JP3665707B2

JP3665707B2 - Ｄｎａセンサおよびｄｎａの検出方法

Info

Publication number: JP3665707B2
Application number: JP32447498A
Authority: JP
Inventors: 繁織竹中
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1998-10-28
Filing date: 1998-10-28
Publication date: 2005-06-29
Anticipated expiration: 2018-10-28
Also published as: JP2000125865A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、電極型ＤＮＡセンサおよび該電極型ＤＮＡセンサを用いて試料ＤＮＡから特定の塩基配列を有するＤＮＡの存在の有無を検出する方法に関する。
【従来の技術】
生物学、医学分野での遺伝子解析においては、特定の塩基配列を有するＤＮＡを検出する方法として、ハイブリダイゼーション法が用いられている。
【０００２】
この中でも特に、目的とする遺伝子を特異的に検出する方法として、サザンハイブリダイゼーション法（サザンブロッティング法）が一般的に用いられている。サザンハイブリダイゼーション法では、まず試料ＤＮＡを一種類以上の制限酵素でフラグメントとし、アガロースゲル電気泳動あるいはポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけてその分子量サイズによって分画ごとに分離する。次に、分離した試料ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに変性した後、ナイロン・フィルターもしくはニトロセルロース・ペーパー等に固定化する。そして、その変性された一本鎖ＤＮＡと、放射性同位元素（以下、ＲＩという）でラベルされた塩基対を形成する相補的な一本鎖ＤＮＡ（以下、プローブＤＮＡという）とをハイブリダイズさせた後、フィルターを洗浄する。洗浄後、該フィルター等をオートラジオグラフにかけ、現像することによってプローブＤＮＡとハイブリダイズする特定の配列を有するＤＮＡを検出することができる。
【０００３】
しかし、上記のサザンハイブリダイゼーション法を含めた従来法は、何れも標識としてＲＩを用いるため、放射性物質取り扱い施設とその維持管理に多大な費用と労力を要するばかりでなく、取り扱い者の健康の点で問題がある。また、オートラジオグラフによって、バンドとして検出するためには、２４時間以上の長時間を必要とし、試料ＤＮＡの量が少ない場合には、さらに時間を要し、バンドが不明確となる等の問題点を有する。
【０００４】
一方、サザンハイブリダイゼーション法において、ＲＩの代わりに蛍光を用いる方法も知られている。この方法は、安全性と迅速さにおいてＲＩより優れている。また、蛍光法による、スライドガラスやシリコン等の基板に多数のＤＮＡ分子を整列させたＤＮＡチップ技術も既に実用化されている。
しかし、励起光による褪色が起こること、測定には専用の蛍光測定装置が必要であること、蛍光の内部消光のために一定量以上の蛍光物質を導入することは困難であること等の欠点を有する。
【０００５】
また、発光にてＤＮＡを検出する方法も実用されているが、蛍光法と同様に測定に専用の発光測定装置が必要とされる。
【０００６】
上記の問題点を解決する方法として、プローブＤＮＡを電極型センサに適用する方法が開示されている（特開平９−２８８０８０号公報および第５７回分析化学討論会予稿集、ｐ１３７〜１３８（１９９６年））。即ち、出力端子を備えた電極であって、プローブＤＮＡが固定された電極と試料ＤＮＡ（断片化が不要）とを、インターカレータ存在下に反応させ、反応後の電極の電流を測定することにより、プローブＤＮＡと試料ＤＮＡとで形成されるハイブリッドＤＮＡの存在を検出あるいはハイブリッドＤＮＡの量を測定する方法である。インターカレータとしては、特に、酸化還元活性を持ったフェロセン化合物が用いられ、これは、ハイブリッドＤＮＡに特異的に結合することが知られている。
【０００７】
