JP3940407B2 - 非ヌクレオチドを含有する酵素性核酸 - Google Patents

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Description

本発明は化学合成された非ヌクレオチドを含む酵素性核酸に関する。
酵素性ＲＮＡ分子もしくはリボザイムの発見の歴史およびその活性について簡単に述べる。この歴史は完全なものではなく、以下に説明する本発明の理解の補助とするためのものである。このまとめは以下に示したすべてが特許請求の範囲に対する従来技術であるということを意味するのではない。
１９７０年代以前はすべての遺伝子は、遺伝子によってコードされるタンパク質と一対一で対応すると考えられていた。この単純な考えは、すべての遺伝子は紙テープに書かれたメッセージのごときものであって、各三連のＤＮＡの「文字」は１つのタンパク質である「言葉」に翻訳されると考えられていた。タンパク質合成は遺伝子のＤＮＡからＲＮＡへの書き換え(文字を異なる形態の文字とする)、次いでＲＮＡをタンパク質へと翻訳する（１度に３文字）。１９７０年代中盤において、遺伝子のうちのいくつかは、自身のコード化するタンパク質と正確に一対一の対応をしないことが発見された。かかる遺伝子はコーディング配列内にあって、タンパク質への翻訳前にＲＮＡから除去すなわち「スプライス」される中断領域を有していることが見いだされた。このようなコーディング領域における中断部には介在配列、すなわち「イントロン」という名前がつけられおり、そしてこのイントロンがＲＮＡから除去される過程には「スプライシング」と名付けられている。少なくとも３つの異なる機構がＲＮＡからイントロンを除去する機構として見いだされている。かかるスプライシング機構のうちの２つには様々なタンパク質因子が結合し、その働きにより正しい位置でＲＮＡが切断、連結されるものである。第３の機構はＲＮＡをイントロン自身により切断および連結させる機構であり、これが触媒的ＲＮＡについての初めての発見である。
セッシュと共同研究者らは池に棲む単細胞生物であるテトラヒメナ・サーモフィラ(Tetrahymena thermophila)においていかにしてＲＮＡスプライシングが発生するかにつき研究した。セッシュはＲＮＡの介在配列が自身を周囲のＲＮＡから切り離すスプライシング因子として作用することを報告した。１９８０年代初頭においてはテトラヒメナのイントロンの複雑な構造をはっきりさせ、セルフスプライシングの機構を解読するためにさらなる研究が行われた。多くの研究グループによりテトラヒメナのイントロンの特別な折り畳み構造が切断され、スプライスされるＲＮＡ部分に伴ってあることを支持していた。スプライシングが終わった後でも、遊離したイントロンは触媒性構造を保持する。その結果、遊離したイントロンはさらなる切断およびスプライシング反応を自身に対して行い、イントロン環を形成する。１９８６年までに、セッシュは短くされたテトラヒメナイントロンが、ＲＮＡの他の切片に対して様々な切断および結合反応をもたらすことを示すことができた。この証明によって、テトラヒメナイントロンが真の酵素として働くことが導かれる：（ｉ）各イントロン分子は多くの基質分子を切断することができるが、イントロン自体は変化せず維持される、そして（ｉｉ）反応は唯一の配列（ＣＵＣＵ）を含有するＲＮＡ分子に特異的であり、かかる配列によってイントロンがＲＮＡを認識し、結合する。ザウとセッシュは「リボザイム」という用語をすべての酵素様性質を有すＲＮＡを表現する用語として新造した。
同じ１９８６年に、セッシュはテトラヒメナのリボザイムによって認識されるＲＮＡ基質配列がリボザイム自身の内部の配列を変化させることによって変え得ることを見いだした。この性質は他のＲＮＡ配列を切断するよう個々にデザインされる多くの部位特異的リボザイムの開発につながった。
テトラヒメナのイントロンは最もよく研究されており、現在では大きな一群のイントロン、すなわちグループＩイントロンとして認識されている。いくつかの配列要素を含有する完全に折り畳まれた構造はグループＩのイントロン内で保存されており、一般的なスプライシング機構に関与している。テトラヒメナのイントロンのごとく、グループＩに含まれるイントロンのうちのいくつかは触媒活性を有する、すなわちイントロン自身が自己スプライシング反応を生じる。他のグループＩのイントロンは他の（タンパク質）因子を、例えばイントロンの折り畳みおよび／または活性構造の維持のために必要とすると考えられている。
リボヌクレアーゼＰ（ＲＮアーゼＰ）はＲＮＡおよびタンパク質成分の両方からなる酵素であり、前駆体ｔＲＮＡ分子の一方の末端から過剰のＲＮＡを取り除きその最終形態へと導く。ＲＮアーゼＰの活性は試験したすべての生物において認められた。シドニー・アルトマンとその共同研究者らは、ＲＮアーゼＰ中のＲＮＡ成分はかかるプロセシング活性に必要であることを示した；しかしながら、彼らは彼らの用いた条件においてはタンパク質成分もまたプロセシングに必要であることもまた示した。セッシュがテトラヒメナのイントロンによって自己スプライシングを発見した後、ＲＮアーゼＰ内のタンパク質とＲＮＡ成分が再調査された。１９８３年、アルトマンとパースがＲＮアーゼＰ複合体の酵素的成分がＲＮＡであることを発見した。このことは、あるＲＮＡ分子を実際の酵素として作用し得、自分自身に変化を受けることなく数多くのｔＤＮＡ分子を変化させることができることを示すものであった。
ＲＮアーゼＰ ＲＮＡの折り畳み構造が調べられている。異なる生物間において、ＲＮＡの配列は正確に保存されていないが、より高次の構造については保存されていた。このことはＲＮアーゼＰ複合体のタンパク質成分が、インビボにおいて折り畳まれたＲＮＡの構造を安定化させているからであると考えられる。
