JP4026686B2

JP4026686B2 - 薄組織断面の免疫標識化装置および方法

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Publication number: JP4026686B2
Application number: JP2004043036A
Authority: JP
Inventors: プランクハインツ
Original assignee: ライカミクロジュステーメゲーエムベーハー
Priority date: 2003-02-28
Filing date: 2004-02-19
Publication date: 2007-12-26
Anticipated expiration: 2024-02-19
Also published as: US20040171141A1; US7410055B2; DE10309210A1; DE10309210B4; JP2004264301A

Description

本発明は薄組織断面の免疫標識化用スライドの搬送容器に関する。

組織や細胞のような生物試料の構造を電子顕微鏡や高解像度光学顕微鏡法を用いて調べるためには、超薄断面（僅か数ｎｍの厚さの）を作成し、金属、好ましくはニッケル製の試料キャリアグリッド（以降、金属グリッドと称す）に適用する。顕微鏡検査については、断面には明暗をつけるか、または特別の細胞化学法を用いて試料の個々の構成要素を標識化する。

抗原／抗体対に関る数多くの方法が従来技術においては知られている。免疫組織化学および免疫細胞化学（以降、免疫標識化技術と称す）と呼ばれているものである。例えば、特許文献１には、造粒ゲル物質に液体試料からの抗原を吸収する方法が開示されている。ゲルペレットは、拡散バリアに囲まれており、スタンプアウトゲルマトリックスへブロックとして統合されて、後に組織試料と全く同様に免疫標識化技術が施される。特許文献２には、免疫金染色法を用いて配位子を標識化するためにコロイド金粒子を用いることが記載されている。試料中の抗原の定量および定性評価を可能とする大きく改善された方法が特許文献３にサンドイッチ検定法の形態で開示されている。ここで、抗原を結合する第１の抗体は、第１の抗体を結合する金標識化された第２の抗体で標識化されている。電子顕微鏡評価法を用いて、金粒子の量に基づいて試料に付随する抗原を定性および定量評価することができる。

薄組織断面の免疫標識化用の多くの免疫組織化学および免疫細胞化学プロトコルに共通の特徴は、１０〜２０の個々のプロセス工程を通常は含んでいるということである。これらプロセス工程の大半に、検査中の試料をバッファ溶液または標識化溶液で洗浄する操作が含まれている。

現在、これらの洗浄操作は煩雑なプロセスで手動で行われており、水性バッファ溶液または標識化溶液の個々の液滴がピペットにより疎水性基質（例えば、パラフィルム（Ｐａｒａｆｉｌｍ）（登録商標）、パルロジオン（Ｐａｒｌｏｄｉｏｎ）（登録商標）、コロイジオン（Ｃｏｌｌｏｉｄｉｏｎ）またはフォルムファン（Ｆｏｒｍｆａｎ）（登録商標））に適用される。処理液と反応させるために、薄組織断面の金属グリッドを別個に載せる。金属グリッドが軽量であることと液滴の表面張力のために、金属グリッドは液的表面に浮く。この工程の特定の滞留時間（５〜１０分であることが多い）の後、金属グリッドを次の液滴のためにピンセットで移動させる。標準プロトコルの最後の位置までこの操作を続ける。各免疫標識化反応について数時間という長い時間、技術者は拘束される。

この手動のプロセスには操作者による注意が常に必要であり、長い時間が必要とされるため人件費が高くかかることは明らかである。同時に処理される試料の数はかなり限定されており、非常に小さな容積の液滴を正確にピペットに取って配置する際に操作者によるエラーを排除することはできない。この手動の方法だと、免疫標識化中の長い処理時間後に、試料が混ざり合うのを排除することはできない。これは、特許文献４に示されているように、チップまたはバーコードの形態の識別子を有する試料キャリアを用いることにより防ぐことができる。

