JP4042815B2 - リガンドに結合している物質の測定装置、及び測定方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンパク質等のリガンドに結合した測定対象物質だけを特異的に測定することができる測定装置、及び測定方法に関し、分析化学、生命科学、及び臨床検査等の分野において特に有用なものである。
【０００２】
【従来の技術】
生体内において、物質はリガンドとなる物質と結合した形態で生体内を移動し、貯蔵され、そして使用されることが多い。
例えば、アルミニウム、鉄、銅、及び亜鉛等の金属やホルモンは、タンパク質等のリガンドと結合して存在することが多い。
近年、リガンドと結合した金属の生体内での挙動が注目を浴びてきた。
例えば、アルツハイマー型痴呆症とアルミニウムの因果関係が推測されているが、この痴呆症や神経障害において注目すべきアルミニウムは、脳関門を通過することができるトランスフェリンと結合したアルミニウムである。
また、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）やアルミニウム骨症では、トランスフェリン結合型以外のアルミニウムの関与が推測されている。
このように、リガンドと結合している金属とリガンドと結合していない遊離の金属を分別して測定することは、デフェロオキサミン製剤などの薬剤による治療効果の判定、疾病の診断、及び予防等において大変重要になってきている。
【０００３】
これまで、試料中の上記の金属の測定には、原子吸光装置又はフレームレス原子吸光装置が用いられてきた。しかしながら、原子吸光装置及びフレームレス原子吸光装置とも試料を高温に加熱して原子化するものであり、リガンドに結合している金属とリガンドに結合していない遊離の金属を分離することができず、リガンドに結合している金属だけを測定するものではなかった。
また、測定しようとする金属と、この測定しようとする金属に対してキレート結合するキレート発色剤を含む試薬とを混合し、生じる吸光度より試料中の金属を測定する吸光光度法や蛍光法も行われてきた。
例えば、測定しようとする金属が鉄の場合、キレート発色剤としては、２−ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）−フェノール、又はバソフェナンスロリンスルホン酸塩等が、銅の場合、キレート発色剤としては４−（３，５−ジブロモ−２−ピリジルアゾ）−Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリンナトリウム、２−（２−チアゾリルアゾ）−４−メチル−５−スルホメチルアミノ安息香酸、又はバソクプロインスルホン酸塩等が用いられる。
【０００４】
しかし、やはりこの吸光光度法や蛍光法においてもリガンドに結合している金属とリガンドに結合していない遊離の金属を分離することができず、リガンドに結合している金属だけを測定することはできなかった。
なお、前段にアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過等のクロマトグラフィー手法を用い、次にこのクロマトグラフィーにより分離されたリガンドに結合している測定対象物質をフレームレス原子吸光装置により測定する方法が知られていた。（「Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｚｉｎｃ Ａｍｏｎｇｓｔ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ Ａｔｏｍｉｃ−ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ」Ｊ．Ｆｏｏｔｅら著，Ａｎａｌｙｓｔ誌，１０８巻，４９２〜５０４頁，１９８３年、「Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎＶｉｔｒｏ ｏｆ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｕｍｉｎｕｍ ｉｎ Ｄｉａｌｙｓｉｓａｆｔｅｒ Ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ Ｃｈｅｌａｔｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｙ」Ｆ．Ｌｅｕｎｇら著，ＣＬＩＮ．ＣＨＥＭ．誌，３１巻，２０〜２３頁，１９８５年、「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ Ａｌｕｍｉｎｉｕｍ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｕｒｅｍｉｃ Ｓｅｒｕｍ ｂｙ Ｆａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｗｉｔｈ Ｅｌｅｃｔｒｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｔｏｍｉｃ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」Ａ．Ｓｏｌｄａｄｏら著，Ａｎａｌｙｓｔ誌，１２２巻，５７３〜５７７頁，１９９７年）
【０００５】
しかし、このフレームレス原子吸光装置は、大変高価であり、また広いスペースを必要とし配管や換気装置が必要であって設置場所が限定されるものであり、そして試料溶液を原子化する炭素炉が測定のたびに消耗し約１００回測定するたびに交換しなければならず、煩雑であり費用がかかるものであった。
更に、前段にアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過等のクロマトグラフィー手法を用い、次にこのクロマトグラフィーにより分離されたリガンドに結合している測定対象物質をフローインジェクション分析により測定する方法も知られていた。（「Ｆｌｏｗ−ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｌｕｍｉｎｕｍ Ｂａｓｅｄ Ｏｎ Ｉｔｓ Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ ８−Ｈｙｄｒｏｘｙｑｕｉｎｏｌｉｎｅ−５−ｓｕｌｐｈｏｎｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｎ Ａ ＭｉｃｅｌｌａｒＭｅｄｉｕｍ」Ｊ．Ａｌｏｎｓｏら著，Ａｎａｌｙｔｉｃａ ＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ誌，２２５巻，３３９〜３５０巻，１９８９年）
しかしながら、このフローインジェクション分析に用いる装置は、複数のポンプ、複数の溶離液、濃度勾配装置、及び流路切り替えバルブなどの特別の装置等を必要とするものであって、高価であり、かつ他の測定に用いることが難しい専用装置であった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
前記のように、従来の測定装置及び測定方法は、リガンドに結合している測定対象物質だけを簡便に測定することはできなかった。
本発明者らは、この問題点の解決を目指して鋭意検討を行った結果、リガンドに対する特異的結合物質を固定した担体よりなる第１のカラム、及び他の物質と結合した信号物質及び遊離の信号物質と測定対象物質と結合した信号物質とを分離することができる担体よりなる第２のカラムを備える液体クロマトグラフィー装置により、リガンドに結合している測定対象物質とリガンドに結合していない測定対象物質とを分離でき、そして他の物質と結合した信号物質及び遊離の信号物質と測定対象物質と結合した信号物質とを分離することができることを見い出し、簡便に試料中のリガンドに結合している測定対象物質だけを特異的に測定することができる測定装置、及び測定方法を完成するに至った。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ポンプ、試料導入部、リガンドに対する特異的結合物質を固定した担体よりなる第１のカラム、他の物質と結合した信号物質及び遊離の信号物質と測定対象物質と結合した信号物質とを分離することができる担体よりなる第２のカラム、及び検出部よりなる、試料中のリガンドに結合している測定対象物質を特異的に測定するための液体クロマトグラフィー装置である。
本発明の液体クロマトグラフィー装置においては、ポンプ、試料導入部、第１のカラム、第２のカラム、及び検出部が、ポンプ−試料導入部−第１のカラム−第２のカラム−検出部の順に連結されていることが好適である。
また、本発明の液体クロマトグラフィー装置においては、リガンドに対する特異的結合物質が、リガンドに対する抗体であることが好適である。
更に、本発明の液体クロマトグラフィー装置においては、測定対象物質が、金属の場合に好適である。
また、本発明は、ポンプ、試料導入部、リガンドに対する特異的結合物質を固定した担体よりなる第１のカラム、他の物質と結合した信号物質及び遊離の信号物質と測定対象物質と結合した信号物質とを分離することができる担体よりなる第２のカラム、及び検出部よりなる、試料中のリガンドに結合している測定対象物質を特異的に測定するための液体クロマトグラフィー装置の試料導入部に試料を注入し、次に、測定対象物質と結合する信号物質を含み測定対象物質をリガンドより遊離させることができる溶液を試料導入部より注入し、そして、測定対象物質と結合した信号物質を検出部において検出することよりなる、試料中のリガンドに結合している測定対象物質の特異的測定方法である。
本発明の特異的測定方法においては、液体クロマトグラフィー装置のポンプ、試料導入部、第１のカラム、第２のカラム、及び検出部が、ポンプ−試料導入部−第１のカラム−第２のカラム−検出部の順に連結されていることが好適である。
また、本発明の特異的測定方法においては、リガンドに対する特異的結合物質が、リガンドに対する抗体であることが好適である。
更に、本発明の特異的測定方法においては、測定対象物質が、金属の場合に好適である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明は、試料中に存在する測定対象物質のうち、リガンドに結合しているものだけを特異的に測定することができるものである。
本発明において、測定対象物質としては、試料中に存在することの測定（定性測定）、又は試料中の量の測定（定量測定）を行おうとするものであれば、いかなるものでも良い。
この測定対象物質としては、例えば、アルミニウム、鉄、銅、亜鉛、コバルト、マグネシウム、ニッケル、鉛、リチウム、水銀、クロム、マンガン、カドミウム、カルシウム、若しくはスズなどの金属、セレンなどの無機元素、チロキシンなどのホルモン、ヘムなどのポルフィリン化合物、ビオチン、リポ酸、ＦＡＤ、若しくはＦＭＮなどの補酵素（補欠分子族）等を挙げることができる。
【０００９】
本発明において、リガンドとは、測定対象物質と結合できる物質のことである。 測定対象物質と結合できるものであれば、特に限定はない。
このリガンドとしては、例えば、酵素、その他のタンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖質、脂質、核酸、ビタミン類、キレート化合物、包接化合物、その他の有機化合物、若しくは無機化合物等を挙げることができる。
より具体的には、α−アミラーゼ、カタラーゼ、若しくはスーパーオキサイドディスムターゼなどの酵素、トランスフェリン、フェリチン、セルロプラスミン、メタロチオネイン、シトクローム、ヘモグロビン、ミオグロビン、ヘモシアニン、カルモデュリン、アルブミン、若しくはグロブリンなどのタンパク質、ヒスチジン−システインなどのペプチド、システインなどのアミノ酸、ＤＮＡ、若しくはＲＮＡなどの核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ビタミンＢなどのビタミン類、ＥＤＴＡなどのキレート化合物、サイクロデキストリン、サイクロデキストリン誘導体、若しくはクラウンエーテル化合物などの包接化合物、ヘム、クロロフィル、クエン酸などの有機化合物、又はリン酸などの無機化合物等を例示することができる。
【００１０】
本発明において、試料は、リガンドに結合している測定対象物質を含む可能性があるものであれば、いかなるものでもよい。
この試料としては、例えば、生体試料（血液、血清、血漿、尿、髄液、精液、唾液、若しくは涙などの体液、脳、肝臓、若しくは腎臓などの臓器の抽出液、毛髪、爪、若しくは皮膚などの組織の抽出液、あるいは糞便等）、食品（穀物、野菜、果物、魚介類、若しくは加工食品など）、飲料（水、茶、牛乳、果汁、若しくは酒類など）、又は環境分析用試料（飲料水、河川水、湖沼水、海水、地下水、温泉、鉱泉、若しくは土壌など）等を挙げることができる。
【００１１】
本発明において、信号物質とは、測定対象物質と結合するものであって、かつ検出できるものであれば良い。
