JP3657375B2 - タンパク質試薬としてのガラス／セルロース - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、タンパク誤差指示薬及び緩衝液を含有する試験片の使用による水性流体（特に、尿）中のタンパク質の検出に関する。より詳細には、本発明は、試験片基材用の特定の種類の材料（即ち、ガラス／セルロースの紙）の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
尿中タンパク質の測定は、中枢神経系と同様に腎臓及び循環系に影響するいくつかの病態の診断において重要である。尿中のタンパク質を定量的及び定性的に測定することは、しばしば必要であり、特に糖尿病及び腎臓疾患の診断において必要である。糖尿病と関係する主要な尿タンパク質は、分析で最も一般的に求められるアルブミンである。
【０００３】
尿中タンパク質の測定用の種々の方法が知られており、そのうち最も簡便な方法は、タンパク誤差指示薬及び緩衝液を含浸した吸収性の試験片を、少量の尿で濡らすことを含む。タンパク誤差指示薬は、イオン化し得る基を含有するｐＨ指示薬であり、該イオン化基は、タンパク質の存在下で置換されて、検出可能な色変化を与える。これは、該指示薬がｐＨ変化の影響下に行うのと同じ色変化であり、ｐＨ増加はタンパク質不在で指示薬の色の変化を起こし、それにより偽陽性の結果を生じ得ることから、緩衝液を該試験片に包含させて、それにより、そのようなｐＨ増加を防ぐことが重要である。生物試料中のタンパク質検出用のタンパク誤差指示薬の用途は、米国特許第５，２７９，７９０号明細書及び同５，４２４，２１５号明細書に開示されている。
【０００４】
種々の材料が、試験片の担体材料として使用されているが、最も一般的なのはろ紙である。大部分のろ紙は、通常のセルロース性のパルプ繊維から作られるが、一部は、ガラスのような合成繊維又はパルプ繊維とガラス繊維の混合物から製造される。天然由来の繊維は、ペクチン酸、ろう質（Waxy substance) 、電解質、タンパク質及び他の植物成分を異なる度合いで含有するため、ガラス繊維又はセルロース繊維とガラス繊維の混合物から作られたろ紙は、時には、天然のセルロース性繊維のみを含有するものよりも好まれる。米国特許第３，８４６，２４７号明細書には、試薬片の基質として、織られるか、又はからみ合わせたガラス繊維（woven or matted glass fiber）の用途を記載している。前述のように、水性流体中のタンパク質測定用試験片の吸収性マトリックスとして、セルロース／ガラス繊維のろ紙を用いることにより、一定の利点が見出される。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するための手段】
本発明は、緩衝液及びタンパク誤差指示薬染料を含浸させた固体担体を含む乾燥試薬片を用いる、水性流体中のタンパク質を測定する方法（染料とタンパク質の相互作用の結果、比色定量的に検出可能な応答をもたらす方法）の改良に関する。該改良は、ガラス／セルロースの紙を固体担体として用いることを含む。
【０００６】
さらに、本発明の範囲内に含まれるのは、水性流体中のタンパク質の試験具であり、その試験具は、タンパク誤差指示薬及び緩衝液を含有する、担体としてのガラス／セルロースの紙を含む。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明で有益なガラス／セルロースのろ紙は、典型的には、標準的な製紙法により製造され、その方法においては、製紙材料のスラリー、この場合はガラス及びセルロース性の繊維をスクリーンに送り、水切りすることにより、乾燥時に、所望の目的に十分な物理的一体性を有する残分を残すように製造される。本発明に有用な典型的ガラス／セルロースのろ紙は、ガラス繊維約３０〜９０重量％及びセルロース繊維約１０〜７０重量％を含むであろう；ガラス５０〜７０重量％からセルロース５０〜３０重量％までの濃度が、好ましい。ガラス／セルロースの組み合わせのセルロースの部分は、カルボキシメチル、ジエチルアミノエチル、スルホキシエチル、トリメチルヒドロキシプロピル及びそれらの混合（組み合わせ）のようなセルロース誘導体化基を含有してもよい。
