JP3783999B2

JP3783999B2 - Propolis composition

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Publication number: JP3783999B2
Application number: JP2000070340A
Authority: JP
Inventors: 貴坂本; 千絵吉田; 弥生長瀬; 貴弘小川; 敏三島
Original assignee: API Co Ltd
Current assignee: API Co Ltd
Priority date: 2000-03-14
Filing date: 2000-03-14
Publication date: 2006-06-07
Anticipated expiration: 2020-03-14
Also published as: JP2001261571A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、糖尿病合併症の発症及び進展を抑制するのに有効な成分を含有するプロポリス組成物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
近年、糖尿病及びそれに関連して起こる糖尿病性合併症を発症する人が増加している。その糖尿病性合併症の発症例の１例について説明すると、まず、体内においては血中のグルコースやガラクトースをポリオール（ソルビトールなど）に変換する酵素であるアルドース還元酵素（アルドースリダクターゼ、以下ＡＲと記載する）が、主に末梢神経や水晶体に存在している。そして、糖尿病のような高血糖の状態、つまり、血中のグルコースの増加に伴い、そのグルコースが前記ＡＲによりソルビトールに変換されて、体内におけるソルビトールの産生量が増加するとともに、体内に蓄積される。その結果、このソルビトールの蓄積により糖尿病性合併症である白内障や神経障害が引き起こされる。
【０００３】
糖尿病性合併症を引き起こすその他の種々の要因としては、ニコチンアミドジヌクレオチドリン酸（以下ＮＡＤＰＨと記載する）、還元型グルタチオン（以下ＧＳＨと記載する）の減少や、水晶体膜の過酸化などが考えられている。従って、これらの糖尿病性合併症の発症、進展を阻止、遅延する目的で、前記ＡＲの活性を阻害するＡＲ阻害剤の開発が進められている。
【０００４】
また、天然物中のＡＲ阻害活性物質としてはプロポリス、ギムネマ、イラクサ、クワ葉、イチョウ葉、エキナセア、チョウセンアザミ、ヨモギ、ローズマリー、メグスリノキ、アブラギク等が報告され、その主な有効成分はカルボン酸やフラボノイドだと考えられている。
【０００５】
前記プロポリスの抗糖尿病作用については、ラットを用いたモデル実験で糖尿病性白内障に有効であったとの報告（Medicine and Biology．133(2)，41-43，1996）がある。またプロポリスに含まれるフラボノイド類の中には、ＡＲ阻害活性を有するものがあり、プロポリスの抗酸化作用による水晶体の過酸化物質の消長による効果も期待できると考えられる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、前記プロポリスを糖尿病性合併症の発症、進展の抑制のために使用した場合、in vitroではＡＲ阻害活性を発揮させることができるが、in vivoではＡＲ阻害活性が十分に発揮されていない。これは糖尿病性合併症に有効なＡＲ阻害活性が不十分、活性成分の体内吸収、標的となる組織への移行が不十分であることを意味し、十分なＡＲ阻害活性を得るためには多量のＡＲ阻害活性物質の摂取が必要となってくる。しかし、多量のＡＲ阻害活性物質を摂取するためにはプロポリスを多量に必要とし、糖尿病性合併症の発症、進展の抑制のための費用が嵩むという問題があった。
この発明は上記のような従来の問題点に着目してなされたものである。その目的とするところは、糖尿病性合併症の発症、進展を抑制する作用を少量の使用量で効果的に発揮することができるプロポリス組成物を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
上記目的を達成するための手段として、請求項１に記載のプロポリス組成物は、投与により糖尿病性合併症の発症及び進展を抑制するためのプロポリス組成物において、プロポリスと、ローヤルゼリー及びシリマリンから選ばれる少なくとも１種とよりなることを特徴とするものである。
請求項２に記載のプロポリス組成物は、請求項１に記載の発明において、前記プロポリスは原料プロポリスから水抽出して得られる水抽出プロポリス又は前記水抽出プロポリスをさらにアルコール抽出して得られる水抽出プロポリスであるものである。
請求項３に記載のプロポリス組成物は、請求項１又は請求項２に記載の発明において、前記ローヤルゼリーは総炭素数１０個の不飽和脂肪酸を２０〜４０重量％含有するものである。
請求項４に記載のプロポリス組成物は、請求項１〜請求項３のうちいずれか一項に記載の発明において、前記ローヤルゼリー及びシリマリンから選ばれる少なくとも１種の配合量はプロポリスに対して重量基準で０．０１〜１００倍の量に設定されているものである。
請求項５に記載のプロポリス組成物は、請求項１又は請求項２記載の発明において、少なくとも前記シリマリンを含有する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
以下、この発明を具体化した実施形態について詳細に説明する。
プロポリス組成物はプロポリスと、ローヤルゼリー及びシリマリンから選ばれる少なくとも１種とよりなり、糖尿病性合併症の発症及び進展を抑制する作用を有するものである。
【０００９】
前記プロポリスについて説明すると、プロポリスはミツバチが種々の植物から採取した樹脂状物質を素材として、花粉やミツバチ自身の腺物質が混ざって構成されたものである。そして、プロポリスは蜂の生活において、巣内の隙間に塗り付けられ、外敵、すなわち有害なウイルス、バクテリア等の微生物、他の昆虫等が蜂の巣に侵入するのを防ぐために使用されるものである。
【００１０】
プロポリスに含まれる糖尿病性合併症の発症及び進展を抑制する作用であるＡＲ阻害活性物質としては、具体的には、クマル酸、桂皮酸、クロロゲン酸、カフェ酸、フェルラ酸等のフェノール性有機酸類等が挙げられる。
【００１１】
プロポリス組成物に使用されるプロポリスとしては原料プロポリス、その原料プロポリスを溶媒によって抽出したプロポリス抽出物（水抽出プロポリス又はアルコール抽出プロポリス）、前記プロポリス抽出物をさらに溶媒によって抽出したプロポリス抽出物が使用される。
【００１２】
前記原料プロポリスの産地は中国、ブラジル、ヨーロッパ諸国、オセアニア諸国、アメリカがあるがそのいずれであってもよい。原料プロポリスはそのまま用いてもよいが、ごみやワックス等の夾雑物もあり、また、そのままでは処理が困難な場合があるので、溶媒によって抽出したプロポリス抽出物を用いるのが好ましい。
【００１３】
前記水抽出プロポリスは体内に速やかにかつ効率的に吸収される。一方、アルコール抽出プロポリスは体内に吸収されにくく、体内における有効成分の利用が阻害されるため、内用剤として用いるときは水抽出プロポリスを利用するのが好ましい。
【００１４】
水抽出プロポリスの原料としてはプロポリス原塊及びアルコール洗浄したプロポリス原塊のうちの少なくとも一方を使用する。そして、前記原料に水を加えて攪拌してプロポリス水分散液とする。次いで、そのプロポリス水分散液をロート等を使用して濾過し、残渣を除去することにより水抽出プロポリスの水溶液が得られる。
【００１５】
水抽出プロポリスのプロポリス組成物への利用形態は特に限定されるものでなく、例えば上記水抽出プロポリスの水溶液等の液状のものを利用してもよく、また、その水抽出プロポリスの水溶液を適当な濃度に濃縮した後に、凍結乾燥、噴霧乾燥等の方法により乾燥させ、それを粉砕して粉末状としたものを利用してもよい。さらに、上記方法により粉末状に形態変更された水抽出プロポリスを水に溶解して再度液状とした水抽出プロポリスの水溶液を利用してもよい。液状又は粉末状の水抽出プロポリスはさらにアルコール抽出してフェノール性有機酸類の濃度を高めてからプロポリス組成物に利用するのが好ましい。
【００１６】
前記アルコール抽出について説明すると、まず、液状の水抽出プロポリス又は粉末状の水抽出プロポリスを水に溶解して水溶液を調製する。このとき、水抽出プロポリスの水溶液の水抽出プロポリスの濃度は０．１〜１０重量％に設定されるのが好ましく、１〜３重量％に設定されるのがより好ましい。水抽出プロポリスの濃度が０．１重量％未満の場合、ＡＲ阻害活性を充分に発揮することができない。一方、水抽出プロポリスの濃度を１０重量％より大きくしても、ＡＲ阻害活性は向上せず、かえって水抽出プロポリスの使用量が多くなる。
【００１７】
次いで、その水溶液に対し適当量のエタノールを添加する。エタノールの添加量は、水抽出プロポリスとエタノールとの溶液におけるエタノールの終濃度が３０〜８０vol/vol％となるように設定されるのが好ましく、水抽出プロポリスの収率とそのＡＲ阻害活性を考慮して６０〜８０vol/vol％となるように設定されるのがより好ましい。
【００１８】
エタノール添加後、この水溶液中に析出物が生成するので、この析出物を静置又は遠心して沈殿除去する。すると、フェノール性有機酸類の濃度が高められた上清画分が得られる。さらに、その上清画分を物質の極性を利用した溶媒抽出法によって分画し、その酸性物質画分を分取することによって、フェノール性有機酸類の濃度がより高められた水抽出プロポリスが得られる。なお、セファデックスのようなゲル濾過担体をカラムに充填したゲル濾過カラムを使用して分画しても、同様にフェノール性有機酸類の濃度がより高められた水抽出プロポリスが得られる。
【００１９】
上記アルコール抽出後の水抽出プロポリスに含まれるフェノール性有機酸類の濃度は、抽出前の水抽出プロポリスに含まれるフェノール性有機酸類の濃度の１．５〜２倍となる。従って、得られる水抽出プロポリスのＡＲ阻害活性は、抽出前の水抽出プロポリスによるＡＲ阻害活性の１．５倍強くなる。なお、得られる水抽出プロポリスは、得られた酸性物質画分の液状の形態のまま、酸性物質画分を蒸留してエタノールを留去した水溶液の形態、又はそれらを乾燥して得られる粉末の形態とされて利用される。
【００２０】
さらに、上記溶媒抽出法によって得られた酸性物質画分をさらに溶媒抽出法によって分画する。この際、酸性物質画分が液状の形態のときは、そのまま又は希釈、濃縮により適当な濃度に調整して使用し、粉末状のときは溶媒、例えば水や含水エタノール等に溶解した溶解液を使用する。このときの酸性物質画分の濃度は０．１〜１０重量％に設定されるのが好ましく、１〜３重量％に設定されるのがより好ましい。また、上記溶解液のｐＨ（水素イオン濃度）を調整するときは、塩酸や水酸化ナトリウムを使用し、その他の溶媒としてはエチルエーテル、クロロホルム、酢酸エチル等の有機溶媒のほか、酸性物質を抽出する場合には水相として飽和炭酸水素ナトリウム溶液（重曹水）やｐＨ８〜９の高濃度のリン酸緩衝液等が用いられる。
【００２１】
従って、２回目の溶媒抽出法により得られる酸性物質画分の水抽出プロポリスに含まれるフェノール性有機酸類の濃度は、１回目の溶媒抽出後の２〜４倍となり、アルコール抽出前の水抽出プロポリスに含まれるフェノール性有機酸類濃度の３〜８倍となる。さらに、ＡＲ阻害活性は、アルコール抽出前の水抽出プロポリスによるＡＲ阻害活性の２〜３倍強くなる。
【００２２】
次に、ローヤルゼリーについて説明すると、ローヤルゼリーは女王蜂の特別食であって、働き蜂の下咽頭腺から分泌される乳白色の半流動体の性状のものである。その成分は水分約６５〜６７重量％、蛋白質約１１〜１３重量％、脂質５〜１０重量％、その他ミネラル、ビタミンを含む。ローヤルゼリーは古来より広く民間で用いられてきており、その薬理作用としては、動物実験において成長促進効果、生殖機能向上があり、また臨床では栄養改善、食欲増進、血圧調節、女性機能改善、肝機能正常化等と多岐にわたっている。
【００２３】
ローヤルゼリー中には総炭素数１０個の不飽和脂肪酸が含有され、その不飽和脂肪酸は生ローヤルゼリー中に約１．４〜２重量％、凍結乾燥ローヤルゼリー中に約５〜７重量％程度含有されている。前記不飽和脂肪酸としては、１０−ヒドロキシデセン酸、１０−ヒドロキシデカン酸及び３，１０−ジヒドロキシデカン酸が挙げられ、それらはＡＲ阻害活性を発揮することが報告されている。
【００２４】
プロポリス組成物の原料として、ローヤルゼリーは生をそのまま使用してもよく、凍結乾燥して粉末状としたローヤルゼリーを使用してもよい。なお、ローヤルゼリーは通常濁りが発生するため、ローヤルゼリー中の濁りの一因となる不活性蛋白質を除去した、いわゆる脱蛋白ローヤルゼリーを使用してもよい。この脱蛋白ローヤルゼリーは、必要によりアルコールで不溶性蛋白質を沈殿させた後、遠心分離し、珪藻土を用いて濾過することによって得られる。
【００２５】
なお、ローヤルゼリーにより発揮されるＡＲ阻害活性は、主に前記不飽和脂肪酸により発揮されると考えられている。そのため、それら不飽和脂肪酸を高含有するローヤルゼリーエキスをプロポリス組成物に使用するのが好ましく、そのローヤルゼリーエキスは不飽和脂肪酸を２０〜４０重量％含有しているものである。
【００２６】
ローヤルゼリーエキスは少なくとも生ローヤルゼリー及び凍結乾燥ローヤルゼリーから選ばれる少なくとも１種から抽出される。また、不飽和脂肪酸等を高濃度に抽出するには、アルコール等の有機溶媒、具体的にはエタノールが用いられる。その際、エタノール濃度は５〜９９重量％であればよく、色、香りの抽出まで考慮するならば、５〜５０重量％が好ましい。なお、その他の溶媒としては水を使用するのが好ましい。また、有機溶媒の使用量はローヤルゼリーに対して等倍以上、さらに不飽和脂肪酸等の抽出効率の点からは８倍以上であることが好ましい。そして、ローヤルゼリーエキスは、ローヤルゼリーにエタノール水溶液を添加し、十分攪拌した後、濾過又は遠心分離により上清を分取し、その上清を滅圧濃縮することにより得られる。
