JP4031994B2 - 環状ペンタペプチド類及びそれらの調製法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規環状ペプチド及びその調製法に関する。
【0002】
【従来の技術】
ペプチド6Aは、心臓の動脈及び大腿部の動脈の血流を増加させることが知られている、フィブリノゲンβ鎖アナログの分解物である。1978年に(1)、ペプチド6Aは、最初に、ベロー(Belew)ら(2)によって、ヒトのフィブリノゲンのβ鎖から単離、精製された。ペプチド6Aの組成は、Ala−Arg−Pro−Ala−Lysと確認された。このペプチドは、イヌの心臓の動脈及び大腿部の動脈の血流を増加させる。1997年に、本発明者らは、溶液法によってペプチド6A及びそのアナログを調製し、このペプチドが、血管の緊張を和らげ、かつ血圧を下げる高い効能を有し、更に血栓症に対する高い効能を有することを観察した。これら化合物の合成技術及び機能は、中国特許第1146458号に記載されている。しかし、1990年に、本発明者らは、ペプチド6Aは、心臓の動脈の血栓症を有するイヌに、組織プラスミノゲン活性化物質とともに静脈内注射されても、血栓溶解のパラメーターにおける更なる利点を持たないことを観察した。それらの結果から、ペプチド6Aは、アンジオテンシン−転換酵素(ACE)の基質なので、静脈内投与中に肺においてこの酵素によって迅速に分解され得ることが示された。更に、本発明者らによって1997年に合成された、ペプチド6A及びそのアナログは、優れた抗血栓症能力を有していたが、インビボでのそれらの半減期は極めて短いため、長期間効果を示すことはできなかった。
【0003】
上記の問題を解決するために、本発明者らは、環状ペプチドは通常、ペプチダーゼに対する良好な安定性をもたらす特定の(restricted)構造を特徴とすることを考慮した。そこで、本発明者らは、ACEによって引き起こされる分解を防ぐために、更に環状化合物が血栓溶解効果を失わないように、ペプチド6A及びそのアナログを環状型として合成することを試みた。ここで、新たな環状化合物、更には直鎖ペプチド6A及びそのアナログを、環状型に転換するための新たな技術が必要とされる。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の1つの目的は、長期間血栓溶解効果を有する新規環状ペプチドを提供することである。
本発明の別の目的は、上記の新規環状ペプチドを調製するための方法を提供することである。
【0005】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、以下の式(I)
(式中、Xaaは、Ala、Gly、Glu、Gln、Asp、Asn、Ar g、又はLysである)
の新規環状ペプチドが提供される。
【0006】
式(I)の環状ペプチドは、以下の方法1又は方法2によって合成され得る。
方法1:
まず、B−Xaa−Arg(T)−Pro−Ala−Lys(Z)−OH、B−Arg(T)−Pro−Ala−Lys(Z)−Xaa−OH、B−Pro−Ala−Lys(Z)−Xaa−Arg(T)−OH、B−Ala−Lys(Z)−Xaa−Arg(T)−Pro−OH、及びB−Lys(Z)−Xaa−Arg(T)−Pro−Ala−OHからなる群から選択される、N−末端保護基を有する少なくとも1つのペプチドを供給する;ここで、Xaaは、Ala、Gly、Glu、Gln、Asp、Asn、Arg又はLysであり;Bは、ペプチド鎖のN−末端保護基であり;Zは、Lys残基の側鎖保護基であり;かつ、Tは、Arg残基の側鎖保護基である。
次いで、p−ニトロフェノール、適当な有機溶媒及びカップリング剤を添加し、前記ペプチドのC−末端を活性化して第一中間体を形成する。
その後、第一中間体からN−末端保護基を除去して第二中間体を形成する。
第二中間体を適当な有機溶媒中に溶解し、環状付加反応を行い、第三中間体を形成する。
最後に、第三中間体からLys及びArg残基の側鎖保護基を除去して最終生成物を形成する。
【0007】
方法2:
まず、B−Xaa−Arg(T)−Pro−Ala−Lys(Z)−OH、B−Arg(T)−Pro−Ala−Lys(Z)−Xaa−OH、B−Pro−Ala−Lys(Z)−Xaa−Arg(T)−OH、B−Ala−Lys(Z)−Xaa−Arg(T)−Pro−OH、及びB−Lys(Z)−Xaa−Arg(T)−Pro−Ala−OHからなる群から選択される、N−末端保護基を有するペプチドを供給する;ここで、Xaaは、Ala、Gly、Glu、Gln、Asp、Asn、Arg、又はLysであり;Bは、ペプチド鎖のN−末端保護基であり;Zは、Lys残基の側鎖保護基であり;かつ、Tは、Arg残基の側鎖保護基である。