シモンズとその共同研究者らは２種類の自己切断ＲＮＡを同定したが、これらすでに報告されていた触媒性ＲＮＡの他の形態と異なっていた。シモンズは、アボガド植物に感染するＲＮＡウイルスであるアボカド・サンブロッチ・ウイロイド（avocado sunblotch viroid(ASV))の繁殖について研究していた。シモンズは５５ヌクレオチドの小ささのＡＳＶのＲＮＡが自己を２切片へと切断するよう、折り畳まれ得ることを証明した。これらのＲＮＡのインビボ自己切断によって、ウイルスの増殖の間に、ＲＮＡが１ゲノム長の断片に切断されると考えられている。シモンズはＡＳＶからのさまざまな最小触媒配列が他の植物病原性ＲＮＡにも認められることを発見した。これらの配列を比較したところ、３本のステムと多くの保存された（ＲＮＡ間で変化しない）ヌクレオチドを有する中心ループで接続されたループから構成される一般的な構造が判明した。この触媒性ＲＮＡに対して予測される二次構造には、ハンマーヘッド型の検索部位を有している；従ってこれはハンマーヘッドと名付けられる。
ウーレンベック（Uhlenbek)はリボザイムの触媒領域を基質から単離することに成功した。すなわち、２つ（または３つ）の小さな合成ＲＮＡから、ハンマーヘッドリボザイムを組み立てることが可能となったのである。１９個のヌクレオチドからなる触媒領域および２４個のヌクレオチドからなる基質が特定の切断を行うには十分である。多くのハンマーヘッド型リボザイムの触媒性部位がウーレンベックのグループとシモンズのグループの両方によって研究されており、ここでは特定の組み立ておよび触媒活性に必要なヌクレオチドの決定および様々な条件下における切断速度の測定が行われている。
ヘーゼロフ（Haseloff)とゲルラック(Gerlach)はハンマーヘッドリボザイムのドメインを異なる方法によって分けることができることを示した。そうすることによって、鎖中において必要とされる配列のほとんどを切断されない部位に置き（リボザイム）、鎖中にＵＨ（Ｈ＝Ｃ，ＡまたはＵ）がある場合のみに切断される（基質）ようにデザインすることが可能となる。このことによって、触媒リボザイムは長い「基質認識」配列の中にはめ込まれているどのＵＨ ＲＮＡ配列をも切断するように設計できる。長いｍＲＮＡの特別な切断を、いくつかのハンマーヘッドリボザイムを用いて予言した方法によって行うことが、１９８８年に報告されている。
ある植物病原性ＲＮＡ（タバコリングスポットウイルスのネガティブ配列から得た）は自己切断を受けるが、上述のコンセンサスなハンマーヘッド構造に折り畳まれない。ブルーニング（Bruening)とその共同研究者らは、このＲＮＡに対して５０ヌクレオチドの触媒ドメインを同定した。１９９０年ハンペル(Hampel)とトリッツ(Tritz)は触媒性ドメインを２つの部分に分け、それぞれ基質とリボザイムとして、多段階繰り返し切断反応を行わせることに成功した。ハンマーヘッドリボザイムのごとく、触媒性部位には触媒活性に必要とされる配列のほとんどを含んでおり、標的においては短い配列（この場合にはＧＵＣ）のみが必要とされる。ハンペルとトリッツはこのＲＮＡの折り畳まれた構造を、シングルヘアピンを構成しているとして表現し、「ヘアピン」リボザイム（ブルーニングと共同研究者らはこのリボザイムモチーフに対して「紙ばさみ」と名付けた）と命名した。その後に研究によって、標的ＲＮＡの結合および切断の機構において、ヘアピンとハンマーヘッドリボザイムの間の類似性が増加することが示されている。
肝炎デルタウイルス（ＨＤＶ）は、ゲノムが一本鎖ＲＮＡであるウイルスである。ゲノムＲＮＡおよび相補的なアンチゲノムＲＮＡの両方における小さな領域（約８０ヌクレオチド）があれば自己切断を行える。１９９１年にビーン(Been)とペロッタ(Perrotta)はＨＤＶのＲＮＡの二次構造がゲノムＲＮＡとアンチゲノムＲＮＡ間で保存されており、これが触媒活性に必要であることを提案した。ＨＤＶのＲＮＡを「リボザイム」と「基質」部分へ分離することが近年になってビーンにより達成された。ビーンはさらにＨＤＶリボザイムの大きさを約６０ヌクレオチドにまで減少させることに成功した。
以下の表には上述のリボザイムの性質を挙げた：
（表１）
リボザイムの性質
グループＩ イントロン
大きさ：〜３００から＞１０００ヌクレオチド
切断部位の５’につながる標的配列においてＵが必要である。
切断部位の５’側において４〜６ヌクレオチドが結合する
このクラスにおいて１００を越える公知のヌクレオチドが、テトラヒメナ・サーモフィラのｒＲＮＡ、黴ミトコンドリア、クロロプラオスト、ファージＴ４、ブルー・グリーンアルガエおよび他のものから単離されている。
ＲＮアーゼＰ ＲＮＡ（Ｍ１ ＲＮＡ）
大きさ：〜２９０から４００ヌクレオチド
リボヌクレオチド酵素のＲＮＡ部分。ｔＲＮＡプレカーサーを切断して成熟ｔＲＮＡを作製する。このグループはおよそ１０個公知のものがあるが、すべては細菌由来である。
ハンマーヘッドリボザイム
大きさ：〜１３から４０ヌクレオチド
切断部位の５’に直接ついているＵＨ標的配列が必要である
さまざまな数のヌクレオチドが切断部位の両側へ結合する。
このクラスには１４個の公知のものがある。ＲＮＡを感染剤として用いる植物病原（ウイルソイズ）に認められる（図１）。
ヘアピンリボザイム
大きさ：〜５０ヌクレオチド
切断部位の３’に直接ついているＧＵＣ配列が必要である。
切断部位の５’側に４ヌクレオチドが結合し、様々な数のヌクレオチドが切断部位の３’側に結合している。
このクラスには１個のみの公知のヌクレオチドがある。これはＲＮＡを感染用に用いる植物病原（タバコリングスポットウイルスのサテライトＲＮＡ）から得られたものである（図２）。
肝炎デルタウイルス（ＨＤＶ）リボザイム
大きさ：〜６０ヌクレオチド（現在）
標的ＲＮＡを切断することが近年証明された。
必要とする配列は完全には解明されていない。
結合部位と構造的な要求性に関しても完全には解明されていないが、切断部位の５’側にはいずれの配列も必要とはされない。
このクラスには１個のみの公知のヌクレオチドがある。これはヒトのＨＤＶから単離されたものである（図３）。
エクスタイン（Eckstein)らの国際公開番号ＷＯ９２／０７０６５；ペラウルト（Perrault)らのネイチャー１９９０、３４４：５６５；ピーケン（Pieken)らのサイエンス１９９１，２５３：３１４；ウスマン（Usman）とセダーグレン（Cedergren)、トレンズ・イン・バイオケム・サイ、１９９２、１７：３３４；ウスマンら国際公開番号ＷＯ９３／１５１８７；およびロッシ（Rossi）ら、国際公開番号ＷＯ９１／０３１６２には、酵素性核酸分子の糖部分へ施す様々な化学的変化が記載されている。
