JP3980101B2 - 結晶質アントラサイクリン抗生物質およびその製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アントラサイクリン抗生物質の新規な結晶質およびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
次式（Ｉ）
【０００３】
【化２】
【０００４】
で表されるアントラサイクリン抗生物質［３′−デアミノ−３′−（４−モルホリニル）−１３−デオキソ−１０−ヒドロキシカルミノマイシン：以下、「ＭＸ２」と略記する］は、次式（ＩＩ）
【０００５】
【化３】
【０００６】
で表される１３−デオキソ−１０−ヒドロキシカルミノマイシン（以下、「５Ｃ」と略記する）から化学合成的に転化されている化合物であり、その優れた抗腫瘍性が注目されている（例えば、特開平５−３１０７７２号公報参照）。
【０００７】
しかし、提供されている固形ＭＸ２は、非晶質粉末であるか、あるいは一応結晶質に分類されるとしても吸湿性が高くしかも安定性に劣るものにすぎない。ＭＸ２を医薬品として製剤化するとの観点に立てば、その最終原末であるか否かを問わず、中間製品であっても、それらが備える性質は重要な意義をもつことになる。例えば、化学安定性に劣る場合には保存に厳重な注意を要することになり、吸湿性が高いと取り扱いが困難となり、また残存溶媒が認められる場合には、医薬品としての用途を考慮すると、致命的な短所にもなりかねないからである。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
すなわち、本発明の目的は少なくとも化学安定性に優れ、好ましくは、さらに吸湿性が低くしかも残存溶媒が実質的に認められないＭＸ２の固形製品を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく検討を重ねてきたところ、容易に製造できるＭＸ２の特定の結晶形態が優れた化学安定性を示し、またその中の一種は吸湿性が低く、残存溶媒の問題も解消できることを見い出した。
【００１０】
したがって、本発明によれば、ＭＸ２の結晶質であって、Ｘ線粉末回折法により測定した場合の特徴的な２θ値（°）として
（Ａ） 少なくとも５.０８、７,２０、９.７６および１９.００またはそれらに近似した値を示すか、あるいは
（Ｂ） 少なくとも６.６６、１０.６８、１１.４２、１３.４０、１７.１０、１９.４２、２０.００および２２.８６またはそれらに近似した値を示す、
結晶質が提供される。
【００１１】
また本発明によれば、ＭＸ２の含有溶液または懸濁液から上記結晶質を製造する方法であって、
前記含有溶液または懸濁液の溶媒が、メタノール、クロロホルム−メタノール（容量比、１：５以上）の混合液およびアセトンからなる群より選ばれ、そして前記含有溶液または懸濁液が晶析法に供される段階を含んでなる方法も提供される。
【００１２】
【発明の具体的な記述】
本発明によるＭＸ２の結晶質は、Ｘ線粉末回折法（デバイ−シェラー法）により測定した場合に、特徴的２θ値（°）として、
（Ａ） 少なくとも５.０８、７.２０、９.７６および１９.００またはそれらに近似した値を示すか、あるいは
（Ｂ） 少なくとも６.６６、１０.６８、１１.４２、１３.４０、１７.１０、１９.４２、２０.００および２２.８６またはそれらに近似した値を示す点に特徴を有する（図１参照：図中の▲３▼が（Ａ）に相当し、▲４▼及び▲５▼が（Ｂ）に相当する）。なお、本明細書において２θを記載する際に、「少なくとも」と規定するのは、本発明に従う結晶質は特徴的なピーク値として、少なくとも列挙した２θを示すことを意味し、また「それらに近似した値」とは、測定機器もしくは試料の調製条件等の相違に基いて、生じうる変動の範囲内にある値を意味する。なお、上記値は、ＪＯＥＬ ＪＤＸ８０３０型Ｘ線回折装置（日本電子株式会社製）を使用し、ステップ角度０.０２°、係数時間１.０秒、管電圧４０.０ｋＶ、管電流２０.０ｍＡで測定したときの特徴的な値いである。
【００１３】
これらの結晶質は、従来のＭＸ２の無定形粉末（図１の▲１▼に相当）および一応結晶質と認められるもの（図１の▲２▼に相当）と、それらの結晶形態が明確に区別される。そして後述するように、（Ａ）の結晶質は吸湿性においては、従来法によるものに比べて特に優れているとはいえないのにもかかわらず、化学的安定性に極めて優れた特性を有し、そして（Ｂ）の結晶質は、吸湿性および化学的安定性の両者において、極めて優れた特性を有する。したがって、本発明の目的上、（Ｂ）の結晶質が特に好ましい。
