JP4010390B2 - Immunostimulatory composition - Google Patents

Description

【００１６】
核酸を添加した食餌を、通常のマウスに２週間自由に経口摂取させた後、ＩＥＬにおけるＴＣＲサブセット構成を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で解析した。
【００１７】
核酸摂取群におけるαβ-ＩＥＬの発現率（％）は、核酸非摂取群（対照群）のそれよりも有意（ｐ＜０．０５）に低くなり、逆にγδ-ＩＥＬの発現率は、対照群のそれよりも有意（ｐ＜０．０５）に高くなった（図１）。これを、核酸摂取群におけるαβ-ＩＥＬ/γδ-ＩＥＬの発現比、対照群におけるαβ-ＩＥＬ/γδ-ＩＥＬの発現比で比較すると、核酸摂取群の方が対照群よりも有意（ｐ＜０．０５）に低下した（図２）。これらの結果は、核酸を添加した食餌を経口摂取すると、ＩＥＬにおけるαβ-ＩＥＬとγδ-ＩＥＬの構成比が、γδ-ＩＥＬが高められる方法にシフトすることを示している。
【００１８】
さらに、αβ-ＩＥＬおよびγδ-ＩＥＬのそれぞれにおけるＣＤ４とＣＤ８の発現比率をＦＡＣＳで個体別に解析した。
【００１９】
αβ-ＩＥＬにおける核酸摂取群のＣＤ８αα⁺の発現率（％）が、対照群のそれよりも有意（ｐ＜０．０５）に低くなったのに対し、γδ-ＩＥＬにおける核酸摂取群のＣＤ８αα⁺の発現比率（％）は、対照群のそれよりも有意（ｐ＜０．０５）に高くなった（図３）。
【００２０】
データは示さないが、核酸摂取群と対照群との間で、αβ-ＩＥＬにおけるＣＤ８αβ⁺の発現比率には差は認められなかったこと、ＣＤ４⁺、ＣＤ４⁺ＣＤ８⁺、の発現比率は、核酸摂取群と対照群で変わらなかったこと、γδ-ＩＥＬにおけるＣＤ４^-ＣＤ８^-は、核酸摂取群で僅かに増加したが、対照群と有意差はなかったことから、核酸摂取群において、αβ-ＩＥＬにおけるＣＤ８αα⁺の構成比率が低くなり、γδ-ＩＥＬにおけるＣＤ８αα⁺の構成比率が高くなることと、αβ-ＩＥＬとγδ-ＩＥＬの構成比率が、γδ-ＩＥＬの発現比率が高められる方向にシフトすることとは相関していることを示していると考えられる。したがって、核酸の経口摂取は、胸腺外でのγδ-ＩＥＬ発達・分化を促進すると考えられる。
【００２１】
さらに、タンパク質抗原の経口摂取が、ＩＥＬにおけるＴＣＲサブセットの発現、およびＣＤ４とＣＤ８発現に及ぼす影響を、主要な食物アレルゲンである卵白アルブミン（ＯＶＡ）に特異的なＴ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）をもつトランスジェニックマウス（ＯＶＡ-ＴＣＲ Ｔｇ）で調べた。
【００２２】
核酸を含む食餌とともにＯＶＡを含む水を自由に摂取したＯＶＡ-ＴＣＲ ＴｇマウスからＩＥＬを調製し、ＴＣＲサブセット構成、およびαβ-ＩＥＬとγδ-ＩＥＬにおけるそれぞれのＣＤ４とＣＤ８サブセット発現を、ＦＡＣＳで個体別に解析した。
【００２３】
経口抗原存在下でも、αβ-ＩＥＬとγδ-ＩＥＬの構成比は、核酸の経口摂取により、γδ-ＩＥＬが高められる方向に有意（ｐ＜０.０５）にシフトした（図４）。ＣＤ８αα⁺の発現率（％）についても、γδ-ＩＥＬにおけるＣＤ８αα⁺の発現率は、対照群のそれよりも有意（ｐ＜０．０５）に高くなった（図５）。しかしながら、核酸摂取群、対照群ともにαβ-ＩＥＬの発現比率が、通常マウスの場合に比較して著明に増加した（図１と４参照）。
【００２４】
一方、八村らは、ＯＶＡを経口摂取したＯＶＡＴＣＲ-Ｔｇマウスでは、ＯＶＡ特異的ＣＤ４⁺-ＩＥＬが増殖し、ＩＥＬ全体に占める割合が増加することを明らかにしている（八村敏志・他：日本農芸化学会誌, 73(5): 523-527, 1999）。
【００２５】
２） 核酸の経口摂取が腸管上皮におけるサイトカイン産生に及ぼす影響核酸を添加した食餌とともにＯＶＡを含む水を自由に摂取したＯＶＡ-ＴＣＲＴｇマウスから調製したＩＥＬと、未感作のＢＡＬＢ/ｃマウスから調製しマイトマイシンＣ処理した脾細胞（抗原提示細胞）とを、ＯＶＡの存在下、あるいは非存在下で共培養すると、核酸摂取群において、ＯＶＡ特異的ＩＦＮ-γおよびＩＬ-２の産生増強が観察された（図６および７）。
【００２６】
これは、核酸の経口摂取は、ＩＥＬ中の抗原特異的なＴｈ１タイプの細胞の増殖応答を誘導することを示していると考えられる。
【００２７】
核酸の経口摂取はマウスの小腸上皮細胞のＩＬ-７産生を有意（ｐ＜０．０１）に増強する（図８）。
【００２８】
また、核酸を添加した食餌とともにＯＶＡを含む水を自由に摂取したＯＶＡ-Ｔｇマウスの小腸上皮細胞のＩＬ-７産生およびＴＧＦ-β産生は、核酸摂取により有意（ｐ＜０．０１）に増強した（図９および１０）。
【００２９】
３） 核酸の経口摂取が抗原特異的ＩｇＡ抗体産生に及ぼす影響
【００３０】
核酸の経口摂取は、腸管における抗原特異的ＩｇＡ抗体の産生を対照群に比較して有意（ｐ＜０．０５）に増強した（図１１）。
【００３１】
ヌクレオチドをマウスに経口摂取させ、脾臓細胞や腹腔マクロファージのp70型のＩＬ-１２に与える影響を、生物学的測定法（Bioassay法）で検討した。また、in vitroでヌクレオチドとともにマクロファージを培養し、その上清中のＩＬ-１２活性をBioassay法で測定した。腹腔マクロファージのＩＬ-１２活性は、ＬＰＳ刺激下でヌクレオチド投与群の方がヌクレオチド非投与群に比べて有意に高くなった（図１２）。また、in vitroでヌクレオチドとともに腹腔マクロファージを培養した場合のＩＬ-１２活性は、ヌクレオチドを添加していない場合に比べて、有意差は見られないものの高くなる傾向が見られた（図１３）。
【００３２】
脾臓リンパ細胞のＩＬ-１２活性は、ヌクレオチド投与群の方がヌクレオチド非投与群に比べて有意に高くなった（図１４）。
【００３３】
以上のことから、核酸組成物の経口摂取は、マクロファージなどによるＩＬ-１２産生を促進し、ＩＬ-１２はナイーブＴ細胞からＴｈ１細胞への分化の促進、抹消血からＩＦＮ-γ産生を誘導することから、生体内でのＴｈ１／Ｔｈ２バランスをＴｈ１優位にシフトすることが期待される。その結果、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスが波綻し、Ｔｈ２優位に変異することに起因する疾患、例えば、アレルギー疾患や自己免疫疾患に対して、核酸組成物を含む飲食品を日常の食生活のなかで摂取することにより、その予防、改善あるいは治療が期待できる。
【００３４】
また、ＩＬ-１２は、静止期のＴ細胞およびＮＫ細胞からのＩＦＮ-γの産生誘導、ＮＫ細胞活性の亢進、ＬＡＫ細胞活性の誘導、静止期Ｔ細胞のレクチン刺激による細胞増殖亢進などが知られており、核酸組成物を含む飲食品を日常の食生活のなかで摂取することにより、生体内での微生物および腫瘍細胞に対する排除能を高め、ＩＦＮ-γの産生増強をとおしてウイルスや腫瘍細胞に対する防御能を高めることが期待される。
【００３５】
これらの結果から、核酸の経口摂取は、１）ＩＥＬにおけるＴ細胞のαβ-ＩＥＬサブセットとγδ-ＩＥＬサブセットの構成比がγδ-ＩＥＬ優位に高められ、それは、γδ-ＩＥＬにおけるＣＤ８αα⁺の比率の増加と、αβ-ＩＥＬにおけるＣＤ８αα⁺の比率の減少と相関しており、２）ＩＥＬにおいて、抗原特異的ＩＬ-２およびＩＦＮ-γの産生を促進し、３）腸管上皮細胞におけるＩＬ-７およびＴＧＦ-βの産生を促進し、４）抗原特異的ＩｇＡ抗体産生を誘導する、５）ＩＬ-１２産生を増強することが示された。
【００３６】
一方、本発明者らは、ヌクレオチドを含む食餌を経口摂取したマウスは、１）パイエル板Ｔリンパ球のマイトジェン刺激に対する増殖応答能およびＩｇＡ産生能が、ストレス下（絶食）で促進されること、２）血清中のＩｇＥ産生が抑制されること、３）ＩｇＧ１／ＩｇＧ２aが低下すること、４）脾細胞のＩＦＮ-γの産生が促進され、ＩＬ-４産生が抑制されること、を示した（特開平9-323979）。さらにその後、本発明者らは、ヌクレオチドを含む食餌を経口摂取したマウスの血清中では、１）カゼイン特異的ＩｇＧ１は変化なかったが、ＩｇＧ２aは高まったこと、２）卵白アルブミン（ＯＶＡ）特異的ＩｇＧ１は変化なかったが、ＩｇＧ２aは高くなり、またＯＶＡ特異的ＩｇＥは低下したこと、３）血清中の全ＩｇＥが低くなったこと、を示した（特開平11-35468）。
【００３７】
一方、γδ-ＩＥＬはＫＧＦを産生し小腸上皮細胞の成長、増殖を制御している（Boismenu, R. & Havran, W.L.: Science, 266: 1253, 1994; Komano, H. etal.: Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 92: 6147, 1995）、分泌型ＩｇＡ産生を促進する（Fujihashi, K. et al.: J. Exp. Med., 183: 1929, 1996）、経口免疫寛容の誘導に必要である（Ke, Y. et al.: J. Immunol., 158: 3610-3618, 1997）、などから、ＩＥＬにおけるγδ-ＩＥＬの発現が高まる方向へのシフトは、腸管免疫系の賦活化に重要であると考えられる。
【００３８】
また、Ｔｈ１細胞の産生するＩＦＮ-γは、上皮細胞の基底膜側に発現している分泌成分（serectory component: ＳＣ）産生に深く関与している（Taguchi,T. et al.: J. Immunol., 3736, 1991）。このＳＣとＩｇＡ形質細胞が産生する２量体のＩｇＡは結合して分泌型ＩｇＡを形成する。
【００３９】
また、上皮細胞のＩＬ-７は、γδ-ＩＥＬのＩＬ-７レセプター（ＩＬ-７Ｒ）を介してγδ-ＩＥＬの分化・増殖に重要な役割を果たす（Fujihashi, K. et al.: Eur. J. Immunol., 27: 2133, 1997）。さらに、ＩＬ-２とＩＬ-７は胸腺由来のγδ-ＩＥＬやαβ-ＩＥＬに対して活性化因子として働いている（Okazaki,et al.: J. Immunol., 143: 2917, 1989）。
【００４０】
また、ＴＧＦ-βは、免疫抑制性のサイトカインとして知られており、これを分泌するＴ細胞は経口免疫寛容における調節性Ｔ細胞として、免疫応答を抑制していることが示唆されている（八村敏志・他：日本農芸化学会誌, 73(5): 523-527, 1999）。また、ＴＧＦ-βは、ＩｇＡへのクラススイッチを行うことが知られており（Sonoda, E. et al.: J. Exp. Med., 170: 1415, 1989）、腸管におけるＩｇＡへの関与も示唆されている。
【００４１】
ところで、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞は、産生するサイトカインプロフィルとそれに基づくエフェクター機能によって、ＩＬ-２やＩＦＮ-γを産生するＴｈ１細胞と、ＩＬ-４やＩＬ-５、ＩＬ-１０を産生するＴｈ２細胞に分類される。このＴｈ１とＴｈ２のバランスの破綻は、がん、感染症、アレルギー、自己免疫疾患、動脈硬化など、さまざまな免疫病の発症に関与しているほか、ストレスと免疫、移植免疫、妊娠免疫にも重要な因子であることが知られている。核酸の経口摂取は、このＴｈ１とＴｈ２のバランスにおけるＴｈ２優位へのバランス破綻を、Ｔｈ１の発現を高めることにより、該バランスを改善することが期待される。
【００４２】
結論として、有効量の核酸の経口摂取により、腸管免疫系に抗原特異的な分泌型ＩｇＡ抗体産生を促進して、有害な病原体などに対する防御能を高め、一方、抗原特異的な経口免疫寛容を効果的に誘導し、さらに、Ｔｈ１/Ｔｈ２細胞のバランスの破綻を改善し、結果、腸管免疫系、あるいは全身免疫系を賦活化することが期待される。
【００４３】
本明細書における“核酸の有効量”は、例えば、ＩＥＬにおけるγδ-ＩＥＬの発現比率が高められること、腸管上皮におけるＩＦＮ-γ、ＩＬ-２、ＩＬ-７、およびＴＧＦ-βの産生が促進されること、抗原特異的ＩｇＡ抗体の産生が促進されること、血清中の抗原特異的ＩｇＥ抗体産生やｔｏｔａｌＩｇＥ抗体産生が抑制されること、脾細胞におけるＩＬ-４産生が抑制されること、ＩｇＧ１/ＩｇＧ２ａの比が低下すること、等を指標にして、公知のアッセイによりその有効量を決定し、さらに臨床症状等を勘案して、有効摂取量を決定することができる。
【００４４】
経口的に摂取された核酸は、膵液中のリボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼによって加水分解を受け、ヌクレオチドになり、ホスファーターゼによってリン酸がはずれてヌクレオシドになり、さらにヌクレオシダーゼによって分解されて核酸塩基と五炭糖になる。胃腸からの吸収は、ヌクレオチド、ヌクレオシドとして行われる。
【００４５】
ここでいう塩基は、アデニン、グアニン、ヒポキサンチン、キサンチン、シトシン、ウラシル、チミンのことである。ここでいうヌクレオシドは、ウリジン、アデノシン、グアノシン、シチジン、リポチミジン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、チミジン、イノシン、キサントシンのことである。
