JP4049393B2 - 共焦点顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は共焦点顕微鏡に関し、更に詳細には、実時間（リアルタイム）で結像を行うことができる共焦点顕微鏡に関する。
共焦点顕微鏡は約１５年前に開発され、空間解像度及び深度弁別が大きいといった、別の顕微鏡では得られない利点を提供することが示された。トニー・ウィルソンがアカデミックプレス誌（１９９０年）に発表した「共焦点顕微鏡」に記載されている共焦点顕微鏡と同様の周知の反射型共焦点走査顕微鏡の概略ダイヤグラムを第１図に示す。この顕微鏡はレーザー光源１を有し、この光源から発せられたレーザー光線はレンズ２を通過し、回折限界点の光を発生する。回折限界点光は、走査を受ける対象物３から反射され、反射光は４で取り出され、光検出器５に通される。対象物３上の走査を受ける点の各々について、反射光の強さを光検出器５によって別々に計測する。次いで、光検出器５が発生した信号を使用し、走査した光の点と同期して走査されるテレビスクリーン６の輝度変調を行う。上文中に説明した共焦点顕微鏡システム等の周知の共焦点顕微鏡システムは、輝度が非常に高い光源を必要とするという欠点がある。これにより、通常は、レーザーを使用することが必要とされる。更に、顕微鏡が光の点を対象物に亘って走査することによって結像するため、実時間結像を行うことは容易でなかった。
上文中に説明した共焦点顕微鏡で得られる光学的セクショニング（optical sectioning）及び横方向解像度は、光源平面内の特定の位置から発せられた光だけが検出器平面内の等価の位置で検出されるように配置された照光システム及び結像システムにより向上する。数学的用語では、これは、光源の分布と検出器の分布とがデルタ相関している（delta correlated）と説明され、多くの周知の共焦点顕微鏡では、単一点光源及び点検出器を使用することによって得られる。
多点光源及び検出器を使用する別の態様の周知の共焦点システムでは、拡大された光源を、通常は交互のアルキメデスの螺旋をなして配置されたピンホールからなるアレイを含む回転ディスクとともに使用する。隣接したピンホール間のクロストークをなくすため、ピンホールは大きく間隔が隔てられていおり、このため、光線供給量（light budget）が極めて小さくなる。一般的には、周知の共焦点システムでは、光源の分布と検出器の分布との間が正確にデルタ相関するようにシステムが設計されており、そのためこのシステムで可能な光線供給量が本質的に制限されるという欠点がある。
本発明は、周知の共焦点顕微鏡に関する上述の欠点を解決すると同時に光学的セクショニング及び横方向解像度の利点を保持しようとするものであり、光線供給量を大幅に改善した実時間（リアルタイム）で結像を行うことができる共焦点顕微鏡を提供しようとするものである。
本発明は、結像されるべき試料に光を差し向けるための手段と、前記試料に入射する光をエンコード（コード化又は符号化）し、これと同時に前記試料の前記複数の領域からの光をデコード（復号）することによって試料の共焦点画像を発生し、これを非共焦点画像に重ねるための少なくとも一つのマスクと、前記試料からのデコードされた光を検出するための手段とを有する、共焦点顕微鏡を提供する。理想的には、検出された光から共焦点画像を分離するための手段が更に設けられている。
かくして、本発明によれば、光源及び検出器マスクを実質的にデルタ相関させるという必要条件がもはや適用されず、及び従って、光効率が大きなマスクを周知の共焦点システムと比較して使用できる。更に、共焦点画像が共焦点画像の複数の領域、好ましくは全ての領域に同時に形成され、試料の実時間共焦点結像を行うことができる。
好ましくは、利用可能な光線供給量を最大にするため、非共焦点画像は、実質的に普通の画像である。しかしながら、非共焦点画像には、ピンぼけ画像及び他の人為的画像結果（imaging artefacts）が含まれる。
