JP3932515B2 - 金コロイド粒子を用いるｄｎａの配列検知方法、ターゲットｄｎａの末端一塩基変異検出方法、遺伝子検査方法 - Google Patents
金コロイド粒子を用いるｄｎａの配列検知方法、ターゲットｄｎａの末端一塩基変異検出方法、遺伝子検査方法 Download PDFInfo
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Description
本発明は、ＤＮＡの配列検知方法、前記方法を用いるターゲットＤＮＡの末端一塩基変異検出方法および遺伝子検査方法に関する。
近年の遺伝子工学の発展により、遺伝子診断は、医療分野における病原菌やウィルスの検出のみならず、犯罪捜査、親子鑑定、考古学研究、生物学などの様々な分野において頻繁に用いられるようになっている。
従来、遺伝子診断は、一般に、検体であるターゲットＤＮＡとこれに相補的なプローブＤＮＡを用意し、これらをハイブリダイゼーションし得る条件でアニールし、ハイブリダイゼーションの有無を検定することで行われてきた。初期の方法では、検体をナイロン膜などの固相に固定し、目的の遺伝子配列に相補的な遺伝子の結合を調べていた。しかし、一塩基変異を検出するという観点からは、その特異性が必ずしも高くないという問題が指摘されていた。また、数時間から１日という長い時間を要する上、遺伝子結合を検知するために、放射性同位元素を用い、あるいは、酵素反応を利用した複雑な化学反応を必要とするため、より精度の高い、簡便な方法が求められていた。
そこで、最近になって、プローブＤＮＡを基板に固定化した遺伝子チップを用いる遺伝子診断方法が研究、報告されている。しかし、この方法も、依然として、一塩基変異を検出におる前述の問題点を解決するものではなかった。
さらに、ラテックス微粒子や金コロイド粒子とＤＮＡの複合体の凝集を用いる遺伝子診断（非特許文献１及び２、特許文献１）が報告され、簡便な方法として注目された。しかし、このような複合体の凝集では、検体として添加されたＤＮＡ（ないしＲＮＡ）が複数の微粒子を架橋することにより凝集を促しているため、検体ＤＮＡの複数の箇所に結合する複数種類のＤＮＡ固定化微粒子を用意する必要があり、複雑で、汎用性がなかったのが実状である。
このような問題を解決する方法として、簡便に、高い精度で遺伝子の相違を診断する汎用的な方法が特許文献２に記載されている。この方法は、１本鎖ＤＮＡと疎水性物質の複合体であるＤＮＡコンジュゲート物質と金属陽イオンを含有する水溶液に、遺伝子ＤＮＡを添加し、該水溶液の光散乱強度、または光透過率のいずれかの変化を測定することを特徴とする遺伝子診断方法である。疎水性物質としては、実際には、イソプロピルアクリルアミドの重合体が用いられている。
確かにこの方法では、１種類のＤＮＡコンジュゲート物質を用いることで遺伝子ＤＮＡの一塩基変異を検出することができた。しかし、このＤＮＡコンジュゲート物質の調製は操作が煩雑であり、また、分析時にはミセル構造をとらせるために３０℃を超える温度に加温する必要があった。さらに、特許文献２の実施例では温度を４０℃に維持しているように、特許文献２に記載の方法では、一塩基変異を検出するためには、ＤＮＡコンジュゲート物質のＤＮＡと遺伝子ＤＮＡとのハイブリダイゼーションの温度を精密に制御する必要が有った。
Chemistry Lett., 1999, 1041-1042 J.Am.Chem.Soc., 1998, 120, 1959-1964 特表２００３−５０３６９９号公報
特開２００１−２５２０９８号公報
Chemistry Lett., 1999, 1041-1042 J.Am.Chem.Soc., 1998, 120, 1959-1964
そこで本発明の目的は、ハイブリダイゼーションの温度を精密に制御することなく、かつ目視を含む様々な検出方法によって、ＤＮＡの配列を検知し得る方法を提供することにある。
上記本発明の目的を達成する手段は、以下の通りである。
[請求項１]表面に１本鎖ＤＮＡを固定した金コロイド粒子とターゲットＤＮＡとを溶液中でハイブリダイズさせて、金コロイド粒子に固定された１本鎖ＤＮＡの金コロイド粒子に固定されていない側においていずれのＤＮＡ鎖も突出していない末端を有する２本鎖ＤＮＡを形成し、ハイブリダイズ後の金コロイド粒子の凝集体の形成の有無により、ターゲットＤＮＡの末端一塩基の情報を得る方法であって、
前記ハイブリダイズを０〜３０℃の範囲の温度で行い、かつ
前記凝集体が形成された場合には、少なくとも、金コロイド粒子に固定された１本鎖ＤＮＡの金コロイド粒子に固定されていない側の末端の一塩基と、この前記一塩基と対向する前記ターゲットＤＮＡの末端の一塩基が、相補的であると判定する、前記方法。
[請求項２]前記金コロイド粒子の凝集体の形成の有無を、溶液の色の変化を測定することによって観察する、請求項１に記載の方法。
[請求項３]前記溶液の色の変化の測定を、色が赤から青に変化するのを目視で識別するか、または吸収スペクトルを測定し、最大吸収の長波長側へのシフトを観測することにより行う、請求項２に記載の方法。
[請求項４]前記溶液に基板を共存させ、前記凝集体を該基板上に堆積させ、堆積した凝集体について凝集体の形成の有無を検出する、請求項１に記載の方法。
[請求項５]前記金コロイド粒子の凝集体の形成の有無を、顕微鏡、粒子からの散乱光の検知、電気化学的検出、表面プラズモン共鳴、または電気化学水晶振動子マイクロバランス（ＥＱＣＭ）によって観察する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
[請求項６]前記ハイブリダイズを、室温で温度制御なしで行う、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
[請求項７]前記ハイブリダイズを氷冷下で行う、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
[請求項８]前記ハイブリダイズを金属陽イオンの存在下で行う請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
[請求項９]前記金属陽イオンがナトリウムイオンまたはマグネシウムイオンである請求項８に記載の方法。
[請求項１０]請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法を含む、ターゲットＤＮＡの末端一塩基変異検出方法。
[請求項１１]ＤＮＡを増幅する工程および／またはプライマー一塩基伸長反応の後に、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法を行うことを特徴とする、遺伝子検査方法。
[請求項１]表面に１本鎖ＤＮＡを固定した金コロイド粒子とターゲットＤＮＡとを溶液中でハイブリダイズさせて、金コロイド粒子に固定された１本鎖ＤＮＡの金コロイド粒子に固定されていない側においていずれのＤＮＡ鎖も突出していない末端を有する２本鎖ＤＮＡを形成し、ハイブリダイズ後の金コロイド粒子の凝集体の形成の有無により、ターゲットＤＮＡの末端一塩基の情報を得る方法であって、
前記ハイブリダイズを０〜３０℃の範囲の温度で行い、かつ
前記凝集体が形成された場合には、少なくとも、金コロイド粒子に固定された１本鎖ＤＮＡの金コロイド粒子に固定されていない側の末端の一塩基と、この前記一塩基と対向する前記ターゲットＤＮＡの末端の一塩基が、相補的であると判定する、前記方法。
[請求項２]前記金コロイド粒子の凝集体の形成の有無を、溶液の色の変化を測定することによって観察する、請求項１に記載の方法。
[請求項３]前記溶液の色の変化の測定を、色が赤から青に変化するのを目視で識別するか、または吸収スペクトルを測定し、最大吸収の長波長側へのシフトを観測することにより行う、請求項２に記載の方法。
[請求項４]前記溶液に基板を共存させ、前記凝集体を該基板上に堆積させ、堆積した凝集体について凝集体の形成の有無を検出する、請求項１に記載の方法。