この検出は、紫外部、可視部、若しくは赤外部の吸光、蛍光強度、化学発光若しくは生物発光、電位、電気伝導度、又は屈折率等、液体クロマトグラフィーにおいて通常用いられる検出方法により行うことができる。
信号物質は、測定対象物質と比べて検出時の強度、又は波長等の性質が異なることが好ましく、強度が高いことが特に好ましい。
また、信号物質は、測定対象物質と結合している場合と、遊離の場合又は他の物質と結合している場合とで、検出時の強度、又は波長等の性質が異なることが好ましく、測定対象物質と結合している場合に強度が高いことが特に好ましい。
なお、測定対象物質が単体で検出できるものであれば、信号物質を使用しなくとも良い。
【００１２】
信号物質としては、２，２−ジヒドロキシアゾベンゼン〔ＤＨＡＢ〕、ポルフィリン、４−（２−ピリジルアゾ）レゾルシノール、８−キノリノール、１，１０−フェナントロリン、２−ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）−フェノール〔Ｎｉｔｒｏｓｏ−ＰＳＡＰ〕、バソフェナンスロリン、４−（２−ピリジラゾ）レゾルシノール（ＰＡＲ）２−（２−チアゾリルアゾ）−４−メチル−５−スルホメチルアミノ安息香酸〔ＴＡＭＳＭＢ〕、若しくは４−（３，５−ジブロモ−２−ピリジルアゾ）−Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリンナトリウム〔３，５−ＤｉＢｒ−ＰＡＥＳＡ〕などのキレート発色剤、３−ブロモメチル−６，７−ジメトキシ−１−メチル−２（１Ｈ）−キノキサリン、３−ブロモメチル−６，７−メチレンジオキシ−１−メチル−２（１Ｈ）−キノキサリン、３−カルボニルクロリド−６，７−ジメトキシ−１−メチル−２（１Ｈ）−キノキサリン、若しくは３−カルボニルアジド−６，７−ジメトキシ−１−メチル−２（１Ｈ）−キノキサリンなどの蛍光ラベル化剤、（＋）−１−（１−イソシアナトエチル）ナフタレン、若しくは（＋）−１−（９−フルオレニル）エチルクロロホルメートなどの光学活性ラベル化剤、アミドブラック、若しくはクマジーブリリアントブルーなどのタンパク質染色剤、測定対象物質に対する抗体にパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−グルコシダーゼなどの酵素を結合させた酵素標識抗体、測定対象物質に対する抗体に蛍光物質を結合させた蛍光物質標識抗体、測定対象物質に対する抗体に放射物質を結合させた放射物質標識抗体、又は測定対象物質に対する抗体に化学発光関連物質を結合させた化学発光物質標識抗体等が挙げられる。
【００１３】
測定対象物質と結合する信号物質を含み測定対象物質をリガンドより遊離させることができる溶液は、上記の信号物質を含み、かつ測定対象物質を第１のカラムの担体に結合したリガンドから遊離させることができるものである。つまり、リガンドと測定対象物質との結合を切ることができるものである。
このような溶液は、酸性にすること、アルカリ性にすること、界面活性剤を含有させること、変性剤を含有させること、又はリガンドと測定対象物質との結合を切る酵素などの触媒を含有させること等により達成できる。
なお、測定対象物質と結合する信号物質を含むことにより、リガンドと測定対象物質との結合を切ることができる場合は、他に何も含有させなくとも良い。
【００１４】
本発明における液体クロマトグラフィー装置は、少なくとも、ポンプ、試料導入部、リガンドに対する特異的結合物質を固定した担体よりなる第１のカラム、他の物質と結合した信号物質及び遊離の信号物質と測定対象物質と結合した信号物質とを分離することができる担体よりなる第２のカラム、及び検出部よりなるものである。
なお、必要に応じて他の部品、機器を組み合わせて使用しても良い。
【００１５】
第１のカラムは、リガンドに対する特異的結合物質を固定した担体よりなるものであるが、リガンドに対する特異的結合物質とは、リガンドに対し親和性を有する物質をいい、リガンドとの特異的な相互作用によりリガンドに安定に結合する物質をいう。
【００１６】
このリガンドに対する特異的結合物質は、例えば、リガンドに対する抗体（ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体）である。また、リガンドが抗体である場合、リガンドに対する特異的結合物質はこの抗体に対する抗原であっても良い。
リガンドとリガンドに対する特異的結合物質の組み合わせとしては、この他にも、タンパク質とプロテインＡ若しくはプロテインＧ、糖質とレクチン、核酸とこの核酸に相補的な核酸、酵素と基質、酵素と阻害物質、キレート化合物と金属、包接化合物とゲスト化合物、アビジンとビオチン、又はレセプターとこれに特異的に結合する物質等を挙げることができる。なお、これらのリガンドとリガンドに対する特異的結合物質の組み合わせは、それぞれ逆であっても良い。
【００１７】
本発明の液体クロマトグラフィー装置における液体クロマトグラフィーとしては、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、中圧液体クロマトグラフィー、又はキャピラリー高速液体クロマトグラフィー等を挙げることができる。
また、これらのモードとして、分配クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、又はゲルクロマトグラフィー等を挙げることができる。
【００１８】
リガンドに対する特異的結合物質を固定する担体は、リガンドに対する特異的結合物質を化学的、又は物理的に結合することができる不溶性の物質であれば良い。
例えば、この担体としては、アガロース、セルロース、デキストラン、ポリアクリルアミド、又は多孔性ガラス等を挙げることができる。
リガンドに対する特異的結合物質の担体への固定は、「蛋白質・酵素の基礎実験法（改訂第２版）」堀尾編，１７７〜２０９頁，南江堂，１９９４年１１月１０日発行、及び「Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ」ファルマシア バイオテク株式会社，１９９４年発行等に記載の公知の方法により行えば良い。
【００１９】
このリガンドに対する特異的結合物質の担体への固定方法としては、例えば、アガロース等の多糖類をブロムシアン（ＣＮＢｒ）等のハロゲン化シアンで処理して得られる活性化された多糖類に、リガンドに対する特異的結合物質が有するアミノ基を介して共有結合させる方法等を挙げることができる。
また、アームを有する担体のアームと、リガンドに対する特異的結合物質が有するアームと結合する反応基を結合させる方法を用いても良い。このアームとリガンドに対する特異的結合物質が有するアームと結合する反応基の組み合わせとしては、例えば、ω−アミノアルキル基とカルボキシル基若しくはアルデヒド基、ブロモアセチル基とイミダゾール基あるいはフェノール性水酸基若しくはアミノ基、ヒドラジドとカルボキシル基若しくはアルデヒド基、又は、エポキシ基と糖の水酸基若しくはアミノ基、Ｎ−アミノカプロン酸基とアミノ基、又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド化合物とアミノ基等を挙げることができる。
【００２０】
この担体を内包するカラムのサイズは特に限定されるものではないが、一般的に分析用としては、内径０．１〜０．５mm×長さ３．５〜３０cm（キャピラリーＨＰＬＣ用）や、内径０．５〜２mm×長さ３．５〜３０cm（セミミクロＨＰＬＣ用）、又は内径２〜１０mm×長さ３．５〜３０cmのものを用いることができる。
【００２１】
第２のカラムは、他の物質と結合した信号物質及び遊離の信号物質と測定対象物質と結合した信号物質とを分離することができる担体よりなるものである。
【００２２】
この測定対象物質と結合した信号物質を他の物質と結合した信号物質及び遊離の信号物質と分離することができる担体は、「他の物質と結合した信号物質」及び「遊離の信号物質」と、「測定対象物質と結合した信号物質」とを分離することができる担体であればいかなるものでも良く、測定対象物質及び信号物質に応じて適宜選択すれば良い。
【００２３】
この担体としては、例えば、分配クロマトグラフィーおよび吸着クロマトグラフィーの担体に関しては、ｉ）順相系として、シリカゲル、アルミナ、チタニア、ジルコニア、セリア、多孔性ガラス、ハイドロキシアパタイト、ニトロフェニル； ii ）逆相系として、ポリスチレンゲル、ハイドロキシアパタイト、若しくはニトロフェニル、又はシリカやポリマー等に下記の基を結合させたもの：オクタデシルシリル（ＯＤＳ）基、オクチルシリル基、エチルシリル基、メチルシリル基、フェニル基、シアノ基、フルオロカーボン基、グラファイトカーボン基、２−（１−ピレニル）エチルシリル基、； iii) 順相逆相系として、アミノプロピル、シアノプロピル、ジオール、キラル；iv）内面逆相系として、細孔部表面がＯＤＳ、フェニル基などの疎水性基であり、担体粒子外表面がポリオキシエチレン基などの親水性基である担体、ならびに；ｖ）ポリオキシエチレンのネットワーク構造系等が挙げられる。
なお、試料がタンパク質等の高分子物質を含む場合には、担体として内面逆相系の担体を用いることが好ましい。
【００２４】
また、イオン交換クロマトグラフィーの担体に関しては、下記のイオン交換基などが結合したセルロース、架橋デキストラン、架橋アガロースや親水性ビニルポリマー等が挙げられる：ｉ）陽イオン交換基として、−Ｏ−（ＣＨ2)3−ＳＯ3 - 、−Ｏ−（ＣＨ2)2−ＳＯ3 - 、−ＣＨ2−ＳＯ3 - 、−ＳＯ3 - 、−ＰＯ4 2- 、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＯＯ- 等を有する樹脂、ならびに；ii）陰イオン交換基として、−Ｎ+(ＣＨ3)3、−ＣＨ2−Ｎ+(ＣＨ3)3、−Ｎ+(ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ）（ＣＨ3)2、−Ｏ−（ＣＨ2)2−Ｎ+(Ｃ2Ｈ5)2Ｈ、−Ｏ−（ＣＨ2)2−Ｎ+(Ｃ2Ｈ5)2−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ3、−ＮＨ2、−ＮＨＲ、−ＮＲ2等を有する樹脂（ここで、Ｒは例えばアルキルなどを表す）。
【００２５】
また、ゲルクロマトグラフィーの担体に関しては、ｉ）有機溶媒系として、ポリスチレンゲル、ポリメチルメタクリレートゲル、ならびに；ii）水溶媒系として、ポリビニルアルコールゲル、ポリアクリルアミドゲル、ポリヒドロキシエチルメタクリレートゲル等が挙げられる。
【００２６】
また、疎水クロマトグラフィーの担体に関しては、疎水基（例えば、フェニル基、ブチル基、オクチル基）などが結合した多孔性セルロース、架橋アガロース、親水性ビニルポリマー等が挙げられる。
【００２７】
そして、この担体を内包するカラムのサイズは特に限定されるものではないが、一般的に分析用としては、内径０．１〜０．５mm×長さ０．５〜３０cm（キャピラリーＨＰＬＣ用）や、内径０．５〜２mm×長さ０．５〜３０cm（セミミクロＨＰＬＣ用）、又は内径２〜１０mm×長さ０．５〜３０cmのものを用いることができる。
【００２８】
本発明において、試料、測定対象物質と結合する信号物質を含み測定対象物質をリガンドより遊離させることができる溶液、及び溶離液を液体クロマトグラフィー装置上で流す流速はカラムの内径により変わるが、カラムの内径と流速の関係は通常、０．１〜１ｍｍの場合は０．００１〜０．１ｍＬ／分、１〜５ｍｍの場合は０．０５〜２ｍＬ／分、及び５〜５０ｍｍの場合は１〜３０ｍＬ／分である。
【００２９】
本発明の液体クロマトグラフィー装置におけるポンプは、プランジャー型、シリンジ型、又はガス圧型等の上記流速に対応できるポンプであれば良い。
本発明の液体クロマトグラフィー装置における試料導入部は、液体クロマトグラフィーに使用できるものであれば良い。
【００３０】
本発明の液体クロマトグラフィー装置における検出部は、信号物質を検出できるものであれば良く、具体的には、紫外部、可視部、若しくは赤外部の吸光、蛍光強度、放射強度、化学発光若しくは生物発光、電位、電気伝導度、屈折率、蒸発光散乱、旋光度、レーザー光散乱、質量分析、又はＩＣＰ質量分析等の検出を行えるものであれば良い。
【００３１】
本発明において、液体クロマトグラフィー装置に流す溶離液は、第２のカラムの担体として分配クロマトグラフィー用の担体、又は吸着クロマトグラフィー用の担体を用いる場合であって、順相系である場合は、ｎ−ヘキサン等の低極性の有機溶媒に高極性の溶媒を混合したものを使用する。
なお、一般に、高極性の溶媒の比率を増やすほど測定対象物質の溶出は早くなる。
溶出は、水の場合が一番早く、アルコール、テトラヒドロフラン、ジオキサン、酢酸エチル、ジクロロメタン、ｎ−ヘキサンの順で遅くなる。
【００３２】
また、逆相系、又は内面逆相系である場合は、水と有機溶媒を混合したものを使用する。