好ましくは、共焦点顕微鏡は、反射型顕微鏡であり、結像されるべき試料に入射する光をエンコード（コード化又は符号化）し、試料からの光をデコード（復号）するための単一のマスクが設けられている。別の態様では、共焦点顕微鏡は透過型顕微鏡であり、二つの別々の焦合マスク（matched mask）が設けられている。
第１実施例では、マスクは入射光及び反射光のコード化及びデコード（復号）を行うようにプログラムされた少なくとも一つの空間光モジュレータ（spatial light modulator）の形態である。この空間光モジュレータは、入射光の所定の輝度変調及び偏光変調を行うように構成されている。別の態様では、マスクは、入射光の少なくとも一つの特性を様々に変化させることができる複数の所定の部分を持つ少なくとも一つの回転ディスクの形態である。これらの所定の部分は、入射光の強さ、位相、又は偏光を変化させることができ、又はこれらの任意の組み合わせを行うことができる。
試料からの光を検出し、共焦点画像を分離するための手段は、プログラムされたコンピューターに接続された光検出器からなるアレイの形態をなしている。入射光の偏光をエンコード（コード化又は符号化）する別の態様では、一つ又はそれ以上の光検出器アレイ又は他のカメラ装置と組み合わせた偏光ビームスプリッターによって共焦点画像を取り出すことができる。
好ましくは、マスクは、有限長二元時間シーケンス（finite length binary time sequence）を使用して、試料に入射した光をエンコード（コード化又は符号化）する。この場合、検出された画像をシーケンスの有限の長さに亘って平均化することによって、共焦点画像と非共焦点画像の合成画像が得られる。
本発明の実施例を添付図面を参照した以下に例として説明する。
第１図は、周知の共焦点顕微鏡の概略ダイヤグラムであり、
第２図は、本発明による第１共焦点顕微鏡の透過モードでの概略ダイヤグラムであり、
第３図は、本発明による第２共焦点顕微鏡の反射モードでの概略ダイヤグラムであり、
第４図は、本発明による共焦点顕微鏡で使用するためのシャドーマスクの一実施例の概略図であり、
第５図は、本発明による共焦点システムを備えた従来の顕微鏡のダイヤグラムである。
第２図に示す共焦点顕微鏡は、光源１０、光源マスク１１、及び結像されるべき試料１３の反対側にある検出器マスク１２、及び検出器マスク１２の裏側にあるＣＣＤカメラ１４を含む。光源１０は、光源マスク１１を照光し、この光源マスク１１は、光源マスク１１と試料１３との間に配置されたレンズシステム１５によって試料上に像を結ぶ。試料１３と検出器マスク１２との間に配置されたレンズシステム１６は、試料の像を検出器マスク１２上に結ぶ。カメラ１４は、検出器マスク１２を結像する。共焦点顕微鏡が第３図に示すように反射モードにある場合には、光源マスク１１及び検出器マスク１２を、一枚のシャドーマスク（aperture mask）１７及び反射光をカメラ１４に差し向けるために光源１０とシャドーマスク１７との間に位置決めされたビームスプリッター１８に代える。
第３図のシャドーマスク１７を参照すると、このマスクには、各検出器ピクセルがその対応する光源ピクセルに対して照合フィルタとして作用するように、所定のパターンがエンコードされている。このようにして、光源の分布と検出器の分布との間で所望の相関を得ることができる。これにより、適当な光源ピクセルエンコード技術及び検出器ピクセルデコード技術を使用できる場合、全画像の平行処理を行うことができる。例えば、各光源ピクセルは、独特の時間シーケンスで変調でき、この同じシーケンスは、検出器の照合フィルタ用の基準信号として使用される。理想的には、各ピクセルに提供されたシーケンスの、任意の他のピクセルに提供されたシーケンスに関する相互相関はゼロでなければならず、各ピクセルについて独立ランダム二元シーケンス（independent random binary sequence）を使用することによってこれに近付けられる。時間シフト相補的ゴレイシーケンス（time-shifted complementary Golay sequence）のような相互相関がゼロの有限長シーケンスからなる組が存在するが、組中のシーケンスの数はシーケンスの長さに合わせて制限される。