)のみ、または双方の末端(10/19)に結合した。
【0108】
Ksb T−DNAを含有するタバコ形質転換体の別のシリーズでは(データは示していない)、形質転換体の81%(21/26)はLBに、61%(16/26)はRBに結合したベクター配列を含有した(データは示していない)。しかしながら驚くべきことに、RBバックボーン配列を含有するこれらの16個の形質転換体のうち、15個は組み込まれたLBベクター配列をも含有する(データは示していない)。
【0109】
まとめると、内側ボーダー配列を有さないT−DNAベクターが用いられた3つの異なるシリーズの形質転換体では、形質転換体の50%以上がベクターバックボーンDNAを含有した。右T−DNA末端にのみ結合するベクターDNAを含有する形質転換体は極わずかであった。一般に、右ボーダーに結合したベクターDNAが存在する場合、左T−DNA末端に結合したベクターDNAをも検出できた。これはとりわけ効率の悪いニッキングによる左ボーダー反復での読み合わせがベクターバックボーン配列の組み込みに寄与することを意味している。内側ボーダー領域の欠失、ベクターが由来した元来のTiプラスミドに存在する1片のT−DNAがLB反復の効率の悪いニッキングを引き起こし、これによりLBを通過する読み合わせおよび下流に位置するベクター配列の転移に至る。これに一致して、HorschおよびKlee(1986)は25塩基対の反復のみを含有するプラスミドの植物への転移の全体の率は、より大きなTi由来のボーダーフラグメントほど高くないことを観察し、これはボーダー反復を取り囲む別の配列が転移においてある役割を果たしていることを示唆している。しかしながらこれらの著者は該ベクターを使用するトランスジェニック植物におけるベクターバックボーン配列の組み込みの可能性の疑問には取り組まなかった。
【0110】
実施例3
DNAゲルブロッティングにより評価されるベクターバックボーン配列の組み込み
本質的にはManiatisら(1982)に従って、およそ0.6μgのゲノムDNAでDNAゲルブロット分析を実施した。用いた制限部位(Kpnl−Sacl)を図5Aに示す。KpnlおよびSaclで制限した後、プローブとしてKプラスミドのベクター配列を使用した。ハイブリダイゼーションおよび検出には各々非放射活性「ジーン・イメージ」ランダムプライム・ラベリングモジュールおよび「ジーン・イメージ」CDPスター・検出モジュール(Amersham、Aylesburg、英国)を使用した。
【0111】
実施例2で概要を示すように、RBおよびLB双方の領域の1つまたは双方のプラスミドの少なくとも1000塩基対のベクターバックボーンフラグメントへの結合をシリーズ1の異なる形質転換体で観察した(表1参照)。完全なバイナリーT−DNAプラスミド(T−DNA+ベクターバックボーン配列)がこれらの形質転換のゲノムに組み込まれているかどうかを決定するために、プローブとしてKベクター配列を用いてDNAゲルブロット分析を実施した。ベクター配列全体が存在する場合、KpnlおよびSaclでゲノムDNAを制限することにより、Kのおよそ8467塩基対(図5Bの矢印1)およびHsbのおよそ7066塩基対(図5Bの矢印2)のフラグメントが検出されるはずである。図3Bに示すDNAゲルブロット分析により、分析された11個の植物のうち10個で、ベクターバックボーン配列全体が植物ゲノムに組み込まれたことが示される。レーン1、2および5のサンプルは記載した実験以外の実験からの植物に由来する。これらの結果により、完全なベクター配列がしばしば植物ゲノムに組み込まれることが示唆される。
【0112】
実施例4
修飾された左ボーダーを有する最適化T−DNAベクターの構築
図2に示す型の修飾がなされた最適化バイナリーT−DNAベクターの実例を以下のように構築した。
【0113】