【００４６】
ここでいうヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分にリン酸がエステル結合で結合している化合物のことで、結合するリン酸の位置はどこでもよく、結合するリン酸の数もいくつでもよい。また、例えば、１つのリン酸が 5'、3' 位の両方に結合する化合物もヌクレオチドに含める。この場合も結合するリン酸の数や位置はどこでもよい。
【００４７】
ここでいう核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡなどのポリヌクレオチドや上記したヌクレオチドが結合したポリヌクレオチドのことである。本発明の核酸は、アデノシン-n'-一リン酸、シチジン-n'-一リン酸、グアノシン-n'-一リン酸、ウリジン-n'-一リン酸、チミジン-n'-一リン酸、およびイノシン-n'-一リン酸の１種または２種以上を含む核酸組成物を意味する。ここでn'は２'、３'、または５'を示す。
【００４８】
本発明の核酸組成物は、特定の組み合わせの核酸を有効成分として含有するものであり、組み合わせを遊離形で示すと、次のとおりである。なお、核酸成分は、ＩＵＰＡＣ-ＩＵＢ規定、あるいは当該分野における慣用記号にしたがう。
【００４９】
すなわち、アデノシンーリン酸（ＡＭＰ）／シチジンーリン酸（ＣＭＰ）／グアノシンーリン酸（ＧＭＰ）／ウリジンーリン酸（ＵＭＰ）／イノシン-n'-一リン酸（ＩＭＰ）の各組み合わせである。これらの組み合わせにおける各成分としては、公知のヌクレオシド、ヌクレオチド類、またはこれらの無毒性塩が含まれる。
【００５０】
また、核酸成分の配合割合を、例えば核酸のモル比で表せば、モル比は、上記のアッセイ系で、核酸成分の種類、配合量等を決定し、さらに患者の病態等を勘案して決定することができる。これらの好ましい組み合わせの１例としては、モル比として、ＩＭＰ：ＡＭＰ：ＧＭＰ：ＣＭＰ：ＵＭＰ：ＡＭＰ＝１〜４：１〜４：１〜４：１〜４である。さらに好ましい一つの例として、ＧＭＰ：ＣＭＰ：ＵＭＰ：ＩＭＰ＝１：３〜４：１〜２：１〜３である。
【００５１】
これらの核酸塩基のうちでの最適な核酸塩基の選択、あるいは組み合わせは、当業者であれば、上記アッセイ系で適切に決定することが可能である。したがって、そのようにして得られた核酸組成物も本発明に包含される。
【００５２】
核酸はその由来に制限はなく、例えば、酵母、細菌、乳、魚介類、動物、植物由来が挙げられる。飲食品タイプの核酸組成物として使用する場合には、有効量の核酸成分（その処理物）をそのまま、使用したり、他の食品ないし食品成分と併用したりして適宜常法にしたがって使用できる。有効量の核酸成分を用いる本発明に係る組成物は、固体状（粉末、顆粒状その他）、ペースト状、液状ないし懸濁状のいずれでもよいが、甘味料、酸味料、ビタミン剤その他ドリンク剤製造に常用される各種成分を用いて、健康ドリンクに製剤化すると好適である。
【００５３】
腸管免疫系の賦活化（抗原特異的ＩｇＡ抗体産生や免疫寛容）を目的として、核酸の有効量を、食品、健康食品、機能性食品、栄養補助食品、特定保健用食品、経腸栄養食品、あるいは経腸栄養剤等の医薬品製剤や医薬部外品製造のために配合することができる。それは周知・慣用技術である。
【００５４】
プリン・ピリミジンの成人１日の必要量は、450〜700mgとされ、また、尿酸に蓄積を生じない最大安全量は、４g/日とされている（Rudolph, F.B. et al.: Nutrition, 6 : 45, 1990）。
【００５５】
［試験例］ 以下、核酸の経口摂取が免疫系に及ぼす影響についての試験例を示すが、本発明はこれらの試験例に限定されるものではない。
【００５６】
統計処理データの統計的有意差は、Student's testによつて決定した。p＜０.０５における値を有意とみなした。
【００５７】
フローサイトメトリー一次抗体は、ビオチン化抗マウスＴＣＲβ(Ｈ５７-５９７)（PharMingen, SanDiego, CA, U.S.A）、ビオチン化抗マウスＣＤ４(Ｈ１２９.１９)（PharMingen）、およびビオチン化抗マウスＩＬ-２Ｒ抗体(ＣＤ２５)(７Ｄ４)(PharMingen)、を用いた。インキュベーションは全て遮光下に行った。細胞は、一次抗体、あるいはアイソタイプコントロール抗体とともに、氷上で３０分間インキュベートした。Ｈａｎｋ's平衡塩類溶液で細胞を洗浄後、Fluorescein isothiocyanate（ＦＩＴＣ）標識抗マウスＴＣＲδ抗体(ＧＬ３)(Cedar Lane Lab.)、ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ４(Ｈ１２９.１９)（PharMingen）、phycoerythrin（ＰＥ）標識抗マウスＣＤ８α(５３-６.７)（GIBCO,Grand Island, NY, U.S.A）、ＦＩＴＣ標識抗マウスＣＤ８β(Ｙ８.７７)（Seikagaku Co., Tokyo, Japan)、ＰＥ標識抗マウスＴＣＲβ、(Ｈ８７-５９７)(PharMingen)、およびstreptavidin-Red 670(GIBCO)、とともに氷上で３０分間インキュベートした。細胞は、遠心して洗浄した。染色細胞は、３カラーによるフローサイトメトリー（Becton Dickinson FACSort）でＩＥＬsサブセットを解析した。解析には、Lysis IIソフトウエアを用いた。
【００５８】
サイトカインアッセイ（ＥＬＩＳＡ）アッセイバッファーとして３％ポリエチレングリコール６０００（Nacalai Tesque Inc., Japan）を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７.４）を用いた（アッセイバッファー）。洗浄バッファーには、０.０５％Ｔｗｅｅｎ-２０を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７.４）（ＰＢＳ-０．０５％Ｔｗｅｅｎ）を用いた。ＩＦＮ-γ、およびＩＬ-２は、ＥＬＩＳＡ法（enzyme-linked immunosorbentassay）で測定した。ラット抗マウスＩＦＮ-γ抗体（６Ａ２）(PharMingen)、ラット抗マウスＩＬ-２抗体（ＪＥＳ６-１Ａ１２）(PharMingen)と、ビオチン化ラット抗マウスＩＦＮ-γ抗体（ＸＭＧ１.２）(PharMingen)、ビオチン化ラット抗マウスＩＬ-２抗体（ＪＥＳ６-５Ｈ４)（PharMingen）を用いた。０.０５Ｍ-Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８.９）で希釈したラット抗マウスＩＦＮ-γ抗体（１μg/ｍｌ）、あるいは０.１Ｍ-NaHCO₃で希釈したラット抗マウスＩＬ-２抗体（１μg/ｍｌ）を、マイクロタイタープレート（Nunc, Roskilde, Denmark）の各ウエルに分注した。４℃で一晩インキュベートし、抗体をウエルに吸着させた。ウエルを洗浄後、５％ＦＣＳを含むアッセイバッファーを加え、室温１時間ブロックした。ウエルを洗浄後、アッセイバッファーで希釈した培養上清を各ウエルに加え、２時間インキュベートした。ウエルを洗浄後、アッセイバッファーで希釈したビオチン化抗マウスＩＦＮ-γ抗体、またはビオチン化抗マウスＩＬ-２抗体を各ウエルに加え、２時間インキュベートした。洗浄後、アッセイバッファーで希釈したアルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジン（Zymed Lab., South San Francisco, CA, U. S.A）を各ウエルに加え反応させた。ウエルを洗浄後、基質溶液［０.１Ｍジエタノールアミン緩衝液(ｐＨ９.８)に溶解した0.１％４ニトロフェニルホスフェイト（Tokyo Kasei Co.）］を各ウエルに加え、室温で１時間インキュベートした。５Ｎ-NaOHを加えて反応を停止し、４０５ｎｍにおける吸光値を測定した。ＩＬ-７およびＴＧＦ-βは、ＥＬＩＳＡ法で測定した。
【００５９】
0.１Ｍ-NaHCO₃で希釈した抗マウスＩＬ-７抗体溶液（２μg/ｍｌ）(Genzyme)をマイクロタイタープレート（Nunc）の各ウエルに分注し、４℃一晩インキュベートし、抗体をウエルに吸着させた。ウエルを洗浄後、１０％ＯＶＡを含むアッセイバッファーをウエルに加え、室温１時間ブロックした。ウエルを洗浄後、0.１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むアッセイバッファーで希釈した培養上清をウエルに加え、２時間インキュベートした。ウエルを洗浄後、0.１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むアッセイバッファーで希釈してヒツジ抗マウスＩＬ-７抗体(１μg/ｍｌ）（R and D, Minneapolis, MN, USA）を各ウエルに加え２時間インキュベートした。ウエルを洗浄後、０.１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むアッセイバッファーで希釈したビオチン化抗ヒツジＩｇＧ抗体を各ウエルに加え、１５分間反応させた。ウエルを洗浄後、アッセイバッファーで希釈したアルカリホスファターゼ標識ストレプトアビジンを各ウエルに加えた。ウエルを洗浄後、ＩＦＮ-γおよびＩＬ-２と同様に、基質溶液を各ウエルに加え、４０５ｎｍにおける吸光値を測定した。
【００６０】
［試験例１］ＩＥＬのＴＣＲサブセット発現に及ぼす影響３週齢の雌性ＢＡＬＢ/ｃマウス［ＳＬＣ,Hamamatsu, Japan］は、ヌクレオチド非添加食餌［ＮＴ(−)］群（ｎ＝４）、およびヌクレオチド添加食餌［ＮＴ(＋)］群（ｎ＝４）、の２群にランダムに分けた。ＮＴ(−)、あるいはＮＴ(＋)を、それぞれ２週間自由摂取させた。ヌクレオチド［Yamasa Co.（Chosi, Japan）］組成を表２に示す。
【００６１】
【表２】

【００６２】
また該ヌクレオチドを含みホエータンパク質（ＷＰＩ）［Davisco, International Inc.（Le Sueur, MN, U.S.A）］を基本とした食餌組成を表３に示す。
【００６３】
【表３】

【００６４】
食餌の摂取後、小腸を摘出し、ＩＥＬを、Nannoらの方法（Nanno, M. et al.:J. Immunol., 153: 2014-2020, 1994）にしたがって調製した。マウスから小腸を摘出した。腸管腔内容物を洗い流した後、ポリエチレンチューブを貫通させ、一端を固定し、内腔が外側になるように反転した。反転した腸管を４等分し、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むＨＢＳＳ４５ｍｌを入れた５０ｍｌコニカルチューブに移し、３７℃で４５分間、水平方向に１３５ｒｐｍ振とうした。振とう後、ガラスウールカラムで濾過して異物を取り除き、細胞を回収した。細胞は、３０％パーコール（Pharmacia, Uppsala, Sweden）に浮遊させ、１８００ｒｐｍで２５分間遠心した。パーコールを用いた密度勾配遠心（１８００ｒｐｍで２５分間遠心）により、４４％と７０％パーコールの境界に集積したＩＥＬを採取した。ＩＥＬの生存ＣＤ３⁺Ｔ細胞は、＞９０％であった。得られたＩＥＬのＴＣＲサブセット構成を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で個体別に解析した。αβ-ＩＥＬのＮＴ(−)群とＮＴ(＋)群における発現率、およびγδ-ＩＥＬのＮＴ(−)群とＮＴ(＋)群における発現率を図１に示す。また、ＮＴ(−)群におけるαβ-ＩＥＬとγδ-ＩＥＬの発現比、およびＮＴ(＋)群におけるαβ-ＩＥＬとγδ-ＩＥＬの発現比を図２に示す。αβ-ＩＥＬの発現率（％）は、ＮＴ(＋)群がＮＴ(−)群のそれよりも有意（ｐ＜０．０５）に低くなり、γδ-ＩＥＬの発現率は、ＮＴ(＋)群がＮＴ(−)群のそれよりも有意（ｐ＜０．０５）に高くなった（図１）。ＮＴ(＋)群のαβ-ＩＥＬとγδ-ＩＥＬの発現比は、ＮＴ(−)群のαβ-ＩＥＬとγδ-ＩＥＬの発現比よりも有意（ｐ＜０．０５）に低下した（図２）。以上の結果、核酸の経口摂取は、αβ-ＩＥＬとγδ-ＩＥＬのバランスを、γδ-ＩＥＬ優位に誘導することが明らかとなった。
【００６５】
［試験例２］ＩＥＬのＣＤ４、ＣＤ８サブセット発現に及ぼす影響αβ-ＩＥＬは、ＣＤ８αα⁺、ＣＤ８αβ⁺、ＣＤ４⁺、およびＣＤ４⁺ＣＤ８αα⁺の４つのサブセットに分類されるのに対し、γδ-ＩＥＬは、ほとんどがＣＤ８αα⁺で残りがＣＤ４^-ＣＤ８^-ある（表１参照）。試験例１の、αβ-ＩＥＬとγδ-ＩＥＬのＣＤ４とＣＤ８の発現率を、ＦＡＣＳで個体別に解析した（図３）。結果、αβ-ＩＥＬにおいては、ＮＴ(＋)群のＣＤ８αα⁺の発現比率がＮＴ(−)群のそれよりも有意に低下し、逆にγδ-ＩＥＬにおいては、ＮＴ(＋)群のＣＤ８αα⁺の発現比率がＮＴ(−)群のそれよりも有意に高くなった。一方、αβ-ＩＥＬにおけるＣＤ８αβ⁺の発現比率とγδ-ＩＥＬにおけるＣＤ８αβ⁺の発現比率には差は認められなかった（データは示さない）。また、ＣＤ４⁺、ＣＤ４⁺ＣＤ８⁺、およびＣＤ４^-ＣＤ８^-の発現比率は、ＮＴ(＋)群とＮＴ(−)群で変わらなかった。γδ-ＩＥＬＣＤ４^-ＣＤ８^-は、ＮＴ(＋)群で僅かに増加したが有意差はなかった（データは示さない）。
