FR2838443A1

FR2838443A1 - Pentapeptides cycliques et leur preparation

Info

Publication number: FR2838443A1
Application number: FR0350085A
Authority: FR
Inventors: Shigi Peng; Ming Zhao; Chao Wang; Lin Na
Original assignee: Purzer Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Purzer Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2002-04-03
Filing date: 2003-04-02
Publication date: 2003-10-17
Anticipated expiration: 2023-04-02
Also published as: JP4031994B2; GB0307028D0; DE10315030A1; DE10315030B4; GB2387386B; FR2838443B1; US20030191278A1; JP2003300997A; GB2387386A; US7053047B2; TWI234460B

Abstract

L'invention a trait à des peptides cycliques de formule (I) suivante cyclo (Xaa-Arg-Pro-Ala-Lys) dans laquelle Xaa représente Ala, Gly, Glu, Gln, Asp, Asn, Arg ou Lys. Ces peptides cycliques ont un effet thrombolytique. Cette invention a également trait à des procédés de préparation de peptides cycliques.

Description

PENTAPEPTIDES CYCLIQUES ET LEUR PREPARATION Arrière-plan de l'invention 1. Domaine de l'invention
La présente invention a trait à un nouveau peptide cyclique et à sa préparation.

2. Description de l'état de la technique
Le peptide 6A est un produit de dégradation d'un analogue de la chaîner du fibrinogène qui est connu pour augmenter le flux sanguin dans l'artère coronaire et l'artère fémorale. En 1978 (1), le peptide 6A a été, pour la première fois, isolé et purifié à partir de la chaîner du fibrinogène humain par Belew et al. (2). Il a été confirmé que la composition du peptide 6A est Ala-Arg-Pro-Ala-Lys. Ce peptide augmente le flux sanguin dans l'artère coronaire et l'artère fémorale chez le chien.

En 1997, les inventeurs ont préparé le peptide 6A et ses analogues au moyen d'un procédé en solution et ils ont observé que ces peptides possèdent une bonne aptitude à décontracter les petits vaisseaux, à abaisser la pression artérielle et un bon effet anti-thrombose. Les techniques de synthèse et les fonctions de ces composées sont décrites dans le brevet CN n 1146458. Cependant, en 1990, les inventeurs ont observé que le peptide 6A n'avait aucune action bénéfique sur les paramètres de la thrombolyse lorsqu'il était injecté par voie intraveineuse (i.v.) conjointement avec un activateur tissulaire du plasminogène chez des chiens souffrant de thrombose coronaire. Les résultats indiquaient que le peptide 6A pourrait être rapidement dégradé par une enzyme de conversion de l'angiotensine (ACE) dans le poumon au cours de

l'administration par voie intraveineuse étant donné que le peptide 6A est le substrat de cette enzyme. De plus, le peptide 6A et ses analogues, qui ont été synthétisés par les inventeurs en 1997, ont montré une excellente activité anti-thrombose mais leur demi-vie in vivo s'est avérée assez courte et, par conséquent, ils se sont révélés incapables de présenter un effet à long terme.

Afin de résoudre les problèmes décrits ci-dessus, les inventeurs ont tenu compte du fait qu'un peptide cyclique présente habituellement la caractéristique d'avoir des conformations limitées, ce qui lui confère une bonne stabilité vis-à-vis de la peptidase. Les inventeurs ont donc tenté de synthétiser le peptide 6A et ses analogues sous des formes cycliques afin d'éviter la dégradation provoquée par ACE ; également pour que les composés cycliques ne perdent pas leurs effets thrombolytiques. Actuellement, il est nécessaire de trouver un nouveau composé cyclique ainsi qu'une nouvelle technique permettant de convertir le peptide 6A linéaire et ses analogues en formes cycliques.

Résumé de l'invention
Un des buts de la présente invention est de fournir de nouveaux peptides cycliques possédant un effet thrombolytique à long terme.

Un autre but de la présente invention est de fournir un procédé permettant de préparer les nouveaux peptides cycliques décrits ci-dessus.

Selon la présente invention, on fournit un nouveau peptide cyclique de formule (I) suivante :

cyclo(Xaa-Arg-Pro-Ala-Lys) (I) dans laquelle Xaa représente Ala, Gly, Glu, Gln, Asp, Asn, Arg ou Lys.

Le peptide cyclique de formule (I) peut être synthétisé au moyen du procédé 1 ou du procédé 2 suivant.

Procédé 1 :
Tout d'abord, on fournit au moins un peptide possédant un groupe protecteur N-terminal, dans lequel ledit peptide est choisi dans le groupe formé par : B-Xaa-Arg(T)-Pro-Ala-Lys(Z')-OH, B-Arg(T)-Pro-Ala-Lys(Z')-Xaa-OH, B-Pro-Ala-Lys(Z')-Xaa-Arg(T)-OH, B-Ala-Lys(Z')-Xaa-Arg(T)-Pro-OH, et B-Lys(Z')-Xaa-Arg(T)-Pro-Ala-OH ; dans lesquels Xaa représente Ala, Gly, Glu, Gln, Asp, Asn, Arg ou Lys ; B est le groupe protecteur N-terminal de la chaîne peptidique ; Z' est le groupe protecteur de la chaîne latérale du résidu Lys ; et T est le groupe protecteur de la chaîne latérale du résidu Arg.

Ensuite, on ajoute du p-nitrophénol, un solvant organique approprié et un agent de couplage, pour activer le groupe C-terminal dudit peptide et pour former un premier intermédiaire.

Puis on élimine le groupe protecteur N-terminal du premier intermédiaire pour former un deuxième intermédiaire.

On dissout le deuxième intermédiaire dans un solvant organique approprié et on le soumet à une réaction de cycloaddition pour former un troisième intermédiaire.