【００２７】
次いで、シリマリンについて説明すると、シリマリンはオオアザミの種子から抽出されるものである。シリマリンの作用としては、脂質過酸化を抑制し、活性酸素を消去することが報告され、最近の論文では肝硬変に糖尿病を併発した患者血液のマロンジアルデハイド（ＭＤＡ）の濃度を低下させることが報告されている。また、肝細胞再生作用があり、核酸、蛋白合成を促進させる作用を有し、加えて、胆汁の排出を促進させる作用を有することも知られている。シリマリンの抗糖尿病作用としては、抗酸化作用による水晶体の過酸化物質の消長による効果が期待できるものと考えられる。
【００２８】
シリマリン中には多くのフラボノイド類が含まれ、特にフラボノリグナンという化合物群が前記各作用の有効成分と考えられ、その有効成分としての化合物はシリビン、シリジアニン、シリクリスチンである。この３種の化合物の化学式はいずれもＣ₂₆Ｈ₂₂Ｏ₁₀の異性体である。
【００２９】
そして、上記シリマリンの抽出方法としては、まず、オオアザミの種子を細かく挽き、エタノールで抽出する。次いで、抽出液を濃縮してエタノールを除去した後、その濃縮液の油分を遠心分離で除去し、さらに得られる液体を乾燥させて粉砕することによりシリマリンが得られる。
【００３０】
従って、上記水抽出プロポリス又は水抽出後にさらにアルコール抽出を行って得られた水抽出プロポリスとローヤルゼリーエキス、水抽出プロポリス又は水抽出後にさらにアルコール抽出を行って得られた水抽出プロポリスとシリマリン、若しくは水抽出プロポリス又は水抽出後にさらにアルコール抽出を行って得られた水抽出プロポリスとローヤルゼリーエキスとシリマリンをそれぞれ混合することによりプロポリス組成物が調製される。
【００３１】
プロポリス組成物の形態は医薬品及び食品の利用目的に応じて適宜選択され、食用、飲料用として液状、ゼリー状にすることができる上、内服用として粉末状とすることができる。また、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、散剤及び錠剤等としても利用される。
【００３２】
プロポリス組成物中におけるローヤルゼリーエキス及びシリマリンの配合量は、水抽出プロポリスに対してローヤルゼリーエキス及びシリマリンの少なくとも１種が重量基準で０．０１〜１００倍に設定されるのが好ましく、０．１〜１０倍に設定されるのがより好ましい。この配合量が０．０１倍未満又は１００倍を超える場合には、相乗的なＡＲ阻害活性の増大が引き起こされにくく、糖尿病性合併症に対する強い効果を発揮させにくくなる。
【００３３】
さらに、プロポリス組成物による相乗的なＡＲ阻害活性の増大を効果的に発揮させるために、水抽出プロポリスに対してローヤルゼリーエキスは重量基準で２〜１０倍、シリマリンが重量基準で１〜３倍に設定されるのが特に好ましい。また、水抽出プロポリスに対してローヤルゼリーエキスとシリマリンの両方を混合する際も、ローヤルゼリーエキスは重量基準で２〜１０倍、シリマリンが重量基準で１〜３倍に設定されるのが特に好ましい。
【００３４】
また、プロポリス組成物には、前記各成分に加えて、ゲル化剤、香料、防腐剤、酸化防止剤、着色剤、清涼剤、殺菌剤、ｐＨ調整剤等の添加剤を適宜添加することも可能である。
【００３５】
次に、上記実施形態によって発揮される効果について説明する。
（１）プロポリス組成物は水抽出プロポリス又は水抽出後にさらにアルコール抽出を行って得られた水抽出プロポリスと、ローヤルゼリーエキス及びシリマリンから選ばれる少なくとも一種とを混合して調製されている。そのため、ＡＲ阻害活性を有する各成分を同時に含有することによって、抗糖尿病作用を相乗的に増大させ、プロポリス組成物の使用量を少量で糖尿病性合併症の発症、進展を抑制する作用を効果的に発揮することができる。また、糖尿病そのものの発症、進展を抑制する作用も効果的に発揮することができる。さらに、取り扱い性がよい上、恒久的な体質改善につながり得る長期間の連続投与を可能にすることができる。
【００３６】
（２）水抽出プロポリス又は水抽出後にさらにアルコール抽出を行って得られた水抽出プロポリス、ローヤルゼリーエキス及びシリマリンはいずれも安価に入手することができるため、プロポリス組成物を安価に製造することができる。
【００３７】
（３）水抽出プロポリス又は水抽出後にさらにアルコール抽出を行って得られた水抽出プロポリス、ローヤルゼリーエキス及びシリマリンはそれぞれ公知の抽出方法によって抽出した抽出物を利用できることから、プロポリス組成物を液状、ゼリー状、粉末状、液剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、散剤及び錠剤等の多様な形態での投与を行うことができる。
【００３８】
（４）プロポリスのなかでも水抽出プロポリス又は水抽出後にさらにアルコール抽出を行って得られた水抽出プロポリスを使用するため、プロポリス原塊を使用する場合と比較してプロポリス組成物中にＡＲ阻害活性を発揮するフェノール性有機酸類を多量に含有させることができる。従って、プロポリス組成物に対する水抽出プロポリスの使用量を少量にすることができるとともに、糖尿病そのもの及び糖尿病性合併症の発症、進展を抑制する作用をより効果的に発揮することができる。
【００３９】
（５）ローヤルゼリーはＡＲ阻害活性を発揮する１０−ヒドロキシデセン酸、１０−ヒドロキシデカン酸及び３，１０−ジヒドロキシデカン酸を２０〜４０重量％含有しているローヤルゼリーエキスを使用した。そのため、ローヤルゼリーを使用する場合と比較してプロポリス組成物に対するローヤルゼリーの使用量を少量にすることができるとともに、糖尿病そのもの及び糖尿病性合併症の発症、進展を抑制する作用をより効果的に発揮することができる。
【００４０】
（６）ローヤルゼリーエキス及びシリマリンの配合量は水抽出プロポリスに対してそれぞれ重量基準で０．０１〜１００倍に設定した。そのため、糖尿病そのもの及び糖尿病性合併症に対する効果の相乗的増大効果を確実に発揮させることができる。
【００４１】
【実施例】
以下、前記実施形態を実施例及び比較例を用いて具体的に説明する。
（比較例１）
ブラジル産プロポリス原塊２００ｋｇを粉砕機で粉砕し、これに９５vol/vol％エタノールを４０００リットル加えて、時々攪拌しながら室温で４日間放置した。その後、その上澄み液を濾過により分離除去してエタノール洗浄済みのプロポリス原塊を得た。次に、得られたエタノール洗浄済みのプロポリス原塊５０ｋｇに温水３００リットルを加え、常時攪拌しながら４５℃で５時間抽出を行った後、バケット型遠心分離機で固液分離して分離液を得た。この分離液に珪藻土３５ｋｇを加えて攪拌した後、濾過をして濾過液を得た。この濾過液を濃縮した後、凍結真空乾燥にて乾燥して、水抽出プロポリスの乾燥粉末２２００ｇを得た。
【００４２】
（比較例２）
上記比較例１で得られた水抽出プロポリスの乾燥粉末１８０ｇに６０℃の温水９リットルを加えて１時間攪拌した後、エタノール２１リットルを加えてさらに２時間攪拌した。そして、この水−エタノール溶液を室温で一晩放置して析出物を沈殿させ、上清画分を分取した。この上清画分を濃縮し、減圧乾燥して水抽出プロポリスをさらにアルコール抽出した水抽出プロポリスの乾燥粉末９５ｇを得た。
【００４３】
（比較例３）
上記比較例１で得られた濾過液の上清画分１７．５リットルを３．５リットルまで濃縮した後、その濃縮液を塩酸でｐＨ３に調整した。この調整液に酢酸エチル３．６リットルを加えて分液ロートを用いて水相と酢酸エチル相に分離し、得られた水相に酢酸エチル３．６リットルを再度加え、前記と同様の分離操作をさらに２回行った。そして、酢酸エチル相を一つにまとめ、これを１．２リットルまで濃縮した後、その濃縮液を水酸化ナトリウムでｐＨ９に調整した。
【００４４】
この調整液に飽和炭酸水素ナトリウム溶液１．２５リットルを加え、その溶液を分液ロートを用いて炭酸水素ナトリウム溶液相と酢酸エチル相に分け、得られた酢酸エチル相に飽和炭酸水素ナトリウム溶液１．２５リットルを再度加え、前記と同様の分離操作をさらに２回行った。飽和炭酸水素ナトリウム溶液相を一つにまとめて、これを塩酸でｐＨ２．８に調整した。
【００４５】
この調整液に酢酸エチル３．８リットルを加え、その溶液を分液ロートを用いて炭酸水素ナトリウム溶液相と酢酸エチル相に分け、得られた炭酸水素ナトリウム溶液相に酢酸エチル３．８リットルを再度加え、前記と同様の分離操作をさらに１回行った。酢酸エチル相を一つにまとめて濃縮し、減圧乾燥して水抽出した後、水抽出プロポリスをさらにアルコール抽出した水抽出プロポリスの乾燥粉末１７０ｇを得た。
【００４６】
（比較例４）
凍結乾燥ローヤルゼリー１０ｋｇに９５vol/vol％エタノール５０リットルを加えて、室温で攪拌した。その上清を濾過により分離除去し、減圧濃縮した後、固形物９５０ｇのローヤルゼリーエキスを得た。
【００４７】
（比較例５）
ブルガリア産オオアザミの種子３ｋｇを粉砕機で粉砕後、９９vol/vol％エタノール３０リットルを加えて、室温で攪拌した。その上清を濾過により分離除去した後、残渣を再度エタノールで抽出して、その抽出液を濾過してその上清を分取した。上清を一つにまとめて減圧濃縮した後、さらに、遠心分離により油脂分と固形分を分け、固形分３７５ｇのシリマリンエキスを得た。
【００４８】
（実施例１）
比較例１で得られた水抽出プロポリス乾燥粉末と、比較例４で得られたローヤルゼリーエキスとを１対５の重量比で混合したものを実施例１のプロポリス組成物とした。
【００４９】
（実施例２）
比較例１で得られた水抽出プロポリス乾燥粉末と、比較例５で得られたシリマリンエキスとを１対２の重量比で混合したものを実施例２のプロポリス組成物とした。
【００５０】
（実施例３）
比較例１で得られた水抽出プロポリス乾燥粉末と、比較例４で得られたローヤルゼリーエキスと、比較例５で得られたシリマリンエキスとを１対５対２の重量比で混合したものを実施例３のプロポリス組成物とした。
【００５１】
（実施例４）
比較例２で得られた水抽出プロポリス乾燥粉末と、比較例４で得られたローヤルゼリーエキスとを１対５の重量比で混合したものを実施例４のプロポリス組成物とした。
【００５２】
（実施例５）
比較例２で得られた水抽出プロポリス乾燥粉末と、比較例５で得られたシリマリンとを１対２の重量比で混合したものを実施例５のプロポリス組成物とした。
【００５３】
（実施例６）
比較例２で得られた水抽出プロポリス乾燥粉末と、比較例４で得られたローヤルゼリーエキスと、比較例５で得られたシリマリンとを１対５対２の重量比で混合したものを実施例６のプロポリス組成物とした。
【００５４】
（実施例７）
比較例３で得られた水抽出プロポリス乾燥粉末と、比較例４で得られたローヤルゼリーエキスとを１対５の重量比で混合したものを実施例７のプロポリス組成物とした。
【００５５】
（実施例８）
比較例３で得られた水抽出プロポリス乾燥粉末と、比較例５で得られたシリマリンとを１対２の重量比で混合したものを実施例８のプロポリス組成物とした。
【００５６】
（実施例９）
比較例３で得られた水抽出プロポリス乾燥粉末と、比較例４で得られたローヤルゼリーエキスと、比較例５で得られたシリマリンとを１対５対２の重量比で混合したものを実施例９のプロポリス組成物とした。
【００５７】
（試験例１）
（ＡＲ阻害活性試験）
比較例１〜５で得られた各水抽出プロポリス乾燥粉末について、ＡＲ阻害活性を測定した。
【００５８】
まず、ＡＲ阻害活性試験方法について説明する。新鮮な牛の水晶体１０個をはさみで細かく切断し、冷却した５倍量の１ｍＭ−２−メルカプトエタノールを含むＰＢＳ（phosphate-buffered saline）を加えて、冷却しながらホモジネートした。このホモジネート液を４℃、１８０００ｇで３０分間遠心し、その上清を分取してＡＲ粗抽出液を得た。
【００５９】
次に、吸光度測定用のセルに、ＡＲ粗抽出液０．４ｍｌと、１００ｍＭの硫酸リチウムを含むＰＢＳ２．０ｍｌと、１．５ｍＭのＮＡＤＰＨ０．２ｍｌと、比較例１〜５で得られた各水抽出プロポリス乾燥粉末を水に溶解した溶解液０．２ｍｌとを入れて、転倒混和する。続いて、このセルを２５℃で１０分間プレインキュベートした後、７５ｍＭのＤＬ−グリセルアルデヒド溶液０．２ｍｌを加えて転倒混和する。そして、このサンプル溶液（計３．０ｍｌ）について、３４０ｎｍの吸光度変化を２５℃で５分間記録した。この測定記録から１分間当たりの吸光度変化を算出し、以下の式に従ってＡＲ阻害率（％）を算出した。
【００６０】
ＡＲ阻害率＝｛１−（ΔＡｓ−ΔＡｂ）／（ΔＡｃ−ΔＡｂ）｝×１００
ΔＡｂ：溶解液とＤＬ−グリセルアルデヒド溶液の代わりに１００ｍＭの硫酸リチウムを含むＰＢＳを使用したときの１分間当りの吸光度変化
ΔＡｃ：溶解液の代わりに１００ｍＭの硫酸リチウムを含むＰＢＳを使用したときの１分間当りの吸光度変化
ΔＡｓ：サンプル溶液の１分間当りの吸光度変化
さらに、サンプル溶液中の水抽出プロポリス乾燥粉末の濃度とＡＲ阻害率との関係から最小二乗法によって、ＡＲ活性を５０％阻害する濃度（ＩＣ₅₀）を求めた。その結果を表１に示す。
【００６１】
これらの酵素調製法及び活性測定法は周知の方法である（Archives of Biochemistry and Biophysics,216(1),337-344,1982、The journal of Antibiotics,48(11),1345-1346,1995）。
【００６２】
【表１】