次いで、前記ペプチドのN−末端保護基を除去して第一中間体を形成する。
第一中間体を適当な有機溶媒中に溶解し、次いでカップリング剤を添加して直接カップリング反応を行うことにより、第二中間体を得る。
最後に、第二中間体のLys及びArg残基の側鎖上の保護基を除去して、式(I)の環状ペプチドを形成する。
【0008】
式(I)の環状ペプチドは、血栓溶解効果を有するので、それらペプチドは、血管の緊張を和らげ、かつ血圧を低下させる薬剤として、更に抗血栓症剤として使用することができ、更に、血栓症、高血圧、及び心筋梗塞の治療に適用することができる。
【0009】
図面の簡単な説明
図1は、P6A及びP6Aアナログの合成経路を示す。ここで、AAは、対応する保護されたL−Ala、Gly、L−Lys、及びL−Glnを表す。
図2は、化合物(5−8)の合成経路を示す。ここで、AAは、対応する保護されたL−Ala、Gly、Lys、及びGlnを表す。
【0010】
【発明の実施の形態】
本発明は、直鎖ペプチド6A及びそのアナログを、バックボーン構造の可動性が制限される環状構造に転換するための方法を提供する。よって、本発明の環状ペプチドの分解率は劇的に低下し、それにより、そのインビボでの半減期は長くなるであろう。
【0011】
本発明では、ペプチド6A及びアナログはそれぞれ、固相合成又は液相合成によって調製される。対応する環状ペンタペプチドも、同じ方法によって調製される。その血栓溶解効果を、血栓症のラットモデルで評価した。
【0012】
本発明は、以下の式(I):
(式中、Xaaは、Ala、Gly、Glu、Gln、Asp、Asn、Ar g、又はLysである)
の環状ペプチドを提供する。
式(I)の環状ペプチドは、固相合成法または液相合成法によって調製され得る。
【0013】
以下の直鎖ペンタペプチド群:
B−Xaa−Arg(T)−Pro−Ala−Lys(Z)−OH、
B−Arg(T)−Pro−Ala−Lys(Z)−Xaa−OH、
B−Pro−Ala−Lys(Z)−Xaa−Arg(T)−OH、
B−Ala−Lys(Z)−Xaa−Arg(T)−Pro−OH、
B−Lys(Z)−Xaa−Arg(T)−Pro−Ala−OH;
(式中、Xaaは、Ala、Gly、Glu、Gln、Asp、Asn、Arg、又はLysであり;Bは、ペプチド鎖のN−末端保護基であり;Zは、Lys残基の側鎖保護基であり;かつ、Tは、Arg残基の側鎖保護基である)
は、原料としてL−保護基を含むアミノ酸を用いて、通常の固相合成法または液相合成法によって調製される。上記の保護基Bは、通常のN−末端保護基であり、好ましくは、Boc(tert-ブチルオキシカルボニル)、Fmoc(9-フルオレニルメチルオキシカルボニル)、Z(ベンジルオキシメチル)、Adoc(アダマンチルオキシカルボニル)、Bpoc(ビフェニルイソプロピルオキシカルボニル)、Trt(トリフェニルメチル)、及びNps(2-ニトロフェニルスルフェニル)を含む群から選択される;Lys残基の側鎖上の少なくとも1つの保護基Zは、4−ClZ(4-クロロベンジルオキシカルボニル)、2−ClZ(2-クロロベンジルオキシカルボニル)、2,4−Cl2Z(2,4-ジクロロベンジルオキシカルボニル)、3,4−Cl2Z(3,4-ジクロロベンジルオキシカルボニル)、3−ClZ(3-クロロベンジルオキシカルボニル)、2,6Cl2Z(2,6ジクロロベンジルオキシカルボニル)、Boc、Tos(4-トルエンスルホニル)、及びCuを含む群から選択される;そして、Arg残基の側鎖上の少なくとも1つの保護基Tは、Tos、No2、Z、Z2、Mbs、Mts (2,4,6−トリメチルベンゾスルフィジル)、Boc、及びAdocを含む群から選択される。
【0014】
上記の直鎖ペンタペプチドは、環化を行うための原料として使用される。最初に、本発明は、上記の直鎖ペンタペプチドに適用され得る2つの環化法を開示する。第一の方法は、“p−ニトロフェノールエステル法”と呼ばれ、ペプチド鎖のC−末端上の不活性な−COOH基を活性化するための活性化物質として、p−ニトロフェノールを使用する。それにより、不安定な−COONp基(−(C=O)-4-ニトロフェニル)が得られ、次いで、分子間環化が自然に起こる。第二の方法は、“直接カップリング法”と呼ばれ、適当な条件下で環化を行うために、カップリング剤を使用する。2つの方法の詳細を以下に述べる。