Enfin, on élimine les groupes protecteurs de la chaîne latérale des résidus Lys et Arg sur le troisième intermédiaire pour former le produit final.

Procédé 2 :
Tout d'abord, on fournit un peptide possédant un groupe protecteur N-terminal, dans lequel ledit peptide est choisi dans le groupe formé par : B-Xaa-Arg(T)-Pro-Ala-Lys(Z')-OH, B-Arg(T)-Pro-Ala-Lys(Z')-Xaa-OH, B-Pro-Ala-Lys(Z')-Xaa-Arg(T)-OH, B-Ala-Lys(Z')-Xaa-Arg(T)-Pro-OH, et B-Lys(Z')-Xaa-Arg(T)-Pro-Ala-OH ; dans lesquels Xaa représente Ala, Gly, Glu, Gln, Asp, Asn, Arg ou Lys ; B est le groupe protecteur N-terminal de la chaîne peptidique ; Z' est le groupe protecteur de la chaîne latérale du résidu Lys ; et T est le groupe protecteur de la chaîne latérale du résidu Arg.

On élimine le groupe protecteur N-terminal dudit peptide pour former un premier intermédiaire.

On dissout le premier intermédiaire dans un solvant organique approprié puis on ajoute un agent de couplage pour réaliser une réaction de couplage direct et fournir un deuxième intermédiaire.

Enfin, on élimine les groupes protecteurs présents sur la chaîne latérale des résidus Lys et Arg sur le deuxième intermédiaire, pour former le peptide cyclique de formule (I) .

Le peptide cyclique de formule (I) possède une activité thrombolytique, et ces peptides peuvent donc être utilisés en tant que médicament pour décontracter les vaisseaux sanguins, pour abaisser la pression artérielle et en tant qu'agent anti-thrombose, et ils peuvent en outre être mis en #uvre pour traiter la thrombose, l'hypertension et l'infarctus du myocarde.

Brève description des dessins
La figure 1 illustre la voie de synthèse de P6A et d'un analogue de P6A, dans laquelle AA représente les résidus L-Ala, Gly, L-Lys et L-Gln protégés correspondants.

La figure 2 illustre la voie de synthèse des composés (5 à 8), dans laquelle AA représente les résidus L-Ala, Gly, Lys et L-Gln protégés correspondants.

Description détaillée de l'invention
La présente invention fournit un procédé pour convertir le peptide 6A linéaire et ses analogues en structures cycliques présentant une mobilité de conformation de squelette limitée. Ainsi, la vitesse de dégradation du peptide cyclique de la présente invention baisse de façon spectaculaire et sa demi-vie in vivo est ainsi prolongée.

Dans la présente invention, le peptide 6A et ses analogues sont respectivement préparés par une synthèse en phase solide ou en solution. Le pentapeptide cyclique correspondant est également préparé par les mêmes procédés.

L'effet thrombolytique est évalué sur un modèle de thrombolyse murin.

La présente invention fournit un peptide cyclique de formule (I) suivante : cyclo(Xaa-Arg-Pro-Ala-Lys) (I) dans laquelle Xaa représente Ala, Gly, Glu, Gln, Asp, Asn, Arg ou Lys.

Le peptide cyclique de formule (I) peut être préparé par un procédé de synthèse en phase solide ou en phase liquide.

Les groupes pentapeptide linéaire suivants sont préparés par un procédé de synthèse en phase solide ou en solution classique, en utilisant, en tant que matière première, un acide aminé comprenant un groupe Lprotecteur :
B-Xaa-Arg(T)-Pro-Ala-Lys(Z')-OH,
B-Arg(T)-Pro-Ala-Lys(Z')-Xaa-OH,
B-Pro-Ala-Lys(Z')-Xaa-Arg(T)-OH,
B-Ala-Lys(Z')-Xaa-Arg(T)-Pro-OH,
B-Lys(Z')-Xaa-Arg(T)-Pro-Ala-OH ; dans lesquels Xaa représente Ala, Gly, Glu, Gln, Asp, Asn, Arg ou Lys ; B est le groupe protecteur N-terminal de la chaîne peptidique ; est le groupe protecteur de la chaîne latérale du résidu Lys ; et T est le groupe protecteur de la chaîne latérale du résidu Arg. Le groupe protecteur B décrit ci-dessus est un groupe protecteur N-terminal classique, et il est choisi, de préférence, dans le groupe formé par Boc, Fmoc, Z, Adoc, Bpoc, Trt et Nps ; moins un groupe protecteur Z' présent sur la chaîne latérale du résidu Lys est choisi dans le groupe formé par 4-C1Z, 2-

C1Z, 2,4-C12Z, 3,4-Cl2Z, 3-C1Z, 2,6C12Z, Boc, Tos et Cu ; et au moins un groupe protecteur T présent sur la chaîne latérale du résidu Arg est choisi dans le groupe formé par Tos, N02, Z, Z2, Mbs, Mts (2,4,6-triméthylbenzosulfidyle), Boc et Adoc.

Les pentapeptides linéaires décrits ci-dessus sont utilisés en tant que matière première pour réaliser la cyclisation. La présente invention divulgue, pour la première fois, deux procédés de cyclisation applicables aux pentapeptides linéaires décrits ci-dessus. Le premier procédé est appelé "procédé à l'ester de p-nitrophénol" et il utilise le p-nitrophénol en tant qu'activateur pour activer le groupe-COOH inerte sur la terminaison C de la chaîne peptidique. Un groupe -COONp labile est ainsi obtenu et la cyclisation intramoléculaire se produit ensuite naturellement. Le deuxième procédé est appelé "procédé de couplage direct" et utilise des agents de couplage pour réaliser la cyclisation dans des conditions appropriées.

Les détails de ces deux procédés sont décrits ci-dessous.