上記のインターカレータ型ＤＮＡセンサでは、リアルタイムでハイブリッドＤＮＡの検出が簡便に高感度で行える。分画処理も不要で、蛍光色素の褪色という問題もない。本方法の装置は、プローブＤＮＡが固定されてなる電極が一個のみである。即ち、そのプローブＤＮＡが固定されてなる電極に、一本鎖に解離させた試料ＤＮＡを添加し反応させ、相補性を判断するものである。
しかし、遺伝子発現のモニタリング、ＤＮＡ塩基配列の決定、遺伝子変異解析、遺伝子多型解析等を効率的に行うためには、上記の電極型センサでは、実用化レベルを十分満足するとは言い難い。そこで、上記の電極型センサ法をＤＮＡチップ技術に近づけることが一つの解決策である。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、インターカレータ型ＤＮＡセンサであって、同時に複数個の特定の塩基配列を有するプローブＤＮＡと相補性を有する試料ＤＮＡを検出することが可能なＤＮＡセンサ、およびその相補性ＤＮＡの存在の有無の検出方法を提供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者の研究により、各々外部に出力する端子を備えた二以上の電極表面の各々に互いに異なる塩基配列部位を有し、導電性物質で修飾されていないプローブＤＮＡが固定されてなることを特徴とする、電気化学的活性縫い込み型インターカレータと組合せて用いて該プローブＤＮＡに相補性を有する一本鎖のＤＮＡの存在の有無を電気化学的に検出するＤＮＡの検出方法に用いるためのＤＮＡセンサが上記の問題を解決できることが判明した。
【００１０】
また、各々外部に出力する端子を備えた二以上の電極表面の各々に互いに異なる塩基配列部位を有し、導電性物質で修飾されていないプローブＤＮＡが固定されてなるＤＮＡセンサおよび電気化学的活性縫い込み型インターカレータからなるＤＮＡ検出キットも上記の課題を解決できることが分かった。
【００１１】
さらに、各々外部に出力する端子を備えた二以上の電極表面の各々に互いに異なる塩基配列部位を有し、導電性物質で修飾されていないプローブＤＮＡが固定されてなるＤＮＡセンサ上にて、該プローブＤＮＡと一本鎖に解離させた試料ＤＮＡとを電気化学活性縫い込み型インターカレータの存在下に結合させ、該プローブＤＮＡと該試料ＤＮＡとによって形成されたハイブリッドＤＮＡに縫い込まれた該インターカレータに流れる電流を測定することによって、あるいは該プローブＤＮＡと該試料ＤＮＡとでハイブリッドさせたＤＮＡに該インターカレータを結合させ、ハイブリッドＤＮＡに縫い込まれた該インターカレータに流れる電流を測定することによって、試料ＤＮＡを検出するＤＮＡ中のプローブＤＮＡに相補性を有するＤＮＡの存在の有無の検出方法によっても上記の課題を解決できることが分かった。
【００１２】
ＤＮＡの検出方法の好ましい態様は、以下の通りである。
（１）プローブＤＮＡの塩基配列が既知であって、そのプローブＤＮＡを使用することを特徴とするＤＮＡの検出方法。
（２）電気化学活性縫い込み型インターカレータが、酸化還元活性を有する物質であることを特徴とするＤＮＡの検出方法。
（３）電気化学活性縫い込み型インターカレータが、フェロセン修飾電気化学活性縫い込み型インターカレータであることを特徴とするＤＮＡの検出方法。
【００１３】
【発明の実施の形態】
図１は、各々外部に出力する端子を備えた二以上の電極表面の各々に互いに異なる塩基配列部位を有し、導電性物質で修飾されていないプローブＤＮＡが固定されてなるＤＮＡセンサである。
図１に示すように、本発明のＤＮＡセンサは、外部に出力する端子（３）を備えた一つの電極（１）表面の各々に、一本鎖のプローブＤＮＡ（２）が固定されており、このような電極（１）が一定面積上に二つ以上並んでなることを特徴とする。各々の電極（１）表面に固定されている一本鎖のプローブＤＮＡ（２）は、互いに異なる塩基配列部位を有している。
【００１４】
電極としては、ＤＮＡを固定できるものが好ましい。金、グラシーカーボンもしくは炭素を用いることがさらに好ましい。電極の面積は、一定であることが好ましい。電極の数は、二以上の複数であれば特に制限されない。
【００１５】