この場合、一般に、有機溶媒の比率を増すほど測定対象物質の溶出は早くなる。
溶出は、テトラヒドロフラン、ジオキサン、イソプロパノール、アセトニトリル、エタノール、メタノールの順で遅くなる。
【００３３】
第２のカラムの担体として、イオン交換クロマトグラフィーを用いる場合、溶離液は、酸性水溶液、塩基性水溶液、又は塩を含む緩衝液を使用することができる。溶出の早さの調整は、溶離液中のイオン濃度を変えることにより行うことができる。
【００３４】
第２のカラムの担体として、ゲルクロマトグラフィーを用いる場合、溶離液は、有機系溶媒では、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、クロロホルム、ヘキサフルオロイソプロパノール、又はトルエン等を用いることができ、水系溶媒では、塩の水溶液を用いることができる。
【００３５】
なお、上記の溶離液には、必要に応じて、緩衝剤、界面活性剤、又はキレート化合物等の添加剤を含有させても良い。
【００３６】
緩衝剤としては、グリシン、ＭＥＳ、ビス−トリス、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、イミダゾール、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、塩酸トリエタノールアミン、ＨＥＰＰＳＯ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ＥＰＰＳ、グリシルグリシン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、ビシン、ＴＡＰＳ、トリシン、ホウ酸、ＣＨＥＳ、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、ＣＡＰＳＯ、ＣＡＰＳ、ジエタノールアミン、又は２−エチルアミノエタノール等を挙げることができる。
この緩衝剤の濃度とｐＨは、目的に応じて適宜選択すればよい。
【００３７】
界面活性剤としては、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、ポリオキシエチレンフィトスタノール、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤、酢酸ベタイン等のカルボキシベタイン、スルホベタイン、アミノカルボン酸などの両性界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤、アミン塩、第４級アンモニウム塩などの陽イオン性界面活性剤等を挙げることができる。
【００３８】
キレート化合物としては、ＥＤＴＡ、ＮＴＡ、ＣｙＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＥＤＴＡ−ＯＨ、ＧＥＤＴＡ、ＴＴＨＡ、ＤＨＥＧ、ＩＤＡ、ＥＤＤＡ、ＤＰＴＡ−ＯＨ、ＮＴＰ、メチル−ＥＤＴＡ、又はＨＩＤＡ等を挙げることができる。
【００３９】
本発明の試料中のリガンドに結合している測定対象物質の特異的測定方法においては、溶離液を流している本発明の液体クロマトグラフィー装置の試料導入部に試料を、通常は１〜１，０００μＬ注入する。
次に、測定対象物質と結合する信号物質を含み測定対象物質をリガンドより遊離させることができる溶液を試料導入部に、通常は１〜１，０００μＬ注入する。
この測定対象物質と結合する信号物質を含み測定対象物質をリガンドより遊離させることができる溶液の注入は、試料の注入の後、第１のカラムにおいてリガンドに結合している測定対象物質と遊離の測定対象物質が充分分離できる時間をおいた後、行うことが好ましい。この時間は、一般的には試料注入後５〜６０分、好ましくは１０〜３０分である。
そして、液体クロマトグラフィー装置の検出部において、測定対象物質と結合した信号物質の検出を行い、試料中のリガンドに結合している測定対象物質の測定を行う。
【００４０】
【作用】
本発明における作用は以下の通りである。
ポンプ、試料導入部、リガンドに対する特異的結合物質を固定した担体よりなる第１のカラム、他の物質と結合した信号物質及び遊離の信号物質と測定対象物質と結合した信号物質とを分離することができる担体よりなる第２のカラム、及び検出部よりなる、試料中のリガンドに結合している測定対象物質を特異的に測定するための液体クロマトグラフィー装置の試料導入部に試料を注入して測定対象物質が結合しているリガンドを第１のカラムの担体に結合させ、次に、測定対象物質と結合する信号物質を含み測定対象物質をリガンドより遊離させることができる溶液を試料導入部より注入してこの信号物質を測定対象物質に結合させ、かつリガンドから遊離させ、更に第２のカラム中において他の物質と結合した信号物質及び遊離の信号物質と測定対象物質と結合した信号物質とを分離させ、そして、この分離した測定対象物質と結合した信号物質を検出部において検出することにより、試料中のリガンドに結合している測定対象物質を特異的に測定する。
【００４１】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【００４２】
（実施例１） 〔血清試料中のトランスフェリン結合アルミニウムの測定〕
本発明の液体クロマトグラフィー測定装置を構築し、これを用いて血清試料中のトランスフェリン結合アルミニウムの測定を行った。
【００４３】
（１）第１のカラムの調製
ＦＰＬＣ用アガロースカラム〔内径７ｍｍ×長さ２５ｍｍ〕（ファルマシア バイオテク社製）に充填されたアガロースに、６−アミノカプロン酸をエポキシ活性化法で共有結合させた。
次に、この末端カルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドでエステル化した。
更にこのエステル結合に、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．２Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）に１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解したウサギの抗ヒト・トランスフェリン抗体〔製品番号：Ａ７０４／Ｒ５Ｈ、バイオジェネシス社（英国）〕の１ｍＬを接触、求核攻撃させて、アミド結合させた。
その後、これに０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５Ｍエタノールアミン緩衝液（ｐＨ８．３）を加え、１時間放置して、過剰な活性基を不活性化させた。
更に、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５Ｍエタノールアミン緩衝液（ｐＨ８．３）と０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４）を交互に３回ずつ流し、結合しなかった抗ヒト・トランスフェリン抗体を洗い流した。
このようにして、ウサギの抗ヒト・トランスフェリン抗体を固定させた担体よりなる第１のカラムを調製した。
【００４４】
（２）液体クロマトグラフィー装置の構築
ポンプ、試料導入部、及び検出部は、ナノスペース・システムＳＩ−１（資生堂社製）を用いた。
第２のカラムとして、内面逆相型カラムのカプセルパック ＭＦ ｐｈ−１〔内径１．５ｍｍ×長さ３５ｍｍ〕（資生堂社製）を使用した。
ポンプ、試料導入部、上記（１）で調製した第１のカラム、第２のカラム、検出部、及びフラクションコレクターを、図１に示したように、ポンプ−試料導入部−第１のカラム−第２のカラム−検出部−フラクションコレクターの順に連結して、本発明の液体クロマトグラフィー装置を構築した。
【００４５】
（３）試料の調製
ヒト血清試料にアルミニウムを１００μｇ／Ｌ（ｐｐｂ）になるように添加して、アルミニウム添加血清試料を調製した。
試料として、このアルミニウム添加血清試料とヒト血清試料の２種類の試料を用意した。
【００４６】
（４）ヒト血清試料中のトランスフェリン結合アルミニウムの測定
上記（２）で構築した液体クロマトグラフィー装置に、溶離液として２０％（ｗ／ｗ）２−プロパノールを含む０．１Ｍ Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）緩衝液（ｐＨ７．０）を１２０μＬ／分の流速で流しておき、上記（３）で調製したヒト血清試料、又はアルミニウム添加血清試料の１００μＬを試料導入部に注入した。
なお、第１のカラム、及び第２のカラムの温度は、１６℃となるようにした。
２８０ｎｍにおける吸光度の検出によりタンパク質のピークが過ぎたことが確認された試料注入１５分後に、１０ｍＭ ８−キノリノールを含む１００ｍＭ塩酸を１００μＬ試料注入部に注入した。
検出部による検出を、励起波長３７０ｎｍ、及び放射波長５０４ｎｍでの蛍光強度の測定により行った。
【００４７】
これらの測定の結果を図２に示した。
これらのクロマトグラムにおいて、（ａ）は試料がヒト血清試料の場合であり、（ｂ）は試料がアルミニウム添加血清試料の場合である。また、横軸は試料を注入してからの経過時間、縦軸は励起波長３７０ｎｍ、放射波長５０４ｎｍでの蛍光強度を表す。
【００４８】
これらの図より、血清試料中のトランスフェリン結合アルミニウムが二十数分で測定できることが確かめられた。
【００４９】
（実施例２） 〔トランスフェリン結合アルミニウム測定の検量線の作成〕
トランスフェリン結合アルミニウムを添加した試料を測定して、検量線の作成を行った。
【００５０】
（１）試料の作成。
ヒト血清試料にアルミニウムを１００μｇ／Ｌ（ｐｐｂ）、又は３００μｇ／Ｌ（ｐｐｂ）になるように添加して、アルミニウム添加血清試料を調製した。
試料として、１００μｇ／Ｌ（ｐｐｂ）のアルミニウム添加血清試料、３００μｇ／Ｌ（ｐｐｂ）のアルミニウム添加血清試料、及びヒト血清試料の３種類の試料を用意した。
【００５１】
（２）ヒト血清試料中のトランスフェリン結合アルミニウムの測定
上記実施例１の（２）で構築した液体クロマトグラフィー装置を用いて、上記（１）で調製した３種類のヒト血清試料中のトランスフェリン結合アルミニウムの測定を、上記実施例１の（４）の記載と同様にして行った。
【００５２】
この測定の結果を図３に示した。
この検量線において、横軸は添加した試料中のトランスフェリン結合アルミニウムの濃度、縦軸は励起波長３７０ｎｍ、放射波長５０４ｎｍでの蛍光強度を表す。
【００５３】
この図より、本発明の測定において、試料中のトランスフェリン結合アルミニウム測定の検量線が直線であることが確かめられた。
このことより、本発明の測定装置及び測定方法は、試料中のリガンドに結合している物質を、定量的かつ正確に測定できることが確かめられた。
【００５４】
（実施例３） 〔試料中のトランスフェリン結合鉄の測定〕
本発明の液体クロマトグラフィー測定装置を構築し、これを用いて試料中のトランスフェリン結合鉄の測定を行った。
【００５５】
（１）試料の調製
ヒト・ホロ型トランスフェリン〔シグマ社製（米国）〕を１０ｍｇ／ｍＬになるように０．１Ｍ ＢＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して、トランスフェリン結合鉄含有試料を調製した。
【００５６】
（２）試料中のトランスフェリン結合鉄の測定
上記実施例１の（２）で構築した液体クロマトグラフィー装置に、溶離液として１５％（ｗ／ｗ）２−プロパノールを含む０．１Ｍ ＢＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を１００μＬ／分の流速で流しておき、上記（１）で調製した試料の１００μＬを試料導入部に注入した。
なお、第１のカラム、及び第２のカラムの温度は、２５℃となるようにした。
２８０ｎｍにおける吸光度の検出によりタンパク質のピークが過ぎたことが確認された試料注入１５分後に、１ｍＭ ４−（２−ピリジラゾ）レゾルシノール〔ＰＡＲ〕、及び１０ｍＭアスコルビン酸を含む１００ｍＭ塩酸を１００μＬ試料注入部に注入した。
検出部による検出を、４９５ｎｍでの吸光の測定により行った。
また、対照として、試料の注入を行わない他は上記と同様に測定を行い、試薬盲検の測定を行った。
【００５７】
これらの測定の結果を図４に示した。
これらのクロマトグラムにおいて、（ａ）はトランスフェリン結合鉄含有試料を測定した場合であり、（ｂ）は試薬盲検を測定した場合である。また、横軸は試料を注入してからの経過時間（ａの場合）、又はＰＡＲ等を注入してからの経過時間（ｂの場合）を、縦軸は４９５ｎｍでの吸光を表す。
【００５８】
これらの図より、トランスフェリン結合鉄含有試料を測定した場合は、ＰＡＲに結合した鉄のピークである経過時間３７分付近のピークが試薬盲検の経過時間２１分付近のピークに比べて顕著に増大していることが分かる。
このことより、本発明の測定においては、試料中のトランスフェリン結合鉄を特異的に測定できることが確かめられた。