1. Procédé à l'ester de p-nitrophénol
On fournit des pentapeptides linéaires comprenant un groupe protecteur N-terminal tels que décrits ci-dessus. On ajoute du p-nitrophénol, des solvants organiques appropriés et un agent de couplage pour activer le groupe C-terminal des peptides et un premier intermédiaire se forme ; les solvants organiques ne sont pas limités, au moins l'un d'entre eux étant choisi, de préférence, dans le groupe formé par le THF, le dioxanne, le DMF, le DMSO, l'acétate d'éthyle, le dichlorométhane et le trichlorométhane ; les agents de couplage sont ceux classiquement utilisés dans la

synthèse des acides aminés, au moins l'un d'entre eux étant choisi, de préférence, dans le groupe formé par DCC, HOBt, HONb, HOSu et le p-nitrophénol. Un exemple du premier intermédiaire est Boc-Xaa-Arg(T)-Pro-Ala-Lys(Z')-ONp, et le reste peut être conçu par l'homme du métier.

On élimine ensuite le groupe protecteur N-terminal du premier intermédiaire en faisant réagir un agent déprotecteur avec le premier intermédiaire pour former un deuxième intermédiaire ; les choix des agents déprotecteurs dépendent des groupes protecteurs N-terminaux, d'après la technique antérieure, au moins l'un d'entre eux étant choisi, de préférence, dans le groupe formé par HCl/acétate d'éthyle, HCl/dichlorocyclohexane, l'acide trifluoroacétique, H2/Pd, C et la pyridine. Un exemple du deuxième intermédiaire est HC1-Xaa-Arg(T)-Pro-Ala-Lys(Z')- ONp, et le reste peut être conçu par l'homme du métier.

On dissout ensuite le deuxième intermédiaire dans des solvants organiques appropriés et il subit une cyclisation pour former un troisième intermédiaire ; les solvants organiques sont tels que décrits ci-dessus, et on réalise la cyclisation en ajoutant au moins un agent choisi dans le groupe formé par Na2C03, NaHC03, K2CO3, KHC03, TEA, NH3, NMM et N(C2H5)3 de sorte que la terminaison C et la terminaison N sur la chaîne peptidique réagissent l'une avec l'autre, les groupes 0, Np ou ONp partant alors naturellement, et forment un composé cyclique. Un exemple du troisième intermédiaire est cyclo(Xaa-Arg(T)-Pro-AlaLys (Z')). Il convient de noter que, depuis l'étape de départ jusqu'à la présente étape, toutes les chaînes latérales des résidus Arg et Lys de l'intermédiaire possèdent des groupes protecteurs.

Ainsi, on doit éliminer les groupes protecteurs présents sur la chaîne latérale des résidus Lys et Arg pour former le composé final. On réalise la réaction de déprotection en faisant réagir le troisième intermédiaire avec les deuxièmes agents déprotecteurs, les deuxièmes agents déprotecteurs étant choisis en fonction du groupe de déprotection souhaité, l'un d'entre eux étant choisi, de préférence, parmi l'acide fluorhydrique, l'acide trifluoroacétique, l'acide trifluorométhylsulfonique, H2/Pd et C. Un exemple de composé final est cyclo(Xaa-Arg-ProAla-Lys), et le reste peut être conçu par l'homme du métier.

2. Procédé de couplage direct :
On fournit un peptide linéaire possédant un groupe protecteur N-terminal tel que décrit ci-dessus. On élimine le groupe protecteur N-terminal en le faisant réagir avec un premier agent déprotecteur pour former un premier intermédiaire, le premier agent déprotecteur étant choisi en fonction du groupe protecteur N-terminal et, de préférence, choisi dans le groupe formé par HCl/acétate d'éthyle, HCl/dichlorocyclohexane, l'acide trifluoroacétique, H2/Pd, C et la pyridine. Un exemple du premier intermédiaire est HC1-Xaa-Arg(T)-Pro-Ala-Lys(Z')OH, et le reste peut être conçu par l'homme du métier.

On dissout ensuite le premier intermédiaire dans des solvants organiques appropriés et on ajoute des agents de couplage pour réaliser une réaction de couplage qui permet d'obtenir un deuxième intermédiaire ; les solvants organiques ne sont pas spécifiés, au moins l'un d'entre eux est, de préférence, choisi dans le groupe formé par le THF

anhydre, le dioxanne, le DMF, le DMSO, l'acétate d'éthyle et le dichlorométhane ; les agents de couplage sont ceux utilisés dans la synthèse classique des acides aminés, au moins l'un d'entre eux est choisi, de préférence, dans le groupe formé par DCC, HOBt, HONb, HOSu et le p-nitrophénol.

Le pH de la réaction varie, de préférence, de 6,0 à 8,0. La température de la réaction varie, de préférence, de 50 C à 90 C ; et le pH est ajusté à l'aide de bases, au moins l'une d'entre elles étant choisie, de préférence, dans le groupe formé par Na2CO3, NaHC03, K2CO3, TEA, NH3 et NMM. La cyclisation est terminée à cette étape, et un exemple d'un deuxième intermédiaire est cyclo(Xaa-Arg(T)-Pro-AlaLys (Z')), et le reste peut être conçu par l'homme du métier.

Comme décrit ci-dessus, il reste encore des groupes protecteurs liés aux chaînes latérales des résidus Arg et Lys des composés cycliques. Par conséquent, on doit éliminer les groupes protecteurs présents sur les résidus Arg et Lys du composé final et le procédé est tel que décrit ci-dessus. Un exemple d'un composé final est cyclo(Xaa-Arg-Pro-Ala-Lys), et le reste peut être conçu par l'homme du métier.