プローブＤＮＡとしては、生物試料から抽出したＤＮＡを制限酵素で切断し、電気泳動による分離等で精製したＤＮＡあるいは化学合成で得られた一本鎖のＤＮＡを用いることができる。生物試料から抽出したＤＮＡの場合には、熱処理あるいはアルカリ処理によって、一本鎖のＤＮＡに解離させておくことが好ましい。これらの一本鎖のＤＮＡの配列は、周知のＤＮＡ配列決定法により、予め決定しておくことが好ましい。
【００１６】
上記の一本鎖のＤＮＡは、電極に固定する。固定化方法としては、公知の方法が用いられる。電極が金である場合、該ＤＮＡの５’−もしくは３’−末端（好ましくは、５’−末端）にチオール基を導入し、金とイオウとの配位結合を介して、該ＤＮＡが電極に固定される。該ＤＮＡにチオール基を導入する方法は、文献（Ｍ．Ｍａｅｄａｅｔａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１８０５〜１８０８（１９９４）およびＢ．Ａ．Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１３，４４８４（１９８５））に記載されている。即ち、上記の方法によって得られたチオール基を有する該ＤＮＡを金電極に滴下し、低温下で数時間放置することによって該ＤＮＡが電極に固定され、プローブＤＮＡが作製される。
電極がグラシーカーボンである場合、グラシーカーボンを過マンガン酸カリウムで酸化することによって、電極表面にカルボン酸基を導入する。次いで、該ＤＮＡはアミド結合により電極表面に固定される。実際の固定化方法については、文献（Ｋ．Ｍ．Ｍｉｌｌａｎｅｔａｌ．，ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，６５，２３１７〜２３２３（１９９３））に詳細が記載されている。
【００１７】
本発明は、図２に示すように、二以上のアレイから構成されるＤＮＡセンサおよび電気化学活性縫い込み型インターカレータ（４）からなるＤＮＡ検出キットと考えることもできる。よって、該ＤＮＡ検出キットに、遺伝病等の検体として、試料ＤＮＡ（５）を添加することにより検体の遺伝子を迅速に定性もしくは定量することが可能となる。
【００１８】
本発明のＤＮＡの検出方法では、一本鎖に解離させた試料ＤＮＡ（５）と各々のプローブＤＮＡ（２）とのハイブリダイゼーションを、アレイの数だけ、同時に行うことができる。ハイブリダイゼーションは、電気活性縫い込み型インターカレータ（４）の存在下に行うことが好ましい。
【００１９】
あるいは、本発明のＤＮＡの検出方法では、一本鎖に解離させた試料ＤＮＡ（５）と各々のプローブＤＮＡ（２）とで予めハイブリッドさせておいたＤＮＡに、電気化学活性縫い込み型インターカレータ（４）を結合させることも好ましく行われる。
【００２０】
電気化学活性縫い込み型インターカレータ（４）は、数ｎＭ〜数ｍＭの濃度範囲で用いられることが好ましい。該インターカレータ（４）は、該プローブＤＮＡ（２）と該試料ＤＮＡ（５）とのハイブリダイゼーションの速度を促進すると共に、形成されたハイブリッドＤＮＡに高い特異性で結合し、該ハイブリッドＤＮＡを安定化する。ハイブリッドＤＮＡが形成されない場合には、該インターカレータ（４）は、一本鎖のままの遊離のＤＮＡ（７）に結合しないかあるいは一旦結合してもすぐに解離して、遊離のインターカレータ（６）となる。
【００２１】
電気化学活性縫い込み型インターカレータは、酸化還元活性を有する物質であり、かつハイブリッドＤＮＡの二本鎖に縫い込まれる構造を有する物質であることが好ましい。
酸化還元活性部として好ましくは、フェロセン化合物、カテコールアミン化合物、金属ビピリジン錯体、金属フェナンスリン錯体もしくはビオローゲン化合物である。さらに好ましくは、フェロセン化合物である。
縫い込み型インターカレータ部分として好ましくは、ナフタレンジイミド、アントラセン、アントラキノン等である。
よって、好ましく用いられる該インターカレータは、フェロセンカルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと対応するアミン体との反応により合成される下記式で表されるフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体（Ｓ．Ｔａｋｅｎａｋａｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｏｍｍｕｎ．，１１１１（１９９８））である。
【００２２】
【化１】