なお、ヒト・アポ型トランスフェリン〔シグマ社製（米国）〕試料についても測定を行ったが、試薬盲検の場合と同様のクロマトグラムであった。
【００５９】
（実施例４） 〔試料中のセルロプラスミン結合銅の測定〕
本発明の液体クロマトグラフィー測定装置を構築し、これを用いて試料中のセルロプラスミン結合銅の測定を行った。
【００６０】
（１）第１のカラムの調製
ＦＰＬＣ用アガロースカラム〔内径７ｍｍ×長さ２５ｍｍ〕（ファルマシア バイオテク社製）に充填されたアガロースに、６−アミノカプロン酸をエポキシ活性化法で共有結合させた。
次に、この末端カルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドでエステル化した。
更にこのエステル結合に、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．２Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）に１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解したヒツジの抗ヒト・セルロプラスミン抗体〔製品番号：１９４０−０００４、バイオジェネシス社（英国）〕の１ｍＬを接触、求核攻撃させて、アミド結合させた。
その後、これに０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５Ｍエタノールアミン緩衝液（ｐＨ８．３）を加え、１時間放置して、過剰な活性基を不活性化させた。
更に、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５Ｍエタノールアミン緩衝液（ｐＨ８．３）と０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４）を交互に３回ずつ流し、結合しなかった抗ヒト・セルロプラスミン抗体を洗い流した。
このようにして、ヒツジの抗ヒト・セルロプラスミン抗体を固定させた担体よりなる第１のカラムを調製した。
【００６１】
（２）液体クロマトグラフィー装置の構築
ポンプ、試料導入部、及び検出部は、ナノスペース・システムＳＩ−１（資生堂社製）を用いた。
第２のカラムとして、内面逆相型カラムのカプセルパック ＭＦ ｐｈ−１〔内径１．５ｍｍ×長さ３５ｍｍ〕（資生堂社製）を使用した。
ポンプ、試料導入部、上記１で調製した第１のカラム、第２のカラム、検出部、及びフラクションコレクターを、図１に示したように、ポンプ−試料導入部−第１のカラム−第２のカラム−検出部−フラクションコレクターの順に連結して、本発明の液体クロマトグラフィー装置を構築した。
【００６２】
（３）試料の調製
ヒト・セルロプラスミン〔製品番号：Ｃ４７７０、シグマ社製（米国）〕を９０ｍｇ／ｍＬになるように０．１Ｍ ＢＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して、セルロプラスミン結合銅含有試料を調製した。
【００６３】
（４）試料中のセルロプラスミン結合銅の測定
上記（２）で構築した液体クロマトグラフィー装置に、溶離液として２０％（ｗ／ｗ）２−プロパノール、及び０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ ＢＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を１００μＬ／分の流速で流しておき、上記（３）で調製したセルロプラスミン結合銅含有試料の１００μＬを試料導入部に注入した。
なお、第１のカラム、及び第２のカラムの温度は、２５℃となるようにした。
２８０ｎｍにおける吸光度の検出によりタンパク質のピークが過ぎたことが確認された試料注入２０分後に、１ｍＭ ４−（３，５−ジブロモ−２−ピリジルアゾ）−Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリンナトリウム〔３，５−ＤｉＢｒ−ＰＡＥＳＡ〕、及び１０ｍＭアスコルビン酸を含む１００ｍＭ塩酸を１００μＬ試料注入部に注入した。
検出部による検出を、６３７ｎｍでの吸光の測定により行った。
また、対照として、試料の注入を行わない他は上記と同様に測定を行い、試薬盲検の測定を行った。
【００６４】
これらの測定の結果を図５に示した。
これらのクロマトグラムにおいて、（ａ）はセルロプラスミン結合銅含有試料を測定した場合であり、（ｂ）は試薬盲検を測定した場合である。また、横軸は試料を注入してからの経過時間（ａの場合）、又は３，５−ＤｉＢｒ−ＰＡＥＳＡ等を注入してからの経過時間（ｂの場合）を、縦軸は６３７ｎｍでの吸光を表す。
【００６５】
これらの図より、セルロプラスミン結合銅含有試料を測定した場合は、３，５−ＤｉＢｒ−ＰＡＥＳＡに結合した銅のピークである経過時間４３分付近のピークが試薬盲検の経過時間１３分付近のピークに比べて顕著に増大していることが分かる。
このことより、本発明の測定においては、試料中のセルロプラスミン結合銅を特異的に測定できることが確かめられた。
なお、ヒト・アポ型セルロプラスミン〔シグマ社製（米国）〕試料についても測定を行ったが、試薬盲検の場合と同様のクロマトグラムであった。
【００６６】
（実施例５） 〔試料中の血清アルブミン結合亜鉛の測定〕
本発明の液体クロマトグラフィー測定装置を構築し、これを用いて試料中の血清アルブミン結合亜鉛の測定を行った。
【００６７】
（１）第１のカラムの調製
ＦＰＬＣ用アガロースカラム〔内径７ｍｍ×長さ２５ｍｍ〕（ファルマシア バイオテク社製）に充填されたアガロースに、６−アミノカプロン酸をエポキシ活性化法で共有結合させた。
次に、この末端カルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドでエステル化した。
更にこのエステル結合に、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．２Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）に１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解したウサギの抗ヒト・血清アルブミン抗体〔シグマ社製（米国）〕の１ｍＬを接触、求核攻撃させて、アミド結合させた。
その後、これに０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５Ｍエタノールアミン緩衝液（ｐＨ８．３）を加え、１時間放置して、過剰な活性基を不活性化させた。
更に、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５Ｍエタノールアミン緩衝液（ｐＨ８．３）と０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４）を交互に３回ずつ流し、結合しなかったウサギ抗ヒト・血清アルブミン抗体を洗い流した。
このようにして、ウサギの抗ヒト・血清アルブミン抗体を固定させた担体よりなる第１のカラムを調製した。
【００６８】
（２）液体クロマトグラフィー装置の構築
ポンプ、試料導入部、及び検出部は、ナノスペース・システムＳＩ−１（資生堂社製）を用いた。
第２のカラムとして、内面逆相型カラムのカプセルパック ＭＦ ｐｈ−１〔内径１．５ｍｍ×長さ３５ｍｍ〕（資生堂社製）を使用した。
ポンプ、試料導入部、上記（１）で調製した第１のカラム、第２のカラム、検出部、及びフラクションコレクターを、図１に示したように、ポンプ−試料導入部−第１のカラム−第２のカラム−検出部−フラクションコレクターの順に連結して、本発明の液体クロマトグラフィー装置を構築した。
【００６９】
（３）試料の調製
ヒト・血清アルブミン〔シグマ社製（米国）〕を４０ｍｇ／ｍＬになるよう、そして、亜鉛濃度が１０μｇ／ｍＬになるよう硝酸亜鉛を、０．１Ｍ ＢＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）にそれぞれ溶解して、ヒト・血清アルブミン結合亜鉛含有試料を調製した。
【００７０】
（４）試料中のヒト・血清アルブミン結合亜鉛の測定
上記（２）で構築した液体クロマトグラフィー装置に、溶離液として２３％（ｗ／ｗ）アセトニトリル、２０ｍＭアデニン、及び１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．２Ｍ ＢＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を２００μＬ／分の流速で流しておき、上記（３）で調製したヒト・血清アルブミン結合亜鉛含有試料の１００μＬを試料導入部に注入した。
なお、第１のカラム、及び第２のカラムの温度は、３０℃となるようにした。
２８０ｎｍにおける吸光度の検出によりタンパク質のピークが過ぎたことが確認された試料注入１５分後に、０．１ｍＭ α，β，γ，δ−テトラキス（４−カルボキシフェニル）ポルフィン〔ＴＣＰＰ〕、及び２０ｍＭアデニンを含む１Ｍ ２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸〔ＣＨＥＳ〕緩衝液（ｐＨ９．０）を１００μＬ試料注入部に注入した。
検出部による検出を、励起波長４２２ｎｍ、及び放射波長６０６ｎｍでの蛍光強度の測定により行った。
また、対照として、試料の注入を行わない他は上記と同様に測定を行い、試薬盲検の測定を行った。
【００７１】
これらの測定の結果を図６に示した。
これらのクロマトグラムにおいて、（ａ）はヒト・血清アルブミン結合亜鉛含有試料を測定した場合であり、（ｂ）は試薬盲検を測定した場合である。また、横軸は試料を注入してからの経過時間（ａの場合）、又はＴＣＰＰ等を注入してからの経過時間（ｂの場合）を、縦軸は励起波長４２２ｎｍ、及び放射波長６０６ｎｍでの蛍光強度を表す。
【００７２】
これらの図より、ヒト・血清アルブミン結合亜鉛含有試料を測定した場合は、ＴＣＰＰに結合した亜鉛のピークである経過時間３４分付近のピークが試薬盲検の経過時間１９分付近のピークに比べて顕著に増大していることが分かる。
このことより、本発明の測定においては、試料中のヒト・血清アルブミン結合亜鉛を特異的に測定できることが確かめられた。
なお、ヒト・血清アルブミン〔シグマ社製（米国）〕試料についても測定を行ったが、試薬盲検の場合と同様のクロマトグラムであった。
【００７３】
【発明の効果】
本発明の測定装置及び測定方法は、特殊若しくは高価な装置又は部品を使用することなく、かつ煩雑な操作を必要とせず、現在広く普及している装置を用いるものでありながら、吸着、濃縮、遊離、結合体形成、分解、及び分離の各工程を簡便な操作で行うことができ、試料中のリガンドに結合している測定対象物質だけを特異的に測定することができる測定装置、及び測定方法である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の液体クロマトグラフィー装置の構成を示した図である。
【図２】ヒト血清試料中のトランスフェリン結合アルミニウム測定のクロマトグラムを示した図である。
【図３】ヒト血清試料中のトランスフェリン結合アルミニウム測定の検量線を示した図である。
【図４】試料中のトランスフェリン結合鉄測定のクロマトグラムを示した図である。
【図５】試料中のセルロプラスミン結合銅測定のクロマトグラムを示した図である。
【図６】試料中の血清アルブミン結合亜鉛測定のクロマトグラムを示した図である。
本発明は、タンパク質等のリガンドに結合した測定対象物質だけを特異的に測定することができる測定装置、及び測定方法に関し、分析化学、生命科学、及び臨床検査等の分野において特に有用なものである。
【０００２】
【従来の技術】
生体内において、物質はリガンドとなる物質と結合した形態で生体内を移動し、貯蔵され、そして使用されることが多い。
例えば、アルミニウム、鉄、銅、及び亜鉛等の金属やホルモンは、タンパク質等のリガンドと結合して存在することが多い。
近年、リガンドと結合した金属の生体内での挙動が注目を浴びてきた。
例えば、アルツハイマー型痴呆症とアルミニウムの因果関係が推測されているが、この痴呆症や神経障害において注目すべきアルミニウムは、脳関門を通過することができるトランスフェリンと結合したアルミニウムである。
また、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）やアルミニウム骨症では、トランスフェリン結合型以外のアルミニウムの関与が推測されている。
このように、リガンドと結合している金属とリガンドと結合していない遊離の金属を分別して測定することは、デフェロオキサミン製剤などの薬剤による治療効果の判定、疾病の診断、及び予防等において大変重要になってきている。
【０００３】