[請求項５]前記金コロイド粒子の凝集体の形成の有無を、顕微鏡、粒子からの散乱光の検知、電気化学的検出、表面プラズモン共鳴、または電気化学水晶振動子マイクロバランス（ＥＱＣＭ）によって観察する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
[請求項６]前記ハイブリダイズを、室温で温度制御なしで行う、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
[請求項７]前記ハイブリダイズを氷冷下で行う、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
[請求項８]前記ハイブリダイズを金属陽イオンの存在下で行う請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
[請求項９]前記金属陽イオンがナトリウムイオンまたはマグネシウムイオンである請求項８に記載の方法。
[請求項１０]請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法を含む、ターゲットＤＮＡの末端一塩基変異検出方法。
[請求項１１]ＤＮＡを増幅する工程および／またはプライマー一塩基伸長反応の後に、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法を行うことを特徴とする、遺伝子検査方法。
本発明によれば、ハイブリダイゼーションの温度を精密に制御することなく、かつ目視を含む様々な検出方法によって、ＤＮＡの配列を検知する方法を提供することができる。さらに、本発明の方法は、ＤＮＡの配列の検知を、（１）目視、（２）最大吸収のシフト、（３）顕微鏡観察、等の様々な方法で行うことができる。更に、本発明によれば、ターゲットＤＮＡの末端一塩基変異の検出を行うこともでき、更には、遺伝子診断を行うこともできる。
本発明の方法は、表面に１本鎖ＤＮＡを固定した金コロイド粒子とターゲットＤＮＡとを溶液中でハイブリダイズさせて、金コロイド粒子に固定された１本鎖ＤＮＡの金コロイド粒子に固定されていない側においていずれのＤＮＡ鎖も突出していない末端を有する２本鎖ＤＮＡを形成し、ハイブリダイズ後の金コロイド粒子の凝集体の形成の有無により、ターゲットＤＮＡの末端一塩基の情報を得る方法である。
なお、本発明において、「配列を検知する」とは、末端の一塩基を含んでプローブとハイブリダイズするターゲット配列が検出対象物に含まれているか否かを知ることを意味し、例えば、少なくとも一部の塩基配列が未知であるターゲットＤＮＡに対して、その未知配列に関する情報を得ることが含まれる。更に、本発明において、「配列を検知する」という語には、ある病原体に特徴的な核酸配列からプローブ核酸を作製して病原体の有無を確認する場合のように、既知ターゲット配列が、検出対象物に含まれるか否かを確認することも含まれる。具体的には、例えば、ターゲットＤＮＡの大部分の配列が既知であり、３'末端のみＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの４通りの可能性が残されている状態から、それが「Ａでない」ことを新たに知ることや、ターゲットＤＮＡが何種類かの配列をもったＤＮＡの混合物であるとき、その中に、ある病原体に特有の配列が存在するかどうかを新たに知ることが含まれる。
なお、本発明において、「配列を検知する」とは、末端の一塩基を含んでプローブとハイブリダイズするターゲット配列が検出対象物に含まれているか否かを知ることを意味し、例えば、少なくとも一部の塩基配列が未知であるターゲットＤＮＡに対して、その未知配列に関する情報を得ることが含まれる。更に、本発明において、「配列を検知する」という語には、ある病原体に特徴的な核酸配列からプローブ核酸を作製して病原体の有無を確認する場合のように、既知ターゲット配列が、検出対象物に含まれるか否かを確認することも含まれる。具体的には、例えば、ターゲットＤＮＡの大部分の配列が既知であり、３'末端のみＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃの４通りの可能性が残されている状態から、それが「Ａでない」ことを新たに知ることや、ターゲットＤＮＡが何種類かの配列をもったＤＮＡの混合物であるとき、その中に、ある病原体に特有の配列が存在するかどうかを新たに知ることが含まれる。
本発明の配列検知方法において、前記凝集体は、少なくとも、金コロイド粒子表面に固定した１本鎖ＤＮＡの金コロイドに固定されていない側の末端の一塩基と、この塩基に対向するターゲットＤＮＡの末端の一塩基とが相補的であり、これら末端の一塩基を含んで、上記１本鎖ＤＮＡとターゲットＤＮＡとがハイブリダイズしているときにのみ生じる。この点について、図１を参照して説明する。
図１に、３’末端にＣを有する１本鎖ＤＮＡを固定した金コロイド粒子と、５’末端にＧを有するターゲットＤＮＡを用いた例を示す。図１に示すように、少なくとも、金コロイド粒子表面に固定した１本鎖ＤＮＡの、金コロイドに固定されていない側（以下、「自由末端側」ともいう）の末端の一塩基（３’末端のＣ）と、この塩基に対向するターゲットＤＮＡの末端の一塩基（５’末端のＧ）とが相補的であり、これら末端の一塩基を含んで、上記１本鎖ＤＮＡとターゲットＤＮＡとがハイブリダイズすると、金コロイド粒子同士が凝集し、凝集体が形成される。一方、ターゲットＤＮＡの末端の一塩基が金コロイド粒子固定化ＤＮＡの自由末端側の末端塩基と相補的でない場合、凝集体は形成されない。こうして、本発明の方法によれば、金コロイド粒子の凝集体の形成の有無により、ターゲットＤＮＡの配列を検知することができ、特に、ターゲットＤＮＡの末端一塩基変異を検出することができる。
図１に、３’末端にＣを有する１本鎖ＤＮＡを固定した金コロイド粒子と、５’末端にＧを有するターゲットＤＮＡを用いた例を示す。図１に示すように、少なくとも、金コロイド粒子表面に固定した１本鎖ＤＮＡの、金コロイドに固定されていない側（以下、「自由末端側」ともいう）の末端の一塩基（３’末端のＣ）と、この塩基に対向するターゲットＤＮＡの末端の一塩基（５’末端のＧ）とが相補的であり、これら末端の一塩基を含んで、上記１本鎖ＤＮＡとターゲットＤＮＡとがハイブリダイズすると、金コロイド粒子同士が凝集し、凝集体が形成される。一方、ターゲットＤＮＡの末端の一塩基が金コロイド粒子固定化ＤＮＡの自由末端側の末端塩基と相補的でない場合、凝集体は形成されない。こうして、本発明の方法によれば、金コロイド粒子の凝集体の形成の有無により、ターゲットＤＮＡの配列を検知することができ、特に、ターゲットＤＮＡの末端一塩基変異を検出することができる。
本発明の配列検知方法は、ターゲットＤＮＡの末端一塩基変異を検出するために用いることができる。本発明の方法により検出できる末端一塩基変異は、塩基の置換、挿入または欠損のいずれであることもできる。
末端への塩基の挿入とは、ターゲットＤＮＡの末端（金コロイド粒子固定化ＤＮＡの自由末端側）に、例えば、１塩基以上の塩基が追加された場合を意味し、金コロイド粒子固定化ＤＮＡの固定化末端側から１５塩基までは完全相補性であることを意味する。
また、末端での塩基の欠損とは、ターゲットＤＮＡの末端（金コロイド粒子固定化ＤＮＡの自由末端側）の１塩基以上の塩基が欠失している場合を意味し、例えば、図６のＢのターゲットＤＮＡにおいて、塩基数は１４で、５’末端のＡが欠失しており、金コロイド粒子固定化ＤＮＡの固定化末端側から１４塩基までは完全相補性である場合である。
末端への塩基の挿入とは、ターゲットＤＮＡの末端（金コロイド粒子固定化ＤＮＡの自由末端側）に、例えば、１塩基以上の塩基が追加された場合を意味し、金コロイド粒子固定化ＤＮＡの固定化末端側から１５塩基までは完全相補性であることを意味する。
