JP3628694B2 - 新生物病態およびその他の障害に対する，単独または他の化合物との併用でのフェニルアセテートおよび誘導体 - Google Patents

新生物病態およびその他の障害に対する，単独または他の化合物との併用でのフェニルアセテートおよび誘導体 Download PDF

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Description

Ｉ 発明の分野
本発明は、フェニル酢酸およびその薬学的に受容可能な誘導体を用いて、病的状態を治療および予防し、かつ細胞の活性を調整する方法に関する。詳細には、本発明はＡ）フェニル酢酸およびその誘導体のガンの治療または予防における使用、Ｂ）フェニル酢酸およびその誘導体の創傷治癒における使用、Ｃ）フェニル酢酸およびその誘導体のインターロイキン−６に関連する疾患の治療における使用、Ｄ）フェニル酢酸およびその誘導体のAIDSに関連するCNS機能不全の治療における使用、Ｅ）フェニル酢酸およびその誘導体の免疫監視を増強するための使用、Ｆ）患者におけるフェニル酢酸およびその誘導体の用量レベルおよび／またはこれらの薬物に対する患者の応答をモニターする方法、Ｇ）フェニル酢酸およびその誘導体によるPPARの活性化、レチノイドレセプターと相互作用する薬剤との併用でのフェニル酢酸およびその誘導体の使用、およびフェニル酢酸およびその誘導体のフリーラジカルに基づいた放射線照射または化学療法感作あるいは保護薬剤としての使用、Ｈ）フェニル酢酸およびその誘導体の、多剤耐性表現型を有するガンの治療における使用、Ｉ）フェニル酢酸およびその誘導体、効力と親油性との相関関係、Ｊ）神経芽腫細胞を含有するガンのようなガンの治療および予防のための、レチノイン酸との相乗的併用でのフェニル酢酸およびその誘導体、Ｋ）悪性神経膠腫または他のCNS腫瘍などのガンの治療および予防のための、ロバスタチンとの相乗的併用でのフェニル酢酸およびその誘導体、Ｌ）悪性黒色腫または他の神経外胚葉の腫瘍を含有するガンおよび他の分化障害などのガンおよび他の分化障害の治療および予防のためのフェニル酢酸およびその誘導体、Ｍ）前立腺ガンようなガンの治療および予防のための、ヒドロキシ尿素（HU）との相乗的併用でのフェニル酢酸およびその誘導体、Ｎ）髄芽腫および神経膠星状細胞腫由来細胞を含有するガンの治療および予防のためのフェニル酢酸およびその誘導体、Ｏ）PAおよびPBを用いる治療に関するヒトでの研究におけるフェニル酢酸およびその誘導体、Ｐ）血清トリグリセリドの減少を含む脂質代謝を改変する方法におけるフェニル酢酸およびその誘導体、Ｑ）悪性および非悪性細胞におけるフェニル酢酸およびその誘導体によるHbFの誘導、およびＲ）フェニル酢酸およびその誘導体の投与方法、に関する。
II 発明の背景
フェニル酢酸（PAA）は、系統発生的範囲を通じて（細菌からヒトまで）見出されるタンパク質分解産物である。進化において高度に保存されているPAAは、増殖細胞および分化における根本的な役割を担っているかもしれない。植物において、PAAは成長ホルモン（オーキシン）として作用して、低用量（10-5〜10-7M）で細胞増殖および腫脹を促進し、その一方でより高濃度では増殖を阻害する。動物およびヒト細胞に対する効果は、十分には特徴付けされていない。ヒトにおいて、PAAはグルタミンを結合して、次いでフェニルアセチルグルタミン（PAG）を腎排泄することが知られている。後者は、不用な窒素の排泄を導き、尿素形成（ureagenesis）の先天性異常に関連する高アンモニア血症の治療において、PAAまたは好ましくはそのフェニルアセテートナトリウム塩（NaPA、これはまた本明細書中でその活性な陰イオン部分であるフェニルアセテートまたは「PA」と呼ばれる）を使用することの基礎となっている。臨床的経験は、高NaPA用量を用いた急性または長期間の治療は良好に寛容され、本質的に有害効果がなく、過剰なグルタミンの除去において有効であることを示す［Brusilow,S.W.,Horwich,A.L.Urea cycle enzymes.Metabolic Basis of Inherited Diseases,Vol.6:629−633（1989）］。
グルタミンは核酸およびタンパク質合成のための主要な窒素源であり、迅速に分裂している正常および腫瘍細胞におけるエネルギーのための基質である。正常組織に比較して、ほとんどの腫瘍は、グルタミンの合成の減少ならびに資化および異化の促進のために、限られたレベルのグルタミン利用率で作動し、その結果さらなるグルタミン涸渇に対して敏感である。腫瘍細胞におけるグルタミン代謝の不均衡およびPAAのグルタミンを除去する能力を考慮して、PAAは潜在的な抗腫瘍剤として提唱されている；しかし、この提唱を実証するデータはこれまでに提供されていない［Neish,W.J.P.「ヒトガンの治療のための潜在的な治療薬剤としてのフェニル酢酸」、Ex perentia,Vol.27,pp.860−861（1971）］。
ガンと戦うためのこれらの努力にかかわらず、本出願において問題にする多くの悪性疾患は、臨床腫瘍学に対して重大な難題を提示し続けている。例えば、前立腺ガンは男性における２番目に一般的なガン死亡の原因である。現在の治療プロトコルは主としてホルモン操作に頼っている。しかし、初期の高い応答率にかかわらず、患者はしばしばホルモン治療抵抗性（hormone−refractory）腫瘍を発達させ、おもわしくない予後を伴う迅速な疾患の進行へ導く。全体的に、細胞障害性化学療法の結果は落胆させるものであり、このことは進行した前立腺ガンの治療に対する新たなアプローチの切実な必要性を示す。異常な細胞複製から生じる他の疾患（例えば、転移性黒色腫、グリア起源の脳腫瘍（例えば、神経膠星状細胞腫）、および肺腺ガン）もまた、おもわしくない予後を伴う高度に攻撃的な悪性疾患である。黒色腫および肺腺ガンの発生率は近年顕著に増加している。脳腫瘍の外科的治療はしばしばすべての腫瘍組織を除去することに失敗し、再発を生じる。全身化学療法は、血液関門により妨害される。それゆえ、進行した前立腺ガン、黒色腫、および脳腫瘍を含むヒト悪性疾患の治療への新たなアプローチに対する切迫した必要性が存在する。
フェニル酢酸（PAA）は、そのグルタミンに結合してグルタミンフェニルアセテートを形成する能力に加えて、腫瘍細胞に分化を経験させることを誘導し得る。PAAは非毒性分化増強因子であり、実験室モデルおよびヒトにおいて抗腫瘍活性を有する。前臨床研究は、フェニルアセテートおよび関連の芳香族脂肪酸は細胞増殖抑制性（cytostasis）を誘導し、ホルモン治療抵抗性前立腺ガンおよび神経膠芽細胞腫を含む種々のヒト悪性細胞の成熟を促進することを示す。腫瘍生活史（biology）の顕著な変化は、腫瘍増殖、浸潤、脈管形成、および免疫原生に関係する遺伝子の発現における改変に関連する。PAAおよびそのアナログは以下を含むいくつかの作用メカニズムを共有するようである：（ａ）核レセプターの活性化を通じての遺伝子発現の調節；および（ｂ）メバロン酸経路およびタンパク質イソプレニル化の阻害。従って、PAAは特に種々の新生物病態の治療に適しているようである。
NaPAにより治療し得るこのような新生物病態の一つは、神経芽腫である。幼児期の悪性腫瘍として、神経芽腫は生物学的および臨床的観点から魅惑的であることが証明されている。このガンは、すべての悪性疾患の中で最も高い自然分化率を有し、いくつかの薬剤は神経芽腫の成熟の神経冠系列を共有する種々の細胞への成熟を誘導をすると報告されている（Evans,A.E.,Chatten,J.,D'Angio,G.J.,Gerson,J.M.,Robinson,J.,およびSchnaufer,L.A.、フィラデルフィア小児病院の17名のIV−Ｓ神経芽腫患者についての概説。Cancer,45:833−839,1980;Abemayor,E.,およびSidell,N.、腫瘍性ニューロン細胞分化のインビトロ研究のためのモデルとしてのヒト神経芽腫細胞株。Environ.Health Perspect.,80:3−15,1989）。分化薬剤として探索された化合物の中で、レチノイン酸（RA）（Sidell,N.,Altman,A.,Haussler,M.R.およびSeeger,R.C.、レチノイン酸（RA）のいくつかのヒト神経芽腫細胞株の増殖および表現型発現に対する効果。Expl.Cell.Res.,148:21−30,1983）は、種々のヒト神経芽腫細胞株の分化を促進する強力な化合物であることが示された（Abemayor,E.,およびSidell,N.、腫瘍性ニューロン細胞分化のインビトロ研究のためのモデルとしてのヒト神経芽腫細胞株。Environ.Health Perspect.,80:3−15,1989;Sidell,N.,Altman,A.,Haussler,M.R.およびSeeger,R.C.、レチノイン酸（RA）のいくつかのヒト神経芽腫細胞株の増殖および表現型発現に対する効果。Expl.Cell.Res.,148:21−30,1983;Thiele,C.T.,Reynolds,C.P.,およびIsrael,M.A.、Ｎ−mycの発現減少がヒト神経芽細胞腫のレチノイン酸誘導性形態的分化に先行する。Nature,313:404−406,1985）；しかし、現在までに、RAはこの疾患において限られた臨床的有効性しか示していない（Finklestein,J.Z.,Krailo,M.D.,Lenarsky,C.,Ladisch,S.,Blair,G.K.,Reynolds,C.P.,Sitary,A.L.,およびHammond,G.D.、従来の化学療法に非応答性の転移性神経芽腫を有する小児の治療における13−シス−レチノイン酸（NSC 122758）：小児ガン研究グループからの報告。Med.Ped.Oncol.,20:307−311,1992）。ヒト神経芽腫のRA誘導性分化の効力を増大させることを求めて、多数の他の化合物および生物学的応答改変剤（例えば、cAMP上昇薬剤およびインターフェロン）は、レチノイド活性を強化するとともに耐性集団を、RA治療に対して感受性にし得る（Lando,M.,Abemayor,E.,Verity,M.A.,およびSidell,N.ヒト神経芽腫細胞の細胞内環状AMPレベルおよび分化応答の調整。Cancer Res.,50:722−727,1990;Wuarin,L.,Verity,M.A.,およびSidell,N.、ヒト神経芽腫細胞に対するγインターフェロンの効果とそのレチノイン酸との相互作用。Int.J.Cancer,48:136−144,1991）。これらの併用治療のいくつかは、現在臨床的に評価されているかまたは神経芽腫および他の悪性疾患の治療のために提唱されている（Smith,M.A.,Parkinson,D.R.,Cheson,B.D.,およびFriedman,M.A.、ガン治療におけるレチノイド。J.Clin.Oncol.,10:839−864,1992）。しかし、神経芽腫ならびに他の類似のガンおよび病的状態の治療のためのより効果的な併用治療の必要性が存在する。
従来治療が困難であった別の新生物病態は悪性神経膠腫である。悪性神経膠腫は、細胞複製に重要なステロールおよびイソプレノイドの合成のためのメバロン酸（MVA）経路に高度に依存する（Fumagalli,R.,Grossi,E.,Paoletti,P.およびPaolette,R.、脳腫瘍における脂質に関する研究。I.ヒト脳腫瘍におけるコレステロールのステロール前駆体の出現と意義。J.Neurochem.11:561−565,1964;Kandutsch,A.A.およびSaucier,S.E.、正常およびjimpyマウスの発達中の脳におけるステロール合成の調節。Arch.Biochem.Biophys.135:201−208,1969;Grossi,E.,Paoletti,P.およびPaoletti,R.、脳コレステロールおよび脂肪酸生合成の解析。Arch.Int.Physiol.Biochem.66:564−572,1958;Azarnoff,D.L.,Curran,G.L.およびWilliamson,W.P.、インビトロでのヒト頭蓋内腫瘍によるアセテート−１−14Cのコレステロールへの取り込み。J.Nat.Cancer Inst.21:1109−1115,1985;Rudling,M.L.,Angelin,B.,Peterson,C.O.およびCollins,V.P.、ヒト頭蓋内腫瘍における低密度リポタンパク質レセプター活性とそのコレステロール要求性との関連。Cancer Res.50（suppl）:483−487,1990）。MVA合成および／または利用を標的にすることにより正常脳組織（ここではMVA経路は最小に活性である）を損傷することなく腫瘍増殖を阻害することが期待される。二つの酵素がコレステロール合成のMVA経路の律速段階を制御する：（ａ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素Ａ（HMG−CoA）レダクターゼは、アセチルCoAからのMVAの合成を触媒する；そして、（ｂ）MVAピロホスフェート（MVA−PP）デカルボキシラーゼはMVA利用ならびに、その結果細胞内信号伝達タンパク質の翻訳後プロセッシングおよび機能を制御する（Goldstein,J.L.およびBrown,M.S.、メバロン酸経路の調節。Nature,343:425−430,1990;Marshall,C.J.、タンパク質プレニル化：タンパク質−タンパク質相互作用のメディエーター。Science,259:1865−1866,1993）。従って、悪性神経膠腫または他の類似のガンおよび病的状態の治療のために、MVA経路のこれら二つの段階を阻害し得る治療を見出すことが高く望まれている。
治療が困難であったさらなる新生物病態は、悪性黒色腫である。散在性悪性黒色腫は、高い死亡率および従来の治療に対する耐性により特徴付けられる（Ferdy Lejeune,Jean Bauer,Serge Leyvraz,Danielle Lienard（1993）：散在性黒色腫、前臨床治療研究、臨床試験、および患者治療。Current Opinion in Oncology 5:390−396）。分化治療は、細胞障害化学療法に応答しないかまたは応答の乏しいガンの治療のための別法を提供し得る（Kelloff,G.J.,Boone,C.W.,Malone,E.F.,Steele,V.E.（1992）：化学的予防臨床的試験。Mutation Res.267:291−295）。いくつかの分化誘導剤が、インビトロで黒色腫細胞の表現型を改変し得る。これらには、レチノイド、ブチレート、ジブチリルアデノシン3':5'−環状一リン酸（dbcAMP）、５−アザシチジン、インターフェロン、ヘキサメチレンビスアセトアミド（HMBA）、ジメチルホルムアミド（DMF）、ジメチルスルホキシド（DMSO）、12−テトラデカノイルホルボル−13アセテート（TPA）が含まれる（Mary J.Hendrix,Rebecca W.Woodら、（1990）：再構成された基底膜を通じてのヒト黒色腫細胞浸潤のレチノイン酸阻害ならびにそのタンパク質分解酵素の発現および能動性の減少との関連。Cancer Research 50:4121−4130;Luara Giffre,Magali Schreyer,Jean−pierre Mach,Stefan Carrel（1988）：環状AMPはヒト黒色腫細胞のインビトロ分化を誘導する。Cancer 61:1132−1141;Jardena Nordenberg,Lina Wasserman,Einat Beery,Doron Aloni,Hagit Malik,Kurt H.Stenzel,Abraham Novogrodsky（1986）：酪酸およびジメチルスルホキシドによるマウス黒色腫の増殖阻害。Experimental Cell Research 162:77−85;Eliezer Huberman,Carol Heckman,Rober Langenbach（1979）：腫瘍促進薬剤およびジメチルスルホキシドによるヒト黒色腫細胞における分化機能の刺激。Cancer Research 39:2618−2624;Claus Garbe,Konstantin Krasagakis（1993）：インターフェロンおよびサイトカインの黒色腫細胞に対する効果。J.Invest.Dermatol.100:239S−244S）。残念ながら、これらの薬剤の臨床適用は、受容不可能な毒性、潜在的な発ガンに関する懸念、または有効な血漿濃度を達成および持続し得ないことにより制限される。従って、悪性黒色腫または他の類似のガン、病的状態、または分化障害のための無毒性で、臨床的に有効な治療の必要が存在する。
リボヌクレオチドレダクターゼインヒビターであるヒドロキシ尿素は、1800年代の後期に最初に合成された単純な化合物（CH4N2O2、MW 76.05）である（Calabresi P,Chabner BA、抗腫瘍薬剤。Gilman AG,Rall TW,Nies AS,Taylor P編、The Pharmacological Basis of Therapeutics.New York:McGraw Hill 1990:1251−２）。ヒドロキシ尿素は、後に実験室動物において白血球減少症を生じることが見出され、次いで抗腫瘍薬剤として試験された（Rosenthal F,Wislicki L,Kollek L.Ueber die beziehungen von schwersten blutgiften zu abbauprodukten des ewweisses.Beitrag zum entstehungsmechanismus der perniziosen.Anamie.Klin.Wschr.1928;7:972）。現在では、ヒドロキシ尿素の主な臨床的役割は、骨髄増殖性障害の治療にある。現在ヒドロキシ尿素は、慢性骨髄性白血病のための好ましい初期治療と考えられている（Donehower RC.ヒドロキシ尿素。Chabner BA,Collins JM編Cancer Chemotherapy,Principles and Practice,Philadelphia:JB Lippincott 1990:225−33）。
ヒドロキシ尿素は、悪性黒色腫、頭部および頚部の扁平上皮ガン、腎細胞ガン、および尿管細胞層（urothelium）の移行上皮ガンを含む多数の固形ガンにおいて評価されている（Bloedow CE.成人におけるヒドロキシ尿素に第二相研究：種々の腫瘍。Cancer Chemother Rep 1964;40:39−41;Ariel IM.ヒドロキシ尿素の治療効果：手術不能の腫瘍を有する118名の患者の経験。Cancer 1970;25:714;Nevinny H,Hall TC.腎細胞ガンにおけるヒドロキシ尿素を用いた化学療法。J Clin Pharmacol 1968;88:352−9;Beckloff GL,Lerner HJ,Cole DR,ら、膀胱ガンにおけるヒドロキシ尿素。Invest Urol 1967;6:530−４）。初期の研究はいくつかのこれらの疾患において有望に見えたが、さらなる研究は、固形ガンについてのいかなる標準的治療養生法においても、ヒドロキシ尿素の役割を定義していない。
ヒドロキシ尿素は細胞周期のＳ期に特異的な薬剤であるので、ホルモン治療抵抗性転移性前立腺ガンにおけるこの薬物のいくつかの臨床試験は、ヒドロキシ尿素がなんらかの活性を有すると示唆したことは驚異である（Lerner HJ,Malloy TR.前立腺のステージＤガンにおけるヒドロキシ尿素。Urol 1977;10:35−8;Kvols LK,Eagan RT,Myers RP.転移性前立腺ガンにおけるメルファラン、ICRF−159、およびヒドロキシ尿素の評価：予備報告。Cancer Treat Rep 1977;61:311−2;Loening SA,Scott WW,deKernion Jら、前立腺の進行性ガンを有する患者におけるヒドロキシ尿素、メチル−クロロエチル−シクロヘキシ−ニトロソウレア、およびシクロホスファミド（clylophosphamide）の比較。J Urol 1981;125:812−6;Mundy AR前立腺のホルモン「逃避」転移性ガンにおけるヒドロキシ尿素の先行研究。Br J Urol 1982;54:20−5;Stephens RL,Vaughn C,Lane Mら、進行した前立腺ガンにおけるアドリアマイシンおよびシクロホスファミド対ヒドロキシ尿素。Cancer 1984;53:406−10）。これらの活性は、特に（１）疾患の進行の遅い性質および（２）これらの試験において用いられる薬物投与のスケジュール（例えば、１日１回から３日に１回）を与える。これらの試験で用いられたヒドロキシ尿素の用量または投与スケジュールはいずれも、細胞周期の感受期にある腫瘍細胞のかなりの割合を捕らえることはなさそうである。表13に、ホルモン治療抵抗性前立腺ガンにおけるヒドロキシ尿素の活性に関する報告された臨床データを要約する。全体の他覚的な応答率は23％であり、自覚的改善の頻度は36％である（Lerner HJ,Malloy TR.前立腺のステージＤガンにおけるヒドロキシ尿素。Urol 1977;10:35−8;Kvols LK,Eagan RT,Myers RP.転移性前立腺ガンにおけるメルファラン、ICRF−159、およびヒドロキシ尿素の評価：予備報告。Cancer Treat Rep 1977;61:311−2;Loening SA,Scott WW,deKernion Jら、前立腺の進行性ガンを有する患者におけるヒドロキシ尿素、メチル−クロロエチル−シクロヘキシ−ニトロソウレア、およびシクロホスファミドの比較。J Urol 1981;125:812−6;Mundy AR、前立腺のホルモン「逃避」転移性ガンにおけるヒドロキシ尿素の先行研究。Br J Urol 1982;54:20−5;Stephens RL,Vaughn C,Lane Mら、進行性前立腺ガンにおけるアドリアマイシンおよびシクロホスファミド対ヒドロキシ尿素。Cancer 1984;53:406−10）。従って、前立腺ガンまたは類似のガンの治療のためのヒドロキシ尿素を用いる改良された治療の必要が存在する。
大部分の原発性中枢神経系（CNS）腫瘍のための治療は、現在まで満足できるものではなかった。化学療法、放射線療法、および手術は主に細胞減少的（cytoreductive）であり、宿主内の生存腫瘍細胞の数を減少させることを目指す。これらの技術の適用は、いくらかのヒト悪性腫瘍において成功した一方、髄芽腫および悪性神経膠星状細胞腫に細胞減少的ストラテジーを使用することは、原発性腫瘍へ到達できないこと、悪性細胞の脳脊髄液への早くからの散在、有効な細胞減少薬剤がないこと、または受容され得ない毒性のために、限られた成功に終わった。従って、従来の細胞減少的治療の上記の欠点を克服する、CNS腫瘍の満足な治療の必要が存在する。
さらに、現在では脂質代謝の問題と心臓疾患との関連がよく受け入れられている。従って、関連する疾病を有する被験者の脂質代謝を調整または改変し得る治療を見出すことが望まれる。特に、血清トリグリセリドを減少させるための治療および方法が高く望まれる。
放射線療法が腫瘍疾患の処理において広く用いられてきたが、これは悪性腫瘍の特定の領域が放射線感受性を欠いていることにより制限される。腫瘍の放射線照射に対する感受性を化学的に増強することは、大体において不成功であり、放射線療法の重要な問題であり続けている。従って、放射線療法を含む改善された方法の必要が存在する。
従って、本発明は、上記およびその他の病的状態をPAAならびにその薬学的に受容可能な塩、誘導体、およびアナログで治療するための方法および組成物を提供する。
III 発明の要旨
本発明は、被験者における種々の病的状態を治療する方法を提供する。また本発明は、被験者における種々の細胞活性の調整を提供する。本発明は、被験者における種々の障害（新生物病態を含む）を治療する方法を提供し、この方法は、以下の式のフェニル酢酸誘導体、それらの塩、それらの立体異性体、およびそれらの混合物の治療的量を投与する工程を含む：
一般構造A:
Figure 0003628694
；ここで
R0＝アリール、フェノキシ、置換されたアリール、または置換されたフェノキシ；
R1およびR2＝Ｈ、低級アルコキシ、低級直鎖および分岐鎖アルキル、またはハロゲン；
R3およびR4＝Ｈ、低級アルコキシ、低級直鎖および分岐鎖アルキル、またはハロゲン；
および
ｎ＝０〜２の整数。
この一般構造は、以下、いかなる特別な方法または組成物に関係なく一般構造Ａという。本方法により治療し得る新生物病態は、神経芽腫、急性前骨髄細胞性白血病、急性脊髄形成異常、急性神経膠腫、前立腺ガン、乳ガン、黒色腫、非小細胞肺ガン、髄芽腫、肺ガン、神経膠星状細胞腫、およびバーキットリンパ腫ならびに他の状態を含む。上記の方法のための化合物（一般構造Ａに開示したような）、および本明細書中で開示するいかなる方法および組成物のための化合物は、特にフェニルアセテートナトリウムおよびフェニルブチレートナトリウムを含む。
さらに、予防的な量の一般構造Ａのフェニル酢酸誘導体を投与する工程を含む、被験者における新生物病態を予防する方法を提供する。この方法はまた、化合物が抗腫瘍薬剤と併用して投与される方法を含む。本発明はまた、分化誘導する量の一般構造Ａのフェニル酢酸誘導体を細胞に投与する工程を含む、細胞の分化を誘導する方法を提供する。
胎児ヘモグロビンを誘導する量の一般構造Ａのフェニル酢酸誘導体を被験者に投与する工程を含む、被験者において胎児ヘモグロビンの産生を誘導する方法もまた含む。
本発明は、治療的な量の一般構造Ａのフェニル酢酸誘導体を被験者に投与する工程を含む、被験者における異常なヘモグロビン活性に関連する病的状態を治療する方法を含む。この方法は、貧血である病的状態を治療するために使用され得る。より特定すると、貧血は鎌状細胞およびβサラセミアからなる群から選択され得る。
別の実施態様において、本発明は、細胞を一般構造Ａのフェニル酢酸誘導体のIL−６阻害量に接触させる工程を含む、細胞におけるIL−６の産生を阻害する方法を提供する。この阻害方法は、以下の病的状態のいずれかを有する被験者において使用され得る：慢性関節リウマチ、キャッスルマン病、メザンギウム増殖、糸球体腎炎、ブドウ膜炎、セプシス、自己免疫炎症性腸疾患、Ｉ型糖尿病、脈管炎、および細胞分化関連皮膚障害。もちろん、この阻害は、障害を治療するに十分量である。
本発明はまた、細胞をTGFα誘導量の一般構造Ａのフェニル酢酸誘導体に接触させる工程を含む、細胞においてTGFαの産生を誘導する方法を提供する。この方法は、誘導が被験者の創傷内である場合および誘導が創傷治癒を促進するに十分である場合に使用され得る。
本発明はまた、細胞をTGF−β２阻害量の一般構造Ａのフェニル酢酸誘導体に接触させる工程を含む、細胞においてTGF−β２の産生を阻害する方法を提供する。
さらに、被験者に治療的な量の一般構造Ａのフェニル酢酸誘導体を投与する工程を含む、被験者における中枢神経系のAIDSに関連した機能不全を治療する方法を提供する。
本発明の別の実施態様は、被験者に免疫監視を増強する量の一般構造Ａのフェニル酢酸誘導体を投与する工程を含む、被験者における免疫監視を増強する方法である。
本発明はまた、一般構造Ａの化合物のバイオアベイラビリティーをモニターする方法を提供する。この方法は、ヘモグロビンに関連しない病的状態の治療のために適用し得、この方法は、被験者に化合物を投与する工程および胎児ヘモグロビンのレベルを測定する工程を含む。胎児ヘモグロビンの量の増加は、化合物の病的状態を治療するためのバイオアベイラビリティーの増加を示し、胎児ヘモグロビンの量の減少は化合物の病的状態を治療するためのバイオアベイラビリティーの減少を示す。この方法は新生物病態である病的状態をモニターするに有用である。
本発明は、被験者の創傷に、創傷を治癒する量の一般 構造Ａのフェニル酢酸誘導体を投与する工程を含む、被験者における創傷の治癒を促進する方法を提供する。
さらに、被験者に治療的な量の一般構造Ａのフェニル酢酸誘導体を投与する工程を含む、放射線照射および化学療法に抵抗性の被験者における新生物病態を治療する方法を提供する。この方法は、多剤耐性表現型を示す新生物病態の治療のために特に有用である。
さらに以下の実施態様を提供する：
治療的な量のレチノイドを、治療的な量の一般構造Ａのフェニル酢酸誘導体と併用して投与する工程を含む、被験者における新生物病態を治療する方法。レチノイドは全トランス−レチノイン酸または９−シス−レチノイン酸であり得る。さらに、この方法は、神経芽腫などの新生物病態を治療するために使用され得る。この方法で治療され得るいくつかの新生物病態は、神経芽腫、急性前骨髄細胞性白血病、急性骨髄形成異常、急性神経膠腫、前立腺ガン、乳ガン、黒色腫、非小細胞肺ガン、髄芽腫、およびバーキットリンパ腫を含むが、これらに限定されない。
本発明はまた、治療的な量のメバロン酸経路のインヒビターを治療的な量の一般構造Ａのフェニル酢酸誘導体と併用して投与する工程を含む、被験者における新生物病態を治療する方法を提供する。この方法は、バスタチンまたはそのアナログであるインヒビターを用いて実施され得る。この方法に有用な特に適切なバスタチンはロバスタチンである。別のクラスのインヒビターはテルペンであり、特にリモネンである。他のインヒビターを、実施例に記載の方法を用いてスクリーニングし得る。この方法は、悪性神経膠腫、腺ガン、および黒色腫を含む新生物病態を治療するために使用され得る。さらに、新生物病態は、非悪性神経膠腫、良性前立腺過形成、および乳頭腫ウイルス感染などの状態を含むが、これらに限定されない非悪性の性質であり得る。関連する方法は上記の工程を使用し、さらに被験者を横紋筋融解症誘導性ミオパシーについて連続的にモニターする工程および、横紋筋融解症誘導性ミオパシーが存在する場合には、被験者にユビキノンを投与する工程を含む。
本発明のさらなる方法は、新生物病態を有する被験者におけるHMG−coAレダクターゼおよびMVA−PPデカルボキシラーゼを阻害する方法であり、治療的な量のメバロン酸経路のインヒビターを治療的な量の一般構造Ａのフェニル酢酸誘導体と併用して投与する工程を含む。適切なインヒビターはバスタチンのクラスまたはそのアナログを含み、特にロバスタチンを含む。他の適切なインヒビターはテルペンおよびそのアナログであり、特にリモネンである。この方法は、必要であれば悪性神経膠腫、腺ガン、および黒色腫を含む新生物病態を治療するために使用され得る。関連する方法はまた、被験者を横紋筋融解症誘導性ミオパシーについて連続的にモニターする工程および、横紋筋融解症誘導性ミオパシーが存在する場合には、被験者にユビキノンを投与する工程をさらに含む。
本発明はまた、治療的な量のフラボノイドを治療的な量の一般構造Ａのフェニル酢酸誘導体と併用して投与する工程を含む、被験者における新生物病態を治療する方法を提供する。適切なフラボノイドはアピゲニンおよびケルセチンを含む。この方法は前立腺ガンを含む新生物病態を治療するために使用され得る。
本発明はまた、治療的な量のヒドロキシ尿素を一般構 造Ａの治療的な量のフェニル酢酸誘導体と併用して投与することを含む、被験者における新生物病態を治療する方法を提供する。この併用治療法は、前立腺ガンを含む新生物病態を治療するために使用され得る。
別の実施態様において、本発明は治療的な量の一般構 造Ａのフェニル酢酸誘導体を投与する工程を含む、被験者における脂質代謝を調整する方法を提供する。関連する実施態様において、本発明は治療的な量の一般構造Ａのフェニル酢酸誘導体を投与する工程を含む、被験者における血清トリグリセリドを減少させる方法を提供する。
本発明は、治療的な量の一般構造Ａのフェニル酢酸誘導体を嚢内投与する工程を含む、被験者の内部組織の新生物病態を局所的に治療する方法を提供する。この方法は、外部から接近可能な内部のオリフィスおよび膀胱の新生物病態を局所的に治療するために使用され得る。従って、この嚢内方法は膀胱ガンおよび腎臓ガンなどの新生物病態を治療するために使用され得る。
本発明は、治療的な量の一般構造Ａのフェニル酢酸誘導体を投与する工程を含む、被験者を放射線療法に対して感受性にする方法を提供する。本発明はまた、レチノイドレセプターと相互作用する薬剤との併用での一般構 造Ａのフェニル酢酸誘導体の使用、および一般構造Ａのフェニル酢酸誘導体の、フリーラジカルに基づく放射線照射または化学療法感受性化または保護的薬剤としての使用を提供する。
治療的な量のバスタチンおよび治療的な量の一般構造 Ａのフェニル酢酸誘導体を別個の調製物中に含む、被験者における新生物病態を治療する際において同時、別々または順次に使用するための製品もまた提供する。この組成物には、治療的な量のユビキノンが添加され得る。治療的な量のユビキノンは、重大な付随する副作用なしに、バスタチン（または、特にロバスタチン）の増加した用量の耐性を可能にするに十分な量である。
被験者における新生物病態の治療における同時、別々または順次の使用のためのさらなる製品は、治療的な量のレチノイドおよび治療的な量の一般構造Ａのフェニル酢酸誘導体を別個の調製物中に含む。この組成物は、全トランス−レチノイン酸および９−シス−レチノイン酸（または両方）を含むレチノイドを用いて作製し得る。
被験者における新生物病態の治療における同時、別々または順次の使用のための別の新規な製品を提供する。この製品は、治療的な量のヒドロキシ尿素および治療的な量の一般構造Ａのフェニル酢酸誘導体を別個の調製物中に含む。
本発明は、治療的な量のバスタチンおよび治療的な量の一般構造Ａのフェニル酢酸誘導体を含む組成物を提供する。
本発明は、治療的な量のレチノイドおよび治療的な量の一般構造Ａのフェニル酢酸誘導体を含む組成物をさらに提供する。
最後に、本発明は、治療的な量のヒドロキシ尿素および治療的な量の一般構造Ａのフェニル酢酸誘導体を含む組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
図１は、150mg/kgのPAをボーラスで静脈注射後２時間の、PAおよびPAGの血清濃度、およびグルタミンの血漿濃度を示す。
図２は、細胞増殖およびHb生産の経時変化を示す。正常なドナー１由来の第II期培養物に２、４、６および８日にNaPA（5mM）を添加し、13日後に細胞を分析した。パネルA:1mlあたりのHb含有細胞数（×10-4）および細胞（MCH）あたりのHb量（pg）。パネルB:培養物1mlあたりのHb総量（pg）および総Hbに占めるHbF比率（％HbF）。データの点は４回測定した平均を表している。それぞれの測定結果の平均値からの偏差は、10％を超えなかった。2.5mMでのNaPBは同等の効果を生じた（結果は示さず）。どの事例でも細胞生存率は95％以上であった。
図３は、鎌形赤血球貧血症患者由来の赤血球前駆体培養時のHb種の比率に対するNaPAの効果を示す。NaPAを７日目の第II期培養物に付加した。細胞を13日目に採集および溶解し、そして陽イオン交換HPLCで分離後、HbF、HbA2およびHbSの比率を測定した。
図４は、NaPB処理した黒色腫細胞で表面抗原W6/32（MHCクラスＩ）、DR（MHCクラスII）およびICAM−１の発現増加を示す。黒色腫1011細胞を2mM PBで10日間処理した。効果の安定性を証明するために、処理は３日で中断した。FACS分析により、処理後の抗原の発現が著しく増加したことが明らかになった（陰の部分）；表面抗原の発現は、13日で10日と同様あるいはわずかに多かった。これは、PBが最終分化を誘導したことを示す。