さらに、長期間にわたる標準プロトコルの最中の液滴の蒸発が重要な問題である。
米国特許第５，１４３，７１４号明細書独国ＤＥ３８７８１６７Ｔ２号明細書米国特許第５，０７９，１７２号明細書独国実用新案ＤＥ２９９０６３８２Ｕ１

従って、本発明の目的は、自動処理プロセスに好適な薄組織断面の免疫標識化用スライドの搬送容器を利用可能とし、スライド上の薄組織断面の取扱いを確実にし、エラーをなくすことである。

この目的は、請求項１の特徴を備えた搬送容器により達成される。

この目的も、請求項１の特徴を備えた搬送容器により達成される。

本発明による搬送容器は、基部により閉じられる周囲区切り壁を含むトラフの形態で実現されるため特に有利である。搬送容器をスタックして配置すると、１つの搬送容器の基部がその下に配置された搬送容器のカバーを構成し特に有利である。搬送容器のスタッキングは、スライドに適用された液滴の蒸発を防ぐため、特に有利である。スライド周囲の封止された空間内の特定の水分レベルを確保するために、水分排除媒体を搬送容器に入れる。搬送容器は、基部により閉じられる周囲区切り壁を含むトラフの形態で実現される。区切り壁のトラフ内部において、スライドが搬送容器の基部から間隔を空けて載っている少なくとも１つの周囲段で実現される。

本発明は、図面に概略を示した実施例を参照すると明らかになろう。

図１に、上側１ａおよび下側１ｂを画定するキャリアプレート１を示す。下側１ｂには、キャリアプレート１に印を付けた位置があり、そこには薄組織断面２ａ（図３参照）を有する金属グリッド２が配置されている。キャリアプレート１の金属グリッド２の位置を上げる（キャリアプレート１から金属グリッド２の位置が上げられている）。これによって、液滴と接触した際の、個々の金属グリッド２間の液体架橋の形成を防ぐ。金属グリッド２の位置とは逆のキャリアプレート１の上側１ａに配置されているのは、磁石３、例えば、永久磁石を含むオリフィス３ａ（図３参照）である。これによって、磁力により、金属グリッド２がキャリアプレート１の下側１ｂの適所に配置される。金属グリッド２と磁石３の間の距離を出来る限り小さく（＜２ｍｍ）保たなければならない。キャリアプレート１は、寸法安定性のある非金属材料、好ましくは、アルミニウム、真鍮または繊維強化プラスチックでできているのが好ましく、金属グリッド２を有する下側１ｂに疎水性コート（例えば、テフロン（登録商標）圧力コーティング）がなされているのが有利である。キャリアプレート１の形状およびキャリアプレート１上の金属グリッド２の配置に関しては数多くの実施形態が可能であることは当業者には明白である。ここに図示した実施形態において、約７６×２６ｍｍ（３×１インチ、顕微鏡スライドサイズ）の寸法を有する矩形プレートは、例えば、直径３ｍｍの１０×３の金属グリッド２を収容する。キャリアプレート１の下側１ｂの金属グリッド２は、キャリアプレート１の上側１ａの磁石３のオリフィスとは逆に配置し、好ましくはまた、スライド４の上側４ａの少なくとも１つの液滴６の位置とは逆に配置されているということが重要である（図２参照）。

