JP4045268B2 - 植物由来のグリコポリペプチドを含む組成物、蛋白質マルチマーおよびそれらの使用 - Google Patents
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Description
経済的理由から、遺伝子工学的に作成した単細胞微生物を使用して種々のポリペプチドを生産することが望ましい。しかし、単細胞生物および哺乳類細胞の性質が本質的に異なることから、単細胞微生物内でのポリペプチドのホールディングおよびプロセシングは、哺乳類細胞内でのホールディングおよびプロセシングと全く異なると考えられる。結果的に単細胞微生物由来の哺乳類ポリペプチドが、必ずしもうまくホールディング、またはプロセシングしてそのポリペプチドの望ましい生物学的、または生理学的活性を提供するとは限らない。
最初の外来遺伝子を発現するトランスジェニック植物は、ホーシュ(Horsch)等、Science,223:496(1984)およびデブロック(DeBlock)等、EMBO J.,31:681(1984)に述べられているアグロバクテリウム ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)ベクターを使用して生産したタバコ植物である。この研究で生産されたトランスジェニック植物は、導入されたトランスジーンにより特定の抗生物質に対して耐性となった。これらの最初のトランスジェニック植物は、植物のプロトプラスト、すなわち機械的、または酵素消化により細胞壁を除去した植物細胞に、外来遺伝子を導入することにより生産した。葉、茎および根など再生可能な植物部分に基づくトランスホーメーション法を利用することでいくつかの双子葉植物のトランスホーメーションが可能となった。マイクロインジェクション、エレクトロポレーションおよび粒子ガン技術を含む種々の遊離DNA供給システムで、トウモロコシおよび米等の単子葉植物のトランスホーメーションが可能となった。
植物細胞中での蛋白質マルチマーの発現には、同じ植物細胞内に各ポリペプチド鎖をコードする遺伝子が存在することが必要である。同一細胞内に両遺伝子を導入できる確率は、非常に低い。また、たとえこのような単一細胞のコトランスホーマントが生成しても、これから植物体が再生されなければ意味がない。
炭水化物残基を含む蛋白質マルチマー、グリコポリペプチドマルチマーは、動植物体内に存在する。植物および動物両グリコポリペプチドマルチマーは、ポリペプチドに存在するアスパラギン残基に直接結合する共通のペンタサッカライドコア、Manα1−3(Manα1−6)Manβ1−4GLcNACβ1−4GLcNAc−,を有する。コーンフェルド(Kornfeld)およびコーンフェルド(Kornfeld),Ann.Rev.Biochem.,54:631(1985)参照。
動植物のグリコポリペプチドは、存在するオリゴサッカライドのアウターブランチに直接結合する種々の末端炭化水素を含んでいる。哺乳類のグリコポリペプチドを含む動物のグリコポリペプチドは、末端炭化水素として存在するシアル酸を有している。一方、植物のグリコポリペプチドマルチマーは、それを含んでいない。スターム(Sturm)等、J.Biol.Chem.,262:13392(1987)参照。
分泌性IgAは、鎖(J鎖)と分泌要素を繋ぐ二つのIgA分子からなるグリコポリペプチドマルチマーである。IgAは、ミルク、唾液、涙、呼吸系分泌物および腸分泌物等の分泌物中に存在する主要なクラスの抗体である。
分泌性IgAは、過酷な環境による変性に対して耐性がある。この変性耐性には、IgA分子、J鎖および分泌要素を含む複合型分泌性IgA分子が、正確かつ効率的に集合することが必要である。
また、動物に対する種々の抗原特異性を有する種々の抗体を含むシアル酸含有可溶性免疫グロブリンを提供することによりその動物を受動免疫化することが出来ることが分かった。タケット(Tacket)等、New England J.Med.,318:1240(1988)およびエイブル(Eibl)等、New England J.Med.,319:1−7(1988)参照。今日まで、所定の病原に結合しうるグリコポリペプチドマルチマーカプセルを投与することにより動物を受動免疫化するという報告はない。
シアル酸を含まず、かつ所定の病原と結合しうるグリコポリペプチドマルチマーのカプセルを投与することによる受動免疫の誘導方法が発見された。
このトランスジェニック植物は、グリコシル化したコア部およびアウターブランチを含むアセチルグルコサミンを有するポリペプチドおよび免疫グロブリン分子のアミノ酸残基配列を有し、かつ検出可能なシアル酸残基を含まないグリコポリペプチドを生産する。
また、本発明は、グリコシル化したコア部分およびアウターブランチを含むN−アセチルグルコサミンを有するポリペプチドおよび免疫グロブリンのアミノ酸残基配列を含むグリコポリペプチドマルチマーで、かつ検出可能なシアル酸残基を含まず、植物細胞などのような保護コート中にカプセル化されたグリコポリペプチドマルチマーを含む生物学的に活性な組成物に関する。
双子葉植物:胚が二つの種子葉または双子葉を有する開花植物。双子葉植物には、タバコ、トマト、アルファルファを含む豆類、樫、楓、薔薇、ミント、カボチャ、ヒナギク、クルミ、サボテン、菫およびキンポウゲがある。
単子葉植物:胚が一つの子葉または種子葉を有する開花植物。単子葉植物には、ユリ、芝、トウモロコシ、オーツ麦、小麦および大麦を含む穀類、ラン、菖蒲、タマネギおよび椰子がある。
真核性ハイブリッドベクター:真核細胞にポリペプチドをコードするDNA(挿入物)を導入しうるDNA。
染色体外リボゾームDNA(rDNA):リボゾームRNAをコードする一つ以上の遺伝子を有し、かつ自分自身で複製しうる(染色体の複製とは独立に)染色体以外に存在する単細胞真核生物のDNA。
DNA:デオキシリボ核酸。
T−DNA:転移したDNAのセグメント。
rDNA:リボゾームDNA。
RNA:リボ核酸。
rRNA:リボゾームRNA。
Ti−プラスミド:腫瘍誘導プラスミド。
Ti−DNA:Ti−プラスミド由来のDNAのセグメント。
構造遺伝子:ポリペプチドをコードし、適当なプロモーター、ターミネーション配列、場合によっては他の調節DNA配列を含む正しい読み枠を有する遺伝子。
シグナル配列:ポリペプチドに結合し、小胞体への該ポリペプチドの結合および蛋白質の分泌に必要なアミノ酸配列をコードするDNA配列。
(選択的)遺伝子マーカー:トランスホームした細胞を非トランスホーム細胞から選別しうる発現型をコードするDNA配列。
プロモーター:遺伝子の発現コントロール要素で、RNAポリメラーゼが特異的にこれに結合しこの遺伝子のRNA合成(転写)を開始する一つ、または一群のDNA配列の認識部位。
ウイルスプロモーター:ウイルスの遺伝子の5’末端にあるプロモーターと実質的に同じのDNA配列を有するプロモーター。典型的プロモーターは、ハング(Huang)等、Cell,27:245(1981)に述べられているMMTVのp21蛋白質をコードする遺伝子の5’末端にある。(本明細書で引用しているすべての文献は、参考として引用している。)
合成プロモーター:生物的にではなく化学的に合成したプロモーター。通常、合成プロモーターには、RNAポリメラーゼの開始効率を至適化する配列変異を含んでいる。
構成的プロモーター:RNAポリメラーゼの結合および開始速度がほぼ一定で、比較的に外部刺激には影響されないプロモーター。構成的プロモーターの例には、ポスコフスキー(Poszkowski)等、EMBO J.,3,2719(1989)およびオデル(Odell)等、Nature,313:810(1985)に述べられているカリフラワーモザイクウイルス35Sおよび19Sプロモーターがある。
空間調節プロモーター:RNAポリメラーゼの結合および開始速度が葉、茎または根など器官の特定の構造内で調節されるプロモーター。空間調節プロモーターの例は、チュア(Chua)等、Science,244:174−181(1989)に述べられている。
空間時間調節プロモーター:RNAポリメラーゼの結合および開始速度の速度が発生の特定の時間に特定の器官で調節されるプロモーター。典型的な空間時間調節プロモーターの例には、チュア(Chua)等、Science,244:174−181(1989)に述べられているEPSPシンテースー35Sプロモーターがある。
一本鎖抗原結合蛋白質:免疫グロブリン軽鎖可変部のアミノ酸配列(VL ) のカルボキシ末端を免疫グロブリン重鎖可変部のアミノ酸配列(VH ) のアミノ末端に結合するペプチド結合でVL に繋がったVH からなるポリペプチド。
蛋白質マルチマー:一つの球状蛋白質を形成するように互いに会合する二つ以上のポリペプチドを含む球状蛋白質。
ポリペプチドおよびペプチド:隣り会うアミノ酸残基のαアミノおよびカルボキシ基間のペプチド結合により互いに連結される一連の線状アミノ酸残基。
蛋白質:ポリペプチドのように互いに連結する約50個以上の一連のアミノ酸残基。
キレート剤:金属を結合しうる化合物、ペプチド、または蛋白質、キレート剤の例には、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、エチレングリコール−ビス−(β−アミノエチルエーテル)N,N,N’,N’−四酢酸(EGTA)、2,3−ジメルカプトプロパネル−1−スルホン酸(DMPS)および2,3−ジメルカプトコハク酸(DMSA)等がある。
免疫グロブリン産物:少なくとも免疫グロブリン重鎖の免疫学的活性部を含み、特定の抗原に特異的に結合しうるポリペプチド、蛋白質または蛋白質マルチマー。代表的な免疫グロブリン産物には、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン分子、実質的免疫グロブリン分子、当分野でFabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)フラグメントおよびFV フラグメントとして知られている部分を含むパラトープを有する免疫グロブリンの一部分等がある。
免疫グロブリン分子:互いに結合する免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖の免疫学的活性部分を含み、抗原と特異的に結合しうる蛋白質マルチマー。
Fabフラグメント:互いに共有結合で結合する免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖の免疫学的活性部分を含み、特定の抗原と特異的に結合しうる免疫グロブリン分子の一部を含む蛋白質マルチマー。一般に、Fabフラグメントは、従来法を用いたパパインによる実質的免疫グロブリン分子の蛋白質分解的消化によって調製する。しかし、Fabフラグメントは、従来法により免疫グロブリン重鎖と免疫グロブリン軽鎖の目的部分を適当な宿主細胞内で発現させる事によっても調製できる。
無性増殖:葉、茎または根の断片、単一の植物細胞(プロトプラスト)およびカルスから全植物体を再生することによる子孫の生産。
グリコシル化コア部分:全てのアスパラギン結合オリゴサッカライドに共通するペンタサッカライドコア。このヘンタサッカライドコアは、Manα1−3(Manα1−6)Manβ1−46LcNACβ1−4 6ScNac(ASNアミノ酸)の構造を持つ。一般に、このペンタサッカライドは、これに結合する二つのアウターブランチを有する。
N−アセチルグルコサミン含有アウターブランチ:アスパラギン結合オリゴサッカライドのペンタサッカライド(グリコシル化コア部分)に結合する別のオリゴサッカライド。哺乳類および植物の両方に存在するアウターブランチは、マンノースのみを含むイーストのアウターブランチと対照的にN−アセチルグルコサミンを含む。哺乳類のアウターブランチは、そのアウターブランチの末端に直接結合するシル酸残基を有する。
免疫グロブリンスーパーファミリー分子:免疫グロブリンまたは免疫グロブリン関連ドメインに有意に相同的なドメインサイズおよびアミノ酸残基配列を有する分子。その相同性の有意性は、デイホフ(Dayhoff)等、Meth.Enzymol.,91:524−545(1983)に述べられているアラインプログラムのようなコンピュータプログラムを用いて統計的に決定する。3以下の典型的アラインスコアはテストした分子が免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーであることを示している。
免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーには、表Aに示された、また、ウイリアムズ(Williams)およびバークレー(Barclay)、免疫グロブリン遺伝子、p361、アカデミックスプレス、ニューヨーク,NY(1989)に報告されているものを含むいくつかの主要クラスの分子が含まれる。
免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの既知メンバー
免疫グロブリン
重鎖(IgM)
軽鎖カッパ
軽鎖ラムダ
T細胞レセプター(Tcr)複合体
Tcr α鎖
Tcr β鎖
Tcr ガンマ鎖
Tcr X鎖
CD3 ガンマ鎖
CD3 σ鎖
CD3 ε鎖
主要組織適合性複合体(MHC)抗原
クラスI H鎖
β2 −ミクログロブリン
クラスII α
クラスII β
β2 −m 関連抗原
TL H鎖
Qa−2 H鎖
CDla H鎖
Tリンパ球抗原
CD2
CD4
CD7
CD8 鎖I
CD8 鎖IId
CD28
CTLA4
造血/内皮抗原
LFA−3
MRC OX−45
脳/リンパ抗原
Thy−1
MRC OX−2
免疫グロブリンレセプター
ポリIg R
Fc ガンマ 2b/ガンマ 1R
FcεRI(α)
神経分子
神経粘着分子(MCAM)
ミエリン関連gp(MAG)
PO ミエリン蛋白質
腫瘍抗原
ガン胎児性抗原(CEA)
成長因子レセプター
血小板由来成長因子(PDGF)レセプター
コロニー活性化因子−1(CSF1)レセプター
非−細胞表面分子
α1 B−糖蛋白質
基底膜結合蛋白質
*ウイリアムズ(Williams)およびバークレー(Barclay),免疫グロブリン遺伝子、p361,アカデミックスプレス、NY(1989)および、免疫学的に興味のある蛋白質の配列、第四編、U.S.,デパートメント・オブ・ヘルス・アンド・ヒューマン・サービング(1987)参照。
酵素部位:触媒部位を含む蛋白質分子の一部分。ほとんどの酵素部位は、非常に高い選択的基質特異性を示す。一つの酵素部位は、同じポリペプチド鎖の異なるセグメント状に存在する二つ以上の酵素部位部分を含むこともある。これらの酵素部位部分が、互いに会合しより大きい酵素部位が生成する。また、酵素部位の一部が金属のこともある。
自家受粉:雄の花部分から同じ植物の雌の花部分への花粉の移動。一般に、この過程で種子が生成する。
エピトープ:免疫グロブリン産物によって特異的に認識される分子の一部分。これは、決定基または抗原決定基とも呼ばれる。
アブザイム:酵素または触媒として作用しうる免疫グロブリン分子。
酵素:触媒作用により、しばしば特異的に基質の特定の変化を促進または生成しうる蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、RNA分子、または蛋白質マルチマー。
B.蛋白質マルチマーを含むトランスジェニック植物の生成法。
本発明は、第一および第二のポリペプチドを含む蛋白質マルチマーを含む植物を生成させる新しい方法を提供する。一般にこの方法は、以下の要素を合わせ持っている。
2.第二の植物種のゲノムに、第二ポリペプチドをコードする遺伝子を挿入して第二トランスホーマントを作製する。
3.第一および第2トランスホーマントから子孫集団を生産する。
4.その集団から蛋白質マルチマーを有する子孫を単離する。
本発明で生産した植物は、生物学的機能構造を維持した形で互いに会合する第一および第二ポリペプチドを含む蛋白質マルチマーを含んでいる。本発明の一つの形態の蛋白質マルチマーは、所定のリガンドに特異的に結合し、リガンドと単離する複合体を作るためのリガンド結合部位間に十分に強い結合を有する複合体を形成するリガンド結合部位を形成するリガンド結合ポリペプチド(レセプター)である。別の態様の蛋白質マルチマーは、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を含む免疫グロブリン分子である。この免疫グロブリン重鎖および軽鎖は互いに会合し、かつ競合的に阻害される能力で証明されるように所定の抗原に特異的な抗原結合部位を有する構造を維持するこの蛋白質マルチマーが抗原結合蛋白質である場合、そのアフィニティーまたは結合性は一般に105 M-1以上、通常106 M-1以上および好ましくは108 M-1以上である。
また、別の態様のトランスジェニック植物には、少なくとも免疫グロブリン重鎖可変部の一部および少なくとも免疫グロブリン軽鎖可変部の一部を含むFvフラグメントをである蛋白質マルチマーを含む。この免疫グロブリン重鎖および軽鎖可変部は、植物細胞内で自発的に会合し、所定の抗原に特異的な結合部位を有する生物学的に活性な構造を維持する。Fvフラグメント状の抗原決定部位は、免疫グロブリン分子に存在する抗原結合部位が示すアフィニティーと同じアフィニティーを示す。
また、他の態様の蛋白質マルチマーは、基質を結合し、かつその基質からの産物の生成を触媒する酵素である。触媒性蛋白質マルチマーの基質結合部位(リガンド結合部位)のトポロジーは、おそらく基質に対するアフィニティー(会合定数またはpKa)よりも活性のほうに重要であるが、所定の基質に対するこの蛋白質マルチマーの会合定数は、103 M-1以上、通常105 M-1または106 M-1、好ましくは10M7 M-1以上である。
目的の第一ポリペプチドをコードする遺伝子を単離する方法はよく知られている。たとえば、“分子クローニング技術ガイド”,Methods In Enzymology,152巻、バーガー(Berger)およびキメル(Kimmel)編、(1987)および Current Protocols in Molecular Biology, オースベル(Ausubel)等編、ジョンウィリーアンドサンズ版、NY(1987)参照(これらの文献は、参考として引用している)。
