JP3872511B2 - 低酸素腫瘍細胞を検出するためのフッ素化２−ニトロイミダゾールアナログ - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、一般に低酸素腫瘍細胞を検出するのに有用な化合物に関し、より詳細には特定の新規な腫瘍検出化合物に関する。本発明はまた、低酸素腫瘍細胞を検出するための方法および薬学的組成物に関する。
背景
酸素は、酸化的リン酸化を介して細胞エネルギーの主要な供給源を提供する。組織の低酸素症は、細胞への酸素供給が阻害される場合に生じ、そして血管性疾患において、発作の間、または腫瘍において生じ得る。それゆえ、低酸素腫瘍細胞は、十分に酸素化された細胞(酸素集団)と生存性を支えるには不十分な酸素を有する細胞(無酸素集団)との間の中間酸素圧で存在する細胞である。0.1％以下の酸素分圧(pO2)で存在する細胞は放射線生物学的に低酸素細胞(hypoxic cell)と称される。腫瘍血管系および微細循環の構造異常および機能異常は、低酸素細胞の存在の原因となる。Vaupelら（1989）Cancer Res. 49:6449-6465。
腫瘍における低酸素症は、不可逆的な拡散制限(「慢性」)形態または可逆的な灌流制限(「急性」)形態で存在し得る。Brown（1979）Br. J. Radiol. 52:650-656；Minchitonら（1993）8th International Conference on Chemical Modifiers of Cancer Treatment, Kyoto, Japan, 192-193；Thomlinsonら（1955）Br. J. Cancer 9:539-549。慢性低酸素症(腫瘍の低酸素症の典型的なモデル)は、固形腫瘍がその支持血管系に比して大きくなりすぎた場合に生じる。酸素分子の拡散距離は、代謝消費により、最も近くの毛細管から150〜200μmに限定される。拡散距離を超えると、細胞は壊死する。壊死領域のすぐ近傍は、酸素が涸渇しているが、生存可能な細胞の層である。これらの細胞は、酸素の拡散制限の結果であり、そして再び酸素化されるか、あるいは死滅するかのいずれかの時まで、低酸素性のままである。したがって、これらの細胞は慢性低酸素細胞と称される。これらの細胞はまた、低レベルのグルコースおよびATP、ならびに高レベルの異化代謝物(例えば乳酸)を有するようである。Vaupel（1992）NMR Biomed. 5:220-225。
血管を通る血流が一時的に停止した場合、閉塞の下流のすべての通常の好気細胞は突然低酸素性になる。これらの細胞は急性低酸素症であると考えられる。なぜなら、これらの細胞は、閉塞が継続する間のみ低酸素性であり、血流が再開された場合、再び酸素化されるからである。ヒト腫瘍における代謝の微細環境を定義付けるパラメーターについての現在利用可能な情報から、腫瘍内の異なる位置の間で、そして同じグレードかつ同じ臨床段階の腫瘍の間で、これらの関連する要因の顕著な変動が生じることが示される。Vaupel（1992）、前出。
歴史的に、低酸素細胞の存在はガンの処置についての重要な指標となる(すなわち、放射線耐性、化学耐性、遺伝子の増幅および誘導ならびに特定の細胞タンパク質またはストレスタンパク質の過剰発現に関して)。低酸素細胞は、酸素性細胞(oxic cell)と比較して、放射線照射のよる細胞殺傷に対して２倍〜３倍耐性であることが知られている。Coleman（1988）J. Natl. Cancer Inst. 80:310-317；Hall(1988), Hall（編）, Radiobiology for Radiologist, Lippencott Co., Philadelphia, 137-160。これは、正常な酸素圧の細胞においては、酸素分子が放射線照射により誘導されたラジカルとDNA中で相互作用し得、損傷の不可逆的な固定を導くために生じる。Hall（1988）、前出。放射化学的競合モデルによれば、酸素分子は、標的分子を元の非損傷形態に回復させ得る還元種(例えば、グルタチオンのようなチオール類)と競合する。Hall（1988）、前出。低酸素細胞は、還元種と効果的に競合するのに十分な酸素分子レベルを有さないため、これらの細胞において放射線照射により誘導された損傷の多くが修復される。
低酸素細胞はまた、ある範囲の化学療法薬物(ブレオマイシンおよび数種のアルキル化剤を包含する)に対しても耐性である。Workman（1983）Cancer Topics 4:54-55。これは、薬物送達の減弱、非循環的な細胞の運動状態の誘導または薬物の作用機構における酸素分子の関与によって生じ得る。低酸素への細胞の曝露はまた、新たなタンパク質の発現を導き得る。これらは、血管内皮成長因子、エリトロポイエチン、酸素により調節されるタンパク質、およびグルコースにより調節されるタンパク質、およびストレスタンパク質(例えば、熱ショック転写因子)を包含する。Giacciaら（1992）Int. J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 23:891-897；Semenzaら（1992）Mol. Cell. Biol. 12:5447-5454；Shweikiら（1992）Nature 359:843-845；Heacockら（1986）Int. J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 12:1287-1290。比較的一時的な低酸素症は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子増幅の頻度を増強し、それゆえメトトレキセート耐性を増幅し得る。Riceら（1986）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5978-5982。しかし、低酸素症誘導性薬物耐性は、P-糖タンパク質に関連する多剤耐性とは異なる。Sakataら（1991）Br. J. Cancer 64:809-814。低酸素細胞が臨床的抗腫瘍治療に対して有する負の効果は、腫瘍中のこれらの細胞を同定する集中的な研究を導いた。
静脈血のpO2は、約５％であり、したがってほぼ完全な放射線感受性を提供する。細胞が、窒素中の感受性と空気中または純粋な酸素中の感受性との中間の感受性を示す酸素圧はほぼ0.5％(Km値)である。これは、通常の組織中で遭遇する酸素レベルをはるかに下回る特定の酸素レベルは、正確に測定される必要があることを示す。しかし、現在の技術は隣接する多くの細胞についての平均値を与える場合が多く、この必要性を満たしていない。これは、検出および診断の深刻な障害である。なぜなら、固形腫瘍の組織学的評価は、細胞酸素における重要な変化がわずな細胞の直径の寸法においてさえ生じ得ることを示唆しているからである。Urtasunら（1986）Int. J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 12:1263-1267。
2-ニトロイミダゾールは、一部は特異的に低酸素細胞を標識し、細胞解析を提供するその能力により、そして一部は上記の低pO2値を正確にモニターするその感度により、腫瘍の低酸素症についてのプローブとして研究されている。この化合物はニトロ還元を受け、低酸素組織中の高分子に不可逆的に結合する反応性中間体(例えばヒドロキシルアミン)を形成することが知られている。Chapmanら（1983）Cancer Res. 43:1523-1528；Kochら（1984）Int. J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 10:1327-1332；Millerら（1982）Int. J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 8:741-744；Taylorら（1978）Cancer Res. 38:2745-2752；Vargheseら（1980）Cancer Res. 40:2165-2169。生物還元(bioreduction)速度は、pO2の減少に伴い上昇し、隣接する間質組織の細胞を含む正常な酸素リッチの細胞に優先して低酸素細胞の標識を可能にする。Urtasunら（1986）、前出。それゆえ、この現象は、腫瘍の低酸素症の侵襲的(生検による)評価および非侵襲的評価の両方についてのマーカーの開発において利用されてきた。侵襲的手順は生検サンプルに依存する。生検サンプルは、全腫瘍を代表しないことがあり、または目的の腫瘍の組織学的構造および血管パターンの詳細な知識を必要とし得る。しかし、非侵襲的技術は腫瘍全体の酸素化状態の測定を可能にする潜在能力を有する。
種々の放射性標識(例えば3Ｈ、14Ｃ、18Ｆ、82Ｂｒおよび125Ｉ）を有する2-ニトロイミダゾールが、オートラジオグラフィー、液体シンチレーションおよびγシンチレーションにより検出された。Chapman（1984）Cancer 54:2441-2449；Kohら（1991）Int. J. Radiation Oncol. Biol. Pys. 22:199-212；Mannanら（1992）Radiation Res. 132:368-374；Raseyら（1982）Radiation Res. 91:542-554；Raseyら（1985）Radiation Res. 102:76-85；Urtasunら（1986）、前出。例えば、ヒトにおけるメラノーマ、鱗状細胞(spuamous)ガン腫および小細胞肺ガンは、Chapmanおよびその共同研究者達により、組織学的切片の液体シンチレーションおよびオートラジオグラフィーを用いて、その酸素化状態についてスクリーニングされている。Chapman（1991）Radiother. Oncol. 20(補遺):13-19。しかし、これらの手順は、低酸素細胞についての特異的マーカーとして作用する2-ニトロイミダゾールの潜在能力を示すが、これらは、必要とされる標識マーカーの用量および関連する放射線用量が多いため、または混入物のために、ルーチンな使用には適切でない。さらに、標識の不安定性および特定の他の組織におけるマーカーの蓄積によりそれらの使用が制限される。Chapman（1991）、前出；Raseyら（1982）、前出。
腫瘍の酸素化状態のいくつかの研究が、免疫組織化学的方法を用いて、特にニトロイミダゾール付加物の固有の蛍光を使用することにより、またはこの付加物に対する蛍光ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体により行われてきた。蛍光側鎖を有する2-ニトロイミダゾール(例えばテオフィリン)および他の蛍光ニトロ複素環(例えばトランス-5-アミノ-3-[(5-ニトロ-2-フリル)ビニル]-1,2,4-オキサジアゾール)は、フローサイトメトリーを用いて組織学的切片中で定量化されている。Hodgkissら（1983）Br. J. Cancer 63:119-125；Oliveら（1983）Cancer Res. 43:3276-3280。さらに、蛍光細胞ソーティング(sorting)は、細胞対細胞基準で酸素化状態を確認する手段を提供する。近年、スフェロイド(spheroid)および実験動物腫瘍の酸素化状態を研究するために、ヘキサフッ化2-ニトロイミダゾールCCI-103Fに対するポリクローナル抗体、およびペンタフッ化2-ニトロイミダゾールEF5に対するモノクローナル抗体が使用されている。Lordら（1993）Cancer Res. 53:5721-5726；Raleighら（1994）Br. J. Cancer 69:66-71；Raleighら（1987）Br. J. Cancer 56:395-396。個々の細胞の酸素化状態についてのデータは別として、これらの抗体技術は、結合部位について、および個々の高分子付加物についてさえも、さらなるデータを提供し得る。しかし、他の侵襲的技術の場合と同じく、それらは、生検サイズにより制限され、それゆえこれも腫瘍全体の不均一性を完全に説明し得ない。
陽電子放射体(例えば18Ｆ)で標識された2-ニトロイミダゾールは、陽電子放射断層法(PET)により非侵襲的に検出され得る。例えば、Kohら（1991）、(前出)は、PET映像法を用いて、放射線治療の前の患者の腫瘍における低酸素領域の存在を示した。この研究において、腫瘍容積内の低酸素エレメントとは、局部腫瘍：血漿の18Ｆ ミソニダゾール(Misonidazole)比の閾値が、注射後２時間以上で、1.4以上である領域として定義された。PETは非常に感度の高い技術であるが、18Ｆ標識の短い半減期(t1/2≒109.7分)のような大きな欠点を有する。この短い半減期のため、処置設備における使用の直前に標識化合物を生成するために必要な技術設備(例えばオンサイトサイクロトロン)に相当な投資が必要となる。研究はまた、放射線曝露および適切な化学情報の欠如により特徴付けられ得る。
従来の核医学およびシングルフォトン放射断層法による腫瘍低酸素症のプローブとして、γ標識2-ニトロイミダゾールを開発する研究が進行中である。例えば、Raseyおよびその共同研究者らは、腫瘍の低酸素症のマーカーとしての4-ブロモミソニダゾールの放射線生物学的特性および薬理学的特性を研究している。Raseyら（1982）、前出。また、Parliamentおよびその共同研究者達は、シングルフォトン断層法(SPECT)による腫瘍低酸素症のプローブとして、123I-ヨードアゾマイシンアラビノシドが使用された。Parliamentら（1992）Br. J. Cancer 65:90-95。研究はいまだ臨床使用についてのこの技術の潜在能力を完全に評価するに至っていない。
今日、2Ｈおよび19Ｆ標識を含む2-ニトロイミダゾールが磁気共鳴分光法(MRS)および磁気共鳴映像法(MRI)により腫瘍中で非侵襲的に検出され得ることが広範に示されている。Evelhochら（1989）Magn. Reson. Med. 9:402-410；Jinら（1990）Int. J. Radiation Biol. 58:1025-1034；Kwockら（1992）Radiation Res. 129:71-78；Maxwellら（1989）Int. J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 16:925-929；Raleighら（1991）Magn. Reson. Med. 22:451-466；Raleighら（1986）Int. J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 12:1243-1245。磁気共鳴分光法は核磁気共鳴と類似の技術であり、目的の核から得たシグナルを強度ピークとして表示する。これは、データを画像/写真または強度値のマップとして表示する磁気共鳴映像法と対照的である。ほとんどの病院においてMR設備が広範に利用できるために、そしてこれらの技術は非放射性プローブを使用するために、これらの技術はますます一般的になっている。19Ｆ核は、MRS研究に理想的に適している。なぜなら、これは1/2のスピンを有し、天然に非常に豊富であり(100％)、検出感度が比較的高く(プロトンと比較して0.83)、そしてバックグランドが低いからである。一般に、19Ｆ MRSの使用は以下のことに依存する：
a)フッ素化薬物の入手可能性。磁気的に等価なフッ素の数が多い2-ニトロイミダゾールは、一般的に、より高い感度を与える。化合物は、理想的には比較的低い親油性を有し、そして代謝プロセスおよび非代謝プロセスを通じた標識の損失に対して比較的安定であるべきである。