また、末端での塩基の欠損とは、ターゲットＤＮＡの末端（金コロイド粒子固定化ＤＮＡの自由末端側）の１塩基以上の塩基が欠失している場合を意味し、例えば、図６のＢのターゲットＤＮＡにおいて、塩基数は１４で、５’末端のＡが欠失しており、金コロイド粒子固定化ＤＮＡの固定化末端側から１４塩基までは完全相補性である場合である。
本発明では、金コロイド粒子の凝集体の形成の有無を、溶液の色の変化を測定することによって観察することができる。本発明の方法に用いる「表面に１本鎖ＤＮＡを固定した金コロイド粒子」において、金コロイド粒子は、例えば、粒子径が５〜２０ｎｍの範囲であり、このコロイド溶液は赤色を呈する。それはこの大きさの金コロイド粒子が表面プラズモン共鳴により 520 nm 付近に強い吸光ピークを持つためである。このピークは粒子径が大きくなるに従い長波長側にシフトし、溶液は紫色あるいは青色を呈する。金コロイド粒子が凝集すると、粒子径が大きくなるのと同様の効果を生じて溶液色が変化する。本発明では、この溶液の色の変化を測定することにより、凝集体の形成の有無を観察することができる。溶液の色の変化の測定は、溶液の色が赤から青に変化するのを目視で識別するか、または吸収スペクトルを測定し、最大吸収の長波長側へのシフトを観測することによって行うことができる。表面に１本鎖ＤＮＡを固定した金コロイド粒子を含む溶液の色は赤であり、これにターゲットＤＮＡをハイブリダイズさせると、ターゲットＤＮＡと金コロイド粒子固定化ＤＮＡとが完全相補性であれば、溶液の色は青に変化する。この変化を例えば、目視で識別するか、最大吸収の長波長側へのシフトを観測するかによって観察する。しかし、ターゲットＤＮＡの末端の一塩基が金コロイド粒子固定化ＤＮＡと相違する場合（但し、固定化されていない方の端が相違する場合）、溶液の色は変化しない。
更に、本発明では、前記凝集体の形成の有無を、顕微鏡、粒子からの散乱光の検知、電気化学的検出、表面プラズモン共鳴、または電気化学水晶振動子マイクロバランス（ＥＱＣＭ）によって観察することもできる。特に、ハイブリダイズを行う溶液に基板を共存させると、金コロイド粒子凝集体が、該基板上に堆積する現象が観察される。本発明では、この基板上の凝集体を、先に示したような手段で観察することもできる。そのような基板としては、シリコーン製基板、ガラス製基板等を用いることができる。
本発明の方法は、液体を、マイクロチップに形成されたマイクロ流路の中に導入するのに外部からの動力を必要としないマイクロ流体制御機構を有するマイクロチップを用いて行うことができる。ここで、マイクロチップとは、平板状の基板に微細加工によってマイクロ流路を集積化して形成したものを意味する。そのようなマイクロチップとしては、高分子材料により形成し、マイクロ流路内に減圧された空間を生起させて、自動的にマイクロ流路内に液体を導入するようにしたマイクロ流体制御機構を有するマイクロチップ、具体的には、以下に記載するようなマイクロ流体制御機構を有するマイクロチップを挙げることができる。
（１）所定の形状に形成されたマイクロチャネルと、前記マイクロチャネル内に液体を導入するために外部に開口する複数のポートとを有し、前記マイクロチャネルの全体または一部を高分子材料により形成し、前記高分子材料を脱気したことを特徴とするマイクロ流体制御機構を有するマイクロチップ；
（２）所定の形状に形成されたマイクロチャネルと、前記マイクロチャネルの複数の端部のうちの所定の端部側に連接され、前記マイクロチャネルの内部とのみ連通し外部に対して遮蔽された内部空間を有する減圧室と、前記マイクロチャネルの複数の端部のうちの前記減圧室が連接された端部を除いた残余の端部それぞれに形成され、前記マイクロチャネル内に液体を導入するために外部に開口する複数のポートとを有し、前記マイクロチャネルまたは前記減圧室のそれぞれの全体または一部のうちの少なくともいずれかを高分子材料により形成し、前記高分子材料を脱気したことを特徴とするマイクロ流体制御機構を有するマイクロチップ；
（３）一方の端部に複数の導入用流路が連接され、他方の端部が減圧室に連接された混合用流路と、前記複数の導入用流路それぞれの前記混合用流路と連通する側の端部とは異なる端部側に形成され、前記導入用流路内に液体を導入するために外部に開口する複数のポートと、前記減圧室の内部空間を、前記混合用流路の内部とのみ連通させ外部に対して遮蔽する封止手段とを有し、前記封止手段、前記減圧室または前記混合用流路のそれぞれの全体または一部のうちの少なくともいずれかを高分子材料により形成し、前記高分子材料を脱気したことを特徴とするマイクロ流体制御機構を有するマイクロチップ。
（１）所定の形状に形成されたマイクロチャネルと、前記マイクロチャネル内に液体を導入するために外部に開口する複数のポートとを有し、前記マイクロチャネルの全体または一部を高分子材料により形成し、前記高分子材料を脱気したことを特徴とするマイクロ流体制御機構を有するマイクロチップ；
（２）所定の形状に形成されたマイクロチャネルと、前記マイクロチャネルの複数の端部のうちの所定の端部側に連接され、前記マイクロチャネルの内部とのみ連通し外部に対して遮蔽された内部空間を有する減圧室と、前記マイクロチャネルの複数の端部のうちの前記減圧室が連接された端部を除いた残余の端部それぞれに形成され、前記マイクロチャネル内に液体を導入するために外部に開口する複数のポートとを有し、前記マイクロチャネルまたは前記減圧室のそれぞれの全体または一部のうちの少なくともいずれかを高分子材料により形成し、前記高分子材料を脱気したことを特徴とするマイクロ流体制御機構を有するマイクロチップ；
（３）一方の端部に複数の導入用流路が連接され、他方の端部が減圧室に連接された混合用流路と、前記複数の導入用流路それぞれの前記混合用流路と連通する側の端部とは異なる端部側に形成され、前記導入用流路内に液体を導入するために外部に開口する複数のポートと、前記減圧室の内部空間を、前記混合用流路の内部とのみ連通させ外部に対して遮蔽する封止手段とを有し、前記封止手段、前記減圧室または前記混合用流路のそれぞれの全体または一部のうちの少なくともいずれかを高分子材料により形成し、前記高分子材料を脱気したことを特徴とするマイクロ流体制御機構を有するマイクロチップ。
以下に、前記マイクロ流体制御機構を有するマイクロチップについて説明する。
まず、図２には、マイクロ流体制御機構を有するマイクロチップの概略構成上面説明図を示す。図３（ａ）には、図２に示すマイクロチップのＡ−Ａ線による断面図（概略構成縦断面図）が示されており、図３（ｂ）には、図２に示すマイクロチップのＢ−Ｂ線による断面図（概略構成縦断面図）が示されている。
ここで、マイクロチップ１０は、第１の板状部材１２と、第２の板状部材１４と、第１の板状部材１２に配置された封止手段としての被覆部材１６とを有して構成されている。
そして、第１の板状部材１２には、マイクロチャネルとして、上面から見てＹ字型状の一連の流路を構成するマイクロチャネル２０が形成されている。このマイクロチャネル２０は、上面から見て直線状に延長するマイクロ流路たる混合用流路２２と、混合用流路２２の一方の端部２２ａが二股に分岐されて形成されたマイクロ流路たる第１導入用流路２４ならびに第２導入用流路２６とを有するものである。ここで、混合用流路２２、第１導入用流路２４ならびに第２導入用流路２６は、第１の板状部材１２の下面１２ｂ側が開口した溝状に形成されており、その下面１２ｂ側の開口面は、第２の板状部材１４により遮蔽されている。
また、第１導入用流路２４の一方の端部２４ａ、即ち、混合用流路２２の端部２２ａ側とは異なる側の端部は、第１の板状部材１２の上面１２ａに形成された試料や試薬などの液体を導入するために外部に開口している開口部たる第１サンプル用ポート３０と連通している。一方、第２導入用流路２６の一方の端部２６ａ、即ち、混合用流路２２の端部２２ａ側とは異なる側の端部は、第１の板状部材１２の上面１２ａ側に形成された試料や試薬などの液体を導入するために外部に開口している開口部たる第２サンプル用ポート３２と連通している。