図５は、PA、PBおよび様々なフェニルアセテート類似体によるペルオキシゾーム性増殖因子受容体（PPAR）の活性化を示す。活性化をインディケーター遺伝子であるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）（これは、アシルCoAオキシダーゼの反応要素によって調節される）の、コントロール（Ｃ）と比較した生成量の増加率で測定した。この活性化測定法の実験的詳細はSherら、Biochem.,32（21）:5598（1993））で見出される。個々の薬品の濃度（mM単位）は，様々な薬剤の以下の略号の後記した:CF＝クロフィブレイト、PA＝フェニルアセテート、CP＝クロロフェニルアセテート、PB＝フェニルブチレート、CPB＝クロロフェニルブチレート、PAG＝フェニルアセチルグルタミン、IPB＝インドフェニルブチレート、Ｂ＝ブチレート、IAA＝インドール酢酸、NA＝ナフチルアセテート、PP＝フェノキシプロピオン酸、２−4D＝2,4−ジクロロフェノキシアセテート。
図６は、フェニルブチレートによるグルタチオン（GSH）、γグルタミルトランスペプチダーゼ（GGT）およびカタラーゼの活性調節を示す。2mM PBで前立腺PC3細胞を処理した後、ほぼ100時間までの酵素の酸化防止力（mMまたは単位/mgタンパク質）を測定した。
図７は、イオン化放射線に曝す（Co60ガンマ照射）前に１、３、5mM PAおよび2.5mM PBでヒトグリア芽腫U87細胞を72時間、前処理することによって、この細胞のPAおよびPBによる放射性感受性が増強することを示す。
図８は前立腺ガン細胞および植物においてフェニルアセテート誘導体により誘導される脂質親和性と細胞増殖抑制性の関係を示す。（表14に示すデータから計算した）前立腺細胞のlog I/IC50値は、急激に生育する植物組織のI/IC5と比較した。試験した化合物を、CLOGPの増加する順に挙げると、４−ヒドロキシ−PA、PA、４−フルオロ−PA、３−メチル−PA、４−クロロ−PA、３−クロロ−PA、および４−ヨード−PAである。
図９はフェニルアセテートおよび選択した誘導体により誘導された表現型回復を示す。悪性の前立腺PC3細胞を「材料および方法」に記述したように処理した。データは、十分に阻害したPC3足場非依存性（Ａ）および基質ゲル侵入からの完全防御（Ｂ）について試験した化合物の比較潜在力を示す。フェニルアセテートおよびその類似体は、CLOGP値が増加する順に（上から下へ）表している。CLOGP値を表14および表15に与えた。足場依存効果は、（示していないが）U87細胞によって確認された。
図10は、処理７日後のLA−Ｎ−５細胞への［3H］チミジン取り込みに対するNaPAの効果の用量作用曲線を示す。値は、典型的な実験である４つのサンプルの平均±S.E.M.を表す。
図11は、NaPAのみ（○）および10-7M（▽）および10-6M（●）のRAの存在下での、培養７日後のLA−Ｎ−５細胞のAChE比活性に効果の見られる用量作用曲線を示す。それぞれの点は３つの培養の平均を表す（すべての場合でS.E.M.＜10％）。
図12は処理７日後の以下のものへの［3H］チミジン取り込みに対するPA（実線）およびフェニルブチレート（PB）（破線）の効果を示す用量作用曲線を示す：三角、SK−Ｎ−AS;黒菱形、LA−Ｎ−5;白菱形、Lan−１−15N;黒四角、LA−Ｎ−6;白四角、SK−Ｎ−SH−F;黒丸、SK−Ｎ−SH−N;および白丸、LA−Ｎ−２細胞。全ての場合、PBはPA以上に細胞増殖を阻害した。
図13はPAおよびPBによるLA−Ｎ−５神経芽腫の生育阻害の時間経過を示す。細胞は、表示の濃度のフェニルブチレート（Ａ）またはフェニルアセテート（Ｂ）で０日目に処理し、示したように毎日［3H］チミジンの取り込みを調べた。
図14は、PB（Ａ）またはPA（Ｂ）が表示したような各種濃度で存在するときあるいは存在しないときの、LA−Ｎ−５細胞のAChE比活性の時間経過を示す。全ての場合で、一時的にAChEが増加したものは図13で示したように［3H］チミジン取り込みの減少が誘導された。4mM PBで見られる処理４日後のAChE活性の急激な低下はおそらく、培養物の生存率の減少によるものである。
図15は、フェニルアセテートおよびフェニルブチレートによるLA−Ｎ−５細胞の増殖抑制効果の可逆性を示す。細胞は６日間、PA（黒丸;5mM）またはPB（黒四角;2mM）を存在させ、あるいは存在させない（０）で培養し、そして洗浄し、コントロール培地（実線）または処理期間と同じ濃度の試薬を含む培地（破線）で再培養した。洗浄後、細胞は図示したように処理後２週間までの間種々の日数培養し、［3H］チミジンの取り込みを調べた。
図16はAChE比活性の誘導増加の可逆性を示す。LA−Ｎ−５細胞は６日間、PA（横線四角;5mM）またはPB（交差四角;2mM）を存在させ、あるいは存在させない（黒四角）で培養し、そして洗浄し、コントロール培地（実線グラフ）あるいは処理期間と同じ濃度の試薬を含む培地（四角記号のある線）で再培養した。細胞は示したように処理後１週間までの間種々の日数培養し、AChE比活性を調べた。
図17は、NaPA、LOV、およびこの２種の試薬の組み合わせを用いる処理における、A172神経膠腫細胞の生育静止を示す（３日間連続処理）。
図18は、ロバスタチン（0.1μＭ）とフェニルアセテート（2mM）との組み合わせによる神経膠種細胞の侵入抑制を示す（A172細胞、３日間連続処理）。
図19は、NaPAによる抗ガン剤の可能性を示す。
図20は、PC−３細胞をオキシ尿素（100μＭ）の試薬に曝したときの持続時間に対する、生存曲線を示す。細胞は各種時間、試薬に曝された。しかし、５日間（120時間）合計すると、全てのものが生育していた。試薬を含有する培地を試薬を含有しない培地に置換することによって、試薬に曝すのを終了した。本実験では、短期間試薬に曝した後で、細胞の生存率が回復するのを検出できなかった。IC50は露出120時間後で初めて得られた。
図21は、各種神経外胚葉ガン細胞株に対するPAの生育阻害効果を示す。細胞をMEM＋10％FCSの96ウェルミクロタイタープレートで生育し、各種濃度のPAを含む培地または培地のみで96時間処理した。次に、１ウェルあたり3H−チミジン１μCiを加えた。４時間後、半自動化細胞回収機で細胞を集め、液体シンチレーションカウンターで3H−チミジンの取り込みを測定した。
図22は、ヒトTGFβ１（上パネル）およびヒトTGFβ２（下パネル）に対する中和抗体がU251細胞に対するPAの抗増殖効果をどれくらいアンタゴナイズできなかったかということを示す。U251細胞をMEM＋10％FCSの96ウェルミクロタイタープレートで10mMのPAを含む培地または培地のみで培養した。インキュベート開始からPAを含むウェルにTGFβ１およびTGFβ２に対する中和抗体を加えた。対応する種類の通常のIgGをコントロールに用いた。細胞増殖速度は、１ウェルあたり１μCiの3H−チミジンを加え、４時間後に細胞を集め、液体シンチレーションカウンターで3H−チミジンの取り込みを測定して決定した。
V.発明の詳細な説明
本明細書で使用される用語「フェニルアセテート誘導体（phenylacetic acidderivative）」または「フェニルアセテートアナログ（phenylacetic acid analog）」は、以下の化合物を意味する：
Figure 0003628694
；ここで、
R0は、アリール（例えば、フェニル、ナフチル）、フェノキシ、置換アリール（例えば、１つまたはそれ以上のハロゲン［例えば、Ｆ、Cl、Br、Ｉ］、低級アルキル［例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル］あるいはヒドロキシ置換体（substituent））または置換フェノキシ（例えば、１つまたはそれ以上のハロゲン［例えば、Ｆ、Cl、Br、Ｉ］、低級アルキル［例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル］あるいはヒドロキシ置換体）である；
R1およびR2は、それぞれ、Ｈ、低級アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ）、低級の直鎖および分枝鎖アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル）またはハロゲン（例えば、Ｆ、Cl、Br、Ｉ）である；
R3およびR4は、それぞれ、Ｈ、低級の直鎖および分枝鎖アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル）、低級アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ）、またはハロゲン（例えば、Ｆ、Cl、Br、Ｉ）である；
そして、
ｎは０から２の整数である；
それらの塩（例えば、Na+、K+、または他の薬学的に受容可能な塩）；それらの立体異性体；およびそれらの混合物。
ｎが２のとき、２つのR3置換基のそれぞれおよび２つのR4置換基のそれぞれは、独立して、上記のフェニルアセテート誘導体の定義内で変化し得る。この定義にはフェニルアセテート（PAA）およびフェニルブチレート（PBA）が包含されることが意図される。この定義による混合物にはカルボン酸塩、例えば、フェニルアセテートナトリウムおよびフェニルアセテートカリウムの混合物、を包含することが意図される。これらの化合物のカルボキシル部分は主な活性部位であるので、ここでフェニルアセテート（PA）およびフェニルブチレート（PB）のようなカルボキシレートについて言及するときは、Na+、K+、または他の薬学的に受容可能なカチオン（例えば、アルギニン）のような適切な中和性のカオチンについて言及することも意図する。それゆえ、本明細書で用いられるPAまたはPB誘導体あるいは類似体とは、この定義でいうフェニルアセテート誘導体を意味する。これらの誘導体のいくつかは、生物系に存在する場合に相互に変換され得る。例えば、PAは、酵素的に動物体内でPBに変換され得、そして同様にPBはPAに変換され得る。
従って、フェニル酢酸誘導体には、フェニル酢酸、フェニルプロピオン酸、フェニル酪酸、１−ナフチル酢酸、フェノキシ酢酸、フェノキシプロピオン酸、フェノキシ酪酸、４−クロロフェニル酢酸、４−クロロフェニル酪酸、４−ヨードフェニル酢酸、４−ヨードフェニル酪酸、α−メチルフェニル酢酸、α−メトキシフェニル酢酸、α−エチルフェニル酢酸、α−ヒドロキシフェニル酢酸、４−フルオロフェニル酢酸、４−フルオロフェニル酪酸、２−メチルフェニル酢酸、３−メチルフェニル酢酸、４−メチルフェニル酢酸、３−クロロフェニル酢酸、３−クロロフェニル酪酸、２−クロロフェニル酢酸、２−クロロフェニル酪酸、および2,6−ジクロロフェニル酢酸、ならびにこれらの化合物のナトリウム塩が包含されるが、これらに限定されない。
本発明の化合物は、静脈的に、腸溶的に、非経口的に、筋肉内に、鼻口内に、皮下的に、局所的に、膀胱内にまたは経口的に投与され得る。投薬量は、インビトロおよびインビボでの抗ガン性研究で観察された効果的な阻害濃度に基づく。本発明の化合物の種々の有効な利用については、これらはまた他の抗ガン剤（例えば、オキシ尿素、５−アザシチジン、５−アザ−2'−デオキシシチジンおよびスラミン）；レチノイド；ホルモン；生物学的応答モディファイヤー（例えば、インターフェロンおよび造血増殖因子）；および従来の化学および放射線療法と併行してあるいは組み合わせて投与し得るという知見からさらに明らかとなる。
本発明の方法および化合物は、ヒト被験者を含む動物被験体を処置するために使用され得ることが理解される。
本明細書を通して用いられている用語「〜と併用し」は、併用構成薬物を、同時にあるいは薬物が体内で同時に活性であるような間隔で処置することを意味する。さらに、本明細書で使用する用語「治療量」とは、薬剤、薬物あるいはクレームされた使用に適切な一般的なクラスの化合物の総量を示す。それゆえ、「治療量」とは、上記活性を有しないクラスのものを排除している。
本明細書で使用する用語「レチノイド」または「レチノイズ」は、９−シスレチノイン酸およびトランス、レチノイン酸を含むあらゆる適切な一般的なクラスを含んでいるが、これに限定されない。レチノイドを組み合わせた療法は乳ガン、白血病、および悪性黒色腫を包含するガンの処置に適切である。
本明細書で使用されるメバロン酸経路の阻害剤は、テルペンおよびバスタチンのような化合物を含む。適切なバスタチンはロバスタチンを含んでいる。適切なテルペンは、リモネンおよびその誘導体を含んでいる。
ビオフラボノイドは、ビタミンＰ複合体として知られている化合物のクラスであり、そして、毛細血管の脆性に影響を与えること（止血剤）として知られている。一般にこれらは毛細血管の透過性および脆性を減少させる。本明細書で使用されるフラボノイドはアピゲニン（apigenin）およびクエルセチン（quercetin）を含む。しかし、他のフラボノイドも同様の有用性が期待され得る。
個々の化合物の特定の活性は、実施例に記載されたアッセイおよびモデルを用しいてスクリーニングされ得る。
本発明で使用される用語「脂質代謝の調節」は、インビボでの脂質生産および分解能を変化させる治療能力を示す。例えば、ある脂質代謝の調節は、血清トリグリセリドの減少（被験体の血清中の低密度および高密度のリポタンパク質のレベル）、すなわち被験体のコレステロールのレベルを下げる。
VI.実施例
実験を含む本明細書中に記載の実施例は、あらゆる言外の限定を有することなく、以下のＡ〜Ｒに関するフェニル酢酸およびその誘導体に焦点を置いた本発明の実施を例示するための方法を提供する。A.ガンの治療および予防におけるフェニル酢酸およびその誘導体の使用;B.創傷癒合におけるフェニル酢酸およびその誘導体の使用;C.インターロイキン−６と関連した疾患の治療におけるフェニル酢酸およびその誘導体の使用;D.エイズ関連のCNS機能障害の治療におけるフェニル酢酸およびその誘導体の使用;E.免疫監視を強めるためのフェニル酢酸およびその誘導体の使用;F.患者におけるフェニル酢酸およびその誘導体の用量レベルおよび／またはこれらの薬物に対する患者の応答をモニターする方法;G.フェニル酢酸およびその誘導体によるPPARの活性化;H.多剤耐性表現型を有するガンの治療におけるフェニル酢酸およびその誘導体の使用;I.フェニル酢酸およびその誘導体の効力と親油性との間の相関;J.神経芽細胞腫細胞を含むようなガンの治療および予防のための、フェニル酢酸およびその誘導体とレチノイン酸との相乗的併用;K.悪性神経膠腫または他のCNS腫瘍のようなガンの治療および予防のための、フェニル酢酸およびその誘導体とロバスタチン（lovastatin）との相乗的併用;L.悪性黒色腫または他の神経外胚葉腫瘍を含むようなガンおよび他の分化障害の治療および予防のためのフェニル酢酸およびその誘導体;M.前立腺ガンのようなガンの治療および予防のための、フェニル酢酸およびその誘導体とオキシ尿素（HU）との相乗的併用;N.髄芽細胞腫および神経膠星状細胞腫誘導細胞を含むガンの治療および予防のためのフェニル酢酸およびその誘導体;O.PAおよびPBを用いる治療に関連するヒト研究におけるフェニル酢酸およびその誘導体;P.血清トリグリセリドを減少させる工程を含む脂質代謝を改変する方法におけるフェニル酢酸およびその誘導体;Q.悪性細胞および非悪性細胞でのフェニル酢酸およびその誘導体によるHbFの誘導；およびR.フェニル酢酸およびその誘導体を投与する方法。
セクションA.ガンの治療または予防におけるフェニル酢酸およびその誘導体の使用
本明細書中で議論されるように、NaPAおよびNaPBは、薬理学的な、非毒性の濃度でインビトロおよび動物モデルにおける腫瘍の増殖に影響を及ぼす。これらの芳香族脂肪酸は、細胞増殖抑制性を誘導し、そしてホルモン治療抵抗性の前立腺癌腫、神経膠芽細胞腫、悪性黒色腫、および肺癌腫を含む種々のヒト悪性細胞の成熟を促進する。腫瘍生物学における顕著な変化は、腫瘍増殖、浸入、血管形成、および免疫原性と関連される遺伝子の発現の変化と関連付けられた。多数の薬物作用メカニズムが関わるようである。これらのメカニズムには、（ａ）脂質代謝の改変、（ｂ）DNAのハイポメチル化（hypomethylation）および転写活性化による遺伝子発現の調節、および（ｃ）タンパク質のイソプレニル化の阻害を包含する。第Ｉ期臨床治験では、これらの新規な、非毒性の分化誘導剤の効果を確認した。
フェニル酸誘導体を含有する薬学的組成物は、悪性への逆行を引き起こすこと、および腫瘍細胞の分化を誘導することが示された。例えば、腫瘍細胞の分化を誘導する薬物の能力を示すために、インビトロおよびインビボの異なる分化モデル系を使用した。使用した第１の系は、ヒト前骨髄球性白血病細胞株HL−60であった。この細胞株は、骨髄細胞または単核細胞株列の方へ最終的に分化するために誘導され得る、方向づけられていない前駆細胞を表す。第２の系では、筋細胞、脂肪細胞、および軟骨細胞に分化する能力を有する不死化胚間葉C3H 10T1/2細胞を使用した。第３の系は、ヒト赤白血病K562細胞を使用した。なぜなら、これらはヘモグロビンを産生するために誘導され得るからである。インビボ実験は、ヒトおよび動物での最終分化を誘導することにおいてNaPAの有効性を示した。
実施例1:悪性神経膠腫（gloma）における増殖阻止
さらに、フェニルアセテートは、フェニルケトン尿症において未成熟脳への損傷と関連付けられている。発育中の正常脳と悪性中枢神経系腫瘍との間の増殖パターンおよび代謝が類似するために、フェニルアセテートはいくかの脳ガンに損傷を与え得る。フェニルアセテートは、小児および成人が十分に耐える薬理学的濃度で使用される場合、細胞増殖抑制性および培養されたヒト神経膠芽細胞腫細胞の悪性特性の逆転を誘導し得る。興味深いことに、処置された腫瘍細胞は、メバロネートからの新たなコレステロール合成の選択的減少を含む、フェニルケトン尿症様病態で観察された生化学的変化と同様の生化学的変化を示した。神経膠腫（しかし、正常な成熟脳細胞ではない）が細胞増殖に必要なステロールおよびイソプレノイドの生産のためのメバロネートに高度に依存するために、フェニルアセテートは、正常組織には影響を与えずに、インビボで腫瘍増殖に影響を及ぼすことが期待される。頭蓋内神経膠腫を有するラットの全身治療は、宿主に明らかな毒性を与えずに有意な腫瘍抑制を生じる。未分化の脳に対する選択的な活性に関する臨床結果と一致する実験データは、フェニルアセテートが悪性神経膠腫の治療に安全かつ効果的な新規アプローチを提供し得ることを示唆する。
尿素回路障害を有する小児のフェニルアセテート治療で得られた臨床経験は、ミリモルレベルが有意な有害作用を有せずに達成され得ることを示す。しかし、これらの患者において神経学的毒性が認められないのは、フェニルケトン尿症（PKU）（フェニルアセテートの産生過剰、小頭蓋症、および精神遅滞と関連したフェニルアラニン代謝の先天的エラー）で報告されている重篤な脳損傷とは明白に対照的である。［Scriver.C.R.およびC.L.Clow.1980.フェニルケトン尿症：ヒト生化学的遺伝学の要説．New Engl.J.Med.303:1394−1400.］。臨床的結果中の差は、フェニルアセテートが、出生前および出生後の両方で血液脳関門を迅速に横切るが、神経学的毒性は未成熟の脳に限られるという事実により説明され得る。感受性の範囲が発育の過程で制限されることについての決定的な証拠は、「母性PKU症候群」の現象により提供される；早期診断され、そしてフェニルアラニン制限食に保持されるPKU女性は、正常に発育し、その後の正規の食餌に耐える。これらの女性は、母性PKUが治療されていないために、しばしば遺伝的に正常ではあるが、精神的に遅滞した乳児を出産する。高レベルの循環中フェニルアセテートは、母親の成熟組織に悪影響を及ぼさずに、胎児の脳に損傷を与える。PKUにおける最初の病理的変化は、神経膠細胞を迅速に発育させることを包含し、そして次の神経機能障害を伴う脂質代謝および髄鞘形成の変化により特徴づけられる。損傷しやすい胎児神経膠組織は、多くの分子的および生化学的局面において新生物神経膠細胞に類似する。これらの局面には、細胞複製に重要なステロールおよびイソプレノイドの合成のためのメバロネート（MVA）代謝［Kandutsch,A.A.およびS.E.Saucier.1969.正常およびジムピ（jimpy）マウスの発育中の脳におけるステロール合成の調節．Arch.Bio chem.Biophys.135:201−208;Fumagalli,R.,E.Grossi,P.Paoletti、およびR.Paoletti.1964.脳腫瘍中の脂質に関する研究I.ヒト脳腫瘍中のコレステロールの前駆体ステロールの発生および意義．J.Neurochem.11:561−565;Grossi,E.,P.Paoletti、およびR.Paoletti.1958.脳のコレステロールおよび脂肪酸の生合成の分析．Arch.Int.Phy siol.Biochem.66:564−572］、およびDNA、RNAおよびタンパク質の合成のための窒素ドナーとしての循環中のグルタミンへの特独な依存性［Perry.T.L.,S.Hasen,B.Tischler,R.Bunting,およびS.Diamond.1970.フェニルケトン尿症におけるグルタミン涸渇、精神欠陥の可能な原因．New Engl.J.Med.282:761−766;Weber,G.1983.ガン細胞の生化学的ストラテジーおよび化学治療法の設計:G.H.A Clowes記念講演．Cancer Res.43:3466−3492」が包含される。これらの研究の基礎となる仮説は、ヒトの血清グルタミンと結合しそしてこれを涸渇すること、および未成熟脳のMVA経路を阻害することが知られているフェニルアセテート［Castillo,M.,M.F.ZafraおよびE.Garcia−Peregrin.1988.実験的高フェニルアラニン血症における脳および肝臓の３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−CoAレダクターゼおよびメバロネート−５−ピロリン酸デカルボキシラーゼの阻害．Neurochem.Res.13:551−555;Castillo.M.,J.Iglesias,M.F.Zafra,およびE.Garcia−Peregrin.1991.フェニルアラニンのフェニルおよびフェノール性誘導体によるニワトリ脳コレステロール生成酵素の阻害．Neurochem.Int.18:171−174;Castillo,M.,M.Martinez−Cayuela,M.F.Zafra,およびE.Garcia−Peregrin.1991.肝臓コレステロール生成の主な調節酵素に対するフェニルアラニン誘導体の効果．Mol.Ce ll.Biochem.105:21−25］は、悪性神経膠腫中のこれらの重要な制御ポイントを攻撃し得る。フェニルアセテートの有効性を、インビトロおよびインビボの腫瘍モデル両方を用いて示した。
細胞培養物および試薬。ヒト神経膠芽細胞腫細胞株をAmerican Type Culture Collection（ATCC,Rockville,MD）から購入し、そして他に特定されなければ、10％の熱で不活性化した仔ウシ血清、抗生物質および2mMLグルタミンを補充したRPMI 1640に保持した。新たに得られた臍帯から単離したヒト臍静脈内皮細胞は、D.GrantおよびH.Kleinman（NIH,Bethesda MD）から提供された。フェニル酢酸およびフェニル酪酸のナトリウム塩はElan Pharmaceutical Corporation（Gainseville,GA）から提供された。フェニルアセチルグルタミンは、S.Brusilow（Johns Hopkins,MD）からの贈呈物であった。
細胞複製および生存率の評価。３−［4,5−ジメチルチアゾール−２−イル］−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロマイドを用いる酵素アッセイ（Sigma,St.Louis,MO）［Alley,M.C.,D.A.Scudiero,A.Monks,M.L.Hursey,M.J.Czerwinski,D.L.Fine,B.J.Abbott,J.G.Mayo,R.H.Schoemaker,およびM.R.Boyd,1988.マイクロ培養テトラゾリウムアッセイを用いるヒト腫瘍細胞株のパネルによる薬物スクリーニングの可能性．Cancer Res.48:589−601］、血球計を用いる細胞計数、続いて、トリプシン/EDTAによる剥離により、およびDNAへのチミジン組み込みにより、増殖率を決定した。異なるアッセイは本質的に同じ結果を生じた。細胞生存率をトリパンブルー排除により評価した。
半固体寒天におけるコロニー形成。腫瘍細胞をトリプシン/EDTAで剥離し、0.36％寒天を含有する成長培地に再懸濁させ、そして薬物の存在または非存在下で固体寒天（0.9％）基底層にプレーティングした。３週間後、30個またはそれ以上の細胞から構成されるコロニーを評価した。
免疫細胞化学。細胞を、Dako PAP kit K537（Dako Corporation,CA）を用いる抗ビメンチン（vimentin）モノクロナール抗体で免疫染色した。
コレステロール、タンパク質およびDNA合成の測定。ステロイド合成の研究のために、３μＭロバスタチンおよび0.5mM非標識メバロネートを含有する成長培地にて、5mMフェニルアセテートまたは2.5mMフェニルブチレートの存在または非存在下で、５×106DPM［５−3H］−メバロネート（35Ci/mmol）（New England Nuclear,Boston,MA）を用いて細胞を24時間標識した。細胞ステロイドをヘキサンで抽出し、そしてシリカ薄層クロマトグラフィーにより分離した。ヘキサンに溶解した放射性標識生成物のRfは、３つの異なる溶媒系中の放射性標識コレステロール標準と同じであった。同様に処置した細胞を、［3H］−ロイシン（158Ci/mmol）または［3H］−デオキシチミジン（6.7Ci/mmol）（New England Nuclear）を用いた代謝標識により、新たなタンパク質およびDNA合成について試験した。フェニルアセテート／フェニルブチレートと共にインキュベートした細胞ホモジネート中の［１−14C］−メバロネート（49.5mCi/mmol）（Amersham,Chicago,IL）から放出した14CO2の測定を、確立された手順に若干の改変を加えて実施した。
タンパク質のイソプレニル化の分析。細胞培養物を、完全成長培地中10mMフェニルアセテートまたは2.5mMフェニルブチレートと共に24時間インキュベートし、そして処理の最後の15時間でRS−［２−14C］−メバロネート（16μCi/ml、比放射能15μCi/mmol）（American Radiolabeled Chemicals,Inc.St.Louis,MO）で標識した。全細胞タンパク質を抽出し、10％SDS−ポリアクリルアミドゲルに再溶解させ、そしてクマシーブリリアントブルー（Commassie Brilliant Blue）で染色した。次いで、ゲルを乾燥させ、そしてKodak X−Omatフィルムに４日間露光させた。
動物研究。ヒト神経膠芽細胞腫細胞の腫瘍形成表現型に対するフェニルアセテートの効果を測定するために、培養物を１週間前処理し、次いで、回収し、30％マトリゲル（matrigel）（Collaborative Biomedical Products,Bedford,MA）を含有する培地に再懸濁させ、そして５週令の雌性無胸腺マウス（Division of Cancer Treatment,NCI Animal Program,Frederick Cancer Research Facility.）にs.c.移植した（部位当たり2.5×106細胞）。次いで、動物を、注射部位での腫瘍増殖について観察した。薬物のインビボでの効果をさらに評価するために、Fisher 344ラットは、上記のように［Weizsaecker,M.,D.F.Deen,M.L.Rosenblum,T.Hoshino,P.H.Gutin,およびM.Baker.1981.9Lラット脳腫瘍：動物モデルの説明および適用．J.Neurol.224:183−192;Culver,K.W.,Z.Ram,S.Walbridge,H.Ishii,E.H.Oldfield,およびR.M.Blaese.1992.実験脳腫瘍の治療のためのレトロウイルスベクター産生細胞を用いたインビボでの遺伝子導入．Science.256:1550−1552］、右大脳半球の深層白質に同系9L神経膠肉腫細胞（４×104）の定位接種を受けた。次いで、浸透ミニポンプによる皮下移植を用いて、ナトリウムフェニルアセテート（550mg/kg/日、s.c.）で動物を２週間連続的に処置した。コントロールラットでは、ミニポンプを生理食塩水で充填した。データの統計的な解析は、フィッシャーの抽出テスト（Fisher's Exact Test）を使用した。
培養ヒト神経膠芽細胞腫細胞における細胞増殖抑制性および表現型復帰の誘導。神経膠芽細胞腫細胞のフェニルアセテートを用いた処置により、時間および用量依存性増殖阻止が生じ、同様にDNA合成の減少を伴った。4mMフェニルアセテートによる46日間連続的な処置の後、U87、A172、U373、U343、およびHS683培養物では約50％の増殖阻害があった（IC50 4.4±0.6mM）。腫瘍細胞応答の異種性質を反映して、神経膠芽細胞腫U251およびU318細胞は、感受性が少なかった（８〜10mMのIC50値）。患者で予想される薬理学的な病態を模倣して行われるさらなる研究は、グルタミン涸渇培地中のフェニルアセテートに細胞を曝すことを含んだ。これらの条件は、神経膠芽細胞腫細胞の増殖を完全にブロックするが、正常内皮細胞の複製に対して影響をほとんど有しなかった。脂肪酸伸長によって脳内に形成されたフェニルアセテートの中間代謝物であるフェニルブチレートもまた、腫瘍細胞複製を阻害したが（A172、U87およびU373では、IC50 2.2±0.2mM）、最終代謝物であるフェニルアセチルグルタミンは不活性であった。選択性腫瘍細胞増殖抑制性を誘導するに加えて、フェニルアセテートおよびフェニルブチレート両方とも、細胞の成熟化および骨格中間体フィラメントのパターンの変化（足場非依存性の消失）により出現する非悪性表現型への復帰を促進し、そして無胸腺マウスにおける腫瘍形成性を低下させる（表１）。腫瘍挙動におけるこれらの重要な変化は、増殖調節、血管形成、および免疫抑制（例えば、TGFα、HbF、およびTGF−β２）に関連される遺伝子の発現の変化により達成された。
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フェニルアセテートはメバロネート経路およびタンパク質のイソプレニル化を阻害する。フェニルアセテートに曝された神経膠細胞に観察された最も一致する生化学的変化は、脂質代謝の変化およびMVA経路の阻害を含んだ。アセチル−CoAおよびMVAのような前駆体からのコレステロールおよびイソプレノイドの活発な新たな合成は、発育中の脳の重要な特徴であり（しかし、成熟脳ではない）、髄鞘形成と一致する。これもまた悪性神経膠腫の特質である［Azarnoff,D.L.,G.L.Curran,およびW.P.Williamson.1958.インビトロでヒト頭蓋内腫瘍によるコレステロールへのアセテート−１−14Cの組み込み．J.Nat.Cancer Inst.21:1109−1115;Rudling,M.J.,B.Angelin,C.O.Peterson,およびV.P.Collins.1990.ヒト頭蓋内腫瘍における低密度リポタンパク質レセプター活性およびコレステロール要求性との関連．Cancer Res.50（補遺）:483−487］。コレステロール生産およびタンパク質のイソプレニル化は、24時間内にフェニルアセテートまたはフェニルブチレートのいずれかで処理した神経膠芽細胞腫において低下し、DNAおよび全タンパク質合成の変化が生じたが、これは48時間後に検出された。イソプレニル化の低下は、PKU様病態の胚脳で先に観察された効果であるMVAのデカルボキシル化の低下（対照の50％未満）と比較した。MVA−５−ピロリン酸テカルボキシラーゼ（脳中のコレステロール合成を調節する鍵酵素）を、MVAキナーゼおよびMVA−５−リン酸キナーゼが最小限だけ影響される条件下でフェニルアセテートにより阻害した。フェニルアセテートはまた、アセチル−CoAからのMVA合成を妨害する。しかし、神経膠芽細胞腫細胞は外因性MVA（0.3〜3mM）により治療し得なかった。これは、この合成よりむしろMVAを利用することが、プライム標的であることを示唆する。
メバロネートは、全細胞周期の進行に必要とされる数種のイソペンテニル部分（例えば、ステロール、ドリコール、ユビキノンおよびイソペンテニルアデニンの側鎖、および重要なタンパク質の小セットを修飾するプレニル基）の前駆体である［Goldstein,J.L.およびM.S.Brown.1990.メバロネート経路の調節．Nature.343:425−430;Marshall,C.J.1993.タンパク質のプレニル化：タンパク質−タンパク質相互作用の仲介物．Science.259:1865−1866;Braun,P.E.,D.De Angelis,W.W.Shtybel,およびL.Bernier.1991.イソプレノイド修飾は2',3'−環状ヌクレオチド3'−ホスホジエステラーゼを膜に結合させる．J.Neurosci.Res.30:540−544］。後者は、分裂シグナル変換導入に関わる原形質膜ＧおよびＧ様タンパク質（例えば、ras）（分子量20〜26kDa）、髄鞘形成関連酵素2',3'−サイクリックヌクレオチド3'−ホスホジエステラーゼ、および分裂に重要な役割を果たす核エンベロープラミン（44−74kDa）を含む。脳の速やかな発育の間におけるステロールおよびイソプレノイドの阻害は、未治療PKUに見られる小頭蓋症および髄鞘形成障害をもたらし得る。他方、成熟脳ではMVA経路が著しく活性でないため、脱分化された悪性神経膠腫をMVAを標的化することは、周囲の正常組織を損傷せずにインビボで腫瘍増殖を阻害することが期待される。
ラットの実験神経膠腫におけるフェニルアセテートの活性。フェニルアセテートのインビボでの抗腫瘍効果を評価するために、Fisherラットを同系9L神経膠肉腫細胞の定位大脳内注射で接種した。この腫瘍モデルは、３〜４週間内で約100％の死亡率が生じるという攻撃的増殖パターンに関して知られている。フェニルアセテートを、浸透圧ミニポンプによる皮下移植により連続的に投与して、550mg/kg/日の臨床的に達成し得る用量を送達した。頭蓋内に神経膠腫細胞を有するラットの２週間の全身治療は、検出可能な有害作用を有せずに腫瘍増殖を著しく抑制した（ｐ＜0.05、表２）。実験動物におけるさらなる研究は、フェニルアセテート（２〜3mMの血漿および髄液レベル）がインビボで腫瘍細胞の成熟化を誘導し、そして生存率を有意に延長した。
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1Fisher344ラットは、材料および方法に記載されるように、右大脳半球の深層白質に同系9L神経膠肉腫細胞（４×104）の定位接種を受けた。次いで、浸透ミニポンプによる皮下移植を用いて、ナトリウムフェニルアセテート（550mg/kg/日、s.c.）または生理食塩水のいずれかで動物を２週間の連続処置に供した。
２腫瘍接種後23日目に動物を屠殺し、抗腫瘍効果を測定した。知見を接種部位の組織的評価により確認した。