国際公開第ＷＯ９２／０７０６５号パンフレット 国際公開第ＷＯ９３／１５１８７号パンフレット 国際公開第ＷＯ９１／０３１６２号パンフレット ペラウルト（Perrault)らのネイチャー１９９０、３４４：５６５ ピーケン（Pieken)らのサイエンス１９９１，２５３：３１４ ウスマン（Usman）とセダーグレン（Cedergren)、トレンズ・イン・バイオケム・サイ、１９９２、１７：３３４
本発明は、化学合成された非ヌクレオチドを含む酵素性核酸を提供することを目的とする。
本発明は、二本鎖核酸（例えばＲＮＡもしくはＤＮＡ）のステム（二重らせんステム）のベースまたは酵素核酸の一本鎖領域、触媒コア、ループもしくは認識アームにおけるスペーサー要素としての非ヌクレオチド分子の使用に関する。二重らせんステムは、酵素ＲＮＡ分子中に遍在する構造要素である。上記ステムは、通常一本鎖ヌクレオチド連鎖によって接続されているが、かようなステムの合成を容易にするため、単一塩基もしくは塩基対の擬似体（ミメティック：mimetic）を使用して、このような分子を合成する際のヌクレオチドの必要数を減らし、かつヌクレアーゼ耐性を付与する（これら擬似体は非核酸要素であるから）ことができる。またこのことは、リボザイムの触媒コアと認識アームの両者にも当てはまる。
このような非ヌクレオチド擬似体の例を図４に示し、これらのハンマーヘッドリボザイム中への組込みを図５に示す。これら非ヌクレオチドのリンカーは、ポリエーテル、ポリアミン、ポリアミドまたはポリ炭化水素の化合物でもよい。具体例としては、SeelaおよびKaiser、Nucleic Acids Res.、18巻、6353頁、1990年およびNucleic Acids Res.、15巻、3113頁、1987年；CloadおよびSchepartz、J.Am.Chem.Soc.、113巻、6324頁、1991年；RichardsonおよびSchepartz、J.Am.Chem.Soc.、113巻、5109頁、1991年；Maら、Nucleic Acids Res.、21巻、2585頁、1993年、およびBiochemistry、32巻、1751頁、1993年；Durands、Nucleic Acids Res.、18巻、6353頁、1990年；McCurdyら、Nucleosides & Nucleotides、10巻、287頁、1991年；Jaschkeら、Tetrahedron Lett.、34巻、301頁、1993年；Onoら、Biochemistry、30巻、9914頁、1991年；Arnoldら、国際特許願公開第ＷＯ89/02439号、標題「Non-nucleotide Linking Reagents for Nucleotide Probes」；ならびにFerentzおよびVerdine、J.Am.Chem.Soc.、113巻、4000頁、1991年に記載されている化合物がある。なおこれら文献はすべて本明細書に援用するものである。
したがって本発明は、第一の態様で、一つ以上の非ヌクレオチド成分を有しかつＲＮＡまたはＤＮＡ分子を切断する酵素活性を有する酵素性核酸を提供するものである。
このような非ヌクレオチド擬似体の例を図４に示し、それらのハンマーヘッドリボザイムへの組込みを図５に示す。これらの非ヌクレオチドリンカーはポリエーテル、ポリアミン、ポリアミドまたはポリ炭化水素の化合物でもよい。
好ましい実施態様で、その酵素性核酸はＲＮＡの一つ以上の領域（stretch）を含有し、その領域は、分子の酵素活性を提供し、非ヌクレオチドの部分に連結される。
「非ヌクレオチド」という用語は、糖および／またはホスフェートの置換を含めて一つ以上のヌクレオチド単位の代わりに核酸連鎖中に組込むことができかつ残りの塩基にその触媒活性を示させることができる基または化合物を意味する。その基または化合物は、アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシルまたはチミンのような公知のヌクレオチド塩基を含有していない点で非塩基である。その基または化合物は、当該技術分野で報告されているように２'もしくは３'のＨもしくはＯＨが置換されていてもよい（EckteinらおよびUsmanらの前記文献参照）。
好ましい実施態様で、その酵素性核酸はＲＮＡの一つ以上の領域を含有し、その領域は分子酵素活性を提供し、非ヌクレオチドの部分に連結される。必要なＲＮＡ成分は当該技術分野で公知である（例えばUsmanの前記文献参照）。
「非ヌクレオチド含有酵素性核酸」という用語は、本願で用いる場合、リボザイムの一部、例えば限定されないが二本鎖ステム、一本鎖「触媒コア」配列、一本鎖ループまたは一本鎖認識配列を置換する少なくとも一つの非ヌクレオチド要素を含有する核酸分子を意味する。これらの分子は、別のＲＮＡまたはＤＮＡの分子を、ヌクレオチド塩基配列に特異的な方式で切断（好ましくは繰返し切断）することができる。またこのような分子は、所望に応じて分子内で切断するよう作用させることができる。このような酵素分子は事実上、ＲＮＡの転写を標的にすることができる。またかような分子としては、エキソヌクレアーゼによる消化を防止するキャップ形成基として有用な３'−または５'−に非ヌクレオチドを有する核酸分子がある。
本発明の酵素分子は、まず標的のＲＮＡまたはＤＮＡに結合することによって作用する。このような結合は、標的のＲＮＡまたはＤＮＡを切断する作用がある分子の酵素部分のごく近くに保持されている酵素の標的結合部分を通じて起こる。したがってその分子は、まず標的核酸を認識し次いで相補的塩基対形成によって標的核酸を捕捉し、そして正しい部位に一旦結合されると酵素として作用して標的を切断する。このような標的の効果的な切断によって、コードされているタンパク質の合成を制御する標的核酸の性能が破壊される。本発明の酵素は、その標的を捕捉して切断した後、その標的から放出され、別の標的を探して、新しい標的を繰返し捕捉して切断することができる。