【００６６】
これらの結果は、核酸の経口摂取による、γδ-ＩＥＬサブセットの優位な誘導が、γδ-ＩＥＬにおけるＣＤ８αα⁺の有意(ｐ＜０.０５)な上昇およびαβ-ＩＥＬにおけるＣＤ８αα⁺の有意（ｐ＜０.０５）な低下、と相関していることを示している。
【００６７】
［試験例３］ＩＥＬのＴＣＲサブセット発現に及ぼす影響卵白アルブミン（ＯＶＡ）特異的ＴＣＲを発現するＴＣＲトランスジェニックマウス（ＯＶＡＴＣＲ-Ｔｇマウス）（ＯＶＡ２３-３；Sato, T. et al.: Eur.J. Immun., 24: 1512-1516, 1994）を用いた。
【００６８】
３週齢の雌性ＯＶＡ-ＴＣＲ Ｔｇマウスは、ＮＴ(−)群(ｎ=１０)、およびＮＴ(＋)群(ｎ=７)の２群に分けた。ＮＴ(−)、あるいはＮＴ(＋)を４週間自由摂取させた。この期間中、２％ＯＶＡを含む水を自由摂取させた。その後、ＯＶＡ-ＴＣＲ Ｔｇマウスは殺し、腸を摘出し、試験例１と同様にＩＥＬを調製した。
【００６９】
ＩＥＬのＴＣＲサブセットの発現比率（％）、およびαβ-ＩＥＬとγδ-ＩＥＬのＣＤ４とＣＤ８サブセットの発現比率を、ＦＡＣＳで個体別に解析した。αβ-ＩＥＬのＮＴ(−)群とＮＴ(＋)群における発現率、およびγδ-ＩＥＬのＮＴ(−)群とＮＴ(＋)群における発現率を図４に示す。また、αβ-ＩＥＬのＮＴ(−)群とＮＴ(＋)群におけるＣＤ８αα⁺サブセット発現比率、およびγδ-ＩＥＬのＮＴ(−)群とＮＴ(＋)群におけるＣＤ８αα⁺サブセット発現比率、を図５に示す。
【００７０】
図５にＮＴ(−)群のαβ-ＩＥＬにおけるＣＤ８αα⁺サブセット発現比率、γδ-ＩＥＬにおけるそれらの発現比率をそれぞれ示す。抗原を摂取したＯＶＡ-ＴＣＲ Ｔｇマウスの場合、ＩＥＬにおけるαβ-ＩＥＬサブセットの発現比率が、通常のＢＡＬＢ／ｃマウスに比較して、図１と図４に示すように、ＮＴ(−)群においては約４８％から約８３％、ＮＴ(＋)群においては約４０％から約７７％と顕著に増加した。しかし、ＮＴ(＋)群におけるγδ-ＩＥＬの発現比率はＮＴ(−)群におけるそれに比較して有意に高く（図４）、これは、ＮＴ(＋)群のγδ-ＩＥＬにおけるＣＤ８αα⁺の発現比率が、ＮＴ(−)群におけるそれに比較して有意に高い（図５）ことと相関している。
【００７１】
［試験例４］ＩＥＬにおける抗原特異的サイトカイン産生に及ぼす影響試験例３におけるＯＶＡ-ＴＣＲ Ｔｇマウスから得たＩＥＬは、１０％非働化ＦＣＳ、ペニシリン１００Ｕ/ｍｌ、ストレプトマイシン１００μg/ｍｌ、メルカプトエタノール５×１０^-5Ｍ、および２ｍＭ Ｌ-グルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０培地（Nissui, Pharmaceutical Co., Tokyo）に、５.０×１０⁵細胞/１.０ｍｌ浮遊させ、９６ウエルプレートに、それぞれ、０.２ｍｌ/ウエルまいた（duplicate）。
【００７２】
一方、抗原提示細胞として用いる脾細胞は、以下のように調製した。未感作のＢＡＬＢ/ｃマウスから脾臓を無菌的に摘出し、細かくきざんだ。細胞（１×１０⁸細胞）は、５０μg/ｍｌのマイトマイシンＣ（SIGMA, St. Louis, MO, U.S.A）を含む１ｍｌのＲＰＭＩ １６４０培地培養液中で、３７℃、４５分間インキュベートした。細胞は、0.８３％ＮＨ₄Ｃｌ溶液に浮遊させ、赤血球を溶解除去した。つぎに、細胞浮遊液は、ステンレススチールのメッシュに通し、均一の細胞浮遊液を得た。細胞は、ＲＰＭＩ-１６４０培地で２回洗浄した。マイトマイシンＣ処理した脾細胞（５×１０⁵細胞）とＴ細胞とを、５０μＭ濃度のＯＶＡ（Seikagaku Co.）の存在下、あるいは非存在下、５％ＣＯ₂/９５％ａｉｒの湿潤条件下で、３７℃２日間培養した。培養後、培養上清は、遠心して集め、−２５℃で貯蔵した。上清中のＩＦＮ-γ、およびＩＬ-２レベルをＥＬＩＳＡ法で測定した。ＩＦＮ-γについて図６に、ＩＬ-２について図７に示す。ＯＶＡ特異的ＩＦＮ-γの産生増強が、ＮＴ(−)群と比較して、有意な差はないがＮＴ(＋)群で観察された。ＮＴ(＋)群におけるＯＶＡ特異的ＩＬ-２産生は、ＮＴ(−)群よりも有意（ｐ＜０.０５）に高かった。
【００７３】
［試験例５］腸管上皮細胞のＩＬ-７産生に及ぼす影響３週齢のＢＡＬＢ/ｃマウスにＮＴ(−)(ｎ＝８)とＮＴ(＋)(ｎ＝９)をそれぞれ２週間自由摂取させた。その後、小腸を摘出し小腸上皮細胞を調製した。小腸上皮細胞の培養は、Perreaultらの方法（Perreaul, N. and Beaulieu, J. F. :Exp. Cell. Res., 245: 34-42, 1998）にしたがった。小腸を縦に開き、ＰＢＳで洗浄し、４つのセグメントにカットした。これらのセグメントは、１０ｍｌのice-cold MatriSperse(Collaborative BiomedicalProducts, Becton Dickinson Lab.)を含む１５-ｍｌチューブに移した。小腸は、４℃で８〜１０時間攪拌なしでインキュベートした。つぎに、各チューブは、穏やかに振って上皮細胞を分離した。浮遊液は、ＰＢＳで２回洗浄（４℃、１２００ｒｐｍ、８分間）した。１０％ＦＣＳ、ペニシリン１００Ｕ/ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ/ｍｌ、メルカプトエタノール５×１０^-5Ｍおよび２ｍｌ-グルタミンを添加した９６ウエルプレート中のＲＰＭＩ １６４０培地に浮遊させた。これらの上皮細胞は、５％ＣＯ₂インキュベーターに入れ、３７℃で１６時間培養した。培養上清のＩＬ-７レベルは、Sharmaらの方法（Sharma, S. et al.: Gene Therapy., 4: 1361-1370, 1997）にしたがい、ＥＬＩＳＡ法で測定した（図８）。ＮＴ(＋)群において、小腸上皮細胞のＩＬ-７産生が、ＮＴ(−)群のそれに比較して有意（ｐ＜０.０１）に増強していることが認められる。すなわち、核酸の経口摂取は小腸上皮細胞のＩＬ-７産生を増強することが明らかとなった。
【００７４】
［試験例６］核酸の経口摂取が腸管上皮細胞のＩＬ-７およびＴＧＦ-β産生に及ぼす影響３週齢の雌性ＯＶＡ-ＴＣＲ ＴｇマウスにＮＴ(−)とＮＴ(＋)をそれぞれ４週間自由摂取させた。実験期間中、２％ＯＶＡを添加した水を自由に摂取させた。その後、小腸を摘出し、４℃で８時間マトリスパーゼ中に静置した。静置後、軽く振とうし、腸管を除き、マトリスパーゼ中の小腸上皮細胞を２回洗浄した。洗浄後、小腸上皮細胞を１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ-1640培地またはＦＣＳを含まないＲＰＭＩ-1640培地で１６時間培養した。培養後、上清中のＩＬ-７およびＴＧＦ-βをＥＬＩＳＡで測定した。その結果、小腸上皮細胞のＩＬ-７産生は、ＮＴ(+)食群の方がＮＴ(-)食群に比べて有意（ｐ＜０.０１）に高くなった（図９）。また、小腸上皮細胞のＴＧＦ-β産生も、ＮＴ(+)食群の方がＮＴ(-)食群に比べて有意（ｐ＜０.０５）有意に高くなった（図１０）。
【００７５】
［試験例７］抗原特異的ＩｇＡ抗体産生に及ぼす影響３週齢の雌性ＯＶＡ-ＴＣＲ Ｔｇマウス にＮＴ(−)（ｎ＝１８）とＮＴ(＋)（ｎ＝１６）を自由摂取させた。実験期間中、２％ＯＶＡを添加した水を自由に摂取させた。６、７、８週齢で糞便を採取し、ＯＶＡ特異的ＩｇＡ抗体をＥＬＩＳＡ法で測定した。結果を図１１に示す。ＯＶＡ特異的ＩｇＡ抗体は、８週齢でＮＴ(＋)食群の方が有意に高くなった。したがって、核酸の経口摂取は、腸管免疫系の抗原特異的ＩｇＡの産生を増強することが明らかとなった。
【００７６】
［試験例８］マクロファージの機能に及ぼす影響Whey Protein Isolate（ＷＰＩ）をタンパク源としたヌクレオチド無添加の食餌 (ＮＴ(-)食) および以下の割合で配合したヌクレオチドを０.４％添加した食餌 (ＮＴ(+)食) をそれぞれ１群６匹でＯＶＡ-ＴＣＲ Ｔｇマウスに３週齢から自由摂取させた。なお、このとき２％ＯＶＡ水溶液を自由摂取させた。チオグリコレートを腹腔投与し、投与後４日後（７週齢）に腹腔マクロファージを採取した。このマクロファージをＬＰＳ（0.1μg/mlおよび1μg/ml）刺激下で２日間培養し、その上清のＩＬ-１２活性をBioassay法で測定した。マウスＩＬ-１２のbioassayは、Skeenら (Skeen, M.J.ら, J Immunol 156:1196 - 1206, 1996) の方法で行った。すなわち、９６ウェルプレートに10μg/mlの抗ＩＬ-１２p40抗体をコーティングした。ウェルを洗浄し、様々な濃度のリコンビナントＩＬ-１２ (rＩＬ-１２) 、脾臓またはマクロファージの培養上清をウェルに加え、プレートを一晩インキュベートした。正常マウスの脾臓細胞を、CO2インキュベーター中で37℃２日間の培養後、培養上清を回収し、ＩＦＮ-γ濃度をELISAで測定した。既知のrＩＬ-１２濃度とＩＦＮ-γ濃度との検量線から上清中のＩＬ-１２濃度を外挿した。コーティングした抗体に、ＩＬ-１２p40とp70が結合するが、ＩＬ-１２p70だけがＩＦＮ-γ産生を誘導できる。その結果、ＬＰＳ濃度が0.1μg/mlでも1μg/mlいずれでも、ＩＬ-１２活性については、ＮＴ(+)食群の方が、ＮＴ(-)食群より有意に高くなった (図１２)。
【００７７】
［試験例９］マクロファージの機能に及ぼす影響８週齢の雌性ＢＡＬＢ/cマウスにチオグリコレートを腹腔投与し、４日後（７週齢）、腹腔マクロファージを採取した。この腹腔マクロファージをヌクレオチド（０〜１０μg/ml）とともに１日間培養し、その上清中のＩＬ-１２活性をBioassay法で測定した。その結果、0.３２〜１０μg/mlのヌクレオチドを添加したときのＩＬ-１２活性は、ヌクレオチドを添加していない場合に比べて、有意差は見られないものの高くなる傾向が見られた(図１３)。
【００７８】
［試験例１０］脾細胞におけるサイトカイン産生に及ぼす影響Whey Protein Isolateをタンパク源としたヌクレオチド無添加の食餌 (ＮＴ(-)食) および上記の割合で配合したヌクレオチドを０.４％添加した食餌 (ＮＴ(+)食) をそれぞれ3週齢のＯＶＡ-ＴＣＲ Ｔｇマウス（１群６匹）に、２％ＯＶＡ水溶液とともに自由摂取させ、７週齢で脾臓細胞を採取した。この脾臓細胞をＯＶＡ（100μg/ml）刺激下で2日間培養し、その上清のＩＬ-１２活性をBioassay法で測定した。その結果、脾臓細胞のＩＬ-１２活性については、ＮＴ(+)食群の方が、NT(-)食群より有意に高くなった (図１４)。
【００７９】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【００８０】
［実施例１］核酸関連物質として、下記の配合割合の核酸混合物を0.０１％の割合で市販の育児用調製粉乳（明治乳業 (株) 製）に配合した。
シチジン5' - 一リン酸 1.62g/kgグアノシン5' - 一リン酸 0.57g/kgイノシン5' - 一リン酸 1.10g/kgウリジン5'-一リン酸 0.71g/kg粉乳１gあたり、0.1mg、好ましくは0.01〜4mgを使用すればよい。また、一般に核酸関連物質の構成成分である塩基は、魚介類や肉などの食品に含まれているので安全である。したがって、上記範囲を越えて使用しても何ら差し支えはないし、予防ないし保健を目的とする場合は、上記範囲よりも少量使用してもよい。また、育児用粉乳以外の飲食品を調製する場合も、上記範囲を参考にしてヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸 または塩基の使用量を定めればよい。
【００８１】
［実施例２］アレルゲンとなるタンパク質を酵素分解した育児用調製粉乳（明治乳業 (株) 製; 調製粉乳A、調製粉乳B）に、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸(RNA、DNA) またはその構成成分である塩基の混合物0.01%を配合した。この場合、調製粉乳Aは乳清タンパク質を酵素分解し、調製粉乳Bはカゼインを酵素分解したものである。しかし、酵素分解するタンパク質に制限はないし、分解に用いる酵素にも制限はない。製品の配合組成は下記表1の通りである。なお、ヌクレオチドの配合割合は実施例1の通りである。なお、本発明による育児用粉乳を製造するにあたり、核酸関連物質の構成成分である塩基は、上記の使用量を１例として使用することができるが、本発明においては、粉乳1gあたり、0.1mg、好ましくは0.01〜4mgを使用すればよい。また、上記範囲を越えて使用しても何ら差し支えはないし、予防ないし保健を目的とする場合は、上記範囲よりも少量使用してもよい。