この実施例では、この実施例に記載される全ての最適化バイナリーT−DNAベクターはpTHW136に由来する。バイナリーベクターpTHW136は不完全な反復を形成するオクトピン型右および左ボーダーコア配列を含有し、各々pTi15955から生じたオクトピン型ボーダー外側領域により隣接している(RB外側領域の場合224塩基対、およびLB外側領域の場合268塩基対)。pTHW136のT−DNAにはGUSイントロン発現カセット(イントロン35Sターミネーターにより割り込まれた35SプロモーターGUSオープン・リーディング・フレーム)およびnptll選択マーカー遺伝子(nosプロモーター−nptllオープン・リーディング・フレーム−ocsターミネーター)が位置する。
【0114】
図2で示す型のバイナリーT−DNAベクターの実例を作るために、XbalおよびHindIIIで消化することによりpTHW136からGUSイントロン発現カセットを除去し、続いて張り出しをクレノウポリメラーゼで埋め、得られたブラント末端を再度ライゲーションした。この方法により得られたベクターをさらにp0130と称する。
【0115】
次の工程では、BamHIで消化することによりnptll選択マーカー遺伝子をp0130から除去し、続いて適合するベクターの張り出しを再度ライゲーションした。この方法により生じたバイナリーT−DNAベクターをpCDVIBと称した。このようにベクターpCDVIBはボーダー外側領域に隣接するコア配列に広がるオクトピン型LB領域を含有し、従って、図2に示すB型の構築物である。図2に示すE型の構築物を作るために、2個の長いオリゴヌクレオチド、prmCDVIB1FおよびprmCDVIB1Rを以下の配列で設計した:
【0116】
【表2】
【0117】
太字および二重下線部はNcoI部位の一部、イタリックおよび一重下線部は左ボーダーコア配列、3’末端G残基はBamHI部位の一部であり;並びに
【0118】
【表3】
【0119】
太字および二重下線部はBamHI部位の一部、イタリックおよび一重下線部は左ボーダーコア配列、3’末端C残基はNcoI部位の一部である。
【0120】
オリゴヌクレオチドprmCDVIB1FおよびprmCDVIB1Rは80ヌクレオチド離れて相補的であり、アニーリングの後その5’(prmCDVIB1Fに相対して)で5’NcoI張り出し(「CATG」)およびその3’(prmCDVIB1Fに相対して)5’BamHI張り出し(「GATC」)を有するdsDNAフラグメントを生じる。該dsDNAフラグメントはさらにprmCDVIB1Fの12〜33および46〜67ヌクレオチドに対応する2個のオクトピン型LBコア配列の縦列を含有する。双方のLBコア配列はpTi15955の天然のLBから生じた別の6塩基対により上流および下流に広がり、pTiAch5でも同様である(Gielenら(1984))。従ってLBコア配列の縦列での反復は12塩基対により分けられる。縦列に配置されたLBコア配列を有する該dsDNAフラグメントをNcoIおよびBamHIで消化したp0130のLBコア配列の上流で隣接して挿入し、pCDVB1を生じた。このようにpCDVIB1はLB外側領域に広がるオクトピン型左ボーダー領域および3個の縦列に配置されたLBコア配列を含有する。
【0121】
図2に示すA型の構築物を作るために、2個の長いオリゴヌクレオチドprmCDVIB2FおよびprmCDVIB2Rを以下の配列で設計した:
【0122】
【表4】
【0123】
太字および二重下線部はNcoI部位の一部、3’末端G残基はBamHI部位の一部であり;並びに
【0124】
【表5】
【0125】
太字および二重下線部はBamHI部位の一部、3’末端C残基はNcoI部位の一部である。
【0126】