間隔が隔てられたピクセル間でのクロストークが実際には起こり難いため、隣接したピクセルに対して相互相関がゼロであるという必要条件が満たされている場合には、シャドーマスク中のピクセルの数と等しいシーケンス長を使用するのでなく、比較的短いシーケンス長を使用するのがよい。輝度変調を使用する場合、光学的に再現できない負の数を含むシーケンスとして使用されるシーケンスにｄｃシフトを導入しなければならない。このｄｃシフトにより、共焦点顕微鏡の検出器が発生する画像は、普通の画像及び共焦点画像の合成となる。画像処理後、共焦点画像を実時間（リアルタイム）で電子的に分離できる。しかしながら、画像を眼で直接的に見る場合には、シーケンスが眼が応答できるよりも速い場合、合成画像を見ることになる。
使用できるシャドーマスクの種類の一例は、空間光変調器（ＳＬＭ）である。ＳＬＭはピクセルのアレイからなり、各ピクセルに個々にアドレスできる。ＳＬＭを使用することによって得られる利点の一つは、フレーム速度が速く、これにより実時間結像が可能であるということである。ＳＬＭの一つの特定の実施例は、強誘電性液晶装置（ＦＬＣＳＬＭ）からなり、この装置では、ＳＬＭの各ピクセルは、その光軸の二つの配向間でＳＬＭの平面内で切り換えることができる複屈折防止プレートとして役立つ。
一つの安定状態にあるＦＬＣＳＬＭの対応する光軸に沿って整合した直交した偏光フィルタ間にＦＬＣＳＬＭを配置した場合には、ＦＬＣＳＬＭを輝度変調器として使用できる。この構成により、ＦＬＣＳＬＭの個々にアドレスできるピクセルの各々は、ＦＬＣＳＬＭの１つの状態では光を通し、ＦＬＣＳＬＭの別の状態では不透明であり、このようにして、ＦＬＣＳＬＭはプログラム可能な空間輝度変調器として作用する。しかしながら、これには、不透明のピクセル中での減衰により光が失われるという欠点がある。
直交した偏光フィルタを偏光ビームスプリッター及び１／４波長板に代えた別の構成のＦＬＣＳＬＭでは、ＦＬＣＳＬＭへの入射光は、ＦＬＣＳＬＭの二つの状態の主軸の二等分線に沿って直線偏光され、これによって、ＦＬＣＳＬＭは、偏光変調器として機能する。この結果、一つのピクセルを通って試料に行き、試料から同じピクセルを通って戻る光にはその偏光に変化が加わえられるが、試料からの反射時に、試料に行くときのピクセルの状態と異なる状態のピクセルを通過した光の偏光には変化が全く及ぼされない。これにより、偏光ビームスプリッターは、試料に行くときと試料から戻るときに異なるピクセルを通過する光を排除する。従って、偏光ビームスプリッターの後側に位置決めされたカメラは、試料に行くときと試料から戻るときに同じピクセルを通過する光だけを整合する。更に、このカメラは、試料に行くときに通過したピクセルと同じ状態の別のピクセルを通過した試料から戻る光を整合する。これにより、普通の画像が共焦点画像に重ねられる。上文中で言及したように、普通の画像を合成画像から電子的に差し引き、試料の純粋な共焦点画像を形成する。しかしながら、偏光ビームスプリッターによって排除された光を使用して画像を形成した場合、画像の共焦点部分のコントラストが逆転する。従って、偏光ビームスプリッターの両出力で得られた画像を差し引くだけで共焦点画像を実時間で得ることができる。偏光を用いた方法には、ＦＬＣＳＬＭが輝度変調器として構成された装置におけるよりも失われる光が少ないという利点がある。
ＳＬＭの別の変形例は、デジタル式マイクロミラー装置（ＤＭＤ）である。この装置は、非常に小さなミラーからなる大規模なアレイからなり、各ミラーは、入射光ビームの変向（deflection）を制御するために個々にアドレスできる。ＤＭＤは、反射モードのＳＬＭとして使用するのに特に適しており、この場合、個々のミラーの配向は、ＦＬＣＳＬＭに関して上文中に説明したのと同様の方法でエンコードされる。
ＳＬＭの代わりにシャドーマスクを回転ディスクの形態にしてもよい。回転ディスクには、シーケンスコード即ち変調コードを写真平版によって設けることができる。共焦点顕微鏡で使用するための適当なマスクの一例を第４図に示す。共焦点画像から普通の画像を差し引くのに必要であるように、普通の画像を提供するため、ディスクにはブランクセクタが設けられている。この場合、カメラ及び電子装置は、差し引くことを行うことができるように、ディスクの回転と同期させる。第４図に示す回転ディスクは、エンコードを行うための輝度変調を使用するが、別の変形例では、回転ディスクは、偏光変調を行うように構成されているのがよい。