【００８２】
［実施例３］ビタミンC40gまたはビタミンCとクエン酸の等量混合物40g、グラニュー糖100g、コーンスターチと乳糖の等量混合物60gに、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸 (RNA、DNA)またはその構成成分である塩基を40g加えて十分に混合した。混合物を袋に詰め、1袋1.5gのスティック状栄養健康食品を100袋製造した。
【００８３】
［実施例４］次の配合によりTCRγδ陽性Ｔ細胞とTCRαβ陽性Ｔ細胞の比率を高める製剤を製造した。(1)ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸 (RNA、DNA)またはその構成成分である塩基50g、(2)ラクトース90g、(3)コーンスターチ29g、(4)ステアリン酸マグネシウム1g。先ず、(1)、(2)、(3) (但し17g) を混合し、(3) (但し7g) から調製したペーストとともに顆粒化した。得られた顆粒に (3) (但し5g) と (4) を加えてよく混合し、この混合物を圧縮錠剤機により圧縮して、1錠あたりヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸 (RNA、DNA)またはその構成成分である塩基を10mg含有する錠剤100個を製造した。投与量は、患者の症状、年齢によっても異なるが、0.1〜1500mg/kg/dayで1日1〜4回投与する。本発明において用いるヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸 (RNA、DNA)、塩基は、本来食品由来のものであり、既述のように安全性にはほとんど問題はなく、したがって、上記容量を越えて、投与しても差し支えはない。また、健康の維持増進、保健栄養剤等としてこれを利用する場合は、上記容量より少ない量を長期間にわたって服用すればよい。また、既述のように本発明による錠剤は、経口投与以外の方法でも投与することができるが、静脈投与および筋肉投与の場合は0.01〜1200mg/kg/dayである。
【００８４】
［実施例５］次の配合を用意した。(1)ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸 (RNA、DNA)またはその構成成分である塩基 1g、(2)塩化ナトリウム 8g、(3)クロロブタノール 4g、(4)炭酸水素ナトリウム 1g。全成分を蒸留水1000mlに溶解し、これを500mlの点滴ビン2本に分注し、TCRγδ陽性Ｔ細胞とTCRαβ陽性Ｔ細胞の比率を高め、IgA抗体の産生を促進する製剤を製造した。
【００８５】
［実施例６］次の配合を用意した。(1)ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸 (RNA、DNA)またはその構成成分である塩基 0.5g、(2)殺菌乳 1l 。(1)を(2)に無菌的に混合し、ビン詰めした。本発明においては、殺菌乳 1l あたり、(1)を 0.01〜10gを混合すればよい。
【００８６】
［実施例７］実施例1の配合割合のヌクレオチドを有効成分として用い、下記に示す組成にて皮膚外用剤を調製した。処方例の配合中、「適量」とは、全体で100％重量になる量を意味する。
【００８７】
処方例１ クリーム（１）
Ａ （重量％） モノステアリン酸 ポリエチレングリコール（40.E.O) ２.０ 自己乳化型モノステアリン酸グリセリン ５.０ ステアリン酸 ５.０ ベヘニルアルコール １.０ 流動パラフィン １０.０ トリオクタン酸グリセリル 1 ０.０ ビタミンE ０.１ ヌクレオチド １.０Ｂ グリセリン ５.０ エチルパラベン ０.１ 精製水 適量Ａに属する成分を加熱溶解する。別に、Ｂに属する成分を加熱溶解する。ＡにＢを添加して撹拌、乳化後、冷却してクリームを製造した。
【００８８】
処方例２ クリーム（２）
Ａ （重量％）
モノステアリン酸 ポリエチレングリコール（40.E.O） ２.０ 自己乳化型モノステアリン酸グリセリン ５.０ ステアリン酸 ５.０ ベヘニルアルコール １.０ 流動パラフィン １０.０ トリオクタン酸グリセリル １０.０ ビタミンE ０.２ ヌクレオチド ０.５Ｂ グリセリン ５.０ エチルパラベン ０.１ 精製水 適量Ａに属する成分を加熱溶解する。別に、Ｂに属する成分を加熱溶解する。ＡにＢを添加して撹拌、乳化後、冷却してクリームを製造した。
【００８９】
処方例３ 乳液Ａ （重量％）
モノステアリン酸 ポリオキシエチレンソルビタン（20.E.O） １.０ モノステアリン酸 ポリオキシエチレンソルビタン（60.E.O） ０.５ 親油型モノステアリン酸グリセリン １.０ ステアリン酸 ０.５ ベヘニルアルコール ０.５ アボガド油 ４.０ トリオクタン酸グリセリル ４.０ ヌクレオチド ５.０Ｂ １, ３ - ブチレングリコール ５.０ エチルパラベン ０.１ 精製水 適量Ａに属する成分を加熱溶解する。別に、Ｂに属する成分を加熱溶解する。ＡにＢを添加して撹拌、乳化後、冷却して乳液を製造した。
【００９０】
処方例４ 化粧水Ａ （重量％）
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（60.E.O） ８.０ エタノール １５.０ ヌクレオチド ０.１ エチルパラベン ０.１ クエン酸 ０.１ クエン酸ナトリウム ０.３ １, ３ - ブチレングリコール ４.０ エデト酸二ナトリウム ０.０１ 精製水 適量上記の各成分を混合、均一に撹拌、溶解し、化粧水を製造した。
【００９１】
処方例５ 親水性軟膏Ａ （重量％）
ポリオキシエチレンセチルエーテル ２.０ グリセリンモノステアレート １０.０ 流動パラフィン １０.０ ワセリン ４.０ セタノール ５.０ ヌクレオチド ３.０Ｂ プロピレングリコール １０.０ メチルパラベン ０.１ 精製水 適量Ａに属する成分を加熱溶解する。別に、Ｂに属する成分を加熱溶解する。ＡにＢを添加して撹拌、乳化後、冷却して親水性軟膏を製造した。本発明においては、実施例1の配合割合のヌクレオチドだけでなく、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸 (RNA、DNA)またはその構成成分である塩基いずれを用いてもよい。また、上記範囲を越えて使用しても何ら差し支えはないし、上記範囲よりも少量使用してもよい。好ましくは、皮膚外用剤1gあたり、ヌクレオチド、ヌクレオシド、核酸 (RNA、DNA)またはその構成成分である塩基を0.1〜100mg使用すればよい。
【００９２】
【発明の効果】
核酸組成物の経口摂取により、ＩＥＬにおけるαβ-ＩＥＬとγδ-ＩＥＬのサブセット構成比がγδ-ＩＥＬが高められる方向にシフトすることが明らかにされた。さらに、核酸組成物の経口摂取により、腸管上皮におけるサイトカイン（ＩＬ-２、ＩＬ-７、ＩＦＮ-γ、ＴＧＦ-βなど）の産生が亢進することが明らかにされた。さらに、腸管における抗原特異的分泌型ＩｇＡ抗体の産生が亢進することが明らかにされた。これらの結果、有効量の核酸の経口摂取により、腸管免疫系に抗原特異的な分泌型ＩｇＡ抗体産生を促進して、有害な病原体などに対する防御能を高め、一方、抗原特異的な経口免疫寛容を効果的に誘導し、さらに、Ｔｈ１/Ｔｈ２細胞のバランスの破綻を改善し、結果、腸管免疫系、あるいは全身免疫系を賦活化することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ３週齢の雌性ＢＡＬＢ/ｃマウスに、ヌクレオチド非添加食餌［ＮＴ(−)］、あるいはヌクレオチド添加食餌［ＮＴ(＋)］を、２週間自由摂取させた後の、ＮＴ(−)群におけるＴＣＲαβ⁺ＩＥＬとＴＣＲγδ⁺Ｔ細胞との構成比率（％）、およびＮＴ(＋)群におけるＴＣＲγδ⁺Ｔ細胞とＴＣＲγδ⁺Ｔ細胞との構成比率（％）、をそれぞれ示す（平均値±ＳＥ;ｐ＜０.０５）。
【図２】 同上の、ＮＴ(−)群におけるＩＥＬのＴＣＲαβ⁺Ｔ細胞とＴＣＲγδ⁺ＩＥＬとの比、およびＮＴ(＋)群におけるＴＣＲαβ⁺Ｔ細胞とＴＣＲγδ⁺Ｔ細胞との比、をそれぞれ示す（平均値±ＳＥ;^*ｐ＜０.０５）。
【図３】 同上のＩＥＬのＣＤ４分子およびＣＤ８分子の発現パターンのうち、ＮＴ(−)群におけるＴＣＲαβ⁺ＣＤ８αα⁺Ｔ細胞とＴＣＲγδ⁺ＣＤ８αα⁺ＩＥＬの構成比率（％）、およびＮＴ(＋)群におけるＴＣＲαβ⁺ＣＤ８αα⁺Ｔ細胞とＴＣＲγδ⁺ＣＤ８αα⁺Ｔ細胞との構成比率（％）、をそれぞれ示す（平均値±ＳＥ;^*ｐ＜０.０５）
【図４】 ３週齢の雌性ＯＶＡ-ＴＣＲ Ｔｇマウスに、ＮＴ(−)、あるいはＮＴ(＋)を、２％のＯＶＡ添加した水とともに、４週間自由摂取させた後のＮＴ(−)群におけるＴＣＲαβ⁺Ｔ細胞とＴＣＲγδ⁺Ｔ細胞との構成比率（％）、およびＮＴ(＋)群におけるＴＣＲαβ⁺Ｔ細胞とＴＣＲγδ⁺Ｔ細胞との構成比率（％）、をそれぞれ示す（平均値±ＳＥ;ｐ＜０.０５）。
【図５】 同上のＩＥＬのＣＤ４分子、およびＣＤ８分子の発現パターンのうち、ＮＴ(−)群におけるＴＣＲαβ⁺ＣＤ８αα⁺Ｔ細胞とＴＣＲγδ⁺ＣＤ８αα⁺Ｔ細胞の構成比率（％）、およびＮＴ(＋)群におけるＴＣＲαβ⁺ＣＤ８αα⁺Ｔ細胞とＴＣＲγδ⁺ＣＤ８αα⁺Ｔ細胞の構成比率（％）、をそれぞれ示す（平均値±ＳＥ;^*ｐ＜０.０５）
【図６】 ３週齢の雌性ＯＶＡ-ＴＣＲ Ｔｇマウスに、ＮＴ(−)、あるいはＮＴ(＋)を、２％のＯＶＡを添加した水とともに、４週間自由摂取させた後のＮＴ(−)群におけるＩＥＬのインターフェロン-γ（ＩＦＮ-γ）産生、あるいはＮＴ(＋)群におけるＩＦＮ-γ産生をそれぞれ示す（平均値±ＳＥ）。
【図７】 同上のＮＴ(−)群におけるＩＥＬのインターロイキン２（ＩＬ-２）産生、あるいはＮＴ(＋)群におけるＩＬ-２産生をそれぞれ示す。（平均値±ＳＥ;ｐ＜０.０５）。
【図８】 ３週齢の雌性ＢＡＬＢ/ｃマウスに、ＮＴ(−)、あるいはＮＴ(＋)を２週間自由摂取させた後のＮＴ(−)群における小腸上皮細胞のインターロイキン７（ＩＬ-７）産生、あるいはＮＴ(＋)群における小腸上皮細胞のインターロイキン７（ＩＬ-７）産生をそれぞれ示す。（平均値±ＳＥ;ｐ＜０.０１）。
【図９】 経口摂取されたヌクレオチドが、OVA-TCR Tgマウス (n=10) の小腸上皮細胞のＩＬ-７産生に与える影響（**; p <０.０１）を示す。(平均値±ＳＤ)
【図１０】 経口摂取されたヌクレオチドがＯＶＡ-ＴＣＲ Ｔｇマウス(n=4) のＩＥＬのＴＧＦ-β産生に与える影響（*; p <０.０５）を示す。(平均値±ＳＤ)
【図１１】 ３週齢の雌性ＯＶＡ-ＴＣＲ Ｔｇマウスに、ＮＴ(−)、あるいはＮＴ(＋)を、２％のＯＶＡ添加した水とともに、自由摂取させ、６、７、および８週齢で、糞中のＯＶＡ特異的なＩｇＡ抗体量を測定した結果を示す（平均値±ＳＥ;p＜０.０５）
【図１２】 ３週齢の雌性ＯＶＡ-ＴＣＲ Ｔｇマウスに、ＮＴ(−)、あるいはＮＴ(＋)を、２％のＯＶＡ添加した水とともに４週間自由摂取させ後（７週齢）の腹腔マクロファージのＩＬ-１２産生を示す（平均値±ＳＥ;p＜０.０５）。
【図１３】 ヌクレオチド存在下で培養した８週齢の雌性ＢＡＬＢ/ｃマウスの腹腔マクロファージのＩＬ-１２産生を示す（平均値±ＳＥ）。
【図１４】３週齢の雌性ＯＶＡ-ＴＣＲ Ｔｇマウスに、ＮＴ(−)、あるいはＮＴ(＋)を、２％のＯＶＡ添加した水とともに４週間自由摂取させ後（７週齢）の脾細胞のＩＬ-１２産生を示す（平均値±ＳＥ;p＜０.０５）。[0001]
[Technical field to which the invention belongs]
The present invention relates to a food / beverage product having an immunostimulatory effect containing a nucleic acid composition as an active ingredient and the use of the nucleic acid composition for the production of the food / beverage product.
[0002]
[Prior art]
The intestinal tract is a digestive organ that digests and absorbs food and obtains the necessary nutrients and energy, while suppressing the immune response to beneficial food components as much as possible, while protecting against harmful pathogenic microorganisms and various toxins It is also a first class immune organ that quickly elicits a response.