オリゴヌクレオチドprmCDVIB2FおよびprmCDVIB2Rは112ヌクレオチド離れて相補的であり、アニーリングの後その5’(prmCDVIB1Fに相対して)で5’NcoI張り出し(「CATG」)およびその3’(prmCDVIB1Fに相対して)5’BamHI張り出し(「GATC」)を有するdsDNAフラグメントを生じる。該dsDNAフラグメントはさらにpTi15955の112塩基対の内側領域を含有する。このフラグメントをNcoIおよびBamHIで消化したp0130のLBコア配列の上流で隣接して挿入し、pCDVIB2を生じた。このようにPCDVIB2はLB外側および内側領域に埋め込まれたLBコア配列に広がるオクトピン型LB領域を含有する。
【0127】
別のT−DNAベクター構築物を図2で示すE型およびF型構築物の特徴を組み合わせた修飾LBで作った。完全なノパリン型LB領域がバイナリーT−DNAベクターpPZP200の331塩基対のBclI−EcoRIフラグメントとして得られた。このフラグメントはpTiC58から生じたノパリン型LB外側領域、LBコア配列およびLB内側領域にわたる(Gielenら(1999))。該ノパリン型LB領域をBamHI(prmCDVIB2Fに相対して、LBコア配列縦列の3’に位置する)およびEcoRIで消化したpCDVIB2のオクトピン型LB領域(縦列反復するオクトピン型LBコア配列)の上流で隣接して挿入し、pCDVIB3を生じた。このようにpCDVIB3は3個の縦列に配置されたコア配列を有する完全なオクトピン型LB領域のコピーおよび完全なノパリン型LB領域のコピーにわたるLB領域を含有する。
【0128】
全ての記載した修飾LB領域を有するT−DNAベクターの実例、すなわちpCDVIB、pCDVIB1、pCDVIB2およびpCDVIB3を目的の(複数の)遺伝子および/または(複数の)選択マーカー遺伝子を該T−DNAベクターのRBおよびLBの間に挿入するための出発点として提供する。
【0129】
ノパリンシンターゼ(nos)プロモーター(Pnos−nptll−3’ocs)の調節下のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(nptll)選択マーカー遺伝子および35Sカリフラワーモザイクウイルスプロモーター(P35S−gus−3’nos)の調節下のβ−グルクロニダーゼ(gus)発現カセットを該T−DNAベクターのRBおよびLB間に挿入した。
【0130】
nptll−gusカセットはEcoRI−AgeIフラグメントとしてpXD610プラスミドに由来した(De Looseら(1995))。このフラグメントをpCDVIB;pCDVIB1;pCDVIB2およびpCDVIB3のSalI/EcoRI部位に挿入した。適合する付着末端を得るために、オープンなAgeI−およびSalI−部位間の2個のアダプターオリゴヌクレオチドを以下の配列と共に使用した:
【0131】
【表6】
【0132】
太字はAgeI部位の一部、3’およびG残基はSalI部位の一部であり、並びに
【0133】
【表7】
【0134】
下線部はSalIの一部、A残基はAgeI部位の一部である。
【0135】
オリゴヌクレオチドNapod3およびNapod4は8ヌクレオチド離れて相補的であり、アニーリングの後その5’(Napod3に相対して)で5’AgeI張り出し(「CCGG」)およびその3’(Napod3に相対して)SalI張り出し(「TCGA」)を有するdsDNAフラグメントを生じる。得られたベクターをpCDVIB+gusnpt、pCDVIB1+gusnpt、pCDVIB2+gusnpt、pCDVIB3+gusnptと称する。
【0136】
実施例5
組み込まれた組換え部位を有する最適化T−DNAベクターの構築
図3に示す型の最適化バイナリーT−DNAベクターの実例を以下のように構築する。この実施例では最適化バイナリーT−DNAベクターはpCDVIBに由来する(実施例4参照)。
【0137】
組換え部位を導入するための1つの方法は:
1.RBの上流およびLBの下流のベクタードメインのPCR増幅のためのプライマー対の設計。該ドメインはRBの上流(例えばpCDVIBベクターバックボーン内に含まれるpVS1レプリコンのNarI部位)およびLBの下流(例えばpCDVIBベクターバックボーン内に含まれるSm/Sp抵抗性マーカーのBclI部位)の独特の制限部位を包含する。RBまたはLBに位置するかまたは近接するPCRプライマーを、これらが5’独特な制限部位、続いて右方向(FRT部位の場合、T−DNAボーダーの外側のダイレクト反復として)で組換え部位(例えばFRT部位)、および続いてボーダー外側領域の一部を含有するように設計する。得られたPCR産生物を続いて適当な酵素で消化する。
【0138】
2.アニーリングの後RBまたはLBコア配列のいずれかにわたり、ボーダーに近接して位置し、RBコア配列の下流の独特の制限部位に相補的な第2の張り出しを有する(例えばpCDVIBのScal)かまたはLBコア配列の上流の独特な制限部位に相補的である(例えばpCDVIBのNcol)(1)のプライマーの5’独特の制限部位に相補的な1つの張り出しを有するdsDNA分子を生じる相補的オリゴヌクレオチド対(実施例4に類似)の設計。
【0139】
3.(a)NarI(pVSレプリコンで)およびScaI(RBコア配列の下流)を有するpCDVIBの消化、続いて1)得られたベクターと2)欠失pCDVIBフラグメントを含み、組換え部位を導入した消化PCR産生物並びに3)アニーリングしたオリゴヌクレオチドに基づき、およびRBコア配列を再導入したdsDNAの3分子ライゲーション;
【0140】
(b)最終的にBclI(Sm/Sp抵抗性マーカー)およびNcoI(LBコア配列の上流)を有する(3a)で得られたベクターの設計、続いて1)得られたベクターと2)欠失pCDVIBフラグメントを含み、組換え部位を導入した消化PCR産生物並びに3)アニーリングしたオリゴヌクレオチドに基づき、およびLBコア配列を再導入したdsDNAの3分子ライゲーション;
からなる。
【0141】
記載した、再導入された組換え部位を有するT−DNAベクターの実例は該T−DNAベクターのRBおよびLB間で目的の(複数の)遺伝子および/または(複数の)選択マーカー遺伝子を挿入するための出発点を提供する。
【0142】
実施例6
誘導されたアグロバクテリウム培養を用いたベクターバクボーン転移頻度の予測
培養培地に対して100μMの濃度でアセトシリンゴンを添加することによりssT−DNA鎖の産生に関していずれかのT−DNAベクターを含有するアグロバクテリウム株を誘導できる(Durrenbergerら(1989))。ssT−DNA鎖の産生を以下の方法のいずれか1つを用いて分析できる(図式的な概要に関しては添付の図面を参照)。
【0143】
1.全DNAを所定のT−DNAベクターを含有するアグロバクテリウム細胞から単離する。異なるアグロバクテリウム株から単離したこのDNA約5μgの重複非変性サザンブロット(Tinlandら(1995))を2つの異なるプローブ:1つはT−DNAの一部であるDNA配列を認識し、1つは左ボーダーを隣接するベクターバックボーンの一部であるDNA配列を認識するプローブにハイブリダイズする。左ボーダーが高効率を有するようにプロセシングされているT−DNAベクターの場合、ベクターバックボーン配列を認識するプローブのハイブリダイゼーションシグナルは欠如するか、または大きく低減する。しかしながらT−DNAを認識するプローブのハイブリダイゼーションシグナルは変わらない。
【0144】
2.全DNAを所定のT−DNAベクターを含有するアグロバクテリウム細胞から単離する。1つは左ボーダーでまたはそのすぐ近くでT−DNAを切断する制限酵素で、もう1つはT−DNA配列内で切断する制限酵素で消化した、等量の全DNAを含有する2つの異なる消化物を用意する。しかしながらssT−DNA鎖は無傷のままである。特異的プライマー対を定量PCRで使用して左ボーダーの下流のT−DNAボーン配列およびベクターボーン配列を増幅する。また、左ボーダーが高効率を有するようにプロセシングされているT−DNAベクターの場合、ベクターバックボーン増幅産生物は得られないかまたは非常に少ない。しかしながらT−DNA特異的増幅産生物の量は変わらない。