表１に示すように、比較例１〜５のいずれにもＡＲ阻害活性が認められた。水抽出プロポリスについては、精製してフェノール性有機酸類を多く含むにつれてＩＣ₅₀が小さくなるため、少量の水抽出プロポリスでＡＲ阻害活性を発揮することができることが示された。
【００６３】
（試験例２）
（ラット糖尿病性白内障試験）
糖尿病性合併症に対する水抽出プロポリス、ローヤルゼリーエキス及びシリマリンの効果を調べるため、その発症、進展にＡＲが関与する糖尿病性白内障について、ラットを用いたモデル実験を実施した。
【００６４】
まず、市販の粉末飼料（オリエンタル酵母株式会社製ＣＲＦ−１）とＤ−ガラクトースとを含有する飼料を調製し、さらに、各比較例及び実施例においては、前記飼料に対して表２に示す配合割合で水抽出プロポリス、ローヤルゼリーエキス及びシリマリンをそれぞれ配合した。なお、比較例１〜５及び実施例１〜９においては、Ｄ−ガラクトースを水抽出プロポリスに対して重量基準で２５倍となるように配合した。なお、対照例１は市販の粉末飼料にＤ−ガラクトースのみを配合した飼料を与えたものであり、対照例２は市販の粉末飼料のみを飼料として与えたものである。
【００６５】
次に、比較例１〜５及び実施例１〜９、対照例１，２において、それぞれ雄性Sprague-Dawley系ラット（体重９０ｇ前後、１群６匹）に対して、上記飼料を１４日間自由摂取させた後、ガラクトース誘発糖尿病性白内障ラットを作製して、それらを解剖に供した。
【００６６】
【表２】