[0003]
The immune organs of the intestinal tract are collectively referred to as “gut-associated lymphoid tissue (GALT)”. GALT consists of Peyer's patches, mesenteric lymphocytes, lamina propria, and intestinal epithelial cells, working in concert. Among them, Peyer's patch and intestinal epithelium are considered to be particularly important as antigen entry routes.
[0004]
In the intestinal tract immune system, the typical defense mechanism against harmful pathogenic microorganisms and toxins is a local immune response mainly based on IgA antibody production, and the typical mechanism for accepting beneficial foods is oral tolerance. .
[0005]
The IgA antibody functions to prevent pathogens from entering the intestinal mucosa, neutralize toxins, and prevent allergens from entering. These antigens are taken up from Peyer's patches, and by the action of antigen-specific T cells, B cells differentiate into IgA antibody-producing cells, and B cells migrate to the lamina propria and differentiate into IgA antibody-secreting cells.
[0006]
On the other hand, the intestinal epithelium, which is considered as another antigen invasion route, consists of intestinal epithelial cells (IEC) and intestinal intraepithelial lymphocytes, which are giant T cell populations that are embedded between them. It consists of intraepithelial lymphocytes (IEL). Most IELs are T cells. There are two types of molecules that T cells recognize antigens, namely TCR molecules, αβTCR consisting of α and β chains and γδTCR consisting of γ and δ chains. IEL T cells are significantly different in nature from the cells that make up Peyer's patches and lamina propria. Many of them are not dependent on the thymus and are presumed to have been selected by the intestinal tract. Many of them express γδTCR (γδ-IEL) and CD8αα homodimer which are hardly present in the periphery. The antigens and functions currently recognized by the IEL are hardly clarified. However, it is likely that the small intestinal epithelium present at the forefront of intestinal immune response plays an important role in characteristic intestinal immune responses such as local IgA antibody production induction and oral tolerance. Accordingly, active research has been conducted on the interaction between the epithelial cells constituting the small intestine epithelium and the IEL, and the interaction between the cytokine and the mucosal cell via its receptor.
[0007]
For example, γδ-IEL produces keratinocyte growth factor (KGF) and controls the growth and proliferation of epithelial cells (Boismenu, R. and Havran, WL: Sience, 266: 1253, 1994). TCRδ ^-/- In mice, the development of epithelial cells is reduced (Komano, H .: et al .: Proc. Natl. Acad. Sci., 92: 6147-6151, 1995), conversely, interleukin 7 secreted by epithelial cells. (IL-7) is deeply involved as a growth and activator of γδ-IEL (Fujihashi, K .: et al .: Proc. Natl. Acad. Sci., 93: 3613, 1996), IL- In mice lacking IL-7 and IL-7 receptor-specific genes, mucosal system γδ-IEL developmental decline and deficiency are observed. Mouse epithelial cells are treated with stem cell factor (SCF). This SCF is deeply involved in the growth and differentiation of γδ-IEL (Puddington, L. et al .: Immunity 1: 733, 1994). IL-2 and IL-7 synergistically produce γδ-IEL. Proliferating (Fujihashi, K. et al .: Proc. Naqtl. Acad. Sci., 93: 3613, 1996) TGF-β produced by epithelial cells as a class switch factor to IgA Provides a signal to prompt a gene conversion from μ chain of g gene into α-chain (Sonoda, E. et al .: J. Exp Med, 170:.. 1415, 1989), there are reports on.
[0008]
Therefore, it is considered that the immune function of the intestinal tract immune system is enhanced through enhancement of cytokine production in the small intestinal epithelium. Such an oral composition having an action of enhancing cytokine production is considered to be useful for preventing or improving a decrease in function of the intestinal tract immune system, or for activating immune activity. So far, there are reports on the effects of oral enteral nucleic acid administration or intravenous nucleic acid component administration on immune function (Akira Usami et al .: Chemistry and Biology. 36 (10): 620, 1998). There are no reports on the effects of oral intake of nucleic acid components on cytokine production in the intestinal epithelium.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
It is an object of the present invention to provide a nucleic acid composition that can be expected to improve, prevent, or stimulate immunosuppression of intestinal immune system function by enhancing cytokine production in the intestinal epithelium. Furthermore, an object of the present invention is to provide an oral composition containing an effective amount of the nucleic acid composition.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have increased the expression ratio of γδ-IEL in the subset composition ratio of αβ-IEL and γδ-IEL in the IEL by ingesting the nucleic acid composition. Found to shift in direction. It was also found that the ingestion of the nucleic acid composition enhances the production of IFN-γ, IL-2, IL-7, and TGF-β in the small intestinal epithelium. Furthermore, the present inventors have found that antigen-specific secretory IgA antibody production is induced by oral intake of a nucleic acid composition.
[0011]
That is, the present invention includes (1) a food and drink having an immunostimulatory effect comprising a nucleic acid composition as an active ingredient, and (2) the nucleic acid composition comprising a group consisting of a high molecular nucleic acid, a polynucleotide, a nucleotide, a nucleoside, and a nucleobase. (1) Food or drink according to (1), which is a selected nucleic acid composition, (3) Food or drink according to (1) or (2), wherein the nucleic acid composition is a mixture of nucleotides and nucleosides, (4) Nucleotides are cytidylic acid and guanyl Acid, adenyl acid (3) a food or drink comprising at least one or more of uridylic acid, and inosinic acid, (5) at least one, or two or more of cytidine, guanosine, adenosine, uridine, and inosine. (6) The food and drink according to (3), wherein (6) the immunostimulatory action increases the subset composition ratio of αβ-IEL and γδ-IEL of intestinal interepithelial T lymphocytes (IEL) in the intestinal tract immune system, (1) food or drink that shifts in the direction, (7) food or drink of (1) whose immunostimulatory action is increased production of IFN-γ, IL-2, IL-7, and TGF-β in the intestinal epithelium, ( 8) Food and beverage according to (1) whose immunostimulatory effect is enhanced production of IL-12 in macrophages and splenocytes, (9) Food and beverage according to any of (6) to (8) whose immunostimulatory effect is enhanced cellular immunity Product, ( 0) The food or drink according to any one of (1) or (6) to (8), wherein the immunostimulatory action is an intestinal regulating action, an antitumor action, an antimutagenic action, a blood pressure lowering action, an antiulcer action, or a lipid metabolism improving action, (11) Any one of (1) to (11) selected from the group consisting of foods, health foods, functional foods, dietary supplements, foods for specified health use, enteral nutrition foods, enteral nutrition, and quasi drugs (12) Use of the nucleic acid composition for producing the food / beverage product of (11). The present invention will be described in detail below.
[0012]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
T cells exert their functions by secreting cytokines. When a protein antigen is administered orally to induce a T cell response and analyze cytokines produced, antibody production helper functions, etc., it is usual to administer an adjuvant together to enhance immune capacity. In this case, the influence of the adjuvant cannot be denied. A T cell response to oral administration of protein antigen corresponds to administration without adjuvant. Recently, it has become possible to analyze a weak T cell response when a protein antigen is orally administered without using an adjuvant by using a TCR-transgenic (TCR-Tg) mouse introduced with a TCR gene. In normal mice, the frequency of antigen-specific T cells is extremely low and analysis is difficult, whereas in TCR-Tg mice, the frequency of T cells recognizing a single antigen is extremely high. Therefore, the present inventors use TCR-Tg mice (OVA-TCR Tg mice) expressing TCR that recognizes ovalbumin (OVA) in addition to normal mice, and the ingestion of nucleic acid is a TCR in the intestinal tract immune system. The effect on cell response was investigated.
[0013]
Hereinafter, the present invention will be described based on test examples. However, the present invention is not limited to these test examples, and those skilled in the art can further expand the technical scope of the present invention derived based on these test examples. Of course included.
[0014]
1) Effect of oral intake of nucleic acid on T cell subset composition in IEL 80-90% of IEL present in the intestine of mice is CD3 ⁺ T cells (this means that more than half of the T cells distributed in other biological sites are CD4 ⁺ Γδ-IEL is very large compared to peripheral blood lymphocytes, accounting for about half of them. CD3 using anti-CD4 and anti-CD8 antibodies ⁺ When T cells are stained, 1) CD4 ^- CD8 ⁺ Group (CD8 ⁺ 2) CD4 ⁺ CD8 ⁺ Group, 3) CD4 ^- CD8 ^- Group, and 4) CD4 ⁺ CD8 ^- Group (CD4 ⁺ ). In these four subset groups, αβ-IEL is CD4 ⁺ Group, CD8 ⁺ Group, CD4 ⁺ CD8 ⁺ Present in the group and γδ-IEL is CD4 ^- CD8 ⁺ Group, CD4 ^- CD8 ^- Only in groups. Table 1 shows the entire T cell subset in the mouse IEL for easy understanding.
[0015]
[Table 1]

[0016]
The diet supplemented with nucleic acids was orally ingested by normal mice for 2 weeks, and TCR subset composition in IEL was analyzed by flow cytometry (FACS).
[0017]
The expression rate (%) of αβ-IEL in the nucleic acid intake group was significantly lower (p <0.05) than that of the non-nucleic acid intake group (control group), and conversely, the expression rate of γδ-IEL was Significantly higher (p <0.05) than that of the group (FIG. 1). When this is compared with the expression ratio of αβ-IEL / γδ-IEL in the nucleic acid intake group and the expression ratio of αβ-IEL / γδ-IEL in the control group, the nucleic acid intake group is more significant than the control group (p <0). .05) (FIG. 2). These results indicate that the composition ratio of αβ-IEL and γδ-IEL in IEL shifts to a method in which γδ-IEL is increased when a diet supplemented with nucleic acid is orally ingested.
[0018]
Furthermore, the expression ratio of CD4 and CD8 in each of αβ-IEL and γδ-IEL was analyzed by individual using FACS.
[0019]
CD8αα of nucleic acid intake group in αβ-IEL ⁺ The expression rate (%) was significantly lower (p <0.05) than that of the control group, whereas the CD8αα of the nucleic acid intake group in γδ-IEL ⁺ (%) Was significantly (p <0.05) higher than that of the control group (FIG. 3).
[0020]
Data not shown, but CD8αβ in αβ-IEL between the nucleic acid intake group and the control group ⁺ There was no difference in the expression ratio of CD4, CD4 ⁺ , CD4 ⁺ CD8 ⁺ , The expression ratio of CD4 in γδ-IEL was unchanged between the nucleic acid intake group and the control group. ^- CD8 ^- Was slightly increased in the nucleic acid intake group, but was not significantly different from the control group. Therefore, in the nucleic acid intake group, CD8αα in αβ-IEL ⁺ Of CD8αα in γδ-IEL ⁺ It is considered that there is a correlation between the increase in the component ratio of γδ-IEL and the shift in the component ratio of γδ-IEL in the direction in which the expression ratio of γδ-IEL is increased. Therefore, it is considered that oral intake of nucleic acid promotes γδ-IEL development / differentiation outside the thymus.
[0021]
In addition, the effect of oral intake of protein antigens on the expression of TCR subsets in IEL and on CD4 and CD8 expression has a T cell antigen receptor (TCR) specific for ovalbumin (OVA), a major food allergen It investigated with the transgenic mouse (OVA-TCR Tg).
[0022]
OVA with a diet containing nucleic acids The IELs were prepared from OVA-TCR Tg mice that had free access to water containing water, and TCR subset composition and the respective CD4 and CD8 subset expression in αβ-IEL and γδ-IEL were analyzed individually by FACS.
[0023]
Even in the presence of oral antigen, the composition ratio of αβ-IEL and γδ-IEL shifted significantly (p <0.05) in the direction in which γδ-IEL was increased by ingestion of nucleic acid (FIG. 4). CD8αα ⁺ Expression rate (%) of CD8αα in γδ-IEL ⁺ Was significantly (p <0.05) higher than that of the control group (FIG. 5). However, the expression ratio of αβ-IEL was significantly increased in both the nucleic acid intake group and the control group as compared with normal mice (see FIGS. 1 and 4).
[0024]
On the other hand, Yamura et al. Reported that OVACR-Tg mice orally ingested OVA had OVA-specific CD4 ⁺ -It has been clarified that IEL proliferates and the ratio to the whole IEL increases (Toshishi Yamura et al .: Journal of Japanese Society for Agricultural Chemistry, 73 (5): 523-527, 1999).
[0025]
2) Effect of oral ingestion of nucleic acid on cytokine production in intestinal epithelium Prepared from IVA prepared from OVA-TCRTg mice that freely ingested water containing OVA together with diet supplemented with nucleic acids, and naïve BALB / c mice Shi Might When co-cultured mycin C-treated splenocytes (antigen-presenting cells) in the presence or absence of OVA, enhanced production of OVA-specific IFN-γ and IL-2 was observed in the nucleic acid intake group (FIGS. 6 and 7).
[0026]
This is believed to indicate that oral ingestion of nucleic acids induces a proliferative response of antigen-specific Th1-type cells in the IEL.
[0027]
Oral intake of nucleic acids significantly enhances IL-7 production in mouse small intestinal epithelial cells (p <0.01) (FIG. 8).
[0028]
In addition, IL-7 production and TGF-β production of small intestinal epithelial cells of OVA-Tg mice that freely ingested OVA-containing water with diets supplemented with nucleic acids were significantly (p <0.01) enhanced by ingestion of nucleic acids. (FIGS. 9 and 10).
[0029]
3) Effects of ingestion of nucleic acids on antigen-specific IgA antibody production
[0030]
Ingestion of nucleic acid significantly enhanced (p <0.05) production of antigen-specific IgA antibodies in the intestine compared to the control group (FIG. 11).
[0031]
Nucleotide was orally ingested into mice, and the effect of spleen cells and peritoneal macrophages on p70 type IL-12 was examined by a biological assay (Bioassay method). In addition, macrophages were cultured in vitro with nucleotides, and IL-12 activity in the supernatant was measured by the Bioassay method. The IL-12 activity of peritoneal macrophages was significantly higher in the nucleotide-treated group than in the non-nucleotide-treated group under LPS stimulation (FIG. 12). In addition, IL-12 activity when peritoneal macrophages were cultured with nucleotides in vitro tended to be higher, although no significant difference was seen compared to the case where nucleotides were not added (FIG. 13).