これまで、試料中の上記の金属の測定には、原子吸光装置又はフレームレス原子吸光装置が用いられてきた。しかしながら、原子吸光装置及びフレームレス原子吸光装置とも試料を高温に加熱して原子化するものであり、リガンドに結合している金属とリガンドに結合していない遊離の金属を分離することができず、リガンドに結合している金属だけを測定するものではなかった。
また、測定しようとする金属と、この測定しようとする金属に対してキレート結合するキレート発色剤を含む試薬とを混合し、生じる吸光度より試料中の金属を測定する吸光光度法や蛍光法も行われてきた。
例えば、測定しようとする金属が鉄の場合、キレート発色剤としては、２−ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）−フェノール、又はバソフェナンスロリンスルホン酸塩等が、銅の場合、キレート発色剤としては４−（３，５−ジブロモ−２−ピリジルアゾ）−Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリンナトリウム、２−（２−チアゾリルアゾ）−４−メチル−５−スルホメチルアミノ安息香酸、又はバソクプロインスルホン酸塩等が用いられる。
【０００４】
しかし、やはりこの吸光光度法や蛍光法においてもリガンドに結合している金属とリガンドに結合していない遊離の金属を分離することができず、リガンドに結合している金属だけを測定することはできなかった。
なお、前段にアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過等のクロマトグラフィー手法を用い、次にこのクロマトグラフィーにより分離されたリガンドに結合している測定対象物質をフレームレス原子吸光装置により測定する方法が知られていた。（「Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｚｉｎｃ Ａｍｏｎｇｓｔ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｕｍ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ Ａｔｏｍｉｃ−ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ」Ｊ．Ｆｏｏｔｅら著，Ａｎａｌｙｓｔ誌，１０８巻，４９２〜５０４頁，１９８３年、「Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎＶｉｔｒｏ ｏｆ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｕｍｉｎｕｍ ｉｎ Ｄｉａｌｙｓｉｓａｆｔｅｒ Ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ Ｃｈｅｌａｔｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｙ」Ｆ．Ｌｅｕｎｇら著，ＣＬＩＮ．ＣＨＥＭ．誌，３１巻，２０〜２３頁，１９８５年、「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ Ａｌｕｍｉｎｉｕｍ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｕｒｅｍｉｃ Ｓｅｒｕｍ ｂｙ Ｆａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｃｏｕｐｌｅｄ Ｗｉｔｈ Ｅｌｅｃｔｒｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｔｏｍｉｃ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ」Ａ．Ｓｏｌｄａｄｏら著，Ａｎａｌｙｓｔ誌，１２２巻，５７３〜５７７頁，１９９７年）
【０００５】
しかし、このフレームレス原子吸光装置は、大変高価であり、また広いスペースを必要とし配管や換気装置が必要であって設置場所が限定されるものであり、そして試料溶液を原子化する炭素炉が測定のたびに消耗し約１００回測定するたびに交換しなければならず、煩雑であり費用がかかるものであった。
更に、前段にアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過等のクロマトグラフィー手法を用い、次にこのクロマトグラフィーにより分離されたリガンドに結合している測定対象物質をフローインジェクション分析により測定する方法も知られていた。（「Ｆｌｏｗ−ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ Ｏｆ Ａｌｕｍｉｎｕｍ Ｂａｓｅｄ Ｏｎ Ｉｔｓ Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ ８−Ｈｙｄｒｏｘｙｑｕｉｎｏｌｉｎｅ−５−ｓｕｌｐｈｏｎｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｎ Ａ ＭｉｃｅｌｌａｒＭｅｄｉｕｍ」Ｊ．Ａｌｏｎｓｏら著，Ａｎａｌｙｔｉｃａ ＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ誌，２２５巻，３３９〜３５０巻，１９８９年）
しかしながら、このフローインジェクション分析に用いる装置は、複数のポンプ、複数の溶離液、濃度勾配装置、及び流路切り替えバルブなどの特別の装置等を必要とするものであって、高価であり、かつ他の測定に用いることが難しい専用装置であった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
前記のように、従来の測定装置及び測定方法は、リガンドに結合している測定対象物質だけを簡便に測定することはできなかった。
本発明者らは、この問題点の解決を目指して鋭意検討を行った結果、リガンドに対する特異的結合物質を固定した担体よりなる第１のカラム、及び他の物質と結合した信号物質及び遊離の信号物質と測定対象物質と結合した信号物質とを分離することができる担体よりなる第２のカラムを備える液体クロマトグラフィー装置により、リガンドに結合している測定対象物質とリガンドに結合していない測定対象物質とを分離でき、そして他の物質と結合した信号物質及び遊離の信号物質と測定対象物質と結合した信号物質とを分離することができることを見い出し、簡便に試料中のリガンドに結合している測定対象物質だけを特異的に測定することができる測定装置、及び測定方法を完成するに至った。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ポンプ、試料導入部、リガンドに対する特異的結合物質を固定した担体よりなる第１のカラム、他の物質と結合した信号物質及び遊離の信号物質と測定対象物質と結合した信号物質とを分離することができる担体よりなる第２のカラム、及び検出部よりなる、試料中のリガンドに結合している測定対象物質を特異的に測定するための液体クロマトグラフィー装置である。
本発明の液体クロマトグラフィー装置においては、ポンプ、試料導入部、第１のカラム、第２のカラム、及び検出部が、ポンプ−試料導入部−第１のカラム−第２のカラム−検出部の順に連結されていることが好適である。
また、本発明の液体クロマトグラフィー装置においては、リガンドに対する特異的結合物質が、リガンドに対する抗体であることが好適である。
更に、本発明の液体クロマトグラフィー装置においては、測定対象物質が、金属の場合に好適である。
また、本発明は、ポンプ、試料導入部、リガンドに対する特異的結合物質を固定した担体よりなる第１のカラム、他の物質と結合した信号物質及び遊離の信号物質と測定対象物質と結合した信号物質とを分離することができる担体よりなる第２のカラム、及び検出部よりなる、試料中のリガンドに結合している測定対象物質を特異的に測定するための液体クロマトグラフィー装置の試料導入部に試料を注入し、次に、測定対象物質と結合する信号物質を含み測定対象物質をリガンドより遊離させることができる溶液を試料導入部より注入し、そして、測定対象物質と結合した信号物質を検出部において検出することよりなる、試料中のリガンドに結合している測定対象物質の特異的測定方法である。
本発明の特異的測定方法においては、液体クロマトグラフィー装置のポンプ、試料導入部、第１のカラム、第２のカラム、及び検出部が、ポンプ−試料導入部−第１のカラム−第２のカラム−検出部の順に連結されていることが好適である。
また、本発明の特異的測定方法においては、リガンドに対する特異的結合物質が、リガンドに対する抗体であることが好適である。
更に、本発明の特異的測定方法においては、測定対象物質が、金属の場合に好適である。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明は、試料中に存在する測定対象物質のうち、リガンドに結合しているものだけを特異的に測定することができるものである。
本発明において、測定対象物質としては、試料中に存在することの測定（定性測定）、又は試料中の量の測定（定量測定）を行おうとするものであれば、いかなるものでも良い。
この測定対象物質としては、例えば、アルミニウム、鉄、銅、亜鉛、コバルト、マグネシウム、ニッケル、鉛、リチウム、水銀、クロム、マンガン、カドミウム、カルシウム、若しくはスズなどの金属、セレンなどの無機元素、チロキシンなどのホルモン、ヘムなどのポルフィリン化合物、ビオチン、リポ酸、ＦＡＤ、若しくはＦＭＮなどの補酵素（補欠分子族）等を挙げることができる。
【０００９】
本発明において、リガンドとは、測定対象物質と結合できる物質のことである。 測定対象物質と結合できるものであれば、特に限定はない。
このリガンドとしては、例えば、酵素、その他のタンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖質、脂質、核酸、ビタミン類、キレート化合物、包接化合物、その他の有機化合物、若しくは無機化合物等を挙げることができる。
より具体的には、α−アミラーゼ、カタラーゼ、若しくはスーパーオキサイドディスムターゼなどの酵素、トランスフェリン、フェリチン、セルロプラスミン、メタロチオネイン、シトクローム、ヘモグロビン、ミオグロビン、ヘモシアニン、カルモデュリン、アルブミン、若しくはグロブリンなどのタンパク質、ヒスチジン−システインなどのペプチド、システインなどのアミノ酸、ＤＮＡ、若しくはＲＮＡなどの核酸、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ビタミンＢなどのビタミン類、ＥＤＴＡなどのキレート化合物、サイクロデキストリン、サイクロデキストリン誘導体、若しくはクラウンエーテル化合物などの包接化合物、ヘム、クロロフィル、クエン酸などの有機化合物、又はリン酸などの無機化合物等を例示することができる。
【００１０】
本発明において、試料は、リガンドに結合している測定対象物質を含む可能性があるものであれば、いかなるものでもよい。
この試料としては、例えば、生体試料（血液、血清、血漿、尿、髄液、精液、唾液、若しくは涙などの体液、脳、肝臓、若しくは腎臓などの臓器の抽出液、毛髪、爪、若しくは皮膚などの組織の抽出液、あるいは糞便等）、食品（穀物、野菜、果物、魚介類、若しくは加工食品など）、飲料（水、茶、牛乳、果汁、若しくは酒類など）、又は環境分析用試料（飲料水、河川水、湖沼水、海水、地下水、温泉、鉱泉、若しくは土壌など）等を挙げることができる。
【００１１】
本発明において、信号物質とは、測定対象物質と結合するものであって、かつ検出できるものであれば良い。
この検出は、紫外部、可視部、若しくは赤外部の吸光、蛍光強度、化学発光若しくは生物発光、電位、電気伝導度、又は屈折率等、液体クロマトグラフィーにおいて通常用いられる検出方法により行うことができる。
信号物質は、測定対象物質と比べて検出時の強度、又は波長等の性質が異なることが好ましく、強度が高いことが特に好ましい。
また、信号物質は、測定対象物質と結合している場合と、遊離の場合又は他の物質と結合している場合とで、検出時の強度、又は波長等の性質が異なることが好ましく、測定対象物質と結合している場合に強度が高いことが特に好ましい。
なお、測定対象物質が単体で検出できるものであれば、信号物質を使用しなくとも良い。
【００１２】