次いで、前記ガラクトース誘発糖尿病性白内障ラットの眼に０．５％トロピカミド点眼液（わかもと製薬）を点眼し、眼を十分に散瞳させた後、水晶体の混濁度を肉眼で観察した。白内障の判定は、水晶体の混濁度をSippelの方法（Invest．Ophthalmol．，5,568-578,1966）に従って評価した（Score０、１、２、３、４）。さらに、得られたスコアより白内障抑制率（％）を、以下に示す計算式に従って計算した。
【００６７】
白内障抑制率（％）＝｛（対照例１のスコア平均値−比較例又は実施例のスコア平均値）／（対照例１のスコア平均値）｝×１００
さらに、水晶体の混濁度を観察後、眼球を摘出し、さらに、水晶体を分離してＧＳＨ含量（μｇ／ｌｅｎｓ）の測定試料とした。ＧＳＨ含量はＯ−フタルアルデヒドによる蛍光法（Analytical biochemistry,74,214-226,1976）に準じて測定した。さらに、得られた水晶体のＧＳＨ含量より、ＧＳＨ含量の減少作用を抑制する抑制率（％）を、以下に示す計算式に従って計算した。
【００６８】
抑制率（％）＝｛（比較例又は実施例のＧＳＨ含量平均値−対照例１のＧＳＨ含量平均値）／（対照例２のＧＳＨ含量平均値−対照例１のＧＳＨ含量平均値）｝×１００
統計学的処理はStudent t-test を用い、表中の＊は対照例１に対する有意差が５％以下の危険率であることを示し、＊＊は対照例１に対する有意差が１％以下の危険率であることを示す。
【００６９】
それらの結果を表３〜６に示す。
【００７０】
【表３】

表３に示すように、比較例１〜５はいずれも白内障の観察において、水晶体の混濁を抑制したが、比較例３を除いてその抑制効果は軽度なものであった。また、比較例１〜３の比較においては、フェノール性有機酸類が最も高含有な比較例３に強い効果が認められた。水晶体中のＧＳＨ含量は、比較例１〜５のいずれも対照例より有意に多かった。
【００７１】
【表４】

表４に示すように、実施例１〜３は各比較例と比べて白内障の程度を著しく抑制し、水晶体ＧＳＨ含量も同様に各比較例と比べて著しく回復していた。この効果は水抽出プロポリスにローヤルゼリーエキス及びシリマリンのうちの少なくとも一種を同時に含有する場合、ＡＲ阻害活性が相乗的に発揮されることを意味している。
【００７２】
【表５】