従って、第１導入用流路２４の端部２４ａならびに第２導入用流路２６の端部２６ａは、大気に開放されていることになる。一方、第１導入用流路２４の他方の端部２４ｂと第２導入用流路２６の端部２６ｂとは、混合用流路２２の一方の端部２２ａと連通している。
そして、混合用流路２２の他方の端部２２ｂ、即ち、第１導入用流路２４ならびに第２導入用流路２６と連通する側とは異なる側の端部は、減圧室４０の側方開口部４０ａと連通している、即ち、混合用流路２２の一方の端部２２ａには、第１導入用流路２４ならびに第２導入用流路２６の複数の導入用流路が連接されており、他方の端部２２ｂには、減圧室４０が連接されている。この減圧室４０は、第１の板状部材１２の上面１２ａにおいて、略円形形状の上方開口部４０ｂで開口するとともに、下面１２ｂ側において略円形形状の開口部で開口する円筒状に形成されており、その下面１２ｂ側の開口部は第２の板状部材１４により遮蔽されている。
一方、減圧室４０の上方開口部４０ｂには、封止手段たる被覆部材１６が配設されており、被覆部材１６によって上方開口部４０ｂは封止されている。これにより、減圧室４０の内部空間４０ｃは、混合用流路２２の内部とのみ連通し、外部に対しては遮蔽されている。即ち、混合用流路２２の他方の端部２２ｂは、減圧室４０の内部空間４０ｃには開放されているが、大気には開放されていない。
まず、図２には、マイクロ流体制御機構を有するマイクロチップの概略構成上面説明図を示す。図３（ａ）には、図２に示すマイクロチップのＡ−Ａ線による断面図（概略構成縦断面図）が示されており、図３（ｂ）には、図２に示すマイクロチップのＢ−Ｂ線による断面図（概略構成縦断面図）が示されている。
ここで、マイクロチップ１０は、第１の板状部材１２と、第２の板状部材１４と、第１の板状部材１２に配置された封止手段としての被覆部材１６とを有して構成されている。
そして、第１の板状部材１２には、マイクロチャネルとして、上面から見てＹ字型状の一連の流路を構成するマイクロチャネル２０が形成されている。このマイクロチャネル２０は、上面から見て直線状に延長するマイクロ流路たる混合用流路２２と、混合用流路２２の一方の端部２２ａが二股に分岐されて形成されたマイクロ流路たる第１導入用流路２４ならびに第２導入用流路２６とを有するものである。ここで、混合用流路２２、第１導入用流路２４ならびに第２導入用流路２６は、第１の板状部材１２の下面１２ｂ側が開口した溝状に形成されており、その下面１２ｂ側の開口面は、第２の板状部材１４により遮蔽されている。
また、第１導入用流路２４の一方の端部２４ａ、即ち、混合用流路２２の端部２２ａ側とは異なる側の端部は、第１の板状部材１２の上面１２ａに形成された試料や試薬などの液体を導入するために外部に開口している開口部たる第１サンプル用ポート３０と連通している。一方、第２導入用流路２６の一方の端部２６ａ、即ち、混合用流路２２の端部２２ａ側とは異なる側の端部は、第１の板状部材１２の上面１２ａ側に形成された試料や試薬などの液体を導入するために外部に開口している開口部たる第２サンプル用ポート３２と連通している。
従って、第１導入用流路２４の端部２４ａならびに第２導入用流路２６の端部２６ａは、大気に開放されていることになる。一方、第１導入用流路２４の他方の端部２４ｂと第２導入用流路２６の端部２６ｂとは、混合用流路２２の一方の端部２２ａと連通している。
そして、混合用流路２２の他方の端部２２ｂ、即ち、第１導入用流路２４ならびに第２導入用流路２６と連通する側とは異なる側の端部は、減圧室４０の側方開口部４０ａと連通している、即ち、混合用流路２２の一方の端部２２ａには、第１導入用流路２４ならびに第２導入用流路２６の複数の導入用流路が連接されており、他方の端部２２ｂには、減圧室４０が連接されている。この減圧室４０は、第１の板状部材１２の上面１２ａにおいて、略円形形状の上方開口部４０ｂで開口するとともに、下面１２ｂ側において略円形形状の開口部で開口する円筒状に形成されており、その下面１２ｂ側の開口部は第２の板状部材１４により遮蔽されている。
一方、減圧室４０の上方開口部４０ｂには、封止手段たる被覆部材１６が配設されており、被覆部材１６によって上方開口部４０ｂは封止されている。これにより、減圧室４０の内部空間４０ｃは、混合用流路２２の内部とのみ連通し、外部に対しては遮蔽されている。即ち、混合用流路２２の他方の端部２２ｂは、減圧室４０の内部空間４０ｃには開放されているが、大気には開放されていない。
ここで、マイクロチップ１０を構成する第１の板状部材１２、第２の板状部材１４、および被覆部材１６の材料としては、高分子材料を用いることができる。
例えば、高分子材料の１つであるゴムは、固体のミクロ構造がかなり疎であり、かつ固体分子の運動自由度が相当に大であるので、気体が固体中に入り込み易く、非常に多くの気体が溶解する固体材料である。このように非常に多くの気体が溶解可能な固体材料であるゴムなどの高分子材料によって、第１の板状部材１２、第２の板状部材１４、および被覆部材１６を形成するとよい。
なお、この実施の形態において、マイクロチップ１０を構成する第１の板状部材１２、第２の板状部材１４、および被覆材料１６の材料として、ゴム、具体的にはポリジメチルシロキサン（以下、「ＰＤＭＳ」ともいう）などのシリコーンゴムを用いることができる。
例えば、高分子材料の１つであるゴムは、固体のミクロ構造がかなり疎であり、かつ固体分子の運動自由度が相当に大であるので、気体が固体中に入り込み易く、非常に多くの気体が溶解する固体材料である。このように非常に多くの気体が溶解可能な固体材料であるゴムなどの高分子材料によって、第１の板状部材１２、第２の板状部材１４、および被覆部材１６を形成するとよい。
なお、この実施の形態において、マイクロチップ１０を構成する第１の板状部材１２、第２の板状部材１４、および被覆材料１６の材料として、ゴム、具体的にはポリジメチルシロキサン（以下、「ＰＤＭＳ」ともいう）などのシリコーンゴムを用いることができる。
マイクロチップ１０を構成する第１の板状部材１２、第２の板状部材１４、および被覆部材１６の材料としては、非常に多くの気体が溶解可能な固体材料が好適であり、例えば、空気に対する溶解度係数Ｓ＝０．０１１〜１０（ｃｍ3（ＳＴＰ；標準状態（０℃、１ａｔｍ））／（ｃｍ3ａｔｍ））の高分子材料を用いることができる。
ここで、
Ｃ：固体中の気体濃度（ｃｍ3（ＳＴＰ）／ｃｍ3）
（１ｃｍ3の固体に溶けている気体の量を、標準状態での体積に換算したもの）
Ｐ：固体に接触する気体の圧力（ａｔｍ）
Ｓ：溶解度係数（ｃｍ3（ＳＴＰ）／（ｃｍ3ａｔｍ））
とするヘンリーの法則
Ｃ＝ＳＰ
により、ＰＤＭＳの空気に対する溶解度係数を算出することができる。温度３５℃、空気を窒素８０％、酸素２０％とすると、ＰＤＭＳの空気に対する溶解度は、Ｓ＝０．１１ｃｍ3（ＳＴＰ）／（ｃｍ3ａｔｍ）となる。ただし、このＰＤＭＳの空気に対する溶解度係数Ｓは、ＰＤＭＳの重合度などに依存するものである。
Ｃ：固体中の気体濃度（ｃｍ3（ＳＴＰ）／ｃｍ3）
（１ｃｍ3の固体に溶けている気体の量を、標準状態での体積に換算したもの）
Ｐ：固体に接触する気体の圧力（ａｔｍ）
Ｓ：溶解度係数（ｃｍ3（ＳＴＰ）／（ｃｍ3ａｔｍ））
とするヘンリーの法則
Ｃ＝ＳＰ
により、ＰＤＭＳの空気に対する溶解度係数を算出することができる。温度３５℃、空気を窒素８０％、酸素２０％とすると、ＰＤＭＳの空気に対する溶解度は、Ｓ＝０．１１ｃｍ3（ＳＴＰ）／（ｃｍ3ａｔｍ）となる。ただし、このＰＤＭＳの空気に対する溶解度係数Ｓは、ＰＤＭＳの重合度などに依存するものである。
なお、マイクロチップ１０を構成する第１の板状部材１２、第２の板状部材１４、および被覆材料１６の材料は、上記のものに限られるものではなく、マイクロチップ１０を用いて実験を行う際の試料や試薬などの液体の種類などに応じて適宜選択することができる。
また、マイクロチップ１０の第１の板状部材１２は、例えば、長さＬ１が３０ｍｍ、長さＬ２が３０ｍｍ、厚さＬ３が２ｍｍの大きさの直方体形状を有しており、第２の板状部材１４は、例えば、第１の板状部材１２と略一致する寸法に設定されている。