b)薬剤の毒性。現在、一般的に、比較的高用量(0.1mmol/Kg/(磁気的に等価なフッ素原子)のオーダー)で与え得る薬物のみが検出され得る。Workmanら（1992）NMR Biomed. 5:270-272。これは、化合物の毒性により影響を受け、次にそれらの親油性に関連する。
c)化合物の薬物動力学的特性および特に通常組織に対する腫瘍組織の比。化合物の毒性に影響することとは別に、これらの特性はまた、目的の現象についてのプローブの特異性を示す。
２つのフッ化ミソニダゾールアナログであるRo 07-0741およびCCI-103Fは、マウス腫瘍中に選択的に保持されることが、19Ｆ MRSを用いて示されている。Maxwellら（1989）、前出；Workmanら（1992）、前出。シグナル強度は、EMT-6およびKHTにおいてRIF-1より高いことが観察され、そしてこれは既知の低酸素分率と一致しており、インビボでのニトロレダクターゼ活性と類似した。Moulderら（1984）Int. J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 10:695-712；Waltonら（1987）Biochem. Pharmacol. 36:887-896。別の研究において、CCI-103Fを腫瘍保持ラットに腹腔内注射した後、腫瘍から得られた19Ｆシグナルは、10匹のラットのうち４匹において24時間後に検出可能なままであり、低酸素細胞によるニトロ還元性生物活性化(nitroreductive bioactivation)の可能性を示した。Kwockら（1992）、前出。これらの腫瘍の免疫組織化学的評価は、壊死領域の周辺に結合した薬物の染色を示した。Kwockら（1992）、前出。
インビボでの腫瘍の検出のためのMRI/MRSアプローチの実行可能性がMaxwellら（1989）、前出(ミソダゾール、CCI-103FおよびRo 07-0741の19Ｆ標識アナログを使用)、およびPriorら（1990）Biochem. Pharmacol. 39:857-863(5-フルオロウラシル(5-FU)を使用)により示されている。また、再発性胃腸腺癌のための5-FU処置を受けた患者を用いる最近の研究(Glaholmら（1990）Br. J. Radiol. 63:547-553)により、MRI/MRS技術は、適切に標識された化合物の薬物動力学をインビボでモニターするのに有用であり得ることも確立された。このような方法は個々の患者についてのより正確な処置スケジュールの設定をよりいっそう可能にする潜在能力を有する。
磁気共鳴感度においては、CCI-103FがRo 07-0741よりも優れているが、その臨床的有用性は、その親油性(CCI-103Fのオクタノール/水分配係数＝20；Ro 07-0741のオクタノール/水分配係数＝0.41)およびそれゆえの毒性により制限され得る。ミソニダゾールと同様に、CCI-103Fはまた、19Ｆ標識の損失を伴う代謝的脱アルキル化を受けやすい。これは、共有結合付加物形成における非酸素依存性変動および保持データの解釈の困難性に寄与し得る。
MRIおよびMRS技術のために今日まで利用されている19Ｆ標識化合物の重大な問題は、それらの比較的高い親油性(CCI-103FおよびRo 07-0741)に起因するその神経毒性副作用および分子あたりのフッ素原子の数に起因する比較的弱いシグナルである(例えば、5-FUで見られる)。
それゆえ、これらの化合物は顕著な潜在能力を示すが、より部位特異的であり、かつ毒性が低く高いシグナル強度を有する19Ｆ腫瘍検出剤の明確な必要性が当該分野に存在する。
関連技術の概要
前節で引用した刊行物に加えて、以下の参考文献は、N-置換2-ニトロイミダゾール誘導体に関するため、関連を有する。
米国特許第3,679,698号(Beamanら)は、2-ニトロイミダゾール誘導体のうち、N-アルカン酸アミド誘導体を記載する。
米国特許第4,977,273号(Kagiyaら)は、フッ素で置換されたメチレン基を有する2-ニトロイミダゾール誘導体を記載する。
Shibamotoら（1992）Int. J. Radiation Biol. 61:473-478、Sasaiら（1991）Int. J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 20:1249-1254およびSasaiら（1991）Int. J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 21:1231-1234は、CH2CF2C(0)NHCH2CH2OHのN1-置換基を有する2-ニトロイミダゾールであるKU-2285を記載する。
Mashibaら（1991）Life Sciences 49:1419-1425およびShibamotoら（1991）Int. J. Radiation Biol. 59:105-115は、1-(4'-ヒドロキシ-2'-ブテノキシ)-メチル-2-ニトロイミダゾール(RK-28)を記載する。
Shibamotoら（1989）Int. J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 16:1045-1048は、側鎖に１つまたは２つのフッ素原子を有する2-ニトロイミダゾールおよび3-ニトロ-1,2,4-トリアゾールを記載する。
Murayamaら（1989）Int. J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 17:575-581は、1-[2-ヒドロキシ-1-(ヒドロキシメチル)エトキシ]メチル-2-ニトロイミダゾール(RP-170)を記載する。
Liら（1991）Cancer Comm. 3:133-139は、インビボでの[1Ｈ]/[19Ｆ]磁気共鳴分光法により測定され得る低酸素細胞標識として、ヘキサフルオロミソニダゾール(CCI-103F)を記載する。
発明の要旨
従って、本発明の第１の目的は、新規化合物を提供することにより、当該分野での上記の要求に取り組むことである。この新規化合物は、磁気共鳴映像法および／または磁気共鳴分光法を用いる、腫瘍の検出および抗腫瘍治療のモニタリングのために有用である。
本発明の他の目的は、低酸素腫瘍細胞の映像法のための、および抗腫瘍治療の進展のモニタリングのための薬学的組成物を提供することである。
本発明のさらなる目的は、低酸素腫瘍細胞の非侵襲的映像法のための、および抗腫瘍治療の進展のモニタリングのための方法であって、有効量の本発明の化合物を処置を受ける個体に投与する工程を包含する方法を提供することである。
さらなる本発明の目的、利点および新規の特徴は、一部は以下の説明で述べられ、一部は以下のことの検討によって当業者に明らかとなり、または本発明の実施により学習され得る。
第１の実施態様では、本発明は、磁気共鳴映像法および磁気共鳴分光法技術を用いる腫瘍検出剤として有用である、特定の新規化合物に関する。本発明で開示および特許請求される新規化合物は、比較的低い神経毒活性を有し、すなわち、脳内で容易に感知し得る程度まで蓄積されず、十分に高い濃度まで腫瘍細胞内で濃縮され、MRI/MRS技術を用いて検出するのに十分な強度の19Ｆシグナルを与え、そして容易に合成され得る。新規化合物は、構造式(I)を有し、
ここで、
Ｒ1およびＲ2は、独立して、水素；モノサッカリドであって、必要に応じて、低級アルコキシ、低級アシル、アミン、ハロゲンまたはカルボン酸部分を含むように官能化され、ここでその結合が該モノサッカリドの炭素原子に結合している、モノサッカリド；-CF3基で置換され、そしてさらに少なくとも１つのＲ3で置換された低級アルキルであって、ここでＲ3が-OHおよび-NR4 2からなる群から選択され、ここでＲ4が水素または低級アルキルである、低級アルキル；およびＮ、ＯおよびＳからなる群から選択される１つのヘテロ原子を含む５員および６員の複素環式環からなる群から選択され、あるいはＲ1およびＲ2は連結してＮおよびＯからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含む５員または６員の複素環式環を形成し、そして上記ヘテロ原子がＮである場合、該Ｎは非置換または低級アルキル基で置換され得、あるいは該Ｎはハライドまたはオキサレートのようなアニオン性対イオンと会合した塩形態であり得、そしてさらに上記５員または６員の複素環式環は-CF3部分で置換され、そして必要に応じて、-CF3で置換されているのと同じ炭素原子がさらに-OH、-CH2OHまたは-NH2で、置換される；
ただし、Ｒ1およびＲ2のうち少なくとも１つは、-CF3基で置換され、そしてさらに少なくとも１つのＲ3で置換された低級アルキルであり；そしてＲ1またはＲ2のいずれかが４個またはそれ以上の炭素原子を含んでいる場合、それは、１つより多いＲ3基で置換されている。
本発明はまた、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて、１種以上の上記化合物を含有する薬学的組成物に関する。しかし、これらの組成物は、一般に、常に経口投与される必要はない。
本発明は、MRIまたはMRS評価を受ける個体に、腫瘍検出に有効な量の本発明の化合物を投与することによる、低酸素腫瘍細胞を検出するための方法をさらに包含する。次いで、MRIおよび／またはMRSを用いて、個体中に存在する腫瘍細胞と会合し、およびそれにより保持されるこの化合物を検出する。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例４で説明するように、マウス肝臓ミクロソームによるSR 4554の代謝をグラフの形で図示する。
図２は、実施例５で記載するように、電子エネルギー損失分光法(EELS)を用いて、得られた培養物を追跡（chase）する前および後で、A2780スフェロイド(spheroid)の外部細胞および内部細胞のフッ素像の評価を、グラフの形で示す。
図３は、実施例６で評価するように、EMT-6腫瘍を有するBalb/cマウス内のSR 4554の薬物動力学をグラフの形で示す。
図４は、実施例６で記載するように、腹膜腔内注射後の時間の関数としてSR 4554の組織対血漿比をグラフの形で示す。
図５Ａは、SR 4554または生理食塩水を静脈内注射の後のBalb/cマウスの体重を、グラフの形で示す。図５Ｂは、SR 4554または生理食塩水を腹膜腔内注射の後のBalb/cマウスの体重を、グラフの形で示す。
図６Ａは、SR 4554および5-フルオロトリプトファンの磁気共鳴スペクトルであり、図６Ｂは、HOD（天然に豊富に存在する重水）および酢酸-dの磁気共鳴スペクトルである。
図７は、実施例８に記載のように、腫瘍重量の関数としてRIF-1腫瘍により保持される薬物の保持をグラフの形で示す。
図８は、マウス腫瘍異種移植片およびヒト腫瘍異種移植片におけるSR 4554の保持を示す。
発明の詳細な説明
定義および命名法
本発明の化合物、組成物および方法を開示および記述する前に、本発明は、特定の試薬または反応条件、特定の薬学的キャリア、あるいは特定の投与法に限定されず、それ自体変わり得ることは理解されるべきである。本明細書中で用いられる用語は、特定の実施態様のみを記述する目的であり、限定されることは意図されないこともまた理解されるべきである。
本明細書および添付の請求の範囲で用いられているように、文脈が明らかに他を示さない限り、単数形「a」、「an」、および「the」は、複数の対象も含み得ることが注意されなければならない。従って、例えば「2-ニトロイミダゾールアナログ（a 2-nitroimidazole analog）」といえば、「2-ニトロイミダゾールアナログ類（2-nitroimidazole analogs）」の混合物を含み、「薬学的キャリア（a pharmaceutical carrier）」といえば、２種以上のそのようなキャリアの混合物を含むなどである。
本明細書および以下の請求の範囲においては、以下の意味を有するように定義された多くの用語に言及する：
本明細書中で用いられる用語「アルキル」は、１個〜24個の炭素原子を含む分枝飽和炭化水素基または非分枝飽和炭化水素基（例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、t-ブチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシル、ヘキサデセニル、エイコセニル、テトラコセニルなど）をいう。本明細書中での好ましいアルキル基は、１個〜12個の炭素原子を含有する。用語「低級アルキル」は、１個〜６個の炭素原子、好ましくは１個〜４個の炭素原子のアルキル基を意味する。
本明細書中で用いられる用語「アルケニル」は、少なくとも１つの二重結合を含有する２個〜24個の炭素原子の分枝炭化水素基または非分枝炭化水素基（例えば、エテニル、n-プロペニル、イソプロペニル、n-ブテニル、イソブテニル、t-ブテニル、オクテニル、デセニル、テトラデセニル、ヘキサデセニル、エイコセニル、テトラコセニルなど）をいう。本明細書中での好ましいアルケニル基は、１個〜12個の炭素原子を含有する。用語「低級アルケニル」は、１個〜６個の炭素原子、好ましくは１個〜４個の炭素原子のアルケニル基を意味する。用語「シクロアルケニル」は、３個〜８個の炭素原子、好ましくは５個または６個の炭素原子の環状アルケニル基を意味する。
本明細書中で用いられる用語「アルコキシ」は、単一の末端エーテル結合を通して結合するアルキル基をいう。すなわち、「アルコキシ」基は-OR（ここでＲは上記で定義したアルキル）として定義され得る。「低級アルコキシ」基は、１個〜６個、より好ましくは１個〜４個の炭素原子を有するアルコキシ基を意味する。
本明細書中で用いられる用語「アシル」は通常の意味で用いられ、-(CO)-結合を介して結合されるアルキル基をいう。用語「低級アシル」は、カルボニル結合で結合されるアルキル基が、低級アルキル基であるアシル基をいう。
「ハロ」または「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨードをいい、そして通常有機化合物中の水素原子に対するハロ置換に関する。ハロの中では、クロロおよびフルオロが一般に好ましい。
用語「糖部分」は、モノサッカリドを包含することが意図される。糖部分は、それが腫瘍検出化合物の水溶性を増強するように、および／または親油性を減少させるように選択されるべきである。用語「糖」としては、修飾された部分が挙げられ、例えば、１つ以上のヒドロキシ基が、ハロゲン、アルコキシ部分、脂肪族基で置換され、あるいはエーテル、アミンなどとして官能化される。修飾された糖の例としては、以下が挙げられる：ヒドロキシ部分の代わりに低級アルコキシ基を含有する糖、すなわち、α-またはβ-グリコシド（例えば、メチルα-D-グルコピラノシド、メチルβ-D-グルコピラノシドなど）；アミンと反応した糖、すなわちN-グリコシルアミンまたはN-グリコシド（例えば、N-(α-D-グルコピラノシル)メチルアミン）；アシル化ヒドロキシ基（代表的に１個〜５個の低級アシル基）を含有する糖；１つ以上のカルボン酸基を含有する糖（例えば、D-グルコン酸など）；および遊離アミン基を含有する糖（例えば、D-グルコサミン、D-ガラクトサミン、N-アセチル-D-グルコサミンなど）。好ましいサッカリドの例は、グルコース、ガラクトース、フルクトース、リボース、マンノース、アラビノース、キシロースであり、D-グルコースが特に好ましい。
本明細書中で提供されるように、試薬の「有効量」という用語により、無毒性だが、MRIまたはMRSが実行され得るように、所望のシグナル強度を提供するに十分な量の試薬が意味される。以下に指摘するように、必要とされる正確な量は、被験者の種、年齢、および一般的な状態、腫瘍の存在に関連する疾患の重篤度、特定のフッ素化2-ニトロイミダゾールアナログおよび投与の様式などに応じて、被験者ごとに変化する。従って、正確な「有効量」を特定するのは不可能である。しかし、適切な有効量は、通常の実験のみを用いて当業者により決定され得る。