【０００８】
該ろ紙は、低濃度のペクチン酸、ろう質又はタンパク質のような異質な材料、及び電解質を含有してもよい。繊維長及び直径は、本発明の実施に対しては臨界的ではないが、長さ１００〜９００μm(ミクロン）及び直径２〜５０μm の範囲の繊維が、好ましい。なぜなら、この範囲では、多孔性及び引張強さのような該ろ紙の物理的性質を調整し得るためである。
【０００９】
タンパク誤差指示薬は、タンパク質の存在下で置換されて、検出可能な色変化を与えるイオン化基を含有するこれらのｐＨ指示薬を包含する。典型的には、該タンパク誤差指示薬は、フェノールスルホンフタレイン染料である。そのような指示薬の例は、テトラブロモフェノールブルー（ＴＢＢＰ）、５′，５″−ジニトロ−３′，３″−ジヨード−３，４，５，６−テトラブロモフェノールスルホンフタレイン（ＤＩＤＮＴＢ）、クマシーブリリアントブルー、ファーストグリーンＦＣＦ、ライトグリーンＳＦ、ピロガロールレッド及びピロカテコールバイオレットである。
【００１０】
接触中の液体が塩基性を増すと、該タンパク誤差指示薬は、典型的に呈色反応を与える。こうして、ＤＩＤＮＴＢは、２．１以上のｐＨ値では無色から青色へ変化し、ＴＢＰＢは、pH３．７を越えると黄色から青色へ変化し、該色変化のため、尿のようにかなり高いｐＨ値を有する流体を試験する場合、緩衝液が必要とされる。これは、該タンパク誤差指示薬が、タンパク質の存在により置換されて検出可能な色変化を与えるイオン化基を含有するためである。前述のように、試験片中に緩衝液を包含させて、それにより、タンパク質不在で指示薬の色変化を起こし、偽陽性の結果を与えるｐＨ増加を防止することが重要である。適切な緩衝液は、クエン酸、リン酸、シトラコン酸、ジグリコール酸、グリシン、マレイン酸、リシン、サルコシン及びベタインを包含する。酒石酸及び他の緩衝液と組み合わせた酒石酸は、好ましい緩衝系である。
【００１１】
本発明の試験具は、典型的には、試薬系で含浸したガラス／セルロースのろ紙から切り取った紙片である。この含浸は、典型的には、２度浸し法で実施する。第一回目の浸し液は水又は水と極性有機溶媒の混合物を含み、その中に、該緩衝液（典型的には、５０〜７５０mMの濃度で）、並びに場合によりバインダーとしてのポリマー及び緩衝液の浸出防止のみではなく安定性と湿潤性付与用としての界面活性剤を溶解している。タンパク質が、イオン化基を置換し、色彩を形成し得るよう、タンパク誤差指示薬をプロトン化した形にとどめておくため、この浸し溶液のｐＨ値を、１．５〜３．５の範囲内に保持する。乾燥後、該紙片を、指示薬を溶解した第二の有機溶媒溶液に浸す。この溶液は、典型的には、０．２〜５．０mMの濃度、そして場合によりルトナール(Lutonal）Ｍ４０、ポリビニルメチルエーテル及び／又はＫＯＫ１００７１、ポリピレングリコール／カルボナートコポリマーのような色彩を強化させる高分子を溶解している。
【００１２】
含浸及び乾燥後、該紙片は使用可能であり、使用は、通常、試験片を尿試料へ浸し、そして手作業により（manually）又はよりよい定量のために反射分光計を使用して、指示薬の色変化からもたらされる応答を読みとることを伴う。
【００１３】
本発明の実施方法を、以下の例により、より詳細に説明する。
【００１４】
【実施例】
実施例Ｉ
ろ紙の切片を１インチ角に切り、これを、２回飽和させることにより、該切片をＴＢＰＢ試薬にする。即ち、最初に、混合液のｐＨを３．７に維持する緩衝液としての、クエン酸ナトリウム２００mM及びクエン酸１８０mMの組み合わせを含有する水性エタノール混合液（水８１．８％／エタノール１８．２％）に飽和させた。２回目の飽和は、１０５℃で５分間乾燥後、ＴＢＰＢ指示薬染料を３．０mMの濃度で含有するエタノール混合液を用い、そして前述と同様に乾燥することによって行った。
【００１５】
乾燥状態で、水のピペッティング後、及びヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）３０mg/dL を含有する水のピペッティング後に、該試薬正方片を測定した。Beckman DU-70 分光光度計の測定台上に、該試薬試料を固定するため、白色のポリスチレン正方片を使用した。