【0145】
双方の型の分析では、異なるT−DNAベクターの左ボーダーのすぐ下流でさらなるGFP(緑蛍光タンパク質)発現カセットをクローン化する。このカセットは左ボーダーの下流によく知られた「ベクターバックボーン」配列を提供する。GUS発現カセットをT−DNA特異的標的として使用する。双方の発現カセットは各々GFPおよびGUSコーディング領域にイントロンを含有し、アグロバクテリウムにおける双方のマーカーの発現を防御する。
【0146】
図6では双方の実験準備を図式的に描く。黒い実線の上はT−DNAベクターを示し、ハイブリダイゼーション実験法は実線の下に示し、定量PCR研究法を示す。
【0147】
実施例7
植物細胞へのベクターバックボーン転移配列の初期分析
実施例6に概要を示し、左ボーダーの下流でさらなるGFP発現カセットを含有する構築物を、植物細胞へのベクターバックボーン転移を評価するための一過性発現アッセイにおいて使用する。この目的のために、アラビドプシス根フラグメントを本発明に従って修飾したT−DNAベクターを含有するアグロバクテリウムで形質転換する(De Buckら(1999)、Valvekensら(1988))。同時培養の3日後、根を、最初にGFPの一過性発現に関して評価し、続いてGUSの一過性発現に関して評価する。左ボーダーが高効率を有するようにプロセシングされているT−DNAベクターの場合、GFP発現のレベルは低いかまたはゼロである。しかしながらGUS活性のレベルは変わらない。
【0148】
または、一過性に蓄積されたGFPおよびGUS転写物のレベルを検出および定量するためにPCRに次いで逆転写の手順を続ける(Narasihuluら(1996))。また、左ボーダーが高効率を有するようにプロセシングされているT−DNAベクターの場合、GFP特異的増幅産生物は得られないかまたは非常に少ない。しかしながらGUS特異的増幅産生物の量は変わらない。
【0149】
実施例8
ベクターバックボーン配列が組み込まれた形質転換植物の修復
植物(例えばアラビドプシス)をFRT組換え部位を含有する実施例5のT−DNAベクターの実例で形質転換する(実施例1参照)。再生した植物を実施例2〜3または6〜7に記載した方法のいずれかに従ってベクターバックボーンの組み込みに関して試験し、そのゲノムにT−DNAおよびベクターバックボーンを含有するトランスジェニック植物を選択する。
【0150】
開花時に、選択したトランスジェニック植物の1セットを、FLP部位特異的リコンビナーゼを構成的に発現する別のトランスジェニク植物に由来する花粉で交雑受粉させ、一方選択したトランスジェニック植物の第2のセットを野生型植物に由来する花粉で交雑受粉させる。種子を収集し、選択物質を含有する培地に播種する。双方の交雑で生存した植物(T−DNAの選択マーカーによる)を再度T−DNAの存在およびベクターバックボーンの存在に関して分析する。FLPを発現する親が関与し、T−DNAを含有する交雑の子孫の大部分では、ベクターバックボーン配列が除去されている。野生型の親が関与し、T−DNAを含有する交雑の子孫では、ベクターバックボーン配列が依然存在する。
【0151】
実施例9
virD遺伝子座のクローニングおよびベクターバックボーン転移に及ぼす遺伝子座の余分なコピーの影響
オクトピン型およびノパリン型virD遺伝子座の配列は公知である(各々Yanofskyら(1986)、Jayaswalら(1987);およびWangら(1990))。完全なvirD遺伝子座のPCR増幅を可能にする特異的プライマーを設計する。これらの遺伝子座を続いてP15aレプリコン(ChangおよびCohen(1987))およびpAlterに由来するテトラサイクリン抵抗性マーカー(Promega)を担持するプラスミドにサブクローニングする。続いてプラスミドをT−DNAベクターを含有するアグロバクテリウムに移動させる。実施例2、3、5または6に記載の方法に従って、該アグロバクテリウム株によるベクターバックボーン配列の転移を分析する。