通常、最後の注射から3−5日後、脾臓を取り出し、標準的技術を用いて脾臓中に存在する再配列B細胞から、免疫グロブリン重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を単離する。Current Protocols in Molecular Biology, オースベル(Ausbel) 等編、ジョンウィリーアンドサンズ版、NY(1987)および“抗体”,ラボラトリーマニュアル、ハーロー(Harlowe)およびレーン(Lane)編、コールドスプリングハーバー、NY(1988)参照。
免疫グロブリン産物をコードする遺伝子を単離するのに有用なプローブには、VH およびVLのフレームワーク部をコードするVHおよびVL配列の不変部をコードする配列および全再配列免疫グロブリン遺伝子の不変部に対するプローブが含まれる。これらの配列は、使用可能な情報源から入手しうる。たとえば、アーリー(Early)およびフード(Hood), Genetic Engineering,セトロー(Setlow)およびホレンダー(Hollaender)編、3巻、157−188,プレナムバプリシングコーポレーション、NY(1981);およびカバ(Kabat)等、免疫学的に重要な配列、ナショナル・インスチチュート・オブ・ヘルス、ベセスダ、MD(1987)参照。
相補的粘着末端を介してベクターにDNAを機能的に結合させる方法がいくつか開発されている。たとえば、挿入するDNAセグメントおよびベクターDNAに相補的なホモポリマートラックを付加する。ついで、その相補的ホモポリマーテール間の水素結合によりそのベクターおよびDNAセグメントを結合し、組み換えDNA分子を生成する。
ポリペプチドコード遺伝子を植物に導入する方法には、アグロバクテリウム((Agrobacterium)仲介の植物トランスホーメーション、プロトプラストトランスホーメーション、花粉への遺伝子転位、再生器官への注入、未熟胚への注入がある。これらの方法には、それぞれ長所、短所がある。特定の植物種に遺伝子を導入する特定の方法が、必ずしも別の植物に有効とは限らない。
葉、および他の組織のアグロバクテリウム(Agrobacterium)仲介トランスホーメーションは、天然でアグロバクテリウム ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)が感染する植物に限られるようである。従って、アグロバクテリウム(Agrobacterium)仲介トランスホーメーションは、双子葉植物に対してもっとも効率的な方法である。しかし、アグロバクテリウム(Agrobacterium)を用いたアスパラガスのトランスホーメーションも成功している。たとえば、バイトビア(Bytebier)等、Proc. Natl. Acad. Sci.,84:5345(1987)参照。
単一の植物プロトプラストまたは種々の植物断片からの植物の再生もよく知られている。たとえば、Methods for Plant Molecular Biology, A.ワイズバッハ(Weissbach)およびH.ワイズバッハ(Weissbach)編、アカデミックプレス、サンダィエゴ、CA(1988)参照。この再生および生育過程には、トランスホーマント細胞および新芽の選択、トランスホーマント新芽の根づけ、土壌における植物の生育のステップが含まれる。
自然に第一ポリペプチドと会合し生物学的に機能的な蛋白質マルチマーを形成しうる第二ポリペプチドをコードする遺伝子が有用である。この第二ポリペプチドをコードする遺伝子を第二植物種に導入するのに用いる方法は、遺伝子を第一の同じ植物種に導入するのに用いた方法と同じであり、先に説明した。
第一および第二トランスホーマントから子孫集団を生産するには、メンデル(Mendel)(1865)(メンデルのオリジナルペーパーの英語訳は、別の人のコメントとメンデルの書籍目録と共に、植物ハイブリダゼーション実験、エジンバラ、スコットランド、オリバー、ボイド(Olive Boyd) 編、1965に見られる)によって述べられている交配として知られている方法で行いうる。
目的の蛋白質マルチマーを含む子孫は、従来法を用いて生物学的蛋白質マルチマーの存在を検定する事により同定しうる。このような方法には、ウエスタンブロッティング、イムノアッセイ、結合検定法および生物学的蛋白質マルチマーを検出するよう設計された全ての検定法が含まれる。たとえば、免疫学:自己−非自己認識の科学、クレイン(Klein),ジョンウィリーアンドサンズ版、NY,NY(1982)参照。
スクリーニング法としては、蛋白質マルチマー上の生物学的活性部位が検出可能なシグナルを生成することにより検出される方法が好ましい。このシグナルは、直接的または間接的に生成され、たとえば、このようなシグナルには、複合体の生成、触媒反応物の生成、エネルギーの放出または取り込み等が含まれる。例えば、この方法で生産される抗体分子を含む子孫を、抗体:ラボラトリーマニュアル、ハーロー(Harlow)およびレーン(Lane)編、コールドスプリングハーバーラボラトリー,コールドスプリングハーバー、NY(1988)に述べられているイムノアッセイと同様のELISAまたはラジオイムノアッセイ等の標準的イムノアッセイにおいてその抗体が抗原に結合するように処理する。さらに、本発明の特徴には、第一および第二ポリペプチドを含む蛋白質マルチマーを生産する方法を提供することにある。一般に、この方法には、本発明の植物を培養すること、および培養により目的の蛋白質マルチマーを生産する植物を収穫することを含んでいる。
目的の第一および第二ポリペプチドからなる蛋白質マルチマーを含む本発明の植物は、良く知られている方法で培養する。本発明のトランスジェニック植物は、いずれも培養することによりそれらが含む目的の蛋白質マルチマーを単離しうる。
培養後、そのトランスジェニック植物を収穫し、生成した蛋白質マルチマーを回収する。この収穫ステップは、植物体、その葉または、その根の収穫を含む。このステップでその植物を殺してしまう場合と、そのトランスジェニック植物の一部のみを収穫する場合には、その残りの部分をさらに生育させることもできる。
(1) 前記トランスジェニック植物の少なくとも一部をホモジナイズして植物パルプを作る、
(2) 前記植物パルプから前記蛋白質マルチマーを抽出し、蛋白質マルチマー含有溶液を作る、および
(3) 前記溶液から前記蛋白質マルチマーを単離する
以上(1)−(3)のステップを含む。
従来法により、トランスジェニック植物の少なくとも一部をホモジナイズして植物パルプを調製する。このトランスジェニック植物の一部が細かく壊れ、植物パルプが生成するならこのホモジナイゼーション操作は手を使っても、機械的、または化学的手段を用いても構わない。この植物パルプはいろいろなサイズのトランスジェニック植物粒子を含んでいる。許容しうる植物粒子のサイズおよびサイズ分布は、植物パルプから蛋白質マルチマーを抽出するのに用いる方法に依存し、それらのパラメーターはよく知られている。
先に示したように生成した植物パルプから蛋白質マルチマーを抽出し、蛋白質マルチマー含有溶液を調製する。この抽出操作は、一般的なもので、当分野でよく知られているものである。たとえば、この抽出操作には、適当な溶媒中での植物パルプの浸せきが含まれる。この適当な溶媒は、植物パルプ中に存在する蛋白質マルチマーを溶解し、蛋白質マルチマー含有溶液を作りうる。この抽出操作に有用な溶媒は良く知られており、水性溶媒、有機性溶媒、およびこれらの組み合わせ物が使用される。
蛋白質単離に関する従来法を用いて、先の溶液から蛋白質マルチマーを単離する。これらの方法には、免疫アフィニティー精製および単離する蛋白質マルチマーの特定のサイズ、電気泳動移動度、生物学的活性および、または荷電に基づく精製法が含まれる。
本発明は、流体サンプルから所定のリガンドを分離する新しい方法を提供する。この方法は、以下の要素を含んでいる。
1.流体サンプルを本発明のトランスジェニック植物由来の植物細胞と混ぜて、混合物とする。
2.リガンドが植物細胞内に入り、蛋白質マルチマーに結合してその植物細胞内で複合体を生成するのに十分な時間この混合物を維持する。
3.この混合物から複合体含有植物細胞を取り出すことにより、その流体サンプルからリガンドが分離する。
流体サンプルを蛋白質マルチマーを含む本発明のトランスジェニック植物由来の植物細胞と混合する。この蛋白質マルチマーは、レセプター、酵素、免疫グロブリン産物、免疫グロブリン分子またはそのフラグメント、またはアブザイムである。当業者は、この蛋白質マルチマーが所定のリガンドを結合できなければならないことを理解できよう。流体サンプルは、液体でも気体でもよい。いずれの場合もその混合操作は、植物細胞を液体、または気体のなかに置くことを含む。また、植物細胞をその流体サンプルと完全に混合することもできる。この混合操作は、流体サンプルを植物細胞と良く接触させて混合物を調製しなければならない。
この方法で使用する植物細胞が生植物を構成しているとき、この手段はリガンドを植物内に濃縮する。リガンドが重要な栄養の場合、その細胞内に特定の栄養が濃縮され、その植物の栄養価が増加する。リガンドが環境汚染物の場合、これが植物細胞内に濃縮され環境から除去しうる。もちろん、応用する方法においてリガンドが植物細胞に入らなければならない。植物細胞に入ることが出来るリガンドは、当分野でよく知られている。
また、本発明は金属イオンを含む流体サンプルから金属イオンを分離する方法に関する。この特定の方法には、以下のステップが含まれる。
2.金属イオンがキレート剤と結合し、金属イオンキレート複合体を形成するのに十分な時間このキレート混合物を維持する。
3.金属イオンキレート複合体を本発明の植物細胞と混ぜ、結合混合物を作る。
4.金属イオンキレート複合体が植物細胞に入り、蛋白質マルチマーと結合して反応複合体を生成するのに十分な時間この結合混合物を維持する。
5.この結合混合物から反応複合体含有植物細胞を除去して、流体サンプルから金属イオンを分離する。
このキレート混合物を、金属がキレート剤と結合し金属イオンキレート複合体を生成するのに十分な時間維持する。金属イオンがキレート剤と結合するのに必要な時間は、少なくとも使用するキレート剤の種類および金属の濃度に依存する。少なくとも一つの金属イオンがキレート剤と会合し、それと結合して複合体を作るとき金属イオンキレート複合体が生成する。
この金属イオンキレート複合体を本発明の植物細胞と混合する。これらの植物細胞は、金属イオンキレート複合体を特異的に結合しうる蛋白質マルチマーを含む。たとえば、この植物細胞は、レアドン(Reardon)等、Nature, 316:265−268(1985)およびミアレス(Meares) 等、Analytical Biochemistry, 142:68−78(1984)に述べられている免疫グロブリン分子と同じ金属キレート複合体に免疫特異的な免疫グロブリンを含みうる。
本発明のトランスジェニック植物は、プロモーターに機能的に結合したポリペプチドコード遺伝子を含んでいる。有用なプロモーターは良く知られており、これには誘導可能プロモーター、ウイルスプロモーター、合成プロモーター、構成的プロモーター、時間調節プロモーター、空間調節プロモーター、および空間時間調節プロモーターが含まれる。
免疫グロブリン、または抗体分子は、IgD,IgG,IgA,IgMおよびIgEなど幾つかのタイプの分子を含む非常に大きな分子群である。一般に、抗体分子は、各々二つの重鎖(H)および軽鎖(L)からなり、その各々の鎖は可変部(V)と不変部(C)の両方を含んでいる。免疫グロブリンの幾つかの領域には、ポリメレースチェーンリアクションを用いて免疫グロブリン遺伝子を単離するのに有用な保存的配列が含まれている。免疫グロブリン分子に関する代表的保存配列を示すアミノ酸および核酸配列データは、カバット(Kabat)等、免疫学的に重要な蛋白質の配列、ナショナルインスチチゥートオブヘルス、ベセスダ、MD(1987)に編集されている。HまたはL鎖のV領域は、一般的に各々保存配列を含み比較的変化の少ない四個のフレームワーク(FR)領域(図1)を含む。VHのFR1およびFR4(J領域)フレームワーク領域由来の保存配列の使用は好ましい態様の一つであり、実施例で説明する。一般に、フレームワーク領域は、いくつか、または全ての免疫グロブリン型に保存されており、従ってそこに含まれる保存配列は、可変部の単離に特に適している。
別の好ましい態様の免疫グロブリン産物は、VHのみか、またはVLと会合したVHから成り立ちFvフラグメントを形成している。
本発明のトランスジェニック植物は蛋白質マルチマーを含んでいる。この蛋白質マルチマーは、上述の免疫グロブリン産物、酵素、特定のリガンドを結合しうるレセプター、またはアブザイムである。
本発明の酵素は、少なくとも二つのポリペプチドを含む蛋白質マルチマーである。これら二つのポリペプチドは、本発明の方法によりトランスジェニック植物に導入される遺伝子によりコードされている。有用な酵素には、アスパラギンサントランスカルバミラーゼ等がある。別の好ましい態様には、特異的リガンドを結合しうるレセプターがある。一般に、このレセプターは、本発明の方法でトランスジェニック植物に導入される遺伝子によってコードされる少なくとも二つのポリペプチドからなる。このようなレセプターおよびこれらの各リガンドには、ヘモグロビン、O2、プロテインキナーゼ、cAMP等がある。
一般的に、本発明の蛋白質マルチマーは、少なくとも二つのポリペプチドを含む。しかし、二つ以上のポリペプチドを含むこともできる。これらの各ポリペプチドは、別々のポリペプチドコード遺伝子によってコードされている。これらのポリペプチドは、ジスルフィド結合、水素結合等により互いに会合し蛋白質マルチマーを形成する。
さらに、本発明は、複合体を含むトランスジェニック植物に関する。一般に、このような複合体含有トランスジェニック植物は、流体サンプルにキレート剤を添加してキレート混合物を調製し、流体サンプル中に存在する金属がキレート剤と結合して金属キレート複合体を形成した後、この金属キレート複合体を本発明のトランスジェニック植物細胞と混合して結合混合物を生成するのに十分な時間、この混合物を維持し、さらに、この結合混合物を、金属キレート複合体が植物細胞中に入り、その植物細胞中に存在する蛋白質マルチマーと結合してその細胞内で複合体を形成するのに十分な時間維持することにより得られる。
また、本発明は、金属キレート複合体および免疫グロブリン産物を含む反応複合体を含有するトランスジェニック植物に関する。一般に、このトランスジェニック植物は、本発明の方法で作製される。
本発明は、(a)免疫グロブリンアミノ酸残基配列、および(b)コア部分、およびN−アセチルグルコサミン含有アウターブランチを含むオリゴサッカライドを有するポリペプチドを少なくとも二つ含み、しかもシアル酸残基を含まない生物学的に活性なグリコポリペプチドに関する。
好ましい態様の生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーには、免疫グロブリン、T−細胞レセプター複合体分子、主要組織適合生複合体抗原等のアミノ酸残基配列のような免疫グロブリンスーパーファミリー分子のアミノ酸残基配列が含まれる。免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン重鎖可変部、または免疫グロブリン重鎖可変部の一部のアミノ酸残基配列を含む生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーが特に好ましい。免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン軽鎖可変部、または免疫グロブリン軽鎖可変部の一部のアミノ酸残基配列を有するグリコポリペプチドマルチマーも好ましい。
別の好ましい態様のグリコポリペプチドマルチマーには、さらにこのグリコポリペプチドマルチマーに存在する免疫グロブリン分子または免疫グロブリン分子の一部に結合する免疫グロブリンJ鎖が含まれる。J鎖は、IgAおよびIgMポリマーおよびIgG,IgD,IgEなどの他の免疫グロブリンおよび他の種々のサブクラスの免疫グロブリンアイソタイプに会合するポリペプチドである。
ヒトおよびマウスのJ鎖のアミノ酸組成は、モル(Mole)等、Biochemistry, 16:3507(1977),マックス(Max)およびコースメイヤー(Korsmeyer),J. Exp. Med,. 161:832(1985),カン(Cann) 等、Proc. Natl. Acad. Sci., USA,79:6656(1982),およびコシュランド(Koshland), Annu. Rev, Immunol., 3:425(1985)に報告されている。J鎖は、酸性アミノ酸を多く含み、グリシン、スレオニン、システインは少なく、メチオニンはたった一つ含んでいる。J鎖には8個のシステイン残基が含まれており、そのうちの6個は鎖間のジスルフィド結合に関与しており、他の2個はアルファまたはミュー重鎖などの免疫グロブリン重鎖の末端から二個目のシステイン残基に結合している。メンデス(Mendez) 等、Biochm. Biophys. Res. Commun., 55:1291(1973),メステキー(Mesteckey)等、Proc. Natl. Acad. Sci., USA,71:544(1974),メステキー(Mesteckey)およびシュロヘンロハー(Schrohenloher), Nature, 249:650(1974)参照。
ヒト免疫グロブリン重鎖の構造特性
不 変 部
全 鎖
鎖 ドメイン 鎖間ブリッジ H−Lブリッジの位置
ガンマ1 4 3 220
ガンマ2 4 5 131
ガンマ3 4 12 131
ガンマ4 4 3 131
アルファ1 4 5 133
アルファ2 A2m(1) 4 4 な し
アルファ2 A2m(2) 4 5 133
ミュー 5 4 140
エプシロン 5 3 127
デルタ 4 2 128
表B(続き)
不 変 部
オリゴサッカライド 残基のおよその数
GlcN GalN ヒンジ C部
1 0 15 330
1 0 12 325
1 0 62 375
1 0 14 325
2 5 26 350
4 0 13 340
5 0 13 340
5 0 0 450
6 0 0 420
3 4または5 64 380