【００１４】
上記本発明の結晶質は、もう一つの本発明である結晶質の製造方法によって、有利に提供できる。従来法によれば、相対純度が９０％を超えるＭＸ２含有濃厚溶液（クロロホルム溶液）へ単に過剰のヘキサンを加えて沈殿を得ることにより、主として実質的に無定形の粉末が提供されていた（特開平５−３１０７７２号公報参照）か、あるいは、ＭＸ２のクロロホルム（過剰）−メタノール溶液（例えば、容量比、９：１）に、それらの総容量を若干上回るメタノールを添加することにより晶析して結晶質（図１の▲２▼に相当）を得ていた（最終クロロホルム−メタノール容量比 １３：１４）。
【００１５】
しかし本発明によれば、無定形ＭＸ２粉末をアセトンに懸濁させて（例えば、相対純度が９０％を超えるＭＸ２粉末対アセトンが重量比で、１：１０〜１：１００）結晶転移させるか、あるいはＭＸ２粉末を熱メタノールに溶解（例えば、上記ＭＸ２粉末対メタノールが重量比で、１：４００〜１：８００）した後、放冷するか、またはＭＸ２粉末をメタノールに懸濁させて（例えば、上記ＭＸ２粉末対メタノールが重量比で、１：１０〜１：１００）結晶移転させるか、あるいはＭＸ２粉末をクロロホルムに溶解した後（例えば、上記ＭＸ２粉末対クロロホルムが重量比で、１：３〜１：５０）、過剰のメタノール（クロロホルムの約１０倍重量）を添加して晶析させることにより、上記本発明の結晶質ＭＸ２を得ることができる。なお、上記アセトンを使用する方法により、図１の▲３▼に示される結晶質が得られる。
【００１６】
本発明にいう晶析法は、上記結晶転移を包含する概念で使用されていることを理解されたい。したがって、本発明の晶析法は、上記懸濁液を室温（１８〜２７℃）で数１０分、好ましくは６０分程度撹拌するか、あるいは上記溶液を氷冷（約５℃）下に静置することによって実施することができる。
【００１７】
上記ＭＸ２は、通常、５Ｃから特開平５−３１０７７２号公報に記載される方法によって化学的に転化したものが使用できる。一方、５Ｃは、特開昭６０−８３００号公報に記載される発酵法により製造される、次式（ＩＩＩ）
【００１８】
【化４】
【００１９】
の１３−デオキソ−１０−カルボキシカルミノマイシンから、特公平２−１２９５９号公報に記載の方法によって転化するか、あるいは特開昭６１−７６４９８号公報に記載の発酵法により直接得ることができる。
【００２０】
したがって、ＭＸ２の製造原料である５Ｃは、通常の発酵法により副生する類縁アントラサイクリンやその他の夾雑物を伴う傾向があるので、培養液から５Ｃを回収する際には十分な注意が必要である。参考までに、５Ｃの回収に関して特開昭６１−７６４９号公報に記載された方法の要約を以下に引用しておく。
【００２１】
アクチノマジュラ ロゼオビオラセエ（Actinomadura roseoviolacea）Ｒ２０×２（微工研菌寄第７１３８号）を、それ自体既知の栄養培地で好気的に培養して得られる培養物から菌体を除去して培養液を調製する。次いで、培養液を１Ｎ塩酸でｐＨ２に調整した後、吸着性多孔質ポリマー［ダイヤイオンＨＰ２０（三菱化成社製）］のカラムに通して目的物を吸着させ、次いで蒸留水および５０％メタノールで洗浄した後、メタノールで目的物を溶出し、さらに溶出液を濃縮し、濃縮液へのヘキサン添加により沈殿物として５Ｃ（該公報ではＲ２０Ｘ２と称されている）の粗標品を得ている。そして、粗標品をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで処理し、次いでシリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）にかけた後、目的画分からの溶出物をクロロホルム中での再結晶にて精製５Ｃを得ている。
【００２２】
次に、こうして得られる５ＣからのＭＸ２の製造法は、上述したとおり特開平５−３１０７７２号公報の記載に従って実施することができる。参考までに、上記方法を要約しておく。５Ｃを、例えば少量の酢酸を加えたメタノール溶媒中、ジメチルアミンボランやトリメチルアミンボランの存在下で１,４−ジオキサン−２,６−ジオールと反応させると高収率で５ＣをＭＸ２に転化することができる。反応液からのＭＸ２の回収は、クロロホルム抽出、抽出液の濃縮、濃縮液へのヘキサンの添加による沈殿の生成、次いで沈殿物の乾燥によりＭＸ２を粗粉末として得ることができる。この粗粉末は必要によりシリカゲルクロマトグラフィー等を用いてさらに精製することができる。
