JP3904505B2 - マラリア感染診断剤及びマラリア原虫染色剤 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ロダシアニン系色素化合物を有効成分として含有するマラリア原虫染色剤や、マラリア感染診断剤、これを用いたマラリア感染症の判定方法や、マラリア原虫の染色方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
マラリアはハマダラカを媒体として人体に注入されたマラリア原虫に感染して発病する感染症であり、ヒトに感染するマラリア原虫には熱帯熱マラリア原虫（P. falciparm）、三日熱マラリア原虫（P．vivax）、四日熱マラリア原虫（P. malariae）、卵形マラリア原虫（P．ovale）等があり、世界中で患者数２〜３億人、死者年間２〜３百万人と推定されている。近年、殺虫剤耐性の蚊や、マラリアの特効薬として多用されてきたクロロキン（式（Ｖ）（ａ））に耐性を有するマラリア原虫が出現し、対策が困難となっている。抗マラリア剤又は抗マラリア化合物としては、２個の複素環を含有するオルソ−縮合系の新規化合物（例えば、特許文献１参照。）や、ＩＣＡＭ−１発現抑制作用を有する化合物を有効成分として含有する抗マラリア剤（例えば、特許文献２参照。）や、５’−ｏ−スルファモイル−２−クロロアデノシン等のヌクレオシド誘導体等を有効成分として含有する抗マラリア剤（例えば、特許文献３参照。）や、トリコテセン類等を有効成分として含有する抗マラリア剤（例えば、特許文献４参照。）や、シクロプロジギオシン等を有効成分とする抗マラリア剤（例えば、特許文献５参照。）や、リミノフェナジンを有効成分として含有するマラリア予防又は治療薬（例えば、特許文献６参照。）や、キノリン誘導体等を有効成分として含有する抗マラリア薬耐性克服剤（例えば、特許文献７参照。）や、５−フルオロオロチン酸及びスルファモノメトキシンを有効成分とする抗マラリア剤（例えば、特許文献８参照。）等が知られている。
【０００３】
一方、クロロキンに耐性をもつマラリア原虫に対して、メフロキン（式（Ｖ）（ｂ））、プリマキン等のクロロキン類似のキノリン環を持つアミン化合物が使用されており、最近では生薬である青嵩（和名：クソニンジン）から抽出されたアルテミシニン（式（Ｖ）（ｃ））等のパーオキシ環状化合物や、マラリア原虫のミトコンドリアに存在するチトクロームｂを阻害するアトバコン（式（Ｖ）（ｄ））等、パーオキシドやキノンという酸化段階の高い化合物が有効な治療薬として使われていた。しかしながら、これらの薬剤に対しても耐性を示すマラリア原虫がすでに現れたことが報告されており、新規なマラリア剤に対して次々に耐性を有するマラリア原虫が出現し、これらの抗マラリア薬が使えなくなる日はそう遠くはないと考えられている。また、マラリア原虫に対して有効であるキニーネ（式（Ｖ）（ｅ））は、腎不全を引き起こす可能性が高く、キニーネは最終治療としてのみ用いられているのが現状であり、感染の予防や、治療を保証することはできなかった。
【０００４】
【化１７】
【０００５】
本発明者らは、各種抗マラリア剤に耐性を有するマラリア原虫に対して有効であり、副作用が少ない抗マラリア剤として、上記抗マラリア剤と全く違う構造を持つ新化学療法剤の開発のためランダムスクリーニングを行った結果、クロロキンに匹敵する抗マラリア活性を示すロダニン母核（４−オキソチアゾリジン環）を有するロダシアニン色素化合物（式（VI）（ａ））（ＥＣ50＝７０ｎＭ、selectivity＝２１０）が有用であることを見い出し、既に報告している（例えば、特許文献９参照。）。更に、かかるロダシアニン色素化合物に種々の置換基を導入してロダシアニン系色素化合物を合成し、抗マラリア活性について検定したところ、ロダニン母核の特定位（Ｎ−３位）にアリル基が導入された化合物（式（VI）（ｂ））（ＥＣ50＝１２ｎＭ、selectivity＝１０００）が非常に高い抗マラリア活性と優れた選択毒性を有することを確認して既に報告している（特願２００１−２２０５７９号）。
【０００６】
【化１８】
【０００７】
このようなマラリア感染症に対する治療の現況において、重篤症状を回避するため早期発見・早期治療が重要である。また、近年では流行地域からの渡航者や帰国者からのマラリアの流入が危惧されており、それらの該当者に対する感染の的確な診断剤や診断方法が必要である。従来からマラリア感染症の診断方法として、ギムザ染色やアクリジンオレンジ染色を用いた方法が使用されている。ギムザ染色法は血液をメタノール固定後、ｐＨ７．２〜７．４のバッファーを用いてギムザ染料により細胞核等を染色する方法であり、アクリジンオレンジ法はアクリジンオレンジ染料を用いて核等を染色する方法であり、その他、核のＤＮＡと結合するＤＡＰＩ（４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）により核の染色によるマラリア感染の診断方法等も知られている。
また、ｂａｓｉｃ ｂｌｕｅ ４１（Colour Index No．11154）によりマラリア原虫が染色されることが知られている（例えば、特許文献１０参照。）。ｂａｓｉｃ ｂｌｕｅ ４１は式（VII）に示すモノアゾ化合物であり、赤血球中のマラリア原虫をギムザ染料より正確に迅速に染色することが明らかにされている。
【０００８】
【化１９】
【０００９】
しかしながら、これら公知の診断方法に用いられる染料は、マラリア原虫のみならず、寄生する赤血球の細胞等を染色したり白血球の核も染色するため、感染したかどうか、また、完治したかどうか明快な診断が困難である。
【００１０】
【特許文献１】
特開２０００−７６７３号公報
【特許文献２】
特開平１１−２２８４４６号公報
【特許文献３】
特開平１１−２２８４２２号公報
【特許文献４】
特開平１１−２２８４０８号公報
【特許文献５】
特開平１０−２６５３８２号公報
【特許文献６】
特開平８−２３１４０１号公報
【特許文献７】
特開平８−７３３５５号公報
【特許文献８】
特開平８−５９４７１号公報
【特許文献９】
特開２０００−１９１５３１号公報
【特許文献１０】
国際公開第８５／５４４６号パンフレット
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、血液中においてマラリア原虫を選択的に染色し、マラリア原虫を容易に、確実に検出することができるマラリア原虫染色剤や、マラリア感染診断剤を提供し、末梢血の赤血球中に寄生するマラリア原虫を容易に、確実に検出できるマラリア感染の検出方法や、マラリア感染症の診断方法を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上述のロダシアニン系色素化合物についての抗マラリア活性の研究の過程において、ロダシアニン系色素化合物が血液中のマラリア原虫の小器官（organelle）に選択的に集積し、赤血球組織には結合しないことを見い出し、ロダシアニン系色素化合物を末梢血に接触させることにより赤血球に寄生するマラリア原虫の有無を高精度に検出することができることを確認し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち本発明は、
【００１５】
式（ＩＩ）〜式（ＩＶ）のいずれかで示されるロダシアニン系色素化合物を含有することを特徴とするマラリア感染診断剤に関し、好ましくは、ロダシアニン系色素化合物が、赤血球中のマラリア原虫の細胞小器官に集積し蛍光を発することによりマラリア感染の診断を可能とすることを特徴とする請求項１記載のマラリア感染診断剤（請求項２）に関する。
【００１６】
【化２１】
【００１７】
【化２２】
【００１８】
【化２３】
【００１９】
また、本発明は、
【００２１】
式（ＩＩ）〜式（ＩＶ）のいずれかで示されるロダシアニン系色素化合物を含有することを特徴とするマラリア原虫染色剤（請求項３）に関し、好ましくは、ロダシアニン系色素化合物が、赤血球中のマラリア原虫の細胞小器官に集積し蛍光を発することを特徴とする請求項３記載のマラリア原虫染色剤（請求項４）に関する。
【００２２】
【化２５】
【００２３】
【化２６】
【００２４】
【化２７】
【００２５】
本発明は、
【００２７】
式（ＩＩ）〜式（ＩＶ）のいずれかで示されるロダシアニン系色素化合物を含有するマラリア感染診断剤を用いて血液中のマラリア原虫を選択的に染色することを特徴とするマラリア感染症の判定方法（請求項５）に関し、好ましくは、ロダシアニン系色素化合物が、赤血球中のマラリア原虫の細胞小器官に集積し蛍光を発することによりマラリア感染症を判定することを特徴とする請求項５記載のマラリア感染症の判定方法（請求項６）に関する。
【００２８】
【化２９】
【００２９】
【化３０】
【００３０】
【化３１】
【００３１】
本発明は、
【００３３】
式（ＩＩ）〜式（ＩＶ）のいずれかで示されるロダシアニン系色素化合物を含有するマラリア原虫染色剤を用いて血液中のマラリア原虫を選択的に染色することを特徴とするマラリア原虫の染色方法（請求項７）に関し、好ましくは、ロダシアニン系色素化合物が、赤血球中のマラリア原虫の細胞小器官に集積し蛍光を発することを特徴とする請求項７記載のマラリア原虫の染色方法（請求項８）に関する。