更なる例証の実施形態において、金属グリッド２は電磁石（図示せず）によりキャリアプレート１の下側１ｂに保持されている。

図２は、上側４ａと下側４ｂとを画定する、本発明によるスライド４の斜視図である。スライド４は、図示した実施形態において、列で構成され、それぞれ液滴６が充填された多数の凹部５（「ウェル」と呼ぶ）を上側４ａに有している。液滴６は、従来技術に開示されているように、洗浄溶液または処理溶液を含んでいる。個々の凹部５に異なる液体を存在させることもできる（例えば、一列の凹部５には洗浄溶液を充填し、次の列の凹部５には様々な抗体を有する標識化溶液を充填）。スライド４は透明であるのが有利であり、寸法安定性材料でできている。スライド４は、ガラスまたはプラスチックでできているのが好ましく、凹部５を有する上側４ａおよび凹部５自身に疎水性コート（例えば、テフロン（登録商標）圧力コーティング５ａにより）する。凹部５は、テフロン（登録商標）コーティング５ａの深さ対厚さＤ（図３参照）と同一である（凹部５は、テフロン（登録商標）コーティング５ａの厚さＤに対する深さが同一となるようにされている）。凹部５は約５０μｍのサイズであるのが有利である。凹部５は５０μｌ〜５μｌの容積を有する液滴６を支持する。洗浄溶液のための液滴６の容積は、抗体および／または金を含む液滴の容積より大きい。抗体または金溶液の容積を減じる理由は、かかる溶液のコストが高いことによる。テフロン（登録商標）圧力コーティングは様々な液滴サイズについて同じである。液滴６は、疎水性リムコーティングのために、大きい、または小さい範囲まで、上方へ膨張する。これらの液滴とグリッドを接触させるために、手順に関して、液滴サイズを知ることが絶対に必要である。というのは、液滴サイズによって、金属グリッド２の下部の動きが異なる位置となるからである。

スライド４とキャリアプレート１間の空間的相関図を部分断面図で図３に示す。空間断面図は、例えば、点線３８で図１に示してある。そこに図示した例証の実施形態において、厚さＤの疎水性コーティング５ａがスライド４に適用される。磁石３のオリフィス３ａはキャリアプレート１に提供されている。試料または薄組織断面２ａは、キャリアプレート１の下側１ｂの印を付けた位置に提供される。各薄組織断面２ａに近接しているのは金属グリッド２である。金属グリッド２、同じく薄組織断面２ａは関連の磁石３により適所に保持されている。図１および３の点線２９は、各薄組織断面２ａが金属グリッド２と共にスライド４の凹部５の逆になるように、キャリアプレート１およびスライド４が構成されている、ということを示すものである。

図４（ａ）に、本発明に用いられるスライドの実施形態を示す。識別のために、スライド４は、例えば、特許文献４に図示されたような識別子を有していると有利である。識別子４ｃは、スライド４の表面４ａに取り付けられており、バーコード、トランスポンダまたはチップの形態で実現することができる。スライド４のサイズおよび形状、ならびにスライド４の上側４ａにある凹部５の構成に関しては数多くの可能な実施形態があることは当業者には明白である。スライド４の更なる実施形態を図４（ｂ）に示す。スライドのテフロン（登録商標）コーティングにおいて、寸法７６ｍｍ×２６ｍｍのスライド４の矩形表面には、直径２〜３ｍｍの８×３個の凹部５が含まれている。記録の目的で、数字８１を各凹部５に付けてある。図４（ｂ）には、スライド４に液滴６の定義された塗布ができるマルチチャネルピペット８０も示されている。さらに、必要な液体容積は、マルチチャネルピペット８０により極めて正確に設定することができ、液滴６のスライドへの適用は特に有効である。スライド４は、８つの凹部５をそれぞれ有する列が３列あるため、マルチチャネルピペット８０も、スライド４の凹部５に従って間隔の空いた８つの個々のチャネル８２を同じく有している。

図８は、処理部４０のスタック２０を備えた搬送ホルダー３４の相互作用の詳細な斜視図である。搬送容器４０のスタック２０はクランプ２８により保持されている。クランプ２８はスタック２０が下方に落ちるのを防ぐ。図５に示すように、搬送ホルダー３４はスタック２０の直下に配置されている。搬送ホルダー３４は、ブラケット４３により搬送機構４２（ここでは詳細は図示せず）に取り付けられている。スライド４は、搬送ホルダー３４に載った搬送容器４０に配置されている。多数の液滴６がスライド４に配置されている。ここに示す好ましい例証の実施形態においては、３×８個の液滴６がスライド４に配置されている。スタック２０の最下部の搬送容器４０は、クランプ２８が搬送容器４０の周囲区切り壁４９の左右側壁５３および５４と相互作用するようにして、クランプ２８により保持されている。クランプ２８は、搬送容器４０の左右側壁５３および５４と接触する少なくとも１つのラグ２８ａへと成形されている。