【0152】
実施例10
左ボーダーでの転移の開始頻度の決定
植物を図2に記載するT−DNAベクターで形質転換する。全DNAを準備し、3つのプライマーセットを合成して異なるPCR反応を実施する。第1のプライマーセットは左ボーダー反復に隣接するT−DNA内側フラグメントを増幅する(PCRフラグメント1)。第2のプライマーセットはT−DNA左ボーダー領域にわたるT−DNA/ベクターフラグメントおよび左ボーダー反復に隣接するベクター領域を増幅する(PCRフラグメント2)。最後に、第3のプライマーセットは左ボーダー反復に隣接するベクターフラグメントを増幅する(PCRフラグメント3)。ベクター転移が左ボーダーでの読み合わせの結果であるのかまたは左ボーダーでの開始の結果であるのかに依存して、異なるPCRフラグメントが増幅される。PCRフラグメント1のみが存在する場合、T−DNA転移は右ボーダーで出発し、左ボーダーで停止し、ベクターDNAは転移しなかった。PCRフラグメント1、2および3が存在する場合、T−DNA転移は右ボーダーで出発するが、左ボーダーで停止しなかった。PCRフラグメント1および3が存在するが、フラグメント2は存在しない場合、右ボーダーからのT−DNA転移とは独立して、ベクター転移は左ボーダーで出発した。このようにおよそ50個の形質転換体に関してこれらの異なるPCR反応を実施し、左ボーダーでの読み合わせ頻度および左ボーダー反復での開始頻度を得る。読み合わせおよびベクター転移の開始の頻度を異なる前後関係で左ボーダー反復を有する異なるT−DNAベクターに関して決定する。
【0153】
表1
KおよびHsb T−DNAベクターで同時形質転換したトランスジェニック植物A.タリアナのT−DNAのLBおよびRBに結合するベクター配列の存在(+)または不在(−)
【0154】
【表8】
【0155】
表2
Ksb T−DNAベクターで形質転換したトランスジェニック植物N.タバクムのT−DNAのLBおよびRBに結合するベクター配列の存在(+)または不在(−)
【0156】
【表9】
【0157】
【表10】
【図面の簡単な説明】
【図1】 実施例1〜3に記載および使用のKおよびHsb T−DNAベクターの左および右ボーダーコア不完全反復の周囲(含まれない)の100塩基対のブロックあたりのA−およびT−残基(ベクターを示す水平線の上および下に示す)のパーセンテージを図式的に示す。
【図2】 ボーダー内側領域を欠く右ボーダーと共に修飾された左ボーダーでのニッキング効率を評価するために設計されたT−DNA構築物を図式的に示す。Gus:β−グルクロニダーゼコーディング配列;nptll:ネオマイシンホスホトランスフェラーゼIIコーディング配列;3’ocs:オクトピンシンターゼ遺伝子の3’ターミネーター;Pnos:ノパリンシンターゼ遺伝子のプロモーター;3’nos:ノパリンシンターゼ遺伝子の3’ターミネーター;P35S:カリフラワーモザイクウイルスの構成性35S RNAプロモーター。
【図3】 真核細胞のゲノムに組み込まれたベクターバックボーン配列を修復できるように設計されたT−DNA構築物を図式的に示す。LB:左ボーダー;RB:右ボーダー。
【図4】 本発明による修飾の組み合わせを特色とするT−DNA構築物の実例を図式的に示す。LB:左ボーダー;RB:右ボーダー;modLB:修飾された左ボーダー(可能な修飾に関しては図2参照)。
【図5】 (A)DNAゲルブロット分析で使用した消化物およびプローブを図式的に示す(比例的に拡大して描いてはいない)。各々の植物ゲノムDNAサンプルおよび陽性対照として用いられたプラスミドをKpnlおよびSaclで消化し、双方をLBおよびRBの外側でベクターバックボーンを切断した。プローブとして、斜線入りのバーで示すKプラスミドのベクター配列をKpnlおよびSaclでの制限の後に使用した。