本発明の酵素の酵素特性は、他の方法、例えばアンチセンス法（この場合、核酸分子は単に核酸標的に結合して核酸標的の翻訳を遮断するだけである）を超えて有利である。というのは、治療処置を行うのに必要な酵素の有効濃度がアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効濃度より低いからである。この利点は本発明の酵素が酵素として作用する性能を反映している。即ち、単一の酵素分子が多数の標的ＲＮＡ分子を切断することができる。その上本発明の酵素は、高度に特異的な阻害剤であり、その阻害作用の特異性は、結合に際しての塩基対生成の機構のみならず、その分子が結合するＲＮＡの発現を阻害する機構に依存している。すなわち、その阻害作用は標的の切断によって起こり、その特異性は、標的核酸の切断率／非標的核酸の切断率の比率と定義する。この切断機構は、塩基対生成に関与する因子の外に追加される因子に依存している。したがって本発明の酵素の作用の特異性は、同じ標的部位を捕捉するアンチセンスオリゴヌクレオチドの作用の特異性より大きいと考えられる。
「フレーズ酵素（phrase enzyme）」という用語は、基質結合領域に、指定の核酸標的に対する相補性を有しかつその標的中のＲＮＡまたはＤＮＡを特異的に切断する酵素活性も有する非クレオチド含有触媒核酸分子を意味する。すなわち、その酵素は、分子内または分子間が、ＲＮＡまたはＤＮＡを切断して、標的のＲＮＡまたはＤＮＡの分子を不活性化することができる。この相補性は、本発明の酵素分子を標的のＲＮＡまたはＤＮＡと充分にハイブリッドを形成させて切断を起こす機能がある。100％の相補性が好ましいが、50〜75％と低い相補性でもこの発明に有用である。
本発明の好ましい実施態様では、本発明の酵素分子は一般にハンマーヘッドのモチーフで形成されるが、ヘアピン、肝炎デルタウイルス、グループIイントロンまたはＲＮアーゼＰ ＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列と関連する）のモチーフで形成することもできる。このようなハンマーヘッドモチーフの例はRossiら、Acids Research and Human Retroviruses、８巻、183頁、1992年に記載されており；ヘアピンモチーフの例は、Hampelらの1988年９月20日付け出願の米国特許第07/247,100号の一部継続出願である1989年９月20日付け出願の「RNA Catalyst for Cleaving Specific RNA Sequences」；Hampel and Tritz、Biochemistry、28巻、4929頁、1989年およびHampelら、Nucleic Acids Research、19巻、299頁、1990年に記載されており；肝炎デルタウイルスモチーフの例はPerrottaおよびBeen、Biochemistry、31巻、16頁、1992年に記載され；ＲＮアーゼＰのモチーフの例はGuerrier-Takadaら、Cell、35巻、849頁、1983年に記載され；ならびにグループIイントロンのモチーフの例はCechらの米国特許第4,987,071号に記載されている。本発明はこれらの特異的モチーフに限定されるものではなく、当該技術分野の当業者は、本発明の酵素分子において重要なことは、その酵素分子が少なくとも一つの非ヌクレオチド部分および標的遺伝子のＲＮＡ領域の一つ以上に相補的な特異的基質結合部位を有し、かつ核酸切断活性をその酵素分子に付与する基質結合部位の中またはその部位を囲むヌクレオチド配列を有することであることが分かるであろう。
本発明は、所望の標的の核酸に対して高い特異性を示す一クラスの切断酵素剤の製造方法を提供するものである。本発明の酵素分子は、標的の高度に保存された配列領域を標的とすることが好ましく、その結果、疾患また症状の特異的な治療を単一の酵素で行うことができる。このような酵素分子は、必要に応じて特定の細胞に対して外因的に送達することができる。好ましいハンマーヘッドのモチーフにおいて、小さい分子（長さが60個未満のヌクレオチド好ましくは30〜40個のヌクレオチド）を用いれば、他のリボザイムのモチーフより治療費用が減少する。
長さが100ヌクレオチドを超える核酸分子は自動化された方法を用いて合成することは困難なのでこのような分子の治療費用は法外なものになる。本発明では、外因的送達に、小さな酵素のモチーフ（例えばハンマーヘッドのモチーフ）を用いる。これらの分子は構造が単純なので、酵素がｍＲＮＡ構造の標的領域に侵入する性能が増大する。ハンマーヘッド構造が長い転写物内に含まれている場合と異なり、酵素構造の正しい折畳みまたは相補的領域を妨害する非酵素の隣接配列は存在しない。
本発明のその外の特徴と利点は、下記の、本発明の好ましい発明を実施するための最良の形態と特許請求の範囲から明らかになるであろう。
図面：
図１は当該技術分野で公知のハンマーヘッドリボザイム領域の線図である。
図２は当該技術分野で公知のヘアピンリボザイム領域の一般構造の線図である。
図３は当該技術分野で公知の肝炎デルタウイルスリボザイム領域の一般構造の線図である。
図４は核酸酵素に組込むことができる各種の非ヌクレオチド擬似体（ミメティック）の線図である。図４では標準的な略語を用いている。化合物１において、Ｘは各々、独立して、酸素、窒素、硫黄または置換炭素を含有するアルキル、アルケンまたは炭素原子１〜10個の長さの均等な連鎖である。化合物６、６ａ、７、８、９および10において、Ｙは各々、独立して、核酸酵素の他の部分に対するホスホジエステル、エーテルまたはアミド結合部分である。化合物４と５において、Ｒは各々、独立してＨ、ＯＨ、保護されたＯＨ、０−アルキル、アルケニルもしくはアルキニル、または炭素原子が１〜10個のアルキル、アルケニルもしくはアルキニルである。
図５は各種の非ヌクレオチド擬似体（ミメティック）と核酸酵素に組込むのに好ましい位置を示す線図である。具体的に述べると、擬似体１〜10は、ステムIIの二つのストランドを接続するループ（図５中に／ ／で示す）を置換することができる。ステムII自体は１〜10個の塩基対である。後記の実施例１と２では、化合物１と２が、長さが１〜５個の塩基対のステムIIを有する分子中に組込まれた。また化合物１、４および５は、ステムIとIIIの認識アームの中のヌクレオチド、またはステムII自体の中のヌクレオチドを置換する。
図６はペリレンベースの非ヌクレオチド擬似体のホスホルアミダイト３の合成を示す線図である。