要約および見込み。フェニルアセテートは、発育中の胎児脳への損傷に長い間関連している。原発性CNS腫瘍が非常に未成熟胎児脳を連想させるので、悪性神経膠腫は、同等に損傷を受け易いはずである。さらに、天然のヒトモデルとしての母性PKU症候群を考慮すると、フェニルアセテートは正常組織に損傷を与えずに脳新生物の増殖を抑制することが期待される。実験データはこの仮説を支持する。フェニルアセテートは選択的な細胞増殖抑制性を誘導し、そしてインビトロおよびインビボで神経膠腫細胞の成熟を促進した。未熟増殖の停止および分化はまた、PKUの胎児脳への損傷の基礎となる。多数の作用メカニズムが関わり、これらには、ヒトにおけるタンパク質イソプレニル化の阻害および血漿グルタミンの涸渇が含まれる。証明可能な抗腫瘍活性、毒性の欠如、および投与の容易さ（経口または静脈内）は、悪性神経膠腫、ならびに他の新生物の処理におけるフェニルアセテートの臨床効果を示す。上記のように、フェニルアセテートは、インビトロで前立腺ガンに対し活性を示した。ガンを患った成人をフェニルアセテートで治療する第１相臨床試験は、治療レベルが有意な毒性を有せずに血漿および髄液で達成され得、そして前立腺癌腫および神経膠芽細胞腫患者に有益な予備証拠を提供することを確認した。
フェニルアセテートは、前立腺癌腫、神経膠芽細胞腫、および悪性黒色腫を含むヒト固体腫瘍を治療するために使用された。治療の結果として、復帰した足場依存性、低下した浸入および無胸腺マウスの腫瘍形成の消失により示されるように、選択的細胞増殖抑制性および表現型復帰が得られた。脳およびホルモン治療抵抗性の前立腺ガン細胞の分子分析は、増殖調節、血管形成、および免疫抑制に関連されるタンパク質であるTGFβの産生および分泌の著しい低下を示した。処理された前立腺細胞は、ヒトの疾患進行の分子マーカーであるウロキナーゼ−プラスミンーゲン活性化因子により仲介される、低下したタンパク質分解活性を示した。
実施例２:NaPAで処理された脳腫瘍における、成長停止、腫瘍成熟、および生存の延長
インビトロ研究。
細胞増殖。細胞増殖に対するNaPAの影響を、培養9L神経膠肉腫細胞に対するトリチウム化チミジン取り込みアッセイ、およびトリプシン/EDTAによる剥離後血球計数器を用いる細胞計数を用いて評価した。9Lは、Fischer 344ラット由来の同系の悪性神経膠腫瘍であり、そして大脳内接種後３〜４週間以内に100％の死亡率を伴う［Weizsaecker M、Deen DF、Rosenblum MLら、9Lラット脳腫瘍：動物モデルの解説および応用、J Neuol.1981;224:183−192］。腫瘍細胞を、５×104腫瘍細胞／ウェルで、24ウェルプレート（Costar、Cambridge、MA）中、10％ウシ胎児血清（Hyclone Laboratories Inc.,Logan,UT）、2mM L−グルタミン（GIBCO BRL、Gaithersburg、MD）、50U/mlペニシリン（GIBCO）および50μg/mlストレプトマシン（GIBCO）および2.5μg/mlファンギゾン（ICN Biomedicals Inc.,Costa Mesa、CA）を添加したダルベッコの改変イーグル培地（DMEM）中にプレーティングした。24時間後、培地を交換し、そしてNaPA（Elan Pharmaceutical Research Corp.,Gainesville、GA）を、０、2.5、５、および10mM濃度で５日間培地に添加した。回収６時間前、0.5mCiトリチウム化チミジン（ICN Radiochemicals、Irvine、CA）を各ウェルに添加した。チミジンの取り込みは、３連のシンチレーションカウントにより測定した。
半固形培地におけるコロニー形成。足場依存性成長（細胞が半固形培地でコロニーを形成する能力）が悪性神経膠細胞の特徴である。9L細胞を、トリプシン/EDTAを用いて回収し、そして0.36％寒天（Difco）を含む成長培地中1.0×104細胞/mlで再懸濁した。2mlの細胞懸濁液を、4mlの固形寒天（0.9％）でプレコートされた60mmプレート（Costar、Cambridge、MA）に添加した。フェニルアセテートを、異なる濃度（０、1.25、2.5および5mM）で寒天に添加した。第２番目の実験では、9L細胞を、5mM NaPAを含む組織培養中で７日間成長させた。次いで、記載のように、細胞を、NaPAを含まない寒天平板に移した。30またはそれより多い細胞を含むコロニーを３週間後に計数した。
9L脳腫瘍接種およびフェニルアセテート投与。230〜350g体重のFisher 344ラット（ｎ＝50）を、腹腔内（i.p.）ケタミン（90mg/Kg、Fort Dodge Laboratories,Inc,Fort Dodge,Iowa）およびキシラジン（10mg/Kg、Mobay Corporation,Shawnee、Kansas）を用いて麻酔し、そして定位固定装置（David Kopf Instruments,Tujunga,Galifornia）中に置いた。５μＬ（Hankの）平衡塩溶液中の４×104の同系の9L神経膠肉腫細胞を、定位固定装置の操作アームに連結した10μＬのハミルトンシリンジを用いて、右大脳半球の深部白質（接種の深さ3.5mm）中に注入した。10匹のラットにおいて、フェニルアセテートを、２つの2ML2浸透圧ポンプを用いて、５μl/時間の放出速度で14日間（Alza Corporation,Palo Alto,CA）、薬物の連続皮下（s.c.）放出により投与した。腫瘍接種の日に、ポンプを両側腹部の皮下組織中に移植した。ラット１匹当たり550mg/kgの連日用量に対して、ポンプ中の薬物濃度は650mg/ml（両方のポンプについて総量2600mg）であった。ミニポンプを、28日の全処置に対して14日後に取り替えた。15匹の別のラットに、記載されたように、腫瘍の大脳内投与７日後から開始して、NaPAを投与した。これらのラットでは、NaPAの別の連日注入（300mg/kg、i.p.）を28日間行った。コントロールラット（ｎ＝25）には、２つのs.c.2ML2浸透圧ポンプから連続生理食塩水を投与した。手術時にペニシリン（100,000u/kg、i.m.）を、ミニポンプ移植前のすべてのラットに投与した。各グループについて生存率を記録した。確立された腫瘍について処理された３匹のラットおよび２匹のコントロールラットを、NaPAの開始後７日（腫瘍摂取14日後）に屠殺した。これらを、処置された腫瘍の電子顕微鏡研究、インビボ増殖アッセイ、および血清中およびCSFのNaPAレベルの測定に用いた。末梢器官（心臓、肺、脾臓、肝臓、腎臓、腸、副腎、および生殖腺）を回収し、そして一般組織学的検査に供した。脳標本を切片にし、そして薬物関連毒性の証拠について、ルーチンのヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）ならびにミエリン染色（Luxol−fast blue）に対して染色した。
電子顕微鏡観察。動物を、pH7.4の0.1Mカコジル酸ナトリウム中の１％パラホルムアルデヒドおよび2.5％グルタルアルデヒドを用いて心臓内灌流により屠殺した。２時間後、固定した脳を緩衝液中で洗浄し、そして1mm厚さの冠状切片にスライスした。腫瘍を含む領域を、1mm3立方体にさらに解剖し、0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液中の２％オスミウムテトラオキシドを用いて２時間の間後固定し、緩衝液中で洗浄し、１％ウラニルアセテートを用いてpH5で一晩一括して媒染処理し、次いで洗浄し、脱水し、そしてEpon中に包埋した。薄切片を、いくつかのレベルで各ブロックに切断し、より大きなサンプリングを確実にした。腫瘍細胞の電子顕微鏡写真を、形態についてランダムに撮った。
インビトロ増殖アッセイ。１匹のNaPA処理および１匹の生理食塩水処理ラットに、腫瘍接種14日後、および処置開始７日後、9mg/3mlのBrdU（Amersham,Illinois）をi.p.注入した。２時間後、ラットを屠殺し、そして脳を取り出し切片にした。マウス抗BrdUモノクロナール抗体を、組織の免疫染色のために用い、この組織は、次いで、ヘマトキシリンで対比染色した。10高出力視野中の腫瘍細胞を、各腫瘍標本中で計数し、そして陽性の染色細胞（活性な細胞分裂の間のBrdUの取り込みを示す）のパーセントを記録した。
血清およびCSF中のNaPAレベルの測定。３匹のNaPA処理および２匹の生理食塩水処理ラットを、s.c.およびi.p.NaPAの併用、または生理食塩水投与の７日後、屠殺した。血液を心臓から引き抜き、そしてCSFを大槽から吸引した。CSFの容量制限のため、プールした血清およびCSFサンプルを同様の様式で評価した。生物流体の200μｌアリコートのタンパク質抽出を、100μｌの10％過塩素酸溶液を用いて実施した。150μｌの上清液を、25μｌの20％重炭酸カリウムで中和し、そして遠心分離した。次いで125μｌの上清液を、サンプリングチューブにピペットで移した。クロマトグラフィーを、30cmのWaters C18カラム（内径3.9mm）を用いて60℃でGilson715HPLCシステム上で実施した。75μｌの注入液を、20分間にわたって1ml/分の流速で５〜30％の範囲のアセトニトリル／水グラジエントを用いて溶出した。UVモニタリングを20nmの波長で実施した。フェニルアセテートの溶出時間は、14.8分であった。
統計解析。χ２乗検定を用いて、BrdU陽性細胞の割合を比較した。Mantel−Haenzel検定を、生存実験におけるNaPA処理と生理食塩水処理ラットとの間の生存率を比較するために用いた。
インビトロの結果
細胞増殖おいよび足場依存性に対するNaPAのインビトロ効果。
５日間のNaPAを用いた9L細胞の処置は、IC50が6.0±0.5mMで、細胞数の用量依存性の減少を生じた。これは、トリチウム化チミジン取り込みの減少を伴った。さらに、フェニルアセテートは、足場依存性の用量依存性回復を誘導し、悪性表現型の逆行を示した（表３）。寒天中（NaPAを含まない）にプレーティングする前７日間の間NaPAに曝された9L細胞は、なおコロニー形成において＞40％の阻害を示した（表３）。
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インビボ研究
インビボ増殖アッセイおよび電子顕微鏡知見。確立した脳腫瘍のNaPAを用いた処置は、増殖速度を有意に減少させる結果となった。1347の生理食塩水処置腫瘍細胞のうち429と比較して、1283の処置腫瘍細胞のうち285がBrdUに対して染色された（生理食塩水処理腫瘍では0.33に対してNaPA処置では0.22の分裂指数;p＜0.0001）。
これら腫瘍の電子顕微鏡撮影は、NaPA処置腫瘍細胞で、著量の良く組織化された粗面小胞体を示し、より高いレベルの細胞分化を示した［Ghadially FN編、細胞分化および新形成における小胞体およびリボソーム、Ultr astructural Pathology of the Cell and Matrix Third、London:Buttorworths;1992:450−454］。対照的に、非処置腫瘍は、一般に、粗面小胞体が乏しくそして多くのポリリボソームを有していた（これは高度に悪性な細胞の特徴である）。さらに、非処置腫瘍では、分裂細胞がより多い頻度で見出された。
NaPAの血清およびCSFレベル。s.c.およびi.p.NaPAの併用（850mg/kgの連日の総用量）または生理食塩水投与の７日後得られた、３匹の処置および２匹のコントロールラット由来のプールされた血清およびCSFのアッセイは、血清中に2.45mMのおよびCSF中に3.1mMの平均フェニルアセテートレベルを示した。生理食塩水処置ラットからのCSFサンプルではフェニルアセテートは検出されなかった。
生存実験
同時腫瘍接種およびNaPAの投与。10匹のNaPA処置ラットのうち７匹は、NaPAが腫瘍接種の日に開始して４週間投与されたとき、腫瘍接種後＞90日生存した。10匹のコントロールラットのうち９匹は、腫瘍接種後34日以内に死亡した（ｐ＜0.01、Mantel−Haenzel検定）。
確立された腫瘍のNaPAを用いた処理。s.c.およびi.p.NaPAで４週間（腫瘍接種７日後に開始）処置した12匹のラットのうち５匹の腫瘍接種後50日間なお生存し、その一方13匹の生理食塩水処置ラットのうち12匹は36日までに死亡した（ｐ＜0.03、Mantel−Haenzel検定）。
毒性。試験されたいずれのラットにおいてもNaPA処置の有害作用は検出されなかった。主な腫瘍末梢器官および非腫瘍性脳の組織学的評価は異常を示さなかった。
考察。フェニルアセテートは、本研究で用いられたインビトロおよびインビボ脳腫瘍モデルにおいて、強力な細胞増殖抑制性効果および抗腫瘍効果を誘導した。この効果は、長期間生存、および腫瘍接種と同時にまたは腫瘍が確立された後のいずれかでNaPAを投与されたラットの明らかな治癒により示されるように、薬物投与の期間を過ぎても持続した。このNaPAの延長効果は、おそらくいくつかの動物では不可逆的に、処置された腫瘍細胞の悪性表現型が、より良性のおよび分化した表現型に逆転したことを示す。足場非依存性、即ち、細胞が半固形寒天でコロニーを形成する能力は、悪性の神経膠腫細胞の特徴である。フェニルアセテートは、足場依存性の用量依存性回復を引き起こし、神経膠腫細胞の非悪性表現型の復帰を示した。コロニー形成の80％より多い阻害を、処置ラットにおいて測定された血清およびCSFレベルと同様に、2.5mMの寒天平板中のNaPA濃度で達成した。さらに、NaPAに対して１週間曝した後、40％より多い腫瘍細胞が、寒天平板中にNaPAが存在しないにもかかわらず良性の成長パターンを維持した（表３）。細胞分化の顕著なインビボ指標が、本発明者らの研究で処置脳腫瘍細胞の細胞下細胞器官中で観察された。生理食塩水処置腫瘍細胞中の非組織化された細胞質ポリリボソームは、NaPAにより過形成性の、良く組織化された、粗面小胞体に転換された。小胞体は、多くの異なる機能を行う高度に分化した構造である。それ故、良好に発達した小胞体は、細胞分化および機能的活性を示す。粗面小胞体の量、成長速度、および腫瘍の悪性度の間において逆の関係が認められている［Ghadially FN.Diagnostic Electron Microscopy of Tumours.第２版、London:Butterworth;1985］。非処置腫瘍細胞における多くのポリリボソームは、光学顕微鏡により観察される有系分裂の数と良く相関し、そしてBrdU増殖アッセイにより確認された。これらの変化は、悪性神経膠腫細胞に対するNaPAの分化効果を顕著に表し、そして細胞増殖におけるインビボ減少および脳腫瘍を有する処置動物で生じた生存の延長と相関する。
処置ラットでは、治療血液中およびCSFのNaPAレベルに到達した。高CSFレベルは、中枢神経系中および増殖する腫瘍中へのNaPAの良好な浸透を示す。用いられる用量は、先天性の尿素合成エラーを有する小児（2.5g/kg/日）またはラット（1.6g/kg/日）における、NaPAの既知の毒性レベルのかなり下であり、そしてNaPAがより高い用量で、おそらく抗腫瘍効率の増大とともに、安全に与えられ得ることを示す。これらのデータは、フェニルアセテートが、非毒性用量でラットに与えられれば、腫瘍成長の調節および細胞成熟に対して重要な効果を有することを示す。
実施例３:5−アザ−2'−デオキシシチジンで誘導される発ガンの抑制：
それらの低細胞障害性および遺伝毒性の可能性について選択された分化インデューサーは、化学的予防および維持治療において主要な価値を有し得る。具体的には、フェニルアセテートが化学的療法ハイポメチル化（hypomethylating）薬物５−アザ−2'−デオキシシチジン（5AzadC）による発ガンを予防する能力を、インビトロでおよびマウス中で試験した。不死化されているが、非腫瘍原性のras形質転換4C8線維芽細胞を5AzadCに一時的に曝すと、成長の接触阻害、獲得侵入力、および無胸腺マウスにおける腫瘍原性の損失により顕示される新生物性の形質転換が生じた。後者は、ras発現の増加およびコラーゲン生合成減少と関連した。これらの重要な表現型および分子変化は、フェニルアセテートの同時処理により妨げられた。フェニルアセテートによる5AzadC発ガンからの保護は：（ａ）両薬剤によるDNAハイポメチル化にかかわらず高度に効率的；（ｂ）細胞障害性および遺伝毒性効果がない；（ｃ）処置をやめた後も安定、および；（ｄ）インビボで再現される、ことである。4C8細胞を保持する無胸腺マウスは、5AzadCによる単回i.p.注入後、線維肉腫を発症したが、腫瘍の発症はフェニルアセテートの非毒性用量による全身処置により有意に阻害された。従って、フェニルアセテートおよび経口投与に適したその前駆体フェニル酪酸（phenylbutyrate）は、新しいクラスの化学的予防剤を呈示し得、その有効性および安全性がさらに評価されるべきである。
新生物性形質転換の複数工程である性質は、この疾患プロセスを、化学予防的介入に対して修正可能にする。いくつかの薬剤が、発ガンを阻害し、そしてそれによって原発性または続発性ガンの発症を阻害することが示されている［Kelloff,G.J.、C.W.Boone、W.F.,Malone、およびV.E.Steele、1992、化学的予防臨床治験、Mutation Res.,267:291−295;Weinstein,B.I.1991.ガン予防：最近の進歩およびさらなる機会、Cancer Res,51:5080S−5085S;Wattenberg,L.W.天然に存在するおよび合成化合物による発ガンの阻害。Y.Kuroda,D.M.ShankelおよびM.D.Waters編、Antimutagenesis and Anticarcinogenesis、Mechanisms II、pp.155−166.New York:Plenum Publishing Corp.,1990;Sporn,M.B.,およびD.L.Newton.1979.ガンおよびレチノイドの化学的予防。Fed.Proc.38:2528−2534］。主に重要なものは、ビタミン（Ａ、B12、Ｃ、D3、およびＥ）、レチノイド、およびテルペンを含む天然産物およびそれらのアナログである。これらの薬剤は、細胞成長および分化を調節することにより発ガン性傷害に続く新生物性形質転換を抑制し得る。そのような１つの成長調節因子がフェニルアセテートである。
化学的予防剤としてのフェニルアセテートの効力は、5AzadC誘導発ガンのインビトロおよびインビボモデルを用いて試験された。ガンおよびβ鎖ヘモグロビン異常症の処置における5AzadCの有望性にもかかわらず、その臨床応用は、発ガンの可能性に関する懸念から妨げられている。本研究で用いられるモデルは、転写的に活性化されたｃ−Ha−rasガン原遺伝子を発現する前ガン性のマウス線維芽細胞（細胞株4C8およびPR4）を含んでいた。これらの非腫瘍形成性細胞は、薬学的用量の5AzadCによって高度に悪性転換を受けやすい。しかし、フェニルアセテートは、培養およびマウスの両方において5AzadC誘導発ガンからそのような傷を受け易い細胞を保護し得る。
細胞培養および試薬。マウスNIH3T3線維芽細胞、PR4Nおよび4C8−A10（本明細書ではPR4および4C8と称する）のサブクローンは先に記載されている［Wilson,V.L.,R.A.Smith,H.Autrup,H.Krokan,D.E.Musci,N−Ｎ−T.Le,J.Longoria,D.Ziska,およびC.C.Harris.1986.32Pポストラベル分析によるゲノム５−メチルシトシン測定、Anal.Bio chem.,152:275−284;Dugaiczyk,A,J.J.Haron,E.M.Ston,O.E.Dennison,K.N.Rothblum,およびR.J.Schwartz.1983.ニワトリ筋肉から単離されたグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデビドロゲナーゼメッセンジャーリボ核酸のデオキシリボ核酸コピーのクローニングおよび配列決定、Biochem.22:1605−1613］。両方の細胞株は、マウスインターフェロンα／βを用いて長期間処置後、LTR/c−Ha−ras１−形質転換3T3細胞から単離された表現型復帰変異体である。培養は、10％の熱不活性化したウシ胎児血清（Gibco）および抗生物質を補充したダルベッコの改変イーグル培地（DMEM）中で維持された。フェニル酢酸およびフェニル酪酸のナトリウム塩（Elan Pharmaceuticals Corporation）は蒸留水に溶解した。5AzadC（Sigma St.Louis MO）は、リン酸塩緩衝化生理食塩水（PBS）中に溶解し、そして使用するまでアリコートに分けて−20℃で貯蔵した。薬物の加水分解を防ぐために、5AzadCを直接光への曝露を常時避けた。
5AzadCによる処置。培養中の処置のために、細胞を１〜２×105細胞で100mm皿中にプレーティングし、そして薬物を、20および48時間後成長培地に添加した。引き続き細胞を、ヌクレオシドアナログの非存在下で継代培養し、そして表現型の変化を観察した。5AzadCを用いたインビボ処置では、６〜９週齢の雌性無胸腺ヌードマウス（Division of Cancer Treatment,NCI Animal Program,Frederick Cancer Research Facility）に、0.5×106細胞を皮下（s.c.）注射で接種した。24時間後、200μlPBS中の新たに調製した400μｇの5AzadCを、各動物に腹腔内（i.p.）投与した（約20mg/kg）。NaPAによる全身処置が本文中に記載されている。
マトリゲル（Matrigel）上での成長。細胞が組織バリアを分解しそして横切る能力を、再構築された基底膜であるマトリゲル（Collaborative Research）を利用する定性インビトロ侵入アッセイにより評価した。細胞を、48時間の間、T.C.プラスチック皿中で、単独の5AzadCまたはNaPAと組み合わせた5AzadCに曝した。NaPA処置を、さらに１〜２週間継続した。次いで細胞を、250μｌのマトリゲル（10mg/ml）で予めコートした16mm皿（Costar、Cambridge、MA）に再プレーティング（ポイント当たり５×104）した。NaPAは、皿に添加されたか、または効果の可逆性を測定するために省略されたかのいずれかであった。侵入細胞のネット様形成特性は、12時間以内に生じた；マトリゲル中への侵入は６〜９日後明らかであった。
無胸腺マウスにおける腫瘍形成。細胞を、４〜６週齢の雌性無胸腺ヌードマウス（Division of Cancer Treatment,NCI animal Program,Frederick Cancer Research Facility）中にs.c.（部位当たり５×105細胞）注入した。腫瘍の数、サイズ、および重量を、３〜４週後記録した。組織化学的検査のために腫瘍を切除し、Bouinの溶液（ピクリン酸:37％ホルムアルデヒド：氷酢酸、15:5:1vol/vol）中で固定し、そしてＨ＆Ｅで染色した。
DNAメチル化の測定。５−メチルシトシン含量を測定するために、第２回目の5AzadC処置の24時間後、培養のサンプルを採取した。細胞ペレットを、0.5％SDS、0.1M NaCl、10mM EDTA pH8.0中で溶解し、400μg/mlのプロテイナーゼＫ（Boehringer Mannheim）を添加し、そしてDNA単離および分析まで−70℃で保存した。細胞内DNA中のメチル化／非メチル化シトシン残基の含量を、先に記載のように、32Pポストラベル技法により測定した。
ノーザンブロット分析およびDNAプローブ。細胞質RNAを指数的に増殖する細胞から抽出し、そして1.2％アガロース−ホルムアルデヒドゲル中の電気泳動により分離した。RNA調製、ナイロン膜上へのブロッティング（Schleicher and Schuell）、放射性標識DNAプローブとのハイブリダイゼーション、およびオートラジオグラフィーは、記載［Rimoldi,D.,V.Srikantan,V.L.Wilson,R.H.Bassin,およびD.Samid.1991。５−アザ−2'デオキシシチジンにより誘導される悪性形質転換に対するrasまたはmycガン原遺伝子を発現する非腫瘍形成性線維芽細胞の増加した感受性。Cancer Res、51:324−330］のように行った。DNAプローブは:v−Ki−rasの6.2kb EcoR Iフラグメント、ヒトｃ−Ha−ras I遺伝子の2.9kb Sac Iフラグメント、およびｃ−mvc遺伝子のBamH I4.5kbフラグメントを含む。グリセルアルデヒドホスフェートデヒドロゲナーゼcDNA［Dugaiczyk,A、J.J.Haron、E.M.Ston、O.E.Dennison、K.N.Rothblum、およびR.J.Schwartz 1983。ニワトリ筋肉から単離されたグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼメッセンジャーリボ核酸のデオキシリボ核酸コピーのクローニングおよび配列決定、Biochem.、22:1605−1613］は、M.A.Tainsky（University of Texas、Houston）により、そしてマウストランシンcDNAは、G.T.Bowden（University of Arizona、Tucson）により提供された。マウス組織適合性クラスＩ抗原に対するcDNAプローブは、G.Jay（NIH、Bethesda）からの贈与であった。放射標識プローブを、ランダムプライムDNA標識キット（Boehringer Mannheim、Germany）を用いて［32P］dCTP（NEN）で調製した。
5AzadCにより誘導されるインビトロ発ガンおよびフェニルアセテートによるその予防。非処置の4C8およびPR4は、上皮様細胞を含む接触阻害された単層を形成した。先の観察に一致して、対数増殖期の間に0.1μM 5AzadCに対しこれらの培養を一時的に曝すと、迅速および大量の新生物性形質転換を生じる。5AzadC処置の１週間以内に、細胞集団の大部分が、屈折性を有し、そして形成が紡錘形になり、そして成長の接触阻害の損失を示す、増加した飽和密度の多層培養を形成した（表４）。これらの表現型変化は、５〜10mM NaPAにより予防され得る（表４）。NaPA処置のいくつかの異なるレジュメが同様に効果的であることが見出された。これらは：（ａ）5AzadCの添加１日前から開始するNaPAを用いた予備処理；（ｂ）両薬物に同時に曝す、および；（ｃ）5AzadC1日後のNaPAの添加を含む。すべての場合において、細胞は、引き続いて、少なくとも１週間の間、NaPAを用いた連続処置を受けた。これら条件下の細胞培養は、NaPA単独で処理された細胞同様、非処置のコントロールに似た接触阻害単層を形成した。これらの細胞は、NaPA処置を止めた後、少なくとも３週間の間良性の成長パターンを維持した。
NaPAが新生物性形質転換を阻害することは、細胞が再構築された基底膜（マトリゲル）に侵入できず、そして無胸腺マウスにおいて腫瘍を形成できないことによりさらに示される。マトリゲル上に置かれたとき、5AzadC形質転換4C8およびPR4細胞は、高度に悪性の細胞に特徴的なネット様構造を発達させ、そして結局、細胞外マトリックス成分を分解した。著しく対照的に、NaPA処置培養は、先に正常な線維芽細胞で観察されたように、マトリゲルの先端上に、小さな、非侵入性のコロニーを形成した。非処置の親細胞は、それらコロニーがゆっくりと成長し、そし非侵入性であるが、おそらくは増加した細胞移動性のために、なお形態が不規則であったように、中間の表現型を示した。フェニルアセテートの化学的予防効果は、その前駆体であるフェニル酪酸によっても同様に生じ得る。フェニル酪酸ナトリウムの存在下（NaPB、1.5〜3mM）で、5AzadCに曝された細胞は、接触阻害される成長を維持し、そしてマトリゲル上に置かれたとき良性の表現型を示した（表４）。
Figure 0003628694
ａ 細胞を、0.1μM 5AzadCおよび／または10mM NaPAを用いて処理し、そして5mCの百分率は、「材料および方法」に記載されたように測定した。
ｂ データは、２回の実験の平均±S.D.（ｎ＝４）を示す。
細胞のインビボ成長特性は、無胸腺マウスにおける細胞の挙動と相関した。5AzadC処置4C8細胞は、マウス中へのs.c.移植の２週間以内に迅速に成長する線維肉腫を発症させた。それらのインビトロ挙動に一致して、親細胞は、はるかに侵略性でなく、８匹のレシピエント動物のうち３匹で、３〜４週間後小さな病巣を形成した。しかし、5AzadCとNaPAとの併用で培養中で１週間の間予備処置された4C8細胞を注入した動物では、腫瘍は発症しなかった（表４）。NaPA単独で処置されて4C8を注入したマウスにおいても腫瘍形成は認められなかった。従って、NaPAが、前悪性の線維芽細胞の表現型復帰を誘導し、そしてシトシンアナログによりそれらの悪性転換を予防したと結論される。
NaPAによる遺伝子発現の調整。NIH3T3由来の細胞株である4C8およびPR4は、LTR活性化ｃ−Ha−rasガン原遺伝子を保持する。5AzadC処置4C8のノーザンプロット分析は、ras mRNAレベルで有意な増加を示し、そして分化マーカー、コラーゲンα（Ｉ型）転写物の減少を示した。NaPAが添加された培養中では遺伝子発現においてそのような変化は起こらなかった。連続処置の１週間後、NaPAを除去してもras発現の回復は起こらず、NaPAの治療利益がさらなる処置がなくても安全であることを確認した。
DNAメチル化に対するフェニルアセテートおよび5AzadCの影響。5AzadCは、DNAメチル化の強力なインヒビターであり、後成的発現機構は、遺伝子発現および細胞表現型の制御に関係した。ハイポメチル化は、ガンおよび重篤な先天性の貧血の治療効果の基礎になる得る［Momparler,R.L.,G.E.Rivard,およびM.Gyger.1985。急性白血病患者における５−アザ−2'−デオキシシチジンに関する臨床治験、Pharmac.Ther.,30:277−286;Stamatoyannopoulos,J.A,およびA.W.Nienhuis.1992。ヘモグロビン異常症の処置におけるヘモグロビン交換に対する治療アプローチ、Annu.Rev.Med.,43:497−521;Ley,T.J.、J.DeSimone、N.P.Anagnou、G.H.Keller、R.K.Humphries、P.H.Turner,P.H.、N.S.Young、P.Heller,およびA.W.Nienhuis.1982。５−アザシチジンは、β−サラセミア患者におけるγグロビン合成を選択的に増加する、N.Engl.J.Me d.、307:1469−1475］。しかし、DNAメチ化における変化がまた、その発ガン性活性の原因となり得る。従って、フェニルアセテートにより保護される細胞におけるDNAメチル化の程度を測定することが重要であった。予期され得るように、5AzadCは、５−メチルシトシン（5mC）含量に有意な減少を引き起こした（表５）。しかし、NaPAとの併用で5AzadC処置した細胞において、およびNaPA単独で処置した細胞において、5mCの比較され得る減少が存在した（表５）。
Figure 0003628694
ａ細胞を示された薬物で同時に処理し、そして集密後５日間培養中で維持し、その時点でそれらを遊離しそして計数した。5AzadCへの曝露は、材料および方法に記載されたように一時的であったが、その一方NaPAおよびNaPBを用いた処理は、実験を通じて継続した。同様の結果が、NaPA処置を、細胞の5AzadCへの曝露１日前後に開始したときに得られた（データは示さず）。
ｂ細胞をマトリゲル層の先端に置き、そして悪性成長パターン（即ち、特徴的プロセスの発達および再構築基底膜の分解およびプラスチック表面以下に向かう侵入）について観察した。
ｃ培養中で予備処置された細胞を、２月齢の雌性無胸腺ヌードマウス中にs.c.注入（部位当たり５×105細胞）した。３週間後に測定された結果は、腫瘍発生（腫瘍保持、注入された動物）およびサイズを示す。腫瘍サイズの値は平均（範囲）である。ND＝測定していない。
NaPAによるインビボ化学的予防。インビボにおけるNaPAの効力を測定するために、研究を拡張して、皮下的に移植された非腫瘍発生性の4C8細胞を持つ無胸腺マウスを含む動物モデルを含めた。5AzadCのマウスへの単回i.p.注入（20mg/kg）は、4C8細胞接種部位で腫瘍の発症を生じた。しかし、マウスが5AzadC注入の1.5時間前にNaPAで前処置され、そしてNaPA処置をその後22日間継続した場合、腫瘍形成の発症は有意に減少した（表６）。動物の体重および挙動により示されるように、NaPA処置に関連する有害作用はなかった。さらに、DNAハイポメチル化を引き起こすにもかかわらず、NaPAは、移植4C8細胞の新生物性形質転換を誘導しなかった。NaPAにより保護された動物は、4C8接種部位で腫瘍の発症もゆっくり増殖する病巣の形成も引き起こさなかった。この動物データは、インビトロでの知見と一致し、NaPAが5AzadC誘導新生物性形質転換を、有意な毒性を生成することなく阻害し得ることを示す。
Figure 0003628694
a4C8細胞（部位当たり５×105）を無胸腺マウスにs.c.で移植した。翌日、これらの動物を400mg/kgのNaPaでi.p.で処置した。そして1.5時間後、20mg/kgの5AzadCでi.p.で処置した。5AzadC注入4.5時間後にNaPA処置を繰り返した。その後の処置には、８日間の１日２回、およびさらに２週間の１日１回のNaPA注入が包まれた。PBSをコントロールとして用いた。
ｂデータは5AzadC処置後４週間目の腫瘍の増殖を示す。その後、PBSを投与されたコントロール動物に自発性腫瘍が発達し、続いてNaPAを処置した動物で発達した。
ｃミリメーター表示の腫瘍の直径。
ガンの化学的予防の非毒性分化誘導剤の使用は大いに興味深い。薬物の毒性は候補者の集団（すなわち、危険性の高い個人および小康状態の患者）の健康状態および変化しやすい寿命全体を考慮すると特に重要である。分化誘導剤フェニルアセテートは、非毒性用量で用いられた場合には、インビトロおよびインビボの両方で、5AzadC誘導性発ガンを予防し得る。
化学的予防は、発ガンの「開始」工程（すなわち、変異誘発）をブロックすること、あるいは悪性疾患への「プロモーション」および進行を抑制することにより成し遂げられ得る。モデルとして活性化したrasガン遺伝子を有する前悪性細胞を用いる本研究では、抗プロモーション薬物としてのフェニルアセテートの効力を試験した。プロモーションをブロックする他のよく特徴づけられた化学的予防薬剤は、ビタミンＡおよびその合成レチノイドを含む；フェニルアセテートと同様にこれらの化合物はまた、細胞増殖および分化の調節因子である。
本研究は、DNA低メチル化薬物である5AzadCおよび5AzaC（16、17）による悪性転換を非常に受け易い（4C8およびPR4と命名された）線維芽細胞を含む、インビトロおよびインビボのモデルを開発した。培養中またはレシピエント無胸腺マウスのいずれかにおいて、これらの細胞を5AzadCに一時的に曝すことにより、迅速な新生物性形質転換が生じた。悪性転換は、ras mRNAレベルの増加、およびコラーゲンＩ型発現のダウンレギュレーションに関係した。このことは細胞分化の喪失を示す。5AzadCによってもたらされる、これらの深い生物学的および分子的変化は、非細胞障害性濃度のフェニルアセテートおよびその前駆体であるフェニルブチレートでの同時の処置によって妨げられる。フェニルアセテートの抗腫瘍活性および毒性の欠如を、無胸腺マウスにおいて確認した。インビボモデルにおいて、s.c.で移植された影響を受けやすい4C8細胞を有するマウスに5AzadCをi.p.で注入した。そのように処置した全てのマウスは、急速に増殖する線維肉腫を発達させた；しかし、腫瘍形成の発生率はNaPAの全身的処置によって著しく減少した。