【0015】
1.p−ニトロフェノールエステル法
上記のN−末端保護基を含む直鎖ペンタペプチドを供給する。p−ニトロフェノール、適当な有機溶媒及びカップリング剤を添加して、ペプチドのC−末端基を活性化し、第一中間体を形成する;ここで、有機溶媒は限定されないが、少なくとも1つが、THF(テトラヒドロフラン)、ジオキサン、DMF(ジメチルホルムアミド)、DMSO(ジメチルスルホキシド)、酢酸エチル、ジクロロメタン、及びトリクロロメタンを含む群から選択されることが好ましい;カップリング剤は、アミノ酸合成において通常使用されるものであり、少なくとも1つが、DCC(ジクロロヘキシルカルボジイミド)、HOBt(1-ヒドロキシベンゾトリアゾール)、HONb(N-ヒドロキシ-5-ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド)、HOSu(N-ヒドロキシスクシニミド)、及びp−ニトロフェノールを含む群から選ばれることが好ましい。第一中間体の一例は、Boc−Xaa−Arg(T)−Pro−Ala−Lys(Z)−ONpであり、その他の例は、当業者であれば想像できる。
【0016】
次いで、脱保護剤と第一中間体を反応させることにより、第一中間体のN−末端保護基を除去し、第二中間体を形成する;ここで、脱保護剤の選択は、従来技術に基づき、N−末端保護基によって決まり、少なくとも1つが、HCl/酢酸エチル、HCl/ジクロロシクロヘキサン、トリフルオロ酢酸、H2/Pd、C、及びピリジンを含む群から選択されることが好ましい。第一中間体の一例は、HCl−Xaa−Arg(T)−Pro−Ala−Lys(Z)−ONpであり、その他の例は、当業者であれば想像できる。
【0017】
次いで、第二中間体を、適当な有機溶媒に溶解して環化を行い、第三中間体を形成する;ここで、有機溶媒は、上記の通りであり、Na2CO3、NaHCO3、K2CO3、KHCO3、TEA(トリエチルアルミニウム)、NH3、NMM(N-メチルモルホリン)、及びN(C2H5)3を含む群から選択される少なくとも1つの薬剤を添加することによって、ペプチド鎖上のC−末端及びN−末端がお互いに反応し、それにより、O、Np(ニトロフェニル)、又はONpがそのまま残るように環化が行われ、そして環状化合物が形成される。第三中間体の一例は、シクロ(Xaa−Arg(T)−Pro−Ala−Lys(Z))である。なお、最初の段階からこの段階まで、中間体のArg及びLys残基上の全ての側鎖は、保護基を有する。
従って、Lys及びArg残基上の側鎖保護基は、最終化合物を形成するために除去されるべきである。第三中間体を第二脱保護剤と反応させることにより、脱保護反応を行う。ここで、第二脱保護剤は、所望の脱保護基によって選択され、少なくとも1つが、フッ化水素酸、トリフルオロ酢酸、トリフルオロメチルスルホン酸、H2/Pd、及びCから選択されることが好ましい。最終化合物の例は、シクロ(Xaa−Arg−Pro−Ala−Lys)であり、その他の例は、当業者であれば想像できる。
【0018】
2.直接カップリング法:
上記のN−末端保護基を有する直鎖ペプチドを供給する。N−末端保護基は、第一脱保護剤と反応させることによって除去され、第一中間体が形成された。ここで、第一脱保護剤は、N−末端基に応じて選択され、好ましくは、HCl/酢酸エチル、HCl/ジクロロシクロヘキサン、トリフルオロ酢酸、H2/Pd、C、及びピリジンから選択される。第一中間体の一例は、HCl−Xaa−Arg(T)−Pro−Ala−Lys(Z)−OHであり、その他の例は、当業者であれば想像できる。
【0019】
次いで、第一中間体を適当な有機溶媒中に溶解し、カップリング剤を添加してカップリング反応を行い、それにより、第二中間体を得る;ここで、有機溶媒は特定されないが、少なくとも1つが、THF、ジオキサン、DMF、DMSO、酢酸エチル、及びジクロロメタンを含む群から選択されることが好ましい;カップリング剤は、通常のアミノ酸合成において用いられるものであり、DCC、HOBt、HONb、HOSu、及びp−ニトロフェノールを含む群から選択される少なくとも1つであることが好ましい。反応のpH値は、6.0〜8.0の範囲であることが好ましい。反応温度は、50℃〜90℃の範囲であることが好ましい;そして、pH値はアルカリによって調整される。そのアルカリは、少なくとも1つが、Na2CO3、NaHCO3、K2CO3、TEA、NH3、及びNMMを含む群から選択されることが好ましい。環化は、この段階で完了し、そして第二中間体の例は、シクロ(Xaa−Arg(T)−Pro−Ala−Lys(Z))であり、その他の例は、当業者であれば想像できる。