(B)DNAゲルブロット分析。少なくとも1000塩基対のベクターバックボーンがトランスジェニック植物のPCR分析により見出されるT−DNAベクターを各レーンの上部に示す。Kプラスミド(K1およびK2はT−DNAで異なる構造遺伝子を担持するが、なお同一である)の全ベクターバックボーン配列が組み込まれた場合には、8476塩基対のフラグメント(矢印1)が観察され、一方Hsbプラスミドの全ベクターバックボーン配列が組み込まれた場合には、7066塩基対のフラグメント(矢印2)が検出される。KおよびHsb T−DNAプラスミドについては実施例1に記載される。
レーン1、2および5のゲノムDNAサンプルは記載した以外の実験からの植物に由来する。
レーンC:形質転換されていないA.タリアナ(A.thaliana)のゲノムDNA。
プラスミドレーン:KpnlおよびSaclで消化された、示されたプラスミドの純粋なDNAを含有する。
【図6】 実施例6の実験準備を図式的に描く。黒い実線の上はT−DNAベクターを示し、ハイブリダイゼーション実験法は実線の下に示し、定量PCR研究法を示す。
Claims (25)
- 修飾された左および右T−DNAボーダーのみを有するT−DNAを含むT−DNA形質転換ベクターであって、
修飾された右T−DNAボーダーが、右ボーダー外側領域により外側で隣接された右ボーダーコア配列からなる右T−DNAボーダーであり、そして
修飾された左T−DNAボーダーが、
(i)左ボーダーコア配列、または
( ii )左ボーダーコア配列と左ボーダー内側領域
からなる左T−DNAボーダーである
ことを特徴とする、T−DNA形質転換ベクター。 - 修飾された左T−DNAボーダーが、ノパリン型T−DNA左ボーダーとオクトピン型T−DNA左ボーダーを含有する左T−DNAボーダーの反復からなる左T−DNAボーダーである、請求項1記載のT−DNA形質転換ベクター。
- 修飾左T−DNAボーダーが、オクトピン型左ボーダーに隣接しその下流または上流にあるノパリン型左ボーダーを含有する左T−DNAボーダーの反復からなる左T−DNAボーダーである、請求項2記載のT−DNA形質転換ベクター。
- 修飾左T−DNAボーダーが、左ボーダーコア配列の下流で組換え部位をさらに含み、そして、修飾右T−DNAボーダーが、右ボーダーコア配列の上流で組換え部位をさらに含み、該組換え部位が反復として構成されていることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項記載のT−DNA形質転換ベクター。
- さらに、右ボーダー外側領域の上流でかつ修飾右T−DNAボーダーの組換え部位の下流で請求項1〜3いずれか1項記載の修飾左T−DNAボーダーの第2のコピーを含む、請求項4記載のT−DNA形質転換ベクター。
- 修飾左T−DNAボーダーの第2のコピーが、修飾右T−DNAボーダーの右ボーダー外側領域に隣接している、請求項5記載のT−DNA形質転換ベクター。
- さらに、修飾左T−DNAボーダーの左ボーダーコア配列の下流の組換え部位の下流に位置するリコンビナーゼ遺伝子を含む、請求項4記載のT−DNA形質転換ベクター。
- リコンビナーゼ遺伝子が、修飾左T−DNAボーダーの組換え部位の反復に隣接しており、さらに該組換え部位に隣接した該リコンビナーゼ遺伝子の下流に位置する請求項1〜3いずれか1項記載の修飾左T−DNAボーダーの第2のコピーを含む、請求項7記載のT−DNA形質転換ベクター。
- さらに、修飾左T−DNAボーダーの第2のコピーの左ボーダーコア配列の下流および上流に反復として構成されたさらなる組換え部位を含む、請求項8記載のT−DNA形質転換ベクター。