【００２３】
本発明の結晶質ＭＸ２を製造するために使用することのできるＭＸ２粉末としては、本発明の目的に沿う限り、上記粗粉末を初めいずれの粉末であってもよいが、通常、９２％以上の純度、好ましくは９５％以上の純度をもつものを挙げることができる。
【００２４】
【実施例】
以下、具体例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
【００２５】
例１（参考）：粗５Ｃの精製
粗５Ｃ粉末２０４ｍｇ（５Ｃ含量１５７ｍｇ、相対純度＊９２.７％、ＨＰＬＣの分析結果、５Ｃより保持時間の大きい不純物含量４.６５％）を酸性水（ｐＨ２.５、ＨＣｌ）に溶解して、この溶液をＨＰ−２０のカラム（５０ｍｌ）にかけた。同酸性水１００ｍｌで洗浄した後、メタノール−酸性水（ｐＨ２.５、ＨＣｌ）（４０：６０）１００ｍｌおよびメタノール−酸性水（ｐＨ２.５、ＨＣｌ）（７０：３０）３００ｍｌで溶出させた。得られた５Ｃ分画を４Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ８.５とし、クロロホルムで抽出、濃縮後、ヘキサンを加えて沈殿を生じさせ８８ｍｇの粉末を得た。なお、以上の処理は室温下で行った。
【００２６】
上記相対純度を質出するのに行ったＨＰＬＣの分析条件：
カ ラ ム：ＹＭＣ Ａ−３１２（ワイ・エム・シー社製）
移 動 相：アセトニトリル−水（３５：６５、ｐＨ２.０、Ｈ3ＰＯ4）
流 速：１.０ｍｌ／ｍｉｎ
検 出：ＵＶ（２５４ｎｍ）
＊相対純度：該ＨＰＬＣ分析の結果得られる５Ｃのピーク面積の総ピーク面積に対する割合
例２（参考）：５ＣからのＭＸ２の製造
５Ｃ ２００ｍｇ（０.３９ミリモル）をメタノール（２０ｍｌ）に溶解し、酢酸（２０μｌ）を加えて５℃に冷却した。メタノール１.４ｍｌに溶解した１,４−ジオキサン−２,６−ジオール１４０ｍｇ（１.１７ミリモル）及びジメチルアミンボラン４６ｍｇ（０.７８ミリモル）を上記の溶液に加えて、室温で１時間反応させた。反応終了後、０.５％リン酸水溶液（ｐＨ１.８）４０ｍｌを加えて１５分撹拌した後、水で希釈して１００ｍｌとした。この反応液を高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析系の移動相で１０倍に希釈して定量分析を行なったところ、生成したＭＸ２の収量は１５７ｍｇ（収率７９％）であった。
【００２７】
反応液１００ｍｌのうち９６ｍｌをクロロホルム１００ｍｌで洗浄した後、１規定の水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ８.０に調節し、これにクロロホルム２００ｍｌを加えて混合した。有機層を分離して水５０ｍｌで洗浄し、濃縮した後に、過剰のヘキサンを加えて沈殿を得た。この沈殿を真空乾燥することにより１９５ｍｇの粗粉末を得た。１８６ｍｇの粗粉末をシリカゲルクロマトグラフィー（和光ゲルＣ２００；５ｇ）に付し、クロロホルム−メタノール（１００：１.３５）の混合溶媒で溶出させて目的物を得た。目的物を含有する溶出分画にリン酸水溶液（ｐＨ２.５）２０ｍｌを加えて混合し、水層を分離した。この水層をクロロホルム１０ｍｌで洗浄した後、１規定の水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを８.０に調節し、クロロホルム２０ｍｌで目的物を抽出した。クロロホルム層を飽和塩化ナトリウム水溶液１０ｍｌで洗浄した後、少量に濃縮し、過剰のヘキサンを加えて沈殿を得た。この沈殿を６０℃で真空乾燥し、純粋なＭＸ２の橙色粉末１１.４ｍｇを得た。
【００２８】
例３（比較例）：無定形粉末の調製
４５ｇのＭＸ２をクロロホルム１ｌに溶解した。室温下、この溶液にヘキサン１０ｌを添加して沈殿を生じさせた後、沈殿物を濾取、乾燥（６０℃、３時間、減圧下）することにより赤褐色の粉末４２ｇを得た。この粉末のＸ線粉末回折法の測定結果は、図１の▲１▼のとおりであった。なお、測定条件は、ステップ角度 ０.０２°、計数時間 １.０秒、管電圧 ４０.０ｋＶ、管電流 ２０.０ｍＡによる（以下同じ）。
【００２９】
例４（比較例）：Ｉ型結晶質の調製
室温下、３０ｇのＭＸ２をクロロホルム−メタノール（９：１）２００ｍｌに溶解し、この溶液にメタノール２５０ｍｌを加え、５℃にて１４時間静置した。析出した沈殿を濾取、乾燥（例３に同じ）して、赤褐色の結晶性粉末２６ｇを得た。こうして得られた生成物の結晶形態をＩ型と称する（Ｘ線粉末回折法の結果は図１の▲２▼を参照されたい）。