5AzadCで誘導される悪性転換をNaPAが妨げるメカニズムは不明である。プロモーションをブロックする他の化学的予防剤と同様に、フェニルアセテートは、細胞増殖抑制性および腫瘍成熟を誘導することにより作用し得る。インビトロおよびげっ歯類モデルにおいて、フェニルアセテートが選択的に増殖停止および腫瘍分化を引き起こし得ることを示す、増えつつある大量の証拠がある。ある場合、例えば、前骨髄細胞性白血病では、フェニルアセテートにより誘導された分化は、mycガン遺伝子発現の低下と関連している。NaPA処置した4C8では、脱分化からの保護（増殖特性およびコラーゲン発現により証明された）は、rasの過剰発現の阻害と関連があった。従って、ガン遺伝子発現のダウンレギュレーションは、NaPAの化学的予防活性の原因の一部分であり得る。mRNAレベルでrasに影響することに加えて、コレステロール合成のメバロン酸回路のインヒビターであるフェニルアセテート（Castillo,M.,J.Iglesias,M.F.Zafra.およびE.Garcia−Peregrin.1991.フェニルアラニンのフェニルおよびフェノール類誘導体によるヒヨコ脳のコレステロール生成酵素の阻害。Neurochem.Int.,18:171−174）はまた、rasがコードするタンパク質p21の翻訳後の改変をブロックし得た。p21のプレニル化のインヒビターであるリモネンもまた化学的予防剤である。
5mC含有量の低下にも関わらず、フェニルアセテートは5AzadCによる発ガンをブロックした。実際、NaPA自身がDNAのメチル化を阻害することが見出された；しかし、5AzadCとは対照的に、NaPAは発ガン性を有していなかった。化学的薬剤の発ガン性の潜在能力とDNA低メチル化活性との相関は、以前に組織培養モデルにおいて記述された。そしてDNA 5mCパターンの変化は発ガンの開始に貢献し、そしてこれをおよび増強していると提唱された。しかし、このデータは、DNAメチル化の量的な変化だけでは、細胞の表現型に影響を与えるに十分でなく、従って低メチル化活性は、これらのインビトロおよび動物モデルにおいて、腫瘍発生の表現型を誘導するのに十分ではないことを示す。
脱メチル化に続く細胞内因子および化学的薬剤による特定の遺伝子の選択的な誘導が、いくつかの研究室により報告されている。例えば、インビトロでのヒトγグロビン遺伝子発現の増加は、5AzaCでの処置後のヘキサメチレンビスアセトアミドによる活性化を必要とすることが見出された。［Ley J.T.,Y.L.Chiang,D.Haidaris,N.P.Anagnou V.L.Wilson,and W.F.Anderson.1984.ヒト染色体11を含むマウス赤血球白血病細胞におけるDNAのヒトβ−グロビン様遺伝子のメチル化および調節。Proc.Natl.Acad.Sci.USA.81:6618−6622）］;5AzadCによるこの遺伝子の脱メチル化は遺伝子発現に十分ではなかった。これに対して、フェニルアセテートおよびフェニルブチレートは、培養した赤血球系前駆細胞およびヒトにおいて、胎児ヘモグロビンのその後の蓄積によりγグロビン遺伝子の発現を誘導した。DNAメチル化に影響を与えることに加えて、NaPAおよびNaPBはまた、転写因子として機能する核レセプターを活性化する（ペルオキシソーム増殖因子レセプターを本明細書で議論する）。従って、ここで見られるNaPA/NaPBと5AzadCとの間の相反する発ガン活性の違いに関する一つの考えられ得る説明は、芳香族脂肪酸の、増殖調節に重要な遺伝子の発現を誘導する能力であり得る。フェニルアセテートおよび関連化合物は、サイレントな抗ガン遺伝子のメチル化媒介抑制状態を逆転し得る可能性がある。哺乳類細胞におけるNaPAによるDNA低メチル化の知見は、植物においてミリモル濃度で、フェニルアセテートがDNAのメチル化を阻害することを示した以前の研究を考慮すると、驚くことではない。興味深いことに、そのような高い濃度では、フェニルアセテートはまた、植物の腫瘍細胞の増殖を阻害する。故に、DNAのメチル化に対するフェニルアセテートの効果、および増殖および分化の調節におけるその役割は進化において保存されている。
NaPAと5AzadC（あるいは5AzaC）との併用の成果は特に興味深い。シトシンアナログは、白血病、鎌状赤血球貧血、およびβ−サラセミアのような重度の血液障害の患者に利益を与えることが示されている。現在、5AzadCは、悪性黒色腫（Weberら、投稿中）および前立腺癌腫を含むいくつかの固形腫瘍でも、活性を有し得ることを示唆する実験データがある。不幸なことに、5AzadCの臨床的応用は発ガンに関する懸念により制限されている。このデータは、NaPAが5AzadCの治療的な効果を保存および増強する一方、発ガンの危険性を最小にし得ることを示す。β−異常血色素症患者由来のヒト白血球細胞および赤血球系前駆細胞を用いた研究は、NaPAが5AzadCの効力を増強し、このことが胎児ヘモグロビン生産の更なる誘導を引き起こし得ることを明らかにした。さらに、非毒性であるが、最適より下の濃度の5AzadCへのNaPA/NaPBの添加は、培養したホルモン治療抵抗性前立腺ガン細胞において増殖を完全に停止させ、そしてアポトーシスを促進した（未発表データ）。
それゆえ、フェニルアセテート（一般的なアミノ酸誘導体）は、抗腫瘍および化学的予防薬物として価値があり得る。不快な臭気を有するNaPAは、その経口投薬用前駆体であるNaPB（あるいはNaPBの誘導体またはアナログ）により置換され得る。ヒトによる摂取の際に、フェニルブチレートは、フェニルアセテートへのβ酸化を受ける。NaPAと同様に、NaPBは実験モデルにおいて抗腫瘍および化学的予防活性を示す。そして両薬とも、尿素サイクル異常の子供の長期経口治療について、安全であることが既に証明された。ガンの成人が参加したより最近の臨床研究は、血漿レベルがミリモルのフェニルアセテートおよびフェニルブチレートを、有害作用なしに達成し得ることを立証した。NaPB/NaPAは、ガンの発達に傾いた、高い危険性の個人に利益をもたらし、他の抗ガン治療薬との併用で適用されて効力を高め、そして有害作用を最小化し、そしておそらく継続治療に用いられて病気の再発を防止する。
セクションB:創傷癒合におけるフェニル酢酸およびその誘導体の使用
成長因子（TGF−αを含む）は、創傷癒合および修復プロセスにおいて重大な役割を果たしている。創傷癒合は、炎症、創傷細胞移動（wound cell migration）および有糸分裂、新血管形成および細胞外マトリックスの再生を含む局在化プロセスである。最近のデータによると、創傷細胞の活動は、オートクライン（autocrine）およびパラクライン（paracrine）メカニズムを介して創傷細胞に影響を及ぼすペプチド成長因子の局所的産生により調節され得る（Schultzら、J.Cell Biochem.45（４）:346（1991）;Schultzら、Acta Ophthalmol.Suppl.（Copenh）,202:60（1992））。組織（例えば、皮膚、角膜、および胃腸管）の正常な創傷癒合において重要な役割を果たし得る２つのペプチド成長因子は、構造的に関連する上皮成長因子（EGF）およびTGF−αであり、これらのレセプターは、皮膚、表皮ケラチン細胞、繊維芽細胞、血管内皮細胞、および胃腸管の上皮細胞を含む多くの型の細胞により発現される。EGFまたはTGF−αは、創傷癒合に関連する様々な細胞（血小板、表皮ケラチン細胞、活性化マクロファージおよび角膜上皮細胞を含む）により合成される。動物および患者の様々な創傷の癒合（例えば、中間層熱傷の再生、皮膚節創傷、胃十二指腸潰瘍および眼球表面の上皮外傷）は、EGFまたはTGF−αを用いて外部から処置することにより増強される。TGF−α（ヒト強膜繊維芽細胞の培養におけるリシルオキシダーゼmRNAレベルの強力なインデューサーである）は、外傷後の細胞外マトリックス成分の合成を誘発する第一の原因であり得る。さらに、TGF−αは、血管形成を促進することが知られている。
成長因子を適切に刺激しなければ、多くの慢性創傷に見られる非癒合症状を起こす。未癒合症状は、外因性TGF−αを添加するかまたはエフェクター細胞を刺激してTGF−αおよび関連成長因子を産生させるかのどちらかで顕著に解消され得る。現状では、PAおよびPB（または薬学的に受容可能な誘導体）は、創傷癒合に関連するメラノサイト起源（origin）の細胞；星状細胞株列（神経グリア芽腫細胞）；およびいくつかの正常ヒト上皮細胞型（表皮ケラチン細胞を含む）においてTGF−αの産生を刺激する能力を有することが見出されている。さらに、PAおよびPBでの処置により、コラーゲン−αＩ型の発現が増強される。例えば、ヒトメラノーマ1011細胞（細胞は、5mM NaPA、10mM NaPA、1.5mM NaPBおよび3mM NaPBで４日間連続して処置した）において、NaPAおよびNaPBで処置をすることにより、TGF−αmRNA発現が誘導されることが、ノーザンブロット分析により示され;TGF−αの発現は、その後のタンパク質分析で確認される。TGF−αタンパク質の産生は、ヒト表皮ケラチン細胞をNaPAおよびNaPBに曝すと増加した。上皮HK5細胞を、NaPB（3.0mM、1.5mM、0.75mM）、NaPB（10mM、5.0mM、2.5mM）およびPAG（5mM）で、４日間連続して処置した。非処置細胞をコントロールとして供した。TGF−αの量（ng/ml/106細胞）は、抗TGF−α抗体を用いることにより測定した。このTGF−α産生の増加は、２、３日間持続し、この後このTGF−α産生のレベルは、ほぼ処置前のレベルに戻る。以下におよび図４で考察するように、創傷の処置にこれらの化合物を用い得ることが、NaPBでの処置後、ICAM−１（細胞接着分子／表面抗原）の発現が増強したことによりさらに支持され得る。
従って、本発明は、細胞におけるTGF−αの産生を刺激する方法を提供する。さらに、ヒトまたは動物の創傷癒合は、フェニル酢酸またはNaPAあるいはNaPBのようなフェニル酢酸誘導体（これらは、TGF−αのインサイチュ産生を刺激する）の治療量で処置することにより増強され得る。例えば、表面創傷は、PA、PBまたはPAあるいはPBのどちらかの誘導体を皮膚表面に局所的に適用すること（例えば、クリーム処方物）により処置され得る。同様にして、眼球の外傷は、PAまたはPB（またはPA/PB誘導体）の処方物（例えば、目薬）を角膜に適用することにより処置され得る。同様に、内部外傷（例えば、胃腸管の外傷）は、経口処方物の投与により処置され得る。膣または肛門の外傷もまた、例えば、PAAまたは誘導体の薬学的効果量を含有する座薬で処置され得る。PA/PBまたは誘導体処方物は、連続的に、または好ましくは断続的に（例えば、１日、１週間または１ヶ月コースで１回またはそれ以上の用量）投与され得る。例えば、0.1mMから10mM PA、好ましくは、0.1mM〜5.0mM PAまたは0.1mMから5mM PB、好ましくは、0.1mM〜2.5mM PBを含む組成物を、１週間にわたって１日１回または２回、局所的に投与すると、創傷の修復が適切に刺激される。本明細書中に含有される情報から、用量濃度および様々な投与媒体の量が容易に決定され得る。例えば、局所処置（例えば、PBを含有するクリーム）は、代表的には、約0.5mM〜3.0mM PBまたは等価効力（equipotent）（等価効力という言葉により、被験体に等価な効果を与えるために異なるフェニル酢酸誘導体を用いた場合、用量が変化し得ることを意味する）を有する用量のフェニル酢酸誘導体を含む。例えば、同様に示されたPA用量と等価な効果を与えるには、PBの約1.5倍の用量が必要であるが、それに制限されない。
セクションC:インターロイキン−６関連病の処置におけるフェニル酢酸またはその誘導体の使用
インターロイキン−６（IL−６）（刺激された単核細胞および表皮ケラチン細胞により産生され得る）は、防御メカニズム（免疫応答、急性期反応および造血を含む）に重要な役割を果たす多面発現性サイトカインである。成熟Ｂ細胞の活性化は、流動相における抗原によって誘発され得る。抗原がIL−１およびIL−６の存在下で細胞膜IgMと結合する場合、成熟処女Ｂ細胞は、分化し、そしてイソタイプをIgG、IgAまたはIgEに転換する。IL−６遺伝子の異常発現は、以下を含む様々な疾患の病院および／または徴候に関連すると提案された：（１）異常分化プログラムに関する非悪性疾患、自己免疫および炎症プロセス（例えば、慢性関節リウマチ、キャスルマン病（Castleman's disease）、メサンギウム増殖、糸球体腎炎、ブドウ膜炎、敗血症、自己免疫疾患（例えば、狼そう、腸炎症、Ｉ型糖尿病、脈管炎）、および細胞分化の様々の皮膚疾患（例えば、乾せんおよび角質増殖））；（２）ウイルス疾患（例えば、AIDSおよびAIDS関連腫瘍（例えば、カポージ肉腫およびリンパ腫））；および（３）その他の腫瘍（例えば、多発性骨髄腫、腎カルチノーマ、レナートＴ−細胞リンパ腫および血漿細胞腫瘍）。例えば、正常組織と比較して外傷乾せん組織においてIL−6mRNAレベルが有意に上昇したことおよびアトピー性コントロールまたは健康コントロール由来の試料と比較して乾せんの血清および末梢血単核細胞においてIL−６量が上昇したことが見出された（Elderら、Arch.Dermatol,Res.,284（６）:324（1992）;Neunerら、J.Invest.Dermatol.,97（１）:27（1991））。
現状では、フェニル酢酸またはフェニル酢酸誘導体（例えば、NaPAまたはNaPB）が、IL−６の発現を阻害し得ることが見出されている。例えば、PAは、結腸カルチノーマ細胞におけるIL−１−誘導−IL−６発現を阻害する。結腸26カルチノーマ細胞に由来する細胞性mRNA（５μg/レーン）について、IL−６特異的プローブを用いたノーザンブロット分析を行った。細胞は、組換えIL−１β（0.1ng/ml）単独で処置するか、2.5mM、5.0mMおよび10mM NaPAと併用で48時間の連続処置するかの、どちらかで処置された。IL−６は、コントロール細胞（非処置）では、検出されなかった。このRNAの減少は、IL−６タンパク質の減少により確認される。従って、PA、PBおよびこれらの誘導体はIL−６の異常な過発現を含む疾患の処置に用いられ得る。
例えば、患者の乾せん性損傷に、鉱物油ベースのクリーム中の2mM NaPBまたは鉱物油ベースのクリーム中の2mMナフチルアセテートおよびビタミンB1のどちらかを直接、局所的に適用することにより、１日２回の処置をすると、１週間以内に損傷が消失した。重度の乾せんを有する患者に同様の処置をすると、約１〜３週間で乾せん損傷が解消された。明らかに、薬物投与モードおよび薬物量は、処置されるIL−６関連疾患に依存して変化し得るが、これはIL−６発現の減少が所望される細胞を、薬物の標的とするためである。例えば、0.1mM〜5mM PBの溶液または薬学的に受容可能なフェニル酢酸誘導体を含む等価効力を有する溶液を連結領域に注射することは、慢性関節リウマチの処置に適切であり得、他方、他の疾患の場合には、局所、静脈または経口送達により、さらに適切な処置がされ得る。処置は、連続または不連続処置のどちらかによりなされ得るが、薬物（特に、PB）の中断は、薬物での処置の中断をすることによる過剰反応を防止するために投与量を傾斜的に減じることにより行われ得る。さらに、IL−６の異常な過剰発現に関する疾患は、フェニル酢酸またはフェニル酢酸誘導体（特に、PAまたはPB）の効果量を抗炎症剤（様々なビタミン（例えば、ビタミンB1、非ステロイド炎症剤およびステロイド抗炎症剤）を含む）の効果量と共に投与することにより、処置され得る。この抗炎症剤は、同様の用量形態で本発明のフェニル酢酸誘導体と組合わせられ得、あるいはこの誘導体と同様の経路または異なる経路により別々に投与され得る。抗炎症剤の効果量とは、一般的に、特定の疾患状態に対する臨床使用量またはそれ未満の量を意味する。
セクションD:AIDS関連CNS機能障害の処置におけるフェニル酢酸またはその誘導体の使用
AIDS患者における中枢神経系（CNS）疾患の特徴（Hallmark）は、頭痛、熱、微細認知変化（sudtle cognitive change）、異常反射および運動失調である。痴呆および重症感覚（severe sensory）および運動機能障害は、より重度の疾患を特徴付ける。自己免疫様末梢神経障害、脳血管疾患および脳腫湯もまた観察される。AIDS痴呆において、CNSのマクロファージおよび小グリア細胞は、HIV−１に感染し、かつHIV−１を増殖する優勢細胞型である。しかし、HIV−１による直接感染よりむしろ、CNS疾患徴候は、ウイルスタンパク質の分泌またはグリア細胞およびニューロンに結合するサイトカイン（例えば、IL−１、TNF−αおよびIL−６）のウイルス誘導を通して媒介されると提案されている（Merrillら、FASEB J.,5（10）:1291（1991））。TGF−βは、多くの細胞型により放出される成長因子である。その他の効果の中で、TGF−βは、マクロファージおよび繊維芽細胞に対する高度な走化性因子であり、そしてTNF−α、TGF−αおよび間接的には、マクロファージから様々な他のモジュレーターの放出を刺激し、AIDSのCNS徴候の開始に関連している。
フェニル酢酸またはフェニル酢酸誘導体（例えば、NaPAまたはNaPB）が、TGF−β２の産生を阻害し得ることが見出された。TGF−β２は、免疫抑制因子なので、この阻害により、患者の免疫系が全般的に改良される。神経グリア芽腫細胞におけるTGF−β２の遺伝子発現は、PAおよびPBの両方により阻害された。A172細胞由来の細胞性mRNA（５μg/レーン）を、TGF−β２特異的プローブを用いたノーザンブロット分析にかけた。細胞を5mM NaPA、10mM NaPAおよび1.5mM NaPBで４日間連続して処置した。このRNAの減少により、TGF−β２タンパク質合成が減少される。従って、PA、PBまたはこれらの誘導体は、細胞におけるTGF−β２の産生を阻害し、特に、HIV感染に起因するCNS徴候を制御または軽減するために使用され得る。上記で考察したように、この処置はまた、IL−６の産生を阻害し、さらにCNS徴候の軽減が可能である。TGF−β２を阻害するために効果的な投与の薬物量および／または処方は、ガンの処置またはガン予防のために適切な薬物量または予防計画に対応する。
セクションE:免疫監視の増強を目的としたフェニル酢酸およびその誘導体の使用
ヒトのような動物の免疫監視は、PA、PBまたはこれらの誘導体で処置することにより増強され得る。腫瘍細胞は、少なくとも２つの方法により免疫系の攻撃から免れると考えられる。第一に、多くの腫瘍は、免疫活性を直接減少させる免疫抑制因子を分泌する。さらに、細胞の中には、免疫系にアウトロー細胞（outlaw cell）を確認させるような適切な表面抗原を発現しないもの、またはこの表面抗原の発現を減少させるものがある。しかし、本発明の組成物は、休眠遺伝子（例えば、胎児グロブリン）を、他の方法により活性化させ得る（おそらく、部分DNA（hypo）メチル化による）。同様に、ガンサプレッサー遺伝子、休眠抗原および他の遺伝子（例えば、（１）細胞性主要組織適合性抗原（MHCクラスＩおよびII）またはICAM−１のような他の表面抗原；（２）MAGE−１のような腫瘍抗原；および（３）EBVラテント膜タンパク質（Ｔ−細胞腫瘍、バーキットリンパ腫鼻咽頭カルチノーマ、およびホジキン病のような多数の疾患に関連している）の活性化は、免疫監視の増強に貢献し得る。従って、新生物性細胞は、PA、PBまたはこれらの誘導体で処置され得、細胞表面抗原を発現させ、それにより腫瘍細胞の適切な確認およびクリアランスによって免疫系の効力増加させる。
このフェニル酢酸またはフェニル酢酸誘導体組成物が、休眠遺伝子を活性化させ得、そして表面抗原の発現を増強し得る証拠が、図４で与えられる。そして、図４は、メラノーマ細胞を2mM NaPBで10日間処置したときのMHCクラスＩ、MHCクラスIIおよび接着分子ICAM−１の発現の増強を示す（例えば、母集団（population）平均のシフトはMHC class Iに対して約50から200までであった）。
さらに、PBが、バーキットリンパ腫細胞におけるEBVラテント膜タンパク質（LMP）の発現を誘導することが見出されている。LandisP、Raj IおよびP3HRIバーキットリンパ腫細胞株から単離した細胞質RNA（20μg/レーン）を、2mM PBで４日間処置した。次いで、特異的LMPプローブを用いるノーザンブロット分析を行った。コントロール（非処置細胞）と比較して、３つの細胞株の全てにおいて陽性反応が観察され、PBがEBVラテント膜タンパク質の発現を誘導することが示された。バーキットリンパ腫細胞において、PAおよびPBの両方がさらに分子および細胞性変化を引き起こし、そしてこれらの変化は細胞増殖抑制性、myc発現の衰退およびHLA＋１の増強を含む。
これらの表面抗原は、インビボで腫瘍免疫原性を増強するので、PA、PBまたはこれらの誘導体で動物（ヒト）を処置することは、個々の免疫系の効果を増強し得る。約0.5mM〜3.0mM PBの用量または薬学的に受容可能なフェニル酢酸誘導体の等価効力を有する用量は、有用であり得る。この処置はまた、従来の免疫療法による処置および／または抗原標的化、抗体−媒介化学療法と組合わせられ得る。通常、処置が、実質的に連続処置を可能にするプロトコルに従ってなされるのに対して、不連続またはパルス処置プロトコルもまた、特にPAAまたはPAA誘導体での処置において最終分化し得る細胞について効果的である。例えば、図４で示されるメラノーマ細胞の10日間の処置は、この10日間の後、表面抗原の発現を連続的に増強させ得るのに十分であった。
参考例1:バーキットリンパ腫におけるNaPAおよびNaPB効果
細胞株に感染したエプスタインバールウイルス（EBV）は、NaPAによる阻害以上にNaPBにより増殖阻害された。これは、処置後約４日目のｃ−myc発現の減少によると考えられる。あいにく、現段階ではこの細胞株の分化を測定する公知の測定法がない。しかし、NaPAでの処置は、実質的な形態変化およびクランピング（おそらく、細胞間または細胞−マトリックス間相互作用が変化したことに起因する）を引き起こす。細胞外マトリックスに結合した細胞の割合の上昇は、ICAM1の上昇によるものであり得る。この細胞は、さらにHLAクラスＩ抗原およびラテント膜タンパク質を産生し、これにより、免疫系が、細胞で視覚的に観察され得る。
セクションF:フェニル酢酸またはその誘導体の投与量レベルを患者および／またはこれらの薬剤に対する患者の応答でモニターする方法
上記のように、フェニル酢酸またはフェニル酢酸の誘導体（例えば、NaPAまたはNaPB）を動物（ヒト）に本明細書に記載したとおり、ある量で、処置期間にわたって投与することは、種々の分子変化を含む。これらの分子の特性は、（１）薬剤の投与量レベルまたはその生物学的利用性を動物でモニターするため、および／または（２）薬剤に対する患者の応答の生物マーカーとして作用するための生物マーカーとして用いられ得る。例えば、上記のように、有効量のNaPAまたはNaPB（またはそれらの誘導体）の投与により、種々の分子効果を生じる。種々の効果を以下に列挙する:a）赤血球の胎児ヘモグロビンのレベルの増加;b）メラノサイト起源、星状細胞株統、または上皮細胞型の細胞のような種々の細胞におけるTGF−αの生産の増加;c）IL−６生産の阻害；およびｄ）TGF−β２生産の阻害。従って、特定の生物マーカーの絶対濃度または相対（処置前／処置後）濃度を個体の適切な細胞集団で決定し得、薬剤の投与量レベルまたは生物学的利用性をモニターし得る。さらに、この濃度は、患者の応答と相関し得るか、または比較され得、この生物マーカーに基づく所望の処置目的のために患者の応答スケールを発達する。例えば、胎児ヘモグロビンの量の増加を用いて、新形成状態の処置または防御のために、PAまたはPBの生物利用能力を示し得、および薬剤に対する患者の応答の程度を示し得る。
セクションG:フェニル酢酸およびその誘導体によるPPARの活性化
ペルオキシソームは、細胞のレドックスポテンシャルを過酸化水素のような種々の基質を代謝することにより制御する酵素を含む細胞オルガネラである。こ領域での最近の進歩により、ペルオキシソームが特定の遺伝子の転写を調節する核レセプターの活性化を介して増殖することが明らかである（Gibson,Toxicol.Lett.,68（１−２）:193（1993））。この核レセプターは、ペルオキシソソーム増殖因子活性化レセプター（peroxisome proliferator−activated receptor）（PPAR）と名付けられ、遺伝子発現および細胞生物学に主要な影響を与えるステロイド核レセプターファミリーに属する。ペルオキシソーム増殖因子（例えば、クロフィブレート、除草剤、およびロイコトリエンアンタゴニスト）によるPPARとの結合は、核レセプターを活性化し、転写因子として作用し、そして分化、細胞成長、およびペルオキシソームの増殖を起こし得る。これらの試薬は、過形成および発ガン、ならびに齧歯動物細胞のような動物細胞の酵素能力の変化で役割を果たすと考えられているが、これらの試薬は、クロフィブレートのような薬剤の安全性により例示するとおり、ヒト細胞で最小の負の効果を有するようである（Green,Biochem.Pharm.43（３）:393（1992））。
ペルオキシソーム増殖因子は、代表的には、カルボン酸官能基を含む。従って、PA、PB、および種々のフェニル酢酸誘導体のPPARを活性化する能力を試験し、そして公知のペルオキシソーム増殖因子と比較した。図５に示すように、クロフィブレート（ペルオキシソーム増殖の公知のアクチベーター）は、acyl−CoAオキシダーゼ（β酸化における律速酵素であり、そしてペルオキシソームに含まれる）に対する応答要素の生産の増加により測定したときに、活性で４〜５倍の増加した（Dreyerら、Biol.Cell,77（１）:67（1993））。PAおよびPBは穏やかな活性化（通常の活性の２倍（double baseline activity））をひき起こし、ナフチルアセテートは相対的にさらに活性が高かった（約2.5〜４倍増加）が、PBのハロゲン化アナログは非常に潜在的な刺激因子であった。興味深いことに、酪酸は重要なペルオキシソーム増殖アクチベーターでなかった。
ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプターは、同じファミリーの核レセプター（例えば、レチノイド、チロイド、およびステロイドレセプター）に属することを示され、そしてPPARは、９−シス−レチノイン酸（全トランス−レチノイン酸の代謝産物）であるRXRと相互作用することが公知である。PPARシグナル経路は、９−シスレチノイドレセプターシグナルで一点に集まるので、レチノイド酸などが、本発明のPAまたはPBまたは他のフェニル酢酸誘導体の活性を顕著に高めることが期待され得る。実際に、レチノイド酸と組み合わせたNaPAによるHL−60細胞分化の促進は本明細書に示される。さらに、この相乗応答は、他の腫瘍、例えば、神経芽腫、黒色腫、および横紋筋肉腫細胞で確認された。
従って、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、β−カロテン、または他のレチノイドなどとPA、PB、または他のフェニル酢酸誘導体との（同じ投与量形態で同時／連続的な、または別々の投与量形態で同時／連続的な）投与からなる併用治療は、本明細書に記載される処置レジメは本発明に含まれる。適切な投与量のフェニル酢酸誘導体は、約0.5〜10mM PA、さらに好ましくは0.5〜5mM PA、薬学的に受容可能なフェニル酢酸誘導体の投与量または等価効力の投与量を含む。0.1μＭと1.0μＭとの間の濃度のレチノイドは、有効であることが予測される。この併用治療は、例えば、ガン、貧血、およびAIDSの処置、創傷治癒、ならびに分化の非悪性疾患の処置において、PA、PB、または他のフェニル酢酸誘導体の単独使用の処置効率を高める。
細胞ペルオキシソームに影響する試薬は、細胞の酸化的ストレスおよびレドックス状態に主に影響する。従って、PA、PB、または他のフェニル酢酸誘導体がPPARを活性化するさらなる証拠は、図６に示すように、PAまたはPBに細胞を曝した後のガンマグルタミルトランスペプチダーゼおよびカタラーゼの迅速な増加により見出され得る。ペルオキシソーム増殖が活性化された時、活性が増大するこれらの抗酸化酵素は、フェニルブチレートナトリウムの投与後24時間で100％まで増加した。この効果は約48時間までには逆転し、そして活性は100時間ずっとコントロールレベル以下で維持された。グルタチオンの細胞内レベルは、最初の増加（20％）、続く100時間で基準以下までレベルを下げる同様の二相性パターンをたどった。これらの抗酸化酵素のその後の急激な減少をともなう迅速な誘導は、前立腺、胸部、および結腸の腺ガン、骨肉腫、および脳腫瘍由来の多数の腫瘍型に観察された。分子分析は、GSH関連酵素および抗酸化酵素の遺伝子転写の速度を変化させるが、これらは、PA、PB、またはそれらのアナログによるPPARの活性化と矛盾しない。
グルタチオンおよびPA、PB、または他のフェニル酢酸誘導体での処置により誘導された抗酸化酵素における二相性変化は、放射線防護プロトコールまたは放射線感受性プロトコールのいずれかを提供するために利用され得る。結果は、処置のスケジュールに高く依存している。特に、PAまたはPBでの細胞の処置は、少なくとも24時間の間ずっと放射線から細胞を保護するが、72時間のようなより長い被曝により、遊離ラジカルに基づく放射線療法または化学療法（例えば、Ｘ線、ガンマ線、陽子、電子、アイソトープ、またはドキソルビシン（duxorubicin）（アドリアマイシン）のような放射線のイオン化）により腫瘍細胞を殺すように顕著に感受性を高める。
PAまたはPBでの処置効果を試験するための実験は、化学ストレスまたは放射線ストレスに供した細胞で行われた。CO60γ−放射線またはアドリアマイシンでの処置の前の、神経膠芽腫（図７）、胸部腫瘍、および転移性前立腺細胞を非毒性用量のPAまたはPBで72時間前処理したが、いずれかの物理療法によって殺される細胞が顕著に投与量に関連して増加した。薬剤処置後の細胞の生存画分は、前処理をしていない生存画分のほぼ10分の１であり、これは、PA、PB、または他の類似のアナログを用いて放射線治療および化学療法の効率を増加し得ることを示唆する。このように、本発明は、放射線療法（特に、局所処置）または化学療法（特に、腫瘍細胞に標的する）と組み合わせた、非毒性有効量のフェニル酢酸または薬学的に受容可能なフェニル酢酸誘導体の投与（本明細書に記載の投与量濃度のプロトコールによる）からなる併用抗ガン治療を含む。このアジュバント治療は、例えば、誘導体の投与開始から約24時間後、例えば、24時間〜120時間以上投与され得る。
PAのようなフェニル脂肪酸およびその誘導体またはアナログは、比較的非毒性投与量での悪性細胞分化を誘導することにより、神経膠芽腫および腺ガンの処置で広範囲な活性を示した。さらに、PAおよびその誘導体／アナログが、腫瘍細胞の放射線耐性に関係しているタンパク質をコードするrasオンコジーンの転写後のプロセッシングを阻害することが見い出された。従って、PAおよびその誘導体／アナログは放射線感受性剤として有用であり、非常に効果的であり得る。現在用いられる化学増感剤と比較すれば、PA/PBは顕著な毒性がないので、特に魅力的な放射線増感剤である。
インビボでのデータは、PAおよびPBに細胞を曝すことが、脳、胸部、前立腺、および結腸のヒト腫瘍細胞における細胞放射線感受性を顕著に増加することを示す。この放射線感受性の増加は、カタラーゼおよびガンマ−グルタミルトランスフェラーゼのような保護性抗酸化酵素の活性の減少およびこれに伴う天然に存在する放射線保護剤、グルタチオン（GSH）の減少に関連する。興味深いことには、PAに曝すことにより少しだけ放射線感受性性とした低レベルのrasを発現する腫瘍細胞と比較して、高レベルのrasオンコジーンを発現する高放射線耐性の前立腺腫瘍細胞は有意に放射線感受性となった。
これらの結果は、種々の病原性疾患のさらなる熟考を示唆する。組織損傷、気腫の病因、虚血性関連機官損傷（ショック）、ドキソルビシン誘導化心臓損傷、薬剤誘導肝臓毒性、アテローム硬化症、および高酸素性肺損傷に対する炎症応答は、それぞれ反応性酸素種の生産および細胞の還元能力の変化と関連する。PAまたは他のフェニル酢酸アナログに長期間曝すことにより、細胞レドックス保護系を涸渇されるので、PAなどでの短期の処理が、反応性の増加した酸素種に関連する疾患の処置に非常に重要な意味がある。
セクションH:多剤耐性表現型を有するガンの治療におけるフェニル酢酸およびその誘導体の使用
散在性のガンの治療において、細胞障害剤による全身性治療は最も有効な治療であると考えられることが多い。しかし、多くのガンは、投与される特定の抗新生物性薬、ならびに患者の全身がいままで曝されたことがない他の薬剤の細胞障害性効果に対して、耐性の能力を示す。さらに、いくつかのガンは、患者がある抗新生物性薬剤に初めて曝される前でさえ、多剤耐性を有するようである。この現象を説明するために３種の機構が提唱されている:p−糖タンパク質多剤耐性（Multiple Drug Resistance（MDR））、トポイソメラーゼ毒によるMDR、および薬剤代謝酵素の発現の変化によるMDR（Hollandら、Cancer Medicine、LeaおよびFebiger,Philadelphia、1993、618〜622頁）。
ｐ−糖タンパク質MDR耐性は、細胞障害剤を細胞から迅速に除去するエネルギー依存性ポンプの発現によって媒介されるように見える。高レベルのｐ−糖タンパク質は、MDR遺伝子および転写活性の増幅に関連する。ｐ−糖タンパク質の発現の増大はまた、熱ショック、重金属、他の細胞障害剤および肝臓の傷害によっても刺激され、そしていくつかの種からのいくつかの細胞株においては電離放射線によって刺激される。この結果は、因果関係を立証するに十分に一致はしていないが、非常に示唆に富む。
トポイソメラーゼは、DNAの複製、転写、および組換えの間の一時的なDNA鎖の破壊の原因となる核酵素である。エトポシド、ドキソルビシン、アムサクリンなどのような細胞障害剤は、トポイソメラーゼIIに対する公知の毒物であり、DNA、トポイソメラーゼIIと薬剤との間に安定な複合体を形成することによってDNA鎖の致命的な破壊を引き起こす。このタイプの薬剤に対するMDRは、DNA−酵素−薬剤複合体の形成あるいはその効果を妨げると考えられる酵素活性の性質および量の変化によって起こると考えられる。
いくつかの細胞障害剤は、毒素の迅速な除去を可能とする代謝能力の上昇を誘導し得る。これらの酵素のなかでも関連しているものは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼアイソザイム（GST）である。これらの酵素は、疎水性薬物の電子吸引性部分とグルタチオンとの結合に関与し、その結果、解毒および薬剤の排泄を引き起こす。