薬学的なキャリアなどを記載するのに用いられる用語「薬学的に受容可能」は、生物学的にまたは他の意味でも、望ましくない物質ではないことを意味する。すなわち、この物質は、所望されない生物学的効果を生じることなしに、または薬学的組成物に他の成分が含まれる場合には、それらの成分のいずれとも有害な様式で相互作用することなしに、選択されるフッ素化2-ニトロイミダゾールアナログと共に個体に投与され得る。
「必要に応じた」または「必要に応じて」は、続いて記載された事象または状況が起こることも起こらないこともあることを意味し、その記載は、上記の事象または状況が起こる場合、およびそれが起こらない場合を包含する。例えば、「必要に応じて官能化されたモノサッカリド」という表現は、モノサッカリド部分が、官能化されていてもされていなくてもよく、そしてその記載は、官能化されているモノサッカリド、および官能化されていないモノサッカリドの両方を包含する。
本発明は、磁気共鳴映像法および／または磁気共鳴分光法による、腫瘍低酸素症の非侵襲的検出のために有用なフッ素化2-ニトロイミダゾール誘導体に関する。2-ニトロイミダゾールのクラスの化合物はニトロ還元を受け、高分子との共有結合付加物を形成する反応性中間体となる。これらの化合物の組織への結合は、酸素濃度の減少（低酸素症の増大）により増強され、従って、この化合物は腫瘍低酸素症のためのマーカーとして作用し得るようになる。19Ｆ標識の導入は、非侵襲的技術（例えば、磁気共鳴映像法および磁気共鳴分光法）を用いた保持化合物の検出を可能にする。固形腫瘍は、一般に低酸素細胞領域を有し、この低酸素細胞領域は強い処置にもかかわらず、腫瘍の生存を維持することを可能とするので、腫瘍中の低酸素領域の検出および定量は、低酸素症標的治療（例えば、放射性増感剤、化学増感剤、および他の生物還元的に(bioreductively)活性化された薬物）からの恩恵を最も被ると思われる患者の合理的な選択を可能とする。さらに、これらの細胞の反応を観察することは、処置手順の改善を結果として得る。
新規化合物：
本明細書中で提供される新規化合物は、構造式(I)により定義される化合物である。ここで、
Ｒ1およびＲ2は、独立して、水素；モノサッカリドであって、必要に応じて、低級アルコキシ、低級アシル、アミン、ハロゲンまたはカルボン酸部分を含むように官能化され、ここでその結合が該モノサッカリドの炭素原子に結合している、モノサッカリド；-CF3基で置換され、そしてさらに少なくとも１つのＲ3で置換された低級アルキルであって、ここでＲ3が-OHおよび-NR4 2からなる群から選択され、ここでＲ4が水素または低級アルキルである、低級アルキル；およびＮ、ＯおよびＳからなる群から選択される１つのヘテロ原子を含む５員および６員の複素環式環からなる群から選択され、あるいはＲ1およびＲ2は連結して、５員または６員の、-CF3部分で置換されるアルキル環を形成する；
ただし、Ｒ1およびＲ2のうち少なくとも１つは、-CF3基で置換され、そしてさらに少なくとも１つのＲ3で置換された低級アルキルであり：そしてＲ1またはＲ2のいずれかが４個またはそれ以上の炭素原子を含んでいる場合、それは、１つより多いＲ3基で置換されている。
この群の中で好ましい化合物の例は、以下の通りである：
・Ｒ1が水素であり、かつＲ2が、-CF3基および少なくとも１つのＲ3基、好ましくは２つのＲ3基で置換された低級アルキルである化合物、そして最も好ましくは、Ｒ3がヒドロキシルである化合物；
・Ｒ1およびＲ2が、独立して-CF3基および少なくとも１つのＲ3で置換された低級アルキルである化合物、そして好ましくは、Ｒ1およびＲ2が同一でない化合物；および
・Ｒ1がモノサッカリドであり、かつＲ2が、-CF3基および少なくとも１つのＲ3で置換された低級アルキルである化合物、そして好ましくは、Ｒ1がD-グルコースである化合物。
特に好ましい化合物の例は、Ｒ1が2-ヒドロキシ-3,3,3-トリフルオロプロピル、Ｒ2が水素、ヒドロキシエチル、またはD-グルコース、Ｒ3が-OHである化合物である。
これらの群の中の特定の化合物は、以下の通りである。
有用性および投与：
構造式(I)（それらの薬学的に受容可能な塩を含む）で定義される本発明の化合物は、腫瘍検出剤として、さらに詳細には低酸素細胞特異的プローブとして有用であり、薬学的に受容可能なキャリアとと共に、１種以上の本化合物から構成される薬学的組成物に都合良く処方され得る。E.W.MartinによるRemington's Pharmaceutical Science、18版、(Mack Publ.Co.、Easton PA 1990)は、本発明の腫瘍検出剤を用いる処方物の調製のために用いられ得る、代表的なキャリアおよび薬学的組成物の通常の調製法を開示する。本発明の方法は、評価を受ける個体（例えば、哺乳動物個体）に腫瘍検出に有効な量の選択された化合物を投与し、続いて存在する腫瘍細胞に会合し、その細胞により保持される化合物を検出する工程を包含する。上記のように、このような検出は、非侵襲的技術（例えば、磁気共鳴映像法または磁気共鳴分光法）を用いて行われる。
本発明の化合物は、経口、非経口（例えば、静脈内）、筋肉内注射、または腹膜腔内注射などにより、投与され得る。溶液処方物の静脈内投与が臨床的に好ましい。なぜなら、与えられる正確な用量に対する制御が、より容易に達成し得るからである。投与される活性化合物の量は、当然、評価を受ける被検体、被検体の体重、投与様式、および処方する医師の判断に依存する。
意図される投与様式により、薬学的組成物は、固体、半固体、または液体の剤形（例えば、錠剤、座剤、丸剤、カプセル、散剤、水剤(solution)、懸濁剤など）であり得、好ましくは正確な投与量の単回の投与に適した単位投与形態であり得る。上記のように、組成物は、有効量の選択された薬物を薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて含み、さらに他の医薬、薬剤、キャリア、添加剤、希釈剤などを含み得る。
固体組成物のためには、通常の無毒性固体キャリアとしては、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、シュクロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。薬学的に投与可能な液体組成物は、例えば、本明細書中で記載のような活性化合物および必要に応じて薬学的添加剤を賦形剤（例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなど）中に溶解、分散等させることにより調製し、それにより水剤または懸濁剤を形成し得る。所望であれば、投与される薬学的組成物はまた、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤などのような少量の無毒性の補助物質（例えば、酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム(triethanolamine sodium acetate)、オレイン酸トリエタノールアミンなども含有し得る。このような剤形の実際の調製方法は公知であり、または当業者にとっては明白である。例えば、上記で参照したRemington's Pharmaceutical Scienceを参照のこと。
経口投与に関して、微粉末または顆粒は、希釈剤、分散剤、および／または界面活性剤を含有し得、そして水中またはシロップ中、乾燥状態でカプセルまたは薬袋中、あるいは非水溶液中または懸濁剤が含有され得る懸濁液中、結合剤または滑剤が含有され得る錠剤中、あるいは水またはシロップの懸濁液中に存在し得る。所望される場合または必要な場合、矯味剤、保存剤、懸濁化剤、濃稠化剤、または乳化剤が含有され得る。錠剤および顆粒剤は、好ましい経口投与形態であり、これらはコートされ得る。
非経口投与は、用いられる場合、一般に注射により特徴づけられる。注射可能なものは、液体状の水剤または懸濁剤、注射前の液体状の水剤または懸濁剤に適した固体形態、または乳剤のいずれかとして、通常の形態で調製され得る。非経口投与のための最近の修正されたアプローチは、遅延放出システムまたは持続放出システムであり、その結果、一定レベルの投与量が維持される。例えば、米国特許第3,710,795号を参照のこと。この特許は、本明細書中で参考として援用される。
肺への投与については、投与される薬物を、粉末形態に変え、通常のプロペラント（例えば、テトラフルオロエタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロフルオロメタンなどのようなハロ炭化水素）と組み合わせて、そしてエアロゾル処方物として投与されることが好ましい。好ましくは、処方物は、界面活性剤もまた含有し、プロペラント中での薬物粉末の懸濁または分散を容易かつ安定にする。薬物粉末は、普通、処方物の約0.1〜10重量％を構成する。固体粒子エアロゾル処方物は、代表的には、上記の投与量を有する１つ以上の単位用量で投与され、治療レベルの薬物を供給し得る。
調製のためのプロセス
本発明の目的は、所望される物理化学的特性（一般にニトロヘテロ環で見られる神経毒性の副作用を減少させる特性、低酸素腫瘍細胞へのこれらの薬物の蓄積を増進させる特性の両方）を有するフッ素含有2-ニトロイミダゾールを生成することである。現在まで利用されているこれらの化合物に関する主要な問題は、１分子当たりのフッ素原子の数に起因する、それらの比較的弱いシグナルであり（例えば、5-フルオロウラシルに関して）、またはそれらの高い親油性におそらく関係する神経毒性副作用（CCI-103FおよびRo 07-0741）である。Brownら(1980)Radiation Res.82:171-190。本発明者らは、本明細書中でトリフルオロメチル基を含有する化合物を合成した。なぜなら、薬物の１分子当たりのフッ素原子の数が、MRI/MRS評価において高いシグナル強度および感度にとって重要であることを発見したからである。2-ニトロイミダゾールの官能性は、必要であると考えられる。なぜなら、低酸素細胞中の高分子への標識薬物の不可逆的共有結合が、これらの細胞中でのフッ素標識の濃度を増加させ、これが次いで、固形腫瘍の検出を改良することに寄与する結果となるからである。
以下に例示する合成アプローチは、以前にSRIでW.W.LeeおよびJ.M.Brown（Stanford University）（Brownら(1981)Int.J.Radiation Oncol.Biol.Phys.7:695-703）により開発された生物還元的に活性化されたニトロヘテロ環化合物であるエタニダゾール（Etanidazole）（SR 2508）のフッ素化物アナログの合成に基づく。彼らは、エタニダゾールは、ミソニダゾールより神経毒性が少ないことを示した。これは、より低い親油性に相関した（ミソニダゾール:log P=-0.32；エタニダゾール:log P=-1.28）。
このシリーズで合成される最初の化合物であるN-(2-ヒドロキシ-3,3,3-トリフルオロプロピル)-2-(2-ニトロ-1H-イミダゾール-1-イル)アセタミド（SR 4554）は、適切なプローブ分子のための全ての所望の成分を含んでいたが、0.9％生理食塩水溶液にかなり不溶性（エタニダゾール=551mmol ml-1に対してSR 4554=23mmol ml-1）であることが発見され、そして予想されるよりさらに正のlogPを有していた（エタニダゾール=-1.28に対してSR 4554=-0.20）。理論により束縛されることを望まないが、それらは、これらの現象の原因と思われるのはトリフルオロメチル基の異常な電子的性質である。従って、フッ素化2-ニトロイミダゾールのこのクラスの範囲は、より水溶性の誘導体およびより親水性の誘導体を包含することまで拡張された。
ターシャリーアミドアナログSR 4557を与える親水性のヒドロキシエチル側鎖の添加は、トリフルオロメチル基の効果を克服し、そして生理化学的特性を有する化合物を与えることが期待された。驚くべきことに、SR 4557は、0.9％生理食塩水への溶解性は大いに増大するが(SR 4557=628mmol ml-1、に対してSR 4554=23 mmol ml-1)、logP値の変化をほとんど示さなかった（SR 4557＝-0.36に対するSR 4554=-0.20）。SR 4554およびSR 4557の親油特性は、元来、これらの化合物をインビボでの使用に好ましくないものと考えられていた。しかし、SR 4554に関して本明細書中で記載された研究は、この仮定が、これらのタイプのフッ素化誘導体には無効であり得ることを示した。なぜなら、薬物動力学的研究は、SR 4554が、十分に高い濃度で低酸素腫瘍細胞に蓄積し、MRI/MRS技術にとって十分な強度の19Ｆシグナルを与えるが、それが脳内で感知される程度まで蓄積されないことを示しているからである。
本発明の化合物は、本明細書中の実験の項で示すように、比較的単純で直接的な方法を用いて高い収率で調製され得る。
本発明は、その好ましい特定の実施態様に関連して記載されているが、上記の説明および以下の実施例は、本発明の範囲を説明することを意図し、制限することを意図しないことが理解されるべきである。本発明の範囲内の他の局面、利点、および改変は、本発明に関係する当業者に明らかである。
実験
組織サンプルおよび標準物質の抽出：硝酸銀溶液（25μl；30% w/v）を250μlの組織サンプルおよび標準物質、ならびに20μlの内部標準物質溶液（0.1M Tris緩衝液中の12.5μl/ml、pH 7.4）に添加した。次いで、サンプルをボルテックスし、そして５分間遠心分離した（2000×ｇ）。次いで、抽出したサンプル（50μl）をHPLCに注入した。
HPLC法：クロマトグラフィーシステムは、WISP Model 712自動サンプル採取器（Waters Chromatography Ltd.）、４組の(quaternary)HPLCポンプを有するModel 660グラジエント制御器、Model 991フォトダイオードアレイ検出器、およびWaters 991フォトダイオードアレイソフトウェアを実行するNEC Powermate SX/16パーソナルコンピュータから構成された。逆相クロマトグラフィー分離を、10μm μ Bondapak C18（3.9×300mm）分析カラム（Millipore）上で室温で実施した。２×6.5mmのステンレススチールカラム（Upchurch Scientific, Inc.）に充填されたPellicular ODS（Whatman）を、プレカラムとして使用した。移動相はメタノール／水（15：85）であった。全ての溶媒を、0.45μm Teflon PTFE/ポリプロピレン濾過膜を通して濾過し、ヘリウムで脱気し、そして2ml/分の流速で等速で送った。カラム溶出液を、UV-フォトダイオードアレイ検出器によって、324nm（UV範囲は200nmから500nmである）でモニターした。分析物の内部標準に対するピーク面積比を、較正曲線を構築することにより検出器の応答を濃度の見積値に変換するために用いた。
以下の実施例は、当業者に、本発明の化合物の調製方法および使用方法の完全な開示および説明を提供するために記載され、発明者らが自分の発明であると考える発明の範囲を制限することを意図しない。数値（例えば、量、温度など）に関してその正確性を確保するための努力はなされているが、いくらかの誤差および偏差は考慮されるべきである。他に示さない限り、部は重量部であり、温度は℃であり、そして圧力は大気圧または大気圧付近である。