信号物質としては、２，２−ジヒドロキシアゾベンゼン〔ＤＨＡＢ〕、ポルフィリン、４−（２−ピリジルアゾ）レゾルシノール、８−キノリノール、１，１０−フェナントロリン、２−ニトロソ−５−（Ｎ−プロピル−Ｎ−スルホプロピルアミノ）−フェノール〔Ｎｉｔｒｏｓｏ−ＰＳＡＰ〕、バソフェナンスロリン、４−（２−ピリジラゾ）レゾルシノール（ＰＡＲ）２−（２−チアゾリルアゾ）−４−メチル−５−スルホメチルアミノ安息香酸〔ＴＡＭＳＭＢ〕、若しくは４−（３，５−ジブロモ−２−ピリジルアゾ）−Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリンナトリウム〔３，５−ＤｉＢｒ−ＰＡＥＳＡ〕などのキレート発色剤、３−ブロモメチル−６，７−ジメトキシ−１−メチル−２（１Ｈ）−キノキサリン、３−ブロモメチル−６，７−メチレンジオキシ−１−メチル−２（１Ｈ）−キノキサリン、３−カルボニルクロリド−６，７−ジメトキシ−１−メチル−２（１Ｈ）−キノキサリン、若しくは３−カルボニルアジド−６，７−ジメトキシ−１−メチル−２（１Ｈ）−キノキサリンなどの蛍光ラベル化剤、（＋）−１−（１−イソシアナトエチル）ナフタレン、若しくは（＋）−１−（９−フルオレニル）エチルクロロホルメートなどの光学活性ラベル化剤、アミドブラック、若しくはクマジーブリリアントブルーなどのタンパク質染色剤、測定対象物質に対する抗体にパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−グルコシダーゼなどの酵素を結合させた酵素標識抗体、測定対象物質に対する抗体に蛍光物質を結合させた蛍光物質標識抗体、測定対象物質に対する抗体に放射物質を結合させた放射物質標識抗体、又は測定対象物質に対する抗体に化学発光関連物質を結合させた化学発光物質標識抗体等が挙げられる。
【００１３】
測定対象物質と結合する信号物質を含み測定対象物質をリガンドより遊離させることができる溶液は、上記の信号物質を含み、かつ測定対象物質を第１のカラムの担体に結合したリガンドから遊離させることができるものである。つまり、リガンドと測定対象物質との結合を切ることができるものである。
このような溶液は、酸性にすること、アルカリ性にすること、界面活性剤を含有させること、変性剤を含有させること、又はリガンドと測定対象物質との結合を切る酵素などの触媒を含有させること等により達成できる。
なお、測定対象物質と結合する信号物質を含むことにより、リガンドと測定対象物質との結合を切ることができる場合は、他に何も含有させなくとも良い。
【００１４】
本発明における液体クロマトグラフィー装置は、少なくとも、ポンプ、試料導入部、リガンドに対する特異的結合物質を固定した担体よりなる第１のカラム、他の物質と結合した信号物質及び遊離の信号物質と測定対象物質と結合した信号物質とを分離することができる担体よりなる第２のカラム、及び検出部よりなるものである。
なお、必要に応じて他の部品、機器を組み合わせて使用しても良い。
【００１５】
第１のカラムは、リガンドに対する特異的結合物質を固定した担体よりなるものであるが、リガンドに対する特異的結合物質とは、リガンドに対し親和性を有する物質をいい、リガンドとの特異的な相互作用によりリガンドに安定に結合する物質をいう。
【００１６】
このリガンドに対する特異的結合物質は、例えば、リガンドに対する抗体（ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体）である。また、リガンドが抗体である場合、リガンドに対する特異的結合物質はこの抗体に対する抗原であっても良い。
リガンドとリガンドに対する特異的結合物質の組み合わせとしては、この他にも、タンパク質とプロテインＡ若しくはプロテインＧ、糖質とレクチン、核酸とこの核酸に相補的な核酸、酵素と基質、酵素と阻害物質、キレート化合物と金属、包接化合物とゲスト化合物、アビジンとビオチン、又はレセプターとこれに特異的に結合する物質等を挙げることができる。なお、これらのリガンドとリガンドに対する特異的結合物質の組み合わせは、それぞれ逆であっても良い。
【００１７】
本発明の液体クロマトグラフィー装置における液体クロマトグラフィーとしては、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、中圧液体クロマトグラフィー、又はキャピラリー高速液体クロマトグラフィー等を挙げることができる。
また、これらのモードとして、分配クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、又はゲルクロマトグラフィー等を挙げることができる。
【００１８】
リガンドに対する特異的結合物質を固定する担体は、リガンドに対する特異的結合物質を化学的、又は物理的に結合することができる不溶性の物質であれば良い。
例えば、この担体としては、アガロース、セルロース、デキストラン、ポリアクリルアミド、又は多孔性ガラス等を挙げることができる。
リガンドに対する特異的結合物質の担体への固定は、「蛋白質・酵素の基礎実験法（改訂第２版）」堀尾編，１７７〜２０９頁，南江堂，１９９４年１１月１０日発行、及び「Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ」ファルマシア バイオテク株式会社，１９９４年発行等に記載の公知の方法により行えば良い。
【００１９】
このリガンドに対する特異的結合物質の担体への固定方法としては、例えば、アガロース等の多糖類をブロムシアン（ＣＮＢｒ）等のハロゲン化シアンで処理して得られる活性化された多糖類に、リガンドに対する特異的結合物質が有するアミノ基を介して共有結合させる方法等を挙げることができる。
また、アームを有する担体のアームと、リガンドに対する特異的結合物質が有するアームと結合する反応基を結合させる方法を用いても良い。このアームとリガンドに対する特異的結合物質が有するアームと結合する反応基の組み合わせとしては、例えば、ω−アミノアルキル基とカルボキシル基若しくはアルデヒド基、ブロモアセチル基とイミダゾール基あるいはフェノール性水酸基若しくはアミノ基、ヒドラジドとカルボキシル基若しくはアルデヒド基、又は、エポキシ基と糖の水酸基若しくはアミノ基、Ｎ−アミノカプロン酸基とアミノ基、又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド化合物とアミノ基等を挙げることができる。
【００２０】
この担体を内包するカラムのサイズは特に限定されるものではないが、一般的に分析用としては、内径０．１〜０．５mm×長さ３．５〜３０cm（キャピラリーＨＰＬＣ用）や、内径０．５〜２mm×長さ３．５〜３０cm（セミミクロＨＰＬＣ用）、又は内径２〜１０mm×長さ３．５〜３０cmのものを用いることができる。
【００２１】
第２のカラムは、他の物質と結合した信号物質及び遊離の信号物質と測定対象物質と結合した信号物質とを分離することができる担体よりなるものである。
【００２２】
この測定対象物質と結合した信号物質を他の物質と結合した信号物質及び遊離の信号物質と分離することができる担体は、「他の物質と結合した信号物質」及び「遊離の信号物質」と、「測定対象物質と結合した信号物質」とを分離することができる担体であればいかなるものでも良く、測定対象物質及び信号物質に応じて適宜選択すれば良い。
【００２３】
この担体としては、例えば、分配クロマトグラフィーおよび吸着クロマトグラフィーの担体に関しては、ｉ）順相系として、シリカゲル、アルミナ、チタニア、ジルコニア、セリア、多孔性ガラス、ハイドロキシアパタイト、ニトロフェニル； ii ）逆相系として、ポリスチレンゲル、ハイドロキシアパタイト、若しくはニトロフェニル、又はシリカやポリマー等に下記の基を結合させたもの：オクタデシルシリル（ＯＤＳ）基、オクチルシリル基、エチルシリル基、メチルシリル基、フェニル基、シアノ基、フルオロカーボン基、グラファイトカーボン基、２−（１−ピレニル）エチルシリル基、； iii) 順相逆相系として、アミノプロピル、シアノプロピル、ジオール、キラル；iv）内面逆相系として、細孔部表面がＯＤＳ、フェニル基などの疎水性基であり、担体粒子外表面がポリオキシエチレン基などの親水性基である担体、ならびに；ｖ）ポリオキシエチレンのネットワーク構造系等が挙げられる。
なお、試料がタンパク質等の高分子物質を含む場合には、担体として内面逆相系の担体を用いることが好ましい。
【００２４】
また、イオン交換クロマトグラフィーの担体に関しては、下記のイオン交換基などが結合したセルロース、架橋デキストラン、架橋アガロースや親水性ビニルポリマー等が挙げられる：ｉ）陽イオン交換基として、−Ｏ−（ＣＨ2)3−ＳＯ3 - 、−Ｏ−（ＣＨ2)2−ＳＯ3 - 、−ＣＨ2−ＳＯ3 - 、−ＳＯ3 - 、−ＰＯ4 2- 、−Ｏ−ＣＨ2−ＣＯＯ- 等を有する樹脂、ならびに；ii）陰イオン交換基として、−Ｎ+(ＣＨ3)3、−ＣＨ2−Ｎ+(ＣＨ3)3、−Ｎ+(ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ）（ＣＨ3)2、−Ｏ−（ＣＨ2)2−Ｎ+(Ｃ2Ｈ5)2Ｈ、−Ｏ−（ＣＨ2)2−Ｎ+(Ｃ2Ｈ5)2−ＣＨ2−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ3、−ＮＨ2、−ＮＨＲ、−ＮＲ2等を有する樹脂（ここで、Ｒは例えばアルキルなどを表す）。
【００２５】
また、ゲルクロマトグラフィーの担体に関しては、ｉ）有機溶媒系として、ポリスチレンゲル、ポリメチルメタクリレートゲル、ならびに；ii）水溶媒系として、ポリビニルアルコールゲル、ポリアクリルアミドゲル、ポリヒドロキシエチルメタクリレートゲル等が挙げられる。
【００２６】
また、疎水クロマトグラフィーの担体に関しては、疎水基（例えば、フェニル基、ブチル基、オクチル基）などが結合した多孔性セルロース、架橋アガロース、親水性ビニルポリマー等が挙げられる。
【００２７】
そして、この担体を内包するカラムのサイズは特に限定されるものではないが、一般的に分析用としては、内径０．１〜０．５mm×長さ０．５〜３０cm（キャピラリーＨＰＬＣ用）や、内径０．５〜２mm×長さ０．５〜３０cm（セミミクロＨＰＬＣ用）、又は内径２〜１０mm×長さ０．５〜３０cmのものを用いることができる。
【００２８】
本発明において、試料、測定対象物質と結合する信号物質を含み測定対象物質をリガンドより遊離させることができる溶液、及び溶離液を液体クロマトグラフィー装置上で流す流速はカラムの内径により変わるが、カラムの内径と流速の関係は通常、０．１〜１ｍｍの場合は０．００１〜０．１ｍＬ／分、１〜５ｍｍの場合は０．０５〜２ｍＬ／分、及び５〜５０ｍｍの場合は１〜３０ｍＬ／分である。
【００２９】
本発明の液体クロマトグラフィー装置におけるポンプは、プランジャー型、シリンジ型、又はガス圧型等の上記流速に対応できるポンプであれば良い。
本発明の液体クロマトグラフィー装置における試料導入部は、液体クロマトグラフィーに使用できるものであれば良い。
【００３０】
本発明の液体クロマトグラフィー装置における検出部は、信号物質を検出できるものであれば良く、具体的には、紫外部、可視部、若しくは赤外部の吸光、蛍光強度、放射強度、化学発光若しくは生物発光、電位、電気伝導度、屈折率、蒸発光散乱、旋光度、レーザー光散乱、質量分析、又はＩＣＰ質量分析等の検出を行えるものであれば良い。
【００３１】
本発明において、液体クロマトグラフィー装置に流す溶離液は、第２のカラムの担体として分配クロマトグラフィー用の担体、又は吸着クロマトグラフィー用の担体を用いる場合であって、順相系である場合は、ｎ−ヘキサン等の低極性の有機溶媒に高極性の溶媒を混合したものを使用する。
なお、一般に、高極性の溶媒の比率を増やすほど測定対象物質の溶出は早くなる。
溶出は、水の場合が一番早く、アルコール、テトラヒドロフラン、ジオキサン、酢酸エチル、ジクロロメタン、ｎ−ヘキサンの順で遅くなる。
【００３２】
また、逆相系、又は内面逆相系である場合は、水と有機溶媒を混合したものを使用する。
この場合、一般に、有機溶媒の比率を増すほど測定対象物質の溶出は早くなる。
溶出は、テトラヒドロフラン、ジオキサン、イソプロパノール、アセトニトリル、エタノール、メタノールの順で遅くなる。
【００３３】
第２のカラムの担体として、イオン交換クロマトグラフィーを用いる場合、溶離液は、酸性水溶液、塩基性水溶液、又は塩を含む緩衝液を使用することができる。溶出の早さの調整は、溶離液中のイオン濃度を変えることにより行うことができる。
【００３４】
第２のカラムの担体として、ゲルクロマトグラフィーを用いる場合、溶離液は、有機系溶媒では、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、クロロホルム、ヘキサフルオロイソプロパノール、又はトルエン等を用いることができ、水系溶媒では、塩の水溶液を用いることができる。
【００３５】
なお、上記の溶離液には、必要に応じて、緩衝剤、界面活性剤、又はキレート化合物等の添加剤を含有させても良い。
【００３６】
緩衝剤としては、グリシン、ＭＥＳ、ビス−トリス、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、イミダゾール、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、塩酸トリエタノールアミン、ＨＥＰＰＳＯ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ＥＰＰＳ、グリシルグリシン、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール、ビシン、ＴＡＰＳ、トリシン、ホウ酸、ＣＨＥＳ、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、ＣＡＰＳＯ、ＣＡＰＳ、ジエタノールアミン、又は２−エチルアミノエタノール等を挙げることができる。