Description détaillée des formes de réalisation préférées Synthèse chimique Préparation des réactifs
On a acheté des acides aminés L-protégés, DCC et HOBt, chez Sigma Chemical Co. ; on a éliminé le Na du THF anhydre par distillation à des températures normales ; on a éliminé le chlorure de calcium du DMF sec et du dioxanne par distillation et on a traité ces derniers avec un tamis

moléculaire 4A ; on a préparé des peptides linéaires par un procédé en solution utilisant la chimie Boc. On a utilisé du DCC en tant qu'agent de couplage à la fois dans la synthèse des peptides linéaires et cycliques ; on a surveillé la réaction à l'aide de réactions à la ninhydrine et on a éliminé le groupe protecteur Boc avec HCl/EtOAc à 4 à 6 mol/L. On a réalisé une chromatographie sur gel de silice H Qingdao. On a déterminé les points de fusion à l'aide d'un appareil otage microscopique et on ne les a pas corrigés. On a obtenu des spectres de masse ESI sur un appareil ES-S989X-HO ; a déterminé la rotation optique sur un polarimètre Polartronic-D de Schmidt + Haensch Company.

1. Préparation des composés (1) à (4) suivants : Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z')OBzl (1) Boc-Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z')OBzl (2) Boc-Lys(Z')-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z')OBzl (3) Boc-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z')OBzl (4)
Protocole général de synthèse des composés (1) à (4) : en partant de lysine à protection Boc, en utilisant du DCC/HOBt en tant qu'agent de couplage, et en utilisant un procédé en solution pour allonger la chaîne peptidique. La voie de synthèse est schématisée sur le schéma 1, voir figure 1. En voici la description détaillée.

Tout d'abord, le groupe protecteur benzyle (Bzl) est lié à la terminaison C de la lysine à protection Boc. La réaction est la suivante :

Boc- Lys(Z')OCs+ Ph - CH2Br DMF Boc-Lys(Z')OBzl (ii)
On élimine ensuite le groupe protecteur Boc N-terminal puis on ajoute Boc-Ala et le DCC pour réaliser une polymérisation. La réaction est la suivante :

On répète les étapes (iii) et (iv) et on ajoute BocPro pour achever l'étape (v) et former des tripeptides. On prépare les composés (1) à (4) selon des schémas similaires.

Les données physiques des composés (1) à (4) sont énumérées ci-dessous : Composé (1), rendement 88%, point de fusion 84 C à 85 C [ ]D20-33(C2, CHC13), FAB-SM(m/e) 1020[M+1]+ (FAB = Fast Atomic Bombardment ; SM = Spectrométrie de masse) ; Composé (2), rendement 82%, point de fusion 76 C à 77 C [ ] D20-43(C2, CHC13), FAB-SM(m/e) 1211[M+1]+, 1028[M+Na]+ ; Composé (3), rendement 78%, point de fusion 72 C à 74 C [ ] D20-46(C2, CHC13), FAB-SM(m/e) 1211 [M+1]+ ; Composé (4), rendement 87%, point de fusion 83 C à 85 C [ ]D20-9(C0,3, CHC13), FAB-SM(m/e) 1077[M+1]+.

2. Préparation des composés (5) à (8) : Boc-Pro-Arg(Tos)-Ala-Lys(Z')-AlaOBzl (5) Boc-Pro-Arg(Tos)-Gly-Lys(Z')-AlaOBzl (6) Boc-Pro-Arg(Tos)-Lys(Z')-Lys(Z')-AlaOBzl (7) Boc-Pro-Arg(Tos)-Gln-Lys(Z')-AloOBzl (8)
Protocole général de synthèse des composés (5) à (8) : en partant d'alanine à protection Boc, en utilisant du DCC/HOBt en tant qu'agent de couplage, et en utilisant un procédé en solution pour allonger la chaîne peptidique. La voie de synthèse est schématisée sur le schéma 2, voir figure 2.

Les données physiques des composés (5) à (8) sont énumérées ci-dessous : Composé (5), rendement 68%, point de fusion 146 C à 148 C [ ]D20-22(C0,5, CHC13), TOF-SM (m/e) 1020[M+1]+ ; 1041 [M+Na]+ ; 1058 [M+K]+ (TOF = Time of Flight) ; Composé (6), rendement 72%, point de fusion 78 C à 80 C [ ]D20-22(Cl, CHC13), TOF-SM(m/e) 1006[M+1]+, 1028[M+Na]+ ; 1044[M+K]+ ; Composé (7), rendement 62%, point de fusion 80 C à 82 C [ ]D20-27(C0,5, CHC13), TOF-SM (m/e) 1211[M+1]+ ; 233[M+Na]+ ; 1249 [M+K]+ ; Composé (8), rendement 78%, point de fusion 90 C à 92 C [ ]D20-24(C0,2, CHC13), TOF-SM (m/e) 1077[M+1]+.

3. Préparation des composés (9) à (16) : Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z')OH (9) Boc-Pro-Arg(Tos)-Ala-Lys(Z')-AlaOH (10) Boc-Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z')OH (11) Boc-Pro-Arg(Tos)-Gly-Lys(Z')-AlaOH (12)

Boc-Lys(Z')-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z')OH (13) Boc-Pro-Arg(Tos)-Lys(Z')-AlaOH (14) Boc-Gln-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z')OH (15) Boc-Pro-Arg(Tos)-Gln-Lys(Z')-AlaOH (16)
On a refroidi une solution de méthanol de 0,2 mmole de composés (5,6,7,8) dans un bain d'eau glacée, on a ajouté goutte à goutte 2,0 mL de NaOH à 2 mol/L sous agitation. On a agité le mélange réactionnel pendant 30 minutes. Lorsqu'une chromatographie en couche mince (CCM) a indiqué que la réaction était terminée, on a neutralisé avec HC1 à 2 mol/L. Après avoir éliminé le méthanol, on a filtré le mélange et on a lavé le filtrat avec de l'eau plusieurs fois, puis on a placé le filtrat dans un séchoir pendant une nuit.