上述のブランクセクタがディスクに設けられていない場合には、発生された画像は共焦点画像と普通の画像とを合成した画像であり、元来の画像に明るい領域が重なっているように見える。ブランクセクタが設けられていないということは、前の例におけるように適当な同期によって普通の画像を選択的に取り出すことができないということを意味する。この画像は、問題の特定の領域を確認するために試料の周りで案内する上で特に有用である。この場合、画像は、共焦点画像を取り出さずに合成形態で使用される。
第４図に示す変調コードパターンの代わりに、例えば、チェッカーボードや等間隔の均等な線等の形態の規則的な密に詰まったパターンをディスクにエンコードできる。この場合には、ディスクを非コヒーレント光で照光すると、合成された非共焦点画像及び共焦点画像が得られ、ここから上文中に説明した方法で共焦点画像を取り出すことができる。別の態様では、螢光結像を行う場合にコヒーレント照光を使用できる。
二つの画像を単に差し引く代わりに、単一のカメラからの画像が偶数の線上の普通の画像Ｉ₀、及び奇数の線上の普通の画像と共焦点画像との合成Ｉ₀＋Ｉ_Cからなる別の方法を使用して共焦点画像を再現できる。この画像は、以下の等式に示すように記述できる。この式では、Ｓは奇数の線に対して＋１の値を有し、偶数の線に対して−１の値を有する。
Ｉ＝Ｉ₀＋Ｉ_C（１＋Ｓ）／２
画像ＩにＳを乗じると、
ＩＳ＝Ｉ_C／２＋Ｉ_CＳ／２＋Ｉ₀Ｓ
この画像は、キャリヤＳ上で重ねられた共焦点画像と、普通の画像と合成した共焦点画像との混合からなる。キャリヤＳが、普通の画像の周波数成分がシフトした正及び負の高空間周波数成分からなるため、共焦点画像は画像ＩＳを低域フィルタにかけることによって容易に取り出すことができる。これは、実際には、高速フーリエ変換を使用することによって行われる。更に、共焦点画像を取り出した後、普通の画像を取り出すこともできる。このようにして、共焦点画像及び普通の画像の両方を同時に発生できる。
シャドーマスクの上述の実施例の他に、シャドーマスクの別のエンコード方法が考えられるということは明らかである。例えば、変形例では、個々のピクセルの波長エンコード、又は周波数変調及び復調、又は時間に従ってランダムに変動するピクセルエンコードを同じマスクを使用した照合フィルタによるデコードとともに行うことを使用できる。更に、ＣＣＤカメラに関して説明したが、上述の共焦点顕微鏡とともに別のカメラを使用してもよい。
反射モードの共焦点顕微鏡及びかくしてシャドーマスクを主に参照したが、シャドーマスクを照合源（matched source）及び検出器マスク（detector mask）に代えることにより、この装置を透過モードにする。
上文中に説明した共焦点顕微鏡では、画像品質及び光線供給量（light budget）は互いに別々である。画像品質は、コードシーケンスの複雑さ及び長さで決まり、光線供給量は、使用された変調に基づいて決定される。共焦点顕微鏡は、実時間結像を実施可能にし、これには全ての立体的作動モードが含まれる。合成画像を直接的に視認でき、第５図に示すように、従来の顕微鏡を改造して共焦点画像を所望の通りに発生することを容易に行うことができる。
第５図には、接眼レンズ２０、チューブレンズ２１、ビームスプリッター２２、対物レンズ２３、及び光源２４を含む従来の顕微鏡が示してある。この顕微鏡は、通常は、試料１３を対物レンズ２３の向こう側に置いた反射モードで使用される。この顕微鏡を共焦点顕微鏡として機能するように適合するため、共焦点アタッチメント２５をビームスプリッター２２と対物レンズ２３との間に設ける。共焦点アタッチメント２５は二つのレンズシステム２６、２７を含み、これらのレンズシステムは、共焦点画像と普通の画像の合成画像が得られるように上文中に説明したのと同様の方法でエンコードされたシャドーマスク２８の両側に一つづつ位置決めされている。