【００３０】
例５（本発明）：ＩＩ型結晶質の調製
１０ｇのＭＸ２をアセトン２００ｍｌに懸濁し、室温下で１時間撹拌して結晶転移を起こさせた。沈殿を濾取、乾燥（例３に同じ）して、赤橙色の結晶性粉末７.７ｇを得た。こうして得られた生成物の結晶形態をＩＩ型と称する（Ｘ線粉末回折法の結果は図１の▲３▼を参照されたい）。
【００３１】
例６（本発明）：ＩＩＩ型結晶質の調製
１０ｇのＭＸ２をメタノール２００ｍｌに懸濁し、室温下で１時間撹拌して結晶転移を起こさせた。沈殿を濾取、乾燥（例３に同じ）して、赤橙色の結晶性粉末８.９ｇを得た。こうして得られた生成物の形晶形態をＩＩＩ型と称する（Ｘ線粉末回折法の結果は図１の▲４▼を参照されたい）。
【００３２】
例７（本発明）：ＩＩＩ型結晶質の調製
５０ｇのＭＸ２をクロロホルム１ｌに溶解し、室温下でメタノール１０ｌを添加した後、１時間撹拌して沈殿を生じさせた。沈殿物を濾取、乾燥（例３に同じ）して、赤橙色の結晶性粉末４５ｇを得た。この結晶性粉末は、例６で得られたものと同様のＸ線粉末回折法の結果を示した。
【００３３】
例８（本発明）：ＩＩＩ型結晶質の調製
１ｇのＭＸ２を熱メタノール５５０ｍｌに溶解した後、５℃にて１０日間静置した。沈殿を濾取、乾燥（例３に同じ）して、赤橙色の結晶０.５９ｇを得た。この結晶の形態も上記ＩＩＩ型に分類できるものであった（Ｘ線粉末回折法の結果は図１の▲５▼を参照されたい）。
【００３４】
例９：吸湿性試験
例３〜７で得られた粉末（または結晶）を、それぞれ２５℃、相対湿度３５％の条件下に１４時間保存し、含湿度を測定した。結果を下記に示す（なお、例６〜８由来の結晶は同様の結果を与えた）。
【００３５】
粉末の形態 非晶質 Ｉ型 ＩＩ型 ＩＩＩ型
含湿度（％） 1.4 2.6 3.2 0.3
上記より、ＩＩＩ型は吸湿性が極めて低いことが認められる。
【００３６】
例１０：化学的安定性試験
例９で使用したのと同じ試料（ＩＩＩ型については例６の結晶性粉末）を、それぞれ６０℃の条件下に３ケ月間気密容器中で保存し、類縁化合物の出現量をＨＰＬＣで分析定量し、試料中の含量を算出した。結果を下記に示す。
【００３７】
粉末の形態 非晶質 Ｉ型 ＩＩ型 ＩＩＩ型
類縁化合物の増加率 ( ％ ) 0.8 4.0 0.1 0.2
上記より、ＩＩ型およびＩＩＩ型は優れた化学的安定性を有することが認められる。
【００３８】
ＨＰＬＣ分析条件
カラム：ＹＭＣ Ａ−３１２（ワイ・エム・シー社製）
移動相：アセトニトリル−水（３５：６５）（ｐＨ２.０、Ｈ3ＰＯ4）
流 速：約１.５ｍｌ／ｍｉｎ
検 出：ＵＶ（２５４ｎｍ）
例１１：残存溶媒
例１０で使用したのと同じ試料を、それぞれガスクロマトグラフィー（ＧＣ分析）にかけ、残存溶媒量を測定した。結果を下記に示す。
【００３９】
上記より、ＩＩＩ型は特に残存溶媒が少ないことが認められる。
【００４０】
ＧＣ分析条件
操作条件
検 出 器 ：水素炎イオン化検出器
カ ラ ム ：内径約３ｍｍ、長さ約２ｍのガラス管に６０〜８０メッシュの多孔質高分子粒［Adsorb Ｐ−１（西尾工業）］を充填する。
【００４１】
カラム湿度 ：１３０°で５分間実施し、次いで２分間で１７０°に昇温維持する。
【００４２】
気化室温度 ：２００°付近の一定温度
キャリア−ガス：窒素
流 量 ：内標準物質の保持時間が約３.５分になるような一定流量（５０ｍｌ／ｍｉｎ）
例１２：帯電性試験
例１０で使用したのと同じ試料に、それぞれ金属製のスパーテルを近づけ静電気を調べた。非晶質およびＩ型結晶質では静電気による粉末の飛散が見られたが、ＩＩ型およびＩＩＩ型結晶質ではそのような飛散は生じなかった。
【００４３】
【発明の効果】
本発明によれば、化学的安定性および／または抗吸湿性に優れたＭＸ２の結晶質が提供される。さらに、そのような結晶質の簡易な製造方法も提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＭＸ２の粉末および各種結晶形態のＸ線粉末回折法による測定結果を示すチャートである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、アントラサイクリン抗生物質の新規な結晶質およびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
次式（Ｉ）
【０００３】
【化２】