全ての出発物質および試薬は市販されている。
実施例１
本実施例は、N-(2-ヒドロキシ-3,3,3-トリフルオロプロピル)-2-(2-ニトロ-1H-イミダゾール-1-イル)アセタミド(SR 4554)の調製を記載している。
SR 4554の合成は、スキーム１に示される。2-ニトロイミダゾール(4)のそのナトリウム塩への転化を、150℃でメタノール-DMF中のナトリウムメトキシドで10分間処理することにより達成した。続いて、85℃で、DMF中のブロモ酢酸メチルと20分間反応させ、メチルエステル(5)を得た。次いで、この化合物５を100℃で0.1N NaOHで15分間処理し、次いで1M HClで酸性化することによりカルボン酸(6)に転化した。フッ素で標識した側鎖を、炭酸カリウムの存在下で、トリフルオロアセトアルデヒドヘミアセタール(7)とニトロメタンとを60℃で３時間反応させることにより調製した。純粋なニトロ化合物(8)を反応混合物から115℃、60mmHgで蒸留することにより得た。８のニトロ基の還元を、40psiでラネーニッケル触媒で水素化することにより達成し、濾過した反応混合物をエーテル性HClで−20℃で処理することにより、アミノ化合物(9)のHCl塩を得た。カルボン酸(6)とこのアミノ化合物とのカップリングは、まず、テトラヒドロフラン(THF)中のイソブチルクロロホルメートおよびN-メチルモルホリンを用いて、０℃で６の酸基を混合無水物に転化することにより実施した。アミン(9)およびさらに等量のN-メチルモルホリンを添加することにより、SR 4554を形成した。これを、カラムクロマトグラフィーおよび酢酸エチル−ヘキサンからの再結晶により精製した。
実施例２
本実施例は、N-(2-ヒドロキシエチル)-N-(2-ヒドロキシ-3,3,3-トリフルオロプロピル)-2-(2-ニトロ-1H-イミダゾール-1-イル)アセタミド(SR 4557)の調製を記載している。
SR 4557の合成はスキーム２に示される。還流エーテル中で、1-ブロモ-3,3,3,-トリフルオロアセトン(10)を水素化アルミニウムリチウムで還元することにより、ブロモアルコール(11)を得、これを120〜122℃で蒸留することにより精製した。この化合物を、100℃でNaOHを用いて環化してエポキシド(12)にし、これを反応混合物から直接蒸留した。エポキシド(12)を水中エタノールアミンと反応させることにより、ジオール(13)を得、これを105℃〜115℃、0.05mmHgで蒸留することにより精製した。この中間体と、カルボン酸(6)とのカップリングは、SR 4554についての手順と同様の手順を用いて実施した。カラムクロマトグラフィーによる精製により、無定型固形物としてSR 4557を得た。
実施例３
本実施例は、メチル2-デオキシ-2-[N-2-ヒドロキシ-3,3,3-トリフルオロプロピル-2-(2-ニトロ-1H-イミダゾール-1-イル)アセタミド-β-D-グルコピラノシドの調製を記載している。
D-グルコース誘導体(1)のために用いられる合成アプローチは、スキーム３に示される。重炭酸ナトリウム水溶液中で、D-グルコサミン塩酸塩(14)をベンジルオキシクロロホルメートで処理することにより(15)を得、これを、塩酸含有メタノール中で還流することにより、メチルグルコシド(16)に転化した。次いで、化合物(6)を、ピリジン中の無水酢酸で処理することにより、トリアセトキシ誘導体(17)に転化した。H2およびエタノール中の10％パラジウムカーボン用いてベンジルオキシカルバメート基を除去し、アミノ化合物(18)を得た。密封管中で85℃の温度のアセトニトリル中のトリフルオロメチルエポキシド(12)で(18)を処理することにより、その第１級アミノ基のアルキル化を行い、(19)を得た。アミノ化合物(19)を、上記のようにTHF中のイソブチルクロロホルメートおよびN-メチルモルホリンを用いて、2-(2'-ニトロイミダゾール)酢酸(6)とカップリングし、そしてアセトキシ保護基をメタノール中の触媒量のナトリウムメトキシドで除去することにより、生成物(1)を、ジアステレオ異性体の混合物である結晶固形物として得た。
実施例４
インビトロでのSR 4554の代謝
SR 4554を低酸素化（100%窒素）で、マウス肝臓ミクロソーム、ならびに精製ラットシトクロムP450レダクターゼおよびヒトシトクロムP450レダクターゼにより還元した。還元は空気により完全に阻害され、またシトクロムP450レダクターゼのインヒビター（TlCl3/4H2O;0.2mg/ml）の存在下でも阻害された。対照的に、一酸化炭素は、ミクロソームにおける代謝の15％しか阻害しなかった。薬剤のミクロソーム代謝の速度を、それぞれ650μMおよび16.84nmol・min-1mg-1のKmおよびVmaxにより特徴づけた。このことにより、生物活性化(bioactivation)の最初の段階におけるシトクロムP450レダクターゼの関与が示唆される。
マウス肝臓ミクロソーム（0.5mg/mlタンパク質）によるSR 4554の還元による代謝の特性を図１に示す。サンプルを種々の時点で取り出し、上記のように硝酸銀で抽出し、そして高速クロマトグラフィー（HPLC）によって分析した。親薬物の減少によって示されるように、SR 4554は低酸素条件下で代謝された。反応は、補因子（NADPH）の非存在下および空気中で実施される場合に完全に阻害された。シトクロムP450インヒビターである一酸化炭素は、SR 4554の低酸素代謝を15％まで阻害した。さらに、シトクロムP450レダクターゼインヒビターTlCl3・4H2O(0.2mg/ml)は、還元プロセスを完全に阻害した。他のニトロ含有種は、代謝時に観察されなかった。
実施例５
電子エネルギー損失分光法を用いる、ヒト卵巣A2780スフェロイドにおけるSR 4554の保持率
約100個のスフェロイド（直径0.5mm-１mm）を、１mMのSR 4554を含有する培養培地中で３時間インキュベートした。次いでスフェロイドを薬物を含有しない培地で洗浄し、結合していない薬物を除去し、そしてさらに37℃で22時間「追跡」した。サンプルを、凍結切片化(cryosectioning)のために-185℃で液体プロパン／イソペンタン中に投入して凍らせた。切片を電子エネルギー損失分光法（EELS）により分析した。SR 4554は、外部の細胞（すなわち、周辺部）よりも、スフェロイドの中心に近い、内部のより低酸素の細胞において蓄積されることが見出された。
SR 4554の局在化のフッ素像は、EELSを用いて得られ、そして図２に示されるように、フッ素／窒素（Ｆ／Ｎ）比として定量された。スフェロイド中心付近の細胞は、スフェロイドの周辺の細胞よりも、７倍もの有意に高レベルのフッ素を含有することが見出された（ｐ＜0.05）。これらの実験は空気中で行われた。
実施例６
SR 4554の薬物動力学
EMT-6腫瘍含有マウスを本研究において使用した。マウスに単回の腹膜内注射または静脈内注射（180mg/kg体重）、あるいはSR 4554での洗浄により単回の経口用量（経口90mg/kg）を与えた。３匹のマウスを各時点ごとに屠殺し、そして心臓に穿刺することによって血液を得た。得られた血液を遠心分離し、血漿を得た。腫瘍、肝臓、および脳もまた、種々の時点で得た。サンプルを硝酸銀で抽出し、そして高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により、実施例４に記載された手順を用いて分析した。
マウス中のSR 4554の吸収およびクリアランスは、低用量のミソニダゾールのそれと同様であることが見出され、薬物は経口、静脈内、および腹腔内投与において非常に高いバイオアベイラビリティを示した（静脈内に対する比は、静脈内100％、腹腔内100.4％、経口95.5％であった）。このことにより、薬物はこれらの経路のいずれによっても効果的に投与され得ることが示唆される。Brownら（1980）、前出；Workmanら（1981）Cancer Chemother. Pharmacol. 6:39-49。重要なことに、SR 4554の脳でのレベル、および脳／血漿比は一般に低かった。実際、思いがけないことに、これらは、ミソニダゾールを含むほとんどの親油性2-ニトロイミダゾールについて以前に引用されたレベルよりも低く、むしろエタニダゾールのようなより親水性のニトロイミダゾールのレベルと匹敵する。Brownら（1980）、前出；Workmanら（1981）、前出。ニトロイミダゾールの脳内濃度は親油性により決定され、そして化合物の毒性に関連することが観察されている。Brownら（1980）、前出；Workmanら（1981）、前出。この観察により、親油性はこのような化合物の脳内への浸透を決定する唯一の基準ではないこと、およびSR 4554はその親油性から予想され得る毒性よりも潜在的に低毒性であることが示唆される。
図３に示されるように、SR 4554は血漿中で、この用量レベルで少なくとも注入後６時間まで検出され得る（検出限界：25ng/ml）。しかし、薬物の組織レベルは６時間の時点で検出限界（100ng/g組織）より低かった。SR 4554濃度のピーク（Cmax）は145μg/mlと見出され、30分（tmax）で生じた。腫瘍の薬物レベルは、52μg/gのCmaxおよび45分のtmaxの血漿のレベルに従った。血漿および腫瘍薬物動力学の両方とも、１次指数のオープンモデルに一致し、モデル非依存（台形）のAUC値は、それぞれ13.9μg・ml-1・minおよび6.3μg・ml-1・minであった。対応するモデル依存のAUC値は、それぞれ15.1μg・ml-1・minおよび7.7μg・ml-1・minであった。排出速度定数ａは、血漿および腫瘍中では、それぞれ0.136min-1よび0.135min-1（半減期t1/2＝50.8±1.6分および51.5±4.4）であることが見出された。
表１は、腫瘍を有さないメスBalb/cマウスにおけるSR 4554の尿中排出を示す。重要なことに、66％までのSR 4554が、無変化の親化合物として検出されたことが見出された。実際に、これらのデータは親油性化合物よりも親水性化合物の典型である。
腹腔内投与後の時間の関数としてのSR 4554の組織対血漿の比は、図４で図示される。肝臓／血漿の比は、極めて急速に低下する一方、脳／血漿の比は一般に、観察機関中でずっと低いままである。240分で、肝臓／血漿および脳／血漿の比がほぼ同一であった。腫瘍／血漿の比が急速に上昇し、90分でピークに達し、時がたつにつれてゆっくりと低下した。吸収後の腫瘍／血漿の比は、肝臓／血漿および脳／血漿の比よりも約６倍〜７倍高いままであった。
実施例７
SR 4554の毒性
SR 4554の毒性の研究は、メスBalb/cマウスにおいて行われた。マウスにSR 4554を191mg/kg（0.05ml/kg）体重で静脈内注射するか、あるいは383mg/kg（0.05ml/kg）体重で腹腔内注射した。コントロールのマウスには、等容量の溶媒（生理食塩水）を注射した。
マウスの平均体重（１日目のマウス体重に対する割合として）を、静脈内注射マウスについては図5Aで、腹腔内注射マウスについては図5Bに作表している。処置したマウスとコントロールのマウスとの間では、体重変化については差が観察されなかった。さらに、処置したマウスまたはコントロールのマウスのいずれにも、行動的変化または死亡は観察されなかった。
実施例８
磁気共鳴分光法
SR 4554を、180mg/kgの単回静脈内注射として、RIF-1腫瘍を有するメスC3H/HeマウスおよびEMT-6腫瘍を有するメスBalb/cマウスに投与した。いくつかの実験では、ヒドララジン（5mg/ml、静脈内注射）をSR 4554の投与１時間前に投与した。磁気共鳴分光法（MRS）を、SR4554注射後45分および６時間に、複同調(double-tuned)(19Ｆ/2Ｈ)回路を用いる、4.7Tesla(SISCO)核磁気共鳴(NMR)分光法計において実施した。薬物濃度は、Thulbornら、（1983）、J. Magn. Reson. 55:357-371の変法を用いて得られた。具体的には、19Ｆシグナル強度は、組織の水からの天然に存在する2Ｈシグナルに関連付けた。較正には、5-フルオロトリプトファン(5-FTP)および酢酸-d(AcOH-d)を含有する参照バルブを用いた。腫瘍はMRS試験の直後に摘出され、そして元の薬物レベルを実施例６に記載の方法のように高速クロマトグラフィー(HPLC)によって、測定した。
MRSを用いてRIF-1腫瘍から得られた代表的なフッ素および重水素分光法は、図６に示される。SR 4554のピークは、5-FTPのピークから45ppm離れている一方、HODのピークは、AcOH-dのピークから6ppm離れている。SR 4554のピークは、元の薬物および関連するニトロ還元代謝産物を含む。
表２は、RIF-1腫瘍における元の薬物および代謝産物に関連する薬物(MRS)、ならびに元の薬物のレベル（HPLC）に対応する19Ｆシグナルレベルを示す。脳内レベルのMRSも表２に示す。６時間での19Ｆの高濃度の保持率は、７時間でのHPLCによって検出された元の薬物の濃度がずっと低い（20倍）にもかかわらず、１つまたはそれ以上のニトロ還元代謝産物を示すことが考えられる。これらの結果は、SR 4554は脳から急速に消失するが、腫瘍に選択的に残存することを示す。
RIF-1腫瘍における薬物シグナルの保持率は、腫瘍重量の関数として図７にプロットされている。６時間および45分での腫瘍19Ｆシグナルレベルを、μmol/g腫瘍で計算した。同一腫瘍において45分に対する６時間での19Ｆの保持率を、対応する腫瘍重量とグラムで比較した。この腫瘍モデル（低酸素画分腫瘍）では、相対的な保持率（６時間／45分）は、腫瘍重量と相関している（相関係数：0.83）。
表３は、２つの腫瘍モデルの間の比較の結果を示す。RIF-1およびEMT-6腫瘍はそれぞれ、低放射能生物学的低酸素画分および高い放射能生物学的低酸素画分を有する。Moulderら、(1984)、前出。予想されるように、SR 4554の保持率は、EMT-6腫瘍における方がRIF-1腫瘍におけるよりも高かった。さらに、これらのデータはまた、マウスをヒドラジンで前処理することにより、保持率が２倍、増加したことを示す。
上記の実験に加え、インビボでのさらなる研究を実施した。種々のマウスおよびヒトの腫瘍異種移植片の酸素状態を評価するために、MRSによって測定される19Ｆシグナルの保持率を、SR 4554の投与後に評価した。図８に示されるデータは、45分に対する６時間での19Ｆ保持率（μmol/g）の比の平均+/-SDを示す。RIF1（腺維肉腫）、EMT-6（扁平上皮細胞ガン）、およびKHT（腺ガン）はマウス腫瘍である一方、HT29（結腸ガン）、BB（結腸ガン）、WIL（非小型細胞肺ガン）、およびHN5（頭および首の扁平上皮ガン）はヒト腫瘍異種移植片である。重要なことに、このデータは、SR 4554の保持率の程度が、異なる腫瘍により変化することを説明している。WIL腫瘍を除き、ヒト腫瘍異種移植片における薬物の保持率は、マウス腫瘍よりも低かった。一般に、より多くの低酸素画分を有することが知られている腫瘍は、より多くのSR 4554を保持する傾向があった。
表４は、C3Hマウス乳腫瘍内のSR 4554保持率に対する高レベルの酸素（カルボジェン呼吸）の影響を示す。
空気を呼吸するマウスにおけるCH3腫瘍では、カルボジェンを呼吸するマウスにおけるCH3腫瘍と比較して、SR 4554の保持率の有意な低下（p＜0.01）があった。このことは、カルボジェンを呼吸する応答として、マウスにおけるC3H腫瘍の酸素レベルが改善されたことと一致する。
腫瘍の酸素の測定は、SR 4554投与後３時間にポーラログラフ酸素針電極を用いて行った。