【００３４】
【化３３】
【００３５】
【化３４】
【００３６】
【化３５】
【００３７】
【発明の実施の形態】
本発明のマラリア感染診断剤や、マラリア原虫染色剤は、一般式（Ｉ）で示されるロダシアニン系色素化合物を含有するものであれば特に制限されるものではない。一般式（Ｉ）中、Ｒ1及びＲ2は、独立して、水素原子、未置換若しくは置換基を有していてもよいＣ１〜Ｃ８のアルキル基、又は未置換若しくは置換基を有していてもよいＣ６〜Ｃ８のアリール基を表す。上記Ｃ１〜Ｃ８のアルキル基としては、直鎖のみならず分枝鎖を有するものであってもよく、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、イソブチル基、ｎ−ペンチル基、ｓ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｎ−ヘキシル基、２−メチル−ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘプチル基、２−メチル−ｎ−ヘキシル基、ｎ−オクチル基等を例示することができ、上記Ｃ６〜Ｃ８のアリール基としては、フェニル基、ｐ−トリル基、４−キシル基等を例示することができる。これらのＣ１〜Ｃ８のアルキル基又はＣ６〜Ｃ８のアリール基に結合される置換基としては、ハロゲン原子、水酸基、オキソ基、アルキル基、アルコキシ基、アルコキシカルボニル基、カルボキシル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基、アリール基、アラルキル基、アミノ基、アルケニル基等を例示することができる。
【００３８】
また、一般式（Ｉ）中、Ｒ3は未置換若しくは置換基を有していてもよいＣ１〜Ｃ８のアルキル基、又は未置換若しくは置換基を有していてもよいＣ６〜Ｃ８のアリール基を表し、かかるＣ１〜Ｃ８のアルキル基やＣ６〜Ｃ８のアリール基としては、具体的には、一般式（Ｉ）中のＲ1及びＲ2におけるＣ１〜Ｃ８のアルキル基やＣ６〜Ｃ８のアリール基と同様のものを挙げることができ、特に、メチル基、アリル基、ベンジル基、（２−テトラヒドロフラニル）メチル基等が好ましい。
【００４０】
また、一般式（Ｉ）中、Ｂで表される窒素含有複素環としては、ｎは０、１又は２のいずれかの整数を表す共役系であり、５員又は６員の窒素含有複素環であることが好ましい。かかる一般式（Ｉ）におけるＢで表される窒素含有複素環としては、具体的には、ピロリジン、ピロール、ピラゾール、イミダゾール等や、ピペリジン、ピリジン、ピペラジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン等の複素環から水素原子一つを除いたものなどを例示することができる。５員又は６員環の窒素含有複素環を構成する炭素原子に結合する置換基としては、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基等のアルキル基や、フェニル基、ｐ−トリル基、２，３−キシリル基、２，４−キシリル基等のアリール基や、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基等のアルコキシ基や、カルボキシル基や、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基等のアルコキシカルボニル基や、シアノ基、水酸基、アミノ基や、塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン原子などを挙げることができ、かかる窒素含有複素環の置換基は窒素含有複素環とオルト縮合環を形成してもよい。かかる置換基が窒素含有複素環とオルト縮合環を形成した場合一般式（Ｉ）におけるＢで表される窒素含有複素環としては、具体的には、インドリン、イソインドリン、インドール、イソインドール、インダゾール、２Ｈ−インダゾール、ベンゾイミダゾール、キノリン、イソキノリン、シンノリン、キナゾリン、キノキサリン、フタラジン、１，８−ナフチリジン等から一つの水素を除いたものなどを例示することができる。
【００４１】
また、本発明の一般式（Ｉ）で示されるロダシアニン系色素化合物中、Ｘ-は薬学的に許容しうるアニオンを示し、ハロゲンイオン、スルホン酸イオン、スルファミン酸イオン、水酸化物イオン等を挙げることができ、具体的には、ハロゲンイオンとしては、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン等を例示することができ、スルホン酸イオンとしては、メタンスルホン酸イオン、エタンスルホン酸イオン、トリフルオロメタンスルホン酸イオン、ｐ−トルエンスルホン酸イオン、ナフタレンスルホン酸イオン、２−ヒドロキシエタンスルホン酸イオン等の脂肪族及び芳香族スルホン酸イオン等を例示することができ、スルファミン酸イオンとしては、シクロヘキサンスルファミン酸イオンを例示することができ、その他、メチル硫酸イオン及びエチル硫酸イオン等の硫酸イオン、硫酸水素イオン、ホウ酸イオン、アルキル及びジアルキルりん酸イオン、カルボン酸イオン、炭酸イオン等を挙げることができる。薬学的に許容し得るアニオンの好ましい具体例としては塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン、酢酸イオン、プロピオン酸イオン、吉草酸イオン、クエン酸イオン、マレイン酸イオン、フマル酸イオン、乳酸イオン、コハク酸イオン、酒石酸イオン、安息香酸イオン、メタンスルホン酸イオン、エタンスルホン酸イオン、ｐ−トルエンスルホン酸イオン、水酸化物イオン等が挙げられ、これらのうち特に、ｐ−トルエンスルホン酸イオン、塩素イオン、水酸化イオンのいずれかが好ましい。
【００４２】
上記のような一般式（Ｉ）で表されるロダシアニン系色素化合物としては、式（II）〜式（IV）のいずれかで示されるロダシアニン系色素化合物を、好ましい具体例として挙げることができる。すなわち、一般式（Ｉ）で表されるロダシアニン系色素化合物として、２−［｛５−（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）−４−オキソ−３−（２−プロペニル）−２−チアゾリジニリデン｝メチル］−１−メチルピリジニウム＝ｐ−トルエンスルホナート（式（II））、２−［｛５−（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）−４−オキソ−３−エチル−２−チアゾリジニリデン｝メチル］−１−エチルピリジニウム＝クロリド（式（III））、４−［｛５−（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）−４−オキソ−３−エチル）−２−チアゾリジニリデン｝メチル］−１−メチルキノリウム＝ｐ−トルエンスルホナート（式（IV））等を例示することができる。
【００４３】
このような一般式（Ｉ）で表されるロダシアニン系色素化合物の製造方法は、特に限定されるものではなく、公知の方法によって製造することができる。例えば、式（VIII）に示すように５工程で行なわれ、一般式（Ｉ）中、Ａで表される窒素含有複素環化合物にメチルチオ基等の脱離基が導入された誘導体、例えば、２−（メチルチオ）ベンゾチアゾリン（2-(methylthio)benzothiazole）（ａ）をアニソール溶媒下、ｐ−トルエンスルホン酸メチルを用いてＮ−メチル化した誘導体（ｂ）とした後に、トリエチルアミン等の存在下、ロダニン環化合物、例えば、３−エチルロダニン（ｃ）と反応させロダニン環が導入されたメロシアニン化合物（ｄ）に変換する。さらにメロシアニン化合物（ｄ）をｐ−トルエンスルホン酸メチル等を用いてチオメチル化して誘導体（ｅ）へと変換した後に、一般式（Ｉ）中、Ｂで表される共役化合物である窒素含有複素環、例えば、Ｎ−メチルピコリニウムｐ−トルエンスルホネート（N-methylpicolinium p-toluenesulfonate）（ｆ）等と縮合させ、最後にイオン交換することでロダシアニン系化合物（ｇ）を総収率３８％で得ることができる。
【００４４】
【化３６】
【００４５】
本発明のマラリア感染診断剤や、マラリア原虫染色剤は、上記一般式（Ｉ）で表されるロダシアニン系色素化合物を含有するものであれば、特に制限されるものではないが、上記一般式（Ｉ）で表されるロダシアニン系色素化合物を、水、ＤＭＳО、ＤＭＦ、オリーブ油等の溶液に溶解した液剤や、使用時に適宜水等に溶解できる錠剤等とすることができる。また、製剤としては、通常、製薬的に許容される担体、その他公知の添加剤を添加して製造できる。
【００４６】
本発明のマラリア感染症の判定方法は、本発明の一般式（Ｉ）で表されるロダシアニン系色素化合物を含有するマラリア感染診断剤を用いて判定をすることができる。本発明のマラリア感染症の判定方法は、採血した血液にロダシアニン系化合物が血液に対して、１．０×１０-7〜１．０×１０-5モル濃度、好ましくは２．０×１０-6モル濃度程度となるようにマラリア感染診断剤を添加して、１０分〜５時間、好ましくは１時間程度、培養（軽く振盪もしくは放置）して接触させた後、光学顕微鏡により、例えば、４５０〜４８０ｎｍの偏光フィルタを通した観察により行なうことができる。ロダシアニン系色素化合物が血液、特に、赤血球に寄生するマラリア原虫の細胞核以外の細胞小器官（オルガネラ）（organelle）に特異的に集積し、橙色から赤色の蛍光を発する。特に、血液中のヒトマラリア原虫や、ネズミマラリア原虫（P．berghei）においては蛍光の発光を容易に検出することができる。しかも、ロダシアニン系色素化合物はマラリア原虫が寄生する赤血球や、末梢血中の白血球等他のものには集積しないため、赤血球中に寄生するマラリア原虫を容易に、確実に検出することができる。