好ましい態様の生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーは、分泌性IgAを含む。分泌性IgAは、4個の免疫グロブリンアルファ重鎖、4個の免疫グロブリン軽鎖、J鎖および分泌性要素からなり、これらがすべて結合してIgAダイマーを含む分泌性IgA分子を形成している。この分泌性IgA分子は、特定の抗原に特異的に結合する重鎖および軽鎖可変部を含む。この分泌性IgA分子は、IgA1またはIgA2を含みうる。分泌性IgAに関する一般的議論については、メステキー(Mesteckey)等、Advances in Immunology, 40:153(1987)参照。
他の好ましい態様の生物学に活性なグリコポリペプチドマルチマーは、全てジスルフィド結合で互いに結合する5個のIgM分子、3個のJ鎖分子および分泌要素を含んでいる。
いずれの分泌性免疫グロブリン(IgMおよびIgA)も、蛋白質分解や消化に対して耐性があり、従って肺や消化管などムコサ表面に存在する場合にも活性を有する。トマシ(Tomasi), N.基礎および臨床免疫学、p.198,ラング
メディカル パブリケーション、ロスアラモス、CA(1982)参照。
別の好ましい態様におけるように、本発明は、グリコシル化コア部分およびN−アセチルグルコサミン含有アウターブランチを有するポリペプチドを含む生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーで、かつ別の免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列を含むポリペプチドに結合する免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列を含み、検出可能なシアル酸を含まないマルチマーに関する。
(1) グリコシル化したコア部分およびN−アセチルグルコサミン含有アウターブランチおよび免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列を有し、かつマウス免疫グロブリン結合レクチンを結合しないポリペプチド、および
(2) 前記ポリペプチドに結合し、前記免疫グロブリンアミノ酸残基配列とは異なる免疫グロブリンアミノ酸残基配列を含む別のポリペプチド、
以上(1)および(2)を含む生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーに関する。
マウス免疫グロブリン結合レクチンには、小麦胚芽アグルチニンおよびリシナス コムニス(Ricinus communis) アグルチニン等の末端シアル酸残基に特異的に結合するレクチンが含まれる。マウス免疫グロブリン結合レクチンは、末端シアル酸残基に特異的であり、植物で生産された免疫グロブリンは末端シアル酸残基を含まないことから植物細胞で生産された免疫グロブリンには結合しない。レクチン結合性に関する一般的議論については、オサワ(Osawa)等、Ana. Rev. Biochem., 56:21−42(1987)参照。
本発明は、動物のムコサ表面と所定のリガンドを結合しうる本発明の生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーを含む組成物を接触させることにより所定のリガンドに対して動物を受動免疫化する方法に関する。
所定の抗原を結合しうる免疫グロブリン分子などの生物学的に活性なグリコポリペプチドは、植物細胞で効率的、かつ経済的に生産される。これらの免疫グロブリン分子にはシアル酸が含まれないが、グリコシル化したコア部分およびN−アセチルグルコサミン含有アウターブランチが含まれる。好ましい態様における免疫グロブリン分子は、IgA,IgM,分泌性IgMまたは分泌性IgAである。
分泌性IgMおよび分泌性IgA等の分泌性免疫グロブリンは、蛋白質分解および変性に対して耐性があり、厳しい環境で使用するには適している。この厳しい環境には酸性環境、高温環境、その他の厳しい環境が含まれる。たとえば、動物の消化管は、プロテアーゼと酸が存在する厳しい環境である。コバヤシ(Kobayashi)等、Immunochemistry,10:73(1973)参照。動物の受動免疫は、動物のムコサ表面とグリコポリペプチドマルチマーを接触させることにより誘導する。動物には、肺、消化管、上咽頭腔、膣系などを含む種々のムコサ表面がある。一般に、これらのムコサ表面には唾液、涙、鼻汁、気管支液、腸液、胆汁、子宮液などを含む種々の分泌液を生産する細胞が含まれる。
病原体に免疫特異的な抗体は、標準的モノクローナル抗体生成技術を用いて生産しうる。抗体:ラボラトリーマニュアル、ハーロー(Harlow) 等、編、コールドスプリングハーバー、NY(1988)参照。軽鎖および重鎖可変部をコードする遺伝子は、ポリメレースチェーンリアクションおよび適当に選択したプライマーを用いて単離しうる。オランディー(Orlandi)等、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86:3833(1989)およびヒューズ(Huse) 等、Science,246:1275(1989)参照。さらに、この可変部を、ハイヤット(Hiatt)等、Nature, 342:76−78(1989)に述べられている発現ベクターなどの植物発現ベクターに挿入する。
好ましい態様において、乳離れし、もはや母親からのミルクを摂取しない哺乳類などの動物が受動免疫化される。そのような動物の受動免疫は、その動物に所定のリガンドに免疫特異的なグリコポリペプチドマルチマーを含む十分な量の組成物を投与し、動物体内に予防濃度のグリコポリペプチドマルチマーを提供することにより誘導する。免疫グロブリンなどグリコポリペプチドマルチマーの予防濃度とは、動物に存在する病原体と結合し、これが検出可能な病気が起こるのを防ぐのに十分な量を意味する。予防濃度を実現するのに必要なグリコポリペプチドマルチマーを含む組成物量は、当分野でよく知られているように動物のサイズ、存在する病原体の量、その病原体に対する特定のグリコポリペプチドマルチマーのアフィニティー、特定のグリコポリペプチドマルチマーが動物体内の活性局部に供給される効率などに依存して様々である。
好ましい態様において、生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーは保護コーティングでカプセル化している。カプセル物質には、メンブレン、ゲル、ポリマー等がある。カプセル物質は、含まれる物質の保護およびカプセル内外の物質の流れのコントロールに働いている。好ましい態様では、グリコポリペプチドマルチマーは植物細胞壁、植物細胞、腸被覆物などにカプセル化されている。
好ましい態様において、組織プラスミノーゲン活性化因子、組み換えヒトインシュリン、組み換えアルファインターフェロン、および成長ホルモン等のグリコポリペプチドマルチマーが種々の方法でうまく投与され、口、鼻および直腸のムコサを通して治療効果をあげている。エプスタイン(Eppstein) 等、薬剤としてのペプチドおよび蛋白質のもう一つの配給システム、CRC Critical. Rev. in Therapeutic Drug Carrier Systems, 5:99−139(1988)。
生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーは、体腔のムコサメンブレンに使用して投与することが出来るリポソーム(ミセル)成形物として投与することが出来る。ジュリアーノ(Juliano)等、J. Pharmacol. Exp. Ther., 214:381(1980)。リポソームは、直径約20−50ナノメーターのもっとも小さい単一ラミナーベシクルから直径数十ミクロン単位のマルチラミナーベシクルまでの範囲の種々の物理学的構造を生ずる種々の従来法によって調製する。グレゴリチディアス(Gregoriadias) 編、Liposome Technology,1:Crcプレス(1984)。鼻孔用成形物についてリストした好ましい投与量の生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーをマルチラミナーベシクルの凍結乾燥パウダーで水和しグリコポリペプチド含有リポソームを生成する。
病原特異的グリコポリペプチドマルチマーは、動物中の特定の位置のマルチマー濃度が予防濃度に達するのに十分な量を投与することが好ましい。特定の予防濃度となるように投与されるマルチマー量は、良く知られているように、存在する病原体量、免疫化を必要とする動物内の位置、病原体に対するマルチマーのアフィニティー、変性や分解に対するマルチマーの耐性、病原体失活様式、投与物成形法などに依存する。
このマルチマーは、毎日一回から四回に分けて、マルチマー約0.1mgから2000mgを含む植物10gから100,000gという形で投与することが好ましい。このマルチマー量で、体重kg当たり約0.01mgから約2,000mgの予防濃度が得られる。好ましい態様のマルチマー予防濃度は、体重kg当たり約0.01mgから約600mgの範囲である。また、別の態様における予防濃度は、体重kg当たり約0.01mgから約200mgの範囲にある。
本発明は、所定のリガンドに対して動物に受動免疫を提供する方法に関する。この方法には、動物体内の生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマー濃度を予防濃度とするのに十分な量の生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーを動物に投与することが含まれる。投与するマルチマーには、グリコシル化したコア部分およびN−アセチルグルコサミン含有アウターブランチを有するポリペプチドおよび免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が含まれ、かつ、このマルチマーには、検出可能なシアル酸残基は含まれない。
好ましい態様において、マルチマーは、そのマルチマーと栄養価を有する物質から構成される組成物として投与される。栄養価を有する物質とは、動物がカロリーを誘導しうる物質または化合物である。典型的な栄養価を有する物質には、蛋白質、炭水化物、脂質、脂肪、糖蛋白質、グリコーゲンなどが含まれる。栄養価を有する物質としては、植物物質、または動物物質が特に好ましい。
別の好ましい態様では、マルチマーは、マルチマーおよび生理学的に不活性な物質から構成される組成物として投与される。生理学的に活性な物質には、水やキャリヤー化合物などの溶液が含まれる。
別の好ましい態様は、(1)動物の消化管に所定の抗原を結合しうる生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーで、(a)免疫グロブリンアミノ酸残基配列、および(b)コア部分およびN−アセチルグルコサミン含有アウターブランチを含むオリゴサッカライドを有するポリペプチドを含む、少なくとも二つのポリペプチドを含み、かつシアル酸残基を含まないマルチマーを含む植物細胞を含有する組成物を導入すること、および(2)消化管内でその植物細胞を破壊し、消化管内に生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーを放出してその動物を受動免疫化する、以上(1)および(2)を含む所定の抗原に対して動物を受動免疫化する方法に関する。
D.グリコポリペプチドマルチマーを含む組成物
本発明は、生物学的に活性なグリコポリペプチドマルチマーで、(a)免疫グロブリンアミノ酸残基配列、および(b)コア部分およびN−アセチルグルコサミン含有アウターブランチを含むオリゴサッカライドを有するポリペプチドを含む、少なくとも二つのポリペプチドを含み、かつシアル酸残基を含まないマルチマーのカプセルを含む生物学的に活性な組成物に関する
組成物中に存在するグリコポリペプチドマルチマー100ナノグラムに対し植物物質約10,000グラムから組成物中に存在するグリコポリペプチドマルチマー10グラムに対し植物物質約100ナノグラムの割合で含む組成物が特に好ましい。また、植物物質が、組成物中に存在するグリコポリペプチドマルチマー1ミリグラムに対し植物物質約10, 000グラムから組成物中に存在するグリコポリペプチドマルチマー1グラムに対し植物物質約100ナノグラムの割合で含まれるのがより好ましい。別の態様では、植物物質が、組成物中に存在するグリコポリペプチドマルチマー1ミリグラムに対し植物物質約10,000グラムから組成物中に存在するグリコポリペプチドマルチマー500ミリグラムに対し植物物質約1ミリグラムの割合で含まれる。
別の態様では、組成物中に、さらにクロロフィル、共働薬、医薬、医薬植物由来の化合物、種々の調合薬等が含まれる。医薬植物由来の化合物は、医薬植物中でグリコポリペプチドを発現させ、その植物を収穫することにより組成物に添加する。
また、本発明は、本発明の方法で生産した他のマルチマーにも関する。
1.ハイブリドーマ細胞系列6D4からの免疫グロブリン重鎖コード遺伝子および免疫グロブリン軽鎖コード遺伝子の単離
トラモンタノ(Tramontano) 等、Science,234:1566−1570(1986)に述べられている抗体6D4を分泌するハイブリドーマ細胞を、10%ウシ胎児血清を含むDMEM培地で対数期まで増殖する。ウルリッヒ(Ullrich)等、Science,196:1313(1977)の方法で全RNAをハイブリドーマ6D4の対数期培養液2リットルから調製する。簡単にいうと、遠心でハイブリドーマ6D4細胞を収穫し、ポリトロンホモジナイザーを用い、5mMクエン酸ナトリウム(pH7.0),0.1M 2−メルカプトエタノール(2Me)および0.5%ラウリルサコシン酸ナトリウムを含む4Mグアニジンチオシアネート溶液70ml中、室温で20秒間ホモジネートする。このホモジネートを8000×gで5分間遠心し、不溶性のデブリを除く。
このホモジネート約28mlを、ベックマンSW70 Tiローター中で、4mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)中5.7M CsCl(ベセスダリサーチラボラトリー、ゲイサースバーグ、MD)溶液10mlのパド上に乗せた。この溶液を、15℃、毎分50,000回転(rpm )で、少なくとも5時間遠心した。上清を注意深く吸い取り、チューブの壁が乾くまで残存するホモジネートを除去した。このRNAペレットを10mM トリス−HCl(pH7.4),2mM EDTAおよび0.5%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含む溶液に溶解した。この溶液をフェノール溶液で二回抽出した。その水層を再びフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:25:1(容積))を含む溶液で抽出した。この水層に1 /10倍容の3M酢酸ナトリウムおよび2倍容のエタノールを加えてRNAを回収した。この溶液を、−20℃に12−18時間維持してRNAを沈殿させた。沈殿を含む溶液を4℃、10,000×gで、20分間遠心してRNA含有ペレットとした。このペレットに70%エタノール5mlを加えて、RNAペレットから過剰の塩を除去し、この溶液を4℃、10,000×gで、10分間遠心した。このRNAペレットを0.5mlのDEPC−H2 Oに溶解し、260nmの吸収を測定するための少量の試料を分け取った後、−70℃で保存した。
このように生成した全第一鎖cDNA産物に、20mM トリス−HCl(pH7.5),10mM KCl,5mM MgCl2 ,10mM(NH4)2 SO4 ,10mM DTT,0.05mg/ml ウシ血清アルブミン(BSA),50μM dGTP,50μM dATP,50μM dTTP,50μM dCTP,150μM β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(β−NAD+ ) (シグマケミカル、セントルイス、MO),15μCi/μl(α−32P)dCTP,30ユニット大腸菌DNAポリメラーゼ、2.5ユニットRNaseHおよび4ユニット大腸菌DNAリガーゼを含む溶液100μlを混合することにより、第二鎖cDNAを合成した。この溶液を14℃に1時間維持したのち、さらに25℃に1時間維持した。この反応は、0.05M EDTA(pH8.0)溶液5μl、10%
SDS溶液5μlを添加することにより停止した。この核酸をフェノール抽出で精製し、エタノール沈殿で濃縮した。
この平滑末端化cDNAにEcoRIアダプターをアニールし、ライゲーションした。簡単にいうと、ポリヌクレオチドN1(表1)1μlおよび20ユニットT4ポリヌクレオチドキナーゼを70mM トリス−HCl(pH7.6),10mM MgCl2 ,5mM DTT,10mM 2Meおよび500μg/ml BSAを含む溶液に加えることで、このポリヌクレオチドを5’リン酸化した。この溶液を37℃に30分間維持し、ついで65℃に10分間維持して反応を停止した。1/10倍容の20mMトリス−HCl(pH7.4),2mM MgCl2 および15mM NaClを含む溶液とともに20ngのポリヌクレオチドN2(表1)をキナーゼ反応液に加えた。この溶液を70℃で5分間加熱し、ついで水を入れた500mlビーカー内で、1.5時間かけて室温、約25℃まで冷やした。この間に、溶液中に存在する二つのオリゴヌクレオチドがアニールし、二本鎖のEcoRIアダプターが生成する。
(N1) 5'-CCTTGACCGTAAGACATG-3'
(N2) 5'-AATTCATGTCTTACGGTCAAGG-3'
上記反応液5μlと、10mM ATPおよび5ユニットT4ポリヌクレオチドキナーゼを含む溶液を混ぜて、生成したcDNAの5’末端をリン酸化した。この溶液を37℃に30分間維持し、ついで65℃に10分間維持してT4ポリヌクレオチドキナーゼを失活させた。