図９は、処理部１６に配置されたキャリアプレート１を備えた搬送ホルダー３４の相互作用の詳細な斜視図である。搬送機構４２と、搬送容器４０の搬送ホルダー３４を保持するブラケット４３とは、点線で示してある。スライド４が配置された搬送容器４０は搬送ホルダー３４に載っている。搬送容器４０に配置されたスライド４の液滴６の位置は、キャリアプレート１の金属グリッド２の位置に対応している（図１参照）。キャリアプレート１は、処理部１６のアーム３６に取り付けられたホルダー３５により処理部１６に保持されている。ホルダー３５は、処理部１６のアーム３６へホルダーを入れ、かつ／またはそこから取り外すのに用いる２つのグリップ凹部３７を有している。処理部は、キャリアプレートを上から横に水平に中心に置く手段（図示せず）を有しており、金属グリッド２および液滴６の位置が一致する。スライド４は搬送機構４２によりキャリアプレート１に近づく。スライド４とキャリアプレート１間の特別に短い距離で、液滴６が、組織断面２ａと共にキャリアプレート１の金属グリッド２を濡らす。キャリアプレート１とスライド４間の距離は、液滴６の容積によって異なる。液滴の容積は変える方がよい。というのは、良好なクリーニング効果を達成するためには液滴を出来る限り大きくしなければならない一方で、抗体の標識化溶液は非常に高価であるため容積は出来る限り小さくしなければならないからである。搬送機構４２は、ステッピングモータ４５および位置センサを用いた駆動システムを有する線状ガイドシステムを有することができる。キャリアプレート１とスライド４間の距離を正確にするために、キャリアプレート１からスライド４までの距離を測定するセンサ４４がある。液滴６をピペットで計量して、その容積を正確に求める。

搬送容器４０の一実施形態の上面斜視図を図７（ａ）に示す。搬送容器４０は、基部５０により閉じられる周囲区切り壁４９を含むトラフの形態で実現される。搬送容器４０は、例えば、アルミニウム、複合体材料、充填ポリマー材料または未充填ポリマー材料のような寸法安定性のある材料から作成される。搬送容器４０は、一般に、射出成形法を用いて作成される。その他の作成方法、例えば、ミリングもまた考えられるが、射出成形が最もコスト有効性がある。搬送容器４０を作製する材料は好適なポリマー材料（例えば、シェブロンフィリップスケミカルカンパニー（ＣｈｅｖｒｏｎＰｈｉｌｌｉｐｓＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ）のリトン（ＲＹＴＯＮ）ＢＲ１１１ＢＬ）である。区切り壁４９は、前壁５１と後壁５２を有しており、これらは左右側壁５３および５４により互いに結合されている。前壁５１および後壁５２はそれぞれ左右側壁５３および５４と直角を成している。区切り壁４９は、内側に向かって、周囲の第１の段５５、周囲の第２の段５６および周囲の第３の段５７を有している。次の搬送容器４０（図５参照）は、第１の段５５の基部５０に載っている。搬送容器４０の基部５０は、このように、同時に、その下に配置された次の搬送容器４０のカバーを構成している。スライド４は第３の段５７に載っており、第２の段５６の端部により同時に定位置に固定されている。搬送容器４０の基部５０は、それぞれ平面領域６０を有する第１および第２の隆起部５８および５９を有している。平面領域６０は、第３の段５７の高さに配置され、隆起部はスライド４を支持する。第１の隆起部５８は丸い。第２の隆起部５９は楕円形である。さらに、水分排除媒体（図７（ａ）には図示せず）を搬送容器４０の基部５０に配置することができる。左右側壁５３および５４はそれぞれ突出部６１を有している。突出部６１の領域において、スライド４は左右側壁５３および５４とは完全には接触しておらず、例えば、搬送容器４０の基部５０にある水分排除媒体からの水分は液滴６を有するスライド４の表面に達する。突出部６１も同様に、スライド４の搬送容器４０からの取り外しを促す。搬送容器４０の左右側壁５３および５４は、その前壁５１の領域において、ユーザーが搬送容器４０を確実に取扱うことができる２つのグリップ凹部６２を有している。搬送容器４０の後壁５２はその上で成形された２つの平行なラグ６３を有している。ラグ６３は、搬送容器を自動的に処理することができる装置におけるガイドとして作用する。