[0032]
IL-12 activity of spleen lymphocytes was significantly higher in the nucleotide administration group than in the nucleotide non-administration group (FIG. 14).
[0033]
From the above, oral intake of the nucleic acid composition promotes IL-12 production by macrophages and the like, IL-12 promotes differentiation from naive T cells to Th1 cells, and induces IFN-γ production from peripheral blood Therefore, it is expected that the Th1 / Th2 balance in the living body is shifted predominantly by Th1. As a result, the Th1 / Th2 balance breaks down and the Th2 dominant mutation occurs. In Prevention, improvement, or treatment of a disease caused by it, for example, an allergic disease or an autoimmune disease can be expected by ingesting a food or drink containing the nucleic acid composition in a daily diet.
[0034]
IL-12 is also known to induce IFN-γ production from quiescent T cells and NK cells, enhance NK cell activity, induce LAK cell activity, and enhance cell proliferation by lectin stimulation of quiescent T cells. By ingesting foods and drinks containing nucleic acid compositions in daily diets, the ability to eliminate microorganisms and tumor cells in vivo is enhanced, and production of viruses and tumors is enhanced through enhanced production of IFN-γ. It is expected to increase the protective ability against cells.
[0035]
From these results, oral ingestion of nucleic acids 1) increased the composition ratio of T cell αβ-IEL subset to γδ-IEL subset in IEL, which is CD8αα in γδ-IEL. ⁺ Of CD8αα in αβ-IEL ⁺ 2) promotes the production of antigen-specific IL-2 and IFN-γ in the IEL, 3) promotes the production of IL-7 and TGF-β in intestinal epithelial cells, 4) induces antigen-specific IgA antibody production, 5) enhances IL-12 production.
[0036]
On the other hand, the inventors of the present invention, in mice orally ingesting a diet containing nucleotides, 1) the ability to respond to mitogenic stimulation of Peyer's patch T lymphocytes and the ability to produce IgA are promoted under stress (fasting), 2) Suppression of IgE production in serum 3) Decrease in IgG1 / IgG2a 4) Promotion of splenocyte IFN-γ production and suppression of IL-4 production (Japanese Patent Laid-Open No. 9-323979). Furthermore, the inventors subsequently found that 1) casein-specific IgG1 did not change but IgG2a increased in the serum of mice orally ingested a diet containing nucleotides, 2) ovalbumin (OVA) specific Although IgG1 was not changed, IgG2a was increased, OVA-specific IgE was decreased, and 3) total IgE in serum was decreased (Japanese Patent Laid-Open No. 11-35468).
[0037]
On the other hand, γδ-IEL produces KGF and regulates the growth and proliferation of small intestinal epithelial cells (Boismenu, R. & Havran, WL: Science, 266: 1253, 1994; Komano, H. etal .: Proc. Natl Acad. Sci., USA, 92: 6147, 1995), promoting secretory IgA production (Fujihashi, K. et al .: J. Exp. Med., 183: 1929, 1996), induction of oral tolerance (Ke, Y. et al .: J. Immunol., 158: 3610-3618, 1997), etc., to increase the expression of γδ-IEL in IEL. of The shift is thought to be important for the activation of the intestinal immune system.
[0038]
In addition, IFN-γ produced by Th1 cells is deeply involved in the production of secretory component (SC) expressed on the basement membrane side of epithelial cells (Taguchi, T. et al .: J. Immunol). ., 3736, 1991). The SC and the dimeric IgA produced by the IgA plasma cells combine to form secretory IgA.
[0039]
In addition, epithelial cell IL-7 plays an important role in the differentiation and proliferation of γδ-IEL through IL-7 receptor (IL-7R) of γδ-IEL (Fujihashi, K. et al .: Eur. J. Immunol., 27: 2133, 1997). Furthermore, IL-2 and IL-7 act as activators for thymus-derived γδ-IEL and αβ-IEL (Okazaki, et al .: J. Immunol., 143: 2917, 1989).
[0040]
In addition, TGF-β is known as an immunosuppressive cytokine, and it is suggested that T cells secreting this cytokine suppress immune responses as regulatory T cells in oral tolerance (8). Satoshi Mura et al .: Journal of Japanese Society for Agricultural Chemistry, 73 (5): 523-527, 1999). TGF-β is known to perform class switching to IgA (Sonoda, E. et al .: J. Exp. Med., 170: 1415, 1989), and is involved in IgA in the intestinal tract. Has been suggested.
[0041]
By the way, CD4 + helper T cells are divided into Th1 cells that produce IL-2 and IFN-γ, and Th2 cells that produce IL-4, IL-5, and IL-10 by the cytokine profile to be produced and the effector function based thereon. being classified. This disruption of Th1 and Th2 balance is involved in the development of various immune diseases such as cancer, infectious diseases, allergies, autoimmune diseases, arteriosclerosis, as well as stress and immunity, transplantation immunity, and pregnancy immunity. It is known to be an important factor. Oral intake of nucleic acid is expected to improve the balance by increasing the expression of Th1, which is a balance failure to Th2 dominance in the balance of Th1 and Th2.
[0042]
In conclusion, the ingestion of an effective amount of nucleic acid promotes the production of secretory IgA antibodies specific to the intestinal tract immune system and enhances the ability to protect against harmful pathogens, etc., while antigen-specific oral tolerance is enhanced. It is expected to induce effectively, further improve the disruption of the Th1 / Th2 cell balance, and as a result, activate the intestinal tract immune system or the systemic immune system.
[0043]
As used herein, “effective amount of nucleic acid” means, for example, that the expression ratio of γδ-IEL in IEL is increased, and the production of IFN-γ, IL-2, IL-7, and TGF-β in intestinal epithelium is promoted The production of antigen-specific IgA antibody is promoted, the production of antigen-specific IgE antibody and total IgE antibody in serum is inhibited, the production of IL-4 in splenocytes is inhibited, IgG1 The effective amount can be determined by determining the effective amount by a known assay using, for example, a decrease in the ratio of / IgG2a as an index, and taking into consideration clinical symptoms and the like.
[0044]
Orally ingested nucleic acids are hydrolyzed by ribonucleases and deoxyribonucleases in pancreatic juice to become nucleotides, phosphates are removed by phosphatases to become nucleosides, and further degraded by nucleosidases to form nucleic acids and nucleobases. Becomes carbon sugar. Absorption from the gastrointestinal tract is performed as nucleotides, nucleosides.
[0045]
A base here is adenine, guanine, hypoxanthine, xanthine, cytosine, uracil, thymine. A nucleoside here is uridine, adenosine, guanosine, cytidine, lipothymidine, deoxyadenosine, deoxyguanosine, deoxyuridine, deoxycytidine, thymidine, inosine, xanthosine.
[0046]
The nucleotide as used herein refers to a compound in which phosphate is bound to the sugar moiety of the nucleoside by an ester bond, and the position of the phosphate to be bound may be anywhere, and the number of phosphates to be bound is any number. In addition, for example, a compound in which one phosphate binds to both positions 5 ′ and 3 ′ is also included in the nucleotide. In this case, the number and position of the phosphoric acid to be bonded may be anywhere.
[0047]
The nucleic acid as used herein refers to a polynucleotide such as RNA or DNA or a polynucleotide to which the above-described nucleotide is bound. The nucleic acids of the present invention include adenosine-n′-monophosphate, cytidine-n′-monophosphate, guanosine-n′-monophosphate, uridine-n′-monophosphate, thymidine-n′-monophosphate. And a nucleic acid composition comprising one or more of inosine-n′-monophosphate. Here, n ′ represents 2 ′, 3 ′, or 5 ′.
[0048]
The nucleic acid composition of the present invention contains a specific combination of nucleic acids as an active ingredient. When the combination is shown in a free form, it is as follows. The nucleic acid component conforms to the IUPAC-IUB regulations or symbols commonly used in the field.
[0049]
That is, each combination of adenosine phosphate (AMP) / cytidine phosphate (CMP) / guanosine phosphate (GMP) / uridine phosphate (UMP) / inosine-n′-monophosphate (IMP). Each component in these combinations includes known nucleosides, nucleotides, or nontoxic salts thereof.
[0050]
In addition, if the mixing ratio of the nucleic acid component is expressed by, for example, the molar ratio of the nucleic acid, the molar ratio is determined by determining the type and mixing amount of the nucleic acid component in the above assay system and further taking into account the patient's disease state and the like. can do. As an example of these preferable combinations, it is IMP: AMP: GMP: CMP: UMP: AMP = 1-4: 1-4: 1-4: 1-4 as a molar ratio. As a more preferred example, GMP: CMP: UMP: IMP = 1: 3 to 4: 1 to 2: 1 to 3.
[0051]
A person skilled in the art can appropriately determine the optimal selection or combination of these nucleobases using the above assay system. Therefore, the nucleic acid composition thus obtained is also included in the present invention.
[0052]
The nucleic acid is not limited in its origin, and examples thereof include yeast, bacteria, milk, seafood, animals, and plants. When used as a food-and-drink type nucleic acid composition, an effective amount of the nucleic acid component (processed product thereof) can be used as it is, or in combination with other foods or food components, and used according to conventional methods. . The composition according to the present invention using an effective amount of the nucleic acid component may be solid (powder, granule, etc.), paste, liquid or suspension, but sweeteners, sour agents, vitamins and other drinks. It is preferable to formulate a health drink using various components commonly used in production.
[0053]
For the purpose of stimulating the intestinal tract immune system (antigen-specific IgA antibody production and immune tolerance), an effective amount of nucleic acid is added to food, health food, functional food, dietary supplement, food for specified health use, enteral nutrition food, Or it can mix | blend for pharmaceutical preparations, such as an enteral nutrient, and quasi-drug manufacture. It is a well-known and conventional technique.
[0054]
The daily required amount of purine pyrimidine for adults is 450-700 mg, and the maximum safe amount that does not cause accumulation of uric acid is 4 g / day (Rudolph, FB et al .: Nutrition, 6: 45, 1990).
[0055]
[Test Examples] Hereinafter, test examples regarding the effect of oral intake of nucleic acids on the immune system will be shown, but the present invention is not limited to these test examples.
[0056]
Statistical processing Statistical significance of the data was determined by Student's test. Values at p <0.05 were considered significant.
[0057]
Flow cytometry Primary antibodies include biotinylated anti-mouse TCRβ (H57-597) (PharMingen, San Diego, CA, USA), biotinylated anti-mouse CD4 (H129.19) (PharMingen), and biotinylated anti-mouse IL-2R antibody (CD25). (7D4) (PharMingen) was used. All incubations were done in the dark. Cells were incubated with ice or isotype control antibody for 30 minutes on ice. After washing the cells with Hank's balanced salt solution, Fluorescein isothiocyanate (FITC) -labeled anti-mouse TCRδ antibody (GL3) (Cedar Lane Lab.), FITC-labeled anti-mouse CD4 (H129.19) (PharMingen), phycoerythrin (PE) -labeled anti-mouse Mouse CD8α (53-6.7) (GIBCO, Grand Island, NY, USA), FITC-labeled anti-mouse CD8β (Y8.77) (Seikagaku Co., Tokyo, Japan), PE-labeled anti-mouse TCRβ, (H87-597) ) (PharMingen), and streptavidin-Red 670 (GIBCO), and incubated on ice for 30 minutes. Cells were washed by centrifugation. The stained cells were analyzed for a subset of IELs by flow cytometry with three colors (Becton Dickinson FACSort). Lysis II software was used for the analysis.
[0058]
Cytokine assay (ELISA) As an assay buffer, a phosphate buffer solution (pH 7.4) containing 3% polyethylene glycol 6000 (Nacalai Tesque Inc., Japan) was used (assay buffer). As a washing buffer, a phosphate buffer solution (pH 7.4) containing 0.05% Tween-20 (PBS-0.05% Tween) was used. IFN-γ and IL-2 were measured by ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Rat anti-mouse IFN-γ antibody (6A2) (PharMingen), rat anti-mouse IL-2 antibody (JES6-1A12) (PharMingen), biotinylated rat anti-mouse IFN-γ antibody (XMG1.2) (PharMingen), biotin Rat anti-mouse IL-2 antibody (JES6-5H4) (PharMingen) was used. Rat anti-mouse IFN-γ antibody (1 μg / ml) diluted with 0.05 M Tris buffer (pH 8.9), or 0.1 M NaHCO 3 _Three Rat anti-mouse IL-2 antibody (1 μg / ml) diluted in 1 was dispensed into each well of a microtiter plate (Nunc, Roskilde, Denmark). Incubate overnight at 4 ° C. to allow the antibody to adsorb to the wells. After washing the wells, assay buffer containing 5% FCS was added and blocked for 1 hour at room temperature. After washing the wells, the culture supernatant diluted with assay buffer was added to each well and incubated for 2 hours. After washing the wells, biotinylated anti-mouse IFN-γ antibody or biotinylated anti-mouse IL-2 antibody diluted with assay buffer was added to each well and incubated for 2 hours. After washing, alkaline phosphatase-labeled streptavidin (Zymed Lab., South San Francisco, Calif., USA) diluted with assay buffer was added to each well for reaction. After washing the wells, a substrate solution [0.1% 4-nitrophenyl phosphate (Tokyo Kasei Co.) dissolved in 0.1 M diethanolamine buffer (pH 9.8)] was added to each well and incubated at room temperature for 1 hour. . The reaction was stopped by adding 5N-NaOH, at 405 nm. Absorbance value Was measured. IL-7 and TGF-β were measured by ELISA.
[0059]
0.1M NaHCO _Three The anti-mouse IL-7 antibody solution (2 μg / ml) (Genzyme) diluted in 1 was dispensed into each well of a microtiter plate (Nunc) and incubated overnight at 4 ° C. to adsorb the antibody to the well. After washing the wells, assay buffer containing 10% OVA was added to the wells and blocked for 1 hour at room temperature. After washing the wells, culture supernatant diluted with assay buffer containing 0.1% Tween 20 was added to the wells and incubated for 2 hours. After washing the wells, dilute with assay buffer containing 0.1% Tween20. The Sheep anti-mouse IL-7 antibody (1 μg / ml) (R and D, Minneapolis, Minn., USA) was added to each well and incubated for 2 hours. After washing the wells, biotinylated anti-sheep IgG antibody diluted with assay buffer containing 0.1% Tween 20 was added to each well and allowed to react for 15 minutes. After washing the wells, alkaline phosphatase labeled streptavidin diluted with assay buffer was added to each well. After washing the wells, as with IFN-γ and IL-2, a substrate solution was added to each well, and at 405 nm Absorbance value Was measured.