表５のデータは、研究されたマウスが比較的に少ないために、結果が限定されているが、これらの２つの腫瘍間でのSR 4554の保持率または中間pO2レベルにおいて有意な差異がないことを示唆している。SR 4554の保持率が0.5より大きかった場合、中間pO2は２mmHg未満であり、そして60％のpO2値は５mmHg未満であった。このことから、SR 4554の保持率は、結果として高レベルの腫瘍低酸素症と関連するという結論に至った。足に移植されたC3H乳腫瘍に関する以前の研究は、５mmHg未満のpO2レベルの割合が約60％を越えており、これは、クローン原性アッセイによって測定されたように、10％の低酸素画分に等しいことを示唆した。
上記のデータは、SR4554がヒトおよびマウスの腫瘍低酸素血症の差異を検出するためのMRS/MRIプローブとして用いられ得ることを示す。
本発明は、一般に低酸素腫瘍細胞を検出するのに有用な化合物に関し、より詳細には特定の新規な腫瘍検出化合物に関する。本発明はまた、低酸素腫瘍細胞を検出するための方法および薬学的組成物に関する。
背景
酸素は、酸化的リン酸化を介して細胞エネルギーの主要な供給源を提供する。組織の低酸素症は、細胞への酸素供給が阻害される場合に生じ、そして血管性疾患において、発作の間、または腫瘍において生じ得る。それゆえ、低酸素腫瘍細胞は、十分に酸素化された細胞(酸素集団)と生存性を支えるには不十分な酸素を有する細胞(無酸素集団)との間の中間酸素圧で存在する細胞である。0.1％以下の酸素分圧(pO2)で存在する細胞は放射線生物学的に低酸素細胞(hypoxic cell)と称される。腫瘍血管系および微細循環の構造異常および機能異常は、低酸素細胞の存在の原因となる。Vaupelら（1989）Cancer Res. 49:6449-6465。
腫瘍における低酸素症は、不可逆的な拡散制限(「慢性」)形態または可逆的な灌流制限(「急性」)形態で存在し得る。Brown（1979）Br. J. Radiol. 52:650-656；Minchitonら（1993）8th International Conference on Chemical Modifiers of Cancer Treatment, Kyoto, Japan, 192-193；Thomlinsonら（1955）Br. J. Cancer 9:539-549。慢性低酸素症(腫瘍の低酸素症の典型的なモデル)は、固形腫瘍がその支持血管系に比して大きくなりすぎた場合に生じる。酸素分子の拡散距離は、代謝消費により、最も近くの毛細管から150〜200μmに限定される。拡散距離を超えると、細胞は壊死する。壊死領域のすぐ近傍は、酸素が涸渇しているが、生存可能な細胞の層である。これらの細胞は、酸素の拡散制限の結果であり、そして再び酸素化されるか、あるいは死滅するかのいずれかの時まで、低酸素性のままである。したがって、これらの細胞は慢性低酸素細胞と称される。これらの細胞はまた、低レベルのグルコースおよびATP、ならびに高レベルの異化代謝物(例えば乳酸)を有するようである。Vaupel（1992）NMR Biomed. 5:220-225。
血管を通る血流が一時的に停止した場合、閉塞の下流のすべての通常の好気細胞は突然低酸素性になる。これらの細胞は急性低酸素症であると考えられる。なぜなら、これらの細胞は、閉塞が継続する間のみ低酸素性であり、血流が再開された場合、再び酸素化されるからである。ヒト腫瘍における代謝の微細環境を定義付けるパラメーターについての現在利用可能な情報から、腫瘍内の異なる位置の間で、そして同じグレードかつ同じ臨床段階の腫瘍の間で、これらの関連する要因の顕著な変動が生じることが示される。Vaupel（1992）、前出。
歴史的に、低酸素細胞の存在はガンの処置についての重要な指標となる(すなわち、放射線耐性、化学耐性、遺伝子の増幅および誘導ならびに特定の細胞タンパク質またはストレスタンパク質の過剰発現に関して)。低酸素細胞は、酸素性細胞(oxic cell)と比較して、放射線照射のよる細胞殺傷に対して２倍〜３倍耐性であることが知られている。Coleman（1988）J. Natl. Cancer Inst. 80:310-317；Hall(1988), Hall（編）, Radiobiology for Radiologist, Lippencott Co., Philadelphia, 137-160。これは、正常な酸素圧の細胞においては、酸素分子が放射線照射により誘導されたラジカルとDNA中で相互作用し得、損傷の不可逆的な固定を導くために生じる。Hall（1988）、前出。放射化学的競合モデルによれば、酸素分子は、標的分子を元の非損傷形態に回復させ得る還元種(例えば、グルタチオンのようなチオール類)と競合する。Hall（1988）、前出。低酸素細胞は、還元種と効果的に競合するのに十分な酸素分子レベルを有さないため、これらの細胞において放射線照射により誘導された損傷の多くが修復される。
低酸素細胞はまた、ある範囲の化学療法薬物(ブレオマイシンおよび数種のアルキル化剤を包含する)に対しても耐性である。Workman（1983）Cancer Topics 4:54-55。これは、薬物送達の減弱、非循環的な細胞の運動状態の誘導または薬物の作用機構における酸素分子の関与によって生じ得る。低酸素への細胞の曝露はまた、新たなタンパク質の発現を導き得る。これらは、血管内皮成長因子、エリトロポイエチン、酸素により調節されるタンパク質、およびグルコースにより調節されるタンパク質、およびストレスタンパク質(例えば、熱ショック転写因子)を包含する。Giacciaら（1992）Int. J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 23:891-897；Semenzaら（1992）Mol. Cell. Biol. 12:5447-5454；Shweikiら（1992）Nature 359:843-845；Heacockら（1986）Int. J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 12:1287-1290。比較的一時的な低酸素症は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子増幅の頻度を増強し、それゆえメトトレキセート耐性を増幅し得る。Riceら（1986）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5978-5982。しかし、低酸素症誘導性薬物耐性は、P-糖タンパク質に関連する多剤耐性とは異なる。Sakataら（1991）Br. J. Cancer 64:809-814。低酸素細胞が臨床的抗腫瘍治療に対して有する負の効果は、腫瘍中のこれらの細胞を同定する集中的な研究を導いた。
静脈血のpO2は、約５％であり、したがってほぼ完全な放射線感受性を提供する。細胞が、窒素中の感受性と空気中または純粋な酸素中の感受性との中間の感受性を示す酸素圧はほぼ0.5％(Km値)である。これは、通常の組織中で遭遇する酸素レベルをはるかに下回る特定の酸素レベルは、正確に測定される必要があることを示す。しかし、現在の技術は隣接する多くの細胞についての平均値を与える場合が多く、この必要性を満たしていない。これは、検出および診断の深刻な障害である。なぜなら、固形腫瘍の組織学的評価は、細胞酸素における重要な変化がわずな細胞の直径の寸法においてさえ生じ得ることを示唆しているからである。Urtasunら（1986）Int. J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 12:1263-1267。
2-ニトロイミダゾールは、一部は特異的に低酸素細胞を標識し、細胞解析を提供するその能力により、そして一部は上記の低pO2値を正確にモニターするその感度により、腫瘍の低酸素症についてのプローブとして研究されている。この化合物はニトロ還元を受け、低酸素組織中の高分子に不可逆的に結合する反応性中間体(例えばヒドロキシルアミン)を形成することが知られている。Chapmanら（1983）Cancer Res. 43:1523-1528；Kochら（1984）Int. J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 10:1327-1332；Millerら（1982）Int. J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 8:741-744；Taylorら（1978）Cancer Res. 38:2745-2752；Vargheseら（1980）Cancer Res. 40:2165-2169。生物還元(bioreduction)速度は、pO2の減少に伴い上昇し、隣接する間質組織の細胞を含む正常な酸素リッチの細胞に優先して低酸素細胞の標識を可能にする。Urtasunら（1986）、前出。それゆえ、この現象は、腫瘍の低酸素症の侵襲的(生検による)評価および非侵襲的評価の両方についてのマーカーの開発において利用されてきた。侵襲的手順は生検サンプルに依存する。生検サンプルは、全腫瘍を代表しないことがあり、または目的の腫瘍の組織学的構造および血管パターンの詳細な知識を必要とし得る。しかし、非侵襲的技術は腫瘍全体の酸素化状態の測定を可能にする潜在能力を有する。
種々の放射性標識(例えば3Ｈ、14Ｃ、18Ｆ、82Ｂｒおよび125Ｉ）を有する2-ニトロイミダゾールが、オートラジオグラフィー、液体シンチレーションおよびγシンチレーションにより検出された。Chapman（1984）Cancer 54:2441-2449；Kohら（1991）Int. J. Radiation Oncol. Biol. Pys. 22:199-212；Mannanら（1992）Radiation Res. 132:368-374；Raseyら（1982）Radiation Res. 91:542-554；Raseyら（1985）Radiation Res. 102:76-85；Urtasunら（1986）、前出。例えば、ヒトにおけるメラノーマ、鱗状細胞(spuamous)ガン腫および小細胞肺ガンは、Chapmanおよびその共同研究者達により、組織学的切片の液体シンチレーションおよびオートラジオグラフィーを用いて、その酸素化状態についてスクリーニングされている。Chapman（1991）Radiother. Oncol. 20(補遺):13-19。しかし、これらの手順は、低酸素細胞についての特異的マーカーとして作用する2-ニトロイミダゾールの潜在能力を示すが、これらは、必要とされる標識マーカーの用量および関連する放射線用量が多いため、または混入物のために、ルーチンな使用には適切でない。さらに、標識の不安定性および特定の他の組織におけるマーカーの蓄積によりそれらの使用が制限される。Chapman（1991）、前出；Raseyら（1982）、前出。
腫瘍の酸素化状態のいくつかの研究が、免疫組織化学的方法を用いて、特にニトロイミダゾール付加物の固有の蛍光を使用することにより、またはこの付加物に対する蛍光ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体により行われてきた。蛍光側鎖を有する2-ニトロイミダゾール(例えばテオフィリン)および他の蛍光ニトロ複素環(例えばトランス-5-アミノ-3-[(5-ニトロ-2-フリル)ビニル]-1,2,4-オキサジアゾール)は、フローサイトメトリーを用いて組織学的切片中で定量化されている。Hodgkissら（1983）Br. J. Cancer 63:119-125；Oliveら（1983）Cancer Res. 43:3276-3280。さらに、蛍光細胞ソーティング(sorting)は、細胞対細胞基準で酸素化状態を確認する手段を提供する。近年、スフェロイド(spheroid)および実験動物腫瘍の酸素化状態を研究するために、ヘキサフッ化2-ニトロイミダゾールCCI-103Fに対するポリクローナル抗体、およびペンタフッ化2-ニトロイミダゾールEF5に対するモノクローナル抗体が使用されている。Lordら（1993）Cancer Res. 53:5721-5726；Raleighら（1994）Br. J. Cancer 69:66-71；Raleighら（1987）Br. J. Cancer 56:395-396。個々の細胞の酸素化状態についてのデータは別として、これらの抗体技術は、結合部位について、および個々の高分子付加物についてさえも、さらなるデータを提供し得る。しかし、他の侵襲的技術の場合と同じく、それらは、生検サイズにより制限され、それゆえこれも腫瘍全体の不均一性を完全に説明し得ない。
陽電子放射体(例えば18Ｆ)で標識された2-ニトロイミダゾールは、陽電子放射断層法(PET)により非侵襲的に検出され得る。例えば、Kohら（1991）、(前出)は、PET映像法を用いて、放射線治療の前の患者の腫瘍における低酸素領域の存在を示した。この研究において、腫瘍容積内の低酸素エレメントとは、局部腫瘍：血漿の18Ｆ ミソニダゾール(Misonidazole)比の閾値が、注射後２時間以上で、1.4以上である領域として定義された。PETは非常に感度の高い技術であるが、18Ｆ標識の短い半減期(t1/2≒109.7分)のような大きな欠点を有する。この短い半減期のため、処置設備における使用の直前に標識化合物を生成するために必要な技術設備(例えばオンサイトサイクロトロン)に相当な投資が必要となる。研究はまた、放射線曝露および適切な化学情報の欠如により特徴付けられ得る。
従来の核医学およびシングルフォトン放射断層法による腫瘍低酸素症のプローブとして、γ標識2-ニトロイミダゾールを開発する研究が進行中である。例えば、Raseyおよびその共同研究者らは、腫瘍の低酸素症のマーカーとしての4-ブロモミソニダゾールの放射線生物学的特性および薬理学的特性を研究している。Raseyら（1982）、前出。また、Parliamentおよびその共同研究者達は、シングルフォトン断層法(SPECT)による腫瘍低酸素症のプローブとして、123I-ヨードアゾマイシンアラビノシドが使用された。Parliamentら（1992）Br. J. Cancer 65:90-95。研究はいまだ臨床使用についてのこの技術の潜在能力を完全に評価するに至っていない。
今日、2Ｈおよび19Ｆ標識を含む2-ニトロイミダゾールが磁気共鳴分光法(MRS)および磁気共鳴映像法(MRI)により腫瘍中で非侵襲的に検出され得ることが広範に示されている。Evelhochら（1989）Magn. Reson. Med. 9:402-410；Jinら（1990）Int. J. Radiation Biol. 58:1025-1034；Kwockら（1992）Radiation Res. 129:71-78；Maxwellら（1989）Int. J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 16:925-929；Raleighら（1991）Magn. Reson. Med. 22:451-466；Raleighら（1986）Int. J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 12:1243-1245。磁気共鳴分光法は核磁気共鳴と類似の技術であり、目的の核から得たシグナルを強度ピークとして表示する。これは、データを画像/写真または強度値のマップとして表示する磁気共鳴映像法と対照的である。ほとんどの病院においてMR設備が広範に利用できるために、そしてこれらの技術は非放射性プローブを使用するために、これらの技術はますます一般的になっている。19Ｆ核は、MRS研究に理想的に適している。なぜなら、これは1/2のスピンを有し、天然に非常に豊富であり(100％)、検出感度が比較的高く(プロトンと比較して0.83)、そしてバックグランドが低いからである。一般に、19Ｆ MRSの使用は以下のことに依存する：