【００７３】
【表６】

表５及び表６に示すように、実施例４〜６及び表７〜９のいずれも、表４の結果と同様に、水抽出プロポリスにローヤルゼリーエキス及びシリマリンのうちの少なくとも一種を同時に含有する場合、ＡＲ阻害活性が相乗的に発揮されることを意味している。また、水抽出プロポリスのフェノール性有機酸類が高含有の場合、ＡＲ阻害活性がさらに増大することが認められた。
【００７４】
なお、前記実施形態より把握される技術的思想につき、以下に説明する。
・前記請求項１〜請求項４のうちいずれか一項に記載のプロポリス組成物を所定の形状に加工し、糖尿病性合併症の発症及び進展を抑制する作用を有することを特徴とするプロポリス含有食品。このように構成した場合、食品として服用しながら糖尿病性合併症の発症、進展を抑制する作用を効果的に発揮することができる。
【００７５】
・前記ローヤルゼリーは、生ローヤルゼリー及び凍結乾燥ローヤルゼリーから選ばれる少なくとも１種をアルコールで抽出したローヤルゼリーエキスである請求項１〜請求項４のうちいずれか一項に記載のプロポリス組成物。このように構成した場合、ローヤルゼリーエキスは不飽和脂肪酸を高含有するため、プロポリス組成物に対するローヤルゼリーの使用量を少量にすることができるとともに、糖尿病性合併症の発症、進展を抑制する作用をより効果的に発揮することができる。
【００７６】
・プロポリスに対してローヤルゼリー及びシリマリンから選ばれる少なくとも１種を混合して調製されるプロポリス組成物の製造方法。このように構成した場合、糖尿病性合併症の発症、進展を抑制する作用を少量の使用量で効果的に発揮することができるプロポリス組成物を容易に製造することができる。
【００７７】
【発明の効果】
以上詳述したように、この発明によれば次のような効果が発揮される。
請求項１〜請求項５のうちいずれか一項に記載の発明によれば、糖尿病性合併症の発症、進展を抑制する作用を少量の使用量で効果的に発揮することができる。
【００７８】
請求項４に記載の発明によれば、糖尿病の合併症に対する効果の相乗的増大効果を確実に引き起こすことができる。さらに、様々な形態に容易に加工することができ、多様な形態での投与を行うことができる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a propolis composition containing a component effective for suppressing the onset and progression of diabetic complications.
[0002]
[Prior art]
In recent years, an increasing number of people develop diabetes and related diabetic complications. An example of the onset of the diabetic complication will be described. First, in the body, aldose reductase (aldose reductase, hereinafter referred to as AR), which is an enzyme that converts glucose or galactose in blood into a polyol (such as sorbitol). ) Is mainly present in the peripheral nerve and lens. And in the state of hyperglycemia such as diabetes, that is, with the increase of glucose in the blood, the glucose is converted into sorbitol by the AR, and the production amount of sorbitol in the body increases and accumulates in the body. . As a result, this accumulation of sorbitol causes diabetic complications such as cataracts and neuropathy.
[0003]
Various other factors that cause diabetic complications include a decrease in nicotinamide dinucleotide phosphate (hereinafter referred to as NADPH), reduced glutathione (hereinafter referred to as GSH), and peroxidation of the lens membrane. It has been. Therefore, development of an AR inhibitor that inhibits the activity of the AR is underway for the purpose of preventing or delaying the onset and progression of these diabetic complications.
[0004]
In addition, as an AR inhibitory active substance in natural products, propolis, gymnema, nettle, mulberry leaf, ginkgo biloba, echinacea, datura, mugwort, rosemary, megsurinoki, aragiku are reported, and the main active ingredients are carboxylic acid Or flavonoids.
[0005]
About the anti-diabetic action of the propolis, there is a report (Medicine and Biology. 133 (2), 41-43, 1996) that it was effective in diabetic cataract in a model experiment using rats. Further, some flavonoids contained in propolis have AR inhibitory activity, and it is considered that the effect of the change of the peroxidation substance of the lens due to the antioxidant action of propolis can be expected.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
However, when the propolis is used to suppress the onset and progression of diabetic complications, it can exert AR inhibitory activity in vitro, but AR inhibitory activity is not sufficiently exhibited in vivo. This means that the AR inhibitory activity effective for diabetic complications is insufficient, the in vivo absorption of the active ingredient, and the transfer to the target tissue are insufficient, and in order to obtain sufficient AR inhibitory activity, a large amount Ingestion of an AR inhibitory active substance becomes necessary. However, in order to ingest a large amount of an AR inhibitory active substance, a large amount of propolis is required, and there is a problem that the cost for suppressing the onset and progression of diabetic complications increases.
The present invention has been made paying attention to the conventional problems as described above. The object is to provide a propolis composition capable of effectively exhibiting the action of suppressing the onset and progress of diabetic complications with a small amount of use.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
As a means for achieving the above object, the propolis composition according to claim 1,In a propolis composition for suppressing the onset and progression of diabetic complications by administration,Propolis and at least one selected from royal jelly and silymarinBecomeIt is characterized by this.
The propolis composition according to claim 2, in the invention according to claim 1, wherein the propolis is a water extraction propolis obtained by water extraction from a raw material propolis or a water extraction obtained by further alcohol extraction of the water extraction propolis. It is what is propolis.
The propolis composition according to claim 3 is the invention according to claim 1 or 2, wherein the royal jelly contains 20 to 40% by weight of unsaturated fatty acid having a total of 10 carbon atoms.
The propolis composition according to claim 4 is the invention according to any one of claims 1 to 3, wherein the blending amount of at least one selected from royal jelly and silymarin is based on weight with respect to propolis. Is set to an amount of 0.01 to 100 times.
The propolis composition according to claim 5 contains at least the silymarin in the invention according to claim 1 or claim 2.
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, embodiments embodying the present invention will be described in detail.
The propolis composition is composed of propolis and at least one selected from royal jelly and silymarin, and has an action of suppressing the onset and progression of diabetic complications.
[0009]
The propolis will be described. The propolis is made of a resinous material collected by honey bees from various plants and mixed with pollen and glandular substances of the bees themselves. Propolis is applied to the gaps in the nest in the life of the bees and used to prevent foreign enemies, that is, harmful viruses, microorganisms such as bacteria, and other insects from entering the beehive.
[0010]
Specific examples of the AR inhibitory active substance that suppresses the onset and progression of diabetic complications contained in propolis include phenolic organic acids such as coumaric acid, cinnamic acid, chlorogenic acid, caffeic acid, and ferulic acid. Etc.
[0011]
The propolis used in the propolis composition includes a raw propolis, a propolis extract obtained by extracting the raw propolis with a solvent (water-extracted propolis or alcohol-extracted propolis), and a propolis extract obtained by further extracting the propolis extract with a solvent. The
[0012]
The raw material propolis is produced in China, Brazil, European countries, Oceania countries, or the United States, and any of them may be used. The raw material propolis may be used as it is, but there are also foreign substances such as dust and wax, and since it may be difficult to process as it is, it is preferable to use a propolis extract extracted with a solvent.
[0013]
The water-extracted propolis is quickly and efficiently absorbed into the body. On the other hand, alcohol-extracted propolis is difficult to be absorbed into the body, and the use of active ingredients in the body is hindered. Therefore, it is preferable to use water-extracted propolis when used as an internal preparation.
[0014]
As a raw material for the water-extracted propolis, at least one of a propolis bulk and an alcohol-washed propolis bulk is used. Then, water is added to the raw material and stirred to obtain a propolis aqueous dispersion. Subsequently, the aqueous solution of propolis is filtered using a funnel or the like, and the residue is removed to obtain an aqueous solution of water-extracted propolis.
[0015]
The use form of the water-extracted propolis in the propolis composition is not particularly limited. For example, a liquid form such as the above-described aqueous solution of the water-extracted propolis may be used. After concentrating to a concentration, it may be dried by a method such as freeze drying or spray drying, and pulverized to form a powder. Furthermore, an aqueous solution of water-extracted propolis that has been changed into a powder form by the above method and dissolved in water to be liquid again may be used. The liquid or powdered water-extracted propolis is preferably extracted with alcohol to increase the concentration of phenolic organic acids before use in the propolis composition.
[0016]
The alcohol extraction will be described. First, an aqueous solution is prepared by dissolving liquid water extraction propolis or powdered water extraction propolis in water. At this time, the concentration of the water extraction propolis in the aqueous solution of water extraction propolis is preferably set to 0.1 to 10% by weight, and more preferably set to 1 to 3% by weight. When the concentration of the water-extracted propolis is less than 0.1% by weight, the AR inhibitory activity cannot be exhibited sufficiently. On the other hand, even if the concentration of the water-extracted propolis is greater than 10% by weight, the AR inhibitory activity is not improved, and the amount of the water-extracted propolis is increased.
[0017]
Next, an appropriate amount of ethanol is added to the aqueous solution. The amount of ethanol added is preferably set so that the final concentration of ethanol in the solution of water-extracted propolis and ethanol is 30-80 vol / vol%, taking into account the yield of water-extracted propolis and its AR inhibitory activity And it is more preferable to set so that it may become 60-80 vol / vol%.
[0018]
After the ethanol is added, a precipitate is formed in this aqueous solution, and this precipitate is left to stand or centrifuged to remove the precipitate. Then, a supernatant fraction with an increased concentration of phenolic organic acids is obtained. Further, the supernatant fraction is fractionated by a solvent extraction method using the polarity of the substance, and the acidic substance fraction is fractionated to obtain a water extraction propolis with a higher concentration of phenolic organic acids. It is done. Even when fractionation is performed using a gel filtration column in which a gel filtration carrier such as Sephadex is packed, a water-extracted propolis with a higher concentration of phenolic organic acids can be obtained.
[0019]
The concentration of the phenolic organic acid contained in the water extraction propolis after the alcohol extraction is 1.5 to 2 times the concentration of the phenolic organic acid contained in the water extraction propolis before the extraction. Therefore, the AR inhibitory activity of the obtained water-extracted propolis is 1.5 times stronger than the AR inhibitory activity of the water-extracted propolis before extraction. The obtained water-extracted propolis is in the form of an aqueous solution obtained by distilling the acidic substance fraction and distilling off ethanol, or in the form of a powder obtained by drying them, in the liquid form of the obtained acidic substance fraction. Used in the form.
[0020]
Further, the acidic substance fraction obtained by the solvent extraction method is further fractionated by the solvent extraction method. At this time, when the acidic substance fraction is in a liquid form, it is used as it is, or adjusted to an appropriate concentration by dilution or concentration, and when it is in a powder form, a solution dissolved in a solvent such as water or hydrous ethanol is used. use. In this case, the concentration of the acidic substance fraction is preferably set to 0.1 to 10% by weight, and more preferably set to 1 to 3% by weight. When adjusting the pH (hydrogen ion concentration) of the above solution, hydrochloric acid or sodium hydroxide is used, and other solvents such as ethyl ether, chloroform, ethyl acetate, and other acidic substances are extracted. In this case, a saturated sodium bicarbonate solution (sodium bicarbonate water), a high concentration phosphate buffer solution having a pH of 8 to 9 or the like is used as the aqueous phase.
[0021]
Accordingly, the concentration of the phenolic organic acids contained in the water extraction propolis of the acidic substance fraction obtained by the second solvent extraction method is 2 to 4 times after the first solvent extraction, and the water extraction propolis before the alcohol extraction. 3 to 8 times the concentration of phenolic organic acids contained in. Furthermore, the AR inhibitory activity is 2 to 3 times stronger than the AR inhibitory activity of water-extracted propolis before alcohol extraction.
[0022]
Next, the royal jelly will be explained. The royal jelly is a special food for the queen bee and is a milky white semi-fluid secreted from the hypopharyngeal gland of the worker bee. Its ingredients include about 65-67% water, about 11-13% protein, 5-10% lipid, other minerals and vitamins. Royal jelly has been widely used in the private sector since ancient times, and its pharmacological effects include growth promotion effects and reproductive function improvement in animal experiments, and clinical improvement in nutrition, increased appetite, blood pressure regulation, female function improvement, liver function Wide range of normalization.
[0023]
The royal jelly contains unsaturated fatty acids having a total of 10 carbon atoms. The unsaturated fatty acids are contained in raw royal jelly at about 1.4 to 2% by weight and freeze-dried royal jelly at about 5 to 7% by weight. Yes. Examples of the unsaturated fatty acid include 10-hydroxydecenoic acid, 10-hydroxydecanoic acid and 3,10-dihydroxydecanoic acid, which are reported to exhibit AR inhibitory activity.
[0024]
As a raw material for the propolis composition, the royal jelly may be used as it is, or a royal jelly that is freeze-dried and powdered may be used. Since royal jelly usually generates turbidity, so-called deproteinized royal jelly from which an inactive protein causing turbidity in the royal jelly is removed may be used. This deproteinized royal jelly can be obtained by precipitating insoluble protein with alcohol, if necessary, and then centrifuging and filtering using diatomaceous earth.
[0025]
The AR inhibitory activity exhibited by royal jelly is considered to be exhibited mainly by the unsaturated fatty acid. For this reason, it is preferable to use a royal jelly extract containing a high content of these unsaturated fatty acids in the propolis composition, and the royal jelly extract contains 20 to 40% by weight of the unsaturated fatty acids.
[0026]
The royal jelly extract is extracted from at least one selected from raw royal jelly and freeze-dried royal jelly. Moreover, in order to extract unsaturated fatty acid etc. to high concentration, organic solvents, such as alcohol, specifically ethanol are used. At that time, the ethanol concentration may be 5 to 99% by weight, and 5 to 50% by weight is preferable in consideration of extraction of color and fragrance. In addition, it is preferable to use water as the other solvent. The amount of the organic solvent used is preferably at least equal to that of royal jelly, and more preferably at least 8 times from the viewpoint of extraction efficiency of unsaturated fatty acids and the like. The royal jelly extract can be obtained by adding an aqueous ethanol solution to the royal jelly, stirring sufficiently, separating the supernatant by filtration or centrifugation, and concentrating the supernatant.