図７は非塩基のデオキシリボースまたはリボースの非ヌクレオチド擬似体ホスホルアミダイトの合成を示す線図である。
図８ａと８ｂはそれぞれ、８ｎＭまたは４０ｎＭの各種リボザイムによる基質の切断を示す線図である。
非ヌクレオチド擬似体
本発明に有用な非ヌクレオチド擬似体としては先に一般的に述べたものがある。当該技術分野の当業者は、これらの擬似体は、標準の方法によって酵素分子中に所望の位置に組込むことができることが分かるであろう。標準の実験を行い例えば分子を合成してその酵素活性を試験することによってその最適位置を決定して、適切な選択を行うことができる。最適の分子は、酵素活性を得るのに必要な公知のリボヌクレオチドを含有し、かつ分子の構造を簡単なものに変える非ヌクレオチドを含有している。要求されることは、いくつかのヌクレオチドが一つの非ヌクレオチドで置換され、酵素分子合成の合成ステップが節約されて、ＲＮＡまたはＤＮＡにさえ比べて酵素分子の安定性が高められることである。
以下に、非ヌクレオチド擬似体を含有する触媒核酸の非ヌクレオチドホスホルアミダイトを用いる合成の実施例を示すが、本発明を限定するものではない。
実施例１：非ヌクレオチド擬似体：ポリエステルスペーサーを含有するハンマーヘッドリボザイムの合成
ポリエステルスペーサーである化合物１（図４；Ｘ＝０、ｎ＝２または４）の、ｎ＝２もしくは４のものを単独でまたはｎ＝２のものを二重に、ハンマーヘッドリボザイムのステムIIのベースにループ２を置換して組込んだところ触媒効率が低いリボザイムが生成したことが分かった。利用した合成法は、Usmanら、J.Am.Chem.Soc.、109巻、7845頁、1987年；およびScaringeら、Nucleic Acids Res.、18巻、5433頁、1990年に記載されているような通常のＲＮＡ合成法の手順にしたがった合成法であり、通常の核酸保護基と核酸カップリング基が用いられ、例えば５'末端ではジメトキシトリチルが３'末端ではホスホルアミダイトが用いられる。段階的カップリングの平均収率は＞98％であった。これらの型の擬似体の構造はまだ最適化されていないが、先に述べたように、このことは標準の試験法を用いて容易に達成することができるであろう。これらの試験は、このような擬似体が、触媒活性を維持しながらリボザイムのループと一部分を置換する可能性を示している。これらの擬似体はハンマーヘッドリボザイム中に組込むことができるだけでなく、ヘアピン、肝炎デルタウイルス、またはグループ１もしくはグループ２のイントロン中にも組込むことができる。したがってこれら擬似体は任意の核酸構造中に置換モチーフとして汎用することができる。このような擬似体を用いると、非ヌクレオチド擬似体なしのオリゴヌクレオチドを使用する場合と比べて、最終の核酸分子から約２〜10個のヌクレオチドを省略することができる。
実施例２：非ヌクレオチド擬似体：芳香族スペーサーを含有するハンマーヘッドリボザイムの合成
別の実施例で、ハンマーヘッドリボザイムのステムIIＣ−Ｇのベースに対する特異的なリンカーを設計した。本発明の発明者は、Ｃ−Ｇの塩基対のＣ１'炭素間の距離は約16オングストロームであると考えている。これら二つのＲＮＡピースを、共有結合類似体のＣ−Ｇ塩基対で結合するため、ＧとＣそれぞれの残基の３'−ＯＨと５'−ＯＨの間にリンカーを含有する新しい型の二量体ホスホルアミダイトを構築することができる。図４に示す二つの型の塩基対擬似体２または３は剛性の芳香族スペーサーである。これらのスペーサーを、実施例１に記載されているようにして、ループ２を置換してハンマーヘッドリボザイムのステムIIのベースに組込んだところ、触媒効率が低いリボザイムが生成することが分かった。他の擬似体は、Nielsenら、Science、254巻、1497頁、1991年に記載されているポリアミド骨格に類似の可撓性のアルキルスペーサーである（図４の６またはその誘導体６ａ；Zuckermanら、J.Am.Chem.Soc.、114巻、10464頁、1992年参照）。このような擬似体を使用すると、非ヌクレオチド擬似体なしのオリゴヌクレオチドを使用する場合と比べて、最終の核酸分子から約２〜10個のヌクレオチドを省略することができる。
実施例３：非ヌクレオチド擬似体の芳香族スペーサーのホスホルアミダイト２の合成
この化合物は、Salunkheら、J.Am.Chem.Soc.、114巻、6324頁、1992年に初めて報告された。その合成法は以下のように改変した。ＤＭＦ（12ml）中のテレフタル酸（1.0g、6.0mmol）に、ＥＤＣ（2.54g、13.2mmol）、アミノヘキサノール（1.55g、13.2mmol）およびＮ−メチルモルホリン（1.45ml、13.2mmol）を添加した。その反応混合物を一夜撹拌したがその時、溶液は濁っていた。その反応混合物に水を添加して生成物を沈澱させた。固形分をろ取して水で洗浄し乾燥して562mg（25.7％）のジオールを得た。
ＤＭＳＯ（40ml）中の上記ジオール（250mg、0.687mmol）に、トリエチルアミン（287μl、2.06mmol）、ジメトキシトリチルクロリド（220mg、0.653mmol）および触媒ＤＭＡＰを添加した。その反応混合物を40℃まで加熱して一夜撹拌した。得られた混合物を室温（約20〜25℃）まで冷却し、水で反応を停止させ、次いでＥｔＯＡｃで３回抽出した。固体の沈澱が有機層中に残留したので、これを単離したところ出発物質のジオール（50mg、20％）であることが分かった。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し次に蒸発させた。得られた油状物をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン中10%のＥｔＯＡｃ〜100％ＥｔＯＡｃ）で精製して250mg（55％）のモノトリチル化化合物を得た。