【0020】
上記のように、環状化合物のArg及びLys残基上の側鎖には、保護基が依然として結合している。よって、最終化合物のArg及びLys残基上の保護基は、除去されるべきである、その方法は、上述の通りである。最終化合物の例は、シクロ(Xaa−Arg−Pro−Ala−Lys)であり、その他の例は当業者であれば想像できる。
【0021】
【実施例】
化学合成
反応物の調製
L−保護(L-protected)アミノ酸、DCC及びHOBtは、シグマ・ケミカル社(Sigma Chemical Co.)から購入し;無水THFを、常温下でNaから蒸留し;乾燥DMF及びジオキサンを、塩化カルシウムから蒸留して4Aモレキュラー・シーブズで処理し;Boc化学を用いて、溶液法によって直鎖ペプチドを調製した。直鎖ペプチド合成及び環状ペプチド合成の両方において、DCCをカップリング剤として使用し;ニンヒドリン反応によって反応を観察し、そしてBoc保護基を4−6mol/LのHCl/EtoAcによって除去した。クゥインダオ・シリカゲルH(Qingdao Silica gel H)においてクロマトグラフィーを行った。顕微鏡ホステージ装置(microscopic hostage apparatus)によって融点を決定し、逆修正した(uncorrected)。ES−S989X−HOにおいてESI−マススペクトルを得て;シュミット+ヘンシュ社(Schmidt + Haensch Company)のポーラートロニック(Polartronic)−D−偏光計によって旋光度を決定した。
【0022】
以下の化合物(1)−(4)の調製:
Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)OBZl (1)
Boc-Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)OBZl (2)
Boc-Lys(Z)-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)OBZl (3)
Boc-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)OBZl (4)
化合物(1)−(4)の合成の一般的な工程:Boc保護(Boc protected)リジンから開始して、DCC/HOBtをカップリング剤として使用し、溶液法を用いてペプチド鎖を伸ばす。合成経路の概要をスキーム1に示す(図1参照)。詳細な説明は以下の通りである。
まず、ベンジル(Bzl)保護基をBoc−保護リジンのC−末端に結合させる。その反応は以下の通りである:
【0023】
【化1】
【0024】
その後、N−末端Boc保護基を除去し、次いでBoc−Ala及びDCCを添加して重合を行う。反応は以下の通りである:
【0025】
【化2】
【0026】
段階(iii)及び(iv)を繰り返し、そしてBoc−Proを添加して段階(v)を完了させ、トリペプチドを形成する。化合物(1)−(4)は、同様のスキームによって調製する。
化合物(1)−(4)の物理的データを以下に示す:
化合物(1)、収率88%、mp84−85℃
[α]D 20−33(C2、CHCl3)、FAB−MS(m/e) 1020[M+1]+;
化合物(2)、収率82%、mp76−77℃
[α] D 20−43(C2、CHCl3)、FAB−MS(m/e) 1211[M+1]+、1028[M+Na]+;
化合物(3)、収率78%、mp72−74℃
[α] D 20−46(C2、CHCl3)、FAB−MS(m/e) 1211[M+1]+;
化合物(4)、収率87%、mp83−85℃
[α] D 20−9(C0.3、CHCl3)、FAB−MS(m/e) 1077[M+1]+
【0027】
2.化合物(5)−(8)の調製:
Boc-Pro-Arg(Tos)-Ala-Lys(Z)-AlaOBzl (5)
Boc-Pro-Arg(Tos)-Gly-Lys(Z)-AlaOBzl (6)
Boc-Pro-Arg(Tos)- Lys(Z)-Lys(Z)-AlaOBzl (7)
Boc-Pro-Arg(Tos)-Gln-Lys(Z)-AlaOBzl (8)
化合物(5)−(8)の合成の一般的な工程:Boc保護アラニンから開始して、DCC/HoBtをカップリング剤として使用し、溶液法を用いてペプチド鎖を伸ばす。合成経路の概要をスキーム2に示す(図2参照)。