[0027]
Next, silymarin will be described. Silymarin is extracted from the seeds of milk thistle. As the action of silymarin, it has been reported that it suppresses lipid peroxidation and eliminates active oxygen, and a recent paper reports that it reduces the concentration of malondialdehyde (MDA) in the blood of patients with cirrhosis and diabetes. Has been. It is also known to have an action of regenerating hepatocytes, an action of promoting nucleic acid and protein synthesis, and an action of promoting the discharge of bile. As the anti-diabetic action of silymarin, it is considered that the effect of the antioxidant of the lens due to the antioxidant action can be expected.
[0028]
Silymarin contains many flavonoids. In particular, a group of compounds called flavonolignans is considered to be an active ingredient for each of the above-mentioned actions, and the compounds as the active ingredients are silybin, silydianin, and silyristine. The chemical formulas for these three compounds are all C₂₆H_{twenty two}O_TenIs an isomer.
[0029]
As a method for extracting silymarin, first, the seeds of milk thistle are finely ground and extracted with ethanol. Next, after concentrating the extract to remove ethanol, the oil in the concentrate is removed by centrifugation, and the resulting liquid is dried and ground to obtain silymarin.
[0030]
Therefore, the above water extraction propolis or water extraction propolis and royal jelly extract obtained by further alcohol extraction after water extraction, water extraction propolis or water extraction propolis and silymarin obtained by further alcohol extraction after water extraction, or water A propolis composition is prepared by mixing an extracted propolis or a water-extracted propolis obtained by further alcohol extraction after water extraction, a royal jelly extract, and silymarin.
[0031]
The form of the propolis composition is appropriately selected according to the purpose of use of the drug and food, and can be made into a liquid or jelly form for food and drink, and can be made into a powder form for internal use. It is also used as capsules, granules, pills, powders and tablets.
[0032]
The blending amount of the royal jelly extract and silymarin in the propolis composition is preferably set to 0.01 to 100 times on a weight basis with respect to at least one of the royal jelly extract and silymarin relative to the water-extracted propolis. More preferably, it is set to 10 times. If this blending amount is less than 0.01 times or more than 100 times, it is difficult to cause a synergistic increase in AR inhibitory activity, and it is difficult to exert a strong effect on diabetic complications.
[0033]
Furthermore, in order to effectively demonstrate the synergistic increase in AR inhibitory activity by the propolis composition, the royal jelly extract is 2 to 10 times by weight and the silymarin is 1 to 3 times by weight with respect to the water-extracted propolis. It is particularly preferred that it is set. Further, when both the royal jelly extract and silymarin are mixed with the water extraction propolis, it is particularly preferable that the royal jelly extract is set to 2 to 10 times on a weight basis and the silymarin is set to 1 to 3 times on a weight basis.
[0034]
In addition to the above-mentioned components, additives such as gelling agents, fragrances, preservatives, antioxidants, colorants, refreshing agents, bactericides, and pH adjusters may be appropriately added to the propolis composition. Is possible.
[0035]
Next, the effect exhibited by the above embodiment will be described.
(1) The propolis composition is prepared by mixing water extraction propolis or water extraction propolis obtained by further alcohol extraction after water extraction and at least one selected from royal jelly extract and silymarin. Therefore, by containing each component having AR inhibitory activity at the same time, the anti-diabetic action is synergistically increased, and the effect of suppressing the onset and progress of diabetic complications can be effectively achieved with a small amount of propolis composition used. Can be demonstrated. Moreover, the effect | action which suppresses onset and progress of diabetes itself can be exhibited effectively. Furthermore, it is easy to handle and can enable continuous administration for a long period of time, which can lead to a permanent improvement in constitution.
[0036]
(2) Water extraction propolis or water extraction propolis obtained by further alcohol extraction after water extraction, royal jelly extract and silymarin can all be obtained at low cost, so that a propolis composition can be manufactured at low cost. .
[0037]
(3) Water extraction propolis or water extraction propolis obtained by further alcohol extraction after water extraction, royal jelly extract, and silymarin can be obtained by using extracts extracted by known extraction methods. Can be administered in various forms such as a powder, powder, liquid, capsule, granule, pill, powder and tablet.
[0038]
(4) Among the propolis, since water-extracted propolis or water-extracted propolis obtained by further alcohol extraction after water extraction is used, the AR inhibitory activity in the propolis composition is compared with the case of using the propolis bulk. A large amount of phenolic organic acids exhibiting the above can be contained. Therefore, the amount of water-extracted propolis to the propolis composition can be reduced, and the action of suppressing the onset and progress of diabetes itself and diabetic complications can be more effectively exhibited.
[0039]
(5) As the royal jelly, a royal jelly extract containing 20 to 40% by weight of 10-hydroxydecenoic acid, 10-hydroxydecanoic acid and 3,10-dihydroxydecanoic acid exhibiting AR inhibitory activity was used. Therefore, the amount of royal jelly used for the propolis composition can be reduced compared to the case where royal jelly is used, and the effect of suppressing the onset and progression of diabetes itself and diabetic complications is more effectively exhibited. be able to.
[0040]
(6) The blending amounts of the royal jelly extract and silymarin were set to 0.01 to 100 times on a weight basis with respect to the water-extracted propolis, respectively. Therefore, the synergistic increase effect of the effect on diabetes itself and diabetic complications can be surely exhibited.
[0041]
【Example】
Hereinafter, the embodiment will be described in detail using examples and comparative examples.
(Comparative Example 1)
200 kg of Brazilian propolis bulk was pulverized with a pulverizer, and 4000 liters of 95 vol / vol% ethanol was added thereto, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 4 days with occasional stirring. Thereafter, the supernatant was separated and removed by filtration to obtain an ethanol-washed propolis bulk. Next, 300 liters of warm water was added to 50 kg of the obtained ethanol-washed propolis ingot, and extraction was performed at 45 ° C. for 5 hours with constant stirring, followed by solid-liquid separation with a bucket-type centrifuge. Obtained. After adding 35 kg of diatomaceous earth to this separated liquid and stirring, it filtered and the filtrate was obtained. The filtrate was concentrated and then dried by freeze vacuum drying to obtain 2200 g of dry powder of water-extracted propolis.
[0042]
(Comparative Example 2)
After adding 9 liters of 60 ° C. warm water to 180 g of the dry powder of water-extracted propolis obtained in Comparative Example 1 and stirring for 1 hour, 21 liters of ethanol was added and stirred for another 2 hours. And this water-ethanol solution was left overnight at room temperature, the deposit was settled, and the supernatant fraction was fractionated. The supernatant fraction was concentrated and dried under reduced pressure to obtain 95 g of a dry powder of water-extracted propolis obtained by further alcohol-extracting the water-extracted propolis.
[0043]
(Comparative Example 3)
After 17.5 liters of the supernatant fraction of the filtrate obtained in Comparative Example 1 was concentrated to 3.5 liters, the concentrated solution was adjusted to pH 3 with hydrochloric acid. Add 3.6 liters of ethyl acetate to this adjustment liquid and separate into an aqueous phase and an ethyl acetate phase using a separatory funnel, and again add 3.6 liters of ethyl acetate to the resulting aqueous phase. The operation was performed twice more. The ethyl acetate phases were combined into one, concentrated to 1.2 liters, and the concentrated solution was adjusted to pH 9 with sodium hydroxide.
[0044]
1.25 liter of saturated sodium hydrogen carbonate solution is added to this adjustment solution, and the solution is divided into a sodium hydrogen carbonate solution phase and an ethyl acetate phase using a separatory funnel, and the resulting ethyl acetate phase is mixed with a saturated sodium hydrogen carbonate solution 1 25 liters were added again, and the same separation operation as described above was further performed twice. The saturated sodium bicarbonate solution phase was combined and adjusted to pH 2.8 with hydrochloric acid.
[0045]
3.8 liters of ethyl acetate was added to this adjustment liquid, and the solution was separated into a sodium hydrogen carbonate solution phase and an ethyl acetate phase using a separatory funnel, and 3.8 liters of ethyl acetate was added to the obtained sodium hydrogen carbonate solution phase. Again, the same separation operation as described above was performed once more. The ethyl acetate phases were concentrated together and concentrated, dried under reduced pressure and extracted with water, and then 170 g of dry powder of water-extracted propolis obtained by further alcohol-extracting the water-extracted propolis was obtained.
[0046]
(Comparative Example 4)
To 10 kg of lyophilized royal jelly, 50 liters of 95 vol / vol% ethanol was added and stirred at room temperature. The supernatant was separated and removed by filtration and concentrated under reduced pressure to obtain 950 g of a royal jelly extract as a solid.
[0047]
(Comparative Example 5)
After pulverizing 3 kg of Bulgarian milk thistle seeds with a pulverizer, 30 liters of 99 vol / vol% ethanol was added and stirred at room temperature. The supernatant was separated and removed by filtration, the residue was extracted again with ethanol, the extract was filtered, and the supernatant was fractionated. The supernatants were combined and concentrated under reduced pressure, and the oil and fat content and solid content were further separated by centrifugation to obtain a silymarin extract having a solid content of 375 g.
[0048]
(Example 1)
The propolis composition of Example 1 was prepared by mixing the water-extracted propolis dry powder obtained in Comparative Example 1 and the royal jelly extract obtained in Comparative Example 4 at a weight ratio of 1: 5.
[0049]
(Example 2)
The propolis composition of Example 2 was prepared by mixing the water-extracted propolis dry powder obtained in Comparative Example 1 and the silymarin extract obtained in Comparative Example 5 at a weight ratio of 1: 2.
[0050]
(Example 3)
Implemented by mixing the water-extracted propolis dry powder obtained in Comparative Example 1, the royal jelly extract obtained in Comparative Example 4 and the silymarin extract obtained in Comparative Example 5 in a weight ratio of 1: 5: 2. The propolis composition of Example 3 was obtained.
[0051]
(Example 4)
The propolis composition of Example 4 was prepared by mixing the water-extracted propolis dry powder obtained in Comparative Example 2 and the royal jelly extract obtained in Comparative Example 4 at a weight ratio of 1: 5.
[0052]
(Example 5)
The propolis composition of Example 5 was prepared by mixing the water-extracted propolis dry powder obtained in Comparative Example 2 and the silymarin obtained in Comparative Example 5 at a weight ratio of 1: 2.
[0053]
(Example 6)
Example of mixing water-extracted propolis dry powder obtained in Comparative Example 2, Royal Jelly Extract obtained in Comparative Example 4 and Silymarin obtained in Comparative Example 5 in a weight ratio of 1: 5 to 2. 6 propolis composition.
[0054]
(Example 7)
The propolis composition of Example 7 was prepared by mixing the water-extracted propolis dry powder obtained in Comparative Example 3 and the royal jelly extract obtained in Comparative Example 4 at a weight ratio of 1: 5.
[0055]
(Example 8)
The propolis composition of Example 8 was prepared by mixing the water-extracted propolis dry powder obtained in Comparative Example 3 and the silymarin obtained in Comparative Example 5 at a weight ratio of 1: 2.
[0056]
Example 9
What mixed 1 to 5 to 2 weight ratio of the water extraction propolis dry powder obtained by the comparative example 3, the royal jelly extract obtained by the comparative example 4, and the silymarin obtained by the comparative example 5 Example 9 propolis compositions were obtained.
[0057]
(Test Example 1)
(AR inhibitory activity test)
About each water extraction propolis dry powder obtained in Comparative Examples 1-5, AR inhibitory activity was measured.
[0058]
First, the AR inhibitory activity test method will be described. Ten fresh beef lenses were cut into small pieces with scissors, and cooled and added with PBS (phosphate-buffered saline) containing 5 volumes of 1 mM-2-mercaptoethanol, and homogenized while cooling. This homogenate solution was centrifuged at 18,000 g for 30 minutes at 4 ° C., and the supernatant was collected to obtain a crude AR extract.
[0059]
Next, 0.4 ml of AR crude extract, 2.0 ml of PBS containing 100 mM lithium sulfate, 0.2 ml of 1.5 mM NADPH, and each water obtained in Comparative Examples 1 to 5 were placed in a cell for absorbance measurement. Add 0.2 ml of a solution obtained by dissolving the extracted propolis dry powder in water, and mix by inverting. Subsequently, the cell is preincubated at 25 ° C. for 10 minutes, and 0.2 ml of a 75 mM DL-glyceraldehyde solution is added and mixed by inversion. The absorbance change at 340 nm was recorded for 5 minutes at 25 ° C. for this sample solution (total 3.0 ml). The change in absorbance per minute was calculated from this measurement record, and the AR inhibition rate (%) was calculated according to the following formula.
[0060]
AR inhibition rate = {1− (ΔAs−ΔAb) / (ΔAc−ΔAb)} × 100
ΔAb: Absorbance change per minute when PBS containing 100 mM lithium sulfate was used instead of the lysate and DL-glyceraldehyde solution
ΔAc: Change in absorbance per minute when PBS containing 100 mM lithium sulfate was used instead of the lysate
ΔAs: change in absorbance of sample solution per minute
Furthermore, from the relationship between the concentration of the water-extracted propolis dry powder in the sample solution and the AR inhibition rate, the concentration that inhibits AR activity by 50% (IC₅₀) The results are shown in Table 1.
[0061]
These enzyme preparation methods and activity measurement methods are well-known methods (Archives of Biochemistry and Biophysics, 216 (1), 337-344, 1982, The journal of Antibiotics, 48 (11), 1345-1346, 1995).
[0062]
[Table 1]