０℃のＴＨＦ（１ml）中の上記アルコール（193mg、0.29mmol）に、ジイソプロピルエチルアミン（101μl、0.58mmol）を添加し、次に２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルアミノクロロホスホルアミダイト（78μl、0.35mmol）を滴下した。得られた混合物を５分間撹拌し次に室温まで昇温させた。１時間後、反応混合物の反応をメタノールで停止させ次に該混合物を蒸発させた。得られた油状物をフラッシュクロマトグラフィー（１：１ヘキサン：ＥｔＯＡｃ）で精製して158mg（63％）のホスホルアミダイトを得た。
実施例４：非ヌクレオチド擬似体の芳香族スペーサーホスホルアミダイト３の合成
図６に示すように、キノリン（10ml）中の３、４、９、10−ペリレンテトラカルボン酸二無水物11（1.0g、2.55mmol）に、エタノールアミン（919μl、15.3mmol）とＺｎＯＡｃ・2.5Ｈ２Ｏ（140mg、0.638mmol）を添加した。反応混合物を190℃で８時間加熱した。得られた溶液を冷却し、１ＮＨＣｌを添加して生成物を沈澱させ、次いでその混合物をろ過した。固形分を、ろ液がもはや淡緑色でなくなるまで熱10％ＣａＣＯ３溶液で洗浄した。残留した鮮やかな赤色の沈澱12を乾燥した。
得られたジオール12を、２について先に述べたようにして処理し、ホスホルアミダイト３を得た。
実施例５：非ヌクレオチド擬似体：非塩基のヌクレオチド４と５を含有するハンマーヘッドリボザイムの合成
化合物４（Ｒ＝Ｈ）をIyerら、Nuleic Acids Res.、18巻、2855頁、1990年にしたがって製造した。図７に示すように、化合物４と５（Ｒ＝ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル）のホスホルアミダイトを以下のようにして製造した。
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（250ml）にＤ−リボース（20.0g、0.105mol）を溶解して得た溶液に、２，２−ジメトキシプロパン（50ml）とｐ−トルエンスルホン酸一水和物（300mg）を添加した。その反応混合物を室温で16時間撹拌し次いで蒸発乾固した。得られた組生成物をピリジン（２×150ml）とともに同時蒸発させたのち乾燥ピリジン（300ml）に溶解し、次に４，４−ジメトキシトリチルクロリド（37.2g、0.110mol）を添加し、室温で24時間撹拌した。得られた反応混合物をメタノール（50ml）で希釈し次いで蒸発乾固した。残留物をクロロホルム（800ml）に溶解し、５％ＮａＨＣＯ３（２×200ml）、食塩水（300ml）で洗浄し、乾燥し、蒸発させ、トルエン（２×100ml）とともに同時に蒸発させ次にフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３）で精製して40.7g（78.1％）の化合物ａを得た。
ジメトキシトリチル誘導体の（9.0g、18.3mmol）とＤＭＡＰ（4.34g、36mmol）を乾燥ＣＨ３ＣＮに溶解して得た溶液に、クエノキシチオカルボニルクロリド（3.47g、20.1mmol）をアルゴン雰囲気下滴下して加えた。得られた反応混合物を室温で16時間放置し次いで蒸発乾固した。得られた残留物をクロロホルム（200ml）に溶解し、５％ＮａＨＣＯ３、食塩水で洗浄し、乾燥し、蒸発し、次いでフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３）で精製して、β−アノマーとして8.0g（69.5％）の化合物ｂを得た。
中間体ｂ（3.0g、4.77mmol）のトルエン（50ml）溶液に、ＡＩＢＮ（0.82g、5.0mmol）とＢｕ３ＳｎＨ（1.74g、6.0mmol）をアルゴン雰囲気下で添加し、その反応混合物を80℃で７時間保持した。その溶液を蒸発し、得られた残留物をフラッシュクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ３）で精製して、1.5g（66％）の保護されたリビトールｃを得た。
次にすべての保護基を酸処理によって除去し次いでトリチル化を行い保護されたリビトールｄを得た。このリビトールｄを、Scaringtら、Nucleic Acids Res.、18巻、5433頁、1990年に記載されている一般的な方法によって目的物のホスボルアミダイト４と５に変換した。
実施例６
図８ａと８ｂを参照して、基質の切断を、８ｎＭと40ｎＭの濃度で各種修飾リボザイムを未修飾リボザイムと比較することによって示す。具体的に述べると、配列ucuccA UCU GAU GAG GCC GAA AGG CCG AAA Auc ccu（小文字は、２'−０−メチル基を含有する）の対照リボザイムを、リボザイムＡ（ucu ccA UCU GAU GAG GCC SGG CCG AAA Auc ccu）、Ｂ（ucu ccA UCU GAU GAG CSG CG AAA Auc ccu)、Ｃ（ucu ccA UCU GAU GAG GCC bbb bGG CCG AAA Auc ccu）、およびＤ（ucu ccA UCU GAU GAG Cbb bbG CGAA AAu ccc u）（Ｓ＝ヘキサエチレングリコールリンカー；およびｂ＝非塩基のヌクレオチド４）と比較した。これらはすべて、基質を切断する活性を有していた。
リボザイムの投与
選択されたリボザイムは例えば、イオン導入法、電気穿孔法またはイオン対分子もしくは共有結合付加物、およびその外の薬理学的に承認された送達法を用いて、適切な送達ビヒクル例えばリポソーム、放出調節媒体により関連組織にリボザイムを外因的に送達することによって、ウイルス感染患者または疾病患者に予防的に投与することができる。投与経路としては、筋肉内、エアゾール、経口（錠剤または丸剤の形態）、局所、全身、眼、腹腔内および／またはくも膜下の経路がある。
任意の選択されたリボザイムの特定の送達経路は、リボザイムの用途によって決まる。一般に各リボザイムの特定の送達プログラムは、細胞内局在に関する未修飾リボザイムの取込み次いで効力の実証に集中している。あるいは、動物の臓器または組織内のこれら同じ細胞への送達を追跡してもよい。取込みの試験法としては、送達ビヒクルまたは送達法にかかわらず細胞のリボザイム取込みを評価する取込み検定法がある。このような検定法によって、取込みによるリボザイムの細胞内局在性も測定され、結局、標的配列を含有している細胞コンパートメント（細胞核および／または細胞質）内の定常状態濃度を維持するのに必要な条件が確認される。次に効力と細胞毒性を測定する。毒性は細胞生存能力のみならず細胞機能にも関連する。