で表されるアントラサイクリン抗生物質［３′−デアミノ−３′−（４−モルホリニル）−１３−デオキソ−１０−ヒドロキシカルミノマイシン：以下、「ＭＸ２」と略記する］は、次式（ＩＩ）
【０００５】
【化３】
で表される１３−デオキソ−１０−ヒドロキシカルミノマイシン（以下、「５Ｃ」と略記する）から化学合成的に転化されている化合物であり、その優れた抗腫瘍性が注目されている（例えば、特開平５−３１０７７２号公報参照）。
【０００７】
しかし、提供されている固形ＭＸ２は、非晶質粉末であるか、あるいは一応結晶質に分類されるとしても吸湿性が高くしかも安定性に劣るものにすぎない。ＭＸ２を医薬品として製剤化するとの観点に立てば、その最終原末であるか否かを問わず、中間製品であっても、それらが備える性質は重要な意義をもつことになる。例えば、化学安定性に劣る場合には保存に厳重な注意を要することになり、吸湿性が高いと取り扱いが困難となり、また残存溶媒が認められる場合には、医薬品としての用途を考慮すると、致命的な短所にもなりかねないからである。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
すなわち、本発明の目的は少なくとも化学安定性に優れ、好ましくは、さらに吸湿性が低くしかも残存溶媒が実質的に認められないＭＸ２の固形製品を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく検討を重ねてきたところ、容易に製造できるＭＸ２の特定の結晶形態が優れた化学安定性を示し、またその中の一種は吸湿性が低く、残存溶媒の問題も解消できることを見い出した。
【００１０】
したがって、本発明によれば、ＭＸ２の結晶質であって、Ｘ線粉末回折法により測定した場合の特徴的な２θ値（°）として
（Ａ） 少なくとも５.０８、７,２０、９.７６および１９.００またはそれらに近似した値を示すか、あるいは
（Ｂ） 少なくとも６.６６、１０.６８、１１.４２、１３.４０、１７.１０、１９.４２、２０.００および２２.８６またはそれらに近似した値を示す、
結晶質が提供される。
【００１１】
また本発明によれば、ＭＸ２の含有溶液または懸濁液から上記結晶質を製造する方法であって、
前記含有溶液または懸濁液の溶媒が、メタノール、クロロホルム−メタノール（容量比、１：５以上）の混合液およびアセトンからなる群より選ばれ、そして前記含有溶液または懸濁液が晶析法に供される段階を含んでなる方法も提供される。
【００１２】
【発明の具体的な記述】
本発明によるＭＸ２の結晶質は、Ｘ線粉末回折法（デバイ−シェラー法）により測定した場合に、特徴的２θ値（°）として、
（Ａ） 少なくとも５.０８、７.２０、９.７６および１９.００またはそれらに近似した値を示すか、あるいは
（Ｂ） 少なくとも６.６６、１０.６８、１１.４２、１３.４０、１７.１０、１９.４２、２０.００および２２.８６またはそれらに近似した値を示す点に特徴を有する（図１参照：図中の▲３▼が（Ａ）に相当し、▲４▼及び▲５▼が（Ｂ）に相当する）。なお、本明細書において２θを記載する際に、「少なくとも」と規定するのは、本発明に従う結晶質は特徴的なピーク値として、少なくとも列挙した２θを示すことを意味し、また「それらに近似した値」とは、測定機器もしくは試料の調製条件等の相違に基いて、生じうる変動の範囲内にある値を意味する。なお、上記値は、ＪＯＥＬ ＪＤＸ８０３０型Ｘ線回折装置（日本電子株式会社製）を使用し、ステップ角度０.０２°、係数時間１.０秒、管電圧４０.０ｋＶ、管電流２０.０ｍＡで測定したときの特徴的な値いである。
【００１３】
これらの結晶質は、従来のＭＸ２の無定形粉末（図１の▲１▼に相当）および一応結晶質と認められるもの（図１の▲２▼に相当）と、それらの結晶形態が明確に区別される。そして後述するように、（Ａ）の結晶質は吸湿性においては、従来法によるものに比べて特に優れているとはいえないのにもかかわらず、化学的安定性に極めて優れた特性を有し、そして（Ｂ）の結晶質は、吸湿性および化学的安定性の両者において、極めて優れた特性を有する。したがって、本発明の目的上、（Ｂ）の結晶質が特に好ましい。
【００１４】
上記本発明の結晶質は、もう一つの本発明である結晶質の製造方法によって、有利に提供できる。従来法によれば、相対純度が９０％を超えるＭＸ２含有濃厚溶液（クロロホルム溶液）へ単に過剰のヘキサンを加えて沈殿を得ることにより、主として実質的に無定形の粉末が提供されていた（特開平５−３１０７７２号公報参照）か、あるいは、ＭＸ２のクロロホルム（過剰）−メタノール溶液（例えば、容量比、９：１）に、それらの総容量を若干上回るメタノールを添加することにより晶析して結晶質（図１の▲２▼に相当）を得ていた（最終クロロホルム−メタノール容量比 １３：１４）。