As shown in Table 1, AR inhibitory activity was observed in any of Comparative Examples 1-5. As for water-extracted propolis, as it is refined and contains more phenolic organic acids, IC₅₀Therefore, it was shown that AR inhibitory activity can be exhibited with a small amount of water-extracted propolis.
[0063]
(Test Example 2)
(Rat Diabetic Cataract Test)
In order to examine the effects of water-extracted propolis, royal jelly extract and silymarin on diabetic complications, a model experiment using rats was carried out for diabetic cataract in which AR is involved in the onset and progression of the disease.
[0064]
First, a feed containing a commercially available powdered feed (CRF-1 manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.) and D-galactose is prepared. Further, in each Comparative Example and Example, the formulation shown in Table 2 for the feed Water extraction propolis, royal jelly extract and silymarin were blended in proportions. In addition, in Comparative Examples 1-5 and Examples 1-9, D-galactose was mix | blended so that it might become 25 times on a weight basis with respect to water extraction propolis. In addition, the control example 1 gave the feed which mix | blended only D-galactose with the commercially available powdered feed, and the control example 2 gave only the commercially available powdered feed as a feed.
[0065]
Next, in Comparative Examples 1 to 5, Examples 1 to 9, and Control Examples 1 and 2, the above diet was freely ingested for 14 days with respect to male Sprague-Dawley rats (weight around 90 g, 6 per group). After galactose-induced diabetic cataract rats, they were subjected to dissection.
[0066]
[Table 2]