この緩衝剤の濃度とｐＨは、目的に応じて適宜選択すればよい。
【００３７】
界面活性剤としては、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、デカグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンフィトステロール、ポリオキシエチレンフィトスタノール、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンヒマシ油、硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンラノリンなどの非イオン性界面活性剤、酢酸ベタイン等のカルボキシベタイン、スルホベタイン、アミノカルボン酸などの両性界面活性剤、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル酢酸塩などの陰イオン性界面活性剤、アミン塩、第４級アンモニウム塩などの陽イオン性界面活性剤等を挙げることができる。
【００３８】
キレート化合物としては、ＥＤＴＡ、ＮＴＡ、ＣｙＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＥＤＴＡ−ＯＨ、ＧＥＤＴＡ、ＴＴＨＡ、ＤＨＥＧ、ＩＤＡ、ＥＤＤＡ、ＤＰＴＡ−ＯＨ、ＮＴＰ、メチル−ＥＤＴＡ、又はＨＩＤＡ等を挙げることができる。
【００３９】
本発明の試料中のリガンドに結合している測定対象物質の特異的測定方法においては、溶離液を流している本発明の液体クロマトグラフィー装置の試料導入部に試料を、通常は１〜１，０００μＬ注入する。
次に、測定対象物質と結合する信号物質を含み測定対象物質をリガンドより遊離させることができる溶液を試料導入部に、通常は１〜１，０００μＬ注入する。
この測定対象物質と結合する信号物質を含み測定対象物質をリガンドより遊離させることができる溶液の注入は、試料の注入の後、第１のカラムにおいてリガンドに結合している測定対象物質と遊離の測定対象物質が充分分離できる時間をおいた後、行うことが好ましい。この時間は、一般的には試料注入後５〜６０分、好ましくは１０〜３０分である。
そして、液体クロマトグラフィー装置の検出部において、測定対象物質と結合した信号物質の検出を行い、試料中のリガンドに結合している測定対象物質の測定を行う。
【００４０】
【作用】
本発明における作用は以下の通りである。
ポンプ、試料導入部、リガンドに対する特異的結合物質を固定した担体よりなる第１のカラム、他の物質と結合した信号物質及び遊離の信号物質と測定対象物質と結合した信号物質とを分離することができる担体よりなる第２のカラム、及び検出部よりなる、試料中のリガンドに結合している測定対象物質を特異的に測定するための液体クロマトグラフィー装置の試料導入部に試料を注入して測定対象物質が結合しているリガンドを第１のカラムの担体に結合させ、次に、測定対象物質と結合する信号物質を含み測定対象物質をリガンドより遊離させることができる溶液を試料導入部より注入してこの信号物質を測定対象物質に結合させ、かつリガンドから遊離させ、更に第２のカラム中において他の物質と結合した信号物質及び遊離の信号物質と測定対象物質と結合した信号物質とを分離させ、そして、この分離した測定対象物質と結合した信号物質を検出部において検出することにより、試料中のリガンドに結合している測定対象物質を特異的に測定する。
【００４１】
【実施例】
以下、実施例により本発明をより具体的に詳述するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定されるものではない。
【００４２】
（実施例１） 〔血清試料中のトランスフェリン結合アルミニウムの測定〕
本発明の液体クロマトグラフィー測定装置を構築し、これを用いて血清試料中のトランスフェリン結合アルミニウムの測定を行った。
【００４３】
（１）第１のカラムの調製
ＦＰＬＣ用アガロースカラム〔内径７ｍｍ×長さ２５ｍｍ〕（ファルマシア バイオテク社製）に充填されたアガロースに、６−アミノカプロン酸をエポキシ活性化法で共有結合させた。
次に、この末端カルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドでエステル化した。
更にこのエステル結合に、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．２Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）に１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解したウサギの抗ヒト・トランスフェリン抗体〔製品番号：Ａ７０４／Ｒ５Ｈ、バイオジェネシス社（英国）〕の１ｍＬを接触、求核攻撃させて、アミド結合させた。
その後、これに０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５Ｍエタノールアミン緩衝液（ｐＨ８．３）を加え、１時間放置して、過剰な活性基を不活性化させた。
更に、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５Ｍエタノールアミン緩衝液（ｐＨ８．３）と０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４）を交互に３回ずつ流し、結合しなかった抗ヒト・トランスフェリン抗体を洗い流した。
このようにして、ウサギの抗ヒト・トランスフェリン抗体を固定させた担体よりなる第１のカラムを調製した。
【００４４】
（２）液体クロマトグラフィー装置の構築
ポンプ、試料導入部、及び検出部は、ナノスペース・システムＳＩ−１（資生堂社製）を用いた。
第２のカラムとして、内面逆相型カラムのカプセルパック ＭＦ ｐｈ−１〔内径１．５ｍｍ×長さ３５ｍｍ〕（資生堂社製）を使用した。
ポンプ、試料導入部、上記（１）で調製した第１のカラム、第２のカラム、検出部、及びフラクションコレクターを、図１に示したように、ポンプ−試料導入部−第１のカラム−第２のカラム−検出部−フラクションコレクターの順に連結して、本発明の液体クロマトグラフィー装置を構築した。
【００４５】
（３）試料の調製
ヒト血清試料にアルミニウムを１００μｇ／Ｌ（ｐｐｂ）になるように添加して、アルミニウム添加血清試料を調製した。
試料として、このアルミニウム添加血清試料とヒト血清試料の２種類の試料を用意した。
【００４６】
（４）ヒト血清試料中のトランスフェリン結合アルミニウムの測定
上記（２）で構築した液体クロマトグラフィー装置に、溶離液として２０％（ｗ／ｗ）２−プロパノールを含む０．１Ｍ Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）緩衝液（ｐＨ７．０）を１２０μＬ／分の流速で流しておき、上記（３）で調製したヒト血清試料、又はアルミニウム添加血清試料の１００μＬを試料導入部に注入した。
なお、第１のカラム、及び第２のカラムの温度は、１６℃となるようにした。
２８０ｎｍにおける吸光度の検出によりタンパク質のピークが過ぎたことが確認された試料注入１５分後に、１０ｍＭ ８−キノリノールを含む１００ｍＭ塩酸を１００μＬ試料注入部に注入した。
検出部による検出を、励起波長３７０ｎｍ、及び放射波長５０４ｎｍでの蛍光強度の測定により行った。
【００４７】
これらの測定の結果を図２に示した。
これらのクロマトグラムにおいて、（ａ）は試料がヒト血清試料の場合であり、（ｂ）は試料がアルミニウム添加血清試料の場合である。また、横軸は試料を注入してからの経過時間、縦軸は励起波長３７０ｎｍ、放射波長５０４ｎｍでの蛍光強度を表す。
【００４８】
これらの図より、血清試料中のトランスフェリン結合アルミニウムが二十数分で測定できることが確かめられた。
【００４９】
（実施例２） 〔トランスフェリン結合アルミニウム測定の検量線の作成〕
トランスフェリン結合アルミニウムを添加した試料を測定して、検量線の作成を行った。
【００５０】
（１）試料の作成。
ヒト血清試料にアルミニウムを１００μｇ／Ｌ（ｐｐｂ）、又は３００μｇ／Ｌ（ｐｐｂ）になるように添加して、アルミニウム添加血清試料を調製した。
試料として、１００μｇ／Ｌ（ｐｐｂ）のアルミニウム添加血清試料、３００μｇ／Ｌ（ｐｐｂ）のアルミニウム添加血清試料、及びヒト血清試料の３種類の試料を用意した。
【００５１】
（２）ヒト血清試料中のトランスフェリン結合アルミニウムの測定
上記実施例１の（２）で構築した液体クロマトグラフィー装置を用いて、上記（１）で調製した３種類のヒト血清試料中のトランスフェリン結合アルミニウムの測定を、上記実施例１の（４）の記載と同様にして行った。
【００５２】
この測定の結果を図３に示した。
この検量線において、横軸は添加した試料中のトランスフェリン結合アルミニウムの濃度、縦軸は励起波長３７０ｎｍ、放射波長５０４ｎｍでの蛍光強度を表す。
【００５３】
この図より、本発明の測定において、試料中のトランスフェリン結合アルミニウム測定の検量線が直線であることが確かめられた。
このことより、本発明の測定装置及び測定方法は、試料中のリガンドに結合している物質を、定量的かつ正確に測定できることが確かめられた。
【００５４】
（実施例３） 〔試料中のトランスフェリン結合鉄の測定〕
本発明の液体クロマトグラフィー測定装置を構築し、これを用いて試料中のトランスフェリン結合鉄の測定を行った。
【００５５】
（１）試料の調製
ヒト・ホロ型トランスフェリン〔シグマ社製（米国）〕を１０ｍｇ／ｍＬになるように０．１Ｍ ＢＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して、トランスフェリン結合鉄含有試料を調製した。
【００５６】
（２）試料中のトランスフェリン結合鉄の測定
上記実施例１の（２）で構築した液体クロマトグラフィー装置に、溶離液として１５％（ｗ／ｗ）２−プロパノールを含む０．１Ｍ ＢＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を１００μＬ／分の流速で流しておき、上記（１）で調製した試料の１００μＬを試料導入部に注入した。
なお、第１のカラム、及び第２のカラムの温度は、２５℃となるようにした。
２８０ｎｍにおける吸光度の検出によりタンパク質のピークが過ぎたことが確認された試料注入１５分後に、１ｍＭ ４−（２−ピリジラゾ）レゾルシノール〔ＰＡＲ〕、及び１０ｍＭアスコルビン酸を含む１００ｍＭ塩酸を１００μＬ試料注入部に注入した。
検出部による検出を、４９５ｎｍでの吸光の測定により行った。
また、対照として、試料の注入を行わない他は上記と同様に測定を行い、試薬盲検の測定を行った。
【００５７】
これらの測定の結果を図４に示した。
これらのクロマトグラムにおいて、（ａ）はトランスフェリン結合鉄含有試料を測定した場合であり、（ｂ）は試薬盲検を測定した場合である。また、横軸は試料を注入してからの経過時間（ａの場合）、又はＰＡＲ等を注入してからの経過時間（ｂの場合）を、縦軸は４９５ｎｍでの吸光を表す。
【００５８】
これらの図より、トランスフェリン結合鉄含有試料を測定した場合は、ＰＡＲに結合した鉄のピークである経過時間３７分付近のピークが試薬盲検の経過時間２１分付近のピークに比べて顕著に増大していることが分かる。
このことより、本発明の測定においては、試料中のトランスフェリン結合鉄を特異的に測定できることが確かめられた。
なお、ヒト・アポ型トランスフェリン〔シグマ社製（米国）〕試料についても測定を行ったが、試薬盲検の場合と同様のクロマトグラムであった。
【００５９】
（実施例４） 〔試料中のセルロプラスミン結合銅の測定〕
本発明の液体クロマトグラフィー測定装置を構築し、これを用いて試料中のセルロプラスミン結合銅の測定を行った。
【００６０】
（１）第１のカラムの調製
ＦＰＬＣ用アガロースカラム〔内径７ｍｍ×長さ２５ｍｍ〕（ファルマシア バイオテク社製）に充填されたアガロースに、６−アミノカプロン酸をエポキシ活性化法で共有結合させた。
次に、この末端カルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドでエステル化した。
更にこのエステル結合に、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．２Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）に１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解したヒツジの抗ヒト・セルロプラスミン抗体〔製品番号：１９４０−０００４、バイオジェネシス社（英国）〕の１ｍＬを接触、求核攻撃させて、アミド結合させた。