【００２３】
また、下記式で表されるフェロセン化ナフタレンジイミド誘導体も好ましく用いられる。
【００２４】
【化２】

【００２５】
但し、Ａは下記式で表されるフェロセン誘導体である。
【００２６】
【化３】

【００２７】
【化４】

【００２８】
【化５】

【００２９】
【化６】

【００３０】
電気活性縫い込み型インターカレータには、酸化還元活性部分と縫い込み型インターカレータ部分とを繋ぐリンカー部分がある。上記式で表される１，４−ジプロピルピペラジン基がリンカー部分に相当する。このピペラジン基の代わりに、二価の四級アミン基を導入することもできる。四級アミン基を導入した下記式で表される化合物は、反応溶液中のｐＨに依らずカチオン性となるために、ハイブリッドＤＮＡとの結合がより強くなる。
【００３１】
【化７】

【００３２】
電気活性縫い込み型インターカレータとして上記のナフタレンジイミド誘導体を用いた場合、ナフタレンジイミド誘導体は、二塩基おきに配列してハイブリッドＤＮＡに飽和している。このことは、ナフタレンジイミド誘導体の二つのフェロセン部分が、それぞれ、ハイブリッドＤＮＡの主溝と副溝とに密に並んだ状態を意味している。このため、ナフタレンジイミド誘導体は、ハイブリッドＤＮＡからの解離速度が極めて遅くなる。ここで、ナフタレンジイミド誘導体のハイブリッドＤＮＡへの結合がインターカレーションモードであることは、アレイにインターカレータおよび試料ＤＮＡを添加したときに、粘度の変化が認められたことにより決定した。閉環状プラスミド（例えば、ウイルスＳＶ４０）の場合、インターカレーションが起こると超らせんの変化に伴って粘度も変化することが知られている。
【００３３】
試料ＤＮＡは、嚢胞性線維症等の遺伝病の患者より抽出したＤＮＡを、熱処理あるいはアルカリ処理によって、一本鎖のＤＮＡに解離させて使用することが好ましい。必要であれば、制限酵素で切断し、電気泳動による分離等で精製してもよい。制限酵素で切断を受けた試料ＤＮＡは、複数個のＤＮＡ断片となるが、プローブＤＮＡとの接触に使用されるＤＮＡ断片は、一つであっても複数個であってもよい。試料ＤＮＡは、数１０^-18 〜数１０^-10 モルの範囲で用いられることが好ましく、数１０^-15 〜数１０^-12 モルの範囲で用いられることが特に好ましい。
【００３４】
ハイブリダイゼーション終了後、電極を洗浄し、遊離のインターカレータを除去しておくことが好ましい。
【００３５】
プローブＤＮＡと試料ＤＮＡとの反応の結果は、電極に流れる電気量を測定することにより判断する。電気量の測定には、電位をかけて流れる電流を測定できる方法であれば何れの方法も用いることができる。サイクリックボルタンメトリー、デファレンシャルパルスボルタンメトリー、ポテンショスタット等が好ましく用いられる。
【００３６】
【実施例】
［実施例１］プローブＤＮＡが固定されてなる電極の作成
二つのアレイよりなるＤＮＡセンサを作成した。面積が２．２５ｍｍ² の各々の電極に固定されるＤＮＡとしては、それぞれ下記式で表される、正常遺伝子の１８量体（Ｎ）および嚢胞性線維症の患者の遺伝子の１８量体（Ａ）を用いた。
ここで用いた嚢胞性線維症の原因遺伝子は、塩素イオン・チャンネルであり、嚢胞性線維症の患者では、５０８番目のフェニルアラニンの欠損という嚢胞性線維症膜貫通型調節蛋白の突然変異が認められている遺伝子である。
各１８量体のチオール化および金電極表面への固定化は、文献（Ｂ．Ａ．Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１３，４４８４（１９８５）、特開平９−２８８０８０号公報）に従って行い、それぞれ、プローブＤＮＡ（ｐＮ）、プローブＤＮＡ（ｐＡ）を得た。
【００３７】
正常遺伝子の１８量体（Ｎ）：
５’−ＧＡＡ−ＡＣＡ−ＣＣＡ−ＡＴＧ−ＡＴＧ−ＡＴＡ−３’
【００３８】
嚢胞性線維症の患者の遺伝子の１８量体（Ａ）：
５’−ＧＡＡ−ＡＣＡ−ＣＣＡ−ＡＴＧ−ＡＴＡ−ＴＴＴ−３’
【００３９】
［実施例２］ハイブリッドＤＮＡの検出
（１）下記式のフェロセン修飾縫い込み型インターカレータは、特開平９−２８８０８０号公報に従って合成した。
【００４０】
【化８】