【００１５】
しかし本発明によれば、無定形ＭＸ２粉末をアセトンに懸濁させて（例えば、相対純度が９０％を超えるＭＸ２粉末対アセトンが重量比で、１：１０〜１：１００）結晶転移させるか、あるいはＭＸ２粉末を熱メタノールに溶解（例えば、上記ＭＸ２粉末対メタノールが重量比で、１：４００〜１：８００）した後、放冷するか、またはＭＸ２粉末をメタノールに懸濁させて（例えば、上記ＭＸ２粉末対メタノールが重量比で、１：１０〜１：１００）結晶移転させるか、あるいはＭＸ２粉末をクロロホルムに溶解した後（例えば、上記ＭＸ２粉末対クロロホルムが重量比で、１：３〜１：５０）、過剰のメタノール（クロロホルムの約１０倍重量）を添加して晶析させることにより、上記本発明の結晶質ＭＸ２を得ることができる。なお、上記アセトンを使用する方法により、図１の▲３▼に示される結晶質が得られる。
【００１６】
本発明にいう晶析法は、上記結晶転移を包含する概念で使用されていることを理解されたい。したがって、本発明の晶析法は、上記懸濁液を室温（１８〜２７℃）で数１０分、好ましくは６０分程度撹拌するか、あるいは上記溶液を氷冷（約５℃）下に静置することによって実施することができる。
【００１７】
上記ＭＸ２は、通常、５Ｃから特開平５−３１０７７２号公報に記載される方法によって化学的に転化したものが使用できる。一方、５Ｃは、特開昭６０−８３００号公報に記載される発酵法により製造される、次式（ＩＩＩ）
【００１８】
【化４】
の１３−デオキソ−１０−カルボキシカルミノマイシンから、特公平２−１２９５９号公報に記載の方法によって転化するか、あるいは特開昭６１−７６４９８号公報に記載の発酵法により直接得ることができる。
【００２０】
したがって、ＭＸ２の製造原料である５Ｃは、通常の発酵法により副生する類縁アントラサイクリンやその他の夾雑物を伴う傾向があるので、培養液から５Ｃを回収する際には十分な注意が必要である。参考までに、５Ｃの回収に関して特開昭６１−７６４９号公報に記載された方法の要約を以下に引用しておく。
【００２１】
アクチノマジュラ ロゼオビオラセエ（Actinomadura roseoviolacea）Ｒ２０×２（微工研菌寄第７１３８号）を、それ自体既知の栄養培地で好気的に培養して得られる培養物から菌体を除去して培養液を調製する。次いで、培養液を１Ｎ塩酸でｐＨ２に調整した後、吸着性多孔質ポリマー［ダイヤイオンＨＰ２０（三菱化成社製）］のカラムに通して目的物を吸着させ、次いで蒸留水および５０％メタノールで洗浄した後、メタノールで目的物を溶出し、さらに溶出液を濃縮し、濃縮液へのヘキサン添加により沈殿物として５Ｃ（該公報ではＲ２０Ｘ２と称されている）の粗標品を得ている。そして、粗標品をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで処理し、次いでシリカゲル薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）にかけた後、目的画分からの溶出物をクロロホルム中での再結晶にて精製５Ｃを得ている。
【００２２】
次に、こうして得られる５ＣからのＭＸ２の製造法は、上述したとおり特開平５−３１０７７２号公報の記載に従って実施することができる。参考までに、上記方法を要約しておく。５Ｃを、例えば少量の酢酸を加えたメタノール溶媒中、ジメチルアミンボランやトリメチルアミンボランの存在下で１,４−ジオキサン−２,６−ジオールと反応させると高収率で５ＣをＭＸ２に転化することができる。反応液からのＭＸ２の回収は、クロロホルム抽出、抽出液の濃縮、濃縮液へのヘキサンの添加による沈殿の生成、次いで沈殿物の乾燥によりＭＸ２を粗粉末として得ることができる。この粗粉末は必要によりシリカゲルクロマトグラフィー等を用いてさらに精製することができる。
【００２３】
本発明の結晶質ＭＸ２を製造するために使用することのできるＭＸ２粉末としては、本発明の目的に沿う限り、上記粗粉末を初めいずれの粉末であってもよいが、通常、９２％以上の純度、好ましくは９５％以上の純度をもつものを挙げることができる。
【００２４】
【実施例】
以下、具体例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
【００２５】