4. Préparation du cyclo[Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z')] (17) :
Procédé 1 : procédé à l'ester de p-nitrophénol
On a dissous 0,2 mmole de Boc-Ala-Arg(Tos)-Pro-AlaLys(Z')OH et 0,3 mmole de p-nitrophénol dans 5 mL de THF anhydre, on a refroidi dans un bain d'eau glacée, on a ajouté 0,3 mmole de DCC et on a agité pendant 3 heures, puis on a élevé la température du mélange réactionnel jusqu'à la température ambiante. Dix-huit heures plus tard, on a filtré le mélange et on a évaporé le solvant à siccité sous vide. On a trituré le résidu avec de l'éther éthylique et on a obtenu une poudre jaune de Boc-Ala-Arg(Tos)-ProAla-Lys(Z')ONp. Après avoir éliminé le Boc avec HCl/EtOAc 4 N, on a dissous le HCl-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z')ONp obtenu dans 12 mL de dioxanne, on a ajouté 2 mL de Na2C03 à 0,1 mol/L et 2 mL de NaHC03 à 0,1 mol/L et on a agité

pendant 2 heures. Après avoir éliminé le solvant, on a purifié le résidu par chromatographie pour obtenir le produit souhaité : 8 mg (5%), point de fusion de 118 C à 120 C, [ ]D20-21(C0,2, CHC13), TOF-SM(m/e) 812[M+1]+.

Procédé 2 : procédé de couplage direct
On a éliminé le Boc de 0,2mmole de Boc-Ala-Arg (Tos) Pro-Ala-Lys(Z')OH avec HCl/EtOAc 4 N et on a dissous le HCl-Ala-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z')OH obtenu dans 200 mL de DMF (10-3 M) sec, on a ajouté du NMM pour ajuster la solution à un pH de 7, on a ajouté 1 mmole de DCC et on a agité le mélange à 70 C pendant 3 jours. On a évaporé le solvant sous vide, on a purifié le résidu par chromatographie pour obtenir le produit souhaité : 29 mg (18%), les autres données physiques étaient identiques à celles du procédé 1.

Procédé 3 : proline et alanine en tant que sites de couplage
On a éliminé le Boc de 0,2mmole de Boc-Pro-Arg (Tos) Ala-Lys(Z')-AlaOH (10), puis on a dissous le Boc-ProArg(Tos)-Ala-Lys(Z')-AlaOH (10) dans 200 mL de DMF (10M), et on a suivi le même protocole que dans le procédé 2 pour obtenir le produit. Les données du produit étaient identiques à celles des procédés 1 et 2 mis à part que le rendement était de 9%.

5. Préparation du cyclo[Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z')] (18) :
Procédé 1 : procédé de couplage direct

On a éliminé le Boc de 0,2 mmole de Boc-Gly-Arg (Tos) Pro-Ala-Lys(Z')OH avec HCl/EtOAc 4 N. On a dissous le HC1Gly-Arg(Tos)-Pro-Ala-Lys(Z')OH obtenu dans 200 mL de DMF (10-3 M) sec, et on a suivi le même protocole que dans le procédé 2 de préparation du cyclo[Ala-Arg(Tos)-Pro-AlaLys(Z')] (17). Le rendement du produit souhaité était de 31%, point de fusion de 102 C à 104 C, [ ]D20-30(C1, CHC13), ESI-SM(m/e) 798[M+1]+, 820[M+Na]+ (ESI Electrospray ionization).

Procédé 2 : proline et glycine en tant que sites de couplage
On a éliminé le Boc de 0,2 mmole de Boc-Gly-Arg(Tos)Pro-Ala-Lys(Z')OH (12) et on a suivi le même protocole de synthèse que dans le procédé 1. Le rendement était de 29% et les autres données physiques étaient identiques à celles obtenues dans le procédé 1.

6. Préparation de composés (P6A, GP6A, KP6A, QP6A, cyclo-
P6A, cyclo-GP6A et cyclo-KP6A) : H-Ala-Arg-Pro-Ala-LysOH (20) (P6A) H-Gly-Arg-Pro-Ala-LysOH (21) (GP6A) H-Lys-Arg-Pro-Ala-LysOH (22) (KP6A) H-Gln-Arg-Pro-Ala-LysOH (23) (QP6A) cyclo(Ala-Arg-Pro-Ala-Lys) (24) (cyclo-P6A) cyclo(Gly-Arg-Pro-Ala-Lys) (25) (cyclo-GP6A) cyclo(Lys-Arg-Pro-Ala-Lys) (26) (cyclo-KP6A)
On a placé chacun des composés 1,2, 3,4, 17,18, et 19 dans le réacteur et on les a respectivement mélangés avec 1 mL de thioéther, 1 mL de thioanisole et 1 mL d'anisole. On a refroidi le mélange avec du N2 liquide, on

a ajouté 2 mL de HF anhydre liquide et on a agité à 0 C pendant 60 minutes. On a ensuite séché le mélange sous vide et on a précipité le produit brut en ajoutant de l'éther éthylique. On a dessalé le précipité sur Sephadex G 10 en utilisant de l'eau en tant qu'éluant et on l'a recueilli au moyen d'une réaction à la ninhydrine. On a lyophilisé le produit recueilli et on a obtenu une poudre blanche. Les données la concernant étaient les suivantes : Composé (20), rendement 80%, point de fusion 168 C à 170 C [ ]D20-44(C2, H20) , FAB-SM (m/e) 542[M+1]+ ; Composé (21), rendement 78%, point de fusion 168 C à 171 C [ ]D20-81(C1, H20), FAB-SM (m/e) 528[M+1]+ ; Composé (22), rendement 82%, point de fusion 138 C à 140 C [ ]D20-65(C1, H20), FAB-SM(m/e) 597[M+1]+ ; Composé (23), rendement 80%, point de fusion 180 C à 182 C [ ]D20-65(C1, H20), FAB-SM (m/e) 599[M+1]+ ; Composé (24), rendement 53%, point de fusion 196 C à 200 C [ ]D20-64(C0,5, H20), ESI-SM (m/e) 524[M+1]+ ; Composé (25), rendement 64%, point de fusion 138 C à 140 C [ ]D20-67(C0,5, H20) , TOF-SM (m/e) 510[M+1]+ ; Composé (26), rendement 60%, point de fusion 170 C à 174 C [ ]D20-61(C0,5, H20) , TOF-SM (m/e) 581[M+l ]+.