【００４１】
（２）実施例１で得られたプローブＤＮＡ（ｐＮ）およびプローブＤＮＡ（ｐＡ）のそれぞれの電極を、０．５ｍＭのフェロセン修飾縫い込み型インターカレータおよび２９ピコモルの一本鎖の異常遺伝子（ｓＡ）を含む３０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）−４１ｍＭ酢酸カリウム／酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）の混合液に浸し、４０℃にて１０分間インキュベートさせた。但し、一本鎖の異常遺伝子（ｓＡ）は、実施例１と同じ遺伝子を用いた。
【００４２】
（３）反応終了後、上記の各々の電極表面を５秒間、３０％ＤＭＳＯ−４１ｍＭ酢酸カリウム／酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）の混合液で洗浄し、遊離のインターカレータおよび一本鎖の異常遺伝子（ｓＡ）を除去した。
【００４３】
（４）（３）により洗浄処理した各々の電極のサイクリックボルタモグラムを測定した。測定は、３０％ＤＭＳＯ−４１ｍＭ酢酸カリウム／酢酸緩衝液（ｐＨ５．２）の混合液中で、スキャン速度１００ｍＶ／秒の条件で行った。その結果、プローブＤＮＡ（ｐＡ）に一本鎖の異常遺伝子（ｓＡ）が結合した電極のインターカレータに由来する６１９ｍＶの増加電流は、０．１５μＡであることが認められた。また、プローブＤＮＡ（ｐＮ）の電極では、増加電流は認められなかった。従って、プローブＤＮＡ（ｐＡ）と該異常遺伝子（ｓＡ）とがハイブリッドＤＮＡを形成したことが分かった。
【００４４】
実施例２より、試料として用いた異常遺伝子（ｓＡ）の配列は、下記式で表される配列の一部を含んでいることが分かった。
【００４５】
３’−ＣＴＴ−ＴＧＴ−ＧＧＴ−ＴＡＣ−ＴＡＴ−ＡＡＡ−５’
【００４６】
また、塩基配列の異なったプローブＤＮＡを固定させたアレイの数をさらに増やすことによって、構造が未知である遺伝病等の遺伝子の、プローブＤＮＡに対する相補性を、数多くの場合について一度に決定することが可能になる。
【００４７】
【発明の効果】
本発明の二以上の電極表面にＤＮＡが固定されてなるＤＮＡセンサにより、効率的に遺伝子発現のモニタリング、ＤＮＡ塩基配列の決定等を行うことが可能になる。本発明のＤＮＡセンサを用いるＤＮＡの検出方法は、生物学、医学分野での遺伝子解析において、特定の配列を有するＤＮＡを検出する手段としては、実用化レベルを満足すると言える。
【図面の簡単な説明】
【図１】二以上の電極表面に互いに異なる塩基配列部位を有するプローブＤＮＡが固定されてなるＤＮＡセンサの模式図である。
【図２】形成されたハイブリッドＤＮＡに電気化学活性縫い込み型インターカレータが結合した模式図、あるいはハイブリッドＤＮＡが形成されなかった場合に試料ＤＮＡおよび該インターカレータが遊離している模式図である。
【符号の説明】
１電極
２プローブＤＮＡ
３出力する端子
４電気活性縫い込み型インターカレータ
５試料ＤＮＡ
６遊離のインターカレータ
７遊離の試料ＤＮＡ

Claims

各々外部に出力する端子を備えた二以上の電極表面の各々に互いに異なる塩基配列部位を有し、導電性物質で修飾されていないプローブＤＮＡが固定されてなることを特徴とする、電気化学的活性縫い込み型インターカレータと組合せて用いて該プローブＤＮＡに相補性を有する一本鎖のＤＮＡの存在の有無を電気化学的に検出するＤＮＡの検出方法に用いるためのＤＮＡセンサ。
各々外部に出力する端子を備えた二以上の電極表面の各々に互いに異なる塩基配列部位を有し、導電性物質で修飾されていないプローブＤＮＡが固定されてなるＤＮＡセンサおよび電気化学活性縫い込み型インターカレータからなるＤＮＡ検出キット。
各々外部に出力する端子を備えた二以上の電極表面の各々に互いに異なる塩基配列部位を有し、導電性物質で修飾されていないプローブＤＮＡが固定されてなるＤＮＡセンサ上にて、該プローブＤＮＡと一本鎖に解離させた試料ＤＮＡとを電気化学活性縫い込み型インターカレータの存在下に結合させ、該プローブＤＮＡと該試料ＤＮＡとによって形成されたハイブリッドＤＮＡに縫い込まれた該インターカレータに流れる電流を測定することによって、あるいは該プローブＤＮＡと該試料ＤＮＡとでハイブリッドさせたＤＮＡに該インターカレータを結合させ、ハイブリッドＤＮＡに縫い込まれた該インターカレータに流れる電流を測定することによって、試料ＤＮＡ中のプローブＤＮＡに相補性を有するＤＮＡの存在の有無を検出するＤＮＡの検出方法。
プローブＤＮＡの塩基配列が既知であって、そのプローブＤＮＡを使用することを特徴とする請求項３に記載のＤＮＡの検出方法。
電気化学活性縫い込み型インターカレータが、酸化還元活性を有する物質であることを特徴とする請求項４に記載のＤＮＡの検出方法。
電気化学活性縫い込み型インターカレータが、フェロセン修飾電気化学活性縫い込み型インターカレータであることを特徴とする請求項４に記載のＤＮＡの検出方法。