【００４７】
また、ロダシアニン系色素化合物による染色はマラリア原虫の細胞小器官を赤い蛍光に染色するため、細胞核を選択的に赤色以外の色に染色する染料、例えば、青色に染色するＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）等を、本発明のマラリア感染診断剤と混合して用いることにより、マラリア原虫の細胞核と、小器官とをそれぞれ異なる色で染色することもできる。
【００４８】
また、本発明のマラリア原虫の染色方法は、本発明の一般式（Ｉ）で表されるロダシアニン系色素化合物を含有するマラリア原虫染色剤を用いて診断することができる。本発明のマラリア原虫の染色方法は、上記マラリア感染症の判別方法と同様にして、採血した血液に本発明のマラリア原虫染色剤を接触させることにより行なうことができる。
【００４９】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１：化合物（II）の合成
４．０ｇの２−メチルチオベンゾチアゾールと、５．０ｍＬのｐ−トルエンスルホン酸メチルのアニソール溶液５．５ｍＬを１３０℃で１．５時間攪拌した。混合物を室温に冷却後、７４ｍＬのアセトニトリルを加え、さらに３．８３ｇの３−（２−プロペニル）−２−チオキソ−４−チアゾリジノンを加えた。この混合物を０℃に冷却した後に４．９ｍＬのトリエチルアミンを徐々に滴下し、０℃にて１時間攪拌した。得られた沈殿物を吸引濾別し、アセトニトリルで洗浄し粗結晶５．５１ｇを得た。この粗結晶の２．１ｇと９．０ｍＬのｐ−トルエンスルホン酸メチルの混合物に７．５ｍＬのジメチルホルムアミドを加え懸濁液とし、１２０℃にて１．５時間撹拌した後、室温に冷却しアセトンを加え、沈殿物を吸引濾別し、アセトンで洗浄し乾燥した結果、８．６４ｇの粗結晶を得た。この粗結晶の８．６４ｇと、４．７１ｇの１−メチル−４−メチルピリジニウム＝ｐ−トルエンスルホナートと８５．０ｍＬのアセトニトリルの混合物を攪拌した。その混合物に７０℃で７．０ｍＬのトリエチルアミンを滴下し、これを７０℃にて１時間撹拌した。得られた混合物を室温に冷却した後に、酢酸エチルを加えた。沈殿物を吸引濾別し、冷酢酸エチルで洗浄した。この粗結晶をメタノール／酢酸エチル混合溶媒から再結晶し、３．９４ｇの２−［｛５−（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）−４−オキソ−３−（２−プロペニル）−２−チアゾリジニリデン｝メチル］−１−メチルピリジニウム＝ｐ−トルエンスルホナートを得た。収率は３２％であった。
m.p. 249-251℃; IR (KBr) cm-1: 1038, 1189, 1057, 1539, 1636, 3471; 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6 ) :δ 2.27 (3H, s), 4.04 (6H, s), 4.69 (2H, d, J = 4.9 Hz), 5.27-5.33 (2H, m), 5.81-5.92 (1H, m), 5.85 (1H, s), 7.09 (2H, d, J = 7.7 Hz), 7.28 (1H, dd, J = 7.4, 7.7 Hz), 7.40 (1H, dd, J = 6.5, 7.6 Hz), 7.45-7.49 (3H, m), 7.60 (1H, d, J = 8.2 Hz), 7.85 (1H, d, J = 7.7 Hz), 7.98 (1H, d, J = 8.2 Hz), 8.25 (1H, dd, J = 7.6, 8.2 Hz), 8.63 (1H, d, J = 6.5 Hz); Anal Calcd for C29H27N3O4S3: C, 59.45; H, 4.81; N, 7.43: Found: C, 59.25, H, 4.80; N, 7.29.
【００５０】
実施例２：化合物（III）の合成
２．９８ｇの２−メチルチオベンゾチアゾールと、３．７４ｍＬのｐ−トルエンスルホン酸メチルのアニソール溶液４．１ｍＬを１２０℃で４時間攪拌した。室温に冷却後、混合物に６０ｍＬのアセトニトリルを加え、さらに２．６７ｇの３−エチル−２−チオキソ−４−チアゾリジノンを加えた。この混合物を０℃に冷却した後に４．９ｍＬのトリエチルアミンを徐々に滴下し、１０℃にて４時間攪拌した。得られた沈殿物を吸引濾別し、アセトニトリルで洗浄し粗結晶４．５２ｇを得た。この粗結晶１．０２ｇと１．４７ｍＬのｐ−トルエンスルホン酸メチルの混合物に１．０ｍＬのジメチルホルムアミドを加え懸濁液とした。これを１３０℃にて２．５時間撹拌した。得られた混合物を室温に冷却した後にアセトンを加え、沈殿物を吸引濾別した。沈殿をアセトンで洗浄し、乾燥した結果、１．４７ｇの粗結晶を得た。
この粗結晶０．５０ｇと、１．２２ｇの１−エチル−４−メチルピリジニウム＝ｐ−トルエンスルホナートと２０ｍＬのアセトニトリルの混合物を攪拌した。その混合物に７０℃で１．７ｍＬのトリエチルアミンを滴下し、これを７０℃にて１．５時間撹拌した。得られた混合物を室温に冷却した後に、酢酸エチルを加えた。沈殿物を吸引濾別し、冷酢酸エチルで洗浄した。この粗結晶をメタノール／酢酸エチル混合溶媒から再結晶し、０．２８ｇのｐ−トルエンスルホナート塩を得た。
メタノールに浸潤した強塩基性陰イオン交換樹脂（アルドリッチ製アンバーライトＩＲＡ−４００（Ｃｌ）を充填したイオン交換カラムに移した。４０ｍｇの上記化合物のメタノール／ジクロロメタン溶液をカラムに通し、溶出液を集めて減圧濃縮した。残渣をメタノールに加熱溶解したものに酢酸エチルを加えた。得られた沈殿を吸引濾別した後、酢酸エチルで洗浄し２５ｍｇの２−［｛５−（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）−４−オキソ−３−エチル−２−チアゾリジニリデン｝メチル］−１−エチルピリジニウム＝クロライドを得た。全行程の収率は３０％、ｍ．ｐ．２５３−２５７℃であった。
【００５１】
実施例３：化合物（IV）の合成
１．０ｍｌの４−メチルキノリンと１．８ｍＬのｐ−トルエンスルホン酸メチルの混合物を７０℃にて１．５時間攪拌した。得られた混合物を室温に冷却した後に、酢酸エチルを加えた。沈殿物を吸引濾別し、冷酢酸エチルで洗浄した後に乾燥することで２．３ｇの１−メチル−４−メチルキノリウム＝ｐ−トルエンスルホナートを得た。収率は９１％であった。次に、この１−メチル−４−メチルキノリニウム＝ｐ−トルエンスルホナート０．１７ｇと、３−エチル４，５−ジヒドロ−５−（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）−２−メチルチオ−４−オキソチアゾリウム＝ｐ−トルエンスルホンナート０．２５ｇと、２．６ｍＬのアセトニトリルの混合物を攪拌した後、７０℃で０．２１ｍＬのトリエチルアミンを滴下し、これを７０℃にて１時間撹拌した。得られた混合物を室温に冷却した後に、酢酸エチルを加えた。沈殿物を吸引濾別し、冷酢酸エチルで洗浄した後に乾燥することで０．２９ｇの４−［｛５−（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）−４−オキソ−３−エチル−２−チアゾリジニリデン｝メチル］−１−メチルキノリウム＝ｐ−トルエンスルホナートを得た。収率は９３％であった。
ｍ.p.267-269℃；IR (KBr) cm-1:1208, 1507, 1616, 3396; 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6 ) δ: 1.29 (3H, t, J = 7．1 Hz), 2.27 (3H, s), 4.11 (3H, s), 4.25（3H, s）, 4.25-4.29 (2H, q, J = 7．1 Hz), 6．85 (1H, s), 7．10 (2H, d, J = 8．2 Hz), 7．27 (1H, t, J = 7．7 Hz), 7．47 (1H, d, J = 8．2 Hz), 7．51−7．55 (1H, m), 7．64 (1H, d, J = 8．2 Hz), 7．76-7．85 (2H, m), 8．00 (1H, t,J = 7．8 Hz), 8．10 (1H, d, J = 8．8 Hz), 8．66 (1H, d, J = 6．9 Hz), 8．74 (1H, d, J = 8．5 Hz), ; Anal Calcd for C31H29N3O4S3・2H2O: C, 58.19; H, 5.20; N, 6.57. Found: C, 58.31; H, 4.99; N, 6.62.