B. Effet thrombolytique
On a évalué l'effet thrombolytique en utilisant un modèle de thrombolyse murin. Parmi les 8 composés, selon la description suivante, les composés GP6A et GP6A cycliques ont un effet thrombolytique beaucoup plus important que les autres.

1. Préparation du thrombus
On a versé 0,1mL de sang de rat Wistar dans un tube en verre (longueur : 15 mm ; diamètre externe : 5,0 mm ; diamètre interne : 2,5 mm) que l'on a fixé verticalement et dont on a scellé le fond avec un bouchon de caoutchouc. On a rapidement inséré une cheville en acier inoxydable, le diamètre de la cheville était de 0,2 mm et sa longueur de 12 mm. Quinze minutes plus tard, on a retiré du tube en verre le thrombus contenant la cheville et on l'a pesé avec précision.

2. Effet thrombolytique de divers peptides
On a anesthésié des rats Wistar mâles pesant 220 g à 280 g avec du pentobarbital sodique (80 mg/kg, i.p.). On a séparé l'artère carotide commune droite et la veine jugulaire externe gauche. On a placé le thrombus contenant la cheville dans un tube en polyéthylène et on a inséré une extrémité dans la veine jugulaire externe gauche. On a injecté 50 UI/kg d'héparine sodique en tant qu'anticoagulant et on a inséré l'autre extrémité du tube dans l'artère carotide commune droite. A ce moment, le sang a coulé de l'artère carotide commune droite à la veine jugulaire externe gauche par l'intermédiaire du tube en polyéthylène. En suite, on a injecté du sérum physiologique normal, UK, GP6A, P6A et KP6A en 6 minutes. On a retiré la cheville et on l'a pesée après 1 heure. Les données sont énumérées dans le tableau 1 et le tableau 2, on a réalisé une analyse de données statistiques en utilisant le test de Student, une valeur p < 0,05 étant considérée significative.

Tableau1
<tb> Réduction <SEP> de <SEP> thrombus <SEP> avec <SEP> NS, <SEP> UK, <SEP> GP6A <SEP> et <SEP> cyclo-GP6A
<tb> Groupe <SEP> Dosage <SEP> m/mg
<tb> =~~~~ ~* <SEP> NS <SEP> 3 <SEP> mL/kg <SEP> 0,76 <SEP> 7,40
<tb> UK <SEP> 20 <SEP> 000 <SEP> UI/kg <SEP> 12,81 <SEP> 5,15a
<tb> GP6A <SEP> 5 <SEP> pmol/kg <SEP> 9,31 <SEP> 3,94a
<tb> GP6A <SEP> 10 <SEP> umol/kg <SEP> 13,17 <SEP> 4,13a
<tb> GP6A <SEP> 20 <SEP> umol/kg <SEP> 16,81 <SEP> ~5, <SEP> 44a,b
<tb> cyclo-GP6A <SEP> 5 <SEP> umol/kg <SEP> 8,35 <SEP> 2,76a
<tb> cyclo-GP6A <SEP> 10 <SEP> umol/kg <SEP> 17,31 <SEP> 4,29a
<tb> cyclo-GP6A <SEP> 20 <SEP> umol/kg <SEP> 18,38 <SEP> ~2,08a,b,c
<tb>
m = réduction de la masse du thrombus ; NS = sérum physiologique normal ; UK = urokinase ; n = 8 ; a) comparé à NS : p < 0,05 ; b) comparé à UK : p < 0,05 ; c) comparé à 5 umol/kg de GP6A : p < 0,05.

Tableau <SEP> 2
<tb> Réduction <SEP> de <SEP> thrombus <SEP> avec <SEP> NS, <SEP> UK, <SEP> P6A, <SEP> cyclo-P6A, <SEP> KP6A
<tb> et <SEP> cyclo-KP6A
<tb> Groupe <SEP> Dosage <SEP> m/mg
<tb> NS <SEP> 3 <SEP> mL/kg <SEP> 0,76 <SEP> 7,40
<tb> UK <SEP> 20 <SEP> 000 <SEP> UI/kg <SEP> 12,81 <SEP> 5,15a
<tb> P6A <SEP> 5 <SEP> pmol/kg <SEP> 6,07 <SEP> 2,14a
<tb> cyclo-P6A <SEP> 5 <SEP> pmol/kg <SEP> 10,62 <SEP> 3,15a
<tb> KP6A <SEP> 5 <SEP> pmol/kg <SEP> 0,28 <SEP> 2,13
<tb> cyclo-KP6A <SEP> 5 <SEP> pmol/kg <SEP> 6,13 <SEP> 2,31a
<tb>
NS = sérum physiologique normal ; UK = urokinase ; n = 8 ; a) comparé à NS : p < 0,05 ; b) comparé à UK : p < 0,05.

A partir des résultats présentés dans les tableaux 1 et 2, l'effet thrombolytique des 6 composés, sauf KP6A, est proche de celui du groupe témoin positif, UK, à savoir ils possèdent un excellent effet thrombolytique. Quant aux composés de formule identique, l'effet thrombolytique des formes cycliques est meilleur que celui des formes linéaires, en particulier pour GP6A. Si l'on utilise une concentration élevée de cyclo-GP6A (>10 umoles), l'effet thrombolytique est encore meilleur que pour UK (2 000 UI/kg). Ceci montre que les pentapeptides cycliques de la présente invention présentent réellement un excellent

effet thrombolytique qui est meilleur que l'effet thrombolytique de UK.