a)フッ素化薬物の入手可能性。磁気的に等価なフッ素の数が多い2-ニトロイミダゾールは、一般的に、より高い感度を与える。化合物は、理想的には比較的低い親油性を有し、そして代謝プロセスおよび非代謝プロセスを通じた標識の損失に対して比較的安定であるべきである。
b)薬剤の毒性。現在、一般的に、比較的高用量(0.1mmol/Kg/(磁気的に等価なフッ素原子)のオーダー)で与え得る薬物のみが検出され得る。Workmanら（1992）NMR Biomed. 5:270-272。これは、化合物の毒性により影響を受け、次にそれらの親油性に関連する。
c)化合物の薬物動力学的特性および特に通常組織に対する腫瘍組織の比。化合物の毒性に影響することとは別に、これらの特性はまた、目的の現象についてのプローブの特異性を示す。
２つのフッ化ミソニダゾールアナログであるRo 07-0741およびCCI-103Fは、マウス腫瘍中に選択的に保持されることが、19Ｆ MRSを用いて示されている。Maxwellら（1989）、前出；Workmanら（1992）、前出。シグナル強度は、EMT-6およびKHTにおいてRIF-1より高いことが観察され、そしてこれは既知の低酸素分率と一致しており、インビボでのニトロレダクターゼ活性と類似した。Moulderら（1984）Int. J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 10:695-712；Waltonら（1987）Biochem. Pharmacol. 36:887-896。別の研究において、CCI-103Fを腫瘍保持ラットに腹腔内注射した後、腫瘍から得られた19Ｆシグナルは、10匹のラットのうち４匹において24時間後に検出可能なままであり、低酸素細胞によるニトロ還元性生物活性化(nitroreductive bioactivation)の可能性を示した。Kwockら（1992）、前出。これらの腫瘍の免疫組織化学的評価は、壊死領域の周辺に結合した薬物の染色を示した。Kwockら（1992）、前出。
インビボでの腫瘍の検出のためのMRI/MRSアプローチの実行可能性がMaxwellら（1989）、前出(ミソダゾール、CCI-103FおよびRo 07-0741の19Ｆ標識アナログを使用)、およびPriorら（1990）Biochem. Pharmacol. 39:857-863(5-フルオロウラシル(5-FU)を使用)により示されている。また、再発性胃腸腺癌のための5-FU処置を受けた患者を用いる最近の研究(Glaholmら（1990）Br. J. Radiol. 63:547-553)により、MRI/MRS技術は、適切に標識された化合物の薬物動力学をインビボでモニターするのに有用であり得ることも確立された。このような方法は個々の患者についてのより正確な処置スケジュールの設定をよりいっそう可能にする潜在能力を有する。
磁気共鳴感度においては、CCI-103FがRo 07-0741よりも優れているが、その臨床的有用性は、その親油性(CCI-103Fのオクタノール/水分配係数＝20；Ro 07-0741のオクタノール/水分配係数＝0.41)およびそれゆえの毒性により制限され得る。ミソニダゾールと同様に、CCI-103Fはまた、19Ｆ標識の損失を伴う代謝的脱アルキル化を受けやすい。これは、共有結合付加物形成における非酸素依存性変動および保持データの解釈の困難性に寄与し得る。
MRIおよびMRS技術のために今日まで利用されている19Ｆ標識化合物の重大な問題は、それらの比較的高い親油性(CCI-103FおよびRo 07-0741)に起因するその神経毒性副作用および分子あたりのフッ素原子の数に起因する比較的弱いシグナルである(例えば、5-FUで見られる)。
それゆえ、これらの化合物は顕著な潜在能力を示すが、より部位特異的であり、かつ毒性が低く高いシグナル強度を有する19Ｆ腫瘍検出剤の明確な必要性が当該分野に存在する。
関連技術の概要
前節で引用した刊行物に加えて、以下の参考文献は、N-置換2-ニトロイミダゾール誘導体に関するため、関連を有する。
米国特許第3,679,698号(Beamanら)は、2-ニトロイミダゾール誘導体のうち、N-アルカン酸アミド誘導体を記載する。
米国特許第4,977,273号(Kagiyaら)は、フッ素で置換されたメチレン基を有する2-ニトロイミダゾール誘導体を記載する。
Shibamotoら（1992）Int. J. Radiation Biol. 61:473-478、Sasaiら（1991）Int. J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 20:1249-1254およびSasaiら（1991）Int. J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 21:1231-1234は、CH2CF2C(0)NHCH2CH2OHのN1-置換基を有する2-ニトロイミダゾールであるKU-2285を記載する。
Mashibaら（1991）Life Sciences 49:1419-1425およびShibamotoら（1991）Int. J. Radiation Biol. 59:105-115は、1-(4'-ヒドロキシ-2'-ブテノキシ)-メチル-2-ニトロイミダゾール(RK-28)を記載する。
Shibamotoら（1989）Int. J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 16:1045-1048は、側鎖に１つまたは２つのフッ素原子を有する2-ニトロイミダゾールおよび3-ニトロ-1,2,4-トリアゾールを記載する。
Murayamaら（1989）Int. J. Radiation Oncol. Biol. Phys. 17:575-581は、1-[2-ヒドロキシ-1-(ヒドロキシメチル)エトキシ]メチル-2-ニトロイミダゾール(RP-170)を記載する。
Liら（1991）Cancer Comm. 3:133-139は、インビボでの[1Ｈ]/[19Ｆ]磁気共鳴分光法により測定され得る低酸素細胞標識として、ヘキサフルオロミソニダゾール(CCI-103F)を記載する。
発明の要旨
従って、本発明の第１の目的は、新規化合物を提供することにより、当該分野での上記の要求に取り組むことである。この新規化合物は、磁気共鳴映像法および／または磁気共鳴分光法を用いる、腫瘍の検出および抗腫瘍治療のモニタリングのために有用である。
本発明の他の目的は、低酸素腫瘍細胞の映像法のための、および抗腫瘍治療の進展のモニタリングのための薬学的組成物を提供することである。
本発明のさらなる目的は、低酸素腫瘍細胞の非侵襲的映像法のための、および抗腫瘍治療の進展のモニタリングのための方法であって、有効量の本発明の化合物を処置を受ける個体に投与する工程を包含する方法を提供することである。
さらなる本発明の目的、利点および新規の特徴は、一部は以下の説明で述べられ、一部は以下のことの検討によって当業者に明らかとなり、または本発明の実施により学習され得る。
第１の実施態様では、本発明は、磁気共鳴映像法および磁気共鳴分光法技術を用いる腫瘍検出剤として有用である、特定の新規化合物に関する。本発明で開示および特許請求される新規化合物は、比較的低い神経毒活性を有し、すなわち、脳内で容易に感知し得る程度まで蓄積されず、十分に高い濃度まで腫瘍細胞内で濃縮され、MRI/MRS技術を用いて検出するのに十分な強度の19Ｆシグナルを与え、そして容易に合成され得る。新規化合物は、構造式(I)を有し、
Ｒ1およびＲ2は、独立して、水素；モノサッカリドであって、必要に応じて、低級アルコキシ、低級アシル、アミン、ハロゲンまたはカルボン酸部分を含むように官能化され、ここでその結合が該モノサッカリドの炭素原子に結合している、モノサッカリド；-CF3基で置換され、そしてさらに少なくとも１つのＲ3で置換された低級アルキルであって、ここでＲ3が-OHおよび-NR4 2からなる群から選択され、ここでＲ4が水素または低級アルキルである、低級アルキル；およびＮ、ＯおよびＳからなる群から選択される１つのヘテロ原子を含む５員および６員の複素環式環からなる群から選択され、あるいはＲ1およびＲ2は連結してＮおよびＯからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含む５員または６員の複素環式環を形成し、そして上記ヘテロ原子がＮである場合、該Ｎは非置換または低級アルキル基で置換され得、あるいは該Ｎはハライドまたはオキサレートのようなアニオン性対イオンと会合した塩形態であり得、そしてさらに上記５員または６員の複素環式環は-CF3部分で置換され、そして必要に応じて、-CF3で置換されているのと同じ炭素原子がさらに-OH、-CH2OHまたは-NH2で、置換される；
ただし、Ｒ1およびＲ2のうち少なくとも１つは、-CF3基で置換され、そしてさらに少なくとも１つのＲ3で置換された低級アルキルであり；そしてＲ1またはＲ2のいずれかが４個またはそれ以上の炭素原子を含んでいる場合、それは、１つより多いＲ3基で置換されている。
本発明はまた、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて、１種以上の上記化合物を含有する薬学的組成物に関する。しかし、これらの組成物は、一般に、常に経口投与される必要はない。
本発明は、MRIまたはMRS評価を受ける個体に、腫瘍検出に有効な量の本発明の化合物を投与することによる、低酸素腫瘍細胞を検出するための方法をさらに包含する。次いで、MRIおよび／またはMRSを用いて、個体中に存在する腫瘍細胞と会合し、およびそれにより保持されるこの化合物を検出する。
【図面の簡単な説明】
図１は、実施例４で説明するように、マウス肝臓ミクロソームによるSR 4554の代謝をグラフの形で図示する。
図２は、実施例５で記載するように、電子エネルギー損失分光法(EELS)を用いて、得られた培養物を追跡（chase）する前および後で、A2780スフェロイド(spheroid)の外部細胞および内部細胞のフッ素像の評価を、グラフの形で示す。
図３は、実施例６で評価するように、EMT-6腫瘍を有するBalb/cマウス内のSR 4554の薬物動力学をグラフの形で示す。
図４は、実施例６で記載するように、腹膜腔内注射後の時間の関数としてSR 4554の組織対血漿比をグラフの形で示す。
図５Ａは、SR 4554または生理食塩水を静脈内注射の後のBalb/cマウスの体重を、グラフの形で示す。図５Ｂは、SR 4554または生理食塩水を腹膜腔内注射の後のBalb/cマウスの体重を、グラフの形で示す。
図６Ａは、SR 4554および5-フルオロトリプトファンの磁気共鳴スペクトルであり、図６Ｂは、HOD（天然に豊富に存在する重水）および酢酸-dの磁気共鳴スペクトルである。
図７は、実施例８に記載のように、腫瘍重量の関数としてRIF-1腫瘍により保持される薬物の保持をグラフの形で示す。
図８は、マウス腫瘍異種移植片およびヒト腫瘍異種移植片におけるSR 4554の保持を示す。
発明の詳細な説明
定義および命名法
本発明の化合物、組成物および方法を開示および記述する前に、本発明は、特定の試薬または反応条件、特定の薬学的キャリア、あるいは特定の投与法に限定されず、それ自体変わり得ることは理解されるべきである。本明細書中で用いられる用語は、特定の実施態様のみを記述する目的であり、限定されることは意図されないこともまた理解されるべきである。
本明細書および添付の請求の範囲で用いられているように、文脈が明らかに他を示さない限り、単数形「a」、「an」、および「the」は、複数の対象も含み得ることが注意されなければならない。従って、例えば「2-ニトロイミダゾールアナログ（a 2-nitroimidazole analog）」といえば、「2-ニトロイミダゾールアナログ類（2-nitroimidazole analogs）」の混合物を含み、「薬学的キャリア（a pharmaceutical carrier）」といえば、２種以上のそのようなキャリアの混合物を含むなどである。
本明細書および以下の請求の範囲においては、以下の意味を有するように定義された多くの用語に言及する：
本明細書中で用いられる用語「アルキル」は、１個〜24個の炭素原子を含む分枝飽和炭化水素基または非分枝飽和炭化水素基（例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、t-ブチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシル、ヘキサデセニル、エイコセニル、テトラコセニルなど）をいう。本明細書中での好ましいアルキル基は、１個〜12個の炭素原子を含有する。用語「低級アルキル」は、１個〜６個の炭素原子、好ましくは１個〜４個の炭素原子のアルキル基を意味する。
本明細書中で用いられる用語「アルケニル」は、少なくとも１つの二重結合を含有する２個〜24個の炭素原子の分枝炭化水素基または非分枝炭化水素基（例えば、エテニル、n-プロペニル、イソプロペニル、n-ブテニル、イソブテニル、t-ブテニル、オクテニル、デセニル、テトラデセニル、ヘキサデセニル、エイコセニル、テトラコセニルなど）をいう。本明細書中での好ましいアルケニル基は、１個〜12個の炭素原子を含有する。用語「低級アルケニル」は、１個〜６個の炭素原子、好ましくは１個〜４個の炭素原子のアルケニル基を意味する。用語「シクロアルケニル」は、３個〜８個の炭素原子、好ましくは５個または６個の炭素原子の環状アルケニル基を意味する。
本明細書中で用いられる用語「アルコキシ」は、単一の末端エーテル結合を通して結合するアルキル基をいう。すなわち、「アルコキシ」基は-OR（ここでＲは上記で定義したアルキル）として定義され得る。「低級アルコキシ」基は、１個〜６個、より好ましくは１個〜４個の炭素原子を有するアルコキシ基を意味する。
本明細書中で用いられる用語「アシル」は通常の意味で用いられ、-(CO)-結合を介して結合されるアルキル基をいう。用語「低級アシル」は、カルボニル結合で結合されるアルキル基が、低級アルキル基であるアシル基をいう。
「ハロ」または「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨードをいい、そして通常有機化合物中の水素原子に対するハロ置換に関する。ハロの中では、クロロおよびフルオロが一般に好ましい。
用語「糖部分」は、モノサッカリドを包含することが意図される。糖部分は、それが腫瘍検出化合物の水溶性を増強するように、および／または親油性を減少させるように選択されるべきである。用語「糖」としては、修飾された部分が挙げられ、例えば、１つ以上のヒドロキシ基が、ハロゲン、アルコキシ部分、脂肪族基で置換され、あるいはエーテル、アミンなどとして官能化される。修飾された糖の例としては、以下が挙げられる：ヒドロキシ部分の代わりに低級アルコキシ基を含有する糖、すなわち、α-またはβ-グリコシド（例えば、メチルα-D-グルコピラノシド、メチルβ-D-グルコピラノシドなど）；アミンと反応した糖、すなわちN-グリコシルアミンまたはN-グリコシド（例えば、N-(α-D-グルコピラノシル)メチルアミン）；アシル化ヒドロキシ基（代表的に１個〜５個の低級アシル基）を含有する糖；１つ以上のカルボン酸基を含有する糖（例えば、D-グルコン酸など）；および遊離アミン基を含有する糖（例えば、D-グルコサミン、D-ガラクトサミン、N-アセチル-D-グルコサミンなど）。好ましいサッカリドの例は、グルコース、ガラクトース、フルクトース、リボース、マンノース、アラビノース、キシロースであり、D-グルコースが特に好ましい。