このように調製したcDNAを、 Molecular Cloning:A Laboratory Manual,マニアチス(Maniatis) 等、編、コールドスプリングハーバーラボラトリー、NY(1982)の方法と同様の方法でサイズ分画し、長いcDNA挿入物を得た。簡単にいうと、上述のように調製した反応混合物を、20mM トリス−HCl(pH8.0),1.2M NaCl,1mM EDTAおよび0.1%サルコシルを含む等倍容の2×CL4Bカラムバッファに加えた。この溶液を、予め膨潤したセファロースCL−4B(ファルマシアLKBバイオテクノロジー、ピスカタウェイ、NJ)を用いて調製した5mlのCL−4Bカラムにロードした。この試料をカラムに入れてから、カラムを10mM トリス−HCl(pH8.0),600mM NaCl,1mM EDTAおよび0.1%サルコシルを含む1×カラムバッファで満たした。重力でこのカラムの溶液を流し、約200μlのフラクションを手で採取した。各フラクションに存在する二本鎖cDNAの大きさは、0.8%アガロースゲル電気泳動で測定した。アガロースゲル電気泳動による測定で高分子量のcDNAを含むフラクションを集め、ブタノール抽出で濃縮し、エタノール沈殿でサイズ分画したcDNAを得た。
このプラークを、ヒト抗体の不変部を含むラジオラベル化したプローブでスクリーニングした。簡単にいうと、ラビッツ(Rabbitts) 等、Cold Spring Harbor Quantitative Bioogy 45:867−878(1980),に報告されているヒトIgG不変部プローブおよびラビッツ(Rabbitts) 等、Cold Spring Harbor Quantitative Bioogy 45:867−878(1980)に報告されているヒトカッパ軽鎖プローブを、Molecular Cloning :A Laboratory Manual,マニアチス(Maniatis) 等、編、コールドスプリングハーバー、NY(1982)に示されている標準法でニックトランスレーションした。この方法で調製し、1×108 cpm /μg以上の比活性を持つプローブを、従来法により先に調製したライブラリー由来のプラークにハイブリダイズした。簡単にいうと、先に調製したcDNAライブラリーのタイターは、このライブラリーを100mM NaCl,50mM トリス−HCl(pH7.5)および10mM硫酸マグネシウムを含むバッファで段階的に希釈することにより測定した。各希釈物10μlを対数期の大腸菌細胞200μlと混合し、37℃に維持してファージをバクテリア細胞に吸着させた。5g/l NaCl,2g/l硫酸マグネシウム、5g/lイーストイクストラクト、10g/l NZアミン(カゼイン加水分解物)および0.7%モルテンアガロースを含むトップアガー3mlを調製し、使用するまで50℃の水浴に保存した。ファージ、バクテリアおよびトップアガーを混ぜ、保温しておいたバクテリア寒天プレート(5g/l NaCl,2g/l硫酸マグネシウム、5g/lイーストイクストラクト、10g/l NZアミンおよび15g/l ディコアガー)の表面に均等に広げた。このプレートを37℃に12−24時間維持した。この間にバクテリアローン上にランダプラークが生成する。このラムダプラークを計数して、元のライブラリー中に存在した1ml当たりの全プラーク形成ユニットを測定した。
下から完全に濡れるまで、0.9M NaClおよび0.09Mクエン酸ナトリウム(pH7.0)を含む溶液の表面に焼いたフィルターを乗せた。このフィルターを同溶液中5分間浸す。ついで、このフィルターを、50mMトリス−HCl(pH8.0),1M NaCl,1mM EDTAおよび0.1%SDSを含む予洗溶液に移した。この予洗溶液を42℃に2時間維持した。
これらの全長cDNAクローンを、 Molecular Cloning:A Laboratory Manual,マニアチス(Maniatis) 等、編、コールドスプリングハーバーラボラトリー、NY(1982)の操作を用い、mp18にサブクローニングした。簡単にいうと、全長cDNAクローンを含むファードミドを制限エンドヌクレアーゼで消化し、その全長cDNA挿入物をゲル電気泳動で単離した。この挿入物を予めEcoRIで消化したM13mp18にライゲーションした。このライゲーション混合物を適当なバクテリア宿主細胞上にプレーティングし、全長cDNA挿入物を含むファージプラークを単離した。このクローニングステップの正しさは、制限地図で確認した。
一本鎖ウラシル含有テンプレートDNAは、200μlのファージストック全部を等容量の中和フェノールで二度抽出することにより調製した。もう一度この水層をフェノールクロロホルム溶液(25:25:1 フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール)で抽出し、さらに数回クロロホルムイソアミルアルコール(1:1/48 クロロホルム;イソアミルアルコール)で抽出した。この水層に、10分の1倍容の7.8M酢酸アンモニウムおよび2.5倍容のエタノールを混合した。この溶液を−70℃に少なくとも30分間維持して、DNAを沈殿させた。このDNAを4℃で15分間遠心することにより回収した。このDNAペレットを90%エタノールで一回抽出し、10mMトリス−HCl(pH7.6)および1M EDTAを含む20μlに懸濁した。この溶液に存在するウラシル含有テンプレートDNAの量は、ゲル電気泳動で測定した。さらに突然異変誘発ステップでこのウラシル含有テンプレートDNAを用いて、全長cDNAに制限エンドヌクレアーゼ部位を導入した。変異した全長cDNAは、ミュージーンシット(バイオラド、リッチモンド、CA)の操作にしたがって合成した。簡単にいうと、EcoRI制限エンドヌクレアーゼ部位を導入するように設計したポリヌクレオチドを用いて、一本鎖ウラシル含有テンプレートDNAからの変異鎖合成を行った。このポリヌクレオチドは、選択した200ピコモル(pmole)を100mMトリス−HCl(pH8.0),10mM MgCl2 ,5mM DTT,0.4mM ATPおよび4.5ユニット T4ポリヌクレオチドキナーゼを含む溶液と混合してリン酸化した。この溶液を37℃に45分間維持した。このキナーゼ反応は、65℃に10分間維持することにより停止した。このリン酸化したポリヌクレオチドを、10mM トリス−HCl(pH7.6)および1ml EDTA)を含む溶液で希釈して6mole/μlとした。
バクトアガーLB培地を入れたバクテリアプレート表面上に注いだ。寒天を約10分間冷し、逆さにして37℃に一晩維持してMV1190ローン上にプラークを出現させた。
このようにして同定した変異体をシーケンシングして免疫グロブリン重鎖または軽鎖をコードする変異cDNAのDNA配列を確認した。
2.カッパ軽鎖遺伝子を含む発現ベクターの構築
カッパリーダーを含む全カッパ軽鎖遺伝子を含む発現ベクターを以下のように調製した。単離した全長カッパ軽鎖遺伝子cDNAをポリヌクレオチドP1およびP3(表2)および上述の突然変異誘発法を用いて変異した。ポリヌクレオチドP1は、全長カッパcDNAの5’末端にEcoRI制限エンドヌクレアーゼ部位を導入する。ポリヌクレオチドP3は、全長カッパ軽鎖cDNAクローンの3’末端にEcoRI制限エンドヌクレアーゼ部位を誘導する。変異体にポリヌクレオチドP1およびP3が導入したことを示す二つのEcoRI制限エンドヌクレアーゼ部位を含む変異トランスホーマントを単離した。これらのトランスホーマントをシーケンシングし、それらがP1およびP3両ポリヌクレオチド配列を含むことを確認した。
リーダーを含まないカッパ軽鎖遺伝子を含む発現ベクターは、以下のように調製した。単離した全長カッパ軽鎖遺伝子cDNAをポリヌクレオチドP2およびP3(表2)および先の突然変異誘発法を用いて変異した。ポリヌクレオチドP2は、成熟カッパ軽鎖のN−末端アミノ酸をコードする配列の丁度5’側にEcoRI制限エンドヌクレアーゼ部位を挿入し、野生型のcDNAで転写されるカッパ軽鎖リーダー配列を除去する。ポリヌクレオチドP3は、全長カッパ軽鎖cDNAクローンの3’末端にEcoRI制限エンドヌクレアーゼ部位を導入する。変異体中にP2およびP3両ポリヌクレオチドが導入されたことを示す二つのEcoRI制限エンドヌクレアーゼ部位を含む変異体トランスホーマントを単離し、シーケンシングして実際にP2およびP3両ポリヌクレオチドのDNA配列を含むことを確認した。
(P1) -5'-TGTGAAAACCATATTGAATTCCACCAATACAAA-3'
(P2) -5'-ATTTAGCACAACATCCATGTCGACGAATTCAATCCAAAAAAGCAT-3'
(P3) -5'-GGGGAGCTGGTGGTGGAATTCGTCGACCTTTGTCTCTAACAC-3'
(P4) -5'-CCATCCCATGGTTGAATTCAGTGTCGTCAG-3'
(P5) -5'-CTGCAACTGGACCTGCATGTCGACGAATTCAGCTCCTGACAGGAG-3'
(P6) -5'-CCTGTAGGACCAGAGGAATTCGTCGACACTGGGATTATTTAC-3'
ガマリーダーを含む全ガンマ重鎖遺伝子を含む発現ベクターを以下のように調製した。単離した全長ガンマ重鎖遺伝子cDNAをポリヌクレオチドP4およびP6(表2)および先に述べた突然変異誘発法を用いて変異した。ポリヌクレオチドP4は、本来の全長ガンマcDNAの5’末端にEcoRI制限エンドヌクレアーゼ部位を導入する。ポリヌクレオチドP6は、全長ガンマ重鎖cDNAクローンの3’末端にEcoRI制限エンドヌクレアーゼ部位を導入する。ポリヌクレオチドP4およびP6の両方が変異体に導入したことを示す二つの付加的EcoRI制限エンドヌクレアーゼ部位を含む変異トランスホーマントを単離し、これをシーケンシングしてP4およびP6両オリゴヌクレオチドのDNA配列を含むことを確認した。
全長ガンマ重鎖cDNAをその5’および3′末端にある制限エンドヌクレアーゼEcoRI部位(図1B)で切りだし、ゲル電気泳動でそのフラグメントを単離した。この制限フラグメントを予めEcoRIで消化した発現ベクターpMON530に直接ライゲーションした(図2)。このライゲーション混合物を適当な宿主にトランスホームし、各トランスホーマントを単離した。各トランスホーマントからDNAを調製し、種々の制限エンドヌクレアーゼで消化して発現ベクター内のガンマ重鎖cDNAの方向を確認した。このガンマ重鎖発現ベクターは、ガンマリーダーを含むガンマ重鎖をコードする遺伝子を含んでいた。
このリーダーレスガンマ重鎖cDNAをその5’および3’末端にある制限エンドヌクレアーゼEcoRIで切りだし、その制限フラグメントをゲル電気泳動で単離した。このフラグメントを、予めEcoRIで消化した発現ベクターpMON530に直接ライゲーションした(図2)。このライゲーション混合物を適当な宿主にトランスホームし、各トランスホーマントを単離した。各トランスホーマントからDNAを単離し、種々の制限エンドヌクレアーゼで消化して発現ベクター内のガンマ重鎖cDNAの方向を確認した。生成したガンマ重鎖発現ベクターには、本来のガンマリーダーを含まないガンマ重鎖をコードする遺伝子が含まれていた。
先の実施例で調製したリーダーレスカッパ発現ベクター、リーダーレスガンマ発現ベクター、本来のカッパ発現ベクターおよび本来のガンマ発現ベクターを、ジッタ(Ditta)等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:7347−7351(1980)のトリペアレンタル・コンジュゲーション・システムを用い、アグロバクテリウム(Agrobacterium)GV3111−SE株に導入した。簡単にいうと、アグロバクテリウム(Agrobacterium)(アクセプター)GV3111−SEを、2.6g/l イーストイクストラクト、5g/l トリプトファン、5g/l NaCl,5g/l マニトール、1.16g/l グルタミン酸一ナトリウム、0.25g/l KH2 PO4 ,0.1g/l MgSO4 −7H2 Oおよび1mg/lビオチン(pH7.0)を含むMGL培地を入れた寒天プレート中、28℃で12−18時間培養した。ベター(Better) 等、J. Bacteriol.,155:311(1983)に述べられているモービライゲーションプラスミドpRK2073を含む大腸菌(ヘルパー)をLB寒天培地(5g/l イーストイクストラクト、10g/l トリプトファン、10g/l NaCl,15g/l バクトアガー、pH7.0)中、37℃で12−18時間培養した。各発現ベクターを含む大腸菌を、37℃で12−18時間、3μg/mlテトラサイクリンおよび10μg/mlカナマイシンを補ったLB培地を含むバクテリア培養寒天培地で培養した。同量(約1×108 細胞)の三種のバクテリア、アクセプターアグロバクテリウム(Agrobacterium)、ヘルパー大腸菌、および発現ベクターを含む大腸菌を混合し、100μg/ml カナマイシン、200μg/ml スペクチノマイシンおよび50μg/ml クロラムフェニコールを含むAB寒天培地(1リットル当たり1g NH4Cl,0.3g MgSO4−H2O,0.15g KCl,0.01g CaCl2,2.5mg FeSO4−7H2O,3g K2HPO4,1.15g NaH2PO4−H2O,5g グルコースおよび15g バクトアガーを含む)を含むバクテリアプレートで培養した。このバクテリア培養プレートを2−4日間28℃でインキュベーションした。単一のトランスホーマントコロニーを、100μg/mlカナマイシン、200μg/mlスペクチノマイシンおよび50μg/mlクロラムフェニコールを補ったLB培地を入れた培養フラスコ内に入れ、穏やかに振盪しながら28℃で12−18時間維持した。先の実施例で調製した各発現ベクターは、このアグロバクテリウム(Agrobacterium)培養物中に存在し、これで植物中の導入する準備が完了した。
先の実施例で構築した各発現ベクターから、概説した操作を用いて植物群を調製した。各植物群の葉抽出物を、エングバル(Engvall)等、J. Immunol.,109:129−135(1972)の方法に基づくELISA法を用いて免疫グロブリン重鎖または軽鎖の存在に関してスクリーニングした。簡単にいうと、150mM NaClおよび20mMトリス−HCl(pH8.0)(TBS)を含む溶液50μlおよび、ヤギ抗マウス重鎖または軽鎖特異的IgG(フィッシャーサイエンティフィック、ピッツバーグ、PA)をマイクロプレートのウェル中で混合した。水でウェルを四回洗浄したのち、5%脱脂肪ドライミルクを含むTBS200μlをマイクロプレートのウェルに入れた。このウェルを20℃に少なくとも30分間維持した後、振ってウェルを空にし、乾燥して固体サポート、即ち、ヤギ抗体を機能的に結合する固体マトリクスを作製した。
各植物の免疫グロブリン含量は二度測定し、表3にはその平均値を示した。各植物群のうちの少なくとも9個をこのように検定した。免疫グロブリン重鎖または軽鎖を発現する植物で免疫グロブリン遺伝子でトランスホームしていることが示され、これらをトランスホーマントまたはトランスジェニック植物とした。
ガンマーNL ガンマーL
30±16 1412±270
(60) (2400)
カッパーNL カッパーL
1.4±1.2 56±5
(3.5) (80)
表3に示した結果は、個々の免疫グロブリン鎖の蓄積にシグナル配列が重要であることを示している。シグナル配列がcDNAに存在するとカッパ鎖の蓄積は、(平均)40倍増加し、ガンマ鎖の蓄積は、47倍増加した。
各免疫グロブリン鎖を発現する実施例4で生成したトランスホーマントを有性的に交配し、両鎖を発現する子孫を作製した。簡単にいうと、一つの免疫グロブリン鎖を発現する一つのトランスホーマントから葯を取り除き雌のトランスホーマントを作製することにより、去勢した未成熟の花を作ることでハイブリッドの子孫を調製した。この雌のトランスホーマントを別の免疫グロブリン鎖を発現する別のトランスホーマント(雄)と交配した。交配受粉後、ハイブリッド種が生産されるまで雌のトランスホーマントを通常の生育条件下で維持した。このハイブリッド種を発芽させ、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の両方を含むハイブリッド子孫を生成した。ハイブリッド子孫を作製する模式図を図3に示す。その葉をホモジナイズし、実施例4で述べたELISA法を用い免疫グロブリン重鎖または軽鎖に関し、そのホモジネートを検定した。免疫グロブリン重鎖または軽鎖を発現するハイブリッド子孫の数を表4に示す。カッパリーダー構築物およびガンマリーダー構築物を発現するトランスホーマントの交配から生成したハイブリッドは、ガンマ重鎖およびカッパ軽鎖の両方を含む集合型免疫グロブリン分子を含んでいた。
ガンマーL ガンマーNL
(カッパ−L) (カッパーNL)
3330±2000 32±26
(12800) (60)
カッパーL カッパーNL
(ガンマーL) (ガンマーNL)
3700±2300 6.5±5
(12800) (20)
ガンマのみ カッパのみ ガンマ・カッパ な し
カッパーNL× 4 6 3 5
ガンマーNL (集合物0%)
カッパーL× 3 10 11 4
ガンマーL (集合物95±16%)
トランスジェニック植物またはハイブリッド子孫における免疫グロブリン重鎖コード遺伝子または免疫グロブリン軽鎖コード遺伝子の存在は、マニアチス(Maniatis) 等、Molecular Cloning: A Laboratory Manusl, コールドスプリングハーバーラボラトリー、NY(1982)のサザンブロッティング法を用いたトランスジェニック植物由来のDNAを分析することにより示された。簡単にいうと、液体窒素で凍結した重鎖遺伝子トランスホーマント、軽鎖遺伝子トランスホーマントまたはハイブリッド子孫から収穫した1グラムの成熟した葉の断片からDNAを抽出した。この凍結セグメントを、シュア(Shure)等、Cell, 25:225−233(1986)の方法にしたがって乳鉢を用いてウレアミックス(420g/l尿素、312.5mM NaCl,50mMトリス−HCl(pH8.0),20mM EDTAおよび1%サルコシン)中でホモジナイズした。この葉のホモジネートをフェノール:CHCl3 (1:1v/v)で抽出し、その溶液に1/6倍容の4.4M酢酸アンモニウム(pH5.2)および1倍容のイソプロピルアルコールを添加し、−20℃に30分間維持することにより核酸を沈殿させた。核酸沈殿を含む溶液を4℃、7500×gで15分間遠心し、核酸沈殿を回収した。このペレットを、10mMトリス−HCl(pH7.6)および1mM EDTAを含むTE溶液に溶かした。この溶液中のDNA濃度は、分光学的に測定した。
焼いたフィルターを下から完全に湿るまで0.9M NaClおよび0.09Mクエン酸ナトリウム(pH7.0)を含む溶液の上に乗せた。このフィルターを同じ溶液に5分間浸した。