[0060]
[Test Example 1] Effect of IEL on TCR subset expression Three-week-old female BALB / c mice [SLC, Hamamatsu, Japan] were fed with a non-nucleotide-added diet [NT (−)] group (n = 4) and nucleotides. The additive diet [NT (+)] group (n = 4) was randomly divided into two groups. NT (-) or NT (+) was ingested freely for 2 weeks each. The nucleotide [Yamasa Co. (Chosi, Japan)] composition is shown in Table 2.
[0061]
[Table 2]

[0062]
Table 3 shows the diet composition based on whey protein (WPI) [Davisco, International Inc. (Le Sueur, MN, USA)] containing the nucleotides.
[0063]
[Table 3]

[0064]
After ingestion of the diet, the small intestine was excised and IEL was prepared according to the method of Nanno et al. (Nanno, M. et al .: J. Immunol., 153: 2014-2020, 1994). The small intestine was removed from the mouse. After the intestinal lumen contents were washed away, the polyethylene tube was penetrated, one end was fixed, and the inside was inverted so that the lumen was on the outside. The inverted intestinal tract was divided into 4 equal parts, transferred to a 50 ml conical tube containing 45 ml of HBSS containing 5% fetal calf serum (FCS), and shaken at 135 ° C. in the horizontal direction at 37 ° C. for 45 minutes. After shaking, the mixture was filtered through a glass wool column to remove foreign substances, and the cells were collected. Cells were suspended in 30% Percoll (Pharmacia, Uppsala, Sweden) and centrifuged at 1800 rpm for 25 minutes. IEL accumulated at the boundary between 44% and 70% Percoll was collected by density gradient centrifugation using Percoll (centrifugation at 1800 rpm for 25 minutes). IEL survival CD3 ⁺ T cells were> 90%. The TCR subset composition of the obtained IEL was analyzed for each individual by flow cytometry (FACS). The expression rates of αβ-IEL in the NT (−) group and NT (+) group and the expression rates of γδ-IEL in the NT (−) group and NT (+) group are shown in FIG. Moreover, the expression ratio of αβ-IEL and γδ-IEL in the NT (−) group and the expression ratio of αβ-IEL and γδ-IEL in the NT (+) group are shown in FIG. The expression rate (%) of αβ-IEL is significantly lower (p <0.05) in the NT (+) group than that of the NT (−) group, and the expression rate of γδ-IEL is NT (+) The group was significantly (p <0.05) higher than that of the NT (−) group (FIG. 1). The expression ratio of αβ-IEL and γδ-IEL in the NT (+) group was significantly lower (p <0.05) than the expression ratio of αβ-IEL and γδ-IEL in the NT (−) group (FIG. 2). ). As a result of the above, it has been clarified that oral intake of nucleic acid induces the balance of αβ-IEL and γδ-IEL predominantly in γδ-IEL.
[0065]
[Test Example 2] Effect of IEL on CD4 and CD8 subset expression αβ-IEL is CD8αα ⁺ , CD8αβ ⁺ , CD4 ⁺ , And CD4 ⁺ CD8αα ⁺ Γδ-IEL is mostly CD8αα ⁺ And the rest is CD4 ^- CD8 ^- Yes (see Table 1). The expression rates of CD4 and CD8 of αβ-IEL and γδ-IEL in Test Example 1 were analyzed for each individual by FACS (FIG. 3). As a result, in αβ-IEL, CD8αα of NT (+) group ⁺ Is significantly lower than that of the NT (−) group, and conversely, in γδ-IEL, the CD8αα of the NT (+) group ⁺ Was significantly higher than that of the NT (-) group. On the other hand, CD8αβ in αβ-IEL ⁺ Expression ratio of CD8αβ in γδ-IEL ⁺ There was no difference in the expression ratio (data not shown). CD4 ⁺ , CD4 ⁺ CD8 ⁺ , And CD4 ^- CD8 ^- The expression ratio was not changed between the NT (+) group and the NT (-) group. γδ-IELCD4 ^- CD8 ^- Was slightly increased in the NT (+) group with no significant difference (data not shown).
[0066]
These results show that the dominant induction of the γδ-IEL subset by oral ingestion of nucleic acids is CD8αα in γδ-IEL. ⁺ Significant increase (p <0.05) and CD8αα in αβ-IEL ⁺ Is significantly correlated (p <0.05).
[0067]
[Test Example 3] Effect of IEL on TCR subset expression TCR transgenic mice (OVACRCR-Tg mice) expressing Ovalbumin (OVA) -specific TCR (OVA23-3; Sato, T. et al .: Eur. J Immun., 24: 1512-1516, 1994).
[0068]
Three-week-old female OVA-TCR Tg mice were divided into two groups, an NT (−) group (n = 10) and an NT (+) group (n = 7). NT (-) or NT (+) was ingested freely for 4 weeks. During this period, water containing 2% OVA was ad libitum. Thereafter, the OVA-TCR Tg mice were killed, the intestines were removed, and IEL was prepared in the same manner as in Test Example 1.
[0069]
The expression ratio (%) of TCR subset of IEL and the expression ratio of CD4 and CD8 subsets of αβ-IEL and γδ-IEL were analyzed for each individual by FACS. FIG. 4 shows the expression rate of αβ-IEL in the NT (−) group and NT (+) group and the expression rate of γδ-IEL in the NT (−) group and NT (+) group. In addition, CD8αα in the NT (−) and NT (+) groups of αβ-IEL ⁺ Subset expression ratio and CD8αα in NT (−) and NT (+) groups of γδ-IEL ⁺ The subset expression ratio is shown in FIG.
[0070]
FIG. 5 shows CD8αα in αβ-IEL of NT (−) group. ⁺ The subset expression ratios and their expression ratios in γδ-IEL are shown respectively. Ingested antigen In the case of OVA-TCR Tg mice, the expression ratio of αβ-IEL subset in IEL is Normal BALB / c mouse 1 and FIG. 4, the NT (−) group increased significantly from about 48% to about 83%, and the NT (+) group increased from about 40% to about 77%. However, the expression ratio of γδ-IEL in the NT (+) group is significantly higher than that in the NT (−) group (FIG. 4), which is the CD8αα in the γδ-IEL of the NT (+) group. ⁺ The expression ratio is significantly higher than that in the NT (−) group (FIG. 5).
[0071]
[Test Example 4] Influence on antigen-specific cytokine production in IEL IEL obtained from OVA-TCR Tg mice in Test Example 3 was 10% inactivated FCS, penicillin 100 U / ml, streptomycin 100 μg / ml, mercaptoethanol 5 × 10 ^-Five In RPMI 1640 medium (Nissui, Pharmaceutical Co., Tokyo) containing M and 2 mM L-glutamine, 5.0 × 10 ^Five Cells / 1.0 ml were suspended and duplicated in 96-well plates, 0.2 ml / well, respectively.
[0072]
On the other hand, splenocytes used as antigen-presenting cells were prepared as follows. Spleens were aseptically removed from naïve BALB / c mice and finely chopped. Cells (1 × 10 ⁸ Cells) were incubated at 37 ° C. for 45 minutes in 1 ml of RPMI 1640 medium culture medium containing 50 μg / ml mitomycin C (SIGMA, St. Louis, MO, USA). Cells are 0.83% NH _Four The cells were suspended in a Cl solution to lyse and remove red blood cells. Next, the cell suspension was passed through a stainless steel mesh to obtain a uniform cell suspension. Cells were washed twice with RPMI-1640 medium. Spleen cells treated with mitomycin C (5 × 10 5 ^Five Cells) and T cells in the presence or absence of 50 μM OVA (Seikagaku Co.), 5% CO ₂ The cells were cultured at 37 ° C. for 2 days under a wet condition of / 95% air. After culture, the culture supernatant was collected by centrifugation and stored at -25 ° C. The IFN-γ and IL-2 levels in the supernatant were measured by ELISA. FIG. 6 shows IFN-γ and FIG. 7 shows IL-2. Enhanced production of OVA-specific IFN-γ was observed in the NT (+) group with no significant difference compared to the NT (−) group. OVA-specific IL-2 production in the NT (+) group was significantly higher (p <0.05) than in the NT (−) group.
[0073]
[Test Example 5] Effect of intestinal epithelial cells on IL-7 production Three weeks old BALB / c mice were treated with NT (-) (n = 8) and NT ( + ) (n = 9) for 2 weeks. Thereafter, the small intestine was removed to prepare small intestinal epithelial cells. Intestinal epithelial cells were cultured according to the method of Perreault et al. (Perreaul, N. and Beaulieu, JF: Exp. Cell. Res., 245: 34-42, 1998). The small intestine was opened vertically, washed with PBS and cut into four segments. These segments were transferred to 15-ml tubes containing 10 ml ice-cold MatriSperse (Collaborative Biomedical Products, Becton Dickinson Lab.). The small intestine was incubated at 4 ° C. for 8-10 hours without agitation. Next, each tube was gently shaken to separate the epithelial cells. The suspension was washed twice with PBS (4 ° C., 1200 rpm, 8 minutes). 10% FCS, penicillin 100 U / ml, streptomycin 100 μg / ml, mercaptoethanol 5 × 10 ^-Five Suspended in RPMI 1640 medium in 96 well plates supplemented with M and 2 ml-glutamine. These epithelial cells are 5% CO ₂ It put into the incubator and culture | cultivated at 37 degreeC for 16 hours. The IL-7 level of the culture supernatant was measured by ELISA according to the method of Sharma et al. (Sharma, S. et al .: Gene Therapy., 4: 1361-1370, 1997) (FIG. 8). In the NT (+) group, it can be seen that IL-7 production of small intestinal epithelial cells is significantly enhanced (p <0.01) compared to that in the NT (−) group. That is, it was revealed that oral intake of nucleic acid enhances IL-7 production of small intestinal epithelial cells.
[0074]
[Test Example 6] Effect of oral intake of nucleic acid on IL-7 and TGF-β production of intestinal epithelial cells NT (-) and NT (+) were freely given to 3-week-old female OVA-TCR Tg mice for 4 weeks each Ingested. During the experiment period, water supplemented with 2% OVA was freely ingested. Thereafter, the small intestine was excised and placed in Matrispase at 4 ° C. for 8 hours. After standing, it was shaken lightly, the intestinal tract was removed, and the small intestinal epithelial cells in Matrispase were washed twice. After washing, small intestinal epithelial cells were cultured in RPMI-1640 medium containing 10% FCS or RPMI-1640 medium not containing FCS for 16 hours. After culture, IL-7 and TGF-β in the supernatant were measured by ELISA. As a result, IL-7 production of small intestinal epithelial cells was significantly higher in the NT (+) diet group than in the NT (−) diet group (p <0.01) (FIG. 9). In addition, TGF-β production of small intestinal epithelial cells was also significantly (p <0.05) significantly higher in the NT (+) diet group than in the NT (−) diet group (FIG. 10).
[0075]
[Test Example 7] Effect on production of antigen-specific IgA antibody Three-week-old female OVA-TCR Tg mice were allowed to freely take NT (-) (n = 18) and NT (+) (n = 16). During the experiment period, water supplemented with 2% OVA was freely ingested. Feces were collected at 6, 7, and 8 weeks of age, and OVA-specific IgA antibodies were measured by ELISA. The results are shown in FIG. OVA-specific IgA antibody was significantly higher in the NT (+) diet group at 8 weeks of age. Thus, it has been clarified that oral intake of nucleic acid enhances production of antigen-specific IgA in the intestinal tract immune system.
[0076]
[Test Example 8] Effect on macrophage function Diet containing no nucleotide (NT (-) diet) using Whey Protein Isolate (WPI) as a protein source and diet containing 0.4% of nucleotides blended in the following proportions (NT (+) diet) was allowed to be freely ingested from 3 weeks of age to OVA-TCR Tg mice in groups of 6 each. In addition, 2% OVA aqueous solution was ingested freely at this time. Thioglycolate was intraperitoneally administered, and peritoneal macrophages were collected 4 days after administration (7 weeks of age). The macrophages were cultured under LPS (0.1 μg / ml and 1 μg / ml) stimulation for 2 days, and the IL-12 activity of the supernatant was measured by the Bioassay method. Mouse IL-12 bioassay was performed by the method of Skeen et al. (Skeen, MJ et al., J Immunol 156: 1196-1206, 1996). That is, a 96-well plate was coated with 10 μg / ml anti-IL-12p40 antibody. The wells were washed and various concentrations of recombinant IL-12 (rIL-12), spleen or macrophage culture supernatants were added to the wells and the plates were incubated overnight. After normal mouse spleen cells were cultured at 37 ° C. for 2 days in a CO 2 incubator, the culture supernatant was collected, and the IFN-γ concentration was measured by ELISA. The IL-12 concentration in the supernatant was extrapolated from a calibration curve of known rIL-12 concentration and IFN-γ concentration. IL-12p40 and p70 bind to the coated antibody, but only IL-12p70 can induce IFN-γ production. As a result, regardless of whether the LPS concentration was 0.1 μg / ml or 1 μg / ml, IL-12 activity was significantly higher in the NT (+) diet group than in the NT (−) diet group (FIG. 12). .
[0077]
[Test Example 9] Effect on macrophage function Thioglycolate was intraperitoneally administered to 8-week-old female BALB / c mice, and peritoneal macrophages were collected 4 days later (7 weeks of age). The peritoneal macrophages were cultured with nucleotides (0 to 10 μg / ml) for 1 day, and IL-12 activity in the supernatant was measured by Bioassay method. As a result, IL-12 activity when 0.32 to 10 μg / ml nucleotide was added tended to be higher although no significant difference was seen compared to the case where no nucleotide was added (FIG. 13).
[0078]
[Test Example 10] Effect on cytokine production in spleen cells Dietary supplemented with nucleotides (NT (-) diet) containing Whey Protein Isolate as a protein source and diet supplemented with 0.4% of nucleotides mixed in the above ratio ( NT (+) diet) was allowed to be freely ingested together with 2% OVA aqueous solution to 3 weeks old OVA-TCR Tg mice (6 mice per group), and spleen cells were collected at 7 weeks of age. The spleen cells were cultured for 2 days under stimulation with OVA (100 μg / ml), and the IL-12 activity of the supernatant was measured by the Bioassay method. As a result, the IL-12 activity of the spleen cells was significantly higher in the NT (+) diet group than in the NT (−) diet group (FIG. 14).