【００１６】
それぞれの試薬正方片（乾燥／水／ＨＳＡ）の反射スペクトルを、ラプスフェア(Labsphere）社（North Sutton, NH）製のRSA BE-70 反射スペクトル分析装置を用いて測定した。種々な種類のろ紙のバックグラウンド及びタンパク応答を、表１に示した。
【００１７】
【表１】

【００１８】
【表２】

【００１９】
表１中の結果について、バックグラウンドは、何も含まない水に基づいており、そしてタンパク応答は、水／タンパクと水の観察の相違に基づいている。試薬は、理想的には、コントロールよりも、より低いか又は同等の値のバックグラウンド、及びより大きいタンパク応答を示すであろう。これは、バックグラウンドが低くなるほど試験がより特異的となり、即ち、より少ない高比重尿の干渉現象、及びタンパク応答が大きいほどタンパク質に対する感度が増大するためである。微小タンパク尿症（microalbuminuria）は、低タンパク質レベルの正確な測定が必要な一例である。本実験では、バックグラウンドの変化及びタンパク応答において、それぞれ１００％を示した綿／木の基準ろ紙を、コントロールとして選択した。これらの１００％変化は、１００％の指定値を有する基準ろ紙から得たバックグラウンド及びタンパク応答であった。それぞれの紙から得たバックグラウンド及びタンパク応答が、基準に対して、報告された。例えば、バックグラウンド１４６％は、基準のバックグラウンドよりも４６％大きい。微小タンパク尿を測定する際に、増大したタンパク応答は特に重要であり、そこでタンパク質は、尿中に通常３〜８mg/dL の濃度で存在し、同様に、タンパク尿の場合にはタンパク質は通常１５〜３０mg/dL の濃度で存在した。
【００２０】
表１より、綿リンター３０％（典型的には、繊維長５００〜３，０００μm を有する）及びガラス７０％を含む綿ガラス紙である、ワットマン（Whatman Ltd.）社製のF-255-03ろ紙が、一定のバックグラウンド（コントロールの１１０％）の維持及びタンパク応答増大（コントロールの２５１％）の表示の二つの目標点を達成する最良の結果を与えたことが判る。対照的に、ガラス繊維ロットＢは、タンパク応答１４３％の変化を示しつつ、バックグラウンドの増加も示した。バックグラウンドの増加は高ＳＧ尿素を偽陽性として読取ったことに起因し得るため、このバックグラウンドの増加は容認できない。このスペクトルの他の端は、漂白した軟材（針葉樹）の木パルプをベースとしたろ紙であり、多少のバックグラウンドの減少を与えたが、コントロール試薬と比較して２１％しかタンパク応答の増大を示さなかった。
【００２１】
ろ紙中のガラス及びセルロースの繊維長は、タンパク応答に重要ではない。繊維長２５〜１００μm を典型的に有する、微結晶セルロースを、同様に使用することもできる。しかしながら、繊維長は、確かに、多孔性及び引張強さのような、紙の物理的性質に影響する。
【００２２】
実施例II
もう一つのフェノールスルホンフタレイン染料、５′，５″−ジニトロ−３′，３″−ジヨード−３，４，５，６−テトラブロモフェノールスルホンフタレイン（ＤＩＤＮＴＢ）を使用した以外は、実施例Ｉのように、ろ紙片をタンパク試薬片に調製し、試験した。
【００２３】
本実験では、ろ紙を乾燥ＤＩＤＮＴＢタンパク試薬にし、試薬片に加工し、それをヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の０〜８mg/dL を含有する尿に浸した後、バイエル・ダイアグノスティックス(Bayer Diagnostics）社製のClinitek-200+ 測定器で試した。ＨＳＡの添加に先立って、天然由来のタンパク質をすべて除去するために、該尿をろ過膜に通してろ過した。
【００２４】
該ＤＩＤＮＴＢタンパク試薬を、ろ紙を２回飽和することによって調製した。その１回目は、緩衝液（クエン酸ナトリウム）及びポリマー強化剤、並びに紙の濡れ引っ張り強さを増加させるために、ある場合は、結合性ポリマー及びポリビニルアルコールを含有する水性エタノール混合液であった。水酸化ナトリウム及び塩酸を用い、該混合液のｐＨを２．１に調整した。該２回目飽和液は、ＤＩＤＮＴＢ及びポリマー強化剤、即ち、ルタノールＭ４０及びＫＯＫ１００７１、を含有するトルエン／ＴＨＦ混合液であった。該混合溶液を、その要素の役割、使用濃度及び許容得範囲について同定し、表２に表し、ろ紙を飽和するのに使用した。各飽和の後、該紙を１０５℃で７分間乾燥した。