En même temps, les inventeurs ont également découvert que le fait de transformer la structure du peptide 6A et de ses analogues d'une forme linéaire en formes cycliques augmente réellement leur demi-vie, ce qui prolonge à son tour l'effet pharmaceutique in vivo ; cette découverte est en corrélation avec les expérimentations thrombolytiques décrites ci-dessus. Ainsi, les peptides cycliques de la présente invention atténuent de façon significative l'inconvénient de la technique antérieure, à savoir la dégradation rapide du peptide 6A, et servent de médicament à effet thrombolytique à long terme. En outre, on peut mettre en #uvre les peptides cycliques de l'invention également pour traiter de nombreuses maladies emboliques, telles la thrombose coronaire, l'embolie artérielle cérébrale et la phlébite. Le peptide 6A de la technique antérieure présente déjà cet effet thrombolytique et sert à réduire la pression artérielle, à élargir le diamètre des vaisseaux sanguins, tandis que la grande stabilité du peptide cyclique de la présente invention lui confère une aptitude encore meilleure à traiter l'artériosclérose, les cardiopathies, l'infarctus du myocarde, les attaques et l'hypertension.

Bien que la présente invention ait été expliquée par rapport à ses formes de réalisation préférées, il convient de comprendre que beaucoup d'autres modifications et changements possibles peuvent être apportés sans s'écarter de la portée de l'invention telle que revendiquée ci-après.

Claims

REVENDICATIONS

1. Peptide cyclique de formule (I) : cyclo(Xaa-Arg-Pro-Ala-Lys) (I) dans laquelle Xaa représente Ala, Gly, Glu, Gln, Asp, Asn, Arg ou Lys.

2. Peptide cyclique selon la revendication 1, dans lequel ledit peptide cyclique est préparé par une synthèse en phase solide.

3. Peptide cyclique selon la revendication 1, dans lequel ledit peptide cyclique est préparé par une synthèse en solution.

4. Peptide cyclique selon la revendication 1, dans lequel ledit peptide cyclique et ses sels acceptables sur le plan pharmaceutique présentent une fonction thrombolytique.

5. Peptide cyclique selon la revendication 1, dans lequel ledit peptide cyclique et ses sels acceptables sur le plan pharmaceutique sont utilisés en tant que médicaments thrombolytiques.

6. Peptide cyclique selon la revendication 1, dans lequel ledit peptide cyclique et ses sels acceptables sur

le plan pharmaceutique sont utilisés en tant que vasodilatateurs.

7. Procédé pour préparer des peptides cycliques de formule (I) : cyclo(Xaa-Arg-Pro-Ala-Lys) (I) dans laquelle Xaa représente Ala, Gly, Glu, Gln, Asp, Asn, Arg ou Lys, comprenant les étapes suivantes : (A) fournir un peptide possédant des groupes protecteurs

N-terminaux, au moins un peptide étant choisi dans le groupe formé par B-Xaa-Arg(T)-Pro-Ala-Lys(Z')-OH,

B-Arg(T)-Pro-Ala-Lys(Z')-Xaa-OH,

B-Pro-Ala-Lys(Z')-Xaa-Arg(T)-OH,

B-Ala-Lys(Z')-Xaa-Arg(T)-Pro-OH,

B-Lys(Z')-Xaa-Arg(T)-Pro-Ala-OH ; dans lesquels Xaa représente Ala, Gly, Glu, Gln, Asp,

Asn, Arg ou Lys ; B est le groupe protecteur N- terminal de la chaîne peptidique ; est le groupe protecteur de la chaîne latérale du résidu Lys ; et T est le groupe protecteur de la chaîne latérale du résidu Arg ; (B) ajouter du p-nitrophénol, des solvants organiques et des agents de couplage pour activer le groupe C- terminal dudit peptide et pour former un premier intermédiaire ; (C) déprotéger le groupe N-terminal dudit premier intermédiaire pour former un deuxième intermédiaire ;

(D) dissoudre ledit deuxième intermédiaire dans des solvants organiques pour réaliser la cyclisation intramoléculaire dudit deuxième intermédiaire et former un troisième intermédiaire ; et (E) éliminer les groupes protecteurs présents sur la chaîne latérale des résidus Lys et Arg pour former un composé final.

8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel au moins un groupe protecteur B de l'étape (A) est choisi dans le groupe formé par Boc, Fmoc, Z, Adoc, Bpoc, Trt et Nps ; au moins un groupe protecteur Z' présent sur la chaîne latérale des résidus Lys est choisi dans le groupe formé par 4-C1Z, 2-C1Z, 2,4-C12Z, 3,4-C12Z, 3-C1Z, 2,6C12Z, Boc, Tos et Cu ; au moins un groupe protecteur T présent sur la chaîne latérale du résidu Arg est choisi dans le groupe formé par Tos, N02, Z, Z2, Mbs, Mts, Boc et Adoc.

9. Procédé selon la revendication 7, dans lequel au moins un solvant organique utilisé dans l'étape (B) et dans l'étape (D) est choisi dans le groupe formé par le THF, le dioxanne, le DMF, le DMSO, l'acétate d'éthyle, le dichlorométhane et le trichlorométhane.

10. Procédé selon la revendication 7, dans lequel au moins un des agents de couplage utilisés dans l'étape (B) est choisi dans le groupe formé par le DCC, le HOBt, le HONb et le HOSu.