例１（参考）：粗５Ｃの精製
粗５Ｃ粉末２０４ｍｇ（５Ｃ含量１５７ｍｇ、相対純度＊９２.７％、ＨＰＬＣの分析結果、５Ｃより保持時間の大きい不純物含量４.６５％）を酸性水（ｐＨ２.５、ＨＣｌ）に溶解して、この溶液をＨＰ−２０のカラム（５０ｍｌ）にかけた。同酸性水１００ｍｌで洗浄した後、メタノール−酸性水（ｐＨ２.５、ＨＣｌ）（４０：６０）１００ｍｌおよびメタノール−酸性水（ｐＨ２.５、ＨＣｌ）（７０：３０）３００ｍｌで溶出させた。得られた５Ｃ分画を４Ｎ水酸化ナトリウムでｐＨ８.５とし、クロロホルムで抽出、濃縮後、ヘキサンを加えて沈殿を生じさせ８８ｍｇの粉末を得た。なお、以上の処理は室温下で行った。
【００２６】
上記相対純度を質出するのに行ったＨＰＬＣの分析条件：
カ ラ ム：ＹＭＣ Ａ−３１２（ワイ・エム・シー社製）
移 動 相：アセトニトリル−水（３５：６５、ｐＨ２.０、Ｈ3ＰＯ4）
流 速：１.０ｍｌ／ｍｉｎ
検 出：ＵＶ（２５４ｎｍ）
＊相対純度：該ＨＰＬＣ分析の結果得られる５Ｃのピーク面積の総ピーク面積に対する割合
例２（参考）：５ＣからのＭＸ２の製造
５Ｃ ２００ｍｇ（０.３９ミリモル）をメタノール（２０ｍｌ）に溶解し、酢酸（２０μｌ）を加えて５℃に冷却した。メタノール１.４ｍｌに溶解した１,４−ジオキサン−２,６−ジオール１４０ｍｇ（１.１７ミリモル）及びジメチルアミンボラン４６ｍｇ（０.７８ミリモル）を上記の溶液に加えて、室温で１時間反応させた。反応終了後、０.５％リン酸水溶液（ｐＨ１.８）４０ｍｌを加えて１５分撹拌した後、水で希釈して１００ｍｌとした。この反応液を高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析系の移動相で１０倍に希釈して定量分析を行なったところ、生成したＭＸ２の収量は１５７ｍｇ（収率７９％）であった。
【００２７】
反応液１００ｍｌのうち９６ｍｌをクロロホルム１００ｍｌで洗浄した後、１規定の水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ８.０に調節し、これにクロロホルム２００ｍｌを加えて混合した。有機層を分離して水５０ｍｌで洗浄し、濃縮した後に、過剰のヘキサンを加えて沈殿を得た。この沈殿を真空乾燥することにより１９５ｍｇの粗粉末を得た。１８６ｍｇの粗粉末をシリカゲルクロマトグラフィー（和光ゲルＣ２００；５ｇ）に付し、クロロホルム−メタノール（１００：１.３５）の混合溶媒で溶出させて目的物を得た。目的物を含有する溶出分画にリン酸水溶液（ｐＨ２.５）２０ｍｌを加えて混合し、水層を分離した。この水層をクロロホルム１０ｍｌで洗浄した後、１規定の水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを８.０に調節し、クロロホルム２０ｍｌで目的物を抽出した。クロロホルム層を飽和塩化ナトリウム水溶液１０ｍｌで洗浄した後、少量に濃縮し、過剰のヘキサンを加えて沈殿を得た。この沈殿を６０℃で真空乾燥し、純粋なＭＸ２の橙色粉末１１.４ｍｇを得た。
【００２８】
例３（比較例）：無定形粉末の調製
４５ｇのＭＸ２をクロロホルム１ｌに溶解した。室温下、この溶液にヘキサン１０ｌを添加して沈殿を生じさせた後、沈殿物を濾取、乾燥（６０℃、３時間、減圧下）することにより赤褐色の粉末４２ｇを得た。この粉末のＸ線粉末回折法の測定結果は、図１の▲１▼のとおりであった。なお、測定条件は、ステップ角度 ０.０２°、計数時間 １.０秒、管電圧 ４０.０ｋＶ、管電流 ２０.０ｍＡによる（以下同じ）。
【００２９】
例４（比較例）：Ｉ型結晶質の調製
室温下、３０ｇのＭＸ２をクロロホルム−メタノール（９：１）２００ｍｌに溶解し、この溶液にメタノール２５０ｍｌを加え、５℃にて１４時間静置した。析出した沈殿を濾取、乾燥（例３に同じ）して、赤褐色の結晶性粉末２６ｇを得た。こうして得られた生成物の結晶形態をＩ型と称する（Ｘ線粉末回折法の結果は図１の▲２▼を参照されたい）。
【００３０】
例５（本発明）：ＩＩ型結晶質の調製
１０ｇのＭＸ２をアセトン２００ｍｌに懸濁し、室温下で１時間撹拌して結晶転移を起こさせた。沈殿を濾取、乾燥（例３に同じ）して、赤橙色の結晶性粉末７.７ｇを得た。こうして得られた生成物の結晶形態をＩＩ型と称する（Ｘ線粉末回折法の結果は図１の▲３▼を参照されたい）。
【００３１】
例６（本発明）：ＩＩＩ型結晶質の調製