【００５２】
実施例４：ヒトマラリア感染標本の染色
供試マラリア原虫として、P.Falciparum ＦＣＲ−３株（ＡＴＣＣ３０９３２）を用いた。実験に用いた培地は、ろ過滅菌したＲＰＭＩ １６４０培地で、ｐＨを７．４に合わせ、ヒト血清を１０％となるように添加した。マラリア原虫の培養は、Ｏ2濃度５％、ＣＯ2濃度５％、Ｎ2濃度９０％、温度３６．５℃の条件下で行った。ヘマトクリット値（赤血球浮遊液中に占める赤血球の体積の割合）は５％にして用いた。培養開始時の熱帯熱マラリア原虫の初期感染率は０．１％とした。２４穴培養プレートを用いて培養し、培地は毎日交換し、感染率４％で植継ぎを行った。供試サンプルにはマラリア感染率が３０〜５０％になった感染血液を使用した。なお、感染率は薄層塗抹標本を作成し、ギムザ染色あるいはＤｉｆｆ−Ｑｉｃｋ染色を行った後、顕微鏡（油浸、１，０００×）下で計測し、マラリア原虫感染率を下記式から算出した。
マラリア原虫感染率（％）＝｛（感染赤血球数）／（総赤血球数）｝×１００
得られたヒトマラリア感染血液サンプル９９μＬに、実施例１で得られた化合物の０．００５重量％ＤＭＳО溶液を１μＬ添加して、３７℃にて１時間振盪し、染色を行なった。その後、薄層塗抹標本をプレパラートに作製したものを光学顕微鏡（油浸、１，０００×）（オリンパス社製）下で観察した。染色されたマラリア原虫を図１（参考写真１参照）に示し、マラリア原虫の拡大図を図２（参考写真２参照）に示す。図１中、マラリア原虫の組織（オルガネラ）が赤い蛍光の斑点（参考写真１）として確認でき、図２中、薄赤色で囲まれた円状のものは単細胞のマラリア原虫を示し、マラリア原虫の特定の組織（オルガネラ）が赤い蛍光（参考写真２）となって確認できた。
【００５３】
比較例として、ヒトマラリア感染標本についてギムサ染色により染色を行なった。ヒトマラリア感染血液の薄層塗抹標本を作製し、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ液（シグマ社製）に浸し乾燥させたものを、光学顕微鏡（油浸、１，０００×）（オリンパス社製）下で観察した。染色されたマラリア原虫を図３（参考写真３参照）に示す。図３中、グレーで囲まれた円状のものは赤血球を示し、黒い斑点（参考写真３）がマラリア原虫の代謝物（ヘモゾイン）を示し、それを囲む白抜きの部分が単細胞マラリア原虫を示す。
結果からロダシアニン系色素化合物により赤血球中のP.Falciparumは赤色の蛍光を発し、容易に確実に染色され、マラリア感染の診断に適用できることがわかった。
【００５４】
実施例５：ネズミマラリア感染標本の染色
供試マラリア原虫として、P.bergheiを用いた。P.bergheiマラリアに感染（感染率３０〜６０％）したＩＣＲマウスより心採血で得たネズミ血清１．０ｍＬにヘパリン１０μＬを加え、軽く振盪する。得られた血液サンプル９９μＬに、実施例１で得られた化合物の０．００５重量％ＤＭＳО溶液を１μＬ添加して、３７℃にて３０分間振盪し、染色を行った。その後、薄層塗抹標本をプレパラートに作製したものを光学顕微鏡（油浸 １，０００×）（オリンパス社製）下で観察した。染色されたマラリア原虫を図４（参考写真４参照）に示す。図４中、濃い緑の円状のものは赤血球を示し、薄い緑の円状のものはマラリア原虫を示し、マラリア原虫中に赤い（黄色に呈色されている）蛍光の斑点（参考写真４）として色素が集積した組織が確認でき、細胞核が青色の点として確認できた。
【００５５】
比較例として、ネズミマラリア感染標本についてギムザ染色により染色を行なった。ネズミマラリア感染血液の薄層塗抹標本を作製し、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ液（シグマ社製）に浸し乾燥させたものを、光学顕微鏡（油浸 １，０００×）（オリンパス社製）下で観察した。染色されたマラリア原虫を図５（参考写真５参照）に示す。図５中、薄黄色で囲まれた円状のものは赤血球を示し、赤血球中にマラリア原虫が褐色の斑点として確認された。
結果からロダシアニン系色素化合物により赤血球中のマラリア原虫は赤い蛍光を発し、容易に確実に染色され、マラリア感染の診断に適用できることがわかった。
【００５６】
【発明の効果】
本発明によれば、ロダシアニン系色素化合物は血液中のマラリア原虫に特異的に集積し、赤い蛍光を発するため、マラリア原虫を容易に確実に検出することができ、マラリア感染の診断を容易に且つ確実に行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のマラリア感染診断剤により染色されたヒトマラリア原虫を示す図である。
【図２】図１に示すヒトマラリア原虫の拡大図である。
【図３】従来例のマラリア感染診断剤により染色されたヒトマラリア原虫を示す図である。
【図４】本発明のマラリア感染診断剤により染色されたネズミマラリア原虫を示す図である。
【図５】従来例のマラリア感染診断剤により染色されたネズミマラリア原虫を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ロダシアニン系色素化合物を有効成分として含有するマラリア原虫染色剤や、マラリア感染診断剤、これを用いたマラリア感染症の判定方法や、マラリア原虫の染色方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
マラリアはハマダラカを媒体として人体に注入されたマラリア原虫に感染して発病する感染症であり、ヒトに感染するマラリア原虫には熱帯熱マラリア原虫（P. falciparm）、三日熱マラリア原虫（P．vivax）、四日熱マラリア原虫（P. malariae）、卵形マラリア原虫（P．ovale）等があり、世界中で患者数２〜３億人、死者年間２〜３百万人と推定されている。近年、殺虫剤耐性の蚊や、マラリアの特効薬として多用されてきたクロロキン（式（Ｖ）（ａ））に耐性を有するマラリア原虫が出現し、対策が困難となっている。抗マラリア剤又は抗マラリア化合物としては、２個の複素環を含有するオルソ−縮合系の新規化合物（例えば、特許文献１参照。）や、ＩＣＡＭ−１発現抑制作用を有する化合物を有効成分として含有する抗マラリア剤（例えば、特許文献２参照。）や、５’−ｏ−スルファモイル−２−クロロアデノシン等のヌクレオシド誘導体等を有効成分として含有する抗マラリア剤（例えば、特許文献３参照。）や、トリコテセン類等を有効成分として含有する抗マラリア剤（例えば、特許文献４参照。）や、シクロプロジギオシン等を有効成分とする抗マラリア剤（例えば、特許文献５参照。）や、リミノフェナジンを有効成分として含有するマラリア予防又は治療薬（例えば、特許文献６参照。）や、キノリン誘導体等を有効成分として含有する抗マラリア薬耐性克服剤（例えば、特許文献７参照。）や、５−フルオロオロチン酸及びスルファモノメトキシンを有効成分とする抗マラリア剤（例えば、特許文献８参照。）等が知られている。
【０００３】
一方、クロロキンに耐性をもつマラリア原虫に対して、メフロキン（式（Ｖ）（ｂ））、プリマキン等のクロロキン類似のキノリン環を持つアミン化合物が使用されており、最近では生薬である青嵩（和名：クソニンジン）から抽出されたアルテミシニン（式（Ｖ）（ｃ））等のパーオキシ環状化合物や、マラリア原虫のミトコンドリアに存在するチトクロームｂを阻害するアトバコン（式（Ｖ）（ｄ））等、パーオキシドやキノンという酸化段階の高い化合物が有効な治療薬として使われていた。しかしながら、これらの薬剤に対しても耐性を示すマラリア原虫がすでに現れたことが報告されており、新規なマラリア剤に対して次々に耐性を有するマラリア原虫が出現し、これらの抗マラリア薬が使えなくなる日はそう遠くはないと考えられている。また、マラリア原虫に対して有効であるキニーネ（式（Ｖ）（ｅ））は、腎不全を引き起こす可能性が高く、キニーネは最終治療としてのみ用いられているのが現状であり、感染の予防や、治療を保証することはできなかった。
【０００４】
【化１７】
【０００５】