【0028】
化合物(5)−(8)の物理的データを以下に示す:
化合物(5)、収率68%、mp146−148℃
[α]D 20−22(C0.5、CHCl3)、TOF−MS(m/e) 1020[M+1]+、1041[M+Na]+、1058[M+K]+;
化合物(6)、収率72%、mp78−80℃
[α]D 20−22(C1、CHCl3)、TOF−MS(m/e) 1006[M+1]+、1028[M+Na]+、1044[M+K]+;
化合物(7)、収率62%、mp80−82℃
[α]D 20−27(C0.5、CHCl3)、TOF−MS(m/e) 1211[M+1]+、233[M+Na]+、1249[M+K]+;
化合物(8)、収率78%、mp90−92℃
[α]D 20−24(C0.2、CHCl3)、TOF−MS(m/e) 1077[M+1]+;
【0029】
3.化合物(9)−(16)の調製:
Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)OH (9)
Boc-Pro-Arg(Tos)-Ala-Lys(Z)-AlaOH (10)
Boc-Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)OH (11)
Boc-Pro-Arg(Tos)-Gly-Lys(Z)-AlaOH (12)
Boc-Lys(Z)-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)OH (13)
Boc-Pro-Arg(Tos)-Lys(Z)-AlaOH (14)
Boc-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)OH (15)
Boc-Pro-Arg(Tos)-Gln-Lys(Z)-AlaOH (16)
0.2mmolの化合物(5、6、7、8)のメタノール溶液を、氷水浴中で冷却し、2.0molの2mol/L NaOHを攪拌しながら滴下して添加した。反応混合物を30分間攪拌した。薄層クロマトグラフィーによって反応が完了したことが示されたら、2mol/LのHClで溶液を中和した。メタノールを除去した後、混合物を濾過し、そして濾過物を水で数回洗浄し、次いで濾過物を一晩ドライヤーに入れた。
【0030】
4.シクロ[Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)] (17)の調製
方法1:p−ニトロフェノールエステル法
0.2mmolのBoc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)OH及び0.3mmolのp−ニトロフェノールを無水THF(5ml)中に溶解し、氷水浴中で冷却し、0.3mmolのDCCを添加して、3時間攪拌し、次いで、反応温度を室温まで上昇させた。18時間後、混合物を濾過して溶媒を蒸発させ、真空乾燥させた(to dryness in vacuo)。残渣にエチルエーテルを加えて粉末にし、黄色のBoc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)Onp粉末を得た。4NのHCl/EtOAcによってBocを除去した後、得られたHcl-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)Onpを、12mlのジオキサン中に溶解し、2mlの0.1mol/L Na2CO3及び2mlの0.1mol/L NaHCO3を添加し、2時間攪拌した。溶媒を除去した後、クロマトグラフィーによって残渣を精製し、所望の生成物8mg(5%)を得た;mp118−120℃、[α]D 20−21(C0.2、CHCl3)、TOF−MS(M/e) 812[M+1]+。
【0031】
方法2:直接カップリング法
4NのHcl/EtOAcによって、0.2mmolのBoc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)OHからBocを除去し、得られたHcl-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)OHを200mlの乾燥DMF(10-3M)に溶解し、NMMを添加して溶液のpHを7にして、1mmolのDCCを添加し、混合物を70℃で3日間攪拌した。溶媒を真空で蒸発させ、残渣をクロマトグラフィーによって精製し、所望の生成物29mg(18%)を得た。その他の物理的データは方法1の場合と同様であった。
【0032】