上述のように、PAおよび他のフェニル酢酸アナログはGSTのいくつかのアイソザイムを含むペルオキシソームの増殖を刺激することが示されている。この観察に基づくと、PAおよびPBもまたMDRを刺激することが予期される。しかし、これとは逆のことが起こることが、現在、見いだされている。例えば、PAは、MDR表現型を示すMCF−７アドリアマイシン耐性乳ガン細胞の増殖を阻害した。PAが上限で培養物中10mMまで、細胞の増殖は用量に依存して劇的に阻害された。驚くべきことに、PAおよびPBは、アドリアマイシン耐性乳ガン細胞に対しての方が、アドリアマイシン感受性細胞に対するより、より高活性である。MDR表現型の感受性のこの上昇は、放射線治療に耐性の腫瘍を含む他の腫瘍モデルにおいて再現され得る。
従って、本発明は、患者における、現在使用されている通常の治療に対して耐性あるいは生存可能な腫瘍（特にMDR表現型を有する腫瘍）細胞集団の治療方法を提供する。この方法は、腫瘍の近傍における非毒性量のPA（例えば、上限10mMのPAまたは等用量の薬学的に許容可能なフェニル酢酸誘導体を与える量）あるいは同等に有効量のフェニル酢酸またはフェニル酢酸アナログを患者に投与することによる。これらのフェニル酢酸関連化合物によって腫瘍細胞における分化の有効性を高めることに関連して記載されたプロトコールと同様の、PAまたは他のアナログの投与プロトコール（本明細書に記載される種々の併用療法を包含する）が、MDR腫瘍のような耐性腫瘍を有する患者の治療のために使用され得る。長期（週、月）または短期（日）の実質的に連続的な治療養生法（連続投与または特定の用量の頻回投与（frequent administration）を包含する）、ならびにパルス養生法（日、週、または月の実質的に連続的な投与の後、薬物なしの期間を置く）が、MDR腫瘍を有する患者の治療に有効に用いられ得る。
セクションI:フェニルアセテートおよびその誘導体、効力と親油性との相関
フェニル酢酸の臨床使用を妨げ得る１つの可能性のある問題は、治療濃度に達するために必要とされる薬剤の量が多いことである（すなわち、300mg/kg/日を超える）。植物における研究によって、フェニルアセテートアナログの親油性（オクタノール−水における分配係数によって測定される）を高めると、その成長調節活性が増大することが明らかになった［Muir,R.M.,Fujita,T.,およびHansch,C.一置換フェニル酢酸のオーキシン活性における構造と活性の関係、Plant Physiol.,42:1519−1526,1967.］。分配係数計算値（CLOGP）を用いて、フェニルアセテートアナログの予想される親油性と測定された抗腫瘍活性とを相関させた。これらのアナログについて、細胞増殖抑制性の誘導における効力の増加、ならびに培養された前立腺ガン、グリオブラストーマ、およびメラノーマ細胞における表現型の反転は、薬剤の親油性の増大と相関した。
細胞培養。以下のヒト腫瘍細胞株を用いて研究した：（ａ）ホルモン治療抵抗性前立腺ガンPC3、DU145、American Type Culture Collection（ATCC、Rockville、MD）；（ｂ）神経膠芽細胞腫U87、A172（ATCC）；（ｃ）メラノーマA375およびmel 1011、J.Fidler（M.D.Anderson,Houston TX）およびJ.Weber（NCI,Bethesda MD）から、各々提供。細胞を、10％熱不活性化ウシ胎児血清（Gibco Laboratories）、抗生物質、および2mM L−グルタミンを補充したRPMI 1640中で維持した。二倍体ヒト包皮FS4線維芽細胞（ATCC）、およびヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVC）を比較のために使用した。新たに得られた臍帯から単離されたHUVC細胞はD.GrantおよびH.Kleinman（NiH,Bethesda MD）から提供された。
抗腫瘍剤。フェニル酢酸ナトリウムおよびフェニル酢酸ナトリウムはElan Pharmaceutical Corp,Gainvesville GAから入手した。４−ヨードフェニルアセテート、４−ヨードフェニルブチレートおよび４−クロロフェニルブチレートは、サンドマイヤー法によって対応する４−アミノ−フェニル−脂肪酸から合成した。ハロゲン化生成物を酸性反応混合物からジエチルエーテルによって抽出し、次いで、これを取って乾燥した。残渣を沸騰ヘキサンに溶解し、そして冷却によって形成した結晶を吸引濾過によって採取した。生成物を、報告されている融点が得られるまで、ヘキサンから再結晶した。上記ナトリウム塩をわずかに過剰の塩化チオニルと共に加熱し、次いで、氷冷した濃縮アンモニアを添加することによって、フェニルアセテートおよびフェニルブチレートのアミドを生成した。このアミドを沸騰水からの再結晶によって精製した。合成した化合物の同定は、融点測定およびマススペクトル分析によって確認した。市販の誘導体はすべて、入手し易さに応じて、Aldrich（Milwaukee、WI）またはSigma（St.Louis,MO）から購入した。試験化合物は、すべて、蒸留水に溶解し、必要に応じてNaOHを添加することによってpHを7.0まで上げ、そして使用時までアリコートとして−20℃で保存した。
薬物の相対親油性の計算。分子の生物学的活性への親油性の寄与の見積もりは、その分子のオクタノール−水分配係数の対数計算値（CLOGP）を基準とした。これは、各化合物について、BodorらのBLOGPプログラム（BLOGPバージョン1.0、Center for Drug Discovery、University of Florida）を用いて、すべての試験化合物についてイオン化度は同様であるとして決定した。
細胞増殖および生存率の定量。増殖率は、トリプシン−EDTAによる遊離の後、血球計数器によって細胞を計数することによって、および３−［4,5−ジメチルチアゾール−２−イル］−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）を用いる酵素アッセイによって測定した。これらの２種のアッセイは本質的に同じ結果を与えた。細胞生存率はトリパンブルー排除（Exclusion）によってアッセイした。
半固形寒天中のコロニー形成。足場非依存性増殖を分析するために、トリプシン−EDTAで細胞を回収し、そして0.36％寒天（Difco）を含む増殖培地1ml当たり1.0×104細胞で再懸濁させた。2mlの細胞懸濁液を、4mlの固形寒天（0.9％）で予めコートした60mmプレート（Costrar）に加えた。試験薬物を異なる濃度で加え、そして３週間後に、30個またはそれ以上の細胞から構成されるコロニーを計数した。
マトリゲル上での増殖。最初に、T.C.プラスチックディッシュ中で細胞を薬物で４〜６日間処理し、次いで、再構築された基底膜である10mg/mlマトリゲル（Collaborative Research）の250μｌでコートした16mmディッシュ（Costar、Cambridge、MA）上に再プレーティング（１ウェル当たり５×104細胞）した。薬物をこのディッシュに加えるか、あるいは効果の可逆性を測定するために薬物を加えなかった。侵入性細胞の網目状形成は12時間以内に起こり、他方、マドリゲル中への侵入は６〜９日後に明らかであった。
薬剤取込の研究。細胞を、６ウェルのT.C.ディッシュ（Costar）に、１ディッシュ当たり５×105細胞で、プレーテイングした。増殖培地を、24時間後、4.5×105DPMの14C−フェニル酢酸（3.4mCi/mmol、Sigma）または14C−ナフチル酢酸（5.4mCi/mmol、Sigma）のいずれかを含む新鮮な培地750μｌで置換し、そしてこの培養物を37℃で10〜180分間インキュベートした。プレートを氷上に置くことによって、標識化を停止させた。次いで、細胞を、5mlの氷冷リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で２回洗浄し、かき取り、そして細胞に保持された放射能を液体シンチレーションに用いて測定した。ブランク値は、空のディッシュに入れた放射性標識化合物をインキュベートすることによって測定決定した。
フェニルアセテートおよびそのアナログの、薬剤親油性と増殖阻害効果との相関。前立腺ガン、神経膠芽細胞腫、およびメラノーマ細胞株におけるこれらの化合物の増殖阻害効果をIC50で表すと、阻害効果はCLOGPプログラムを用いて決定した薬剤の親油性と相関する。表14および15に示されるように、細胞増殖抑制性と親油性との間には強い相関がある。フェニルアセテートについての以前の観察と一致して、正常な内皮細胞および皮膚線維芽細胞の増殖に顕著な影響を与えるためにはより高い薬物濃度が必要とされるため、細胞増殖抑制性効果は選択的であった。試験化合物での４〜６日の継続処理の間には、細胞障害性（すなわち、細胞生存率の低下）は生じなかった。
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構造−活性の関係のさらなる分析は、バルビツレートの麻酔および代謝効果とそのオクタノール−水の分配係数との関係付けで用いるHanschおよびAndersonの方法に基づくものであった［Hansch,C.,およびAnderson,S.M.,バルビツレートにおける構造−活性の関係および他の麻酔薬におけるそれとのその類似性，J.Med.Chem.10:745−753,1967］。この方法の採用は、もしその関係が単純であれば、方程式:log1/C＝傾きlogP＋Ｋに従うであろうと仮定する。前立腺細胞−対−薬剤CLOGPで得られたlog1/IC50値をプロットした結果（図８）、方程式:log1/IC50＝0.89CLOGP＋0.55によって記載される直線に最良に近似された。この直線の傾き（0.89）は、一連のバルビツレートアナログの麻酔能力で見い出された値の範囲内にある。Hanschおよび同僚はまた、フェニルアセテートおよびその誘導体が植物の成長に与える効果を研究した。図８に示すごとく、フェニルアセテートアナログの濃度範囲および植物成長の阻害のランク順はこの同一シリーズの化合物による前立腺ガン細胞の増殖の阻害に匹敵する。
クロロ−およびメチル−両置換については、パラ位がオルト位よりも優れている。加えて、それらの親油性に対するほぼ等しい寄与にも拘わらず、パラ クロロ−置換はメチルよりも優れていた。環またはα−炭素置換を含有する誘導体とは対照的に、ブロックされたカルボキシル基を持つものは、細胞増殖抑制活性の減少を示した。フェニルアセテートのメチルエステルは遊離酸の約半分の活性であった（DU145前立腺細胞におけるIC50は、8.8mM−対−フェニルアセテートにつき4.1mM）。また、アミド形態はこの実験系では親化合物よりも活性が低く、フェニルブチルアミドについての2.0mMに対してフェニルブチレートについての1.2mM、およびフェニルアセトアミドについての4.8mMに対してフェニルアセテートについての4.1mMのIC50であった。
薬物摂取。増大する親油性の１つの可能な機能は、芳香族脂肪酸が原形質膜ならびに他のオルガネラの膜に侵入し、それを横切る場合の増大である。腫瘍細胞のフェニルアセテート摂取率を、より疎水性のアナログであるナフチルアセテートのそれと比較した（表15）。10分後、フェニルアセテートに対して、２倍以上のナフチルアセテートが神経膠芽細胞腫U87細胞に侵入し（フェニル酢酸の摂取はナフチル酢酸の41％であった）、原形質膜を通過するその動きはフェニルアセテートよりも２倍以上速いことを示した。20分後、細胞によって摂取されたナフチルアセテートの量はフェニルアセテートのそれよりも26％だけ大きく、そして180分においては、両化合物の細胞内レベルはほぼ等しく、この時点ではナフチル酢酸のより迅速な流入は、等しく迅速な流出によってバランスされていることを示した。さらなる摂取はほとんどなく、そして細胞内外のフェニルアセテートの濃度はほぼ等しく、これらの細胞が多量の芳香族脂肪酸を能動的に蓄積しないことを示した。
表現型の復帰。選択的な細胞増殖抑制に加え、フェニルアセテートは、悪性細胞がより良性の表現型へ復帰するように誘導する。元は骨転移に由来するホルモン治療抵抗性の前立腺PC3細胞をモデルとして用い、アナログが腫瘍生物学に与える効果をテストした。PC3はインビボでその悪性挙動に相関するインビトロでのいくつかの増殖特徴を示し、これは、足場非依存性増殖（すなわち、半固体寒天中でのコロニー形成）、つまり再構成基底膜（マドリゲル）上で平板培養した場合には［網］−様構造の形成を含む。このような特性の喪失をもたらすフェニルアセテートおよび代表的なアナログの能力を図９に要約する。細胞増殖抑制効果と同様に、非悪性表現型への復帰を誘導する薬物能力は、計算された薬物の親油性と大いに相関していた。テストした化合物のうち、ナフチルアセテート、ならびにヨード−および塩素置換を持つフェニルブチレートおよびフェニルアセテートの誘導体がモルベースで最も活性であることが判明した。足場非依存性増殖を抑制する化合物の相対的効果は、U87神経膠芽細胞腫を用いて確認した（データは示さず）。
顕著な結果は、（ａ）フェニルアセテート誘導体の親油性とヒト腫瘍細胞に対するその活性との間に単純な関係が存在する。および（ｂ）ヒト新生物で観察された相対的能力は、植物において記載されているそれと同様であり、ここは成長調節における芳香族脂肪酸の役割が進化において保存されていたことを示すという発見である。
フェニルアセテートおよび誘電体は遺伝子発現および細胞生物学を改変する複数の機能を介して作用し得るという蓄積されつつある証拠がある。成長阻害濃度においては、芳香族脂肪酸は、DNAのメチル化、すなわち種々の真核生物遺伝子の転写を制御する後生的機構を改変し得る。フェニルアセテートは植物および哺乳動物細胞におけるDNAのメチル化を阻害し、そしてフェニルアセテートおよびフェニルブチレートは共に他の休止メチル化依存性遺伝子の発現を活性化することが示された。DNAの低メチル化自体は遺伝子発現を誘導するのに十分ではない。予備的知見は、フェニルアセテート、フェニルブチレートおよびいくつかのアナログが転写因子として機能する核受容体を活性化し、興味深いことには、この受容体はステロイド核受容体スーパーファミリーのメンバーであり、そのリガンドはカルボン酸であって、レチノイドのような十分特徴的付けされている分化インデューサーを含む。
遺伝子転写に影響することに加え、フェニル−脂肪酸は、コレステロール合成のメバロネート（MVA）経路を阻害することによって、タンパク質の翻訳後プロセッシングを妨害し得る。MVAは、細胞周期の進行に必要ないくつかのイソペンテニル部分の、および臨界的タンパク質の小セットを修飾するフェニル基の前駆体である。後者は細胞分裂シグナルの変換に関与する原形質膜ＧおよびＧ−様タンパク質（例えば、ras）（分子量20−60kDa）、および有糸分裂において鍵となる役割を演ずる核エンベロープラミン（44−47kDa）を含む。芳香族脂肪酸は補酵素Ａと結合し得、鎖伸長への経路に入り、そして一般に脂質代謝を妨害する。さらに、フェニルアセテートのような化合物はメバロネートピロホスフェートに似たコンフォメーションを取り得、そしてMVA利用を特異的に阻害する。分化が貧弱な哺乳動物組織（ヒト神経膠芽細胞腫および発生中の胎児脳）に対するフェニルアセテート活性がMVA脱カルボキシル化の阻害およびタンパク質のイソプロペニル化に関連することが最近示された。迅速に発生する哺乳動物および植物組織は、細胞複製につきMVAを高度に依存している。フェニルアセテート関連化合物によるMVA利用の阻害は、従って、このような高度に多様な生物において記載されている効果の部分的原因であり得る。
セクションJ:NaPAおよびNaPBレチノイン酸組合せ処置
LA−Ｎ−５細胞株を用い、NaPAはヒト神経芽細胞の分化を刺激し得る。さらに、結果は、NaPAおよびRAを用いた組合せ処置の結果、他の機構の中でも、RA分化プログラムに対してポジティブにインパクトを与えるNaPAの能力によって媒介され得る相乗的抗腫瘍および分化効果を生じることを示す。
参考例2:LA−Ｎ−５細胞−NaPAおよびRAの組合せ
細胞培養。先に記載されているように（Sidell,N.,Altman,A.Haussler,M.R.,およびSeeger,R.C.、「いくつかのヒト神経芽腫瘍細胞株の増殖および表現型発現に与えるレチノイン酸（RA）の影響,Expl.Cell.Res.,148:21−30,1983）、10％加熱不活化FCS、HEPES緩衝液および50IU/mlペニシリン／ストレプトマイシンおよび１μｇアンホテリシンを補足したRPMI1640培地（完全培地）でLA−Ｎ−５ヒト神経芽腫瘍細胞株を増殖させた。NaPAはElan Pharmaceutical Research Corporation（Gainesville,GA）から入手した。特に断りのない限り、全ての他の化学薬品はSigma（St.Louis,MO）から購入した。全てのトランス−RAをジメチルスルホキシドに溶解させて５×10-2ミリモルの濃度とし、−20℃で貯蔵した。
3H−チミジン取込み。細胞（３〜５×1010/ウェル）を24−ウェルのプラスチック製組織培養皿（2cm2、Corning,Palo Alto,CA）に接種し、示した濃度のNaPAおよび／またはRAの非存在下または存在下で増殖させた。特に断りのない限り、増殖の６〜７日後に、１μCiの3H−チミジン／ウェルを培養に添加した。12〜16時間の取込みの後、培養をPBS中で十分にすすぎ、30分間TCA−沈殿させ（10％TCA）、そして無水エタノール中で洗浄した。次いで、培養を1N NaOHで可解化し、1N HClで中和し、そしてアリコットをScintifluor（National,Diagnostics,Manville,NJ）カクテルで計数した。代表的な実験からの結果を３つまたは４つのウェルの平均cpm（±SEM）として表す。各実験は少なくとも３回行い、同様の結果が得られた。
アセチルコリンエステラーゼ（AChE）活性。AChE比活性を、処置および対照のLA−Ｎ−５細胞の分化の相対的状態の生化学的指標として測定した（Sidell,N.,Lucas,C.A.,およびKreutzberg,G.W.,「ヒト神経芽腫瘍細胞株におけるレチノイン酸によるアセチルコリンエステラーゼ活性の調節,Expl.Cell Res.,155:305−309,1984）。AChE活性の測定のために、示した濃度のNaPAおよび／またはRAの非存在下または存在下、25cm2の組織培養フラスコで６日間増殖させ、等張生理食塩水で２回洗浄し、そして培養フラスコを激しく撹拌することによって回収した。生理食塩水を除去した後、細胞を−20℃で凍結し、0.5％トリトンＸ−100（1.5ml/106細胞）を含有する氷冷10mMリン酸緩衝液（pH7.4）の添加によって解凍し、そして10秒間音波処理した。ホモジネートの試料中におけるAChE活性を先に記載されているように（Sidell,N.,Lucas,C.A.,およびKreutzberg,G.W.,「ヒト神経芽腫瘍細胞株におけるレチノイン酸によるアセチルコリンエステラーゼ活性の調節,Expl.Cell Res.,155:305−309,1984）、アセチルコリンの加水分解の後に分光光学的に測定した。標準としてウシ血清アルブミンを用い、Bio−RadのCoomassieタンパク質のアッセイキットで測定した。ナノモル／時間/mgタンパク質で表した結果を、代表的実験における３つのウェルの平均値±SEMとして表す。全ての実験は少なくとも３回行った。
ノーザンブロット分析。総RNAをグアニジニウムイソチオシアネート法によって、回収した細胞から抽出し、CsClグラジエントにより沈殿させた（Chirgwinら,1979）。次いで,RNAを使用するまで−70℃で貯蔵した。RNA（20−25μｇ）をグリオキザールによって変性させ、低電圧にて1.2％のアガロースを通す電気泳動によって分画し、次いで、正圧の移行装置（Stratagene,La Jolla,CA）を用いてBiotransナイロン膜（ICN,Irvine,CA）に移した。ランダムプライムキットを用いてDNAプローブを標識し、109cpm/μｇの活性を通常に得た（Amersham,Arlington Heights,IL）。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション媒体は６×標準クエン加生理食塩水（SSC）、５×デンハート溶液、0.5％SDSおよび100μg/mlサケ精子DNAから構成された。16時間のインキュベーションの後、フィルターを、室温にて、30分間、１×SSC、0.1％SDS中で１回、68℃にて0.2％SSC、0.1％SDSで３回洗浄した。−70でKodak SARフィルムを用いてオートラジオグラフィーを行った。走査型レーザーデンシトメーター（Biomed Instruments,Irvine,CA）で定量的デンシトメトリーを行った。
核レチノイン酸受容体−β（RARβ）プローブに記載されているように（Brand N.,Petkovich,M.Krust,A.,Chambon,P.,de The,H.,Marchio,A.Tiollais,P.およびDejean,A.,第２のヒトレチノイン酸受容体の同定、Nature,332:850−853,1988），クローンRAR−β０から得た。Ｎ−myc特異的プローブpNB−１をAmerican Type Culture Collectionから得た。試料の比較し得る負荷を確認するために、すべてのフィルターをA600塩基EcoR I/BamH Iβアクチン断片で再プローブした。
免疫細胞学。湿潤な５％CO2雰囲気中、LA−Ｎ−５細胞を、組織溶媒チャンバースライド（Nunc,Inc.,Naperville,IL）に平板培養した。細胞を一晩付着させ、次いで、示した濃度のNaPAおよび／またはRAで処理した。１週間の処置の後、細胞をPBSで洗浄し、pH7.0のPBA中の２％パラホルムアルデヒド、続いて４℃にてメタノールにて、各々10分間固定した。室温にて、メタノール中の３％H2O2にて10分間インキュベートすることによって、内因性ペルオキシダーゼ活性を排除した。PBS中の10％正常ヤギ血清と共に室温で30分間、続いて37℃で一次抗体と共に２時間インキュベートすることによって、非特異的抗体部位をブロックした。抗−Ｎ−mycモノクロナール抗体NCM II 100（Ikegaki,N.,Bukovsky,J.およびKennett,R.H.,「規定された特異性を持つモノクローナル抗体によるヒト芽腫細胞におけるNMYC遺伝子産物の同定および特徴付け」,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,83:5929−5933,1986）および非結合性IgG対照モノクローナル抗体を反応における一次抗体として使用した。一次抗体とのインキュベーションに続き、室温にて30分間ビオチン化ヤギ抗−マウス抗体、室温にて30分間Ｚ−アビジン−ペルオキシダーゼ結合体（Zymet Laboratories,Inc.,San Francisco,CA）、および室温にて10分間pH8の50mMトリス中の0.5mg/mlのジアミノベンジジン/H2O2（Sigma）で順次インキュベーションした。細胞を全ての工程の間でPBS中で15分間洗浄した。核染色強度を定量し、そしてNikonデジタル画像顕微鏡システムおよび画像処理ならびにAnalytical Imaging Concepts（Irvine,CA）からの分析ソフトウェアを用いて分析した。
タンパク質のイソプレニル化の分析。細胞培養を、５μＭバスタチンを含有する完全培地中、10mMフェニルアセテートおよび／または１μM RAで24時間インキュベートした。処置の最後の15時間の間に、細胞をRS−［２−12C］メバロネート（16μCi/ml、比活性15μCi/ミリモル）（American Radiolabled Chemicals,Inc.,St.Louis MO）で標識した。全細胞タンパク質を抽出し、10％SDS−ポリアクリルアミドゲルで分離し、そしてクーマシーブリリアントブルーで染色した。次いで、ゲルを乾燥し、Kodak X−Omatフイルムに４日間曝露した。
形態学的分化。NaPAはLA−Ｎ−５細胞から軸索の発芽後成長（outgrowth）を誘導した。この効果はまず培養における連続的曝露の約３日後に出現し、５−10mMの間の濃度のNaPAで軸索の形成の最大増加が起こった。1mM未満の濃度は検出可能な形態学的影響を生じなかった。生存細胞パーセントの減少は、対照培養と比較して処置培養で検出されなかった。しかしながら、より高いNaPA濃度（＞10mM）は長期培養期間（＞７日間）にわたって毒性であることが判明した。5mMを超えるNaPA濃度において脂質液滴に似た細胞内封入体の数のわずかな増加が観察できたにも拘わらず、細胞体はNaPA処理で顕著には変化しなかった。
さらに報告されるように、RAはまた、LA−Ｎ−５細胞から軸索の出芽を誘導し、１μＭを超えるRA濃度で最大効果であった（Abemayor,E.およびSidell,N.、「ニューロン細胞分化に対する新形成のインビトロ研究のためのモデルとしてのヒト神経芽腫細胞株」,Environ,Health Perspect.,80:3−15,1989;Sidell,N.,Altmann,A.Haussler,M.R.およびSeeger,R.C.、「いくつかのヒト神経芽腫細胞株の成長および表現型発現に対するレチノイン酸（RA）の効果」、Expl.Cell Res.,148:21−30,1983;Lando,M.,Abemayor,E.,Verity,M.A.,およびSidell,N.、「細胞内環状AMPレベルの調整、およびヒト神経芽腫細胞の分化応答」、Cancer Res.,50:722−727,1990;Sidell,N.,Lucas,C.A.,およびKreutzberg,G.W.、「ヒト神経芽腫細胞株におけるレチノイン酸によるアセチルコリンエステラーゼ活性の調節」、Expl.Cell Res.,155:305−309,1984）。最適濃度の両薬剤の存在下、LA−Ｎ−５の形態学的分化は高かった。事実、5mM NaPA＋１μM RAを用いた処置は、培養のわずか６−７日後に、細胞のクラスター化および偽性神経節形成の軸索束暫増レミニッセンスを誘導した。両薬剤とともにより長期間（〜２週間）では、細い繊維の精巧なバックグラウンドネットワークに対する軸索の濃い束によって結合された大きな細胞集合体が優勢となる培養を生じた。この時点で、非常に少数の個々の細胞（細胞クラスターには関係しない）しか観察されなかった。
増殖。図10はLA−Ｎ−５細胞における3H−チミジン取込みに対するNaPA処置の用量依存性効果を示す。65％を超える阻害が、5mM以上のNaPA濃度で達成され、他方、1.25mM未満では効果はほとんど観察されなかった。10mMを超える濃度はテストしなかった。何故なら、フラスコからの細胞の脱着が有意な毒性を示唆したからである。
NaPAおよびRAは、独立したメカニズムを介して作用する２つの抗増殖剤の組合せ作用から予測される取り込みよりも、その組合せ処置はより低レベルまで3H−チミジン取込みを終始一貫して低下させた点で、LA−Ｎ−５細胞に対してその抗増殖効果において相乗的であった。例えば、1.25mMのNaPAの存在下での3H−チミジン取込みは対照の約90％であり、他方、10-7mM RAでは約70％であった。これらの濃度において一緒になって両薬剤は対照の30％まで3H−チミジンを低下させ、その一方、互いに独立して作用する２つの薬剤から63％が予測され得た（0.90×0.70−63％）。テストした最高濃度における組合せ処置（NaPA−5mM;RA−１μＭ）の結果、細胞成長はほとんど完全に停止し、その一方、各剤単独ではアッセイ期間の６日後には部分的効果しか生じなかった。RA（10-7M）、NaPA（1.25mM）、RA（10-7M）＋NaPA（1.25mM）の存在下、あるいは示したような添加化合物の非存在下において、細胞を培養した。６日後、培養を［3H］チミジンの取込みについてアッセイした。
アセチルコリンエステラーゼ（AChE）活性。軸索の発芽後成長と同時に、RAを含む種々の剤を用いて分化させるように誘導したLA−Ｎ−５細胞中でAChE活性が増加する（Lando,M.,Abemayor,E.,Verity,M.A.,およびSidell,N.、「細胞内環状AMPレベルの調整およびヒト神経芽腫細胞の分化応答」、Cancer Res.,50:722−727,1990;Wuarin,L.,Verity,M.A.,およびSidell,N.、「ヒト神経芽腫細胞に対するγインターフェロンの効果およびレチノイン酸とのその相互作用」、Int.J.Cancer,48:136−144、1991）。神経芽腫細胞分化のこの生化学的指標がNaPA−誘導の軸索発芽成長に関連するか否かを評価するために、種々の濃度のNaPAで処理した細胞でAChE活性を６−７日間測定した（図11）。図に見られるように、1.25mM NaPAでAChEは有意に増加し、最大増加は5mM AChEで起こった。NaPAおよびRAの存在下では、各々の薬剤単独で観察された活性よりも有意にAChE活性は増強された。従って、図11で示されたように、NaPAまたはRAいずれかで処置された細胞ではAChE活性は40nm/分/mgタンパク質未満のままであったが、150nm/分/mgタンパク質もの高レベルが組合わ処置で達成され得た。この活性は、種々の分化剤を単独または組み合わせて用い、LA−Ｎ−５細胞で観察された今までとしては最強のAChE誘導を表す。AChEの絶対値は実験相互間で変動するが、パターンは一致しており、図11に示す結果は代表的である。一般に、AChE活性の誘導増加は、LA−Ｎ−５培養における軸索形成の程度および完全性と平行していた。
LA−Ｎ−５細胞のグルタミン枯渇に対する感受性。ヒトにおいて、NaPAは、フェニルアセチルグルタミンを形成するためのアミノ酸の結合（肝臓および腎臓で起こることが知られている酵素反応）に起因して循環グルタミンの枯渇を引き起こす（James,M.O.,Smith,R.L.,Williams,F.R.S.,and Reidenberg,M.,「ヒト、ヒト下の霊長類およびいくつかの非霊長類種におけるフェニル酢酸の結合」,Proc.R.Soc.Lond.B,182:25−35,1972）。血漿グルタミンレベルのインビボ低下は細胞を低グルタミン濃度の存在下で培養することによって模倣した。グルタミンの略奪はLA−Ｎ−５細胞の成長、形態、またはAChE活性に有意な効果を示さなかった。事実、外因性グルタミンの完全な非存在下において、LA−Ｎ−５培養はグルタミンの生理学的レベルで増殖する培養と本質的に区別がつかなかった。さらに、LA−Ｎ−５細胞のNaPA−およびRA−の両方で誘導される分化はグルタミンの非存在下によって影響を受けなかった。従って、NaPAによるグルタミン枯渇はLA−Ｎ−５細胞に対するこの化合物の分化誘導効果を説明し得なかった。
Ｎ−myc発現。ｎ−mycオンコプロテインの発現は、RA−誘導分化の間に、LA−Ｎ−５および他の神経芽腫細胞で迅速に減少することが示されている（Thiele,C.T.,Reynolds,C.P.,およびIsrael,M.A.,「Ｎ−mycの発現の低下はヒト神経芽腫細胞のレチノイン酸が誘導する形態学的分化に先行する」、Nature,313:404−406,1985）。未処理LA−Ｎ−５細胞の核はＮ−myc抗体と強力に反応し、そして一般に神経芽腫細胞で先に報告されたように培養内で染色強度の顕著な不均質性を示した（Ikegaki,N.,Bukovsky,J.およびKennett,R.H.）、「規定された特異性を持つモノクローナル抗体によるヒト神経芽腫細胞におけるNMYC遺伝子産物の同定および特徴付け」、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83:5929−5933,1986）。この不均質性は、免疫染色した細胞スライド（cytoslide）調製物の定量的画像分析によって確認された。NaPAまたはRAと共に３日間以上インキュベートした細胞は、中間の相対的染色強度における減少によって示されるように、対照培養における44から、NaPAおよびRA−処理培養のそれぞれ36および29までのＮ−myc発現の顕著な低下を示した。NaPAおよびRA両者を用いた組合せ処置の結果、Ｎ−mycレベルはさらに深く低下し、平均相対染色強度は16であった。
NaPAはＮ−mycタンパク質の低下を誘導したにも拘わらず、短期間（３〜６日）培養におけるＮ−myc mRNA発現で変化は観察されなかった。5mM NaPAを用いたLA−Ｎ−５細胞の６日間処理は（Ｎ−mycタンパク質レベルを終始一貫して低下させる条件）、ノーザンブロッティングによって評価してＮ−myc mRNAレベルにおいて未処理培養からの明らかな差異を示さなかった。他方、RA処理は先に報告されたように生成されるメッセージの量の劇的な低下を引き起こし（約60％低下）、その一方、組合せ処置の結果、RA単独で観察されたメッセージレベルと同様のメッセージレベルであった。短期間培養におけるＮ−myc RNAに対するNaPAの効果のこの欠如とは対照的に、NaPAを用いたより長期間処置（＞８日間）は、Ｎ−myc mRNAレベルにおける中程度の減少（16％）、RA単独による64％減少、およびNaPAをRAと組み合わせた場合のさらなる大きな減少（97％）の両方を誘導した。
核レチノイン酸受容体−β（RARβ）発現。多くの他の組織におけるように、ヒト神経芽腫において、RARβは未処理細胞において低い構成的発現を示すが、RAによって迅速に誘導される（de The,H.,Marchio,A.Tiollais,P.,およびDejean,A.、「レチノイン酸受容体αおよびβ遺伝子の分化の発現および調節」,EMBO J.,8:429−433,1989;Wuarin,L.Chang,B.,Wada,R.,およびSidell,N.「レチノイン酸は、ヒト神経芽腫における核レチノイン酸受容体−α発現を上昇調節する」,Int.J.Cancer（印刷中）」）。RARβ発現はNaPAによって増強された。LA−Ｎ−５細胞を、示したように、溶媒対照（Ｃ）、RA（10-6M）、NaPA（PA、5mM）またはRA（10-6）＋NaPA（5mM）で３日間処置し、RARβ発現につきノーザンブロットによって分析した。デンシトメトリー走査により、対照と比較して、NaPA単独によって誘導されたRARβmRNAレベルにおいて2.5倍増加、RA単独による４倍増加、およびNaPAおよびRAの組合せによる16倍増加が示された。全ての値をβ−アクチンレベルに正規化した。RARβmRNAレベルはNaPAによって中程度に増加され、その一方、NaPAおよびRA両方の存在下では、この受容体の発現はRA単独で観察された発現よりも顕著に増強された。LA−Ｎ−５細胞では、この効果は、NaPAによって誘導された形態学的または他の表現型変化に先立って起こった。