そして、マイクロチャネル２０の混合用流路２２の端部２２ａから端部２２ｂまでの長さＬ４は、例えば、１４ｍｍに設定され、混合用流路２２の幅Ｌ５は、例えば、１００μｍに設定され、混合用流路２２の深さＬ６は、例えば、２５μｍに設定されている。
また、第１導入用流路２４の端部２４ａから端部２４ｂまでの長さ、ならびに、第２導入用流路２６の端部２６ａから端部２６ｂまでの長さＬ７は、例えば、４ｍｍに設定されている。なお、第１導入用流路２４ならびに第２導入用流路２６の幅は、例えば、混合用流路２２の幅Ｌ５と略一致する寸法に設定され、第１導入用流路２４ならびに第２導入用流路２６の深さは、例えば、混合用流路２２の深さＬ６と略一致する寸法に設定されている。
また、第１サンプル用ポート３０ならびに第２サンプル用ポート３２の直径Ｌ８は、例えば、２ｍｍに設定されている。また、減圧室４０の上方開口部４０ｂの直径Ｌ９は、例えば、１ｍｍに設定されている。
なお、上記した各構成部位の寸法は、各構成部位の大きさの一例を示すものであって、本発明で使用する場合、前記寸法に限定されるものではない。
以上の構成において、マイクロチップ１１０を脱気するために、圧力１０ｋＰａの真空チャンバーに、例えば、０．５〜３時間入れることができる（図４（ａ）参照）。このように、マイクロチップ１０全体を低圧環境に置くことにより、マイクロチップ１０全体に溶け込んでいる空気を抜くことができる（図４（ａ）における破線矢印参照）。つまり、マイクロチップ１０を形成しているＰＤＭＳに溶解している気体が取り除かれることになる。
そして、脱気を開始してから所定時間が経過した後、マイクロチップ１０を真空チャンバー内から大気中（１００ｋＰａ）に取り出す（図４（ｂ）参照）。こうして、真空チャンバー内における脱気を終了し、大気中に取り出されてマイクロチップ１０が大気圧に戻されたときから、マイクロチップ１０を形成するＰＤＭＳへの空気の再溶解が始まる（図４（ｂ）における破線矢印参照）。
こうしたＰＤＭＳへの空気の再溶解は、気体溶解度に関するヘンリーの法則に基づく現象である。即ち、ＰＤＭＳなどのシリコーンゴムは、液体のように平衡溶解度が接触気体の分圧に比例するものである。このため、低圧から大気圧に戻すことにより、平衡溶解度が再び上がり、系がこの新しい平衡に向かう際に、ＰＤＭＳへの空気の再溶解が始まる。
そして、前述のように溶解度係数Ｓ＝０．１１ｃｍ3（ＳＴＰ）／（ｃｍ3ａｔｍ）のＰＤＭＳは、非常に多くの気体が溶解可能な固体材料であって、こうしたＰＤＭＳによりなるマイクロチップ１１０の外部環境が低圧環境下から大気圧に戻されることで、マイクロチップ１０全体に新たに多くの空気が溶解することになる。こうして、大気中に取り出した後、マイクロチップ１０の第１サンプル用ポート３０に、第１の液体を滴下する。
ここで、マイクロチャネル２０を構成する３つの流路、即ち、混合用流路２２、第１導入用流路２４、ならびに第２導入用流路２６のうち、混合用流路２２の端部２２ｂ側は、被覆材料１６によって予め大気には開放されておらず、第１導入用流路２４の端部２４ａは、第１サンプル用ポート３０に滴下された第１の液体によって封止されている。その結果、第１の液体がマイクロチャネル２０に導入されたときには、第２導入用流路２６の端部２６ａのみが大気に開放されていることになる。
次に、マイクロチップ１０の第２サンプル用ポート３２に、第１の液体と混合すべき第２の液体を滴下する。これにより、第２導入用流路２６の端部２６ａが、第２サンプル用ポート３２に滴下された第２の液体によって封止されるので、マイクロチャネル２０に形成された各流路が、外部に対して閉ざされ、第１の液体と第２の液体とを混合用流路２２へ導入する動作が開始される。
より詳細には、第１サンプル用ポート３０に第１の液体を滴下し、第２サンプル用ポート３２に第２の液体を滴下した状態では、マイクロチャネル２０に形成された各流路が外部に対して閉ざされるので、混合用流路２２内の空気や、混合用流路２２の端部２２ｂが開放している減圧室４０の内部空間４０ｃの空気は、第１サンプル用ポート３０ならびに第２サンプル用ポート３２を介したマイクロチップ１０の外部との連絡を失い、マイクロチップ１０の閉ざされた各流路と減圧室とにより形成される空間（以下、「閉空間」という）に位置するようになる。
ここで、前述のようにマイクロチップ１０を真空チャンバー内から大気中に取り出したときから、マイクロチップ１０を形成するＰＤＭＳへの空気の再溶解が始まっているので（図４（ｂ）参照）、この閉空間に位置する空気は、混合用流路２２の内壁２２ｃや減圧室４０の内壁４０ｄからＰＤＭＳに溶解する（図４（ｄ）における破線矢印参照）。
その結果、混合用流路２２内や減圧室４０の内部空間４０ｃよりなる閉空間の圧力が下がり、第１導入用流路２４内の第１の液体と第２導入用流路２６内の第２の液体とは、同時に混合用流路２２に流れ込む（図４（ｃ）参照）。こうして、第１の液体と第２の液体との２液は、混合用流路２２内において混合される。
前述のマイクロチップ１０においては、第１の板状部材１２、第２の板状部材１４、および被覆材料１６をＰＤＭＳにより形成して、脱気し、ＰＤＭＳへの空気の再溶解が始まるようにした状態において、混合すべき２液によってマイクロチャネル２０が外部に対して閉ざされると、マイクロチャネル２０内に減圧された空間が生起され、液体は減圧された空間に吸引されて自動的に混合用流路２２内へ導入される。ここで、第１の液体として金コロイド粒子含有溶液を、第２の液体としてターゲットＤＮＡ含有溶液を用いれば（またはその逆でも構わない）、金コロイド粒子表面に固定した１本鎖ＤＮＡの自由末端側の末端の塩基と、ターゲットＤＮＡの末端の塩基とがハイブリダイズする場合には、金コロイド粒子の凝集体が形成され、基板上（主として混合用流路２２上）に堆積する様子が観察される。一方、ターゲットＤＮＡが末端一塩基変異を有する場合には、凝集体は形成されない。こうして、このようなマイクロチップを用いることにより、ターゲットＤＮＡの変異を検出することができる。
次に、前述のマイクロチップ１０の製造方法について説明する。マイクロチップ１０の製造工程の概略を、図５（ａ）〜（ｄ）の順に時系列で示す。
まず、マイクロチップ１０の第１の板状部材１２は、以下のような型成形技術によって製造され得る。即ち、所定の高さのマイクロチャネル２０を成形するための反転パターンを形成するために、超厚膜フォトレジスト（ＳＵ−８；Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍ社製、米国）をシリコン基板の上にスピンコートし、製造者メーカーの指示に従って処理する。その後、反転パターンを露光し、現像する。
現像の後に、接着を強化するために、炉中で４分間１５０℃で焼き、次いで、１〜２時間かけて室温まで徐冷する。型離れをよくするために、シリコン基板は、反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）機械（ＲＩＥ−１０ＮＲ；サムコインターナショナル研究所社製、日本）中で、ＣＨＦ3プラズマにより重合化されたフロロカーボン層を２分間成膜する。そのときの条件は、例えば、ＣＨＦ3ガス流量５０ｓｃｃｍ、圧力２０Ｐａ、電力２００Ｗとすることができる。
更に、ＰＤＭＳ（Ｓｙｌｇａｒｄ １８４；Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、米国）の未重合液体を、当該溶液を保持する型枠を使用してシリコン基板上に注ぐ（図５（ａ）参照）。これに対して、６５℃で１時間の第１キュアと、１００℃で１時間との第２キュアを行う。キュアされたＰＤＭＳチップは、シリコン基板から剥離される。