このオートラジオグラムを図4Aに示す。リーダー無し(レーン1)またはリーダー配列有り(レーン3)のカッパ軽鎖cDNAを発現するトランスホーマントで検出されるハイブリダイズDNAフラグメントが示されている。リーダー無し(レーン2)またはリーダー配列有り(レーン4)のガンマ重鎖cDNAを発現するトランスホーマントで検出されるハイブリダイズDNAフラグメントが示されている。本来のリーダーを含むカッパ軽鎖および本来のリーダーを含むガンマ重鎖の両方を含むハイブリッド子孫で検出されるハイブリダイズDNAフラグメントも示されている(レーン5)。
トランスジェニック植物またはハイブリッドにおける免疫グロブリン重鎖または免疫グロブリン軽鎖遺伝子をコードするmRNAの存在が、Molecular Cloning , A Laboratory Manusl(上述)の方法を用い、トランスジェニック植物から抽出したRNAを分析することで示された。簡単にいうと、重鎖遺伝子トランスホーマント、軽鎖遺伝子トランスホーマントまたはハイブリッド子孫から収穫した成熟葉組織1グラムからRNAを調製した。この葉組織を小さく切り、0.1Mトリス−HCl(pH9.0)およびこのバッファで飽和したフェノールを含む溶液10mlを混合する。この葉組織をこの溶液中、高速で1分間ポリトンホモジナイザーを用いてホモジナイズした。このホモジネートを室温で4000rpmの遠心を15分間行った。水層を取り除き、3M酢酸ナトリウム(pH5.2)1mlおよびイソプロパノール25mlを混合することによりRNAを沈殿させた。この溶液を−20℃に20分間維持してRNAを沈殿させた。この溶液を4℃、4000×gで15分間遠心することにより沈殿したRNAを回収した。このRNAペレットを400μlのDEPC−H2Oに溶かし、1.5mlのエッペンドルフチューブに移した。この溶液をエッペンドルフ遠心機を用い最高速度で5分間遠心した。この上清を新しいエッペンドルフチューブに移し、3M酢酸ナトリウム(pH5.2)40μlおよびエタノール1mlを混合した。この溶液を−20℃に20分間維持してから、エッペンドルフ遠心機で5分間遠心した。生成したRNAペレットを400μlのDEPC−H2Oに溶かし、少量の試料を取り、260nmの吸光度からRNA濃度を測定した。残りの溶液は、使用するまで−70℃で凍結して保存した。
トランスジェニック植物およびハイブリッド子孫における免疫グロブリン重鎖および軽鎖の発現は、重鎖および軽鎖の両方が検出されるウエスタンブロッティングで示された。ウエスタンブロッティングは、Antibody: A Laboratory Manual, ハーロー(Harlow)およびレーン(Lane)編、コールドスプリングハーバーラボラトリー、NY(1988)に従った。簡単にいうと、成熟した植物の葉セグメント1gを0.05Mトリス−HCl(pH7.5)および1mMフゥニルメチルスルホニルフルオライド(PMSF)を含む溶液1ml中、乳鉢でホモジナイズし、生成した葉抽出物を指示されているように2mM DTT有り、または無しの条件下、最終濃度4M尿素および1%SDSとなるように溶液を加え、3分間煮沸した。その後、この溶液を、N.H.チュア(Chua)、Methods in Enzymol.,6
軽鎖トランスホーマントにおける免疫グロブリン軽鎖、重鎖トランスホーマントにおける免疫グロブリン重鎖、およびハイブリッド子孫における免疫グロブリン重鎖および軽鎖の発現は、ウエスタンブロットを用いて示された(図5)。さらに、非還元条件で見られる高分子量免疫反応性ガンマおよびカッパ鎖で明らかなように、ハイブリッド子孫で生成した免疫グロブリン重鎖および軽鎖は会合していた。
トランスジェニック植物中で発現される免疫グロブリン分子による抗原の結合は、実施例4で述べたELISA法と同様の方法で示された。この抗原結合ELISA検定は、以下のように修正した。マイクロプレートのウェルにヤギ抗体を吸着する代わりに、トラモンタノ(Tramontano)等、Proc, Nati. Acad. Sci. USA, 83:6736−6740(1986)の方法に従いBSAに結合した抗原P3をマイクロプレートのウェルに吸着させた。各植物群由来の葉抽出物をウェルに入れ、ホモジネート中に存在する免疫グロブリン分子の結合が、実施例4に述べたHRPOに結合したヤギ抗マウス重鎖を用いて検出した。
トランスジェニック植物中で発現する免疫グロブリン分子は、この抗原結合ELISA検定においてその特異的抗原P3に直接結合した。この抗体抗原相互作用の特異性を示すために、別の競争ELISA検定を行った。この検定法は、葉ホモジネートの一連の希釈前に、500μMのP3溶液5μlを二つのウェルに添加し、ウェルに吸着したP3−BSAに結合する抗体の対する競争者として作用させること以外は、先に述べた抗原結合ELISA検定法と同様である。この競争ELISA検定の残りの部分は、実施例4と同様に行った。
トランスジェニック植物中で発現する抗体とその特異的抗原P3の相互作用は、BK競争ELISA検定において遊離した抗原により特異的に阻害された。
トランスジェニック植物で発現される免疫グロブリン分子の触媒活性は、機能性免疫グロブリンを発現するタバコ植物由来の免疫グロブリン分子6D4を精製し、その触媒活性を測定することにより示された。
簡単にいうと、集合型免疫グロブリン分子を含む植物は、実施例1,2,3,4,5,6および8で述べた方法および操作を用いて作製した。マウスで生産される通常のグリコシル化した抗体6D4は、カルボン酸エステルの加水分解を触媒することから、植物中での発現に免疫グロブリン分子6D4を選択した。トラモンタノ(Tramontano) 等、Science,234:1566(1986)参照。
免疫グロブリン6D4は、セファクリル分画およびプロテインA−セファロースへの吸着により免疫グロブリンを発現するタバコ植物の葉から精製した。簡単にいうと、若い葉10グラムから葉脈を除去し、これを50mMトリス−HCl(pH8.0)および1mM PNSFを含むホモジネーションバッファ50ml中で手でホモジネートした。このホモジネートを10000×gで遠心し、その上清をセントリコン30(アミコン、デンバース、MA)を用い最終的に10mlまで濃縮した。この濃縮ホモジネートを予め調製したセファクリルS−300カラムにロッドした。このカラムを0.1M酢酸ナトリウム(pH5.0)で溶出し、1mlの溶出液フラクションを採用した。各フラクションの存在する免疫グロブリン量は、実施例4で述べたELISA検定法で測定した。
溶出した大部分の免疫グロブリンを含むフラクションを集め、1.5Mグリシン(pH8.9)および3.0M NaClをふくむ結合バッファに対して十分に透析した。透析後、この免疫グロブリンを、2gのプロテインA−セファロース(ファルマシア、ピスカタウェイ、NJ)を含むカラムにゆっくり通し、免疫グロブリンをカラムに結合させた。プロテインA−セファロースを20mlの結合バッファで洗浄した。結合した免疫グロブリンは、0.1Mクエン酸塩(pH6.0)を含む溶出バッファ10mlで溶出した。この溶出物を、セントリコン30を用いて1ml当たり免疫グロブリン50μgとなるまで濃縮した。濃縮した免疫グロブリンを50mMリン酸バッファ(pH8.0)に対して透析した。この溶液中に存在する免疫グロブリンの最終濃度は、実施例8に述べたELISA検定を用いて測定した。
マウス由来の6D4モノクローナル抗体を植物のは由来の抗体を精製したのに用いた方法を使用してマウスの腹水から精製した。簡単にいうと、モノクローナル抗体6D4を含むマウス由来の腹水をセファクリル(S−300)カラムおよびプロテインA−セファロースカラムを用いて分画した。この精製したマウスモノクローナル抗体6D4を0.1Mクエン酸塩(pH6.0)バッファで500μg/mlとした。
トラモンタノ(Tramontano)等、Science,234:1566−1569(1986)の方法を用い、特異的インヒビター有無の条件下で基質と精製した抗体をインキュベートすることにより植物由来およびマウス由来の抗体6D4の触媒活性を検定した(図9)。簡単にいうと、約100nMのマウス由来または植物由来の抗体6D4を50mMリン酸バッファ(pH8.0)中、25℃でプリインキュベートした。基質を含む種々の量のジオキサンストック溶液を混合することにより、5%ジオキサンおよび1乃至8mMの範囲の基質を含む一連の反応混合物を調製した。この反応混合物を、25℃に1時間維持し、ついで、エステル基質の加水分解をヒューレットパッカード8452Aダイオードアレイ分光光度計を用い、245ナノメーター(nm)での吸光度変化をモニターすることで測定した。コントロール反応混合物に非特異的エステラーゼ(シグマ、セントルイス、MO)を加えることにより最高の吸光度変化が得られた。その速度パラメーターは、トラモンタノ(Tramontano)等、Science,234:1566(1986)に述べられているラインウィーバー・バーク・データ処理を用い、バックグランド加水分解値を差し引いて得た。阻害定数は、100nMおよび300nMリン酸塩で得られる傾斜をプロットすることで測定した。
KM, Kl, VmzxおよびKcatで測定される精製した植物由来およびマウス由来の抗体6D4の触媒活性を表6に示す。植物由来およびマウス由来の抗体6D4には、約桁の差があった。
起源 タバコ 腹水
KM 1.41×10-6M 9.8×10-6M
Vmzx 0.057×10-8Msec-1 0.31×10-8Msec-1
Kl 0.47×10-6M 1.06×10-6M
(競争) (競争)
Kcat 0.008sec-1 0.025sec-1
b:このデータは、直線回帰で分析した。
植物における免疫グロブリン集合に関する異種リーダー配列の効果を測定するために、実施例1で述べた本来のマウスリーダー配列の代わりにサッカロミセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) のα−メイティング因子由来のシグナル配列を含む免疫グロブリンcDNAを調製した。サッカロミセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) のα−メイティング因子の配列は、カーザン(Kurzan) 等、Cell, 30:933−943(1982)に報告されており、これを表7に示した。
GAATTCATTCAAGAATAGTTCAAACAAGAAGATTACAAACTATCAATTTCA
TACACAATATAAACGATTAAAAGA MRFPSIFTAVLFAASSAL
AAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLP
FSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLDLKR/DVVL
(カッパ鎖);/EVEL(ガンマ鎖)
簡単にいうと、カーザン(Kurzqn)等、Cell,30:933−943(1982)に述べられているサッカロミセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)α−メーティング因子由来のプレプロ配列を、p69A由来のα−メーティンイグ因子を含むEcoRI−HindIII制限エンドヌクレアーゼフラグメントを単離することによりM13mp18にサブクローニングした。このα−メーティング因子含有制限エンドヌクレアーゼフラグメントを、予めEcoRIおよびHindIII制限エンドヌクレアーゼで消化したM13mp18ベクターにライゲーションした。このクローニングステップの正確性は、α−メーティング因子DNAを含むM13クローンの制限エンドヌクレアーゼ消化により検定した。
単離したα−メーティング因子含有制限エンドヌクレアーゼフラグメントを、別のライゲーション反応でHindIII消化したガンマおよびカッパベクターにライゲーションした。オリゴヌクレオチド依存突然変異誘発を用い、α−メーティング因子プレプロ配列の末端およびGlnコドン(ガンマ鎖)またはAspコドン(カッパ鎖)の間の余分のヌクレオチドを除去して、キメラcDNAを生成した。オリゴヌクレオチド依存突然変異誘発の正確性は、DNAシーケンシングで確認した。
α−メーティング因子プレプロ配列およびガンマまたはカッパ免疫グロブリンコード配列を含むキメラcDNAを、ロジャース(Rogers)等、Me th. Enzymol. 153:253(1987)に述べられているpMON530ベクターに挿入した。簡単にいうと、このキメラcDNAをT4DNAリガーゼによりpMON530ベクターに結合した。このライゲーション反応の生産物を、ベセスダリサーチラボラトリーズ(ベセスダ、MD)のバクテリア種および方法を用いて大腸菌に導入した。各プラスミド(キメラcDNAを含む組み換えpMON530)を、制限エンドヌクレアーゼ消化およびシーケンシングで分析した。
ガンマmat鎖またはカッパmat鎖のいずれかを発現する各再生物を内在性マウスリーダーペプチドを含む本来の6D4抗体を発現する植物と交配し、本来のガンマ鎖およびカッパmatを含む子孫、またはガンマmatおよび本来のカッパ鎖を含む子孫を作製した。また、これらの子孫を、実施例4に述べたELISA検定法でスクリーニングした。
各子孫の抗体発現レベルは、実施例4で述べたELISA検定法を用いて測定し、その結果を表8に報告した。
ガンマmata カッパmat
743±260 48±8
(1030) (72)
ガンマmat(カッパmat)c カッパmat(ガンマmat)
2410±1230 2280±1300
(7700) (7700)
ガンマmat(カッパマウス) カッパmat(ガンママウス)
2615±1505 2490±1175
(8300) (8300)
ガンマ−t(カッパリーダー無し) カッパmat(ガンマリーダー無し)
705±300 38±8
(0) (0)
c α(K)は、ELISAで測定されたようにK鎖を発現する植物における豊富なα鎖およびその逆を意味する(有性的交配の子孫)。この場合の括弧のなかの値は、BSAに結合したホスホネート抗原(P3)(先に、トラモンタノ(Ttamontano)等、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,83:6736−6740(1986)に報告されている)でコーティングしたELISAプレートに結合する抗体の結果である。ハイアット(Hiatt)等、Nature,342:76−78(1989)。もっとも高いレベルのK複合体を発現する植物のみを、抗原結合検定に使用した。
サッカロミセス セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)リーダー配列を含む各ガンマおよびカッパ鎖は、すでにハイアット(Hiatt)等、Nature,342:76−78(1989)に報告されている本来のマウスリーダーを発現する構築物とほぼ同じレベルで蓄積した。さらに、機能的抗体は、同じシグナル(ガンマmat×カッパmat)または異なるシグナル(カッパmat×ガンマnative;カッパnative×ガンマmat)を含むガンマおよびカッパ鎖を交配することにより生成した。この事は、リーダーを含まない免疫グロブリンを発現する親が、ハイアット(Hiatt)等、Nature,342:76−78(1989)に報告されているように機能性抗体を生産しない場合の植物の交配と対照的である。
植物由来の免疫グロブリンのガンマ鎖グリコシル化パターンを測定するために、フェイ(Faye)等、Anal.Biochem.,149:218−224(1985)に述べられているように精製した抗体をニトロセルロースにブロッティングし、ビチオン化したレクチンで探った。簡単にいうと、1μg/mlのビオチン化レクチン(ビアス、ロックフォード、IL)を含むバッファ(50mMトリス−HCl,0.5M NaCl,0.1mM CaCl2,0.1mM MgCl2,および0.1mM MnCl2)(TIBS)中、室温で1時間ニトロセルロースメンブレンでインキューベートした。このフィルターをTIBSで洗浄し、室温で1時間、1μg/mlストレプトアビジン・アルカリホスファターゼを含むTIBS中でインキュベートした。ハイアット(Hiatt)等、Nature,342:76−78(1989)に述べられているように、結合したアルカリホスファターゼは、ブロモ−クロロ−インドリルホスフェートを用いて観察した。
ある場合には、ブロッティング前に200mM酢酸ナトリウム(pH5.8)50μl中、37℃で2時間40ミリユニットのエンドグリサシダーゼH(シグナルケミカル、セントルイス、MO)と共に精製した抗体をインキュベートして、高マンノース型糖を除去した。
これらの結果は、植物由来の免疫グロブリンがマウス腹水由来の抗体と同様の細胞成分を介して処理されることを示している。ガンマ鎖のコンカナバリンAへの結合およびこのグリカンのカンドグリコトダーゼHによる消化に対する耐性は、正しいカッパ鎖N−末端と共に抗体が小胞体からゴルジ体に移動し、細胞膜から分泌されることを示している。ウォルター(Walter)等、Annu.Rev.Cell.Biol.,2:499−516(1986)参照。
13.植物細胞壁における免疫グロブリンの保持
細胞壁を含まない植物プロトプラストからの免疫グロブリンの分泌速度は、本来の植物壁からの免疫グロブリンの分泌速度と比較した。植物細胞からのプロトプラストの調製は、トリコリ(Tricole)等、Plant Cell Report,5:334−337(1986)に報告されている。簡単にいうと、タバコの葉1cm2片をセルリシン(カルバイオケム)、マセラーゼ(カルバイオケム)およびドリセラーゼ(シグマ)を含む混合物中、18時間インキュベートして細胞壁を消化し、その葉からプロトプラストを放出させた。このプロトプラストを、0.4Mマニトール中での遠心で(100×g、2分間)精製した。2×106個のプロトプラストを10μCi mCiの35S−メチオニンを含むマニトール培地0.5mlに懸濁することにより、プロトプラストまたは元の植物細胞から生産される免疫グロブリンをラベル化した。この細胞をラベル培地中で2時間維持し、細胞および培地の一部を採取して抗体6D4へのラベル化メチオニンの取り込みを測定した。インキュベーション培地におけるラベル化6D4抗体の量は、プロテインA−セファロースカラムへの培地中に含まれる免疫グロブリンの吸着およびカラムに吸着した全ラベル量の測定により決定した。細胞中で抗体6D4に取り込まれたラベル化メチオニン量は、ハイアット(Hiatt)等、J.Biol.Chem.,261:1293−1298(1986)に述べられているように、細胞の調製およびその分解物の10%SDS−PAGEゲル電気泳動により測定した。抗体6D4を含むSDS−PAGEゲルの部分を切り出し、そのゲルからラベル化した抗体を溶出した。存在する全ラベル化抗体量を測定した。さらに、100mMメチオニン存在下でラサに2時間維持したのちに同様の測定を行った。