本発明者らは、各種抗マラリア剤に耐性を有するマラリア原虫に対して有効であり、副作用が少ない抗マラリア剤として、上記抗マラリア剤と全く違う構造を持つ新化学療法剤の開発のためランダムスクリーニングを行った結果、クロロキンに匹敵する抗マラリア活性を示すロダニン母核（４−オキソチアゾリジン環）を有するロダシアニン色素化合物（式（VI）（ａ））（ＥＣ50＝７０ｎＭ、selectivity＝２１０）が有用であることを見い出し、既に報告している（例えば、特許文献９参照。）。更に、かかるロダシアニン色素化合物に種々の置換基を導入してロダシアニン系色素化合物を合成し、抗マラリア活性について検定したところ、ロダニン母核の特定位（Ｎ−３位）にアリル基が導入された化合物（式（VI）（ｂ））（ＥＣ50＝１２ｎＭ、selectivity＝１０００）が非常に高い抗マラリア活性と優れた選択毒性を有することを確認して既に報告している（特願２００１−２２０５７９号）。
【０００６】
【化１８】
【０００７】
このようなマラリア感染症に対する治療の現況において、重篤症状を回避するため早期発見・早期治療が重要である。また、近年では流行地域からの渡航者や帰国者からのマラリアの流入が危惧されており、それらの該当者に対する感染の的確な診断剤や診断方法が必要である。従来からマラリア感染症の診断方法として、ギムザ染色やアクリジンオレンジ染色を用いた方法が使用されている。ギムザ染色法は血液をメタノール固定後、ｐＨ７．２〜７．４のバッファーを用いてギムザ染料により細胞核等を染色する方法であり、アクリジンオレンジ法はアクリジンオレンジ染料を用いて核等を染色する方法であり、その他、核のＤＮＡと結合するＤＡＰＩ（４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）により核の染色によるマラリア感染の診断方法等も知られている。
また、ｂａｓｉｃ ｂｌｕｅ ４１（Colour Index No．11154）によりマラリア原虫が染色されることが知られている（例えば、特許文献１０参照。）。ｂａｓｉｃ ｂｌｕｅ ４１は式（VII）に示すモノアゾ化合物であり、赤血球中のマラリア原虫をギムザ染料より正確に迅速に染色することが明らかにされている。
【０００８】
【化１９】
【０００９】
しかしながら、これら公知の診断方法に用いられる染料は、マラリア原虫のみならず、寄生する赤血球の細胞等を染色したり白血球の核も染色するため、感染したかどうか、また、完治したかどうか明快な診断が困難である。
【００１０】
【特許文献１】
特開２０００−７６７３号公報
【特許文献２】
特開平１１−２２８４４６号公報
【特許文献３】
特開平１１−２２８４２２号公報
【特許文献４】
特開平１１−２２８４０８号公報
【特許文献５】
特開平１０−２６５３８２号公報
【特許文献６】
特開平８−２３１４０１号公報
【特許文献７】
特開平８−７３３５５号公報
【特許文献８】
特開平８−５９４７１号公報
【特許文献９】
特開２０００−１９１５３１号公報
【特許文献１０】
国際公開第８５／５４４６号パンフレット
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、血液中においてマラリア原虫を選択的に染色し、マラリア原虫を容易に、確実に検出することができるマラリア原虫染色剤や、マラリア感染診断剤を提供し、末梢血の赤血球中に寄生するマラリア原虫を容易に、確実に検出できるマラリア感染の検出方法や、マラリア感染症の診断方法を提供することにある。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上述のロダシアニン系色素化合物についての抗マラリア活性の研究の過程において、ロダシアニン系色素化合物が血液中のマラリア原虫の小器官（organelle）に選択的に集積し、赤血球組織には結合しないことを見い出し、ロダシアニン系色素化合物を末梢血に接触させることにより赤血球に寄生するマラリア原虫の有無を高精度に検出することができることを確認し、本発明を完成するに至った。
【００１３】
すなわち本発明は、
【００１５】
式（ＩＩ）〜式（ＩＶ）のいずれかで示されるロダシアニン系色素化合物を含有することを特徴とするマラリア感染診断剤に関し、好ましくは、ロダシアニン系色素化合物が、赤血球中のマラリア原虫の細胞小器官に集積し蛍光を発することによりマラリア感染の診断を可能とすることを特徴とする請求項１記載のマラリア感染診断剤（請求項２）に関する。
【００１６】
【化２１】
【００１７】
【化２２】
【００１８】
【化２３】
【００１９】
また、本発明は、
【００２１】
式（ＩＩ）〜式（ＩＶ）のいずれかで示されるロダシアニン系色素化合物を含有することを特徴とするマラリア原虫染色剤（請求項３）に関し、好ましくは、ロダシアニン系色素化合物が、赤血球中のマラリア原虫の細胞小器官に集積し蛍光を発することを特徴とする請求項３記載のマラリア原虫染色剤（請求項４）に関する。
【００２２】
【化２５】
【００２３】
【化２６】
【００２４】
【化２７】
【００２５】
本発明は、
【００２７】
式（ＩＩ）〜式（ＩＶ）のいずれかで示されるロダシアニン系色素化合物を含有するマラリア感染診断剤を用いて血液中のマラリア原虫を選択的に染色することを特徴とするマラリア感染症の判定方法（請求項５）に関し、好ましくは、ロダシアニン系色素化合物が、赤血球中のマラリア原虫の細胞小器官に集積し蛍光を発することによりマラリア感染症を判定することを特徴とする請求項５記載のマラリア感染症の判定方法（請求項６）に関する。
【００２８】
【化２９】
【００２９】
【化３０】
【００３０】
【化３１】
【００３１】
本発明は、
【００３３】
式（ＩＩ）〜式（ＩＶ）のいずれかで示されるロダシアニン系色素化合物を含有するマラリア原虫染色剤を用いて血液中のマラリア原虫を選択的に染色することを特徴とするマラリア原虫の染色方法（請求項７）に関し、好ましくは、ロダシアニン系色素化合物が、赤血球中のマラリア原虫の細胞小器官に集積し蛍光を発することを特徴とする請求項７記載のマラリア原虫の染色方法（請求項８）に関する。
【００３４】
【化３３】
【００３５】
【化３４】
【００３６】
【化３５】
【００３７】
【発明の実施の形態】
本発明のマラリア感染診断剤や、マラリア原虫染色剤は、一般式（Ｉ）で示されるロダシアニン系色素化合物を含有するものであれば特に制限されるものではない。一般式（Ｉ）中、Ｒ1及びＲ2は、独立して、水素原子、未置換若しくは置換基を有していてもよいＣ１〜Ｃ８のアルキル基、又は未置換若しくは置換基を有していてもよいＣ６〜Ｃ８のアリール基を表す。上記Ｃ１〜Ｃ８のアルキル基としては、直鎖のみならず分枝鎖を有するものであってもよく、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、イソブチル基、ｎ−ペンチル基、ｓ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｎ−ヘキシル基、２−メチル−ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘプチル基、２−メチル−ｎ−ヘキシル基、ｎ−オクチル基等を例示することができ、上記Ｃ６〜Ｃ８のアリール基としては、フェニル基、ｐ−トリル基、４−キシル基等を例示することができる。これらのＣ１〜Ｃ８のアルキル基又はＣ６〜Ｃ８のアリール基に結合される置換基としては、ハロゲン原子、水酸基、オキソ基、アルキル基、アルコキシ基、アルコキシカルボニル基、カルボキシル基、アルキルカルボニル基、アリールカルボニル基、アリール基、アラルキル基、アミノ基、アルケニル基等を例示することができる。
【００３８】
また、一般式（Ｉ）中、Ｒ3は未置換若しくは置換基を有していてもよいＣ１〜Ｃ８のアルキル基、又は未置換若しくは置換基を有していてもよいＣ６〜Ｃ８のアリール基を表し、かかるＣ１〜Ｃ８のアルキル基やＣ６〜Ｃ８のアリール基としては、具体的には、一般式（Ｉ）中のＲ1及びＲ2におけるＣ１〜Ｃ８のアルキル基やＣ６〜Ｃ８のアリール基と同様のものを挙げることができ、特に、メチル基、アリル基、ベンジル基、（２−テトラヒドロフラニル）メチル基等が好ましい。