こうして製造されたＰＤＭＳチップに対して、金属パイプを使用してパンチすることにより、第１サンプル用ポート３０、第２サンプル用ポート３２、ならびに減圧室４０に対応する丸孔を穿設する（図５（ｂ）参照）。こうして製造された第１の板状部材１２は、同じくＰＤＭＳチップからなる第２の板状部材１４の表面に単に接触させるだけで可逆的に接着される（図５（ｃ）参照）。
そして、減圧室４０の開口部を被覆するようにして、第１の板状部材１２の上面１２ａにＰＤＭＳからなるテープを取り付けると（図５（ｄ）参照）、マイクロチップ１０が完成する。この際、ＰＤＭＳからなるテープに代わって、市販されている粘着テープを用いてもよい。
なお、本発明において使用し得るマイクロチップの製造方法は、上記の態様に限られるものではなく、マイクロチップを形成する材料の種類などに応じて、適当な製造プロセスでマイクロチップを製造することができる。また、上記には、導入用のマイクロ流路として、第１導入用流路２４ならびに第２導入用流路２６を有するマイクロチップを例にとり説明したが、混合用流路の一方の端部に連接される導入用流路の本数は、３本以上でもよい。また、ＰＤＭＳのような高分子材料により形成される領域は、マイクロチップ１０の全体に限られるものではなく、被覆材料１６の全体または一部、マイクロチャネル２０の混合用流路２２の全体または一部、減圧室４０の全体または一部、これらのうちの少なくともいずれかとすることができる。ただし、ＰＤＭＳなどの高分子材料により形成される領域全体の容量は、高分子材料内部の気体濃度に影響するものなので、マイクロチャネル２０内に減圧された空間が生起可能な範囲で、マイクロチャネル２０全体や減圧室４０全体の寸法に応じて、高分子材料により形成される領域は適宜変更するとよい。
本発明において使用される表面に１本鎖ＤＮＡを固定した金コロイド粒子を得るためには、金表面がチオール基と強く結合する性質を利用して、金コロイド粒子にＤＮＡや抗体を固定化するための公知の方法を用いることができる。
例えば、金コロイド粒子表面への１本鎖ＤＮＡの固定は、金コロイド粒子溶液にチオール化したDNAを添加し加熱すると、金表面にチオール基が結合し、結合しなかったチオール化DNAを遠心分離によって取り除くことにより、１本鎖ＤＮＡを固定した金コロイド粒子が得られる。１つの金コロイド粒子に対する１本鎖ＤＮＡの固定量（本数）は、例えば、金コロイド粒子の分散安定性や加えたいターゲットＤＮＡの量を考慮して、適宜決定され、通常５０〜３００本の範囲であることができる。金コロイド粒子に対する１本鎖ＤＮＡの固定量は、例えば、固定化するチオール化ＤＮＡの濃度や固定化反応時間などで制御することができる。
金コロイド粒子表面に固定した１本鎖ＤＮＡ（以下、「金コロイド粒子固定化ＤＮＡ」ということがある）は、塩基数が例えば、５〜３０の範囲、好ましくは１２〜１８、より好ましくは１４〜１６の範囲である。金コロイド粒子固定化ＤＮＡの配列は、ターゲットＤＮＡの配列に応じて適宜決定し、そのようなＤＮＡは公知の方法により適宜調製できる。金コロイド粒子固定化ＤＮＡの塩基数は、ターゲットＤＮＡの塩基数と同等であることができる。また、本発明の方法においては、金コロイド粒子固定化ＤＮＡの塩基数とターゲットＤＮＡの塩基数とは、必ずしも同等である必要はなく、少なくとも、金コロイド粒子固定化ＤＮＡの自由末端側の末端塩基とターゲットＤＮＡの末端塩基とが相補的でありハイブリダイズすれば、凝集体が形成される。
本発明の方法において、ターゲットＤＮＡは、塩基数が５〜３０の範囲であることができ、好ましくは１２〜１８、より好ましくは１４〜１６の範囲である。ターゲットＤＮＡの塩基数は、検出すべきターゲットＤＮＡの由来や調製のし易さ、あるいは、検出感度等を考慮して、適宜決定される。
本発明の方法においては、表面に１本鎖ＤＮＡを固定した金コロイド粒子とターゲットＤＮＡとを溶液中でハイブリダイズさせる。上記ハイブリダイズは、例えば、０〜３０℃の温度で行うことができる。本発明においては、前記ハイブリダイズを室温で温度制御なしに行うことができ、または、氷冷下で行うこともできる。ハイブリダイズを氷冷下で行うことにより、金コロイド粒子の凝集を促進することができる。
本発明の方法においては、表面に１本鎖ＤＮＡを固定した金コロイド粒子とターゲットＤＮＡとを溶液中でハイブリダイズする際に、金属陽イオンを共存させることができる。使用する金属陽イオンは特に限定されないが、好ましくはナトリウムイオン、またはマグネシウムイオンである。ナトリウムイオンとしては、NaCl等が考慮され、その濃度は、０．１〜３Ｍとすることが好ましく、より好ましくは、０．５〜２．５Ｍである。また、マグネシウムイオンとしては、MgCl2等が適用でき、その濃度は２０〜１００ｍＭ、より好ましくは、３０〜５０ｍＭとする。これらの金属陽イオンがＤＮＡ固定化金コロイド溶液中に共存することにより、相補的遺伝子を添加した際に、金コロイド粒子表面のＤＮＡ鎖と二重らせんが形成され、金コロイド粒子どうしの凝集が円滑に生じる。
更に、本発明は、前記配列検知方法を含む、ターゲットＤＮＡの末端一塩基変異検出方法にも関する。その詳細は、前述の通りである。
更に、本発明は、ＤＮＡを増幅する工程および／またはプライマー一塩基伸長反応の後に、前記配列検知方法を行うことを特徴とする、遺伝子診断方法にも関する。ＤＮＡの増幅工程およびプライマー一塩基伸長反応は、特に限定されず、公知の方法で行うことができる。ＤＮＡを増幅する工程および／またはプライマー一塩基伸長反応の後に、前述の本発明の配列検知方法を行うことにより、遺伝子診断、例えば、患者の一塩基多型の診断を行うことができる。これにより、例えば、その患者の薬物副作用に対する危険因子を評価することが可能である。具体的には、患者から採取した細胞を公知の方法で処理してＤＮＡを抽出する。抽出したＤＮＡのうち、目的の一塩基を含む領域を増幅する。その後、プライマー一塩基伸長反応により、目的の一塩基をプライマーの３’末端にコピーする。その後、前述の本発明の配列検知方法を行うことにより、金コロイド粒子の凝集体の形成の有無によって、目的の一塩基の種類を判定することができる。更に、本発明の遺伝子診断方法は、病原体由来ＤＮＡの検出にも有効である。
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
実施例１
直径15nmの金粒子を含むコロイド溶液を購入した。粒子濃度は1.4×1012 mL-1(=2.3 nM)であった。この金粒子は、非特許文献２の方法に少し修正を加えた以下の方法によって一本鎖DNAで修飾した。すなわち、3 nmolのチオール化ＤＮＡ HS-(CH2)6-5'-TAC GCC ACC AGC TCC-3' を、1 mLの金コロイド粒子溶液と50℃で16時間インキュベートした。この溶液に必要な塩類を添加して、0.1MのNaCl、10mMのリン酸塩緩衝液(pH 7)に変え、50℃で40時間反応させた。未反応のチオール化ＤＮＡを除去するために、溶液を14000rpmで25分間遠心分離し、上清を上記組成の緩衝液1 mLで置換した。同じ条件で再度遠心分離を行い、沈殿を上記組成の緩衝液0.5 mLに再分散した。
実施例１
直径15nmの金粒子を含むコロイド溶液を購入した。粒子濃度は1.4×1012 mL-1(=2.3 nM)であった。この金粒子は、非特許文献２の方法に少し修正を加えた以下の方法によって一本鎖DNAで修飾した。すなわち、3 nmolのチオール化ＤＮＡ HS-(CH2)6-5'-TAC GCC ACC AGC TCC-3' を、1 mLの金コロイド粒子溶液と50℃で16時間インキュベートした。この溶液に必要な塩類を添加して、0.1MのNaCl、10mMのリン酸塩緩衝液(pH 7)に変え、50℃で40時間反応させた。未反応のチオール化ＤＮＡを除去するために、溶液を14000rpmで25分間遠心分離し、上清を上記組成の緩衝液1 mLで置換した。同じ条件で再度遠心分離を行い、沈殿を上記組成の緩衝液0.5 mLに再分散した。