タンパク質イソプレニル化に対するNaPAの影響。アセチル−CoAおよびメバロネート（MVA）のような前駆体からのコレステロールおよびイソプレノイドの活性なデノボ合成は、発育するニューロン組織の重要な特徴である（Grossi,E.,Paoletti,P.およびPaoletti,R.「脳コレステロールおよび脂肪酸生合成の分析」、Arch.Int.Physiol.Biochem.,66:564−572,1958）。タンパク質プレニル化は、それ故に、細胞増殖および分化の正常な調節に臨界的な重要な翻訳後プロセスであることが示されている（Marshall,C.J.,「タンパク質のプレニル化：タンパク質−タンパク質相互作用のメディエーター」Science,259:1865−1866,1993;Braun,P.E.,DE Angelis,D.,Shtybel,W.W.,およびBernier,L.「イソプレノイド修飾は2',3'−環状ヌクレオチド3'−ホスホジエステラーゼが膜に結合することを可能とする」、J.Neurosci.Res.30:540−544,1991）。本明細書の他の箇所で議論したように、NaPAはヒト神経膠芽細胞腫細胞においてタンパク質イソプレニル化およびMVA脱カルボキシル化を阻害する。また、この効果はフェニルケトン尿症（フェニルアセテートの過剰生産に関連するフェニルアラニン代謝の先天性異常）において胚性脳で観察される（Scriver,C.R.,およびClow,C.L.,「フェニルケトン尿症：ヒト生化学遺伝学の概要」,N.Engl.J.Med.,303:1394−1400,1980;Castillo,M.,Zafra,M.F.およびGarcia−Peregrin,E.「実験的高フェニルアラニン血症における脳および肝臓３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−CoAレダクターゼおよびメバロネート−５−ピロホスフェートデカルボキシラーゼの阻害」、Neurochem.Res.,13:551−555,1988）。阻害実験は、RAではなくNaPAがLA−Ｎ−５神経芽腫においてタンパク質のイソプレニル化を阻害したことを示す。LA−Ｎ−５細胞を、示したように、溶媒対照、RA（10-6M）、NaPA（10mM）、またはRA（10-6M）＋NaPA（10mM）で24時間処理し、そしてRS−［２−14C］メバロネートを用いた標識化の後、タンパク質のイソプレニル化について分析した。さらに、NaPAおよびRAの存在下では、それらの効果はNaPA単独で誘導された効果と同様であった。
NaPAは、用量依存性増殖阻害、軸索発芽後成長、増大したAChE活性、およびＮ−myc発現の低下によって評価されるように、LA−Ｎ−５ヒト神経芽腫細胞株の分化を誘導した。本明細書で論議されるように、NaPAは、前骨髄球白血病、前立腺ガン、および神経膠芽細胞腫細胞の悪性表現型を減少させることが示された。（本明細書で議論した）悪性脳腫瘍を持つラットを用い、腫瘍成長を選択的に阻止し、分化を促進するNaPAの能力が確認された。このデータは、２つの他のヒト神経芽腫細胞株におけるNaPAが誘導する形態学的分化、成長阻害、およびＮ−mycタンパク質レベルの低下を示すデータを確認し、それを拡張する（Cinatl,J.,Cinatl,J.,Mainke,M.,Weissflog,A.,Rabenau,H.,Komhuter,B.,およびDoerr H−Ｗ「フェニル酢酸ナトリウムによって誘導されたヒト神経芽腫細胞のインビトロ分化」、Cancer Lett,70:15−24,1993）。NaPAおよびRAはLA−Ｎ−５分化を誘導することにおいて相乗的であった。従って、各薬剤単独を用いた分化応答に関して飽和していた濃度におけるNaPAおよびRAを用いた組合せ処置は、測定した全てのパラメーターのさらなる顕著な増強を引き起こした。さらに、全ての濃度において、組合せ処置は、互いに独立して作用する２つの薬剤から予測されるよりも大きなレベルまでLA−Ｎ−５分化を終始一貫して誘導した。事実、両薬剤の組合せ効果は、応答する細胞の数および達成された成熟レベルに関する両方において、いままでに神経芽細胞腫細胞で観察された最強の分化応答を表す。
参考例3:
神経芽腫細胞株に対する抗増殖効果
細胞株。関連する実験において、神経伝達物質表現型、Ｎ−myc増幅、Ｎ−rasおよびp53発現、神経堤系統応答、およびレチノイン酸誘導分化に対する感受性に関連する特徴を変化させて、７のヒト神経芽腫細胞株を用いた。以下の表７は７つの株のいくつかの重要な特徴を要約する。
Figure 0003628694
始原型でおよび最もよく特徴付けされた株はLA−Ｎ−５であり、これは、ヒト神経芽腫細胞株の大部分と同様に、Ｎ−mycの増幅されたコピーを含有し、そしてレチノイン酸による分化誘導に対して感受性である。このようなLA−Ｎ−５は、PAおよびPBの可逆性および薬剤濃度に対する処置持続の関係に関する特定の疑問に近づく最良の規定されたモデル系であった。
ヒト神経芽腫細胞に対するPAおよびPBの抗増殖効果。図12は、処置７日後における７つの細胞株での［3H］チミジンの取込みに対するPAおよびPBの濃度依存性効果を示す。図に見られるように、７つの株のうち６において、テストした最高PB濃度（4mM）において95％を超える阻害が達成され、同じ細胞株は2mM PBでは70％を超える阻害を示した。１つの株LA−Ｎ−６は、4mM未満の濃度でほとんど増殖阻害がないことを示すことによって、感受性が低いことが判明した。
全ての場合において、神経芽腫細胞株は、PBによるよりもPAによる増殖阻害に対して感受性が低かった。表８は、この細胞株において50％増殖阻害（GI50）を誘導し得る濃度を図12から外挿する。また、図に見られるように、PAに対して最も感受性の低い株（LA−Ｎ−２、SK−Ｎ−SH−Ｎ、およびLA−Ｎ−６）はPBに対しても最も感受性が低かった。しかしながら、逆は真ではなかった;SK−Ｎ−ASはPAによる増殖阻害に対して最も感受性であったが、PBに対しては最も感受性ではなかった。表８に示した細胞株の一般的特徴と、PAまたはPBによるその増殖阻害との間には明らかな相関は認められなかった。
Figure 0003628694
これらの結果は、組織学的群として、ヒト神経芽腫細胞がPBおよびPAによる増殖阻害に対して非常に感受性であることを示す。PAおよびPB処理の間に起こる形態学的変化の観察において、軸索伸長の一般的特徴、および全ての細胞株における細胞のクラスター化も認められた。従って、種々の株におけるPB−およびPA−で誘導される神経伝達物質変化はまだ定量化されていないが、観察された形態学的変化は、ニューロン分化がPBおよびPAに対するヒト神経芽腫細胞の応答における一般的特徴であることを示す。
神経芽腫細胞に対するPBおよびPAの用量−および時間−依存性効果。LA−Ｎ−５細胞を、各々、0.5〜4mMおよび1.25〜10mMの範囲の用量でPBおよびPAを用いて処理し、そして［3H］チミジン取り込み（増殖の尺度）およびアセチルコリンエステラーゼ（分化の尺度）を次の８日間にわたって評価した。図13Aに見られるように、２または4mM PBと共にインキュベートした細胞は、培養の開始後２日と早く［3H］チミジン取込みの減少を示し、その一方、0.5および1mM PBと共にインキュベートした細胞は、処置の４日後に有意な阻害を示したに過ぎなかった。PBの最高濃度（4mM）は、細胞毒性効果を誘導するようであり、これは培養第４日に開始した（トリパンブルー排除によって評価した）細胞生存性の暫時の減少によって反映された。他の濃度のPBで処理した培養では生存細胞のパーセントの減少は検出されなかった。有意な増殖阻害を示すために必要な、薬剤濃度と処置時間との間に、同様の逆の関係がPAについて認められた（図13B）。しかし、図12と一致して、テストした最高（10mM）PA濃度において３日後に有意な増殖阻害が最初に認められた点で、PAはPBよりも効果が低かった。LA−Ｎ−５細胞の増殖阻害を誘導するために全ての他の濃度のPAでは少なくとも４日を要した。
PBおよびPAによるAChE活性の誘導は、一般に、これらの薬剤によって誘導された増殖阻害よりも迅速に起こった（図14）。全ての濃度のPBにおいて、培養したLA−Ｎ−５細胞は、処置の第１日に開始し、第４日まで徐々に増加するAChE活性における用量依存性増強を示した。この時期後（第６日目および８日目）、AChEレベルは、一般に、4mM PBの存在下で観察された急激な減少を除き、横ばい状態となった。この減少は、恐らくは、上記のように、これらの培養の低下した生存率を反映していた。PAに関しては、LA−Ｎ−５培養におけるAChE活性はまた、時間−および用量依存性増加を示したが、この効果は全ての濃度について、測定の最終の日（第８日）まで進行した。PAおよびPB処理の可逆性に関する実験（後記）は、AChEレベルが２週間またはそれ以上までPA−処理培養において増加し続けることを示唆する。
増殖およびAChE活性に対するPBおよびPA効果の可逆性。LA−Ｎ−５細胞を、各々、溶媒対照、2mM PBまたは5mM PAのいずれかを用いて、６日間培養し、次いで、洗浄し、そして対照培地または当初の処置濃度のこの薬剤を含有する培地のいずれかを再度与えた。次いで、［3H］チミジン取込み（図15）および特異的AChE活性（図16）を、洗浄（処置後）後第１日目に開始し、そしてその後種々の日に評価した。図15に見られるように、PAで細胞を処理した７日後まで、対照培地を再度与えた培養における［3H］チミジン取込みは、基本的にはPAを再度与えた培養と同一速度でゆっくりと増加し続けた。しかし、処置後１週間後には、対照培地を再度与えた細胞は、PAの連続的な存在下で培養された細胞よりも高い増殖速度を示した。対照またはPB含有培地のいずれかを再度与えた培養において処置後７日までの間ほとんど増殖が見られなかった点で、同様なゆっくりとした可逆性がPBで観察されたが、この時点以後は２つの増殖曲線は離別した。処置後期間14日までの間でさえ（合計20日の処置時間）、5mM PAの連続的な存在下で観察された［3H］チミジン取り込みにおけるゆっくりとした定常的増加は、この濃度のPAは総じて細胞増加を抑制しないか、あるいはこの薬剤に対する変化する耐性を持つLA−Ｎ−５細胞の個々に分離した集団が培養中に存在することを示唆する。対照的に、20日までの間PBの連続的な存在下で増殖させた細胞は、任意の増殖を示さず、これは、PAを用いたより完全な抑制および／または耐性集団の欠如を示唆する。しかし、PBの高い抗増殖効果でさえ、この実験条件下でいくぶん可逆的であるようであった。
この薬剤を用いて培養した６日後のAChE活性の測定は、課せられた条件下で、LA−Ｎ−５の増殖および分化に対するPAおよびPB両者の効果が可逆的であるという結論を支持する。図16に見られるように、PAおよびPBによって当初誘導された増大AChE活性は、処置後１週間後にベースライン値に復帰した。PBを再度与えた培養では、AChE活性は大なり小なり一定のレベルまで上昇したままであった。他方、PAを再度与えた培養では、特異的AChE活性が処置後時点から７日までさえ増加し続け、結局はPBで達成された以上のレベルまで達した。この後者の観察は、PAによるAChEの誘導（そして恐らくは分化）が比較的ゆっくりとした過程であり、そしてその十分な分化−誘導活性が実現されるまで、薬物に連続的な何週間もの曝露が必要であり得ることを示唆する。
参考例4:
フラボノイドおよびリグニンと併用したNaPA。さらに、PAおよびそのアナログもまた同様に、上記のようなレチノイドを用いたように、フラボノイドとリグニンとを組み合わせて使用され得る。例えば、PAおよびアピゲニン（フラボノイド）は、ヒト前立腺癌腫PC3細胞の増殖を抑制するために相乗的な様式で作用する。PAを９−シス−レチノイン酸と組み合わせてPAを用いた場合に同様の結果が観察された。９−シス−RA（および上記のような全てのトランス−RAを含めたその前駆体）は、PAおよびそのアナログによるPPARの刺激に必要である（本明細書および同時係属出願に記載される）、核受容体RXRを活性化する。
PC細胞を、１）10μM EtOH（対照）、２）PA 4mM、３）アピゲニン10μＭ、４）PA 4mMと組み合わせたアピゲニン10μＭ、５）９−シス−RA 2μＭおよび６）PA 4mMと組み合わせた９−シス−RA 2μＭで処置した。組合せ療法は、PC3細胞生存率において、有意な増強された減少（アピゲニン/PA約50％および９−シス−RA/PA約50％）を示した。
さらに、植物細胞からのPAの流出をブロックすることが知られているフラボノイドであるケルセチンを、本明細書に記載される療法を増強するためにPAと組み合わせ用いて使用し得る。
セクションK:NaPAおよびNaPB−ロバスタチン併用処置。
悪性神経膠腫は、コレステロールおよび細胞複製に重要な中間体の合成のためのメバロネート（MVA）経路に高度に依存する。MVAの合成および／または利用の標的化は、従って、正常な脳組織を損傷することなく腫瘍増殖を阻害し、そこでは、MVA経路は最小限に活性である。ヒト神経膠芽細胞は、鍵となる調節酵素HMG−CoAレダクターゼおよびMVA−PPデカルボキシラーゼの阻害剤としてそれぞれ作用するロバスタチン（LOV）およびフェニル酢酸ナトリウム（NaPA）に対して独特に傷つきやすいことが見い出された。
実施例4:ロバスタチンのようなバスタチンとのNaPA組合せ療法
インビトロテスト。LOV（表９参照）およびNaPA両者の単独療法は、実験室モデルおよびヒト（本明細書に記載された）における神経膠腫に対して効果的である（細胞増殖抑制および表現型逆転の誘導）。しかしながら、組み合わせた場合、この２つの薬物は神経膠腫細胞増殖を抑制し、そして良性表現型への復帰を誘導するために相乗的に作用する。特に、NaPA（１〜3mM）と組み合わせた、薬理学上達成可能であるが準最適濃度のLOV（0.1〜0.5μＭ）を用いたヒト神経膠芽細胞腫A172細胞の処置の結果は：（ａ）腫瘍細胞複製の完全な阻止（図17参照）；（ｂ）侵入能力の90％を超える減退（図18参照）；および（ｃ）神経膠腫オートクライン増殖、脈管形成、および腫瘍誘導免疫抑制に関与する12.5kDタンパク質をコードするTGF−β２の発現の高阻害を生じた。NaPAとLOVとの間の相乗作用は、別の調節部位においてMVA経路をブロックする各々の能力に起因し得、タンパク質イソプレニル化の阻害に至る。さらに、NaPAは、DNA低メチル化、増殖制御およびグルタミン枯渇に関与する核受容体の活性化のような別のメカニズムにより腫瘍細胞増殖抑制および分化をさらに誘導し得る。
Figure 0003628694
インビボテスト。難治性グレード３および４の星状膠細胞腫を持つ13名の患者に、ロバスタチンを、連続７日間で４週間30〜35mg/kg/日の範囲の用量で経口投与した。活性を４名の患者で記録した:1名は部分的および１名は小さな応答、ならびに２名の別の患者における６カ月にわたる間の病気安定化。反応状態は、カルノフスキィ尺度で20〜40％改良された。NaPA（用量範囲15〜40グラム/24時間）を、同様の組織学および臨床的コースの12名の患者に、連続的または間欠的静脈内注射（CIVI）によって投与した。４名の患者は臨床的な改善を示し;2名は小さな応答および２名は病気安定化があり、反応状態は有意に改善された（１名は８カ月にわたる間、他は１カ月にわたる間）。両方の投与態様は臨床的活性に関連していた（毎日の血清濃度、平均±S.D.;174±97μg/ml）。
NaPAおよびLOVを用いた初期の臨床的体験は、個々に、十分に許容される用量で、高グレードの神経膠腫を持つ患者において活性を示した。興味深いこいとに、LOVに応答しなかった１名の患者は、NaPAを用いた治療に際し、客観的で臨床的な改善を示し、これは、これらの薬物に対して交差耐性が存在しないことを示した。NaPAおよびLOVは、明らかに、重複する毒性は有しない。NaPAの用量制限毒性（900μg/mlを超える血清濃度）は、可逆的CNS毒性である一方、横紋筋融解症で誘導される筋障害が（35mg/kg/日で）LOVを用いて観察された（経口的なユビキノンの補足により容易に制御された）。従って、LOVと組み合わせたNaPAの投与は、有意な副作用または毒性の危険なくして神経膠腫患者に対して有益である。
セクションL:メラノーマ細胞株に対するNaPAおよびNaPBの効果。メラノーマの増加した発生率および従来の処置に対する伝播性疾患の貧弱な応答性は、新しい治療アプローチの開発を必要とする。非毒性の分化インデューサーであるフェニルアセテートは、実験室モデルおよびヒトにおいて、他の神経外胚葉腫瘍、すなわち、神経膠腫の増殖を抑制し得る。これは、悪性メラノーマにおいて、フェニルアセテートおよび関連する芳香族脂肪酸の効率の探究に導いた。フェニルアセテートおよびフェニルブチレートは：（ａ）培養したヒト・メラノーマ細胞の選択的細胞増殖抑制および成熟を誘導し、（ｂ）腫瘍転移に関与する遺伝子（コラゲナーゼＩ型、TIMP）の発現および免疫原性（HLAクラスＩ）を調整し、そして（ｃ）レチノイド、インターフェロンα、スラミン、および５−アザ−2'−デオキシシチジンを含む臨床的興味ある他の剤の効力を増大することが見い出された。メラノーマの表現型不均質性を反映して、フェニルアセテート／フェニルブチレートによって誘導される生物学的改変の程度は、テストした腫瘍細胞株の間で有意に変化した。無胸腺マウスにおいて侵入性能力および腫瘍形成性を喪失するが、貧弱に分化した細胞は、形態において周縁の変化を示したに過ぎず、無色性を維持し、処置を中断した後に増殖を回復した。対照的に、成熟のより進んだ段階のメラノーマ細胞の処置の結果、末端の分化と一致して、細胞増殖、形態および色素沈着において大きな変化を生じた。インビトロで腫瘍細胞生物学に影響するフェニルアセテートおよびフェニルブチレートの濃度が有意な毒性なしでヒトで達成され、これは、悪性メラノーマの処置におけるこれらの薬剤の臨床的効力を示唆した。
実施例5:メラノーマ細胞のNaPA処置
細胞培養および試薬。SKMEL28、G361およびRPMIメラノーマ細胞株はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC,Rockville,MD）由来であった。A375はJ.Fidler（MD Anderson,Houston,TX）から贈られた。メラノーマ株624mel、501mel、888melおよび1011melはSrgery Branch NCIで観察された患者から確立した。これらの腫瘍細胞株ならびに正常ヒトメラノサイトはJ.Weber（NCI,Bethesda,MD）の好意によって提供された。全ての腫瘍培養を、10％熱不活化胎児ウシ血清（Gibco Laboratoires）、抗生物質、および2mM L−グルタミンを補足したRPMI 1640で維持した。一次メラノサイト培養を、Melanocyte Basal Medium（Clonetics,San Diego,CA）中で維持した。フェニル酢酸のナトリウム塩（NaPA）およびフェニル酪酸のナトリウム塩（NaPB）は、Elan Pharmaceutical Research Corp.,Gainesville GAから提供された。
PAGは塩化フェニルアセチルとグルタミンとの反応によって合成した（Thierfelder,H.およびSherwin,C.P.（1914）:Phenylacetyl−Glutamin,ein Stoffwechsel−Product des Menschliechen Korpers（o"）nach Eingabe von Phenyl−essigsaure（a"）,Ber.Chem.Ges.47:2630−2643）。簡単に述べれば、7.5gグルタミン（Aldrich,Milwaukee,WI）および8.4g NaHCO3を水200mlに添加し、そして混合物をpH10に調整した。激しく撹拌しつつ、塩化フェニルアセチル（Milwaukee,WI）7.5gを１時間にわたって滴下して添加した。最後の塩化フェニルアセチルが分散したとき、溶液をpH2に調整し、ヘキサンで２回抽出し、そして乾固させた。乾燥した粉末をヘキサンで濯ぎ、そして最小量の沸騰水に溶解させた。転換溶融範囲および狭いHPLCプロフィールを有する結晶化PAGを確認した。スラミンはMobay Chemical Corp.（New York,NY）由来であった。インターフェロンα（Referon−Ａ）はHoffmann−LaRoche Inc.（Nutley,NJ）から購入した。5AzadCおよび全てのトランス−RAはSigma（St.Louis,MO）由来であった。
細胞増殖および生存率の分析。増殖速度は、トリプシン/EDTAを用いた脱着後のヘモチトメーターを用いる細胞計数によって、および臭化３−［4,5−ジメチルチアゾール−２−イル］−2,5−ジフェニルテトラゾリウム（MTT）を用いる酵素アッセイによって測定した（Alley,M.C.,Scudiero,D.A.,Monks,A.,Hursey,M.L.,Czerwinski,M.J.,Fine,D.L.,Abbott,B.J.,Schoemarker,R.H.,Boyd,M.R.（1988）：マイクロ培養テトラゾリウムアッセイを用いるヒト腫瘍細胞株のパネルを用いた薬物スクリーニングの可能性,Cancer Res.48:589−601）。２つのアッセイは本質的に同一の結果を生じた。DNA合成は［3H］デオキシチミジン（New England Nuclear）を用いた代謝標識によって測定した（6.7Ci/ミリモル）。細胞生存率はトリパンブルー排除によって評価した。
免疫細胞化学。Dako PAPキットK537（Dako Corporation,CA）を用い、抗−ビメンチンモノクローナル抗体で細胞を免疫染色した。
マトリゲルを通じての侵入。組織バリアーを分解しおよび横切る腫瘍細胞の能力は、マトリゲル（再構築した基底膜）を利用するインビトロ侵入アッセイによって評価した。定量的分析は、製造業者の指示に従い、Biocoat Matrigel侵入チャンバー（Becton Dickinson Labware,Bedford,MA）を用いて行った。
無胸腺マウスにおける腫瘍形成。細胞（部位当たり５×105細胞）を、４〜６週齢の雌無胸腺ヌードマウス（Division of Cancer Treatment,NCI animal Program,Frederick Cancer Research Facility）に皮下注射した。腫瘍の数およびサイズを４週間後に記録した。
メラニン生産の定量。メラニン含量はWhittaker（Whittaker,J.R.（1963）：細胞培養におけるヒヨコ網膜色素細胞の分化の間のメラニン形成の変化、Dev.Biol.8:99−127）によって記載されている比色方法によって測定した。簡単に述べれば、脱イオン水0.5ml添加し、凍結および解凍を２サイクル行うことによって、腫瘍細胞をポイント当たり１〜２×106細胞で平板培養した。過塩素酸を0.5Nの最終濃度まで添加し、そして懸濁液を氷上に10分間保持し、次いで、15,000rpmで５分間遠心した。ペレットを0.5N HClO4で２回以上抽出し、続いて、エチルアルコール：エチルエーテル（3:1,v/v）の冷混合液で２回抽出し、そして最後にエチルエーテルで抽出した。ペレットを風乾し、0.85N KOH 1mlを添加し、次いで、100℃で10分間加熱することによって溶解した。不溶性残渣をペレット化した後、上清を室温まで冷却し、そして400nmにおける吸光度を二重ビーム分光光度計（UV−160A,Shimadzu Corporation,Kyoto,Japan）で読んだ。５〜150μg/mlの範囲の濃度で、熱KOHに溶解した合成メラニン（Sigma）を用いることによって標準曲線を作成した。相対的メラニン含量は５×106細胞/ml当たりの400nmにおける吸光度として表される。
ノーザンブロット分析。Invitrogen mRNA単離キット（San Diego,CA）によって、メッセンジャーRNAを、処理細胞および対照細胞から抽出した。試料（５μg/レーン）を１％アガロース／ホルムアルデヒドゲルを通して電気泳動し、nytran膜（Schleicher ＆ Schuell,Keene NH）にブロットし、UV架橋させ、そして32P−標識特異的プローブとハイブリダイズさせた。チロシナーゼcDNAプローブはY.Kawakami（NCI,Bethesda,MD）の好意により提供された。コラゲナーゼIVのためのプローブは、Bluescript SK−2961塩基対）のEcoR I/BamH I部位にサブクローン化された、p16SPT19−１（ヒト72kDa IV型コラゲナーゼcDNA）の305塩基対のPCR挿入物であった。β−アクチンプローブ（Oncor Inc,,Gaithersburg,MD）を試料の等しい負荷を保証するために使用した。
ランダム起点DNA標識キット（Ready−To−Go,Pharmacia P−Ｌ−Biochemicals,UK）を用いてプローブを32P dCTP（NEN）で標識した。（Stratagene,La Jolla,CAによって提供されたQuikhybプロトコルに従って）68℃にて膜を１時間プローブとハイブリダイズさせ、そして15分間、各々室温で２×標準の生理食塩水−クエン酸/0.1×ドデシル硫酸ナトリウムを用いて２回、そして30分間、60℃で0.1×標準生理食塩水−クエン酸/0.1×ドデシル硫酸ナトリウムを用いて１回洗浄した。Kodak XAR5フィルムを用い、増感スクリーンを用いて、−70℃でオートラジオグラフィーを行った。
NaPAおよびNaPBによるメラノーマ細胞増殖の阻害。ヒト・メラノーマ細胞をNaPAまたはNaPBに曝露した結果、３日以上の連続した処置の後に、用量依存性増殖阻止の証拠が得られた（表10）。細胞増殖の減少は、同様に低下したDNA合成がともなったが、細胞の生存率には変化がなかった。NaPAと比較して、NaPBは細胞増殖抑制の誘導で有意においてより活性であり、テストした８つの細胞株のうち７つにおいて、IC50値は、NaPAが2.0〜5.7mMであるのに対し、0.15〜1.0mMの間であった。メラノーマ細胞の不均質な応答を反映し、RPMI細胞はより耐性であり、増殖の50％阻害を引き起こすために8.4mM NaPAまたは1.5mM NaPBを必要とした。しかし、一次正常メラニン細胞は感受性が低く、NaPAおよびNaPBのIC50は各々11.0mMおよび2.8mMであった。フェニルアセチルグルタミン（PAG）（ヒトにおけるNaPBおよびNaPAの最終代謝産物）は10mMも高い用量でさえ腫瘍細胞増殖に対して有意な効果を有していなかった。
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形態学および色素沈着の変化。腫瘍細胞増殖への影響に加え、芳香族脂肪酸が誘導する形態学的変化は、低下した細胞質に対する核の比率、増強された細胞骨格組織化を伴う細胞の平坦化、そして特定の場合には、樹木状プロセスの発達および増大したメラニン形成を含むメラニン細胞分化に合致した。NaPA/NaPBによって誘導された分化の程度は、処置が決定された時点における細胞の表現型に依存して有意に変化した。例えば、無色性上皮様細胞よりなるA375培養においては、樹状細胞が時々出現するような周縁の形態学的変化が誘導されたに過ぎず、その一方、より分化した1011培養では劇的な変化が観察された。NaPB処置の３〜４日以内に、1011細胞は、顕著に増大した、核に対する細胞質比率を伴って拡大して見えた。さらに、この細胞は十分に組織化された細胞骨格（ビメンチンに対する染色によって示される）を有し、長い樹木状プロセスを発達させ、そして高度に黒色となった。分化は進行的で、細胞集団の大多数が関与し、そして連続的処置の２週間後には安定した形質となった（以下を参照）。細胞増殖抑制剤としてのその相対的能力に一致して、NaPBは、1011細胞の末端分化を促進するにおいてNaPAよりも効果的であった。しかし、いずれの薬物も、A375M培養において主要な形態学的変化またはメラニン産生を誘導し得ず、これは、分化に対する内因性の耐性を示唆する。
抗腫瘍効果の可逆性。NaPBで誘導される細胞増殖抑制および分化の安定性は、処置した細胞のみならず薬物への曝露の持続期間にも依存するようであった。1011培養において、1.5mM NaPBを用いた４日目またはそれより長期の処理の後、倍加時間は26±２時間から約110時間に増加した。処置を１週間後に中断した場合、増加時間は67時間に低下した。しかし、持続期間をフェニルブチレートへの14日の連続的曝露に増加した場合、複製速度は処置の中止に際し有意に変化しなかった（96時間毎に細胞は倍増）。これは、薬物の非存在下では増殖を回復する（20〜24時間の倍加時間）A375M細胞とは対照的であった。1.5mM NaPBに14日間曝露した1011mel細胞は106細胞当たり31.1μg/mlメラニンを有していた；処理を中断した３日後、メラニンレベルは39.9μg/mlにさらに増加した。1011細胞における増殖能力、安定な形態学的変化および持続するメラニン形成の喪失は、全て、NaPBによって誘導された末端分化を示す。
侵入性および腫瘍形成性の喪失。悪性メラノーマはインビボでは高度に侵入性かつ転移性である。生物学的に攻撃的な細胞集団は、なおメラニン形成を含む特定の分化マーカーを呈示するので、悪性表現型に対するNaPBおよびNaPAの効果をさらに調査することが重要であった。マトリゲルで被覆されたフィルターを備えた修飾Boydenチャンバーを用い、インビトロ侵入アッセイによって、組織バリアーを分解しかつ横切るA375M、SKMEL28および1011細胞の能力を評価した。芳香族脂肪酸を用いた連続的処置３〜５日の後、侵入能力の用量依存的喪失があった（表11）。表現型逆行のこのインビトロ指標は、インビボにおける腫瘍形成性の喪失と相関していた：培養中でNaPAを用いて１週間処置したA375M細胞は、非処置細胞とは対照的に、無胸腺マウスに皮下移植した場合に腫瘍を形成しなかった（表11）。侵入性および腫瘍形成性のほぼ完全な阻害が5mM NaPA（部分的細胞増殖抑制のみを引き起こす濃度）で観察され、これは、悪性特性が組織培養皿で細胞増殖よりも感受性であり得ることを示す。
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遺伝子発現の調整。腫瘍生物学における大きな変化は、悪性表現型の維持に重要な遺伝子の発現の変化、およびにインビボの免疫原性に影響し得る変化に関連していた。より詳細には、NaPAまたはNaPBのずれかで処置された細胞は、72,000ダルトンのメタロプロテアーゼをコードするコラゲナーゼIV型mRNAのレベルが低下していた。後者は細胞外ストローマおよび基底ラミナ構造の分解に関与し、腫瘍の侵入および転移を容易にする能力を有する。他の腫瘍応答に関しては、遺伝子発現における変化の程度はテストした異なる細胞株間で変化した。
例えば、5mM NaPAは、SKMEL28細胞においてコラゲナーゼIV発現を完全に阻害したが、A375M細胞においては特異的な転写レベルは２倍低下したに過ぎなかった。NaPAおよびNaPBを用いて処理したA375におけるコラゲナーゼIVの低下には、その阻害剤TIMP IIの増加した発現が伴い、これは、正味の蛋白分解活性、および結果として侵入性が芳香族脂肪酸によって有意に減少し得ることを示唆した。
分化マーカーであるメラニンの合成は酵素チロシナーゼによって調節される。NaPBおよびNaPAは共に（程度は異なるが）1011細胞におけるチロシナーゼmRNAの定常状態レベルを増加させ、これは、色素沈着の増大と相関していた。ノーザンブロット分析は、処置細胞はまた、HLA−A3 mRNAの約２倍に上昇したレベルを有していた。結果は、NaPAを用いた処置後の、ヒト白血病および前立腺癌腫細胞におけるMHCクラスＩ抗原発現の増加という先の知見と一致する。
他の抗腫瘍剤の活性の増強。表現型不均質性はメラノーマを持つ患者における腫瘍障害に特徴的である。異種腫瘍塊の治療応答の多様性は、適切な組合せ処置プロトコルを必要とし得る。図19にまとめるデータは、NaPAが臨床目的の他の抗腫瘍剤の効力を有意に増強し得ることを示す。70％を超えるメラノーマ細胞増殖の阻害が、非毒性であるが準最適濃度のIFN−α、全−トランス−RA、スラミンまたは5AzadCと、NaPAとを組み合わせた場合に観察された。
しかし、メラノーマ細胞株を用いた知見は、NaPBが、NaPAと比較して、遺伝子発現および細胞生物学のより強力な調整剤であることを示す。相対的能力は、リンパ腫、神経膠腫、ならびに前立腺、乳房、卵巣、肺および結腸のアデノカルシノーマを含む種々の造血系および固体腫瘍で確認された。後者は、NaPBのより高い親油性に起因し得るか、あるいは作用メカニズムのいくらかの差異に関連し得た。フェニルアセテートに代謝されるに先立って、フェニルブチレートが、治療能力を持つ十分に特徴付けられた分化インデューサーである短鎖脂肪酸ブチレート（butyrate）と同様に作用し得るという可能性がある。しかし、フェニルブチレートとブチレートでは、腫瘍応答にいくつかの差異がある。前者はヒト・メラノーマ細胞でビメンチン組織化を増加させるが、ブチレートはＢ−16メラノーマ細胞でビメンチン発現を減少させることが報告されている（RyanおよびHiggs,1988）。さらに、NaPBとは対照的に、ブチレートはチロシナーゼ活性およびメラノーマ細胞のメラニン化を誘導せず、ある場合には阻害さえする（Jardena Nordenberg,Lina Wasserman,Einat Beery,Doron Aloni,Hagit Malik,Kurt H.Stenzel,Abraham Novogrodsky（1986）：酪酸およびジメチルスルホキシドによるマウス・メラノーマの増殖阻害,Experimental Cell Research 162:77−85）。可能な臨床的意義を持つフェニルブチレートのさらなるユニークな属性は、その延長された半減期（ブチレートが分単位であるのに対し時間単位）、およびフェニルアセテートへの変換、それ自体が細胞増殖抑制的で分化インデューサーであることを含む。尿への排泄前に、フェニルアセテートはまずグルタミンと結合してPAGを形成しなければならない。NaPA関連療法にともなうPAGの尿排泄の高い速度は、有利なことに、血漿グルタミンを涸渇させ（Simell,O.,Sipila,I.,Rajantie,J.,Valle,D.L.,Prusilow,S.W.（1986）：アミノ酸のアシル化を介する廃棄物窒素の排泄；リシン尿症タンパク質不耐性におけるベンゾエートおよびフェニルアセテート、Pediatric Res.20:1117−1121）、腫瘍増殖に重要なアミノ酸を涸渇させる。（Hiroyuki Takahashi,Peter G.Parsons（1990）：分化剤によって誘導されたヒト・メラノーマ細胞のインビトロ表現型変化：細胞増殖および形態、酵素活性、および抗原発現に対する不均質な効果,Pigment Cell Research 3:223−232）。
セクションM:NaPAおよびNaPB−オキシ尿素併用治療
以前の臨床治験より、オキシ尿素が前立腺ガンに対して一定の作用を有することが示されている。オキシ尿素のインビトロ活性を、３つのホルモン治療抵抗性前立腺ガン細胞株、PC−３、DU−145、およびPC−3Mにおいて評価した（MTT法により測定）。オキシ尿素の100μＭ以上の濃度において細胞障害性が認められ、少なくとも120時間以上の薬物に対する曝露を必要とした（100μＭは３つの細胞株全てに対するおおよそのIC50である）。臨床上の薬物動力学的データに基づき、120時間に100μＭを超えるオキシ尿素血漿濃度を生じるように、投薬レジュメをシミュレートした（体重70kgの男性に対して、1gの負荷用量、続いて500mgを６時間毎に５日間）。この血漿濃度では許容できない程度の骨髄抑制を生ずるので、インビトロでの併用研究は、オキシ尿素と新しい分化剤であるフェニルブチレートで実施された。これらの研究により、50％の増殖阻害に必要なオキシ尿素濃度の減少が認められた（50μＭオキシ尿素＋0.5mMフェニル酪酸）。このオキシ尿素濃度を達成するように設計されたレジュメ（400mgの負荷用量、続いて200mgを６時間毎に５日間）は、臨床上達成可能でなければならない。この併用は、Ｄ期の前立腺ガンの患者の治療における使用についてさらに評価された。