使用できる送達法としては以下のものがある。
ａ．リポソーム内への封入
ｂ．レトロウイルスベクターによる形質導入
ｃ．コレステロールとの接合
ｄ．大部分のｓｎＲＮＡまたは核タンパク質に見られる抗原結合部位または核標的部位を利用する核コンパートメントへの局在化
ｅ．ヌクレオチド誘導体を用いることによるリボザイムの電荷の中和、および ｆ．血液幹細胞を用いて行うリボザイムの全身体への分布、である。
本発明に有用な送達法には、リボザイムの修飾および粒子担体の医薬送達ビヒクルを含む。恐らく大部分が小分子の未修飾リボザイムは、ゆっくりではあるが細胞によって吸収される。細胞の取込みを増大させるため、リボザイムはその電荷を減らすが特定の官能基を維持する方式で、ほとんどランダムに修飾することができる。その結果、細胞膜を横切って拡散できる分子が得られ、透過性にかかるバリヤーが除かれる。
電荷を減らすために行うリボザイムの修飾は、これらの大きい分子の細胞取込みを増大する一方法である。しかし上記のランダム法は、リボザイムが構造および機能の面で、小さい医薬分子より複雑なので得策ではない。リボザイムの触媒活性を維持するのに必要な構造上の必要条件は当該技術分野の当業者は充分理解していることである。これらの必要条件は、細胞送達を強化するために修飾を計画するときに考慮される。この修飾は、ヌクレアーゼによる分解に対する感受性を低下させるためにも計画される。これら両者の特徴はリボザイムの効力を大きく改善するはずである。細胞の取込みは、リボザイムの切断活性のために必要なホスホジエステル結合を変える必要なしでいく桁も増大させることができる。
ホスフェートの骨格の化学的修飾で、負の電荷が減少し、膜を横切って自由に拡散できるようになる。この原理は、アンチセンスＤＮＡ法について実証され成功している。ＤＮＡとＲＮＡとは化学的組成が類似しているので、この方法は便利な方法である。身体内では、修飾リボザイムを組織の細胞中に拡散させるには外部の濃度（external concentration）を維持することが必要である。疾患組織が一過性高濃度の医薬に暴露され、その医薬が全身吸収によってゆっくり分散される投与経路が好ましい。リボザイムの循環半減期を増大するために計画された医薬担体とともに静脈内投与する方法も利用できる。医薬担体の大きさと組成によって、血液流からの迅速なクリアランス（clearance）が制限される。感染部位に蓄積するように製造された担体は、リボザイムを分解プロセスから保護することができる。
医薬送達ビヒクルは全身投与と局所投与の両者に対して有効である。これらの媒体は、除放用容器として働くようにまたはその内容物を標的細胞に直接送達するように設計することができる。直接伝達医薬媒体を用いる利点は、１回の取込み当たり多数の分子が送達されることである。このような媒体は、他の方法では血液流から速やかに除去される医薬の循環半減期を増大させることができることが示されている。この範疇に入るかような特別の医薬送達ビヒクルの例としては、リポソーム類、ヒドロゲル類、シクロデキストリン類、生分解性ナノカプセル類および生物接着性ミクロスフェア（bioadhesive microsphere）類がある。
この範疇の送達系のうちリポソームが好ましい。リポソームは細胞内安定性を増大し、取込み効率を高め、そして生物活性を改善する。
リポソームは、細胞膜を構成している脂質と類似の方式で配列された脂質で構成された中空の球状媒体である。リポソームは、水溶性化合物を保有する内部水性空間を有し、大きさは直径が0.05〜数ミクロンの範囲内にある大きさである。いくつかの試験の結果、リポソームはＲＮＡを細胞に送達することができかつそのＲＮＡは生物活性を保有したままであることが分かった。
例えば、研究用具として最初設計されたリポソーム送達ビヒクルのリポフェクチン（Lipofectin）は、無傷のｍＲＮＡ分子を細胞に送達して対応するタンパク質を産生させ得るることが分かった。他の試験では、長さが3500ヌクレオチドでかつＨＩＶの構造タンパク質に対してアンチセンスのＲＮＡ分子を含有する抗体標的（antibody targeted）リポソーム伝達系は、配列特異的にウイルスの増殖を阻害した。その抗体はリポソームを目標の感染細胞に向けたのみならず、感染細胞によるリポソームのインターナリゼーションをトリガーした。エンドサイトーシスをトリガーすることはウイルスを阻害するのに有用である。最終的に、リポソームで送達された合成のリボザイムは、Ｈ９細胞（ＨＩＶ感受性細胞の一例）の核に集中して機能することが分かり、それらリボザイムが配列を細胞内で切断することが実証された。一層小さいリボザイム（長さが142個未満のヌクレオチド）を用いて他の細胞型にリポソームで伝達すると、異なる細胞内局在を示す。
リポソームはいくつもの利点を提供する。すなわちリポソームは組成が非毒性でかつ生物分解性であり；リポソームは長い循環半減期を示し；そして認識分子をその表面に容易に結合して、組織をターゲティングすることができる。最終的に、液体懸濁物または凍結乾燥物の製品のリポソームベース医薬をコスト面で効率的に製造できたので、この方法が容認可能な医薬伝達系として実施できることが実証された。
ナノカプセルおよびヒドロゲルのような他の徐放性医薬送達系をリボザイムの送達ビヒクルとして用いてもよい。これらの担体は化学療法剤およびタンパク質ベースの医薬用に開発されたものであるので、リボザイムの送達に適応させることができる。
リボザイムの局所投与は、投与部位に濃度が局在して全身吸収が最少になるので有利である。このことから疾患部位に対するリボザイムの送達法が簡単になり、毒性の程度が低下する。さらに、塗布すべき物質の量が他の投与経路の場合に必要な量よりはるかに少ない。有効な送達を行うにはリボザイムが感染細胞中に拡散する必要がある。負の電荷を中和するためリボザイムを化学的に中和することが浸透させるのに必要である。しかし、電荷の中和が不充分な場合、修飾リボザイムを、アゾーン（Azone）またはオレイン酸のような浸透エンハンサーをリポソーム中に混合して調合してもよい。リポソームが、修飾リボザイムと浸透エンハンサーがリポソームから感染細胞中に移動する場合に除放性を与える媒体であるか、または、リポソームのリン脂質が、修飾リボザイムと浸透エンハンサーの細胞への送達を容易にすることとに直接参画する。場合によっては、リボザイムと浸透エンハンサーの両者を、除放性を付与するため坐剤に配合してもよい。