【００４０】
また、一般式（Ｉ）中、Ｂで表される窒素含有複素環としては、ｎは０、１又は２のいずれかの整数を表す共役系であり、５員又は６員の窒素含有複素環であることが好ましい。かかる一般式（Ｉ）におけるＢで表される窒素含有複素環としては、具体的には、ピロリジン、ピロール、ピラゾール、イミダゾール等や、ピペリジン、ピリジン、ピペラジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン等の複素環から水素原子一つを除いたものなどを例示することができる。５員又は６員環の窒素含有複素環を構成する炭素原子に結合する置換基としては、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基等のアルキル基や、フェニル基、ｐ−トリル基、２，３−キシリル基、２，４−キシリル基等のアリール基や、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基等のアルコキシ基や、カルボキシル基や、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基等のアルコキシカルボニル基や、シアノ基、水酸基、アミノ基や、塩素、臭素、ヨウ素等のハロゲン原子などを挙げることができ、かかる窒素含有複素環の置換基は窒素含有複素環とオルト縮合環を形成してもよい。かかる置換基が窒素含有複素環とオルト縮合環を形成した場合一般式（Ｉ）におけるＢで表される窒素含有複素環としては、具体的には、インドリン、イソインドリン、インドール、イソインドール、インダゾール、２Ｈ−インダゾール、ベンゾイミダゾール、キノリン、イソキノリン、シンノリン、キナゾリン、キノキサリン、フタラジン、１，８−ナフチリジン等から一つの水素を除いたものなどを例示することができる。
【００４１】
また、本発明の一般式（Ｉ）で示されるロダシアニン系色素化合物中、Ｘ-は薬学的に許容しうるアニオンを示し、ハロゲンイオン、スルホン酸イオン、スルファミン酸イオン、水酸化物イオン等を挙げることができ、具体的には、ハロゲンイオンとしては、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン等を例示することができ、スルホン酸イオンとしては、メタンスルホン酸イオン、エタンスルホン酸イオン、トリフルオロメタンスルホン酸イオン、ｐ−トルエンスルホン酸イオン、ナフタレンスルホン酸イオン、２−ヒドロキシエタンスルホン酸イオン等の脂肪族及び芳香族スルホン酸イオン等を例示することができ、スルファミン酸イオンとしては、シクロヘキサンスルファミン酸イオンを例示することができ、その他、メチル硫酸イオン及びエチル硫酸イオン等の硫酸イオン、硫酸水素イオン、ホウ酸イオン、アルキル及びジアルキルりん酸イオン、カルボン酸イオン、炭酸イオン等を挙げることができる。薬学的に許容し得るアニオンの好ましい具体例としては塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン、酢酸イオン、プロピオン酸イオン、吉草酸イオン、クエン酸イオン、マレイン酸イオン、フマル酸イオン、乳酸イオン、コハク酸イオン、酒石酸イオン、安息香酸イオン、メタンスルホン酸イオン、エタンスルホン酸イオン、ｐ−トルエンスルホン酸イオン、水酸化物イオン等が挙げられ、これらのうち特に、ｐ−トルエンスルホン酸イオン、塩素イオン、水酸化イオンのいずれかが好ましい。
【００４２】
上記のような一般式（Ｉ）で表されるロダシアニン系色素化合物としては、式（II）〜式（IV）のいずれかで示されるロダシアニン系色素化合物を、好ましい具体例として挙げることができる。すなわち、一般式（Ｉ）で表されるロダシアニン系色素化合物として、２−［｛５−（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）−４−オキソ−３−（２−プロペニル）−２−チアゾリジニリデン｝メチル］−１−メチルピリジニウム＝ｐ−トルエンスルホナート（式（II））、２−［｛５−（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）−４−オキソ−３−エチル−２−チアゾリジニリデン｝メチル］−１−エチルピリジニウム＝クロリド（式（III））、４−［｛５−（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）−４−オキソ−３−エチル）−２−チアゾリジニリデン｝メチル］−１−メチルキノリウム＝ｐ−トルエンスルホナート（式（IV））等を例示することができる。
【００４３】
このような一般式（Ｉ）で表されるロダシアニン系色素化合物の製造方法は、特に限定されるものではなく、公知の方法によって製造することができる。例えば、式（VIII）に示すように５工程で行なわれ、一般式（Ｉ）中、Ａで表される窒素含有複素環化合物にメチルチオ基等の脱離基が導入された誘導体、例えば、２−（メチルチオ）ベンゾチアゾリン（2-(methylthio)benzothiazole）（ａ）をアニソール溶媒下、ｐ−トルエンスルホン酸メチルを用いてＮ−メチル化した誘導体（ｂ）とした後に、トリエチルアミン等の存在下、ロダニン環化合物、例えば、３−エチルロダニン（ｃ）と反応させロダニン環が導入されたメロシアニン化合物（ｄ）に変換する。さらにメロシアニン化合物（ｄ）をｐ−トルエンスルホン酸メチル等を用いてチオメチル化して誘導体（ｅ）へと変換した後に、一般式（Ｉ）中、Ｂで表される共役化合物である窒素含有複素環、例えば、Ｎ−メチルピコリニウムｐ−トルエンスルホネート（N-methylpicolinium p-toluenesulfonate）（ｆ）等と縮合させ、最後にイオン交換することでロダシアニン系化合物（ｇ）を総収率３８％で得ることができる。
【００４４】
【化３６】
【００４５】
本発明のマラリア感染診断剤や、マラリア原虫染色剤は、上記一般式（Ｉ）で表されるロダシアニン系色素化合物を含有するものであれば、特に制限されるものではないが、上記一般式（Ｉ）で表されるロダシアニン系色素化合物を、水、ＤＭＳО、ＤＭＦ、オリーブ油等の溶液に溶解した液剤や、使用時に適宜水等に溶解できる錠剤等とすることができる。また、製剤としては、通常、製薬的に許容される担体、その他公知の添加剤を添加して製造できる。
【００４６】
本発明のマラリア感染症の判定方法は、本発明の一般式（Ｉ）で表されるロダシアニン系色素化合物を含有するマラリア感染診断剤を用いて判定をすることができる。本発明のマラリア感染症の判定方法は、採血した血液にロダシアニン系化合物が血液に対して、１．０×１０-7〜１．０×１０-5モル濃度、好ましくは２．０×１０-6モル濃度程度となるようにマラリア感染診断剤を添加して、１０分〜５時間、好ましくは１時間程度、培養（軽く振盪もしくは放置）して接触させた後、光学顕微鏡により、例えば、４５０〜４８０ｎｍの偏光フィルタを通した観察により行なうことができる。ロダシアニン系色素化合物が血液、特に、赤血球に寄生するマラリア原虫の細胞核以外の細胞小器官（オルガネラ）（organelle）に特異的に集積し、橙色から赤色の蛍光を発する。特に、血液中のヒトマラリア原虫や、ネズミマラリア原虫（P．berghei）においては蛍光の発光を容易に検出することができる。しかも、ロダシアニン系色素化合物はマラリア原虫が寄生する赤血球や、末梢血中の白血球等他のものには集積しないため、赤血球中に寄生するマラリア原虫を容易に、確実に検出することができる。
【００４７】
また、ロダシアニン系色素化合物による染色はマラリア原虫の細胞小器官を赤い蛍光に染色するため、細胞核を選択的に赤色以外の色に染色する染料、例えば、青色に染色するＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）等を、本発明のマラリア感染診断剤と混合して用いることにより、マラリア原虫の細胞核と、小器官とをそれぞれ異なる色で染色することもできる。
【００４８】