金コロイド粒子表面上に固定化されたチオール化ＤＮＡの数を評価するために、ジチオスレイトール(DTT)を添加し(終濃度=10 mM)、ＤＮＡを金コロイド粒子から遊離させた。オリグリーン(OliGreen) ssDNA定量キット(モレキュラープローブ社、米国)を使用して、溶液中のDNA濃度を測定したところ、約1μMであった。計算すると、1 粒子当たり約200のDNA (50pmol・cm-2)に相当する。
様々なNaCl濃度で、溶液色の観察により、および可視スペクトルの測定により金コロイド粒子の凝集挙動を調査した。
下記実験はすべて、室温(約25℃)で実施された。DNAを固定化していない金コロイド粒子は、0.1M のNaClで直ちに凝集し、溶液は紫色に変化した。対照的に、DNAを固定化した金コロイド粒子は、2.5MまでのNaCl濃度範囲内で、色変化は示さなかった(図６A)。粒子表面に固定化されたDNAが、金コロイド粒子の分散を安定化したことが分かる。次に、固定化DNAに相補的な配列を有するターゲットDNAを、双方のDNA量が等しくなるように加えた(図６B)。NaCl濃度が0.5M以上の場合、粒子凝集を意味する紫色への明確な変化が直ちに観察された(１０分以内)。この非架橋系での凝集プロセスは、数十分から数時間を要する架橋系での凝集プロセスよりはるかに迅速である。この違いは、凝集メカニズムが異なることに起因していると考えられる。この非架橋系では、金コロイド粒子の表面上にＤＮＡの二本鎖が形成されたとき、この二本鎖が溶液中のナトリウムイオンを強く引き付けることにより、金コロイド粒子周辺の電荷が中和されるために凝集が起きると考えられる。凝集の駆動力はロンドン−ファン・デル・ワールス引力であり、この力はある程度離れた距離からでも作用し、迅速な凝集へと導く。他方、架橋系では、凝集の速度論は、比較的遅いブラウン運動をする金コロイド粒子のランダムな衝突に支配される。図６のAおよびBに対応する可視スペクトルを図７にＡ及びＢとして示す。0.5MのNaClの存在下で、吸光ピークは、相補的なターゲットDNAの添加後10分間で525nmから560nmへ移動した。
下記実験はすべて、室温(約25℃)で実施された。DNAを固定化していない金コロイド粒子は、0.1M のNaClで直ちに凝集し、溶液は紫色に変化した。対照的に、DNAを固定化した金コロイド粒子は、2.5MまでのNaCl濃度範囲内で、色変化は示さなかった(図６A)。粒子表面に固定化されたDNAが、金コロイド粒子の分散を安定化したことが分かる。次に、固定化DNAに相補的な配列を有するターゲットDNAを、双方のDNA量が等しくなるように加えた(図６B)。NaCl濃度が0.5M以上の場合、粒子凝集を意味する紫色への明確な変化が直ちに観察された(１０分以内)。この非架橋系での凝集プロセスは、数十分から数時間を要する架橋系での凝集プロセスよりはるかに迅速である。この違いは、凝集メカニズムが異なることに起因していると考えられる。この非架橋系では、金コロイド粒子の表面上にＤＮＡの二本鎖が形成されたとき、この二本鎖が溶液中のナトリウムイオンを強く引き付けることにより、金コロイド粒子周辺の電荷が中和されるために凝集が起きると考えられる。凝集の駆動力はロンドン−ファン・デル・ワールス引力であり、この力はある程度離れた距離からでも作用し、迅速な凝集へと導く。他方、架橋系では、凝集の速度論は、比較的遅いブラウン運動をする金コロイド粒子のランダムな衝突に支配される。図６のAおよびBに対応する可視スペクトルを図７にＡ及びＢとして示す。0.5MのNaClの存在下で、吸光ピークは、相補的なターゲットDNAの添加後10分間で525nmから560nmへ移動した。
この系は、5'末端の一塩基ミスマッチに対して特別高い感度を有する。図６のCに示すような、5'末端の一塩基が置換されたターゲットＤＮＡに対して上記と同様の実験を実施したところ、あらゆるNaCl濃度で全く色の変化が起きなかった。さらに、可視スペクトルは、図７のターゲットを含まない場合におけるＡの曲線と判別不能であった。
末端ミスマッチについてのこの異常な感度に対する解釈は困難であるが、本発明者らは、1つの塩基でも一本鎖として働き、それがDNA-金コロイド粒子複合体の最外殻に位置する場合には、マイナスの電荷を維持して粒子凝集を妨げると考える。
実施例２
ＮａＣｌ濃度を１Ｍとして、実施例１と同様の方法で、様々な配列を有するプローブＤＮＡおよびターゲットＤＮＡを用いて実験を行った。結果を表１に示す。
ターゲットa2のように、固定末端側に変異があっても、完全相補鎖と同じように凝集が観察された。一方、ターゲットa4のようなランダム配列では、粒子表面で二本鎖形成が起こらないため、金コロイド粒子の凝集は観察されなかった。ターゲットa5〜a9のように、自由末端に挿入、欠損、置換などの変異を有するサンプルでも、凝集は起こらなかった。この挙動は、置換の結果生じたミスマッチの種類には関係しなかった（a7〜a9参照）。これらに完全相補する、別のプローブＤＮＡ（B〜D）を用いた場合は、金コロイド粒子が凝集することも確認した。さらに30塩基までの様々な長さ、配列を持ったプローブＤＮＡ（E〜K）を用いて実験したところ、完全相補ターゲットを加えたときには金コロイド粒子は凝集し、末端置換ターゲットを加えたときは凝集せず、例外はなかった。また、プローブの向きを逆転させて3'末端を金コロイド粒子に固定化した場合（M）も同様であった。
ＮａＣｌ濃度を１Ｍとして、実施例１と同様の方法で、様々な配列を有するプローブＤＮＡおよびターゲットＤＮＡを用いて実験を行った。結果を表１に示す。
ターゲットa2のように、固定末端側に変異があっても、完全相補鎖と同じように凝集が観察された。一方、ターゲットa4のようなランダム配列では、粒子表面で二本鎖形成が起こらないため、金コロイド粒子の凝集は観察されなかった。ターゲットa5〜a9のように、自由末端に挿入、欠損、置換などの変異を有するサンプルでも、凝集は起こらなかった。この挙動は、置換の結果生じたミスマッチの種類には関係しなかった（a7〜a9参照）。これらに完全相補する、別のプローブＤＮＡ（B〜D）を用いた場合は、金コロイド粒子が凝集することも確認した。さらに30塩基までの様々な長さ、配列を持ったプローブＤＮＡ（E〜K）を用いて実験したところ、完全相補ターゲットを加えたときには金コロイド粒子は凝集し、末端置換ターゲットを加えたときは凝集せず、例外はなかった。また、プローブの向きを逆転させて3'末端を金コロイド粒子に固定化した場合（M）も同様であった。
実施例３
実施例１で使用したものと同様のＤＮＡ修飾金コロイド粒子を28nM、NaClを1.0M、Tween 20を0.01%含む水溶液を調製し,金コロイド溶液とした。
実施例１で使用した２種類のターゲットＤＮＡの凍結乾燥物を、脱イオン水に溶解した後、NaClおよびTween 20を添加し、６．０μM ＤＮＡ、１．０Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％ Tween 20の最終濃度に調整し、ターゲットＤＮＡ溶液とした。以下、金コロイド粒子表面に固定された１本鎖ＤＮＡと完全相補性の配列を有するターゲットＤＮＡをＴ１、末端一塩基変異を有するターゲットＤＮＡをＴ２という。
実施例１で使用したものと同様のＤＮＡ修飾金コロイド粒子を28nM、NaClを1.0M、Tween 20を0.01%含む水溶液を調製し,金コロイド溶液とした。
実施例１で使用した２種類のターゲットＤＮＡの凍結乾燥物を、脱イオン水に溶解した後、NaClおよびTween 20を添加し、６．０μM ＤＮＡ、１．０Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％ Tween 20の最終濃度に調整し、ターゲットＤＮＡ溶液とした。以下、金コロイド粒子表面に固定された１本鎖ＤＮＡと完全相補性の配列を有するターゲットＤＮＡをＴ１、末端一塩基変異を有するターゲットＤＮＡをＴ２という。