この分泌分析の結果を表9に示す。2時間のラベル後、新たに合成された抗体の一部が、プロトプラストから有意に分泌された。100mMメチオニンによる2時間のチェイス後、ラベル化抗体のほとんどがプロトプラストから培地中に分泌されていた。このことは抗体の分泌が起こっていることを示している。一方、約40%のラベル化抗体が元の細胞壁を有するカルスサスペンジョン細胞系列内に保持された。これらの細胞は、薄い一次細胞壁を有しており、したがってその細胞壁内に抗体を保持してしまう。
プロトプラスト プロテインA 0.33
〃 SDS−PAGE 0.31
カルスサスペンジョン細胞 プロテインA 0.39
〃 SDS−PAGE 0.25
2時間チェイス後の6D4への取り込み
プロトプラスト プロテインA 6.60
〃 SDS−PAGE 6.31
カルスサスペンジョン細胞 プロテインA 2.77
〃 SDS−PAGE 2.14
A.病原特異的可変部をコードするメッセンジャーRNAの単離
所定の抗原に免疫特異的な分泌性IgAは、まず所定のハイブリドーマから可変部コード遺伝子を単離することにより植物中で生産する。メッセンジャーRNAは、ストラタジーン(ラジョラ、CA)によって製造されているRNA単離キットおよびその説明書を用い、チョムジンスキー(Chomczynski)等、Anal.Biochem.,162:156−159(1987)の方法に従って調製した。簡単にいうと、ガラスホモジナイザーを使用して約1×107個の細胞を、4.0Mグアニンイソチオシアネート、0.25Mクエン酸ナトリウム(pH7.0)および0.1M 2−メルカプトエタノールを含む変性溶液10ml中でホモジナイズする。pH4.0の2M 酢酸ナトリウム1mlをホモジナイズした細胞を含む変性溶液に混合する。このホモジネートに、クロロホルム:イソアミルアルコール(24:1v/v)2mlを添加する。このホモジネートを10秒間激しく攪拌し、氷水中で15分間維持した。このホモジネートを厚みのある50mlポリプロピレン遠心チューブ(フィッシャーサイエンティフィックカンパニー、ピックバーグ、PA)に移す。この溶液を4℃、10000×gで20分間遠心し、上のRNA含有水層を新しい50mlポリエチレン遠心チューブに移して等容量のイソプロピルアルコールを混合する。この溶液を−20℃に少なくとも1時間維持してRNAを沈殿させる。沈殿したRNAを含む溶液を、4℃、10000×gで,20分間遠心する。ペレット化した全細胞RNAを回収し、先に述べた変性溶液3mlに溶かした。
この全細胞性RNAに、イサアミルアルコール3mlに溶かした。イソアミルアルコール3mlを全細胞性RNAに添加し、激しく攪拌する。この溶液を−20℃に少なくとも1時間維持してRNAを沈殿させる。RNAの沈殿を含む溶液を4℃、10000×gで10分間遠心する。ペレット化したRNAを75%エタノールを含む溶液を洗浄した。ペレット化したRNAを減圧化で15分間乾燥し、ついでジメチルピロカーボネート処理した(DEPC−H2O)H2Oに懸濁した。
B.ポリメレースチェーンリアクションを用いた可変部の単離
PCR増幅を目的とした調製物では、プライマー伸長反応によるcDNA合成用のテンプレートとしてて先の実施例で調製したmRNAを使用する。典型的な50μlの転写反応では、まず5−10μgのハイブリドーマmRNAの水溶液を、65℃で5分間かけて500ng(50.0pmol)の3’VHプライマーとハイブリダイス(アニール)する。オランディ(Orlandi)等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.86:3833−3937(1989)参照。つづいて、この混合物を、1.5mM dATP,dCTPおよびdTTP,40mM トリス−HCl(pH8.0),8mM MgCl2,50mM NaCl,および2mM スペルミジンとなるように調整する。この溶液にモロニー・ムライン白血病ウイルス逆転写酵素(26ユニット、ストラタジーン)を添加し、37℃に1時間維持する。
PCR増幅は、逆転写反応産物(約5μgのcDNA/RNAハイブリッド)、オランディ(Orlandi)等、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.86:3833−3937(1989)に述べられている3’VHプライマー300ng、オランディ(Orlandi)等、(上述)に述べられている8個の5’VHプライマー各300ng,200mM dNTP混合物、501mM KCl,10mM トリス−HCl(pH8.3),15mM MgCl2,0.1%ゼラチンおよび2ユニットTaq DNAポリメラーゼを含む100μlの反応液で行う。この反応物にミネラルオイルを重層し、増幅を40サイクル行う。各増幅サイクルには、92℃、1分間の変性、52℃、2分間のアニーリング、およひ72℃、1.5分間のプライマー伸長によりポリヌクレオチド合成(伸長反応)が含まれる。増幅されるVH−コードDNAホモログ含有サンプルを、フェノール−クロロホルムで2回およびクロロホルムで1回抽出し、エタノール沈殿後、10mM トリス−HCl(pH7.5)および1mM EDTAを含む溶液に溶解して−70℃で保存した。
C.植物発現ベクターへの病原体特異的重鎖および軽鎖可変部の挿入
先に述べたように、病原体特異的重鎖および軽鎖可変部を単離し、IgAの不変部を含む植物発現ベクターに挿入する。標準的分子生物学的技術を用いて、このベクターを構築する。このベクターは、実施例1で述べた抗体6D4由来の免疫グロブリンシグナル配列および完全に配列決定され、オーフレー(Auffray)等、Gene,13:365−374(1981)に報告されているMOPC315から単離した免疫グロブリンα不変部の両方を含むpMON530の誘導体である。また、このベクターには、免疫グロブリンシグナル配列およびIgA不変部遺伝子の間にポリリンカー部分が含まれ、病原体特異的重鎖可変部の挿入が容易となっている。ポリリンカー中に存在する制限エンドヌクレアーゼ部位は、重鎖可変部の単離に使用するPCRプライマー中に存在する制限エンドヌクレアーゼ部位に一致する。ベクターを適当な制限酵素で切断し、かつ可変部を単離するのに用いたPCRプライマー中に存在する適当な制限酵素部位で病原体特異的可変部を切断することにより、病原体特異的重鎖可変部をベクターに挿入する。ついで、このベクターに病原体特異的可変部をライゲーションする。
このベクターを実施例4で述べた方法を用いて植物に導入する。病原体特異的IgA重鎖を含む植物が同定され、これを病原体特異的重鎖可変部含有植物と交配する。
病原体特異的重鎖可変部含有植物と同様の技術を用いて、適当な軽鎖に結合した病原体特異的軽鎖可変部を含む植物を作製する。
pMON530ベクターなどの植物発現ベクターに分泌要素をコードする遺伝子を導入することにより、IgAの分泌要素を含む植物を作製する。分泌要素の配列は、モストフ(Mostov)等、Nature,308:37(1984)に報告されている。標準的分子生物学的技術を用い、適当なシグナル配列とともに分泌要素遺伝子をpMON530ベクターに挿入する。この分泌要素含有ベクターを用いて植物細胞をトランスホームし、分泌要素を含み、これを発現する植物を作製する。
分泌要素、軽鎖および重鎖に関して述べられているように、植物発現ベクターにJ鎖をコードする遺伝子を挿入することにより、免疫グロブリンIgAのJまたは結合鎖を含む植物を作製する。J鎖遺伝子の配列は、マックス(Max)等、J.Exp.Med.,161:832−849(1985)に報告されている。さらに、他のJ鎖の配列は、免疫学的に重要な蛋白質の配列、第四編、アメリカ、デパートメント・オブ・ヘルス・アンド・ヒューマン・サービス(1987)から入手できる。このベクターを用いJ鎖を発現する植物を作製する。
これらのJ鎖発現植物と分泌要素を発現する植物と交配し、分泌要素およびJ鎖の両方を発現する植物を作製する。これらの植物を病原体特異的IgA抗体を発現する植物と交配し、二つのIgA分子、分泌要素およびJ鎖からなる真の分泌性IgAを発現する植物を作製する。
分泌性IgAを生産する植物を実施例11にしたがって生産する。これらの植物は、赤痢菌トキシンに免疫特異的な分泌性IgAを生産した。この分泌性IgAは、13C2(ATCC#CRL1794)と命名したハイブリドーマから重鎖および軽鎖可変部を単離することにより生産した。分泌性IgAを発現する植物は、植物物質10−100グラム当たり約1ミリグラムの分泌性IgAを含ん
でいた。これらの植物を収穫し、この植物が新鮮なうちに受動免疫に使用する。
毎日1−4回、分泌性IgAを発現する植物10−100グラムを摂取させることにより受動免疫が必要とされる成人を免疫化する。この免疫グロブリン摂取は、全部で三日間行い、ついで赤痢菌トキシンを含むバクテリアを摂取することにより受動免疫の誘導を分析する。成人は、炭酸水素ナトリウムを含む水1オンスに懸濁した赤痢菌約1.2×109コロニー形成ユニットを摂取する。約15分から30分後、その成人は、分泌性IgAを含む植物10−100グラム以上を摂取する。
バクテリア摂取から1から2日後、その成人について下痢の状態をモニターする。分泌性IgA含有植物を摂取せず、同じバクテリアを摂取した成人に比べ、分泌性IgAを含む植物を摂取した成人の下痢の発生は非常に減少する。
小児には、通常の食事への補填物として、三回以上に分けて1日に必要な植物物質量に存在する6−600mgの抗体等価物を与える。小児を通常の赤痢菌に曝した後、赤痢の症状を測定する。分泌性IgAを含む植物物質を摂取せず同様の赤痢菌を受けた小児に対して赤痢菌トキシンに特異的な分泌性IgAを含む植物物質を受けた小児の赤痢の症状は非常に減少する。
これまでの事項は本発明を説明するためのものであり、これを制限するものではない。これらを本発明の精神および範囲を逸脱すること無しに修正および変化しうることは明白である。
Claims (42)
- 二種類のポリペプチドから形成されるグリコシル化哺乳類ヘテロマルチマー及び植物物質を含むグリコポリペプチドマルチマー組成物であって、前記マルチマー組成物がシアル酸残基を含まず、前記植物物質が双子葉植物由来若しくは米とトウモロコシから選択される単子葉植物由来である、上記グリコポリペプチドマルチマー組成物。
- ポリペプチドが、重鎖または軽鎖免疫グロブリン可変部アミノ酸残基配列を含む免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列を有する、請求項1記載のグリコポリペプチドマルチマー組成物。
- 少なくとも一つの触媒部位または酵素部位を含む、請求項1記載のグリコポリペプチドマルチマー組成物。
- 第一及び第二のポリペプチド及び植物物質を含むグリコポリペプチドマルチマー組成物であって、第一のポリペプチドが第一の免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列を含み、かつ第一のポリペプチドは前記第一の免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列と異なる第二の免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列を含む第二のポリペプチドに結合しており、第一及び第二のポリペプチド中の免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列は、抗原と特異的に結合しうる、互いに結合した免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖の免疫学的活性部分を形成しており、かつ前記組成物が検出可能なシアル酸を含まず、また前記植物物質が双子葉植物由来若しくは米とトウモロコシから選択される単子葉植物由来である、グリコポリペプチドマルチマー組成物。
- 前記第一の免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列が、免疫グロブリン重鎖可変部アミノ酸残基配列を含む請求項4記載のグリコポリペプチドマルチマー組成物。
- 前記第二の免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列が、免疫グロブリン軽鎖可変部アミノ酸残基配列を含む請求項4記載のグリコポリペプチドマルチマー組成物。
- 前記第一の免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列が免疫グロブリン重鎖可変部アミノ酸残基配列を含み、および前記第二の免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列が免疫グロブリン軽鎖可変部アミノ酸残基配列を含む請求項4記載のグリコポリペプチドマルチマー組成物。
- 前記第一の免疫グロブリンアミノ酸残基配列が触媒部位の第一部分を規定し、ならびに前記第二の免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列が該触媒部位の第二部分を規定し、かつ該第一および第二部分が会合して該触媒部位を形成する請求項4記載のグリコポリペプチドマルチマー組成物。
- 前記第一の免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列が、触媒部位の一部を規定する免疫グロブリン重鎖可変部のアミノ酸残基配列を含む請求項4記載のグリコポリペプチドマルチマー組成物。
- 前記第二の免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列が、触媒部位の一部を規定する免疫グロブリン軽鎖可変部のアミノ酸残基配列を含む請求項4記載のグリコポリペプチドマルチマー組成物。
- 前記第一の免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列が、触媒部位の第一部分を規定する免疫グロブリン重鎖可変部のアミノ酸残基配列を含み、ならびに前記第二の免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列が、触媒部位の第二部分を規定する免疫グロブリン軽鎖可変部のアミノ酸残基配列を含み、かつ該第一および第二部分が会合して該触媒部位を形成する請求項4記載のグリコポリペプチドマルチマー組成物。
- (i)免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列を有し、マウス免疫グロブリン結合レクチンに結合しない第一のポリペプチド、および
(ii)異なる免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列を含み、前記第一のポリペプチドに結合する第二のポリペプチド、および
(iii)植物物質、
を含み、第一及び第二のポリペプチド中の免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列は、抗原と特異的に結合しうる、互いに結合した免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖の免疫学的活性部分を形成しており、かつ前記組成物が検出可能なシアル酸を含まず、また前記植物物質が双子葉植物由来若しくは米とトウモロコシから選択される単子葉植物由来である、グリコポリペプチドマルチマー組成物。 - 前記免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列が免疫グロブリン重鎖可変部アミノ酸残基配列を含む請求項12記載のグリコポリペプチドマルチマー組成物。
- 前記異なる免疫グロブリン分子アミノ酸残基配列が免疫グロブリン軽鎖可変部アミノ酸残基配列を含む請求項12記載のグリコポリペプチドマルチマー組成物。
- 前記マウス免疫グロブリン結合レクチンが小麦胚芽アグルチニンである請求項12記載のグリコポリペプチドマルチマー組成物。
- 前記マウス免疫グロブリン結合レクチンがリシナス コムニス(Ricinus communis)アグルチニンである請求項12記載のグリコポリペプチドマルチマー組成物。
- 該植物物質が、植物細胞壁、植物細胞器官、植物細胞質、植物プロトプラスト、植物細胞、無処置植物、生植物、植物葉抽出物、植物葉ホモジネート、薬用植物からの誘導物質およびクロロフィルからなる群から選択される、請求項1、4または12記載のマルチマー組成物。
- 前記植物物質が、存在する100ngのグリコポリペプチドマルチマー当たり植物物質が10000gから10gのグリコポリプチドマルチマー当たり植物物質が100ngの比率で存在する、請求項1、4または12記載のマルチマー組成物。
- 二種類のポリペプチドから形成されるグリコシル化哺乳類ヘテロマルチマーと植物物質とを含むカプセル化したグリコポリペプチドマルチマー組成物であって、該グリコポリペプチドの一つが、抗原と特異的に結合しうる、互いに結合した免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖の免疫学的活性部分を形成している、免疫グロブリンアミノ酸残基配列を含み、及び該マルチマー組成物がシアル酸残基を含まず、前記植物物質が植物由来若しくは米とトウモロコシから選択される単子葉植物由来である、上記マルチマー組成物。
- 前記カプセルが植物細胞または腸溶コーティングである請求項19記載の組成物。