図７（ｂ）は、図７（ａ）に示した搬送容器４０の一実施形態の下面斜視図である。第１の隆起部５８および第２の隆起部５９は中空で構成されている。第１の隆起部５８は、円５８ａの形状の断面を有する凹部を備えている。第２の隆起部５９は、長形孔５９ａの形状の断面を有する凹部を備えている。両凹部とも平面領域６０の領域で終わっている。凹部は、搬送ホルダー３４に搬送容器４０を配置する役割を果たす。凹部に係合することにより搬送ホルダー３４に搬送容器４０を配置する２本のピン（図示せず）をその目的で搬送ホルダー３４上に成形する。左側壁５３、後壁５２および右側壁５４はリム４１を備えている。少なくとも１つの留め具７０が左側壁５２と右側壁５４にそれぞれある。留め具７０は、例えば、搬送容器４０のスタック２０で作用して、その下に確実に搬送容器４０が配置される。

図８は、図７（ａ）に示した点線Ａ−Ａに沿った搬送容器４０の断面図である。第３の段５７は、第１および第２の隆起部５８および５９の平面領域６０として同じレベルにあるのは明らかである。図７（ａ）の説明で既に述べた通り、水分排除媒体６４が搬送容器４０の基部５０にあり、水分が液滴（図５参照）を乾燥させるのを防ぐ。

図９は、図７（ｂ）に示した点線Ｂ−Ｂに沿った搬送容器４０の断面図である。搬送容器４０は、セクション線Ｂ−Ｂに沿って実際にＵ形の断面を有しており、左側壁５３と右側壁５４はＵ形断面のヘリを構成している。留め具７０は搬送容器の基部５０から離れている。左右側壁５３および５４の区切り壁４９は、内側に向かって、周囲の第１の段５５、周囲の第２の段５６および周囲の第３の段５７を有している。次の搬送容器４０（図５参照）は、第１の段５５の基部５０に載っている。搬送容器４０の基部５０は、このように、同時に、その下に配置された次の搬送容器４０のカバーともなっている。スライド４は第３の段５７に載っており、第２の段５６の端部により同時に定位置に固定されている。

図１は、複数の金属グリッドを備えたキャリアプレートの斜視図である。図２は、少なくとも１種類の処理液を充填可能な凹部を有するスライドの斜視図である。図３は、スライドが装着されたキャリアプレートの空間的相関図を示す概略断面図である。図４（ａ）は、スライドの一実施形態の平面図である。図４（ｂ）は、図示されたのと同様のスライド、液滴の適用のためのピペットの更なる実施形態の平面図である。図５は、第１または第２のステーション中に搬送容器のスタックを備えた搬送ホルダーの相互作用を示す詳細な斜視図である。図６は、処理部に配置されたキャリアプレートを載せた搬送ホルダーの相互作用を示す詳細な斜視図である。図７（ａ）は、搬送容器の一実施形態の上面斜視図である。図７（ｂ）は、搬送容器の一実施形態の下面斜視図である。図８は、図７（ａ）に示した点線Ａ−Ａに沿った搬送容器の断面図である。図９は、図７（ｂ）に示した点線Ｂ−Ｂに沿った搬送容器の断面図である。