Subsequently, 0.5% tropicamide ophthalmic solution (Wakamoto Pharmaceutical Co., Ltd.) was instilled into the eyes of the galactose-induced diabetic cataract rat. For the determination of cataract, the turbidity of the lens was evaluated according to Sippel's method (Invest. Ophthalmol., 5,568-578, 1966) (Score 0, 1, 2, 3, 4). Furthermore, the cataract suppression rate (%) was calculated from the obtained score according to the calculation formula shown below.
[0067]
Cataract suppression rate (%) = {(score average value of control example 1−score average value of comparative example or example) / (score average value of control example 1)} × 100
Further, after observing the turbidity of the lens, the eyeball was extracted, and the lens was further separated to prepare a measurement sample of the GSH content (μg / lens). The GSH content was measured according to a fluorescence method using O-phthalaldehyde (Analytical biochemistry, 74, 214-226, 1976). Furthermore, the suppression rate (%) which suppresses the reduction | decrease effect of GSH content from the GSH content of the obtained lens was computed according to the calculation formula shown below.
[0068]
Inhibition rate (%) = {(average value of GSH content of comparative example or example−average value of GSH content of control example 1) / (average value of GSH content of control example 2−average value of GSH content of control example 1)} × 100
Statistical treatment uses Student t-test, * in the table indicates that the significant difference with respect to Control 1 is a risk factor of 5% or less, and ** indicates that the significant difference with respect to Control 1 is 1% or less. Indicates a risk factor.
[0069]
The results are shown in Tables 3-6.
[0070]
[Table 3]

As shown in Table 3, all of Comparative Examples 1 to 5 suppressed the turbidity of the crystalline lens in the observation of cataract, but the suppression effect was mild except for Comparative Example 3. Moreover, in the comparison of Comparative Examples 1-3, the strong effect was recognized by the comparative example 3 with the highest content of phenolic organic acids. The GSH content in the lens was significantly higher in all of Comparative Examples 1-5 than in the control example.
[0071]
[Table 4]

As shown in Table 4, Examples 1 to 3 markedly suppressed the degree of cataract compared to each Comparative Example, and the lens GSH content was also significantly recovered compared to each Comparative Example. This effect means that when the water-extracted propolis contains at least one of royal jelly extract and silymarin at the same time, the AR inhibitory activity is synergistically exhibited.
[0072]
[Table 5]

[0073]
[Table 6]

As shown in Tables 5 and 6, when any of Examples 4 to 6 and Tables 7 to 9 contains at least one of royal jelly extract and silymarin at the same time in the water extraction propolis as in the results of Table 4. This means that the AR inhibitory activity is exerted synergistically. Moreover, when the phenolic organic acid content of water extraction propolis was high, AR inhibitory activity was further increased.
[0074]
The technical idea grasped from the embodiment will be described below.
The propolis composition according to any one of claims 1 to 4 is processed into a predetermined shape and has an action of suppressing the onset and progression of diabetic complications. Food. When comprised in this way, the effect | action which suppresses the onset and progress of diabetic complication can be exhibited effectively, taking as food.
[0075]
The propolis composition according to any one of claims 1 to 4, wherein the royal jelly is a royal jelly extract obtained by extracting at least one selected from raw royal jelly and freeze-dried royal jelly with alcohol. When configured in this way, the royal jelly extract contains a high amount of unsaturated fatty acids, so the amount of royal jelly used in the propolis composition can be reduced, and the effect of suppressing the onset and progression of diabetic complications is further improved. It can be demonstrated effectively.
[0076]
-The manufacturing method of the propolis composition prepared by mixing at least 1 sort (s) chosen from royal jelly and silymarin with respect to propolis. When comprised in this way, the propolis composition which can exhibit the effect | action which suppresses onset and progress of a diabetic complication effectively with a small usage-amount can be manufactured easily.
[0077]
【The invention's effect】
As described above in detail, according to the present invention, the following effects are exhibited.
Claims 1 to5According to the invention described in any one of the above, the effect of suppressing the onset and progress of diabetic complications can be effectively exhibited with a small amount of use.
[0078]
According to the invention described in claim 4, it is possible to reliably cause a synergistic increase effect of the effect on the complication of diabetes. Furthermore, it can be easily processed into various forms, and can be administered in various forms.

Claims

In propolis composition for inhibiting the onset and progression of diabetic complications by administration, propolis composition characterized with propolis, to become more and at least one selected from royal jelly, and silymarin.

The propolis composition according to claim 1, wherein the propolis is a water extraction propolis obtained by extracting water from a raw material propolis or a water extraction propolis obtained by further alcohol extraction of the water extraction propolis.

The propolis composition according to claim 1 or 2, wherein the royal jelly contains 20 to 40% by weight of unsaturated fatty acids having 10 carbon atoms in total.

The compounding quantity of at least 1 sort (s) chosen from the said royal jelly and silymarin is set to the quantity of 0.01-100 times on a weight basis with respect to propolis, The Claim 1 any one of Claims 1-3. Propolis composition.

The propolis composition according to claim 1 or 2, which contains at least the silymarin.