この他の利点には、レーザー光源を用いない螢光結像法で共焦点顕微鏡を使用すること、及びファスナ画像束を使用した内視鏡検査法が含まれる。

Claims (15)

1. 共焦点顕微鏡において、
   試料に光を差し向けるための手段と、前記試料の複数の領域に入射する光をエンコードすると同時に前記試料の前記複数の領域からの光をデコードし、これによって、デコードされた光が共焦点画像を発生し、この共焦点画像を非共焦点画像に重ねるための少なくとも一つの合成画像マスクと、前記試料からのデコードされた光を検出するための手段と、検出された光から前記試料の共焦点画像を分離するための取り出し手段とを有する、ことを特徴とする共焦点顕微鏡。
2. 前記少なくとも一つの合成画像マスクは、前記試料からの光をデコードし、普通の画像に重ねられた共焦点画像である合成画像を発生する、請求項１に記載の共焦点顕微鏡。
3. 前記少なくとも一つの合成画像マスクは、有限長二元シーケンスを使用して光のエンコード及びデコードを行うようになっている、請求項１又は２に記載の共焦点顕微鏡。
4. 前記取り出し手段は、検出された光をシーケンスの有限の長さに亘って平均化するための時間平均化装置を有する、請求項３に記載の共焦点顕微鏡。
5. 前記少なくとも一つの合成画像マスクは、空間光モジュレータである、請求項１乃至４のうちのいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡。
6. 前記空間光モジュレータは、デジタル式マイクロミラー装置である、請求項５に記載の共焦点顕微鏡。
7. 前記少なくとも一つの合成画像マスクは、エンコードした回転自在のディスクである、請求項１乃至４のうちのいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡。
8. 前記エンコードした回転自在のディスクは、普通の画像並びに共焦点画像を取り出すことを可能にする実質的に透明な領域を含む、請求項７に記載の共焦点顕微鏡。
9. 単一のマスクが設けられており、顕微鏡が反射モードで作動するように構成されている、請求項１乃至８のうちのいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡。
10. 少なくとも二つのマスクが設けられており、顕微鏡が透過モードで作動するように構成されている、請求項１乃至８のうちのいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡。
11. 前記少なくとも一つの合成画像マスクは、輝度変調を使用してエンコードされている、請求項１乃至１０のうちのいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡。
12. 前記少なくとも一つの合成画像マスクは、偏光変調を使用してエンコードされている、請求項１乃至１０のうちのいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡。
13. 前記少なくとも一つの合成画像マスクは、位相変調を使用してエンコードされている、請求項１乃至１０のうちのいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡。
14. デコードされた光を検出するための手段は、光検出装置のアレイからなる、請求項１乃至１３のうちのいずれか一項に記載の共焦点顕微鏡。
15. 顕微鏡アタッチメントにおいて、試料の複数の領域に入射する光をエンコードすると同時に前記試料の前記複数の領域からの光をデコードし、これによって、デコードされた光が共焦点画像を発生し、この共焦点画像を非共焦点画像に重ねるための少なくとも一つの合成画像マスクと、該マスクに光を差し向け、前記マスクから光を受け入れるための手段とを有し、前記アタッチメントは、通常の顕微鏡で実施されるようになっている、アタッチメント。

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