符号の説明

１キャリアプレート
１ａ上側
１ｂ下側
２金属グリッド
２ａ薄組織断面
３磁石
３ａオリフィス
４スライド
４ａ上側
４ｂ下側
４ｃ識別子
５凹部
５ａコーティング
６液滴
１０装置
１１ディスプレイ
１２入力部
１３入力ボタン
１４ステーション部
１５ａ第１のドア
１５ｂ第２のドア
１６処理部
１８脚
１９カバー
２０第１のステーション
２１第２のステーション
２２ユーザーインターフェース
２４ａ第１のバー
２４ｂ第２のバー
２４ｃ第３のバー
２５染色装置
２８クランプ
２８ａラグ
２９モータ
３０分配装置
３１モータ
３２搬送手段
３３分配管
３４搬送ホルダー
３５ホルダー
３６アーム
３７グリップ凹部
３８点線
４０搬送容器
４１突出部
４２搬送機構
４３ブラケット
４４センサ
４５ステッピングモータ
４９周囲区切り壁
５０基部
５１前壁
５２後壁
５３左側壁
５４右側壁
５５周囲の第１の段
５６周囲の第２の段
５７周囲の第３の段
５８第１の隆起部
５８ａ円
５９第２の隆起部
５９ａ長形孔
６０平面領域
６１突出部
６２グリップ凹部
６３ラグ
６４水分排除媒体
８０マルチチャネルピペット
８１数字
８２チャネル

Claims

周囲区切り壁と、前記周囲区切り壁に取り付けられて、搬送容器を閉じる基部と、前記搬送容器の内部に形成された少なくとも１つの周囲段とを含み、前記搬送容器の前記基部にスライドが間隔を空けて載っている薄組織断面の免疫標識化用スライドの搬送容器。
前記搬送容器の前記周囲区切り壁が、後壁および前壁により互いに結合された左右側壁により構成されている請求項１記載の搬送容器。
少なくとも１つの留め具が前記左右の側壁にそれぞれある請求項２記載の搬送容器。
前記搬送容器がスタック可能で、１つの搬送容器の前記基部が、それぞれの場合において、下にある搬送容器のカバーを構成している請求項１記載の搬送容器。
前記搬送容器の前記区切り壁が、互いに逆に配置された前記前壁の２つのグリップ凹部の領域にある請求項１〜４のいずれか一項に記載の搬送容器。
前記搬送容器の前記区切り壁が、前記スタックの前記搬送容器を配置するためのガイドとして部分的に作用する前記後壁の２つの平行なラグの領域に成形された請求項１〜５のいずれか一項に記載の搬送容器。
前記区切り壁は前記左右側壁にそれぞれ少なくとも１つの突出部を有しており、前記スライドが前記突出部の領域において前記左右側壁と接触しないように構成されている請求項１記載の搬送容器。
後壁および前壁により互いに結合された左右側壁により構成される周囲区切り壁と、前記周囲区切り壁に取り付けられて、搬送容器を閉じる基部と、前記搬送容器の内部に形成された少なくとも１つの周囲段とを含み、前記搬送容器の前記基部にスライドが間隔を空けて載っており、グリップ凹部が前記前壁に近接した前記左右側壁に形成されている薄組織断面の免疫標識化用スライドの搬送容器。
後壁および前壁により互いに結合された左右側壁により構成される周囲区切り壁と、搬送容器を閉じる、前記周囲区切り壁に取り付けられた基部と、前記搬送容器の内部に形成された少なくとも１つの周囲段と、前記搬送容器をスタックに配置するガイドとして作用する前記後壁に形成された２つの平行なラグとを含み、前記搬送容器の前記基部にスライドが間隔を空けて載っている薄組織断面の免疫標識化用スライドの搬送容器。