またリボザイムは全身投与を行ってもよい。全身吸収とは、薬剤が血流中に蓄積され次いで全身に分布されることを意味する。全身吸収をもたらす投与経路としては、静脈内、皮下、腹腔内、鼻腔内、くも膜下および眼の経路がある。これらの各投与経路によって、接近可能な疾患組織がリボザイムに対して暴露される。皮下投与の場合は局在リンパ節に注入されそこからリンパネットワークを通じて循環が行われる。循環系に入る速度は分子量または大きさの関数であることが示されている。リポソームなどの医薬担体を使用すると、リボザイムはリンパ節に局在する。そのリボザイムは細胞中に拡散するよう修飾することができ、または未修飾リボザイムまたは修飾リボザイムを細胞中に送達するのにリポソームは直接参画することができる。この方法は、抗ＨＩＶリボザイムを用いてＡＩＤＳを治療するのに特に有用である。
ＡＩＤＳ療法に好ましいのは、オリゴヌクレオチドをリンパ球とマクロファージに送達できるリポソーム配合物を使用することである。このオリゴヌクレオチド送達系は、感染した一次免疫細胞内でＨＩＶの増殖を阻害する。この配合物は37℃にて８時間後に、90％のリンパ球が吸収することを全血の試験結果が示している。生体分布（biodistribution）および薬物動態学の予備試験では、静脈内投与を行ってから１時間後に、脾臓組織の１g当たり注射された投与量の70％が脾臓で得られた。この配合物は、二つの理由から、抗ＡＩＤＳリボザイムに用いる優れた送達ビヒクルを提供する。第一に、Ｔヘルパーリンパ球とマクロファージがウイルスに感染した一次細胞であり、そして第二に皮下投与によって、リボザイムが、リンパ節内に常在しているＨＩＶに感染したリンパ球とマクロファージに送達される。リポソームはリンパ系を出て循環系に入り、次いで脾臓内に蓄積され、脾臓内でリボザイムが、常在しているリンパ球とマクロファージに送達される。
腹腔内投与の場合もやはり循環系に入り、リボザイム送達ビヒクルの複合体の分子量または大きさが循環系に入る速度を制御している。
静脈内に注射されたリポソームは、肝臓、肺および脾臓への蓄積を示す。その組成と大きさを調節して、注射投与量の30〜40％が蓄積されるようにすることができる。残りの投与量は血流中を24時間まで循環する。
選択される送達方法は、感染細胞中の細胞質への蓄積が行われねばならずかつ分子は最適の投与を行うためある種のヌクレアーゼ耐性を有していなければならない。核への送達も利用できるが余り好ましくない。最も好ましい送達法としては、リポソーム（10〜400nm）、ヒドロゲル、放出制御ポリマー、マイクロインジェクションもしくは電気穿孔法（エキソビボ処置の場合に用いる）およびその外の薬学的に許容される媒体が挙げられる。投与量は疾患の症状と投与経路によって決まるが、体重１kg当たり１日に100〜200mgである。治療期間は、疾患の症状の過程によって定まり、通常少なくとも14〜16日間、可能であれば連続して行う。局所投与、眼への投与および膣への投与の場合、毎日複数回投与することが考えられる。その投与回数は、疾患送達ビヒクルおよび臨床試験による効力のデータによって決まる。
リボザイムの細胞内治療濃度は、取込みと分解の速度によって決定される。分解度が低下するとリボザイムの細胞内半減期が延長される。したがって、化学的に修飾されたリボザイム、例えばホスフェート骨格の修飾またはリボザイムの５'と３'の末端のヌクレオチド類似体によるキャッピングを行ったリボザイムでは異なる投与量を投与する必要がある。有用な系の説明は上記技術中に提供されているが、これらはすべて本明細書に援用するものである。
リボザイムの設計に関するさらに詳細な説明については1993年８月６日付けで出願されたDraperの米国特許願第08／103,243号を参照のこと。なおこの文献はすべて本明細書に援用するものである。
その外の実施態様は後記の特許請求の範囲に含まれている。
図１は当該技術分野で公知のハンマーヘッドリボザイム領域の線図である。 図２は当該技術分野で公知のヘアピンリボザイム領域の一般構造の線図である。 図３は当該技術分野で公知の肝炎デルタウイルスリボザイム領域の一般構造の線図である。 図４は核酸酵素に組込むことができる各種の非ヌクレオチド擬似体（ミメティック）の線図である。 図５は各種の非ヌクレオチド擬似体（ミメティック）と核酸酵素に組込むのに好ましい位置を示す線図である。 図６はペリレンベースの非ヌクレオチド擬似体のホスホルアミダイト３の合成を示す線図である。 図７は非塩基のデオキシリボースまたはリボースの非ヌクレオチド擬似体ホスホルアミダイトの合成を示す線図である。 図８−ａと８−ｂはそれぞれ、８ｎＭまたは４０ｎＭの各種リボザイムによる基質の切断を示す線図である。 図９−ａから９−ｅは配列を示す図である。

Claims (4)

  1. 以下の化合物４および化合物５によって示される化合物からなる群から選択される化合物を用いて核酸分子に非塩基(abasic)ヌクレオチドが組み込まれている、非塩基ヌクレオチドを少なくとも１つ含む核酸分子：
    Figure 0003940407
     [式中、ＤＭＴはジメトキシトリチル、ＣＥはシアノエチル、ＲはＨまたはＯ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルである]。
  2. 該核酸分子が、２’糖の修飾を有するヌクレオチドを少なくとも１つ含む、請求項１に記載の核酸分子。
  3. 該核酸分子が、ホスフェート骨格の修飾を有するヌクレオチドを少なくとも１つ含む、請求項１または２に記載の核酸分子。
  4. 該核酸分子が、５’キャップまたは３’キャップあるいは５’キャップと３’キャップの両方を含む、請求項１から３のいずれかに記載の核酸分子。
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