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参考例5:オキシ尿素と併用したNaPA−PC−３細胞およびDU−145細胞
２つのヒト前立腺細胞株（PC−３およびDU−145）をAmerican Type Culture Collection,Rockville,MDより入手した。PC−3Mは、the University of WisconsinのJames Kozlowski,M.D.より、Frederick,MDのNCI Cancer Treatment Screening Programを介して入手した。オキシ尿素は、Sigma Chemical Co.,St.Louis,MOから購入した。フェニルブチレートは、Elan Pharmaceutical Research Corporation（Gainesville,GA）から入手した、細胞培養培地は、10％の熱不活性化ウシ退治血清液（FBS）、ペニシリン5,000単位/mL、ストレプトマイシン5,000μg/mL、および2mM L−グルタミン（Gibco Laboratories,Grand Island,NY）を補充したRPMI 1640を使用した。
前立腺癌腫細胞株を、10％FBSと１％抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン）とで補充されたRPMI−1640で増殖させた。細胞を、80％集密度の単一層（６×105細胞/cm2）に増殖させ、75cm2のフラスコ（Nunc,Denmark）内に培養した。細胞を、トリプシン（0.05％）EDTA（0.02％）（Gibco Laboratories,Grand Island,NY）溶液で回収し、血球計で計数した。細胞は、その後96ウェルマイクロタイタープレート（CoStar,Cambridge,MA）に、１ウェル当たり3,000細胞の密度で、10％FBSと１％ペニシリン−ストレプトマイシン溶液とを補充したRPMI 1640培地内に接種し、細胞の再付着が行われるように24時間再インキュベートした（37℃、５％CO2雰囲気）。次いで、最終ウェルの容量が200μＬとなるように組織培養培地内に希釈したオキシ尿素を所定の濃度（0.01、0.1、１、10、100、1,000、10,000、および100,000μＭ）で加え、組織培養インキュベーター内に120時間静置した。コントロール細胞を等容量の培地内に増殖させた。３−（4,4−ジメチル−２−チアゾリル）−2,5−ジ−フェニル−2H−テトラゾリウムブロミド（MTT,Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO）アッセイを使用し、細胞数を算出した（Beckloff GL,Lerner HJ,Frost Dら、生物学的流体中のオキシ尿素（NSC−32065）：用量−濃度の関係。Cancer Chemother Rep 1965;48:57−８）。オキシ尿素に曝した後、MTT（20μＬ、PBS中5mg/mL）をウェルに加え４時間インキュベートし、2,000gにて遠心分離し、そして培地をデカントした。ジメチルスルホキシド（150μＬ）を各ウェルに加え、プレートを30秒間振盪し、カイネティックマイクロプレートリーダー（Bio−Tek EC340イムノプレート−リーダー）で540nmでの光学的密度を測定した。
相乗活性効果の研究を、PC−３細胞を使用し、0.5mMおよび1mMのフェニルブチレートを50μＭおよび100μＭのオキシ尿素に加えることによって行った。上記のように、同様のインビトロ条件および薬物への曝露持続時間を利用した。細胞数は、血球計によって計数した。
SASコンピュータプログラム（バージョン6.02、SAS Institute,Inc.,Cary,NC）を使用し、統計解析を行った。対コントロールのオキシ尿素の様々な濃度の平均光学密度を、修正両側Wilcoxon順位和検定（adjusted two−sided Wilcoxon rank−sum test）によって比較した。0.05のαを用いて、統計的誤差を検出した。オキシ尿素の用量と細胞生存との間の関係を測定するために、PC−３実験をPC−３細胞株について５回行い、DU−145とPC−3Mとの両方について３回行った。そこで行われた各実験では、６つのウェルは濃縮物であった。最適持続時間を測定する実験を、１回につき、１つの一定濃度で、12個のウェルを使用して行った（両方の方法において５枚のプレート）。
３つの細胞株全てにおいて、10から1,000μＭの濃度のオキシ尿素で、用量に依存する細胞生存率の低下があった。100μＭの濃度では、非処置の細胞と比較して、３つの細胞株全てにおいて細胞生存率の約50％の低下PC−３では42.7％、DU−145では45.5％、PC−3Mでは52％）があった（（ｐ＝0.016）。1,000μＭを超えてオキシ尿素濃度が増加すると、細胞増殖の阻害に対するさらなる効果はほとんど発揮されない。100μＭ未満の濃度では、オキシ尿素は細胞増殖抑制性を示すのみであるが、100μＭ未満の範囲で濃度が増加するに従って細胞障害性も増加し、トリパンブルー染色（Gibco Laboratories,Grand Island,NY）で測定したところ、100μＭでは全細胞の86％が、1,000μＭでは41.9％が生存可能であった。
オキシ尿素曝露の持続時間と細胞増殖の阻害との間の関係を調べるために、PC−３を使った追加実験を２つ行った。第１の実験では、オキシ尿素の４つの異なる濃度（0.1、1.0、10、および100μＭ）において、細胞生存を24時間から120時間の曝露の間に連日評価した；オキシ尿素曝露の所定の持続時間の終了直後にMTTアッセイを行った。第２の実験では、細胞を同じ濃度のオキシ尿素に種々の期間（24、48、72,96、および120時間）曝すが、MTTアッセイを行う前に合計120時間の間増殖させた。薬物含有培地を薬物を含まない培地と取り替えることにより、薬物曝露をいろいろな間隔で終了させた。後者の実験は、短期間の薬物曝露後の細胞増殖の回復の可能性を検出するために行われた。図20は、PC−３細胞における、オキシ尿素（100μＭ）の薬物曝露持続時間対生存率曲線を示す。細胞は種々の期間薬物に曝されたが、全細胞とも合計で５日間（120時間）増殖された。薬物曝露は、薬物含有培地を薬物を含まない培地で取り替えることにより、種々の間隔で終了させた。この実験では、短期間の薬物曝露後の細胞生存能のいかなる回復も検出されなかった。120時間の曝露の後、IC50のみが達成された。両方の実験において、曝露の持続時間が増加するに従って細胞生存率の低下があった。120時間の効果におけるプラトーの証拠は認められず、薬物ウォッシュアウト後の細胞増殖の復活も認められなかった。
オキシ尿素の濃度が増加するのに伴い、PC−３細胞の形態に著しい変化があった。特に、100μＭのオキシ尿素濃度に曝した場合、コントロールの細胞と比較して、PC−３細胞株にはかなりの程度の細胞選択性があったことが明らかである。PC−３細胞は異しゅせい（heterogenous）であり、そしてオキシ尿素は核／細胞質比率の低い細胞（すなわち、巨大偏平細胞）を選択し得る。
ヒトにおけるオキシ尿素の性質を説明するのに使用される薬物動力学的モデルおよびモデルパラメータは、以前より報告されている本薬の臨床治験からの濃度対時間データから誘導された（Beckloff GL,Lerner HJ,Frost Dら、生物学的流体中のオキシ尿素（NSC−32065）：用量−濃度の関係。Cancer Chemother Rep 1965;48:57−8;Veale D.Cantwell BMJ,Kerr N.ら、肺ガンにおける高用量オキシ尿素の第Ｉ相治験。Cancer Chemother Pharmacol 1988;21:53−6;Adamson RH,Ague SL,Hess SMら、オキシ尿素−C14の分布、排泄および代謝。J.PharmacolおよびExp Therapeut 1969;150:322−7;Belt RJ,Haas CD,Kennedy Jら、連続点滴によるオキシ尿素投与の研究。Cancer 1980;46:455−62;Rosner F,Rubin H,Parise F.オキシ尿素（NSC−32065）の吸収、分布、および排泄。Cancer Chemother Rep 1971;55:167−73;Creasey WA,Capizzi RL,DeConti RC.オキシ尿素（NSC−32065）による固形腫瘍の高用量断続的療法の臨床および生化学的研究。Cancer Chemother Rep 1970;54:191−4;Bolton BH,Woods LA,Kaung,DTら、オキシ尿素（NSC−32065）の簡便比色定量分析法。Cancer Chemother Rep 1965;46:1−5;Davidson JD,Winter TS.生物学的流体中のオキシ尿素の分析法。Cancer Chemother Rep 1963;27:97−110）。オキシ尿素の単回経口容量（80mg/kg）後の濃度対時間データに適用されたカーブストリッピング（curve−stripping）技術（AbbottbaseTM薬物動態システム、ver.1.0）では、これらのデータは単一の指数的崩壊によって最も良く記述され、オキシ尿素の薬物動態の予測に単一コンパートメントオープン線形モデル（single compartment open linear model）を用いること可能とした。オキシ尿素のバイオアベイラビリティは正確に測定されていないが、「完全」であると報告されており（Donehower RC.オキシ尿素。:Chabner Ba,Collins JM,編、Cancer Chemotherapy,Principles and Practice,Philadelphia:JB Lippincott 1990:225−33）、従って、バイオアベイラビリティを100％とした。オキシ尿素の全身クリアランスの推定値は、台形則を使用して得られた。このモデルから誘導された平均パラメータ値（分布容積、半減期、およびクリアランス）を使用して、Lenerらにより使用されたオキシ尿素の投薬レジュメ（３日毎に80mg/kg）がシミュレートされた。このレジュメは、インビトロでの抗増殖活性を有するオキシ尿素濃度へのごくわずかの短期間の曝露を提供する。体重70kgの男性で1.0gの負荷用量および続いて500mgを６時間毎に５日間のレジュメ；このレジュメは、インビトロで前立腺ガン細胞の増殖の50％阻害に必要な条件に近似する。
100μＭ以上のオキシ尿素血漿濃度は、患者によっては、受け入れられない程度の骨髄抑制を引き起こし得るため、オキシ尿素の効力を増すフェニルブチレートの性能を調べた。50μＭの準最適濃度で、オキシ尿素を、濃度0.5mMおよび1mMでフェニルブチレートと組み合わせた。0.5mMのフェニルブチレートを50μＭのオキシ尿素に添加すると、PC−３細胞の増殖が58％減少した。単独療法としては、オキシ尿素（50μＭ）は、細胞増殖を38％しか減少せず、フェニルブチレートは0.5mMと1mMとにおいて各々細胞増殖を38％および55％減少した。50μＭのオキシ尿素を1mMのフェニルブチレートと組み合わせたとき、細胞の生存率に影響を与えることなくPC−３の増殖が約80％阻止されることが観察された。
結論として上記の結果は、細胞障害性の細胞死には、単一薬剤として、先の臨床実験で達成されたよりも遥かに強くオキシ尿素（即ち、100μＭ以上で少なくとも120時間）に曝すことが必要であるということを示している。このような濃度を達成するために設計されたレジメンは、受け入れられない副作用を引き起こす結果になる可能性が高い。しかし、フェニルブチレートと組み合わせたオキシ尿素は、ホルモン無反応性の転移性前立腺ガン患者において、臨床的役割を有する。この組み合わせレジメンは、比較的低用量のオキシ尿素（400mgの負荷用量、次いで５日間６時間毎に200mg）を必要とし、50μＭおよびより低い濃度のフェニルブチレートを生成する。用いられるオキシ尿素の用量は、好中球のおだやかな減少を引き起こし得るが、この減少は臨床的には許容されるべきである。フェニルブチレートに関連する悪影響は、オキシ尿素に関連する骨髄抑制に対して付加的（すなわち、CNS抑制）であるべきではない。これらの結果に基づいて、この組み合わせは、Ｄ段階の前立腺ガン患者において更に評価する価値がある。
セクションN:髄芽細胞腫および星状細胞腫由来細胞に対するNaPAおよびNaPBの影響
髄芽細胞腫および他の悪性脳腫瘍は、細胞形態学、抗原表現型、および生化学的特徴に関して不均質である。一部の細胞はより分化した表現型を発現する。細胞の悪性形質転換は、増殖の停止を含む分化した特性の発現のそれらの能力を必ずしもなくさない（Sartorelli,AC:可能性のある治療アプローチとしての悪性細胞分化、Br.J.Cancer 52:293−302,1985;Marks PA,Sheffery M,Rifkind RA:形質転換された細胞の末端分化への誘導および遺伝子発現の調整、Cancer Res.47:659−666,1987）。髄芽細胞腫の、非増殖的状態への自発的分化が時として起こる（DeChadarevian J−P,Montes JL,Govman AM,Freman CR:脳神経芽細胞腫の、黒色症を有する神経節細胞腫への成熟、Cancer 59:69−76,1987）。このことは、神経外胚葉は、有効信号に対して分化が可能であり得ることを示す。これらの生物学的特徴および十分に有効な治療戦略が現在欠如していることにより、これらの腫瘍に分化を誘導する薬剤が特に興味深い。
分化薬剤が応答性の細胞株の成長および表現型特性に影響を与えるメカニズムは広く研究されており、これらの作用は完全に理解されてはいないが、全トランスレチノイン酸（ATRA）のような薬剤がオートクリン成長制御経路と相互作用するということが実質的な証拠により示されている（Falk LA,DeBenedetti F,Lohrey Nら：レチノイン酸処置HL−60細胞におけるTGFβ１レセプター発現の誘導およびTGFβ１タンパク質産生、Blood 77:1248−1255,1991）。様々な成長因子分子およびそのレセプターが、ATRAのような分化薬剤に曝されることにより影響を受ける。多くの腫瘍細胞株および非腫瘍細胞型において、ATRAは１以上のTGFβのイソ型の産生および分泌を誘導する（Falk LA,DeBenedetti F,Lohrey Nら：レチノイン酸処置HL−60細胞におけるTGFβ１レセプター発現の誘導およびTGFβ１タンパク質産生、Blood 77:1248−1255,1991）。
TGFβオートクリン増殖調節経路は、原発性中枢神経系腫瘍において特に興味がもたれる。この多能性成長レギュレーターは、原発性悪性星状細胞腫組織（Clark WC,Bressler J:中枢神経系の腫瘍におけるTGFβ様活性、J Neurosurg 68:920−924,1988;Samuels V,Barett JM,Brochman Sら：良性および悪性神経膠腫によるトランスフォーミング成長因子発現の免疫細胞化学的研究、Am J Pathol 134:895−902,1989）と、このような腫瘍から誘導される細胞株（Jennings MT,Macina RJ,Carver Rら:TGFβ１およびTGFβ２はオートクリン仮説を支持する証拠により、インビトロにおける低グレード且つ悪性の神経膠腫に対するレギュレーターとして用いられる可能性がある、Int.J.Cancer 49:129−139,1991）との両方によって生成される。インビトロで同時培養されたリンパ球に対する悪性星状細胞腫の免疫抑制影響は納得できるほどTGFβ産生に関連づけられ、そしてTGFβに対する抗体により部分的に中和され得る。TGFβは、インビトロにおいて神経膠腫に対する成長レギュレーターであることが示されている（Jennings MT,Macina RJ,Carver Rら:TGFβ１およびTGFβ２はオートクリン仮説を支持する証拠により、インビトロにおける低グレード且つ悪性の神経膠腫に対する成長レギュレーターとして用いられる可能性がある、Int.J.Cancer 49:129−139,1991）。髄芽細胞腫の成長調節におけるTGFβ経路の役割は、悪性星状細胞腫に対するほどは確立されていない。Daoy髄芽細胞腫細胞に対するATRAの抗増殖的影響は、TGFβ２の増大した分泌とTGFβレセプター発現の誘導とに関連している。成長因子のTGFβファミリーは悪性星状細胞腫の生物学においてそのような重要な役割を果たすため、このオートクリン経路としての可能性にまず焦点が当てられている。
神経外胚葉腫瘍由来型細胞株に対する、非毒性分化インデューサーであるフェニルアセテート（PA）の影響を調べた。髄芽細胞腫（Daoy,D283）および神経膠腫（U251,C6,RG2）細胞株を処理した結果、DNA合成および細胞増殖が用量に依存して減少した。ID50値は、6.3〜14.6mMの範囲にあった。PAは、髄芽細胞腫Daoy細胞によるTGFβ２の産生を増加したが、TFGβ２またはTGFβ１のいずれかに対する抗体を中和したことにより、観察された成長の停止を遮断することはできなかった。このことは、レチノイン酸のような他の分化薬剤とは異なり、TGFβ経路はPAの抗増殖効果の媒体としては用いられないということを示唆している。細胞増殖抑制に加えて、PAは増加した大量のGFAP−ポジティブプロセスに関連するU251およびC6神経膠腫における顕著な形態変化を誘導した。PA処置髄芽細胞腫細胞の形態は有意には変化しなかったが、D283細胞は、ニューロフィラメントタンパク質およびHu抗原の増大した発現を示した。このことは、神経経路に沿った分化を示す。髄芽細胞腫細胞株に対するPAの影響を、よく確立されたヒト神経芽細胞腫分化モデルBE（２）Ｃに対するPAの影響と比較した。BE（２）Ｃは、神経および神経膠／シュワン細胞経路に向かって両方向に分化し得る。BE（２）Ｃ細胞において、PAはシュワン／神経膠細胞様表現型に向かう分化を誘導し、このことは、分化経路の選択が細胞型および薬剤に対して特異的であるということを示唆している。
実施例6:星状細胞腫細胞に対するNaPAの効力
細胞培養技術。ヒト神経膠腫（U251）、ラット神経膠腫（C6,RG2）、ヒト髄芽細胞腫（Daoy,D283）、ヒト神経芽細胞腫（BE（２）Ｃ）（全てATCCより）、およびマウス肺繊維芽細胞株MuLv1（Dr.S.Cheifietzにより提供）を、10％のウシ胎児血清（FCS）、非必須アミノ酸（NEAA）、Ｌグルタミン（2mM）、ペニシリン（100U/mL）、およびストレプトマイシン（100ug/ml）（培地の全成分は、Gibco,Grand Island,NY,USAより購入した）で補足したEagles最小必須培地（MEM）（GIBCO）で日常的に維持した。接着性細胞株を、Ｔ−150組織培養フラスコ（Becton−Dickenson）中にプレートし、集密度が70％のときにトリプシン化を用いて通過させた。懸濁液中で増殖する細胞株（D283）を細胞密度105〜106細胞/mlで維持した。湿潤５％CO2インキュベータ内で37℃で細胞を成長させた。グルタミン枯渇実験のために、U251細胞を血清およびグルタミンを含有しないUltraculture培地（Hyclone）に適合させた。外因性TGFβ１およびTGFβ２による増殖実験ならびにTGFβに対する中和抗体の実験のために、0.2％FCSを含有するMEM中でDaoy細胞を増殖させ、そして血清を含有しないUltraculture培地（Hyclone）中でU251細胞を培養した。
細胞株のPAおよびATRA処理。MEM中にフェニルアセテート（Sigma）を溶解して100mMストック溶液を生成し、そしてNaOHでpHを7.2に調整した。その後、10％の熱不活性化FCSをMEMに補足した。全トランスレチノイン酸（ATRA）をエタノール中で溶解して10-3Mストック溶液を調製し、そして培地に添加することにより、10-7〜10-6Mの範囲の最終濃度とした。
細胞増殖アッセイ。増殖実験には、対数増殖期の腫瘍細胞を採取し、そして濃度20,000細胞/mlで再懸濁した。100μl/ウェルの細胞懸濁液を、96ウェルマイクロタイタープレート（Costar）にプレートした。24時間後、細胞を、同量のPAの系列希釈液とインキューベートして５〜20mM PAの範囲の最終濃度を得た。10％FCSを含有するMEMを、コントロールとして用いた。3H−チミジン取り込みにより、24時間間隔で細胞増殖を測定した。各ウェルに3H−チミジン（Amercham）を１μCi添加し、そしてマイクロタイタープレートを37℃で４時間インキュベートした。その後、半自動化細胞採取器（Cambridge Biotechnologies）を用いて細胞をグラスファイバーフィルター上に添加し、液体シンチレーションカウンター（Hewlett Packard）を用いて3H−チミジン活性を定量した。全実験を４回行った。
外因性TGFβの影響。Daoy細胞に対する外因性TGFβの影響を測定するために、0.5pM〜1nMの範囲の濃度で組み換えヒトTGFβ１およびTGFβ２（Ｒ＆D Systems）を、同様に調製したマイクロタイタープレートに24時間の間添加した後、3H−チミジン取り込み量を判定した。
抗ヒトTGFβ１およびTGFβ２抗体を用いた中和研究。ヒトTGFβ１およびTGFβ２（Ｒ＆D Systems）に対するポリクローナル抗体を、0.2％FCS中で増殖したDaoy細胞、または10mMのPAに曝された血清を含有しない培地（Ultraculture,Hyclone）中で増殖したU251中と、濃度10〜40μg/mlで同時インキュベートした。上記のように、3H−チミジン取り込みにより増殖を測定した。
ウォッシュアウト研究。ウェルあたり250個の細胞を用いること以外は、上記の増殖実験と同様にして細胞を播種した。PAで処理してから２日目に、様々な濃度の薬剤を含む培地を通常の培養培地に置き換え、４、８、24、24、および72時間後に3H−チミジンの取込量を定量した。
免疫細胞化学。細胞培養について前記したのと同様の条件下で、接着性細胞株を、Lab−Tek8チャンバスライド（Nunc）上で成長させた。24時間後、細胞をPA20、10あるいは5mMで４から７日間処理した。冷アセトン内で固定した後、Hsuおよび共同研究者のアジビンビオチンペルオキシダーゼ複合法（Hus SM、Raine LおよびFanger H:アビジンビオチンペルオキシダーゼ技術の使用:ABC手順と非標識抗体（PAP）手順との比較、J.Histochem Cytochem 29:577−580、1981）を用いて免疫反応を決定した。非接着性細胞株については、Cytospin II（Shandon）を用いて細胞遠心分離調製を行い、そして実質的に上記のように固定した。
GFAP（クローンＧ−Ａ−５）、NFトリプレットタンパク質（68kD（クローンNR4）、160kD（クローンBF10）および200kD（クローンRT97））、シナプトフィシン（クローンSY38）あるいはビメンチン（クローンV9）に対して特異的なマウスmAbsを、Boehringer−Mannheimから購入した。抗TGFα（クローン213−4.4）およびEGFレセプター（クローン）抗体を、Oncogene Scienceから得た。抗HLAクラスＩ（クローン）およびII（クローンL243）mAbsを、Becton−Dickensonから購入した。関連のないマウス抗体（MOPC−21、Sigma）は、ネガティブコントロールとして用いた。抗Hu IgG（Dr.J.B.Posnerが提供）を、高力価抗Hu血清から調製し、既報の（Szabo A、Dalmau J、Manley G、Rosenfeld M、Wong E、Henson J、Posner JB、Furneaux H:パラネオプラスチック脳脊髄炎抗原のHuDはRNA結合ドメインを含み、そしてElavおよびSex−lethalと相同である。Cell 67:325−333、1991）ビオチンに結合させた。ヒト脳の凍結部（７μｍ厚）をポジティブコントロールとして用いた。正常な個体からのビオチン化IgGによるインキュベーションを、ネガティブコントロール用いた。
ウェスタンブロッティング。腫瘍細胞を、0.5％NP−40およびプロテイナーゼインヒビター（フェニルメチルスルホニルフッ化物、ペプスタチン、ロイペプチン、大豆トリプシンインヒビター、アプロチニンおよびベンザミジン）を含む50mM Tris−HCl、pH7.2に溶解させた。タンパク質抽出物の等量のアリコート（15から30μｇ）を、変性条件下で８あるいは10％SDS−PAGEゲル中で電気泳動させた。次いで、ゲルから0.2μｍの細孔サイズのニトローセルロース上にタンパク質をエレクトロブロッティング（Hoeffler Transblot system）した。ブロットを５％ミルク中で２時間ブロッキングし、一次抗体（マウスあるいはヒト血清中のmAb）で１時間インキュベートし、そして適切な種の一次抗体に対するHRP結合ヒツジ抗IgG（Amersham）および化学発光技術（Amersham）を用いて検出した。
Huのウエスタン分析について、抗Hu症候群の患者の高力価血清を用い、そして健康な個体からの血清をネガティブコントロールとして用いた。
細胞周期分析。細胞周期の研究について、血清含有培地の入ったＴ−150培養フラスコで、Daoy細胞を平板培養した。24時間のインキュベーション後、培養培地を血清を含有しない培地（Ultraculture、Hyclone）に24時間置き換え、細胞培養を同調させた。次いで、PA 10mM含有培地あるいはプレーンな血清含有培地を培養物に再び与えた。48時間後に細胞を収集し、アクリジンオレンジで染色し、FAC−Scan（Becton−Dickenson）で分析した。
HuD発現のRT−PCRアッセイ。腫瘍細胞株からの総RNA（１μｇ）を、1mMの各dNTP、1U/μl RNaseインヒビターおよび2.5U/μl MMLV−RT（Gibco）を含有する20μｌの反応容積において、ランダムヘキサマー（2.5μＭ）を用いて37℃で50分間逆転写した。逆転写反応を、99℃で５分間のインキュベーションによって終結させた。RT反応生成物の20分の１を、PCR増幅に用いた。１×PCR緩衝液（50mM Tris pH9.5、1.5mM MgCl2、20mM硫酸アンモニウム）、0.2mMの各dNTP、５μCiの（32P）dCTP、HuDおよびβ２−ミクログロブリンに対する上流プライマーおよび下流プライマー（CCAGGCCCTGCTCTCCC、AGGCTTGTCATTCCATC）各0.5μＭずつ、およびTagポリメラーゼ（Perkin−Elmer Cetus）1U中で、PCRを行った。PCR分析を、以下の温度プロフィールでPerkin−Elmer Cetus DNAサイクラーにおいて行った。90℃で１分間、55℃で30秒、72℃で１分間、92℃で１分間を35サイクル、55℃で２分間および72℃で10分間。PCR生成物の10分の１を、６％アクリルアミドゲル中で電気泳動させ、PCR生成物をオートラジオグラフィーで分析した。
TGFβバイオアッセイ。Ｔ−150培養フラスコ中でPA10mMが存在する状態でDaoy細胞をインキュベートすることによって、馴化培地を産生した。培養培地を吸引し、Amicon遠心分離濃縮機を用いて終体積200μｌまで20倍に濃縮した。濃縮された培地を、シリコン処理ポリプロピレンマイクロヒュージチューブ（Danville Scientific）に移し、そしてプロテアーゼインヒビター（上記のものと同一）を添加した。潜在TGFβを活性化させるために、酢酸を用いてサンプルを酸性化し、次いでアッセイの前に5N NaOHで中和した。
MuLvl細胞を、スクレーピングフラスコに収集し、血清を含有しないMEMで洗浄し、MEM＋0.2％FCS中で再懸濁し、そして50μｌアリコートの１ウエルについて2000細胞の細胞密度で、96ウエルマイクロタイタープレートに播種した。プレートを４時間インキュベートした後、TGFβ産生について試験される細胞株からの馴化培地150μｌを、ウエル毎に添加した。プレートを24時間インキュベートし、そして次に細胞増殖を、上記のように3H−チミジン取り込みによって測定した。TGFβ濃度と3H−チミジン導入速度に関連の標準曲線を、0.1pMから10nMまでのヒト組換えTGFβ１（Ｒ＆D systems）を用いて得た。
TGFβ２についてのElisa。Amicon濃縮機を用いて、馴化培地を終容量200μｌまで20倍に濃縮した。すべての濃縮工程は４℃で行った。プロテアーゼインヒビター（ウエスタン分析について記載したものと同一）を、−70℃で保存する前に濃縮されたサンプルに添加した。サンプルに終濃度の1M酢酸になるように氷酢酸を添加することによって潜在TGFβを活性化した。次いで、Speed−Vacを用いてサンプルを乾燥するまで蒸発させ、200μｌの蒸留水に再溶解した。再構成／乾燥工程を、全部で３回の洗浄について繰り返した。次いで、キットに備えられているサンプル処理緩衝液RD5B中でサンプルを再溶解し、そして製造者の指示に従って収集ELISA実験が行われた。すべてのデータポイントは、２回行われる。Bio−RAD Microplate読み取り装置およびBiorad Elisamaticソフトウエアを用いて450nmでの吸光度を測定することによって、比色反応を定量した。タンパク質標準としてヒト組換えTGFμ２を用いて標準曲線を得た。
細胞成長および細胞周期へのPAの影響。48時間から96時間後に最大効果が得られるPA（図21）によるインキュベーション後、６つすべての細胞株は、用量依存成長阻害を示した。耐ATRAであることが以前に報告されているヒト悪性神経膠腫細胞株U251（Yung WKA、Lotan R、Lee P、Lotan D、Steck PA:ヒト神経膠腫細胞中のレチノイン酸による、成長および表皮成長因子レセプター活性の調節。Cancer Res 49:1014−1019、1989）も、PAに応答した。ヒト腫瘍細胞株およびラット神経膠腫細胞株C6はPAのID50値が5.8と9.5mMとの間を示し、一方ラット神経膠腫細胞株RG2は、ID5014.6mM（表12）で感受性が低いように思われる。トリパンブルー排除は、PA処理細胞培養の90％を超える生存度を示した。PAを48時間後に除去すると、研究された３つの細胞株（Daoy、U251およびC6）において明確な洗い流し効果が示された．
Figure 0003628694
２日間10mM PAで処理されたDaoy細胞の細胞周期分析は、ＳおよびG2/Mにおける細胞の比率をに減少量と等量に、G0/G1における細胞の蓄積を示した。処理の前は、Daoy細胞の34.2％がG0/G1相で、55.5％がＳ相でおよび10.3％がG2/M相であった。PAによる処理後、51.9％がG1相で、39.9％がＳ相で、8.2％がG2/M相であった。
神経膠腫細胞株の形態および表現型へのPAの影響。PAは、顕著な形態学的変化をU251細胞に誘導した。細胞を、10mM（ｂ）、20mM（ｃ）PAを含むMEM＋10％FCS中あるいは培地のみ（１）において96時間成長させ、そして次いで、培地を除去し、細胞を冷アセトン中で10分間固定した。次いで、細胞をビメンチンに対するマウスmAbあるいは無関係のアイソタイプ一致コントロールマウスmAbでインキュベートし、そしてアビジンビオチンペルオキシダーゼ法を用いて免疫反応性を検出した。処理の前に、スピンドルによる二極GFAP能動プロセスによって細胞を特徴づけた。４日間のPA処理後、細胞質プロセスは広範囲にわたり、複雑になった。細胞体の拡大および肥厚星条膠細胞に似た細胞プロセスの放射星状配列の生産に伴って、細胞質／核の比率は大幅に増加した。これらの形態学的変化の程度は、用量に関連している。同様の効果が、C6ラット神経膠腫細胞において見られる。10mM PAを含むMEM＋10％FCSあるいは培地のみで細胞を96時間成長させ、そして次いで、培地を除去し、そして細胞を冷アセトン中で10分間固定した。次いで、細胞をGFAPに対するマウスmAbあるいは無関係のアイソタイプ適合コントロールマウスmAbでインキュベートし、そしてアビジンビオチンペルオキシダーゼ法を用いて免疫反応性を検出した。処理（ａ）の前には、希な細胞のみが周辺核細胞質の狭幅の外皮においてGFAP反応を示し、PA処理（96時間、10mM）によって顕著なGFAP反応プロセスを有する細胞が現れた。処理されていない細胞の大部分はGFAPに対してネガティブであり、数個のポジティブな細胞中では、免疫反応が核周辺の領域に集中した。両方の細胞株におけるGFAP発現についてのウエスタン分析は、PAにさらした後に明確な量的変化を示すことができなかったが、GFAPについて染色する細胞の画分は増加し、繊維状免疫反応は細胞プロセスにおいて現れる。処理されていないU251細胞は、ビメンチン、EGFr、TGFαおよびELAクラスＩ抗原も発現した。これらの細胞マーカーのいずれも、PA処理によって修飾されなかった。PA処理を中断して４日後、U251細胞のすべての形態学的変化は３日から５日のうちに処理前の状態に戻った。
髄芽腫細胞株の分化状態に対するPAの効果。髄芽腫細胞株DaoyおよびD283の短期間培養において、PAによる増殖阻害は全体の形態学的変化を伴わなかった。Daoy細胞は、クラスＩおよびクラスIIのHLA免疫反応性の両方を発現した。これらの表現型のマーカーは、PA（10mM）処理後も変化がないままであった。２つの細胞株のいずれも、PAでの処理前または処理後にシナプトフィジン（synaptophysin）およびGFAPを発現しなかった。未処理のDaoy細胞は、EGFγおよびTGFαに対して反応性があった:EGFγおよびEGFαに対する免疫組織化学的染色は、PA処理によって影響されなかった。
Huの発現は、ニワトリの末梢神経系におけるニューロンの表現型の最も初期のマーカーの１つであり（Marusitchを参照のこと）、そしてマウスの発育中の中枢神経系におけるニューロンの表現系の最も初期のマーカーの１つである。ヒトの正常組織および腫瘍組織におけるHuの発現のこれまでの研究は、Hu抗原が、神経系、小細胞肺癌腫瘍および神経芽腫に高度に限定されていることを示した（Dalmau J、Furneaux HM、Cordon−Cardo C、Posner JB:ヒトの正常組織および腫瘍組織におけるHu（パラ新生物形成（paraneoplastic）の脳脊髄炎／知覚神経障害）抗原の発現:Am J Pathol 141:881−886、1992）。ビオチニル化抗Hu抗血清を用いる免疫細胞化学は、D283およびBE（２）Ｃ細胞におけるHu抗原の発現を示したが、Daoy細胞およびすべての神経膠腫細胞株はネガティブであった。免疫染色の結果は、ウェスタン分析およびRT−PCRによって確認された。
ウェスタン分析に対しては、0.5％NP−40を含有する50mM Tris緩衝液に細胞を溶解し、そして２−メルカプトエタノールの存在下で７分間油浸した。１レーン当たり20μｇのタンパク質をのせて、10％SDS−PAGEゲル上でタンパク質を分離した。エレクトロブロッティングにより、タンパク質は、ゲルからニトロセルロースに移動した。このブロットを、高力価の抗Hu抗体を有するヒト血清または正常ドナー由来の血清を曝すことによって、免疫反応性を測定し、次いでHRP複合化ヒツジ−抗ヒトIgGでインキュベートした。次いで、増感化学ルミネセンスシステム（Amersham）を用いて、ブロットのオートラジオグラフィーを行った。Hu融合タンパク質および皮質ニューロンのタンパク質抽出物は、ポジティブコントロールとして働き、そして正常なヒト血清は、ネガティブコントロールとして働いた。RT−PCR分析に対しては、腫瘍細胞株からの全RNAのうち１μｇをランダムヘキサマーで逆転写し、そしてHuDおよびβ２−ミクログロブリン特異性プライマーとのPCR増幅のために、RT反応生成物の20分の１を用いた。PCR生成物を６％アクリルアミドゲルで電気泳動し、そしてオートラジオグラフィーにより分析した。