方法3:カップリング部位としてのプロリン及びアラニン
0.2mmolのBoc-Pro-Arg(Tos)-Ala-Lys(Z)-AlaOH(10)からBocを除去し、次いで200mlのDMF(10-3M)中にBoc-Pro-Arg(Tos)-Ala-Lys(Z)-AlaOH(10)を溶解し、その後、方法2と同様の工程を行い、生成物を得た。収率が9%であったこと以外、物理的データは方法1及び2の場合と同様であった。
【0033】
5.シクロ[Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)] (18)の調製
方法1:直接カップリング法
4NのHcl/EtOAcによって、0.2mmolのBoc-Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)OHからBocを除去した。200mlの乾燥DMF(10-3M)中に、得られたHCl-Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)OHを溶解し、その後の工程は、シクロ[Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)](17)の調製の方法2と同様に行った。所望の生成物の収率は31%であり、mp102−104℃、[α]D 20−30(C1、CHCl3)、ESI−MS(m/e)、798[M+1]+、820[M+Na]+であった。
【0034】
方法2:カップリング部位としてのプロリン及びグリシン
0.2mmolのBoc-Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z)OH(12)からBocを除去し、その後の合成工程は、方法1と同様に行った。収率は29%であり、その他の物理的データは方法1で得られたものと同様であった。
【0035】
6.化合物(P6A、GP6A、KP6A、QP6A、シクロP6A、シクロGP6A、及びKP6A)の調製:
H-Ala-Arg-Pro-Ala-LysOH (20) (P6A)
H-Gly-Arg-Pro-Ala-LysOH (21) (GP6A)
H-Lys-Arg-Pro-Ala-LysOH (22) (KP6A)
H-Gln-Arg-Pro-Ala-LysOH (23) (QP6A)
Cyclo(Ala-Arg-Pro-Ala-Lys) (24) (シクロP6A)
Cyclo(Gly-Arg-Pro-Ala-Lys) (25) (シクロGP6A)
Cyclo(Lys-Arg-Pro-Ala-Lys) (26) (シクロKP6A)
化合物1、2、3、4、17、18又は19を、それぞれ反応容器に入れ、1mlのチオールエーテル、1mlのチオアニソール、及び1mlのアニソールと混合した。混合物を液体N2によって冷却し、液体無水HF(2ml)を添加して、0℃で60分間攪拌した。次いで、混合物を真空乾燥させ、エチルエーテルを添加することにより、粗生成物を沈殿させた。溶離液として水を用いて、セファデックス(Sephadex)G10において沈殿を脱塩し、ニンヒドリン反応によって回収した。回収物を凍結乾燥し、白色粉末を得た。関連するデータは以下の通りであった:
【0036】
化合物(20)、収率80%、mp 168−170℃
[α]D 20−44(C2、H2O)、FAB−MS(m/e) 542[M+1]+;
化合物(21)、収率78%、mp 168−171℃
[α]D 20−81(C1、H2O)、FAB−MS(m/e) 528[M+1]+;
化合物(22)、収率82%、mp 138−140℃
[α]D 20−65(C1、H2O)、FAB−MS(m/e) 597[M+1]+;
化合物(23)、収率80%、mp 180−182℃
[α]D 20−65(C1、H2O)、FAB−MS(m/e) 599[M+1]+;
化合物(24)、収率53%、mp 196−200℃
[α]D 20−64(C0.5、H2O)、ESI−MS(m/e) 524[M+1]+;
化合物(25)、収率64%、mp 138−140℃
[α]D 20−67(C0.5、H2O)、TOF−MS(m/e) 510[M+1]+;
化合物(26)、収率60%、mp 170−174℃
[α]D 20−61(C0.5、H2O)、TOF−MS(m/e) 581[M+1]+
【0037】
B.血栓溶解効果
血栓溶解ラットモデルによって、血栓溶解効果を評価した。以下に説明するように、8つの化合物の中で、GP6A及び環状GP6Aは、その他のものよりはるかに高い血栓溶解効果を有する。