- 各々、反復として構成された組換え部位が直列反復として構成された部位特異的組換え部位か、または逆反復として構成されたトランスポゾンボーダー配列のいずれかとして定義され;リコンビナーゼ遺伝子が部位特異的リコンビナーゼかまたはトランスポザーゼ遺伝子のいずれかとして定義される、請求項4〜9のいずれか1項記載のT−DNA形質転換ベクター。
- 請求項1〜10のいずれか1項で定義された修飾された左および右T−DNAボーダーのみを含む、遺伝子治療の目的のアグロリスティック形質転換のためのアグロバクテリウム媒介形質転換のためのベクターであって、該ベクターが、アグロリスティック形質転換または遺伝子治療に使用されるバイナリー形質転換ベクター、スーパーバイナリー形質転換ベクター、同時組み込み形質転換ベクター、Ri−由来の形質転換ベクターおよびT−DNA担持ベクターから選択される、ベクター。
- 請求項1〜11のいずれか1項記載のT−DNA形質転換ベクターを用いる植物、酵母、カビまたは糸状菌のアグロバクテリウム媒介形質転換からなるトランスジェニック植物、酵母、カビまたは糸状菌を得る方法。
- トランスジェニック植物、酵母、カビまたは糸状菌を得る方法であって、請求項4〜6のいずれか1項で定義されるT−DNA形質転換ベクターでの植物、酵母、カビまたは糸状菌のアグロバクテリウム媒介形質転換に、該ベクターから生じる可能性のある組み込まれたベクターバックボーン配列から得られた形質転換細胞を修復するためにリコンビナーゼまたはトランスポザーゼの供給を組み合わせてなる方法。
- トランスジェニック植物、酵母、カビまたは糸状菌を得る方法であって、請求項7〜9のいずれか1項で定義されるT−DNA形質転換ベクターを用いる植物、酵母、カビまたは糸状菌のアグロバクテリウム媒介形質転換からなる、ベクターから生じる可能性のある組み込まれたベクターバックボーン配列から得られた該形質転換細胞を修復するための方法。
- さらに、リコンビナーゼまたはトランスポザーゼの供給を組み合わせてなる、請求項14記載の方法。
- アグロバクテリウム媒介形質転換細胞におけるベクターバックボーン配列の組み込みを防御する方法であって、T−DNAニッキング複合体内に含まれるVirD1および/またはVirD2タンパク質の産生を増加させることにより、請求項1〜11のいずれか1項記載のT−DNA形質転換ベクターを含む、T−DNA形質転換ベクターの左ボーダーコア配列でニッキング効率を増強することを含む方法。
- アグロバクテリウムのゲノムまたは染色体外実体にvirD遺伝子座の追加のコピーを組み込むことを含む、請求項16記載の方法。
- virD遺伝子座の追加のコピーが、オクトピン型virD遺伝子座またはノパリン型virD遺伝子座から選択される、請求項17記載の方法。
- さらに請求項16〜18のいずれか1項記載の方法を用いて、T−DNAニッキング複合体内に含まれるVirD1および/またはVirD2タンパク質の産生を増加させることを含む、請求項12〜14のいずれか1項記載の方法。
- 請求項1〜11のいずれか1項記載のT−DNA形質転換ベクターを用いる、真核細胞のアグロリスティック基盤の形質転換の方法。
- 請求項1〜11のいずれか1項記載のT−DNA形質転換ベクターのいずれかの使用を含む、遺伝子治療方法であって、ヒトのための遺伝子治療方法を除く、方法。
- 請求項1〜11のいずれか1項で定義されるいずれかのT−DNA形質転換ベクターを含有する、組換え宿主細胞。
- アグロバクテリウム・ツメファシエンスであると同定される、請求項22記載の宿主細胞。
- 請求項12〜20のいずれか1項記載のアグロバクテリウム媒介形質転換法により得ることができるトランスジェニック植物細胞または植物、その一部、またはその子孫。
- 請求項12〜20のいずれか1項記載のアグロバクテリウム媒介形質転換法により得ることができる、トランスジェニック酵母、カビまたは糸状菌。
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