１０ｇのＭＸ２をメタノール２００ｍｌに懸濁し、室温下で１時間撹拌して結晶転移を起こさせた。沈殿を濾取、乾燥（例３に同じ）して、赤橙色の結晶性粉末８.９ｇを得た。こうして得られた生成物の形晶形態をＩＩＩ型と称する（Ｘ線粉末回折法の結果は図１の▲４▼を参照されたい）。
【００３２】
例７（本発明）：ＩＩＩ型結晶質の調製
５０ｇのＭＸ２をクロロホルム１ｌに溶解し、室温下でメタノール１０ｌを添加した後、１時間撹拌して沈殿を生じさせた。沈殿物を濾取、乾燥（例３に同じ）して、赤橙色の結晶性粉末４５ｇを得た。この結晶性粉末は、例６で得られたものと同様のＸ線粉末回折法の結果を示した。
【００３３】
例８（本発明）：ＩＩＩ型結晶質の調製
１ｇのＭＸ２を熱メタノール５５０ｍｌに溶解した後、５℃にて１０日間静置した。沈殿を濾取、乾燥（例３に同じ）して、赤橙色の結晶０.５９ｇを得た。この結晶の形態も上記ＩＩＩ型に分類できるものであった（Ｘ線粉末回折法の結果は図１の▲５▼を参照されたい）。
【００３４】
例９：吸湿性試験
例３〜７で得られた粉末（または結晶）を、それぞれ２５℃、相対湿度３５％の条件下に１４時間保存し、含湿度を測定した。結果を下記に示す（なお、例６〜８由来の結晶は同様の結果を与えた）。
【００３５】
粉末の形態 非晶質 Ｉ型 ＩＩ型 ＩＩＩ型
含湿度（％） 1.4 2.6 3.2 0.3
上記より、ＩＩＩ型は吸湿性が極めて低いことが認められる。
【００３６】
例１０：化学的安定性試験
例９で使用したのと同じ試料（ＩＩＩ型については例６の結晶性粉末）を、それぞれ６０℃の条件下に３ケ月間気密容器中で保存し、類縁化合物の出現量をＨＰＬＣで分析定量し、試料中の含量を算出した。結果を下記に示す。
【００３７】
粉末の形態 非晶質 Ｉ型 ＩＩ型 ＩＩＩ型
類縁化合物の増加率 ( ％ ) 0.8 4.0 0.1 0.2
上記より、ＩＩ型およびＩＩＩ型は優れた化学的安定性を有することが認められる。
【００３８】
ＨＰＬＣ分析条件
カラム：ＹＭＣ Ａ−３１２（ワイ・エム・シー社製）
移動相：アセトニトリル−水（３５：６５）（ｐＨ２.０、Ｈ3ＰＯ4）
流 速：約１.５ｍｌ／ｍｉｎ
検 出：ＵＶ（２５４ｎｍ）
例１１：残存溶媒
例１０で使用したのと同じ試料を、それぞれガスクロマトグラフィー（ＧＣ分析）にかけ、残存溶媒量を測定した。結果を下記に示す。
【００３９】
【００４０】
ＧＣ分析条件
操作条件
検 出 器 ：水素炎イオン化検出器
カ ラ ム ：内径約３ｍｍ、長さ約２ｍのガラス管に６０〜８０メッシュの多孔質高分子粒［Adsorb Ｐ−１（西尾工業）］を充填する。
【００４１】
カラム湿度 ：１３０°で５分間実施し、次いで２分間で１７０°に昇温維持する。
【００４２】
気化室温度 ：２００°付近の一定温度
キャリア−ガス：窒素
流 量 ：内標準物質の保持時間が約３.５分になるような一定流量（５０ｍｌ／ｍｉｎ）
例１２：帯電性試験
例１０で使用したのと同じ試料に、それぞれ金属製のスパーテルを近づけ静電気を調べた。非晶質およびＩ型結晶質では静電気による粉末の飛散が見られたが、ＩＩ型およびＩＩＩ型結晶質ではそのような飛散は生じなかった。
【００４３】
【発明の効果】
本発明によれば、化学的安定性および／または抗吸湿性に優れたＭＸ２の結晶質が提供される。さらに、そのような結晶質の簡易な製造方法も提供される。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＭＸ２の粉末および各種結晶形態のＸ線粉末回折法による測定結果を示すチャートである。
Claims (3)
- 次式（Ｉ）
（Ａ） 少なくとも５.０８、７.２０、９.７６および１９.００またはそれらに近似した値を示すか、あるいは
（Ｂ） 少なくとも６.６６、１０.６８、１１,４２、１３.４０、１７.１０、１９.４２、２０.００および２２.８６またはそれらに近似した値を示す、
結晶質。 - 特徴的な２θ値（°）として、少なくとも６.６６、１０.６８、１１.４２、１３.４０、１７.１０、１９.４２、２０.００および２２.８６またはそれらに近似した値を示す、請求項１記載の結晶質。
- 式（Ｉ）で表されるアントラサイクリン抗生物質の含有溶液または懸濁液から請求項１記載の結晶質を製造する方法であって、
前記含有溶液または懸濁液の溶媒が、メタノール、クロロホルム−メタノール（重量比、１：５以上）の混合液およびアセトンからなる群より選ばれ、そして
前記含有溶液または懸濁液が晶析法に供される段階を含んでなる方法。
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