その後、これに０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５Ｍエタノールアミン緩衝液（ｐＨ８．３）を加え、１時間放置して、過剰な活性基を不活性化させた。
更に、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５Ｍエタノールアミン緩衝液（ｐＨ８．３）と０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４）を交互に３回ずつ流し、結合しなかった抗ヒト・セルロプラスミン抗体を洗い流した。
このようにして、ヒツジの抗ヒト・セルロプラスミン抗体を固定させた担体よりなる第１のカラムを調製した。
【００６１】
（２）液体クロマトグラフィー装置の構築
ポンプ、試料導入部、及び検出部は、ナノスペース・システムＳＩ−１（資生堂社製）を用いた。
第２のカラムとして、内面逆相型カラムのカプセルパック ＭＦ ｐｈ−１〔内径１．５ｍｍ×長さ３５ｍｍ〕（資生堂社製）を使用した。
ポンプ、試料導入部、上記１で調製した第１のカラム、第２のカラム、検出部、及びフラクションコレクターを、図１に示したように、ポンプ−試料導入部−第１のカラム−第２のカラム−検出部−フラクションコレクターの順に連結して、本発明の液体クロマトグラフィー装置を構築した。
【００６２】
（３）試料の調製
ヒト・セルロプラスミン〔製品番号：Ｃ４７７０、シグマ社製（米国）〕を９０ｍｇ／ｍＬになるように０．１Ｍ ＢＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して、セルロプラスミン結合銅含有試料を調製した。
【００６３】
（４）試料中のセルロプラスミン結合銅の測定
上記（２）で構築した液体クロマトグラフィー装置に、溶離液として２０％（ｗ／ｗ）２−プロパノール、及び０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ ＢＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を１００μＬ／分の流速で流しておき、上記（３）で調製したセルロプラスミン結合銅含有試料の１００μＬを試料導入部に注入した。
なお、第１のカラム、及び第２のカラムの温度は、２５℃となるようにした。
２８０ｎｍにおける吸光度の検出によりタンパク質のピークが過ぎたことが確認された試料注入２０分後に、１ｍＭ ４−（３，５−ジブロモ−２−ピリジルアゾ）−Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリンナトリウム〔３，５−ＤｉＢｒ−ＰＡＥＳＡ〕、及び１０ｍＭアスコルビン酸を含む１００ｍＭ塩酸を１００μＬ試料注入部に注入した。
検出部による検出を、６３７ｎｍでの吸光の測定により行った。
また、対照として、試料の注入を行わない他は上記と同様に測定を行い、試薬盲検の測定を行った。
【００６４】
これらの測定の結果を図５に示した。
これらのクロマトグラムにおいて、（ａ）はセルロプラスミン結合銅含有試料を測定した場合であり、（ｂ）は試薬盲検を測定した場合である。また、横軸は試料を注入してからの経過時間（ａの場合）、又は３，５−ＤｉＢｒ−ＰＡＥＳＡ等を注入してからの経過時間（ｂの場合）を、縦軸は６３７ｎｍでの吸光を表す。
【００６５】
これらの図より、セルロプラスミン結合銅含有試料を測定した場合は、３，５−ＤｉＢｒ−ＰＡＥＳＡに結合した銅のピークである経過時間４３分付近のピークが試薬盲検の経過時間１３分付近のピークに比べて顕著に増大していることが分かる。
このことより、本発明の測定においては、試料中のセルロプラスミン結合銅を特異的に測定できることが確かめられた。
なお、ヒト・アポ型セルロプラスミン〔シグマ社製（米国）〕試料についても測定を行ったが、試薬盲検の場合と同様のクロマトグラムであった。
【００６６】
（実施例５） 〔試料中の血清アルブミン結合亜鉛の測定〕
本発明の液体クロマトグラフィー測定装置を構築し、これを用いて試料中の血清アルブミン結合亜鉛の測定を行った。
【００６７】
（１）第１のカラムの調製
ＦＰＬＣ用アガロースカラム〔内径７ｍｍ×長さ２５ｍｍ〕（ファルマシア バイオテク社製）に充填されたアガロースに、６−アミノカプロン酸をエポキシ活性化法で共有結合させた。
次に、この末端カルボキシル基を、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドでエステル化した。
更にこのエステル結合に、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．２Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．３）に１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解したウサギの抗ヒト・血清アルブミン抗体〔シグマ社製（米国）〕の１ｍＬを接触、求核攻撃させて、アミド結合させた。
その後、これに０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５Ｍエタノールアミン緩衝液（ｐＨ８．３）を加え、１時間放置して、過剰な活性基を不活性化させた。
更に、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．５Ｍエタノールアミン緩衝液（ｐＨ８．３）と０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４）を交互に３回ずつ流し、結合しなかったウサギ抗ヒト・血清アルブミン抗体を洗い流した。
このようにして、ウサギの抗ヒト・血清アルブミン抗体を固定させた担体よりなる第１のカラムを調製した。
【００６８】
（２）液体クロマトグラフィー装置の構築
ポンプ、試料導入部、及び検出部は、ナノスペース・システムＳＩ−１（資生堂社製）を用いた。
第２のカラムとして、内面逆相型カラムのカプセルパック ＭＦ ｐｈ−１〔内径１．５ｍｍ×長さ３５ｍｍ〕（資生堂社製）を使用した。
ポンプ、試料導入部、上記（１）で調製した第１のカラム、第２のカラム、検出部、及びフラクションコレクターを、図１に示したように、ポンプ−試料導入部−第１のカラム−第２のカラム−検出部−フラクションコレクターの順に連結して、本発明の液体クロマトグラフィー装置を構築した。
【００６９】
（３）試料の調製
ヒト・血清アルブミン〔シグマ社製（米国）〕を４０ｍｇ／ｍＬになるよう、そして、亜鉛濃度が１０μｇ／ｍＬになるよう硝酸亜鉛を、０．１Ｍ ＢＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）にそれぞれ溶解して、ヒト・血清アルブミン結合亜鉛含有試料を調製した。
【００７０】
（４）試料中のヒト・血清アルブミン結合亜鉛の測定
上記（２）で構築した液体クロマトグラフィー装置に、溶離液として２３％（ｗ／ｗ）アセトニトリル、２０ｍＭアデニン、及び１Ｍ塩化ナトリウムを含む０．２Ｍ ＢＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）を２００μＬ／分の流速で流しておき、上記（３）で調製したヒト・血清アルブミン結合亜鉛含有試料の１００μＬを試料導入部に注入した。
なお、第１のカラム、及び第２のカラムの温度は、３０℃となるようにした。
２８０ｎｍにおける吸光度の検出によりタンパク質のピークが過ぎたことが確認された試料注入１５分後に、０．１ｍＭ α，β，γ，δ−テトラキス（４−カルボキシフェニル）ポルフィン〔ＴＣＰＰ〕、及び２０ｍＭアデニンを含む１Ｍ ２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸〔ＣＨＥＳ〕緩衝液（ｐＨ９．０）を１００μＬ試料注入部に注入した。
検出部による検出を、励起波長４２２ｎｍ、及び放射波長６０６ｎｍでの蛍光強度の測定により行った。
また、対照として、試料の注入を行わない他は上記と同様に測定を行い、試薬盲検の測定を行った。
【００７１】
これらの測定の結果を図６に示した。
これらのクロマトグラムにおいて、（ａ）はヒト・血清アルブミン結合亜鉛含有試料を測定した場合であり、（ｂ）は試薬盲検を測定した場合である。また、横軸は試料を注入してからの経過時間（ａの場合）、又はＴＣＰＰ等を注入してからの経過時間（ｂの場合）を、縦軸は励起波長４２２ｎｍ、及び放射波長６０６ｎｍでの蛍光強度を表す。
【００７２】
これらの図より、ヒト・血清アルブミン結合亜鉛含有試料を測定した場合は、ＴＣＰＰに結合した亜鉛のピークである経過時間３４分付近のピークが試薬盲検の経過時間１９分付近のピークに比べて顕著に増大していることが分かる。
このことより、本発明の測定においては、試料中のヒト・血清アルブミン結合亜鉛を特異的に測定できることが確かめられた。
なお、ヒト・血清アルブミン〔シグマ社製（米国）〕試料についても測定を行ったが、試薬盲検の場合と同様のクロマトグラムであった。
【００７３】
【発明の効果】
本発明の測定装置及び測定方法は、特殊若しくは高価な装置又は部品を使用することなく、かつ煩雑な操作を必要とせず、現在広く普及している装置を用いるものでありながら、吸着、濃縮、遊離、結合体形成、分解、及び分離の各工程を簡便な操作で行うことができ、試料中のリガンドに結合している測定対象物質だけを特異的に測定することができる測定装置、及び測定方法である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の液体クロマトグラフィー装置の構成を示した図である。
【図２】ヒト血清試料中のトランスフェリン結合アルミニウム測定のクロマトグラムを示した図である。
【図３】ヒト血清試料中のトランスフェリン結合アルミニウム測定の検量線を示した図である。
【図４】試料中のトランスフェリン結合鉄測定のクロマトグラムを示した図である。
【図５】試料中のセルロプラスミン結合銅測定のクロマトグラムを示した図である。
【図６】試料中の血清アルブミン結合亜鉛測定のクロマトグラムを示した図である。
Claims (8)
- ポンプ、試料導入部、リガンドに対する特異的結合物質を固定した担体よりなる第１のカラム、他の物質と結合した信号物質及び遊離の信号物質と測定対象物質と結合した信号物質とを分離することができる担体よりなる第２のカラム、及び検出部よりなる、試料中のリガンドに結合している測定対象物質を特異的に測定するための液体クロマトグラフィー装置。
- ポンプ、試料導入部、第１のカラム、第２のカラム、及び検出部が、ポンプ−試料導入部−第１のカラム−第２のカラム−検出部の順に連結されている、請求項１記載の試料中のリガンドに結合している測定対象物質を特異的に測定するための液体クロマトグラフィー装置。
- リガンドに対する特異的結合物質が、リガンドに対する抗体である、請求項１又は請求項２記載の試料中のリガンドに結合している測定対象物質を特異的に測定するための液体クロマトグラフィー装置。
- 測定対象物質が、金属である、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の試料中のリガンドに結合している測定対象物質を特異的に測定するための液体クロマトグラフィー装置。
- ポンプ、試料導入部、リガンドに対する特異的結合物質を固定した担体よりなる第１のカラム、他の物質と結合した信号物質及び遊離の信号物質と測定対象物質と結合した信号物質とを分離することができる担体よりなる第２のカラム、及び検出部よりなる、試料中のリガンドに結合している測定対象物質を特異的に測定するための液体クロマトグラフィー装置の試料導入部に試料を注入し、次に、測定対象物質と結合する信号物質を含み測定対象物質をリガンドより遊離させることができる溶液を試料導入部より注入し、そして、測定対象物質と結合した信号物質を検出部において検出することよりなる、試料中のリガンドに結合している測定対象物質の特異的測定方法。
- 液体クロマトグラフィー装置のポンプ、試料導入部、第１のカラム、第２のカラム、及び検出部が、ポンプ−試料導入部−第１のカラム−第２のカラム−検出部の順に連結されている、請求項５記載の試料中のリガンドに結合している測定対象物質の特異的測定方法。
- リガンドに対する特異的結合物質が、リガンドに対する抗体である、請求項５又は請求項６記載の試料中のリガンドに結合している測定対象物質の特異的測定方法。
- 測定対象物質が、金属である、請求項５〜請求項７のいずれか１項に記載の試料中のリガンドに結合している測定対象物質の特異的測定方法。
【０００１】
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