本明細書中で提供されるように、試薬の「有効量」という用語により、無毒性だが、MRIまたはMRSが実行され得るように、所望のシグナル強度を提供するに十分な量の試薬が意味される。以下に指摘するように、必要とされる正確な量は、被験者の種、年齢、および一般的な状態、腫瘍の存在に関連する疾患の重篤度、特定のフッ素化2-ニトロイミダゾールアナログおよび投与の様式などに応じて、被験者ごとに変化する。従って、正確な「有効量」を特定するのは不可能である。しかし、適切な有効量は、通常の実験のみを用いて当業者により決定され得る。
薬学的なキャリアなどを記載するのに用いられる用語「薬学的に受容可能」は、生物学的にまたは他の意味でも、望ましくない物質ではないことを意味する。すなわち、この物質は、所望されない生物学的効果を生じることなしに、または薬学的組成物に他の成分が含まれる場合には、それらの成分のいずれとも有害な様式で相互作用することなしに、選択されるフッ素化2-ニトロイミダゾールアナログと共に個体に投与され得る。
「必要に応じた」または「必要に応じて」は、続いて記載された事象または状況が起こることも起こらないこともあることを意味し、その記載は、上記の事象または状況が起こる場合、およびそれが起こらない場合を包含する。例えば、「必要に応じて官能化されたモノサッカリド」という表現は、モノサッカリド部分が、官能化されていてもされていなくてもよく、そしてその記載は、官能化されているモノサッカリド、および官能化されていないモノサッカリドの両方を包含する。
本発明は、磁気共鳴映像法および／または磁気共鳴分光法による、腫瘍低酸素症の非侵襲的検出のために有用なフッ素化2-ニトロイミダゾール誘導体に関する。2-ニトロイミダゾールのクラスの化合物はニトロ還元を受け、高分子との共有結合付加物を形成する反応性中間体となる。これらの化合物の組織への結合は、酸素濃度の減少（低酸素症の増大）により増強され、従って、この化合物は腫瘍低酸素症のためのマーカーとして作用し得るようになる。19Ｆ標識の導入は、非侵襲的技術（例えば、磁気共鳴映像法および磁気共鳴分光法）を用いた保持化合物の検出を可能にする。固形腫瘍は、一般に低酸素細胞領域を有し、この低酸素細胞領域は強い処置にもかかわらず、腫瘍の生存を維持することを可能とするので、腫瘍中の低酸素領域の検出および定量は、低酸素症標的治療（例えば、放射性増感剤、化学増感剤、および他の生物還元的に(bioreductively)活性化された薬物）からの恩恵を最も被ると思われる患者の合理的な選択を可能とする。さらに、これらの細胞の反応を観察することは、処置手順の改善を結果として得る。
新規化合物：
本明細書中で提供される新規化合物は、構造式(I)により定義される化合物である。ここで、
Ｒ1およびＲ2は、独立して、水素；モノサッカリドであって、必要に応じて、低級アルコキシ、低級アシル、アミン、ハロゲンまたはカルボン酸部分を含むように官能化され、ここでその結合が該モノサッカリドの炭素原子に結合している、モノサッカリド；-CF3基で置換され、そしてさらに少なくとも１つのＲ3で置換された低級アルキルであって、ここでＲ3が-OHおよび-NR4 2からなる群から選択され、ここでＲ4が水素または低級アルキルである、低級アルキル；およびＮ、ＯおよびＳからなる群から選択される１つのヘテロ原子を含む５員および６員の複素環式環からなる群から選択され、あるいはＲ1およびＲ2は連結して、５員または６員の、-CF3部分で置換されるアルキル環を形成する；
ただし、Ｒ1およびＲ2のうち少なくとも１つは、-CF3基で置換され、そしてさらに少なくとも１つのＲ3で置換された低級アルキルであり：そしてＲ1またはＲ2のいずれかが４個またはそれ以上の炭素原子を含んでいる場合、それは、１つより多いＲ3基で置換されている。
この群の中で好ましい化合物の例は、以下の通りである：
・Ｒ1が水素であり、かつＲ2が、-CF3基および少なくとも１つのＲ3基、好ましくは２つのＲ3基で置換された低級アルキルである化合物、そして最も好ましくは、Ｒ3がヒドロキシルである化合物；
・Ｒ1およびＲ2が、独立して-CF3基および少なくとも１つのＲ3で置換された低級アルキルである化合物、そして好ましくは、Ｒ1およびＲ2が同一でない化合物；および
・Ｒ1がモノサッカリドであり、かつＲ2が、-CF3基および少なくとも１つのＲ3で置換された低級アルキルである化合物、そして好ましくは、Ｒ1がD-グルコースである化合物。
特に好ましい化合物の例は、Ｒ1が2-ヒドロキシ-3,3,3-トリフルオロプロピル、Ｒ2が水素、ヒドロキシエチル、またはD-グルコース、Ｒ3が-OHである化合物である。
これらの群の中の特定の化合物は、以下の通りである。
構造式(I)（それらの薬学的に受容可能な塩を含む）で定義される本発明の化合物は、腫瘍検出剤として、さらに詳細には低酸素細胞特異的プローブとして有用であり、薬学的に受容可能なキャリアとと共に、１種以上の本化合物から構成される薬学的組成物に都合良く処方され得る。E.W.MartinによるRemington's Pharmaceutical Science、18版、(Mack Publ.Co.、Easton PA 1990)は、本発明の腫瘍検出剤を用いる処方物の調製のために用いられ得る、代表的なキャリアおよび薬学的組成物の通常の調製法を開示する。本発明の方法は、評価を受ける個体（例えば、哺乳動物個体）に腫瘍検出に有効な量の選択された化合物を投与し、続いて存在する腫瘍細胞に会合し、その細胞により保持される化合物を検出する工程を包含する。上記のように、このような検出は、非侵襲的技術（例えば、磁気共鳴映像法または磁気共鳴分光法）を用いて行われる。
本発明の化合物は、経口、非経口（例えば、静脈内）、筋肉内注射、または腹膜腔内注射などにより、投与され得る。溶液処方物の静脈内投与が臨床的に好ましい。なぜなら、与えられる正確な用量に対する制御が、より容易に達成し得るからである。投与される活性化合物の量は、当然、評価を受ける被検体、被検体の体重、投与様式、および処方する医師の判断に依存する。
意図される投与様式により、薬学的組成物は、固体、半固体、または液体の剤形（例えば、錠剤、座剤、丸剤、カプセル、散剤、水剤(solution)、懸濁剤など）であり得、好ましくは正確な投与量の単回の投与に適した単位投与形態であり得る。上記のように、組成物は、有効量の選択された薬物を薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて含み、さらに他の医薬、薬剤、キャリア、添加剤、希釈剤などを含み得る。
固体組成物のためには、通常の無毒性固体キャリアとしては、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、シュクロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。薬学的に投与可能な液体組成物は、例えば、本明細書中で記載のような活性化合物および必要に応じて薬学的添加剤を賦形剤（例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなど）中に溶解、分散等させることにより調製し、それにより水剤または懸濁剤を形成し得る。所望であれば、投与される薬学的組成物はまた、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤などのような少量の無毒性の補助物質（例えば、酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム(triethanolamine sodium acetate)、オレイン酸トリエタノールアミンなども含有し得る。このような剤形の実際の調製方法は公知であり、または当業者にとっては明白である。例えば、上記で参照したRemington's Pharmaceutical Scienceを参照のこと。
経口投与に関して、微粉末または顆粒は、希釈剤、分散剤、および／または界面活性剤を含有し得、そして水中またはシロップ中、乾燥状態でカプセルまたは薬袋中、あるいは非水溶液中または懸濁剤が含有され得る懸濁液中、結合剤または滑剤が含有され得る錠剤中、あるいは水またはシロップの懸濁液中に存在し得る。所望される場合または必要な場合、矯味剤、保存剤、懸濁化剤、濃稠化剤、または乳化剤が含有され得る。錠剤および顆粒剤は、好ましい経口投与形態であり、これらはコートされ得る。
非経口投与は、用いられる場合、一般に注射により特徴づけられる。注射可能なものは、液体状の水剤または懸濁剤、注射前の液体状の水剤または懸濁剤に適した固体形態、または乳剤のいずれかとして、通常の形態で調製され得る。非経口投与のための最近の修正されたアプローチは、遅延放出システムまたは持続放出システムであり、その結果、一定レベルの投与量が維持される。例えば、米国特許第3,710,795号を参照のこと。この特許は、本明細書中で参考として援用される。
肺への投与については、投与される薬物を、粉末形態に変え、通常のプロペラント（例えば、テトラフルオロエタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロフルオロメタンなどのようなハロ炭化水素）と組み合わせて、そしてエアロゾル処方物として投与されることが好ましい。好ましくは、処方物は、界面活性剤もまた含有し、プロペラント中での薬物粉末の懸濁または分散を容易かつ安定にする。薬物粉末は、普通、処方物の約0.1〜10重量％を構成する。固体粒子エアロゾル処方物は、代表的には、上記の投与量を有する１つ以上の単位用量で投与され、治療レベルの薬物を供給し得る。
調製のためのプロセス
本発明の目的は、所望される物理化学的特性（一般にニトロヘテロ環で見られる神経毒性の副作用を減少させる特性、低酸素腫瘍細胞へのこれらの薬物の蓄積を増進させる特性の両方）を有するフッ素含有2-ニトロイミダゾールを生成することである。現在まで利用されているこれらの化合物に関する主要な問題は、１分子当たりのフッ素原子の数に起因する、それらの比較的弱いシグナルであり（例えば、5-フルオロウラシルに関して）、またはそれらの高い親油性におそらく関係する神経毒性副作用（CCI-103FおよびRo 07-0741）である。Brownら(1980)Radiation Res.82:171-190。本発明者らは、本明細書中でトリフルオロメチル基を含有する化合物を合成した。なぜなら、薬物の１分子当たりのフッ素原子の数が、MRI/MRS評価において高いシグナル強度および感度にとって重要であることを発見したからである。2-ニトロイミダゾールの官能性は、必要であると考えられる。なぜなら、低酸素細胞中の高分子への標識薬物の不可逆的共有結合が、これらの細胞中でのフッ素標識の濃度を増加させ、これが次いで、固形腫瘍の検出を改良することに寄与する結果となるからである。
以下に例示する合成アプローチは、以前にSRIでW.W.LeeおよびJ.M.Brown（Stanford University）（Brownら(1981)Int.J.Radiation Oncol.Biol.Phys.7:695-703）により開発された生物還元的に活性化されたニトロヘテロ環化合物であるエタニダゾール（Etanidazole）（SR 2508）のフッ素化物アナログの合成に基づく。彼らは、エタニダゾールは、ミソニダゾールより神経毒性が少ないことを示した。これは、より低い親油性に相関した（ミソニダゾール:log P=-0.32；エタニダゾール:log P=-1.28）。
このシリーズで合成される最初の化合物であるN-(2-ヒドロキシ-3,3,3-トリフルオロプロピル)-2-(2-ニトロ-1H-イミダゾール-1-イル)アセタミド（SR 4554）は、適切なプローブ分子のための全ての所望の成分を含んでいたが、0.9％生理食塩水溶液にかなり不溶性（エタニダゾール=551mmol ml-1に対してSR 4554=23mmol ml-1）であることが発見され、そして予想されるよりさらに正のlogPを有していた（エタニダゾール=-1.28に対してSR 4554=-0.20）。理論により束縛されることを望まないが、それらは、これらの現象の原因と思われるのはトリフルオロメチル基の異常な電子的性質である。従って、フッ素化2-ニトロイミダゾールのこのクラスの範囲は、より水溶性の誘導体およびより親水性の誘導体を包含することまで拡張された。
ターシャリーアミドアナログSR 4557を与える親水性のヒドロキシエチル側鎖の添加は、トリフルオロメチル基の効果を克服し、そして生理化学的特性を有する化合物を与えることが期待された。驚くべきことに、SR 4557は、0.9％生理食塩水への溶解性は大いに増大するが(SR 4557=628mmol ml-1、に対してSR 4554=23 mmol ml-1)、logP値の変化をほとんど示さなかった（SR 4557＝-0.36に対するSR 4554=-0.20）。SR 4554およびSR 4557の親油特性は、元来、これらの化合物をインビボでの使用に好ましくないものと考えられていた。しかし、SR 4554に関して本明細書中で記載された研究は、この仮定が、これらのタイプのフッ素化誘導体には無効であり得ることを示した。なぜなら、薬物動力学的研究は、SR 4554が、十分に高い濃度で低酸素腫瘍細胞に蓄積し、MRI/MRS技術にとって十分な強度の19Ｆシグナルを与えるが、それが脳内で感知される程度まで蓄積されないことを示しているからである。
本発明の化合物は、本明細書中の実験の項で示すように、比較的単純で直接的な方法を用いて高い収率で調製され得る。
本発明は、その好ましい特定の実施態様に関連して記載されているが、上記の説明および以下の実施例は、本発明の範囲を説明することを意図し、制限することを意図しないことが理解されるべきである。本発明の範囲内の他の局面、利点、および改変は、本発明に関係する当業者に明らかである。
実験
組織サンプルおよび標準物質の抽出：硝酸銀溶液（25μl；30% w/v）を250μlの組織サンプルおよび標準物質、ならびに20μlの内部標準物質溶液（0.1M Tris緩衝液中の12.5μl/ml、pH 7.4）に添加した。次いで、サンプルをボルテックスし、そして５分間遠心分離した（2000×ｇ）。次いで、抽出したサンプル（50μl）をHPLCに注入した。
HPLC法：クロマトグラフィーシステムは、WISP Model 712自動サンプル採取器（Waters Chromatography Ltd.）、４組の(quaternary)HPLCポンプを有するModel 660グラジエント制御器、Model 991フォトダイオードアレイ検出器、およびWaters 991フォトダイオードアレイソフトウェアを実行するNEC Powermate SX/16パーソナルコンピュータから構成された。逆相クロマトグラフィー分離を、10μm μ Bondapak C18（3.9×300mm）分析カラム（Millipore）上で室温で実施した。２×6.5mmのステンレススチールカラム（Upchurch Scientific, Inc.）に充填されたPellicular ODS（Whatman）を、プレカラムとして使用した。移動相はメタノール／水（15：85）であった。全ての溶媒を、0.45μm Teflon PTFE/ポリプロピレン濾過膜を通して濾過し、ヘリウムで脱気し、そして2ml/分の流速で等速で送った。カラム溶出液を、UV-フォトダイオードアレイ検出器によって、324nm（UV範囲は200nmから500nmである）でモニターした。分析物の内部標準に対するピーク面積比を、較正曲線を構築することにより検出器の応答を濃度の見積値に変換するために用いた。