【0038】
1.血栓調製
0.1mlのウィスター(Wistar)・ラットの血液を、ガラス管(長さ15mm;外径5.0mm;内径2.5mm)に入れ、垂直に固定し、ラバーストッパーによって底部を密閉した。ステンレススチールボルト(ボルト径0.2mm、長さ12mm)を素早く挿入した。15分後、ボルトを含む決戦をガラス管から取り出し、正確に秤量した。
【0039】
2.様々なペプチドの血栓溶解効果
重さ220g−280gの雄のウィスター・ラットをペントバルビタールナトリウム(80mg/kg、i.p.)によって麻痺させた。右総頸動脈と左外頸静脈を分離した。ボルトを含む血栓を、ポリエチレン管に入れ、一端を左外頸静脈に挿入した。50IU/kgのヘパリンナトリウムを抗凝固剤として注射し、他方の管の端を右総頸動脈に挿入した。この時点で、血液は、ポリエチレン管を通って右総頸動脈から左外頸静脈へ流れた。次いで、通常の食塩溶液、UK、GP6A、P6A及びKP6Aを6分で注入した。1時間後にボルトを取り出して秤量した。データを表1及び表2に示す。ステューデントのt検定(student’s t test)を用いて、統計学的なデータ分析を行った。p<0.05を有意と判断した。
【0040】
【表1】
【0041】
【表2】
【0042】
表1及び2に示した結果から、6つの化合物の中で、KP6A以外の血栓溶解効果は、プラスの対照グループ、UKのものに近い。即ち、それらは、優れた血栓溶解効果を示す。同じ式を有する化合物では、特にGP6Aで、環状型の血栓溶解効果は、直鎖型のものより良好である。高濃度(>10μmol)のシクロGP6Aを使用する場合、血栓溶解効果は、UK(2000IU/Kg)よりさらに良好である。本発明のシクロペンタペプチドは、優れた血栓溶解効果を示し、それは、UKの血栓溶解効果より良好であることが示される。
【0043】
同時に、本発明者は、ペプチド6Aおよびそのアナログの構造を、直鎖型から環状型に変形させることにより、それらの半減期が延び、インビボでの薬効も同様に(in turn)延びることも見出した;この発見は、上記の血栓溶解実験によるものである。従って、本発明の環状ペプチドは、従来技術の欠点、例えば、ペプチド6Aがすぐに分解してしまうこと、を顕著に軽減し、かつ長期にわたり血栓溶解効果を有する薬剤として役立つ。更に、本発明の環状ペプチドは更に、冠状動脈血栓症、大脳動脈塞栓症、及び静脈炎のような、様々な塞栓症の治療に適用され得る。従来技術のペプチド6Aも血栓溶解効果を示し、かつ血圧を低下させるために役立ち、血管の直径を広げるのに対し、本発明の環状ペプチドは、高い安定性を有することにより、血管硬化、心臓病、心筋梗塞、脳卒中、及び高血圧の治療に更に高い効果を示す。
【0044】
本発明を、その好ましい態様に関連して説明したが、請求項に記載した本発明の範囲を逸脱することなく、他の多くの考えられ得る修正及び変更が行われ得ることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図1】 P6A及びP6Aアナログの合成経路を示す。
【図2】 化合物(5−8)の合成経路を示す。
Claims (8)
- 式(I):
シクロ(Xaa−Arg−Pro−Ala−Lys)
(I)
(式中、Xaaは、Ala、Gly、又はLysである)で表され、バックボーンでのアミド結合により環状化されている環状ペプチドまたはその薬学的に許容され得る塩類を有効成分とする血栓溶解剤。 - 前記環状ペプチドが、固相合成によって調製される、請求項1に記載の血栓溶解剤。
- 前記環状ペプチドが、溶液合成によって調製される、請求項1に記載の血栓溶解剤。
- 前記環状ペプチド及びその薬学的に許容され得る塩類が、血栓溶解剤として使用される、
請求項1に記載の血栓溶解剤。 - 式(I):
シクロ(Xaa−Arg−Pro−Ala−Lys)
(I)
(式中、Xaaは、Ala、Gly、又はLysである)で表され、バックボーンでのアミド結合により環状化されている環状ペプチドまたはその薬学的に許容され得る塩類を有効成分とする血管拡張剤。 - 前記環状ペプチドが、固相合成によって調製される、請求項5に記載の血管拡張剤。
- 前記環状ペプチドが、溶液合成によって調製される、請求項5に記載の血管拡張剤。
- 前記環状ペプチド及びその薬学的に許容され得る塩類が、血管拡張剤として使用される、
請求項5に記載の血管拡張剤。
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