３つの導入用流路を有するマイクロチップを、先に説明した方法に従って作製し、１時間脱気した。５分後、室温（約２５℃）で、金コロイド溶液、Ｔ１溶液、およびＴ２溶液を、それぞれ、中央導入用流路、左側導入用流路、および右側導入用流路から、各３μｌずつ導入した。数分後、４０倍の対物レンズおよびデジタルスチルカメラ（オリンパス、キャメディア(Camedia) C-4040）を有する倒立顕微鏡によって、明視野像を記録した。得られた明視野像を図９に示す。金コロイド溶液とＴ１溶液との境界部分に、黒色の線が徐々に現れ、金コロイド粒子凝集体の堆積が観察された。それに対し、金コロイド溶液とＴ２溶液との境界部分には、凝集体は観察されなかった。
実施例４
ヒト培養細胞株遺伝子の検定
PCR: 大腸がん培養細胞株HCT-15、WiDr、Sw480、DLD-1、COLO205を東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターより供給を受けた。キアゲンQIAamp DNA Mini Kitを用いて、各細胞からDNAを抽出、精製した。がん遺伝子K-rasのコドン12を含む配列をPCRにより増幅した。プライマーの配列は、5'-GAC TGA ATA TAA ACT TGT GG-3' および 5'-CTA TTG TTG GAT CAT ATT CG-3'であった。 100 μlのスケールでPCRを行った。反応液の組成は、50 ngのゲノムDNA、各プライマー（最終濃度1 μM）、 2.5 U ピロベストＤＮＡポリメラーゼ(Pyrobest DNA polymerase) (タカラ(TaKaRa))、ピロベスト反応バッファー(Pyrobest reaction buffer)、dNTP（最終濃度200 μM）であった。 94℃ 30秒、55℃ 30 秒、72℃ 1分の条件で30サイクル反応を行った。PCR反応生成物に対し、東洋紡(TOYOBO)製のMaExtractorを用いて脱塩とプライマー除去を行った。
ヒト培養細胞株遺伝子の検定
PCR: 大腸がん培養細胞株HCT-15、WiDr、Sw480、DLD-1、COLO205を東北大学加齢医学研究所医用細胞資源センターより供給を受けた。キアゲンQIAamp DNA Mini Kitを用いて、各細胞からDNAを抽出、精製した。がん遺伝子K-rasのコドン12を含む配列をPCRにより増幅した。プライマーの配列は、5'-GAC TGA ATA TAA ACT TGT GG-3' および 5'-CTA TTG TTG GAT CAT ATT CG-3'であった。 100 μlのスケールでPCRを行った。反応液の組成は、50 ngのゲノムDNA、各プライマー（最終濃度1 μM）、 2.5 U ピロベストＤＮＡポリメラーゼ(Pyrobest DNA polymerase) (タカラ(TaKaRa))、ピロベスト反応バッファー(Pyrobest reaction buffer)、dNTP（最終濃度200 μM）であった。 94℃ 30秒、55℃ 30 秒、72℃ 1分の条件で30サイクル反応を行った。PCR反応生成物に対し、東洋紡(TOYOBO)製のMaExtractorを用いて脱塩とプライマー除去を行った。
プライマー伸長反応: 精製したPCR産物を鋳型として、プライマー伸長反応を20 μlのスケールで行った。プライマーの配列は、5'-GTG GTA GTT GGA GCT-3'であり、K-rasコドン7-11に相当する。以下の反応により、コドン12の最初の一塩基がプライマーに付加される。反応液の組成は、PCR産物（最終濃度約250 nM）、プライマー（最終濃度1 μM）、 4 U サーモシーケナーゼ(ThermoSequenase)（アマシャム(Amersham)）、サーモシーケナーゼ反応バッファー(ThermoSequenase reaction buffer)、ddNTP（最終濃度25 μM）であった。 94℃ 30秒、37℃ 30秒、72℃ 30秒の条件で、Nucleic Acids Res. 2002 Mar 15;30(6):e27.に記載の方法に従って、30サイクル反応を行った。
金ナノ粒子凝集反応: プローブDNA（5'-C AGC TCC AAC TAC CAC-3'-(CH2)6-SH）で修飾された金ナノ粒子9.2 nM水溶液 5 μl に、上記プライマー伸長反応生成物を10 μl、NaCl 5 M水溶液を4 μl、Tween 20の1%水溶液1 μlを加えて混合し、氷冷した。結果を図１０に示す。鋳型なしでプライマー伸長反応を行った試料では金ナノ粒子は分散したままであったのに対し、鋳型ありの場合では５種類とも凝集した。この結果から、５種類の細胞すべてにおいて、対立遺伝子の少なくとも片方が、プローブDNAに相補する、すなわち標的部位に塩基Gを持つことが示された。別途シークエンシングを行った結果、すべての細胞で両方の対立遺伝子が標的部位に塩基Ｇを持つことが確認された。以上から、本発明の方法が、細胞から遺伝子の配列情報を得るために有効であることが実証された。
本発明によれば、ハイブリダイゼーションの温度を精密に制御することなく、かつ目視を含む様々な検出方法によってＤＮＡの配列を検知することができる。更に、本発明によれば、ターゲットＤＮＡの末端一塩基を検出することもできる。更に、本発明の方法は、遺伝子診断にも応用することができる。
Claims (11)
- 表面に１本鎖ＤＮＡを固定した金コロイド粒子とターゲットＤＮＡとを溶液中でハイブリダイズさせて、金コロイド粒子に固定された１本鎖ＤＮＡの金コロイド粒子に固定されていない側においていずれのＤＮＡ鎖も突出していない末端を有する２本鎖ＤＮＡを形成し、ハイブリダイズ後の金コロイド粒子の凝集体の形成の有無により、ターゲットＤＮＡの末端一塩基の情報を得る方法であって、
前記ハイブリダイズを０〜３０℃の範囲の温度で行い、かつ
前記凝集体が形成された場合には、少なくとも、金コロイド粒子に固定された１本鎖ＤＮＡの金コロイド粒子に固定されていない側の末端の一塩基と、この前記一塩基と対向する前記ターゲットＤＮＡの末端の一塩基が、相補的であると判定する、前記方法。 - 前記金コロイド粒子の凝集体の形成の有無を、溶液の色の変化を測定することによって観察する、請求項１に記載の方法。
- 前記溶液の色の変化の測定を、色が赤から青に変化するのを目視で識別するか、または吸収スペクトルを測定し、最大吸収の長波長側へのシフトを観測することにより行う、請求項２に記載の方法。
- 前記溶液に基板を共存させ、前記凝集体を該基板上に堆積させ、堆積した凝集体について凝集体の形成の有無を検出する、請求項１に記載の方法。
- 前記金コロイド粒子の凝集体の形成の有無を、顕微鏡、粒子からの散乱光の検知、電気化学的検出、表面プラズモン共鳴、または電気化学水晶振動子マイクロバランス（ＥＱＣＭ）によって観察する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ハイブリダイズを、室温で温度制御なしで行う、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ハイブリダイズを氷冷下で行う、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ハイブリダイズを金属陽イオンの存在下で行う請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記金属陽イオンがナトリウムイオンまたはマグネシウムイオンである請求項８に記載の方法。
- 請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法を含む、ターゲットＤＮＡの末端一塩基変異検出方法。
- ＤＮＡを増幅する工程および／またはプライマー一塩基伸長反応の後に、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法を行うことを特徴とする、遺伝子検査方法。
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