- 二種類のポリペプチドから形成されるグリコシル化哺乳類ヘテロマルチマーと植物物質とを含むグリコポリペプチドマルチマー組成物であって、該グリコポリペプチドの一つが(a)免疫グロブリンアミノ酸残基配列を有するポリペプチドであり、及び該マルチマー組成物がシアル酸残基を含まず、かつ少なくとも一つの触媒部位を有し、前記植物物質が双子葉植物由来若しくは米とトウモロコシから選択される単子葉植物由来である、上記マルチマー組成物。
- 二種類のマルチマー形成ポリペプチドコード哺乳類遺伝子、及び該遺伝子によってコードされる二種類のマルチマー形成ポリペプチドであって、互いに会合してポリペプチドマルチマーとなっているマルチマー形成ポリペプチド、を含む植物細胞を含み、米とトウモロコシから選択される単子葉植物である、トランスジェニック植物。
- 前記二種類のマルチマー形成ポリペプチドコード哺乳類遺伝子が、分泌シグナル配列を含む免疫グロブリン重鎖部分含有ポリペプチドをコードする少なくとも一つの遺伝子、及び分泌シグナル配列を含む免疫グロブリン軽鎖部分含有ポリペプチドをコードする少なくとも別の遺伝子を含み、前記ポリペプチドマルチマーが抗体である、請求項22記載のトランスジェニック植物。
- 前記抗体がFabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)2フラグメントまたはFvフラグメントである、請求項23記載の植物。
- 前記免疫グロブリン重鎖部分含有ポリペプチド若しくは前記免疫グロブリン軽鎖部分含有ポリペプチド、または両者いずれもが完全長より短い、請求項23記載の植物。
- 前記ポリペプチドマルチマーが酵素、アブザイムまたは所定のリガンドを特異的に結合しうるレセプターである請求項22記載の植物。
- マルチマー蛋白を生産しうるトランスジェニック植物の作製方法であって、以下の(a)〜(d)を含む方法。
(a) 分泌シグナル配列を含む、マルチマー形成哺乳類ポリペプチドをコードする第一遺伝子を第一植物種のゲノムに導入し、第一トランスホーマントを生成する、
(b) 分泌シグナル配列を含む、異なるマルチマー形成哺乳類ポリペプチドをコードする第二の遺伝子を第二の同じ植物種のゲノムに導入し、第二トランスホーマントを生成する、
(c) 該第一及び第二トランスホーマントから子孫集団を生成する、及び
(d) 該子孫集団から該マルチマー蛋白を生産するトランスジェニック植物を単離する、
ただし前記植物は米とトウモロコシから選択される単子葉植物である。 - 前記第一遺伝子が分泌シグナル配列を有する免疫グロブリン重鎖部分含有ポリペプチドをコードし、前記第二遺伝子が分泌シグナル配列を有する免疫グロブリン軽鎖部分含有ポリペプチドをコードし、及び前記マルチマー蛋白が抗体である、請求項27記載の方法。
- 前記子孫集団から、抗体を生産する植物種が単離され、前記免疫グロブリン重鎖部分含有ポリペプチド若しくは前記免疫グロブリン軽鎖部分含有ポリペプチド、または両者いずれもが完全長より短い、請求項28記載の方法。
- 前記子孫集団からFabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)2フラグメントまたはFvフラグメントを生産する植物種を単離することを特徴とする請求項28記載の方法。
- 抗体の製造方法であって、以下の(a)〜(c)を含む方法。
(a) 請求項22に記載のトランスジェニック植物を培養する、
(b) 該トランスジェニック植物を収穫する、及び
(c) 収穫した植物から抗体を回収する。 - 前記回収ステップが、(i) 収穫した植物の少なくとも一部をホモジナイズし、パルプとすること、及び(ii)該パルプから抗体を抽出することを含む請求項31記載の方法。
- 以下を含む、グリコポリペプチドマルチマーを生産するトランスジェニック植物を作製する方法。
(a) グリコポリペプチドマルチマーの構成部分であるN−結合グリコシル化シグナルを有するマルチマー形成ポリぺプチドをコードする第一哺乳類遺伝子を第一植物種のゲノムに導入し、第一トランスホーマントを生成すること、
(b) グリコポリぺプチドマルチマーの構成部分である別のマルチマー形成モノマーポリペプチドをコードする第二の哺乳類遺伝子を第二の同じ植物種のゲノムに導入し、第二トランスホーマントを生成すること、
(c) 該第一及び第二トランスホーマントから子孫集団を生成すること、及び
(d) 該子孫集団から該グリコポリペプチドマルチマーを生産するトランスジェニック植物を単離すること、
ただし前記植物は米とトウモロコシから選択される単子葉植物である。 - 前記第一哺乳類遺伝子が免疫グロブリン重鎖部分含有ポリペプチドをコードし、前記第二哺乳類遺伝子が免疫グロブリン軽鎖部分含有ポリペプチドをコードし、及び前記グリコポリペプチドマルチマーがグリコシル化抗体である、請求項33記載の方法。
- 前記第一及び第二哺乳類遺伝子を分離ベクターにより導入することを特徴とする、請求項33記載の方法。
- Fabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)2フラグメントまたはFvフラグメントの形態の抗体を生産する植物種が前記子孫集団から単離されることを特徴とする、請求項33記載の方法。
- 前記子孫集団がグリコシル化抗体を生産する植物種であり、前記免疫グロブリン重鎖部分含有ポリペプチド若しくは前記免疫グロブリン軽鎖部分含有ポリペプチド、または両者いずれもが完全長より短い、請求項34記載の方法。
- 以下を含む、双子葉植物若しくは米とトウモロコシから選択される単子葉植物:
a)免疫グロブリン重鎖部分含有ポリペプチド及び免疫グロブリン軽鎖部分含有ポリペプチドを含む免疫グロブリン一本鎖ポリペプチド生成物をコードし、かつ分泌シグナルを形成するリーダー配列をコードするヌクレオチド配列を含む植物細胞;及び
b)該ヌクレオチド配列によりコードされる免疫グロブリン一本鎖ポリペプチド生成物であって、該リーダー配列がタンパク質分解プロセスに続いて該ポリペプチド生成物から開裂するものであるポリペプチド生成物。 - 前記免疫グロブリン生成物が一本鎖Fv抗原結合蛋白質である、請求項38記載の植物。
- 前記免疫グロブリン生成物が抗体に特異的に結合することができる、請求項38記載の植物。
- 前記免疫グロブリン生成物がアブザイムである、請求項38記載の植物。
- 前記免疫グロブリン生成物がパラトープを含む、請求項38記載の植物。
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US7005560B1 (en) * | 1989-10-27 | 2006-02-28 | The Scripps Research Institute | Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies |
US5665595A (en) * | 1991-06-07 | 1997-09-09 | Dowelanco | Immunoglobulins against insect tissue |
IT1248361B (it) * | 1991-06-28 | 1995-01-05 | Enea | Vettori plasmidici per l'espressione di geni in piante |
GB9319429D0 (en) | 1993-09-21 | 1993-11-03 | London Health Ass | Methods and products for controlling immune responses in mammals |
US5693506A (en) * | 1993-11-16 | 1997-12-02 | The Regents Of The University Of California | Process for protein production in plants |
IT1264083B1 (it) * | 1993-12-10 | 1996-09-10 | Enea Ente Nuove Tec | Procedimento per la produzione in piante di anticorpi ingegnerizzati, anticorpi prodotti e loro uso in diagnosi e terapia. |
US6140466A (en) | 1994-01-18 | 2000-10-31 | The Scripps Research Institute | Zinc finger protein derivatives and methods therefor |
TW414713B (en) * | 1994-05-12 | 2000-12-11 | Dentsply Gmbh | Fluoride releasing liquid dental primer product and method |
US5686600A (en) * | 1994-06-28 | 1997-11-11 | Novartis Finance Corporation | Antibodies which bind to insect gut proteins and their use |
US6080560A (en) * | 1994-07-25 | 2000-06-27 | Monsanto Company | Method for producing antibodies in plant cells |
US6140075A (en) * | 1994-07-25 | 2000-10-31 | Monsanto Company | Method for producing antibodies and protein toxins in plant cells |
CN1183802A (zh) | 1994-12-30 | 1998-06-03 | 行星生物技术有限公司 | 在植物中生产含有保护性蛋白质的免疫球蛋白的方法和应用 |
US6046037A (en) * | 1994-12-30 | 2000-04-04 | Hiatt; Andrew C. | Method for producing immunoglobulins containing protection proteins in plants and their use |
US6808709B1 (en) * | 1994-12-30 | 2004-10-26 | The Regents Of The University Of California | Immunoglobulins containing protection proteins and their use |
FR2736930B1 (fr) | 1995-07-17 | 1997-09-19 | Biocem | Procede de production, par des cellules vegetales, de proteines heminiques, proteines ainsi obtenues et produits contenant ces proteines |
WO1997029200A1 (de) * | 1996-02-08 | 1997-08-14 | Institut für Pflanzengenetik und Kulturpflanzenforschung | Kassetten zur expression von lagerstabilen proteinen in pflanzen |
US5855881A (en) * | 1996-02-22 | 1999-01-05 | Loike; John D. | Mammalian alcohol dehydrogenase and aldehyde dehydrogenase production in plants |
DE69724428T3 (de) * | 1996-06-07 | 2009-07-23 | Poniard Pharmaceuticals, Inc., Seattle | Humanisierte antikörper die an das gleiche antigen wie antikörper nr-lu-13 binden und deren verwendung in "pretargeting" verfahren |
CA2276046A1 (en) | 1997-01-10 | 1998-07-16 | Epicyte Pharmaceutical, Inc. | Novel epithelial tissue targeting agent |
US6045774A (en) * | 1997-01-10 | 2000-04-04 | Epicyte Pharmaceutical Inc. | J chain polypeptide targeting molecule linked to an imaging agent |
CN101613718A (zh) | 1997-08-12 | 2009-12-30 | 北卡罗莱纳州立大学 | 基因工程浮萍 |
US7161064B2 (en) * | 1997-08-12 | 2007-01-09 | North Carolina State University | Method for producing stably transformed duckweed using microprojectile bombardment |
US6251392B1 (en) | 1997-10-20 | 2001-06-26 | Epicyte Pharmaceuticals, Inc. | Epithelial cell targeting agent |
US5990385A (en) * | 1997-11-10 | 1999-11-23 | Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Minister Of Agriculture And Agri-Food | Protein production in transgenic alfalfa plants |
CA2220563C (en) * | 1997-11-10 | 2008-06-03 | Her Majesty The Queen, In Right Of Canada, As Represented By The Ministe R Of Agriculture | Protein production in transgenic alfalfa plants |
GB9726955D0 (en) * | 1997-12-19 | 1998-02-18 | Zeneca Ltd | Improvements in or relating to organic compounds |
AU771908C (en) * | 1998-12-09 | 2005-03-10 | Phyton Holdings, Llc | A method for manufacturing glycoproteins having human-type glycosylation |
US6395962B1 (en) | 1999-06-22 | 2002-05-28 | University Of South Carolina | Enhancing expression of a silenced target sequence in plants using plant viral enhancers and amplicons |
IL149271A0 (en) * | 1999-10-26 | 2002-11-10 | Plant Res Int Bv | Mammalian-type glycosylation in plants |
CA2394015C (en) | 1999-12-20 | 2013-11-05 | Immunex Corporation | Tweak receptor |
DE60139864D1 (de) * | 2000-04-28 | 2009-10-22 | Planet Biotechnology Inc | Immunoadhesin zur impfung gegen rhinovirus |
US20060015969A1 (en) * | 2000-04-28 | 2006-01-19 | Planet Biotechnology, Inc. | Novel immunoadhesins for treating and prventing toxicity and pathogen-mediated diseases |
US6696620B2 (en) * | 2000-05-02 | 2004-02-24 | Epicyte Pharmaceutical, Inc. | Immunoglobulin binding protein arrays in eukaryotic cells |
US7304208B2 (en) * | 2000-05-02 | 2007-12-04 | Ventria Bioscience | Expression of human serum albumin (HSA) in monocot seeds |
US7632983B2 (en) * | 2000-07-31 | 2009-12-15 | Biolex Therapeutics, Inc. | Expression of monoclonal antibodies in duckweed |
US20060064782A1 (en) * | 2000-12-18 | 2006-03-23 | Conopco, Inc. | Production of antibodies |
US7098383B2 (en) * | 2000-12-19 | 2006-08-29 | Sembiosys Genetics Inc. | Methods for the production of multimeric immunoglobulins, and related compositions |
ZA200306406B (en) | 2001-01-19 | 2004-09-06 | Dow Chemical Co | Method for secretory production of glycoprotein having human-type sugar chain using plant cell. |