[0079]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention concretely, this invention is not limited to these Examples.
[0080]
[Example 1] As a nucleic acid-related substance, a nucleic acid mixture having the following blending ratio was blended with commercially available infant formula (produced by Meiji Dairies Co., Ltd.) at a ratio of 0.01%.
Cytidine 5 '-monophosphate 1.62g / kg guanosine 5'-monophosphate 0.57g / kg inosine 5 '-monophosphate 1.10g / kg uridine 5'-monophosphate 0.71g / kg 0.1mg per gram of milk powder Preferably, 0.01 to 4 mg may be used. In general, bases that are constituents of nucleic acid-related substances are safe because they are contained in foods such as seafood and meat. Therefore, there is no problem even if it is used outside the above range, and for the purpose of prevention or health, it may be used in a smaller amount than the above range. In addition, when preparing food and drink other than infant formula, the amount of nucleotides, nucleosides, nucleic acids, or bases to be used may be determined with reference to the above range.
[0081]
[Example 2] An infant formula milk powder (manufactured by Meiji Dairies Co., Ltd .; formula milk formula A, formula milk formula B), which is obtained by enzymatic degradation of an allergen protein, with nucleotides, nucleosides, nucleic acids (RNA, DNA) or constituents thereof A base mix of 0.01% was formulated. In this case, formula milk A is obtained by enzymatic degradation of whey protein, and formula milk B is obtained by enzymatic degradation of casein. However, there is no restriction on the protein to be enzymatically degraded, and there is no restriction on the enzyme used for degradation. The composition of the product is as shown in Table 1 below. The mixing ratio of nucleotides is as in Example 1. In producing the infant formula according to the present invention, the base used as a component of the nucleic acid-related substance can be used as an example of the above-mentioned use amount, but in the present invention, 0.1 mg per 1 g of milk powder. Preferably, 0.01 to 4 mg may be used. Moreover, there is no problem even if it uses beyond the said range, and when aiming at prevention or health, you may use a small amount from the said range.
[0082]
[Example 3] 40 g of vitamin C or an equal mixture of vitamin C and citric acid, 100 g of granulated sugar, 60 g of an equal mixture of corn starch and lactose, nucleotide, nucleoside, nucleic acid (RNA, DNA) or a base that is a component thereof 40 g was added and mixed well. The mixture was packed in a bag to produce 100 bags of 1.5 g of stick-like nutritional health food.
[0083]
[Example 4] A preparation for increasing the ratio of TCRγδ positive T cells to TCRαβ positive T cells was prepared by the following composition. (1) Nucleoside, nucleoside, nucleic acid (RNA, DNA) or its constituent base 50g, (2) lactose 90g, (3) corn starch 29g, (4) magnesium stearate 1g. First, (1), (2), (3) (provided 17 g) were mixed and granulated with the paste prepared from (3) (provided 7 g). Add (3) (however, 5 g) and (4) to the resulting granule, mix well, compress this mixture with a compression tablet machine, and mix nucleotides, nucleosides, nucleic acids (RNA, DNA) or their composition per tablet. 100 tablets containing 10 mg of the base component were produced. The dose varies depending on the patient's symptoms and age, but is administered 0.1 to 1500 mg / kg / day 1 to 4 times a day. The nucleotides, nucleosides, nucleic acids (RNA, DNA), and bases used in the present invention are originally derived from foods, and as described above, there is almost no safety problem. There is no problem. Moreover, when using this as health maintenance promotion, health nutrition, etc., what is necessary is just to take | do the quantity smaller than the said capacity | capacitance over a long period of time. As described above, the tablet according to the present invention can be administered by a method other than oral administration, but 0.01 to 1200 mg / kg / day in the case of intravenous administration and intramuscular administration.
[0084]
Example 5 The following formulation was prepared. (1) Nucleoside, nucleotide, nucleoside, nucleic acid (RNA, DNA) or its constituent base 1g, (2) sodium chloride 8g, (3) chlorobutanol 4g, (4) sodium bicarbonate 1g. All components were dissolved in 1000 ml of distilled water and dispensed into two 500 ml infusion bottles to increase the ratio of TCRγδ-positive T cells and TCRαβ-positive T cells to produce a preparation that promotes IgA antibody production.
[0085]
Example 6 The following formulation was prepared. (1) Nucleoside, nucleoside, nucleic acid (RNA, DNA) or a base component 0.5 g thereof, (2) 1 l of pasteurized milk. (1) was aseptically mixed with (2) and bottled. In the present invention, 0.01 to 10 g of (1) may be mixed per liter of pasteurized milk.
[0086]
[Example 7] An external preparation for skin was prepared with the composition shown below using the nucleotides in the proportions of Example 1 as active ingredients. In the formulation of the formulation examples, “appropriate amount” means an amount that makes 100% by weight as a whole.
[0087]
Formulation Example 1 Cream (1)
A (wt%) Monostearic acid Polyethylene glycol (40.EO) 2.0 Self-emulsifying glyceryl monostearate 5.0 Stearic acid 5.0 Behenyl alcohol 1.0 Liquid paraffin 10.0 Glyceryl trioctanoate 1 0.0 Vitamin E 0.1 Nucleotide 1.0B Glycerin 5.0 Ethylparaben 0.1 Purified water Dissolve ingredients belonging to appropriate amount A by heating. Separately, the component belonging to B is dissolved by heating. B was added to A, stirred and emulsified, and then cooled to produce a cream.
[0088]
Formulation Example 2 Cream (2)
A (wt%)
Polyethylene glycol monostearate (40.EO) 2.0 Self-emulsifying glyceryl monostearate 5.0 Stearic acid 5.0 Behenyl alcohol 1.0 Liquid paraffin 10.0 Glyceryl trioctanoate 10.0 Vitamin E 0.2 Nucleotide 0 .5B Glycerin 5.0 Ethylparaben 0.1 Purified water The ingredients belonging to an appropriate amount A are dissolved by heating. Separately, the component belonging to B is dissolved by heating. B was added to A, stirred and emulsified, and then cooled to produce a cream.
[0089]
Formulation Example 3 Emulsion A (wt%)
Monostearic acid Polyoxyethylene sorbitan (20.EO) 1.0 Monostearic acid Polyoxyethylene sorbitan (60.EO) 0.5 Lipophilic glyceryl monostearate 1.0 Stearic acid 0.5 Behenyl alcohol 0.5 Avocado Oil 4.0 Glyceryl trioctanoate 4.0 Nucleotides 5.0B 1,3-Butylene glycol 5.0 Ethylparaben 0.1 Purified water The components belonging to the appropriate amount A are dissolved by heating. Separately, the component belonging to B is dissolved by heating. B was added to A, stirred and emulsified, and then cooled to produce an emulsion.
[0090]
Formulation Example 4 Lotion A (wt%)
Polyoxyethylene hydrogenated castor oil (60.EO) 8.0 Ethanol 15.0 Nucleotides 0.1 Ethylparaben 0.1 Citric acid 0.1 Sodium citrate 0.3 1,3-Butylene glycol 4.0 Edetate di Sodium 0.01 Purified water Appropriate amount Each of the above components was mixed, stirred and dissolved uniformly to produce a skin lotion.
[0091]
Formulation Example 5 Hydrophilic ointment A (wt%)
Polyoxyethylene cetyl ether 2.0 Glycerin monostearate 10.0 Liquid paraffin 10.0 Petrolatum 4.0 Cetanol 5.0 Nucleotide 3.0B Propylene glycol 10.0 Methyl paraben 0.1 Purified water Heat ingredients in appropriate amount A Dissolve. Separately, the component belonging to B is dissolved by heating. B was added to A, stirred and emulsified, and then cooled to produce a hydrophilic ointment. In the present invention, not only nucleotides in the mixing ratio of Example 1, but also nucleotides, nucleosides, nucleic acids (RNA, DNA) or bases that are constituents thereof may be used. Moreover, there is no problem even if it uses beyond the said range, and you may use a small amount from the said range. Preferably, 0.1 to 100 mg of nucleotide, nucleoside, nucleic acid (RNA, DNA) or a base component thereof may be used per 1 g of the external preparation for skin.
[0092]
【The invention's effect】
It was revealed that the ingestion of the nucleic acid composition shifted the subset composition ratio of αβ-IEL and γδ-IEL in IEL in the direction of increasing γδ-IEL. Furthermore, it has been clarified that oral intake of the nucleic acid composition enhances the production of cytokines (IL-2, IL-7, IFN-γ, TGF-β, etc.) in the intestinal epithelium. Furthermore, it has been clarified that the production of antigen-specific secretory IgA antibodies in the intestine is enhanced. As a result, oral intake of an effective amount of nucleic acid promotes the production of secretory IgA antibodies specific to the intestinal tract immune system and enhances the protective ability against harmful pathogens, while antigen-specific oral tolerance It is expected to improve the breakdown of the Th1 / Th2 cell balance and to activate the intestinal tract immune system or the systemic immune system.
[Brief description of the drawings]
[Fig. 1] NT (-) after 3-week-old female BALB / c mice were allowed to freely consume a diet without a nucleotide [NT (-)] or a diet with a nucleotide added [NT (+)] for 2 weeks. TCRαβ in group) ⁺ IEL and TCRγδ ⁺ Composition ratio (%) with T cells, and TCRγδ in NT (+) group ⁺ T cells and TCRγδ ⁺ The composition ratio (%) with T cells is shown (mean ± SE; p <0.05).
FIG. 2 Same as above, IEL TCRαβ in NT (−) group ⁺ T cells and TCRγδ ⁺ Ratio to IEL and TCRαβ in NT (+) group ⁺ T cells and TCRγδ ⁺ The ratio to T cells is shown respectively (mean ± SE; ^* p <0.05).
FIG. 3 shows TCRαβ in the NT (−) group of the expression patterns of CD4 and CD8 molecules of IEL ⁺ CD8αα ⁺ T cells and TCRγδ ⁺ CD8αα ⁺ IEL composition ratio (%) and TCRαβ in NT (+) group ⁺ CD8αα ⁺ T cells and TCRγδ ⁺ CD8αα ⁺ Each component ratio (%) with T cells is shown (mean ± SE; ^* p <0.05)
[Fig. 4] NT (-) group after 3 weeks old female OVA-TCR Tg mice were allowed to freely ingest NT (-) or NT (+) with water supplemented with 2% OVA for 4 weeks. TCRαβ in ⁺ T cells and TCRγδ ⁺ T cell composition ratio (%) and TCRαβ in NT (+) group ⁺ T cells and TCRγδ ⁺ The composition ratio (%) with T cells is shown (mean ± SE; p <0.05).
FIG. 5 shows TCRαβ in the NT (−) group among the expression patterns of CD4 molecule and CD8 molecule of IEL same as above. ⁺ CD8αα ⁺ T cells and TCRγδ ⁺ CD8αα ⁺ T cell composition ratio (%), and TCRαβ in the NT (+) group ⁺ CD8αα ⁺ T cells and TCRγδ ⁺ CD8αα ⁺ T cell composition ratios (%) are shown respectively (mean ± SE; ^* p <0.05)
FIG. 6: NT (−) after 3 weeks old female OVA-TCR Tg mice were allowed to freely ingest NT (−) or NT (+) with water supplemented with 2% OVA for 4 weeks. IEL interferon-γ ( IFN -γ) production, or in NT (+) group IFN -Gamma production is shown respectively (mean value ± SE).
FIG. 7 shows IEL interleukin 2 (IL-2) production in the NT (−) group, or IL-2 production in the NT (+) group, respectively. (Mean ± SE; p <0.05).
[Fig. 8] Interleukin 7 (IL-) of small intestinal epithelial cells in the NT (-) group after free intake of NT (-) or NT (+) for 2 weeks to 3-week-old female BALB / c mice. 7) Production or interleukin 7 (IL-7) production of small intestinal epithelial cells in the NT (+) group, respectively. (Mean ± SE; p <0.01).
FIG. 9: Effect of orally ingested nucleotides on IL-7 production in small intestinal epithelial cells of OVA-TCR Tg mice (n = 10) (**; p <0.01). (Average ± SD)
FIG. 10: Effect of orally ingested nucleotides on TGF-β production of IEL in OVA-TCR Tg mice (n = 4) (*; p <0.05). (Average ± SD)
FIG. 11: Three-week-old female OVA-TCR Tg mice were allowed to freely ingest NT (−) or NT (+) with water supplemented with 2% OVA at 6, 7, and 8 weeks of age. The results of measuring the amount of OVA-specific IgA antibody in feces are shown (mean ± SE; p <0.05)
FIG. 12 Peritoneal macrophages after 3 weeks old female OVA-TCR Tg mice were allowed to freely ingest NT (−) or NT (+) with water supplemented with 2% OVA for 4 weeks (7 weeks old). IL-12 production is shown (mean ± SE; p <0.05).
FIG. 13 8 cultured in the presence of nucleotides Shown is IL-12 production of peritoneal macrophages of week-old female BALB / c mice (mean ± SE).
FIG. 14: Splenocytes after 3-week-old female OVA-TCR Tg mice were allowed to freely take NT (−) or NT (+) with water supplemented with 2% OVA for 4 weeks (7-week-old). IL-12 production is shown (mean ± SE; p <0.05).

Claims (3)

A mixture in which nucleotides having purine bases and nucleotides having pyrimidine bases are blended at a ratio of 2: 1 to 6, wherein the effective intake is 0.1 to 1500 mg / kg of infant body weight. Intestinal immunity stimulating composition for infants . Intestinal immunity activation action shifts the subset composition ratio of αβ-IEL and γδ-IEL of intestinal interepithelial T lymphocytes (IEL) in the intestinal immunity system to increase γδ-IEL, and produces antigen-specific secretory IgA The intestinal immunity activation composition for infants of Claim 1 which promotes . The intestinal tract immune activation composition for infants according to claim 1 or 2 , wherein the intestinal immunity activation action is enhanced production of IFN-γ, IL-2, IL-7 and TGF-β in the intestinal epithelium.

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