以下の実施例は、当業者に、本発明の化合物の調製方法および使用方法の完全な開示および説明を提供するために記載され、発明者らが自分の発明であると考える発明の範囲を制限することを意図しない。数値（例えば、量、温度など）に関してその正確性を確保するための努力はなされているが、いくらかの誤差および偏差は考慮されるべきである。他に示さない限り、部は重量部であり、温度は℃であり、そして圧力は大気圧または大気圧付近である。
全ての出発物質および試薬は市販されている。
実施例１
本実施例は、N-(2-ヒドロキシ-3,3,3-トリフルオロプロピル)-2-(2-ニトロ-1H-イミダゾール-1-イル)アセタミド(SR 4554)の調製を記載している。
SR 4554の合成は、スキーム１に示される。2-ニトロイミダゾール(4)のそのナトリウム塩への転化を、150℃でメタノール-DMF中のナトリウムメトキシドで10分間処理することにより達成した。続いて、85℃で、DMF中のブロモ酢酸メチルと20分間反応させ、メチルエステル(5)を得た。次いで、この化合物５を100℃で0.1N NaOHで15分間処理し、次いで1M HClで酸性化することによりカルボン酸(6)に転化した。フッ素で標識した側鎖を、炭酸カリウムの存在下で、トリフルオロアセトアルデヒドヘミアセタール(7)とニトロメタンとを60℃で３時間反応させることにより調製した。純粋なニトロ化合物(8)を反応混合物から115℃、60mmHgで蒸留することにより得た。８のニトロ基の還元を、40psiでラネーニッケル触媒で水素化することにより達成し、濾過した反応混合物をエーテル性HClで−20℃で処理することにより、アミノ化合物(9)のHCl塩を得た。カルボン酸(6)とこのアミノ化合物とのカップリングは、まず、テトラヒドロフラン(THF)中のイソブチルクロロホルメートおよびN-メチルモルホリンを用いて、０℃で６の酸基を混合無水物に転化することにより実施した。アミン(9)およびさらに等量のN-メチルモルホリンを添加することにより、SR 4554を形成した。これを、カラムクロマトグラフィーおよび酢酸エチル−ヘキサンからの再結晶により精製した。
本実施例は、N-(2-ヒドロキシエチル)-N-(2-ヒドロキシ-3,3,3-トリフルオロプロピル)-2-(2-ニトロ-1H-イミダゾール-1-イル)アセタミド(SR 4557)の調製を記載している。
SR 4557の合成はスキーム２に示される。還流エーテル中で、1-ブロモ-3,3,3,-トリフルオロアセトン(10)を水素化アルミニウムリチウムで還元することにより、ブロモアルコール(11)を得、これを120〜122℃で蒸留することにより精製した。この化合物を、100℃でNaOHを用いて環化してエポキシド(12)にし、これを反応混合物から直接蒸留した。エポキシド(12)を水中エタノールアミンと反応させることにより、ジオール(13)を得、これを105℃〜115℃、0.05mmHgで蒸留することにより精製した。この中間体と、カルボン酸(6)とのカップリングは、SR 4554についての手順と同様の手順を用いて実施した。カラムクロマトグラフィーによる精製により、無定型固形物としてSR 4557を得た。
本実施例は、メチル2-デオキシ-2-[N-2-ヒドロキシ-3,3,3-トリフルオロプロピル-2-(2-ニトロ-1H-イミダゾール-1-イル)アセタミド-β-D-グルコピラノシドの調製を記載している。
D-グルコース誘導体(1)のために用いられる合成アプローチは、スキーム３に示される。重炭酸ナトリウム水溶液中で、D-グルコサミン塩酸塩(14)をベンジルオキシクロロホルメートで処理することにより(15)を得、これを、塩酸含有メタノール中で還流することにより、メチルグルコシド(16)に転化した。次いで、化合物(6)を、ピリジン中の無水酢酸で処理することにより、トリアセトキシ誘導体(17)に転化した。H2およびエタノール中の10％パラジウムカーボン用いてベンジルオキシカルバメート基を除去し、アミノ化合物(18)を得た。密封管中で85℃の温度のアセトニトリル中のトリフルオロメチルエポキシド(12)で(18)を処理することにより、その第１級アミノ基のアルキル化を行い、(19)を得た。アミノ化合物(19)を、上記のようにTHF中のイソブチルクロロホルメートおよびN-メチルモルホリンを用いて、2-(2'-ニトロイミダゾール)酢酸(6)とカップリングし、そしてアセトキシ保護基をメタノール中の触媒量のナトリウムメトキシドで除去することにより、生成物(1)を、ジアステレオ異性体の混合物である結晶固形物として得た。
インビトロでのSR 4554の代謝
SR 4554を低酸素化（100%窒素）で、マウス肝臓ミクロソーム、ならびに精製ラットシトクロムP450レダクターゼおよびヒトシトクロムP450レダクターゼにより還元した。還元は空気により完全に阻害され、またシトクロムP450レダクターゼのインヒビター（TlCl3/4H2O;0.2mg/ml）の存在下でも阻害された。対照的に、一酸化炭素は、ミクロソームにおける代謝の15％しか阻害しなかった。薬剤のミクロソーム代謝の速度を、それぞれ650μMおよび16.84nmol・min-1mg-1のKmおよびVmaxにより特徴づけた。このことにより、生物活性化(bioactivation)の最初の段階におけるシトクロムP450レダクターゼの関与が示唆される。
マウス肝臓ミクロソーム（0.5mg/mlタンパク質）によるSR 4554の還元による代謝の特性を図１に示す。サンプルを種々の時点で取り出し、上記のように硝酸銀で抽出し、そして高速クロマトグラフィー（HPLC）によって分析した。親薬物の減少によって示されるように、SR 4554は低酸素条件下で代謝された。反応は、補因子（NADPH）の非存在下および空気中で実施される場合に完全に阻害された。シトクロムP450インヒビターである一酸化炭素は、SR 4554の低酸素代謝を15％まで阻害した。さらに、シトクロムP450レダクターゼインヒビターTlCl3・4H2O(0.2mg/ml)は、還元プロセスを完全に阻害した。他のニトロ含有種は、代謝時に観察されなかった。
実施例５
電子エネルギー損失分光法を用いる、ヒト卵巣A2780スフェロイドにおけるSR 4554の保持率
約100個のスフェロイド（直径0.5mm-１mm）を、１mMのSR 4554を含有する培養培地中で３時間インキュベートした。次いでスフェロイドを薬物を含有しない培地で洗浄し、結合していない薬物を除去し、そしてさらに37℃で22時間「追跡」した。サンプルを、凍結切片化(cryosectioning)のために-185℃で液体プロパン／イソペンタン中に投入して凍らせた。切片を電子エネルギー損失分光法（EELS）により分析した。SR 4554は、外部の細胞（すなわち、周辺部）よりも、スフェロイドの中心に近い、内部のより低酸素の細胞において蓄積されることが見出された。
SR 4554の局在化のフッ素像は、EELSを用いて得られ、そして図２に示されるように、フッ素／窒素（Ｆ／Ｎ）比として定量された。スフェロイド中心付近の細胞は、スフェロイドの周辺の細胞よりも、７倍もの有意に高レベルのフッ素を含有することが見出された（ｐ＜0.05）。これらの実験は空気中で行われた。
実施例６
SR 4554の薬物動力学
EMT-6腫瘍含有マウスを本研究において使用した。マウスに単回の腹膜内注射または静脈内注射（180mg/kg体重）、あるいはSR 4554での洗浄により単回の経口用量（経口90mg/kg）を与えた。３匹のマウスを各時点ごとに屠殺し、そして心臓に穿刺することによって血液を得た。得られた血液を遠心分離し、血漿を得た。腫瘍、肝臓、および脳もまた、種々の時点で得た。サンプルを硝酸銀で抽出し、そして高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により、実施例４に記載された手順を用いて分析した。
マウス中のSR 4554の吸収およびクリアランスは、低用量のミソニダゾールのそれと同様であることが見出され、薬物は経口、静脈内、および腹腔内投与において非常に高いバイオアベイラビリティを示した（静脈内に対する比は、静脈内100％、腹腔内100.4％、経口95.5％であった）。このことにより、薬物はこれらの経路のいずれによっても効果的に投与され得ることが示唆される。Brownら（1980）、前出；Workmanら（1981）Cancer Chemother. Pharmacol. 6:39-49。重要なことに、SR 4554の脳でのレベル、および脳／血漿比は一般に低かった。実際、思いがけないことに、これらは、ミソニダゾールを含むほとんどの親油性2-ニトロイミダゾールについて以前に引用されたレベルよりも低く、むしろエタニダゾールのようなより親水性のニトロイミダゾールのレベルと匹敵する。Brownら（1980）、前出；Workmanら（1981）、前出。ニトロイミダゾールの脳内濃度は親油性により決定され、そして化合物の毒性に関連することが観察されている。Brownら（1980）、前出；Workmanら（1981）、前出。この観察により、親油性はこのような化合物の脳内への浸透を決定する唯一の基準ではないこと、およびSR 4554はその親油性から予想され得る毒性よりも潜在的に低毒性であることが示唆される。
図３に示されるように、SR 4554は血漿中で、この用量レベルで少なくとも注入後６時間まで検出され得る（検出限界：25ng/ml）。しかし、薬物の組織レベルは６時間の時点で検出限界（100ng/g組織）より低かった。SR 4554濃度のピーク（Cmax）は145μg/mlと見出され、30分（tmax）で生じた。腫瘍の薬物レベルは、52μg/gのCmaxおよび45分のtmaxの血漿のレベルに従った。血漿および腫瘍薬物動力学の両方とも、１次指数のオープンモデルに一致し、モデル非依存（台形）のAUC値は、それぞれ13.9μg・ml-1・minおよび6.3μg・ml-1・minであった。対応するモデル依存のAUC値は、それぞれ15.1μg・ml-1・minおよび7.7μg・ml-1・minであった。排出速度定数ａは、血漿および腫瘍中では、それぞれ0.136min-1よび0.135min-1（半減期t1/2＝50.8±1.6分および51.5±4.4）であることが見出された。
表１は、腫瘍を有さないメスBalb/cマウスにおけるSR 4554の尿中排出を示す。重要なことに、66％までのSR 4554が、無変化の親化合物として検出されたことが見出された。実際に、これらのデータは親油性化合物よりも親水性化合物の典型である。
実施例７
SR 4554の毒性
SR 4554の毒性の研究は、メスBalb/cマウスにおいて行われた。マウスにSR 4554を191mg/kg（0.05ml/kg）体重で静脈内注射するか、あるいは383mg/kg（0.05ml/kg）体重で腹腔内注射した。コントロールのマウスには、等容量の溶媒（生理食塩水）を注射した。
マウスの平均体重（１日目のマウス体重に対する割合として）を、静脈内注射マウスについては図5Aで、腹腔内注射マウスについては図5Bに作表している。処置したマウスとコントロールのマウスとの間では、体重変化については差が観察されなかった。さらに、処置したマウスまたはコントロールのマウスのいずれにも、行動的変化または死亡は観察されなかった。
実施例８
磁気共鳴分光法
SR 4554を、180mg/kgの単回静脈内注射として、RIF-1腫瘍を有するメスC3H/HeマウスおよびEMT-6腫瘍を有するメスBalb/cマウスに投与した。いくつかの実験では、ヒドララジン（5mg/ml、静脈内注射）をSR 4554の投与１時間前に投与した。磁気共鳴分光法（MRS）を、SR4554注射後45分および６時間に、複同調(double-tuned)(19Ｆ/2Ｈ)回路を用いる、4.7Tesla(SISCO)核磁気共鳴(NMR)分光法計において実施した。薬物濃度は、Thulbornら、（1983）、J. Magn. Reson. 55:357-371の変法を用いて得られた。具体的には、19Ｆシグナル強度は、組織の水からの天然に存在する2Ｈシグナルに関連付けた。較正には、5-フルオロトリプトファン(5-FTP)および酢酸-d(AcOH-d)を含有する参照バルブを用いた。腫瘍はMRS試験の直後に摘出され、そして元の薬物レベルを実施例６に記載の方法のように高速クロマトグラフィー(HPLC)によって、測定した。
MRSを用いてRIF-1腫瘍から得られた代表的なフッ素および重水素分光法は、図６に示される。SR 4554のピークは、5-FTPのピークから45ppm離れている一方、HODのピークは、AcOH-dのピークから6ppm離れている。SR 4554のピークは、元の薬物および関連するニトロ還元代謝産物を含む。
表２は、RIF-1腫瘍における元の薬物および代謝産物に関連する薬物(MRS)、ならびに元の薬物のレベル（HPLC）に対応する19Ｆシグナルレベルを示す。脳内レベルのMRSも表２に示す。６時間での19Ｆの高濃度の保持率は、７時間でのHPLCによって検出された元の薬物の濃度がずっと低い（20倍）にもかかわらず、１つまたはそれ以上のニトロ還元代謝産物を示すことが考えられる。これらの結果は、SR 4554は脳から急速に消失するが、腫瘍に選択的に残存することを示す。
表３は、２つの腫瘍モデルの間の比較の結果を示す。RIF-1およびEMT-6腫瘍はそれぞれ、低放射能生物学的低酸素画分および高い放射能生物学的低酸素画分を有する。Moulderら、(1984)、前出。予想されるように、SR 4554の保持率は、EMT-6腫瘍における方がRIF-1腫瘍におけるよりも高かった。さらに、これらのデータはまた、マウスをヒドラジンで前処理することにより、保持率が２倍、増加したことを示す。
表４は、C3Hマウス乳腫瘍内のSR 4554保持率に対する高レベルの酸素（カルボジェン呼吸）の影響を示す。
腫瘍の酸素の測定は、SR 4554投与後３時間にポーラログラフ酸素針電極を用いて行った。
上記のデータは、SR4554がヒトおよびマウスの腫瘍低酸素血症の差異を検出するためのMRS/MRIプローブとして用いられ得ることを示す。
Claims (16)
- 以下の構造式（Ｉ）の化合物であって：
ただし、Ｒ 1またはＲ2のいずれかが４個またはそれ以上の炭素原子を含んでいる場合、それは、１つより多い−ＯＨ基で置換されている、化合物。 - Ｒ 2が、水素である、請求項１に記載の化合物。
- Ｒ1およびＲ2が同一でない、請求項１に記載の化合物。
- Ｒ 2 がモノサッカリドである、請求項１に記載の化合物。
- Ｒ 2 が、グルコース、ガラクトース、フルクトース、リボース、マンノース、アラビノース、およびキシロースからなる群から選択される、請求項４に記載の化合物。
- Ｒ 2 がＤ−グルコースである、請求項５に記載の化合物。
- 構造式（ＩＩ）
- 構造式（ＩＩＩ）
- 構造式（ＩＶ）
- 薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて、腫瘍検出に有効な量の請求項１に記載の化合物を含有する、低酸素腫瘍細胞を検出するための薬学的組成物。
- 薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて、腫瘍検出に有効な量の請求項７に記載の化合物を含有する、低酸素腫瘍細胞を検出するための薬学的組成物。
- 請求項１に記載の化合物を含む、哺乳動物個体中の低酸素腫瘍細胞を検出するキット。
- 請求項７に記載の化合物を含む、哺乳動物個体中の低酸素腫瘍細胞を検出するキット。
- 請求項９に記載の化合物を含む、哺乳動物個体中の低酸素腫瘍細胞を検出するキット。
- 検出が磁気共鳴映像法を用いる、請求項１２に記載のキット。
- 検出が磁気共鳴分光法を用いる、請求項１２に記載のキット。
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