CN1541059A (zh) * | 2001-03-06 | 2004-10-27 | �Ϻ���ͨ��ѧ | 具有动物型糖链加成功能的植物细胞 |
CA2448096A1 (en) * | 2001-05-30 | 2002-12-05 | Chromos Molecular Systems, Inc. | Plant artificial chromosomes, uses thereof and methods of preparing plant artificial chromosomes |
US20030033637A1 (en) * | 2001-06-05 | 2003-02-13 | Croptech Corporation | Gene expression and production of TGF-beta proteins including bioactive mullerian inhibiting substance from plants |
JP2004535192A (ja) * | 2001-06-08 | 2004-11-25 | イコン ジェネティクス インコーポレイティッド | 植物中におけるタンパク質の産生 |
WO2003012035A2 (en) * | 2001-07-27 | 2003-02-13 | Icon Genetics, Inc. | Commercial use of arabidopsis for production of human and animal therapeutic and diagnostic proteins |
CA2459141A1 (en) * | 2001-08-27 | 2003-03-06 | Advanced Bionutrition Corporation | Delivery of disease control in aquaculture and agriculture using nutritional feeds containing bioactive proteins produced by viruses |
JP4472336B2 (ja) * | 2001-09-14 | 2010-06-02 | アドバンスド バイオニュートリション コーポレーション | 治療用蛋白質の生産システムとしての甲殻類 |
US7550647B2 (en) * | 2001-09-14 | 2009-06-23 | Advanced Bionutrition | Transfected shrimp as production systems for therapeutic proteins |
US20070118934A1 (en) * | 2001-10-26 | 2007-05-24 | Planet Biotechnology, Inc. | Chimeric toxin receptor proteins and chimeric toxin receptor proteins for treatment and prevention of anthrax |
EP1537255A2 (en) * | 2002-02-05 | 2005-06-08 | Elisha Holding LLC | Method for treating metallic surfaces and products formed thereby |
US20040188262A1 (en) * | 2002-02-05 | 2004-09-30 | Heimann Robert L. | Method for treating metallic surfaces and products formed thereby |
WO2003073982A2 (en) * | 2002-02-28 | 2003-09-12 | Eli Lilly And Company | Anti-interleukin-1 beta analogs |
KR101196023B1 (ko) * | 2002-03-19 | 2012-10-30 | 스티칭 디엔스트 랜드보위쿤디그 온데조에크 | 식물에서 글리칸 프로세싱의 최적화 |
NZ534881A (en) | 2002-03-19 | 2006-09-29 | Plant Res Internat B | Mammalian GnTIII expression in plants |
EP1517605A2 (en) | 2002-06-28 | 2005-03-30 | University of Guelph | Harvest-inducible genes from alfalfa (medicago sativa) and methods of use thereof |
US7329798B2 (en) * | 2002-06-28 | 2008-02-12 | University Of Guelph | Harvest-inducible regulatory elements and methods of using same |
WO2004031362A2 (en) * | 2002-10-03 | 2004-04-15 | Large Scale Biology Corporation | Multimeric protein engineering |
US6920521B2 (en) * | 2002-10-10 | 2005-07-19 | International Business Machines Corporation | Method and system of managing virtualized physical memory in a data processing system |
CL2003002461A1 (es) * | 2002-11-27 | 2005-01-07 | Dow Chemical Company Agroscien | Inmunoglobulina que comprende al menos un glicano afucosilado, composicion que la contiene, secuencia nucleotidica y vector que la comprende, procedimiento para producir dicha inmunoglobulina en plantas. |
JP4405736B2 (ja) | 2003-01-31 | 2010-01-27 | コニカミノルタホールディングス株式会社 | データベースシステム |
DE10325814A1 (de) * | 2003-06-06 | 2004-12-23 | Icon Genetics Ag | Sichere Erzeugung eines gewünschten Produkts in hybriden Samen |
DK1633876T3 (da) * | 2003-06-17 | 2008-12-08 | Sembiosys Genetics Inc | Fremgangsmåde til fremstilling af insulin i planter |
DK1678314T3 (da) | 2003-10-22 | 2012-12-03 | Keck Graduate Inst | Fremgangsmåde til syntetisering af heteromultimere polypeptider i gær ved anvendelse af en haploid parringsstrategi |
TW200526778A (en) * | 2003-11-14 | 2005-08-16 | Sembiosys Genetics Inc | Methods for the production of apolipoproteins in transgenic plants |
WO2005056578A2 (en) * | 2003-12-09 | 2005-06-23 | Ventria Bioscience | High-level expression of fusion polypeptides in plant seeds utilizing seed-storage proteins as fusion carriers |
US7622573B2 (en) | 2006-01-17 | 2009-11-24 | Biolex, Inc. | Expression control elements from the lemnaceae family |
EP3438131B1 (en) | 2006-02-10 | 2022-03-16 | Life Technologies Corporation | Oligosaccharide modification and labeling of proteins |
BRPI0714893A2 (pt) | 2006-09-05 | 2013-05-28 | Medarex Inc | anticorpo monoclonal isolado ou uma porÇço de ligaÇço ao seu antÍgeno, um fragmento de anticorpo, um anticorpo mimÉtico, imunoconjugado, composiÇço molÉcula de Ácido nuclÉico isolada, vetor de expressço, cÉlula hospedeira, mÉtodo para preparar um anticorpo anti-bmp2 ou anti-bmp4, mÉtodo para tratar ou prevenir uma doenÇa associada com formaÇço àssea normal e ossificaÇço, hibridoma e metodo para preparar o anticorpo |
AU2008237632B2 (en) | 2007-04-17 | 2014-01-16 | Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek | Mammalian-type glycosylation in plants by expression of non-mammalian glycosyltransferases |
PL2164514T3 (pl) | 2007-05-21 | 2017-08-31 | Alderbio Holdings Llc | Przeciwciała przeciwko IL-6 i ich zastosowanie |
EP2227556B1 (en) | 2007-11-19 | 2014-08-27 | Celera Corporation | Lung cancer markers and uses thereof |
WO2009070642A1 (en) * | 2007-11-28 | 2009-06-04 | Medimmune, Llc | Protein formulation |
NZ602166A (en) | 2008-11-25 | 2014-02-28 | Alder Biopharmaceuticals Inc | Antibodies to il-6 and use thereof |
CN102271704A (zh) | 2008-11-28 | 2011-12-07 | 梅里亚有限公司 | 重组禽流感疫苗及其用途 |
WO2010138631A1 (en) | 2009-05-26 | 2010-12-02 | Biolex Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for production of aglycosylated plasminogen |
FR2947824B1 (fr) * | 2009-07-09 | 2011-10-07 | Michel Mazon | Procede et installation de valorisation des polyolefines |
JP5933451B2 (ja) | 2009-12-28 | 2016-06-08 | メリアル リミテッド | 組換えndv抗原及びその使用 |
AU2011332817A1 (en) | 2010-11-23 | 2013-06-13 | Alder Biopharmaceuticals, Inc. | Anti-IL-6 antibodies for the treatment of anemia |
US20140216118A1 (en) | 2011-06-14 | 2014-08-07 | Synthon Biopharmaceuticals B.V. | Compositions and Methods for Making and Biocontaining Auxotrophic Transgenic Plants |
US9896695B2 (en) | 2012-02-02 | 2018-02-20 | Consejo Nacional De Investigaciones Cientificas Y Tecnicas (Conicet) | HAHB11 provides improved plant yield and tolerance to abiotic stress |
WO2013136273A2 (en) | 2012-03-13 | 2013-09-19 | University Of Guelph | Methods of increasing tolerance to heat stress and amino acid content of plants |
US20150203864A1 (en) | 2012-03-13 | 2015-07-23 | University Of Guelph | Myb55 promoter and use thereof |
US9616114B1 (en) | 2014-09-18 | 2017-04-11 | David Gordon Bermudes | Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity |
EA038931B9 (ru) * | 2014-11-20 | 2022-02-18 | Йиссум Рисерч Дивелопмент Компани Оф Зе Хебрю Юниверсити Оф Иерусалим Лтд. | Композиции и способы получения полипептидов с модифицированным профилем гликозилирования в клетках растений |
US11180535B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-11-23 | David Gordon Bermudes | Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria |
US11129906B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-09-28 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
EP3712611A4 (en) | 2017-12-20 | 2021-05-26 | Unicharm Corporation | PROCESS FOR EVALUATING THE LEVEL OF PURITY OF RECYCLING MATERIAL, PROCESS FOR MANUFACTURING RECYCLING MATERIAL, RECYCLING PULP FIBER AND PROCESS FOR MANUFACTURING RECYCLED PULP FIBER |
JP6907147B2 (ja) * | 2018-03-30 | 2021-07-21 | ユニ・チャーム株式会社 | リサイクル資材の清浄度を評価する方法、及び使用済の衛生用品からリサイクル資材を製造する方法 |
Family Cites Families (10)
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GB8308235D0 (en) * | 1983-03-25 | 1983-05-05 | Celltech Ltd | Polypeptides |
US4816567A (en) * | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
US4771002A (en) * | 1984-02-24 | 1988-09-13 | Lubrizol Genetics, Inc. | Transcription in plants and bacteria |
US4956282A (en) * | 1985-07-29 | 1990-09-11 | Calgene, Inc. | Mammalian peptide expression in plant cells |
SE8605621D0 (sv) * | 1986-12-30 | 1986-12-30 | Biokonsult Ab | Heteromultimeric proteins and their manufacture |
IL85035A0 (en) * | 1987-01-08 | 1988-06-30 | Int Genetic Eng | Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same |
GB8901677D0 (en) * | 1989-01-26 | 1989-03-15 | Ici Plc | Hybrid seed production |
GB8901674D0 (en) * | 1989-01-26 | 1989-03-15 | Ici Plc | Regulation of plant gene expression |
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