また、本発明のマラリア原虫の染色方法は、本発明の一般式（Ｉ）で表されるロダシアニン系色素化合物を含有するマラリア原虫染色剤を用いて診断することができる。本発明のマラリア原虫の染色方法は、上記マラリア感染症の判別方法と同様にして、採血した血液に本発明のマラリア原虫染色剤を接触させることにより行なうことができる。
【００４９】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
実施例１：化合物（II）の合成
４．０ｇの２−メチルチオベンゾチアゾールと、５．０ｍＬのｐ−トルエンスルホン酸メチルのアニソール溶液５．５ｍＬを１３０℃で１．５時間攪拌した。混合物を室温に冷却後、７４ｍＬのアセトニトリルを加え、さらに３．８３ｇの３−（２−プロペニル）−２−チオキソ−４−チアゾリジノンを加えた。この混合物を０℃に冷却した後に４．９ｍＬのトリエチルアミンを徐々に滴下し、０℃にて１時間攪拌した。得られた沈殿物を吸引濾別し、アセトニトリルで洗浄し粗結晶５．５１ｇを得た。この粗結晶の２．１ｇと９．０ｍＬのｐ−トルエンスルホン酸メチルの混合物に７．５ｍＬのジメチルホルムアミドを加え懸濁液とし、１２０℃にて１．５時間撹拌した後、室温に冷却しアセトンを加え、沈殿物を吸引濾別し、アセトンで洗浄し乾燥した結果、８．６４ｇの粗結晶を得た。この粗結晶の８．６４ｇと、４．７１ｇの１−メチル−４−メチルピリジニウム＝ｐ−トルエンスルホナートと８５．０ｍＬのアセトニトリルの混合物を攪拌した。その混合物に７０℃で７．０ｍＬのトリエチルアミンを滴下し、これを７０℃にて１時間撹拌した。得られた混合物を室温に冷却した後に、酢酸エチルを加えた。沈殿物を吸引濾別し、冷酢酸エチルで洗浄した。この粗結晶をメタノール／酢酸エチル混合溶媒から再結晶し、３．９４ｇの２−［｛５−（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）−４−オキソ−３−（２−プロペニル）−２−チアゾリジニリデン｝メチル］−１−メチルピリジニウム＝ｐ−トルエンスルホナートを得た。収率は３２％であった。
m.p. 249-251℃; IR (KBr) cm-1: 1038, 1189, 1057, 1539, 1636, 3471; 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6 ) :δ 2.27 (3H, s), 4.04 (6H, s), 4.69 (2H, d, J = 4.9 Hz), 5.27-5.33 (2H, m), 5.81-5.92 (1H, m), 5.85 (1H, s), 7.09 (2H, d, J = 7.7 Hz), 7.28 (1H, dd, J = 7.4, 7.7 Hz), 7.40 (1H, dd, J = 6.5, 7.6 Hz), 7.45-7.49 (3H, m), 7.60 (1H, d, J = 8.2 Hz), 7.85 (1H, d, J = 7.7 Hz), 7.98 (1H, d, J = 8.2 Hz), 8.25 (1H, dd, J = 7.6, 8.2 Hz), 8.63 (1H, d, J = 6.5 Hz); Anal Calcd for C29H27N3O4S3: C, 59.45; H, 4.81; N, 7.43: Found: C, 59.25, H, 4.80; N, 7.29.
【００５０】
実施例２：化合物（III）の合成
２．９８ｇの２−メチルチオベンゾチアゾールと、３．７４ｍＬのｐ−トルエンスルホン酸メチルのアニソール溶液４．１ｍＬを１２０℃で４時間攪拌した。室温に冷却後、混合物に６０ｍＬのアセトニトリルを加え、さらに２．６７ｇの３−エチル−２−チオキソ−４−チアゾリジノンを加えた。この混合物を０℃に冷却した後に４．９ｍＬのトリエチルアミンを徐々に滴下し、１０℃にて４時間攪拌した。得られた沈殿物を吸引濾別し、アセトニトリルで洗浄し粗結晶４．５２ｇを得た。この粗結晶１．０２ｇと１．４７ｍＬのｐ−トルエンスルホン酸メチルの混合物に１．０ｍＬのジメチルホルムアミドを加え懸濁液とした。これを１３０℃にて２．５時間撹拌した。得られた混合物を室温に冷却した後にアセトンを加え、沈殿物を吸引濾別した。沈殿をアセトンで洗浄し、乾燥した結果、１．４７ｇの粗結晶を得た。
この粗結晶０．５０ｇと、１．２２ｇの１−エチル−４−メチルピリジニウム＝ｐ−トルエンスルホナートと２０ｍＬのアセトニトリルの混合物を攪拌した。その混合物に７０℃で１．７ｍＬのトリエチルアミンを滴下し、これを７０℃にて１．５時間撹拌した。得られた混合物を室温に冷却した後に、酢酸エチルを加えた。沈殿物を吸引濾別し、冷酢酸エチルで洗浄した。この粗結晶をメタノール／酢酸エチル混合溶媒から再結晶し、０．２８ｇのｐ−トルエンスルホナート塩を得た。
メタノールに浸潤した強塩基性陰イオン交換樹脂（アルドリッチ製アンバーライトＩＲＡ−４００（Ｃｌ）を充填したイオン交換カラムに移した。４０ｍｇの上記化合物のメタノール／ジクロロメタン溶液をカラムに通し、溶出液を集めて減圧濃縮した。残渣をメタノールに加熱溶解したものに酢酸エチルを加えた。得られた沈殿を吸引濾別した後、酢酸エチルで洗浄し２５ｍｇの２−［｛５−（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）−４−オキソ−３−エチル−２−チアゾリジニリデン｝メチル］−１−エチルピリジニウム＝クロライドを得た。全行程の収率は３０％、ｍ．ｐ．２５３−２５７℃であった。
【００５１】
実施例３：化合物（IV）の合成
１．０ｍｌの４−メチルキノリンと１．８ｍＬのｐ−トルエンスルホン酸メチルの混合物を７０℃にて１．５時間攪拌した。得られた混合物を室温に冷却した後に、酢酸エチルを加えた。沈殿物を吸引濾別し、冷酢酸エチルで洗浄した後に乾燥することで２．３ｇの１−メチル−４−メチルキノリウム＝ｐ−トルエンスルホナートを得た。収率は９１％であった。次に、この１−メチル−４−メチルキノリニウム＝ｐ−トルエンスルホナート０．１７ｇと、３−エチル４，５−ジヒドロ−５−（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）−２−メチルチオ−４−オキソチアゾリウム＝ｐ−トルエンスルホンナート０．２５ｇと、２．６ｍＬのアセトニトリルの混合物を攪拌した後、７０℃で０．２１ｍＬのトリエチルアミンを滴下し、これを７０℃にて１時間撹拌した。得られた混合物を室温に冷却した後に、酢酸エチルを加えた。沈殿物を吸引濾別し、冷酢酸エチルで洗浄した後に乾燥することで０．２９ｇの４−［｛５−（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）−４−オキソ−３−エチル−２−チアゾリジニリデン｝メチル］−１−メチルキノリウム＝ｐ−トルエンスルホナートを得た。収率は９３％であった。
ｍ.p.267-269℃；IR (KBr) cm-1:1208, 1507, 1616, 3396; 1H-NMR (300 MHz, DMSO-d6 ) δ: 1.29 (3H, t, J = 7．1 Hz), 2.27 (3H, s), 4.11 (3H, s), 4.25（3H, s）, 4.25-4.29 (2H, q, J = 7．1 Hz), 6．85 (1H, s), 7．10 (2H, d, J = 8．2 Hz), 7．27 (1H, t, J = 7．7 Hz), 7．47 (1H, d, J = 8．2 Hz), 7．51−7．55 (1H, m), 7．64 (1H, d, J = 8．2 Hz), 7．76-7．85 (2H, m), 8．00 (1H, t,J = 7．8 Hz), 8．10 (1H, d, J = 8．8 Hz), 8．66 (1H, d, J = 6．9 Hz), 8．74 (1H, d, J = 8．5 Hz), ; Anal Calcd for C31H29N3O4S3・2H2O: C, 58.19; H, 5.20; N, 6.57. Found: C, 58.31; H, 4.99; N, 6.62.