【００２５】
【表３】

【００２６】
１個のガラスマトリックスのみ及び数種のセルロースろ紙のみ、並びに、数種の異なるセルロース／ガラスろ紙を用いて行った、本実験の結果を、表３に示した。
【００２７】
【表４】

【００２８】
表３から、ＴＢＢＰ以外の染料についてのタンパク応答の改善が見られることが確認できた。唯一の例外、即ち、オルトリン酸セルロース：ガラスは、おそらくタンパク質と染料との相互作用が阻害されたため、タンパク応答を改善し得なかったのであろう。セルロース／ガラスの配合へのＰＶＡの添加は、結果を変化させなかった。
【００２９】
本発明は、特定の理論又は操作方法に基づいて断言するわけではないが、ガラス／セルロースで観察される応答の改善は、該マトリックスと該試薬の化学物質／試料タンパクとの相互作用の減少によると考える。

Claims (14)

1. 水性流体を緩衝液及びタンパク誤差指示薬染料を含む試薬と接触させ、そこでタンパク誤差指示薬とタンパク質の該反応が、タンパク誤差指示薬から比色分析による検出が可能な応答が生じる水性流体中のタンパク質測定方法であって、ガラスとセルロースの組み合わせの存在下で該方法を実施することを特徴とする方法。
2. 該ガラスとセルロースの組み合わせが、試薬の担体として用いる、ガラス及びセルロース繊維を含む紙である、請求項１記載の方法。
3. 該ガラス及びセルロース繊維を含む紙が、ガラス３０〜９０重量％を含み、残りの部分が実質的にセルロースである、請求項２記載の方法。
4. 該ガラス及びセルロース繊維を含む紙が、ガラス５０〜７０重量％及びセルロース５０〜３０重量％を含む、請求項２記載の方法。
5. 該組み合わせのセルロースの部分が、誘導体化セルロース基を含有する、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
6. 該誘導体化セルロース基が、カルボキシメチル、ジエチルアミノエチル、スルホキシエチル、トリメチルヒドロキシプロピル又はそれらの混合物である、請求項５記載の方法。
7. 該タンパク誤差指示薬が、フェノールスルホンフタレイン染料である、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
8. 該フェノールスルホンフタレイン染料が、テトラブロモフェノールブルー、５′，５″−ジニトロ−３′，３″−ジヨード−３，４，５，６−テトラブロモフェノールスルホンフタレイン、クマシーブリリアントブルー、ファーストグリーンＦＣＦ、ライトグリーンＳＦ、ピロガロールレッド又はピロカテコールバイオレットである、請求項７記載の方法。
9. 該水性流体が、尿である、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
10. 水性流体中のタンパク質を測定するための試験具であって、基材として、緩衝液、及びタンパク質を包含する水性流体と接触させられて、比色分析により検出が可能な応答を示すタンパク誤差指示薬染料を含む、ガラスとセルロースの紙を含むことを特徴とする試験具。
11. ガラスとセルロースの紙が、ガラス３０〜９０重量％を含み、残りの部分が実質的にセルロースである、請求項１０記載の試験具。
12. ガラスとセルロースの紙が、ガラス５０〜７０重量％及びセルロース５０〜３０重量％を含む、請求項１０記載の試験具。
13. 該タンパク誤差指示薬が、フェノールスルホンフタレイン染料である、請求項１０〜１２のいずれか１項記載の試験具。
14. 該フェノールスルホンフタレイン染料が、テトラブロモフェノールブルー、５′，５″−ジニトロ−３′，３″−ジヨード−３，４，５，６−テトラブロモフェノールスルホンフタレイン、クマシーブリリアントブルー、ファーストグリーンＦＣＦ、ライトグリーンＳＦ、ピロガロールレッド又はピロカテコールバイオレットである、請求項１３記載の試験具。