11. Procédé selon la revendication 7, dans lequel ladite réaction de déprotection de l'étape (C) est réalisée

en faisant réagir ledit premier intermédiaire avec les premiers agents de couplage, dans lequel au moins un premier agent de couplage est choisi dans le groupe formé par HCl/acétate d'éthyle, HCl/dichlorohexane, l'acide trifluoroacétique, H2/Pd, C et la pyridine.

12. Procédé selon la revendication 7, dans lequel ladite réaction de cyclisation de l'étape (D) est réalisée en ajoutant au moins un composé choisi dans le groupe formé par Na2C03, NaHC03, K2CO3, KHCO3, TEA, NH3 et NMM.

13. Procédé selon la revendication 7, dans lequel ladite réaction de déprotection de l'étape (E) est réalisée en faisant réagir ledit troisième intermédiaire avec un deuxième agent déprotecteur, dans lequel au moins un desdits deuxième agents déprotecteurs est choisi dans le groupe formé par l'acide fluorhydrique, l'ester trifluorométhylsulfosilique-acide trifluoroacétique, H2/Pd et C.

14. Procédé selon la revendication 7, dans lequel lesdits peptides cycliques et leurs sels acceptables sur le plan pharmaceutique présentent une fonction thrombolytique.

15. Procédé selon la revendication 7, dans lequel lesdits peptides cycliques et leurs sels acceptables sur le plan pharmaceutique sont utilisés en tant que médicaments thrombolytiques.

16. Procédé selon la revendication 7, dans lequel lesdits peptides cycliques et leurs sels acceptables sur le

plan pharmaceutique sont utilisés en tant que vasodilatateurs.

17. Procédé pour préparer des peptides cycliques de formule (I) : cyclo(Xaa-Arg-Pro-Ala-Lys) (I) dans laquelle Xaa représente Ala, Gly, Glu, Gln, Asp, Asn, Arg ou Lys, comprenant les étapes suivantes : (A) fournir au moins un peptide possédant des groupes protecteurs N-terminaux, au moins un peptide étant choisi dans le groupe formé par

B-Xaa-Arg(T)-Pro-Ala-Lys(Z')-OH,

B-Arg(T)-Pro-Ala-Lys(Z')-Xaa-OH,

B-Pro-Ala-Lys(Z')-Xaa-Arg(T)-OH,

B-Ala-Lys(Z')-Xaa-Arg(T)-Pro-OH,

Asn, Arg ou Lys ; B est le groupe protecteur N- terminal de la chaîne peptidique ; est le groupe protecteur de la chaîne latérale du résidu Lys ; et T est le groupe protecteur de la chaîne latérale du résidu Arg ; (B) éliminer le groupe protecteur N-terminal dudit peptide pour former un premier intermédiaire ; (C) dissoudre ledit premier intermédiaire dans des solvants organiques puis ajouter des agents de couplage pour réaliser des réactions de couplage direct, ce qui fournit un deuxième intermédiaire ; et

(D) éliminer les groupes protecteurs présents sur la chaîne latérale des résidus Lys et Arg pour former un composé final.

18. Procédé selon la revendication 17, dans lequel au moins un groupe protecteur B de l'étape (A) est choisi dans le groupe formé par Boc, Fmoc, Z, Adoc, Bpoc, Trt et Nps ; au moins un groupe protecteur Z' présent sur la chaîne latérale des résidus Lys est choisi dans le groupe formé par 4-C1Z, 2-C1Z, 2,4-C12Z, 3,4-C12Z, 3-C1Z, 2,6C12Z, Boc, Tos et Cu ; au moins un groupe protecteur T présent sur la chaîne latérale du résidu Arg est choisi dans le groupe formé par Tos, N02, Z, Z2, Mbs, Mts, Boc et Adoc.

19. Procédé selon la revendication 17, dans lequel ladite réaction de déprotection de l'étape (B) est réalisée en faisant réagir ledit premier intermédiaire avec les premiers agents de couplage, dans lequel au moins un premier agent de couplage est choisi dans le groupe formé par HCl/acétate d'éthyle, HCl/dichlorohexane, l'acide trifluoroacétique, H2/Pd, C et la pyridine.

20. Procédé selon la revendication 17, dans lequel au moins un solvant organique utilisé dans l'étape (C) est choisi dans le groupe formé par le THF, le dioxanne, le DMF, le DMSO, l'acétate d'éthyle, le dichlorométhane et le trichlorométhane ; et dans lequel au moins un desdits agents de couplages utilisés est choisi dans le groupe formé par le DCC, le HOBt, le HONb et le HOSu.

21. Procédé selon la revendication 17, dans lequel ladite réaction de couplage direct est réalisée à un pH compris entre 6,0 et 8,0 et à une température allant de 50 C à 90 C.

22. Procédé selon la revendication 21, dans lequel ledit pH est ajusté à l'aide de bases, dans lequel au moins une base est choisie dans le groupe formé par Na2C03, NaHC03, K2CO3, KHC03, TEA, NH3 et NMM.

23. Procédé selon la revendication 17, dans lequel ladite réaction de déprotection de l'étape (D) est réalisée en faisant réagir ledit deuxième intermédiaire avec un deuxième agent déprotecteur, dans lequel au moins un desdits agents déprotecteurs est choisi dans le groupe formé par l'acide fluorhydrique, l'ester trifluorométhylsulfosilique-acide trifluoroacétique, H2/Pd et C.

24. Procédé selon la revendication 17, dans lequel lesdits peptides cycliques et leurs sels acceptables sur le plan pharmaceutiques présentent une fonction thrombolytique.

25. Procédé selon la revendication 17, dans lequel lesdits peptides cycliques et leurs sels acceptables sur le plan pharmaceutique sont utilisés en tant que médicaments thrombolytiques.

26. Procédé selon la revendication 17, dans lequel lesdits peptides cycliques et leurs sels acceptables sur le

plan pharmaceutique sont utilisés en tant que vasodilatateurs.