【００５２】
実施例４：ヒトマラリア感染標本の染色
供試マラリア原虫として、P.Falciparum ＦＣＲ−３株（ＡＴＣＣ３０９３２）を用いた。実験に用いた培地は、ろ過滅菌したＲＰＭＩ １６４０培地で、ｐＨを７．４に合わせ、ヒト血清を１０％となるように添加した。マラリア原虫の培養は、Ｏ2濃度５％、ＣＯ2濃度５％、Ｎ2濃度９０％、温度３６．５℃の条件下で行った。ヘマトクリット値（赤血球浮遊液中に占める赤血球の体積の割合）は５％にして用いた。培養開始時の熱帯熱マラリア原虫の初期感染率は０．１％とした。２４穴培養プレートを用いて培養し、培地は毎日交換し、感染率４％で植継ぎを行った。供試サンプルにはマラリア感染率が３０〜５０％になった感染血液を使用した。なお、感染率は薄層塗抹標本を作成し、ギムザ染色あるいはＤｉｆｆ−Ｑｉｃｋ染色を行った後、顕微鏡（油浸、１，０００×）下で計測し、マラリア原虫感染率を下記式から算出した。
マラリア原虫感染率（％）＝｛（感染赤血球数）／（総赤血球数）｝×１００
得られたヒトマラリア感染血液サンプル９９μＬに、実施例１で得られた化合物の０．００５重量％ＤＭＳО溶液を１μＬ添加して、３７℃にて１時間振盪し、染色を行なった。その後、薄層塗抹標本をプレパラートに作製したものを光学顕微鏡（油浸、１，０００×）（オリンパス社製）下で観察した。染色されたマラリア原虫を図１（参考写真１参照）に示し、マラリア原虫の拡大図を図２（参考写真２参照）に示す。図１中、マラリア原虫の組織（オルガネラ）が赤い蛍光の斑点（参考写真１）として確認でき、図２中、薄赤色で囲まれた円状のものは単細胞のマラリア原虫を示し、マラリア原虫の特定の組織（オルガネラ）が赤い蛍光（参考写真２）となって確認できた。
【００５３】
比較例として、ヒトマラリア感染標本についてギムサ染色により染色を行なった。ヒトマラリア感染血液の薄層塗抹標本を作製し、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ液（シグマ社製）に浸し乾燥させたものを、光学顕微鏡（油浸、１，０００×）（オリンパス社製）下で観察した。染色されたマラリア原虫を図３（参考写真３参照）に示す。図３中、グレーで囲まれた円状のものは赤血球を示し、黒い斑点（参考写真３）がマラリア原虫の代謝物（ヘモゾイン）を示し、それを囲む白抜きの部分が単細胞マラリア原虫を示す。
結果からロダシアニン系色素化合物により赤血球中のP.Falciparumは赤色の蛍光を発し、容易に確実に染色され、マラリア感染の診断に適用できることがわかった。
【００５４】
実施例５：ネズミマラリア感染標本の染色
供試マラリア原虫として、P.bergheiを用いた。P.bergheiマラリアに感染（感染率３０〜６０％）したＩＣＲマウスより心採血で得たネズミ血清１．０ｍＬにヘパリン１０μＬを加え、軽く振盪する。得られた血液サンプル９９μＬに、実施例１で得られた化合物の０．００５重量％ＤＭＳО溶液を１μＬ添加して、３７℃にて３０分間振盪し、染色を行った。その後、薄層塗抹標本をプレパラートに作製したものを光学顕微鏡（油浸 １，０００×）（オリンパス社製）下で観察した。染色されたマラリア原虫を図４（参考写真４参照）に示す。図４中、濃い緑の円状のものは赤血球を示し、薄い緑の円状のものはマラリア原虫を示し、マラリア原虫中に赤い（黄色に呈色されている）蛍光の斑点（参考写真４）として色素が集積した組織が確認でき、細胞核が青色の点として確認できた。
【００５５】
比較例として、ネズミマラリア感染標本についてギムザ染色により染色を行なった。ネズミマラリア感染血液の薄層塗抹標本を作製し、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ液（シグマ社製）に浸し乾燥させたものを、光学顕微鏡（油浸 １，０００×）（オリンパス社製）下で観察した。染色されたマラリア原虫を図５（参考写真５参照）に示す。図５中、薄黄色で囲まれた円状のものは赤血球を示し、赤血球中にマラリア原虫が褐色の斑点として確認された。
結果からロダシアニン系色素化合物により赤血球中のマラリア原虫は赤い蛍光を発し、容易に確実に染色され、マラリア感染の診断に適用できることがわかった。
【００５６】
【発明の効果】
本発明によれば、ロダシアニン系色素化合物は血液中のマラリア原虫に特異的に集積し、赤い蛍光を発するため、マラリア原虫を容易に確実に検出することができ、マラリア感染の診断を容易に且つ確実に行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のマラリア感染診断剤により染色されたヒトマラリア原虫を示す図である。
【図２】図１に示すヒトマラリア原虫の拡大図である。
【図３】従来例のマラリア感染診断剤により染色されたヒトマラリア原虫を示す図である。
【図４】本発明のマラリア感染診断剤により染色されたネズミマラリア原虫を示す図である。
【図５】従来例のマラリア感染診断剤により染色されたネズミマラリア原虫を示す図である。
Claims (8)
- 式（ＩＩ）〜式（ＩＶ）のいずれかで示されるロダシアニン系色素化合物を含有することを特徴とするマラリア感染診断剤。
- ロダシアニン系色素化合物が、赤血球中のマラリア原虫の細胞小器官に集積し蛍光を発することによりマラリア感染の診断を可能とすることを特徴とする請求項１記載のマラリア感染診断剤。
- 式（ＩＩ）〜式（ＩＶ）のいずれかで示されるロダシアニン系色素化合物を含有することを特徴とするマラリア原虫染色剤。
- ロダシアニン系色素化合物が、赤血球中のマラリア原虫の細胞小器官に集積し蛍光を発することを特徴とする請求項３記載のマラリア原虫染色剤。
- 式（ＩＩ）〜式（ＩＶ）のいずれかで示されるロダシアニン系色素化合物を含有するマラリア感染診断剤を用いて血液中のマラリア原虫を選択的に染色することを特徴とするマラリア感染症の判定方法。
- ロダシアニン系色素化合物が、赤血球中のマラリア原虫の細胞小器官に集積し蛍光を発することによりマラリア感染症を判定することを特徴とする請求項５記載のマラリア感染症の判定方法。
- 式（ＩＩ）〜式（ＩＶ）のいずれかで示されるロダシアニン系色素化合物を含有するマラリア原虫染色剤を用いて血液中のマラリア原虫を選択的に染色することを特徴とするマラリア原虫の染色方法。
- ロダシアニン系色素化合物が、赤血球中のマラリア原虫の細胞小器官に集積し蛍光を発することを特徴とする請求項７記載のマラリア原虫の染色方法。
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