Hu抗原は、変性SDS−PAGEゲルのブロット上に35〜40kDaの分子量を有するバンドとして検出可能であった。
免疫細胞化学的に測定すると、Daoy細胞はNFに対してネガティブであったが、D283細胞は３つのNFタンパク質の全てを発現した。免疫細胞化学により、PAによる処理後、NF−ＭおよびHu発現に対して量的変化が見られた。PA（10mM）に７日間曝した後、NF−ＭおよびHu免疫反応性が増大した。未処理のD283細胞およびPAで処理されたD283細胞のホモジネートのウェスタン分析により、NF−ＭおよびHuタンパク質発現におけるこれらの量的変化が確認された。未処理のD283細胞およびPA（10mM、7d）で処理されたD283細胞のHuおよびNF−Ｍ発現に対して、ウェスタン分析を行った。ここでは、これらのD283細胞を0.5％NP−40を含有する50mM Tris中で溶解し、10％SDS−PAGEゲルを通して電気泳動によって変性条件下で分離し、そしてエレクトロブロッティングによってニトロセルロース紙に移動させた。高力価のHu抗体およびマウス抗NF−Ｍをそれぞれ含有するヒト血清ならびに増感化学ルミネセンス技術（Amersham）を用いて、特異的免疫反応性を測定した。無関係のmAbと適合する正常なヒト血清または適切なイソタイプが、コントロールとして働いた。NF−Ｌに対する免疫染色は、PA処理後に、同様ではあるがあまりはっきりしない変化を示し、そしてNF−Ｈは変化しないままであった。
ヒト神経芽腫の分化モデルBE（２）Ｃに対するPAの効果。髄芽腫細胞株に対するPAの効果をヒト神経芽腫細胞株BE（２）Ｃ（これは、ニューロン細胞および神経膠／シュヴァン（schwann）細胞の分化に対して定評のある両能性分化モデルの代表である）と比較し、この効果は、ニューロンおよびDUdR、神経膠／シュヴァン細胞表現型を誘導するATRAでの、NFタンパク質、Huおよびビメンチン（Vimentin）などの表現型マーカーの変化によって示される（Biedler JL、Casals D、Chang T、Meyers MB、Spengler BA、Ross RA:多剤耐性のヒト神経芽腫細胞は、コントロールよりもさらに分化し、そしてレチノイン酸は、系統特異的分化をさらに誘導する。Advances in Neuroblastoma Research 3:181−191、1991、Wiley−Liss,Inc.;Ross RA、Bossart E、Spengler BA、Biedler JL:分化誘導薬剤による処理後の形態学的中間（Ｉ−タイプ）ヒト神経芽腫細胞の多能性。Advances in Neuroblastoma Research 3:193−201、1991、Wiley−Liss,Inc.;Ciccarone V、Spengler BA、Meyers MB、Biedler JL、Ross RA:ヒト神経芽腫細胞における表現型の多様性：神経堤系統の発現。Cancer Res 49:219−225、1989;Ross Ra、Spengler BA、Rettig WR、Biedler JL:ヒト神経芽腫Ｉ−タイプ細胞の永久表現型の変換。Proc Am Assoc Cancer Res 35:44、1993）。BE（２）Ｃ神経芽腫細胞は、免疫細胞化学およびウェスタン分析の両方によって、PA処理（10mM）を７日間行った後、HuおよびNF−Ｍタンパク質発現の減少と、ビメンチン発現の増加とを示した。0.5％NP−40を含有する50mM Trisを用いて細胞を溶解し、次いで８〜10％SDS−PAGEゲルを通して電気泳動により変性条件下でタンパク質を分離し、そしてエレクトロブロッティングによりニトロセルロース紙に移動させた。マウス抗ビメンチンmAb、高力価の抗Hu抗体を有するヒト血清、およびマウス抗NF−Ｍ、ならびに増感化学ルミネセンス技術（Amersham）を用いて、特異的免疫反応性を測定した。無関係のmAbと適合する正常なヒト血清または適切なイソタイプが、コントロールとして働いた。
PA仲介性増殖阻害におけるTGFβの役割。Daoy細胞のPA調整培地の増殖阻害効果を仲介することにTGFβが関与しているという仮説を試験することを、PAによる処理前および処理後において研究した。PA10mMと共にDaoy細胞をインキュベートすると、調整培地中のTGFβの量が増加し、これは、ミンクの肺細胞（MuLvl）バイオアッセイによって測定された。４日間のインキュベーションの後、コントロール培地は、0.5pMのTGFβを含み、そしてPAで処理された調整培地は、3.0pMのTGFβを含んでいた。TGFβ２に対して特異的なELISAアッセイを用いて、分泌された生物活性的なTGFβタンパク質のさらなる特徴付けは、TGFβ２の分泌がPAによって刺激されることを示した。
0.5pM〜1nMの範囲の濃度の外因性ヒト組換えTGFβ１またはTGFβ２を添加すると、0.2％FCSを含有するMEM中で維持された見処理のDaoy細胞の増殖は阻害されなかった。これらのTGFβタンパク質は、2pMのID50で24時間曝した後、MuLvlの細胞の増殖を著しく阻害した。最高20μg/mlまでの濃度における、TGFβ１およびTGFβ２に対する中和抗体とのブロッキング研究は、DaoyおよびU251細胞増殖に対するPA誘導阻害に対して効果がなかった（図22）。しかし、これらの濃度の抗体は、MuLvl細胞に対する外因性のTGFβ１およびTGFβ２の増殖阻害効果を中和することが可能であった。
セクションO:NaPAおよびNaPBヒト研究
造血細胞株および固形腫瘍細胞株に対するナトリウムフェニルアセテートの増殖阻害および分化の効果は、抗ガン剤としての使用に対して臨床的興味を引き起こした。２週間の連続静脈内点滴（CIVI）によって投与された場合のPAの非直線薬物動態、代謝、毒性および臨床的活性を、まず、一回目の第１相臨床治験において決定した。この場合、前臨床での活性に関連する範囲の薬物濃度を維持するように、CIVIによって薬物を投与した。これらの条件下において、フェニルアセテートは、飽和可能な動態およびそれ自体の代謝の誘導の証拠を示した（薬物動力学パラメータ、平均値±SD:Km＝105.1±44.5μg/ml、Vmax＝24.1±5.2mg/kg/時間、Vd＝19.2±3.3L、およびIR＝0.0028±0.003h-1）。血清フェニルアセテート濃度が１〜2mMに達した、転移性ホルモン非依存性前立腺ガンおよび悪性神経膠腫の数名の患者に臨床的改善が見られた。しかし、3mM以上の濃度を達成するためには、代謝酵素のVmaxに近い点滴速度が必要であった。このことにより、しばしば、急速な薬物蓄積が生じ、フェニルアセテートのレベルが6mMを超えるると神経学的な毒性を伴う。これらの限界点のために、異なる投与スケジュールの調査を行った。これらのスケジュールでは、フェニルアセテート濃度の上昇が、一時的であれば、十分忍容性があり、そして断続的な投与であれば、薬物蓄積の制御に役立つという仮定に基づいて、１日２回１時間の点滴をして薬物を与えた。
６カ月の期間にわたって、CIVIのプロトコールを数箇所変更した。第一に、最初の３名の患者を治療した後、初期ボーラスの投与量の規模を150mg/kg静注から60mg/kg静注に下げ、そしてボーラス点滴時間を２時間から30分間に下げた。この変更により、６時間以内の薬物の薬物動態（下記参照）を評価するために最適な薬物濃度を得た。第２に、フェニルアセテートの薬物動態の非直線性が認められた後（下記参照）、プロトコールを、一定用量の段階的増加の治験（用量レベル１および2:それぞれ150mg/kg/日および250mg/kg/日）から濃度による段階的増加の治験（用量レベル３および4:それぞれ200μg/mlおよび400μg/ml）に変更した。後者のフォーマットにおいては、14日間の薬物のCIVIを開始する１週間前に、患者にフェニルアセテートのボーラス用量（30分間にわたり60mg/kg）を静脈内に投与した。ボーラス用量から算定された患者特異的薬物動力学パラメータを用いて、14日間の点滴の間の目標レベルにおける血清フェニルアセテート濃度を維持するであろう点滴速度を計算した。血清薬物濃度を毎週測定し、すばやく個々の薬物動態および投与量調節（フィードバックを伴う適応性制御）の週ごと（weekining）の再評価を行った。
フェニルアセテートのクリアランスのメカニズム。図１に示すように、フェニルアセテートは、フェニルアセチルグルタミンに急速に変化した。２時間にわたって150mg/kgのフェニルアセテートを投与された３名の患者において、フェニルアセチルグルタミン（平均値±SD）の血清濃度のピークは、点滴の325±72分後では224±81μg/mlであり、60mg/kgのボーラス投与後、血清フェニルアセチルグルタミン濃度のピークは、86±33分の時点で104±33μg/mlであった。フェニルアセテートによるボーラス処理前の血漿グルタミン濃度は、105±29μg/ml（平均値±SD、ｎ＝16）であり、健常なボランティアに対しての文献で報告された値に類似していた。150mg/kgのボーラス投与された患者において、循環血漿グルタミンレベルにおける最大の減少（46％）が観察された。
24時間の採尿物からフェニルアセチルグルタミンのモル排泄を測定した。これは、同じ期間にわたって投与されたフェニルアセテートの用量の99±23％（ｎ＝18）を占めた。遊離の非代謝の薬物の回収率は、全投与量のわずか1.5±2.4％であった。身体検査の後、患者の衣服および検査者の手に強いフェニルアセテート臭が検出された。このことは、フェニルアセテートもまた、皮膚を通してある程度排泄され得ることを示唆している。
フェニルアセテートおよびフェニルアセチルグルタミンのCSFへの分布。臨床状況により、転移性前立腺ガンであるがCNS転移はない２名の患者の脳脊髄液の評価が必要とされた。第１の患者では、定常状態でのフェニルアセテートおよびフェニルアセチルグルタミン濃度が各々141および199μg/mlに達し、応答する同時に存在するCSF濃度は各々74および５μg/mlであった。第２の患者は、血清およびCSF同時サンプリング時には、フェニルアセテートの血清濃度が1044μg/mlに達した後６時間にわたって、治療をしてなかった。血清およびCSFでの測定値は、それぞれ、フェニルアセテートでは781対863μg/mlであり、フェニルアセチルグルタミンでは374対46μg/mlであった。
臨床毒性。薬物のボーラス投与に関連した毒性はなかった。２時間にわたる150mg/kgのボーラス投与後、最大ピーク血清濃度を測定した（533±94μg/ml、平均値±SD）。表16は、用量レベル当たりの平均血清フェニルアセテート濃度を示す。用量レベル３および４で達成された数値はそれぞれの目的値に近いが、大きな標準偏差は、フィードバックを伴う適応性制御を用いる場合でも、血清フェニルアセテート濃度を所望の範囲内に維持することができないことを反映している。
薬物に関連した毒性は明らかに血清フェニルアセテート濃度と関係があった。CNS毒性の３つの症状（錯乱および嗜眠（lethargy）、ならびにしばしばそれらに先行して嘔吐に限られる）は、用量レベル３および４で治療された患者に起こった。これらは薬物濃度906、1044、および1285μg/ml（平均値:950±300μg/ml）と関連していた。すべての症例において、症状は、薬物注入の終了後18時間以内で完全に消失した。
抗腫瘍活性。用量レベル２、３、および４（平均フェニルアセテート濃度:234±175μg/ml）で治療を受けた前立腺ガンの９名の患者のうち３名において、PSAの２カ月以上にわたる安定化が見られた。第４の患者には骨痛に著しい改善が見られ、そしてモルヒネのレジュメに対して非ステロイド性抗炎症剤を代用することができた。多形性神経膠芽腫の１名の患者は、動作状態（performance status）の改善（カルノフスキー尺度（Karnofsky's scale）で30％）、知的機能、および５カ月以上の表現的失語症の改善がみられた。腫瘍塊のサイズには変化は見られなかったが、腫瘍周囲（peritumoral）の浮腫の縮小がMRIにより観察された。
２回目の第Ｉ相臨床治験では、血清薬物濃度のピークを最大にする一方で薬物蓄積を最大限にするように、PAを１日２回（BID）静脈投与した。２つの用語レベル（125および150mg/kg BIDで14日間）で18名の患者に27サイクルの治療を行った。８名の患者における詳細な薬物動態研究を行った結果、PAが２週間にわたってそれら自体のクリアランスを44％だけ（by a factor of 44％）誘導することが示された。用量限界毒性は、吐気および難聴と関連する可逆性中枢神経系抑制からなっていた。８名の患者に臨床的改善が観察された。難治性悪性神経膠腫の７名の患者のうちの３名は、最大９カ月間、動作状態が改善された。１名の患者はMRI上で部分的に反応を示し、もう１名の患者は小さな反応を示した。ホルモン非依存性前立腺ガン（HIPC）の９名の患者のうちの５名にもまた改善が見られた。１名の患者はPSAが50％以上減少し、１名の患者は播種性血管内凝固症候群が消失し、そして１名の患者は１ヶ月以上続いた骨痛が軽減した。２名の患者は８ヶ月以上にわたって動作状態の改善を維持し、このうち１名は、芽球骨転移（blastic bone metastases）の治癒を示した。これらの結果により、PAは悪性神経膠腫およびHIPCに活性を有することが示唆される。第II相試験のための推奨されるスケジュールは、毎月14日間のサイクルで行われる125mg/kg BID（１時間点滴）である。
実施例7:NaPA B.I.D.によるインビボ試験
患者集団。従来の治療では難治性の進行性固形腫瘍を有し、動作状態がカルノフスキー尺度で60％以上、肝臓トランスアミナーゼおよびビリルビンが正常値であり、血清クレアチニンが1.5mg/dl以下であり、白血球数および血小板数が正常値である成人の患者がこの研究に適していた。臨床プロトコルは、NCI Institutional Review Boardによって検討および承認され、そしてこの研究への参加に先立って、すべての患者のから書面によるインフォームドコンセントを得た。平均年齢が54歳（32才〜76才の範囲）の18名の患者（男性15名および女性３名）が、1993年の７月と10月との間に登録された。疾患の分布としては、転移性ホルモン非依存性前立腺ガン（９名）、原発性CNS腫瘍（７名）、腎細胞ガン（１名）、および肉腫（１名）であった。４名の患者（神経膠腫の２名および前立腺ガンの２名）は、CIVIにより投与されたフェニルアセテートによる前治療を受けていた。
薬物調製および投与。注射用ナトリウムフェニルアセテート（Elan Pharmaceutical Research Co.,Gainesville,GA）は、Pharmacy Department of the Clinical Center,NIHにより得た滅菌ナトリウムフェニルアセテート粉末をバイアル中で注射用滅菌水USP中に500mg/mlの薬物濃度を含むようにして調製された。水酸化ナトリウムまたは塩酸を加えて最終pHを7.4に調整した。１時間にわたって注入される用量のナトリウムフェニルアセテートを、250mlの注射用滅菌水USP中で調製し、そして注入ポンプを用いて投与した。この実験では、１コンパートメント非線形薬物動態モデルおよびフェニルアセテートを用いた以前の経験から得られたパラメータ集団を用いて、いくつかの断続的な投薬レジュメからなる推移を刺激した。第１の目的は、大部分の患者を3mM過剰のフェニルアセテートに一時的に曝し、そして約2mMというトラフ濃度を維持するようなものを設計することであった。これらはインビトロにおける抗腫瘍活性にとって必要であると考えられたもので、患者は２週間もの長い間十分に忍容性であった。第２の目的は、上記のことを達成するためのフェニルアセテートの最適用量を薬物動態的に決定し、この決定された量で開始することによって治験における段階的増加ステップ数を最小限にすることであった。
フェニルアセテートは２つの用量レベルで送達された。すなわち、10名の患者は125mg/kg用量で、そして８名の患者は150mg/kg用量で、BIDで連続14日間治療を受けた。治療のサイクルは４週間毎に繰り返した。用量は少なくとも３名の患者よりなる群毎に順次増大させた。個々の患者は、薬物に関連した毒性の経験がなく、かつ病状が安定しているかまたは改善している場合に、連続サイクルで１つの用量レベルから次の用量レベルまで段階的に上昇させた。
サンプリングスケジュール。すべての患者において、午後５時の点滴投与の直前および投与15分後に１日２回血清薬物濃度を測定した。フェニルアセテートがそれ自体のクリアランスを誘導する可能性を評価するために、２週間の治療のうち１、２、または３日目ならびに12、13、または14日目に、８名の患者にさらに集中的な薬物レベルのモニタリングを行った。これらの患者では、午前８時の点滴の開始から０、65、90、105、120、150、180、210、240、300、および360分後に採血した。これにより、治療の開始時および終了時での同用量のフェニルアセテートから生成される両AUC間の比較を行い得た。いかなる相違もこの期間にわたる薬物クリアランスの変化を反映している。
分析方法。血液を、無地のVacutainer（登録商標）ガラス管に採取して冷蔵庫に保存した。血清を分離して、採血から12時間以内に−85℃で冷凍した。フェニルアセテートおよびフェニルアセチルグルタミンの血清濃度を測定するHPLC法については、本明細書の他の部分で述べている。簡単に述べれば、100μｌの10％過塩素酸を200μｌの血清に添加してタンパク質を沈殿させた。遠心分離の後、上清を重炭酸カリウムの20％溶液25μｌで中和した。２回目の遠心分離の後、60℃に加温した300×3.4mmのＣ−18カラムに20μｌの上清を注入した。水に含まれるアセトニトリルの勾配を５％から30％へ増加させて20分間にわたり溶出を行った。280nmでのUV吸光度をモニターすることによって溶出の進み具合を追跡した。これらの条件下におけるフェニルアセテートおよびフェニルアセチルグルタミンの特徴的な溶出時間は、それぞれ、17.1および9.8分であった。
治療に対する反応の測定。患者は少なくとも月１回、NCIの医師による診察を受けた。各サイクルの治療の前に、前立腺ガンおよび原発性CNS腫瘍以外の悪性疾患の反応状態を、従来の解剖学的基準を用いて決定した。前立腺ガンの患者に対しては、NPCP治験からの基準およびPSA低下の公表された基準を用いた。最初にポジティブであった場合または新しい骨の症状が存在する場合に、テクネチウム骨スキャンを３ヵ月毎に行った。腫瘍は微細な中心が多数あることが多いため、腫瘍に関連した浮腫およびステロイド治療に対する浮腫の反応が多様であるため、ならびに腫瘍反応を測定するためにMRIでのガドリニウム増強の強度を用いることが技術的要因によりできないため、神経膠種の患者を評価することは複雑になる。これらの理由により、各往診で評価された動作状態およびステロイド要求性の変化に特別の注意が払われた。完全な反応は、MRI上での病変の完全な消失（２つの異なる面内で行われた評価）およびステロイドからの脱却として定義した。部分的な反応は、従来の解剖学的基準、動作状態の低下がないこと、およびコルチコステロイド要求性の安定化または軽減によって定義した。軽微な反応も同様に、サイズの縮小の最小限度としての25％を用いて定義した。進行性疾患は、解剖学的基準、動作状態がカルノフスキー尺度で少なくとも20ポイント低下すること、または機能を維持するためにステロイド量を増加させる必要があることのいずれかによって定義した。病状の安定化は、腫瘍のサイズの有意な（25％以上）増大または縮小がない一方で、患者が動作状態を治療前のレベルに維持しているかまたは改善している場合として定義した。有意であるとしてスコア化されるためには、これらの患者の病状の安定化は少なくとも３ヶ月は維持されなければならないこととした。
統計的方法。フェニルアセテートがそれ自体のクリアランスを誘発するか否かを決定するために、８名の患者におけるPA治療の開始時および終了時において薬物を単回投与した後のAUCを、対のあるデータ（paired data）に関するWilcoxon符号付き順位検定（Wilcoxon signed rank test）を用いて比較した。
薬物動態学（pharmacokinetic）シミュレーションおよび臨床所見。以前のフェニルアセテート治験から得られた薬物動力学的パラメータを用いて、数種の断続的投与スケジュールをモデル化した。フェニルアセテートを125mg/kg/用量BID（午前08:00および午後05:00）にて与えられた70kgの男性の薬物動力学的推移をモデル化した。このシミュレーションは、トラフ濃度1mM未満かつ薬物蓄積なしで、1.5〜3.5mMのピークレベルを予測した（95％信頼区間）。
18名の患者の薬物レベル分析は、２つの用量レベルにおいて、3.0±1.2mM（ｎ＝10）および3.7±0.8mM（ｎ＝８）のピーク血清濃度（平均値±SD）を示している。対応トラフ濃度は、それぞれ0.2±0.2mMおよび0.7±0.5mMであった。平均して、上記の患者の治療時間の40％は、2mMを超える濃度であった。神経学的毒性（最大フェニルアセテート濃度:7.3mM）関連の薬物蓄積が、第２の用量レベルの１名の患者について起こった。薬物動力学的パラメータ集団（population pharmacokinetic parameters）を、上記で説明した平均パラメータ値の推定値を初期パラメータとして用いて、各患者の投与データおよび薬物濃度データにコンパートメント非線形モデル（one compartment non−linear model）を適用することによって、決定した。各患者個人の薬物動力学的パラメータを平均し、標準偏差付きの平均パラメータ値として表現した。
Km＝112±34μg/ml、
Vmax＝25.8±5.0mg/kg/時間、および
Vd＝21.4±4.6Lである。
フェニルアセテートクリアランス。フェニルアセチルグルタミンのモル排泄を、24時間採尿物から測定した。これは、同じ時間にわたって投与されたフェニルアセテート用量の76±15％（平均値±SD、ｎ＝24）を占めた。遊離の未代謝の薬物の回収率は、全投与用量の３±１％であった。
フェニルアセテートのクリアランスの誘導。フェニルアセテートがそれ自体のクリアランスを誘導するという仮説を、治療の開始時および終了時においてフェニルアセテートをAM点滴後のAUCを８名の患者について比較することによって、検定した。全員がAUCの減少を示し、各治療サイクルの最初と最後における平均値は44±27％（ｐ値＝0.0008）であった。
抗腫瘍活性の臨床的変化。脳腫瘍７名の患者中３名が、抗腫瘍活性または病状安定の証拠を示した。１名は、短期間記憶における自覚的な改善を伴う部分的な反応を示した。この反応は、転移性ホルモン非依存性前立腺ガンの57歳の男性において、同じ期間にわたって血清PSA濃度が上昇したにも関わらず、骨芽細胞への転移（６ヶ月フォローアップ）が治癒したことを示すＸ線撮影の証拠によって確認された。その患者はまた、毎日のコルチコステロイド用量を、すなわち、デキサメタゾン8mgから4mgまで、50％減らすことが出来た。初期に錯乱（confusion）を呈した２名の患者は、断続的スケジュールでの治療を行う前に、フェニルアセテートをCIVIによって与えられていた。１名は、レジュメを変えた後、Ｘ線撮影の記録による微少な反応（minor response）を示したが、２例目においては腫瘍サイズが安定した。両者とも、パフォーマンスステータスにおいて20％および30％の改善を、それぞれ６ヶ月間および７ヶ月間維持した。彼等のコルチコステロイド用量は治療を通して一定に保たれた。
ホルモン非依存性前立性ガン患者９名中５名が、臨床的改善を示した。１名は、PSAの50％を超える減少を１ヶ月間持続して経験し、カルノフスキー（Karnofsky）尺度で100％のパフォーマンスステータスを５ヶ月以上もの間維持した。腫瘍に伴って起こる播種性血管内凝固症候群（プロトンロンビン時間の延長、フィブリノーゲンの低下、正常値の血小板数）の１名は、フェニルアセテートの開始と同時にフルタミド（flutamide）の服用を中止した。その患者の血液学的パラメータは、治療第１週目に正常化し、骨痛の減少によりパフォーマンスステータスは30％改善した。既にCIVI投与によるフェニルアセテート治療を受け、それに伴い骨痛およびパフォーマンスステータスが改善していた２名は、更に５ヶ月間それが持続した。そのうち１名は、CTスキャンにおいて骨芽細胞転移治癒の証拠が現れた。再発性多形性膠芽腫の患者の治療前のガドリニウム増強脳MRIと、３サイクルのフェニルアセテート（150mg/kg BID）による治療後ガドリニウム増強MRIとの比較により、この部分的反応が確認された。同時期における血清PSA濃度が1.0ng/mlから80ng/mlへ一定して増加したにも関わらず、転移治癒の証拠は継続した。最終的に、１名の患者は、自覚的な骨痛の改善が１ヶ月間持続した。
臨床的毒性。可逆的な神経学的毒性は、１日２回のフェニルアセテート投与に関連して最も普通に見られる副作用であった。全患者が、軽度の（第Ｉ度）眠気を経験した（ピーク血清濃度、平均±SD:2.9±0.5mM）。150mg/kg BIDを投与された３名の患者において、用量を制限する神経学的毒性が見られた（血清濃度、平均±SD:5.3±1.7mM）。うち多形性膠芽腫の患者１名は、薬物蓄積（フェニルアセテート濃度:7.3mM）に関連した一過性の空間的失見当識（spatial disorientation）および聴力障害を経験した。退形成星状細胞腫の別の患者は、フェニルアセテートのピーク濃度（平均ピーク濃度:4.7mM）に一時的に関連した第II度の経口を経験した。スラミン誘発感覚神経障害（neuropathy）を患っていた３番目の前立腺ガン患者は、フェニルアセテート投与（ピークおよびトラフレベル、平均±SD:3.9±0.4および0.9±0.4mM）の最初の10日間にわたって漸進的な状態悪化を経験し、その時点で治療を中止した。この患者における副作用は、３ヶ月間にわたって次第に改善した。
狭心症、上室性頻脈または僧帽弁脱出症関連の動悸の病歴のある患者３名が、フェニルアセテート点滴中、その患者らの通常症状の可逆的な悪化を報告した。これは、恐らく薬剤処方物（drug formulation）の高ナトリウム含有量によって誘発された体液の著しい移動に関連している。心臓血管障害のない患者においては、そのような症状は見られなかった。
この治験は、フェニルアセテートのCIVIによる高用量投与に関連した急速な薬物蓄積の問題を克服するように計画された。この目標は、前臨において活性（2mM）が見い出された一過性のピークフェニルアセテート濃度範囲を達成し、フェニルアセテートの各投与間に薬物除去のために十分な時間を与えることであった。フェニルアセテートの最初の治験から得られる薬物動態情報を、数種の断続服用レジュメをシミュレートするために用いた。125mg/kg/用量のフェニルアセテートを１日２回（９時間間隔）60分間の点滴として投与することにより、患者の95％以上において、薬物蓄積なしで３〜5mMの血清薬物濃度が達成されることが予測された。従ってこの用量を治験の開始時点で選択した。
この結果は、125および150mg/kg/用量のフェニルアセテートで処置された患者のほとんどが、３〜5mMの範囲のピーク血清薬物濃度を達成することが確認された。より高いレベルで治療を受けた８名の患者中１名に起こった望ましくない薬物蓄積を経験した者は、第１の用量レベルで治療を受けた患者中には無かった。患者は、全治療時間の40％に等しい時間、潜在活性濃度のフェニルアセテートに曝された。薬物動力学的シミュレーションの正確さにより、他段階の段階的増加（multiple esclation step）の必要がなくなり、臨床的疑問にすばやく答えることが出来た。
この治験により、ピーク薬物レベルに対するフェニルアセテートの毒性の特徴づけが可能になった。125mg/kg用量レベルは、平均ピーク血清濃度3.0mMおよび第Ｉ度の神経系毒性（眠気）と関連が見られた。薬物注入と眠気の開始との時間的な関連は、この用量レベルで治療を受けた全患者に見られた。各注入間の漸進回復が一様に見られた。第２の用量レベル（150mg/kg BIO）は、５名の患者において第Ｉ度の神経学的毒性（平均ピーク血清濃度:3.7mM）、および平均ピーク薬物濃度が5.3mMであった３名の患者においてはより重篤な毒性との関連が見られた。既にスラミン誘発性感覚神経障害を有する患者に見られた悪化以外は、フェニルアセテートによる神経学的毒性は急性かつ可逆であった。
フェニルアセテートのクリアランス誘導の証拠は、フェニルアセテートの最初の治験により得る。しかし、この証拠は、各治療サイクルにおいて薬物用量の調節を頻繁に行ったため、間接的なものであった。現行の一定用量レジュメでは、２週間にわたる治療の開始時と終了後に投与された同用量の薬物に関連して、AUCの44％平均値の減少が示された。このことは、PAが肝臓酵素（hepatic enzyme）フェニルアセチルコエンチームA:グルタミンアシルトランスフェラーゼによる自身のクリアランスを誘導するという仮説を立証するものである。代謝の誘導は、治療の中止後には持続しなかったため、フェニルアセテート代謝が自己誘導であるという仮説がより強化された。クリアランスの自己誘導の観察は、フェニルアセテート治療の最適な長さおよび経時的な用量変更の必要性にとって、重要である。
悪性膠腫の患者に見られた部分的かつ軽微な反応は、インビトロで細胞増殖抑制性（cytostasis）を引き起こす分化剤（differentiating agent）からは期待されなかった。しかし、悪性大膠細胞（astroglia）の成長が主に依存する、コレステロール合成のメバロンネート経路を、フェニルアセテートが阻害することの証拠（本文明細書中に記載する）は存在する。この結果、細胞が死滅し、腫瘍サイズが減少し得る。別のメカニズムは、様々な腫瘍細胞タイプにおける主要なエネルギー源である、グルタミン循環の欠乏に関連する。フェニルアセテート代謝は、フェニルアセチルグルタミンを産生し、急速な注入後に血漿グルタミンの著しい減少を引き起こす。この点において、フェニルアセテートの繰り返し投与と血漿グルタミン濃度減少の持続との関連は見られなかったが、１日２回125mg/kg/用量を投与されている70kgの患者は、１日に90モルを超えるグルタミンを、尿中フェニルアセチルグルタミンとして排泄することになる。これが腫瘍部位に反映されるか否かは現在未知である。分化剤で治療を受けている患者の腫瘍反応の評価は、難しいかもしれない。ホルモン非依存性前立腺ガン患者において特に困難であるため、これらの患者に対してはPSAが最良の入手可能フォローアップツールとして提案されてきた。PSA生成は器官特異的であり、腫瘍の分化の度合いと直接相関があるため、フェニルアセテートに誘発される表現型反転は、マーカーの血清レベル上昇と関連している可能性がある。このため、PSAは疾患による負荷（disease burden）のマーカーとしての臨床的な有用性を失い、より伝統的な解剖学的基準としての役割を強調することになる。後者は、軟組織転移の無い進行性前立腺ガンを有する大多数の患者の評価のためには、不運にも不適切である。従って、伝統的な解剖学的基準およびパフォーマンスステータスのスコア（痛みの軽減を含む）は、この意味でのPSAについて、さらなる経験が得られるようになるまでは、反応を記述するために用いられるべきである。これらの指針を適用することにより、転移したホルモン非依存性前立腺ガンを有する患者９名中５名は、フェニルアセテート治療によって臨床的利益を受けたようであった。
２週間連続して125mg/kg BIDの用量で投与されたフェニルアセテートは、十分認容性であり、高度の神経膠腫および進行性前立腺ガンの患者において抗腫瘍活性との関連が見られた。
インビボでは、PAはグルタミンと結合してフェニルアセテチルグルタミンを形成した（PAG）。しかし、PAは、不快な異臭を有するため、患者の許容性を制限する。フェニルブチレート（PB）は、同様にインビトロ活性（0.5〜2mM）を有する無臭な化合物であり、インビボβ酸化により急速にPAに変換されると思われる。
PBの薬物動態（PK）を調べるため第Ｉ相の研究を行い、２つの代謝産物（PAおよびPAG）の性質を特徴付けた。14名のガン患者（平均年齢51.8±13.8歳）が、３つの用量レベル（600、1200および2000mg/m2）のPBの30分間の点滴を受けた。連続（serial）血液サンプルおよび24時間採尿物を得た。サンプルをHPLCによりアッセイした（CV＜10％）。３つの化合物全てのPKを同時に記述するためのモデルを、ADAPT IIを用いて開発した。データを、モル当量としてモデル化した。
PB、PAおよびPAGの測定（determination）係数（r2）の平均（±SD）がそれぞれ0.96±0.07、0.88±0.10および0.92±0.06であったことによって示されるように、モデルは、データによく適合した。患者内におけるパラメータ推定値に対するCV％は小さかった（87.2％〜33.5％範囲）。PBは、インビトロ腫瘍活性範囲においてピーク濃度を達成し、飽和可能な除去（saturable elimination）を示した（Km＝34.1±18.1μg/mlおよびVmax＝18.1±18mg/時間/kg）。代謝は急速であった。すなわち、PAおよびPAGのTmaxはそれぞれ１時間および２時間であった。PBからPAへの変換は広範であったが（80±12.6％）PAの血清濃度は、その後の急速なPAGへの変換のために低かった。PB AUC/PA AUC比は2.25であった。従って、PBは、独立の治療剤としての活性を示し、必ずしもそれだけでの活性を示さない。
セクションP:脂質代謝のNaPAおよびNaPB改変
NaPAは、脂質代謝に関連する生化学変化を誘導する一貫した能力を示している。このような活性は、ガンおよび心血管疾患を含む脂質代謝関連障害の治療において、価値がある。
上記のように、NaPAおよびその誘導体は、ヒトペルオキシソーム増殖因子活性化レセプター（PPAR）を活性化する。PPARは、アシル−CoAオキシダーゼおよびチトクロームP450IVファミリーの酵素などの脂質代謝に関連する重要な酵素の発現を調節する。他の薬剤、例えば、脂肪酸およびフィブリック酸（fibric acid）誘導体（クロフィブレート）などの低脂血性作用薬（hypolipidimic drug）は、PPARを活性化し得る。このグループの薬物は、血清トリグリセリドのレベルを低下させるのに非常に効果的であるため、冠状動脈疾患の高められた危険性に関連するアテローム発生性リポタンパク質のレベルを減少させるのに広く用いられる。
神経膠腫細胞は、PAでの処置後脂質を蓄積する。従って、ガン細胞は、あるエネルギー代謝の遊離脂肪酸に依存する。PAおよびPBを用いて治療された患者では、脂質の30〜50％減少が見られる。PAの脂質低下能力は、300〜350mg/kg/日（IV）のNaPAで治療された何名かのガン患者において示される（表17）。これらの患者は、治療中に、トリグリセリド（TG）レベルの30〜60％減少を示した。例えば、患者S.L.は、350mg/kg/日のPAを用いる14IV治療のコースの間に、TGレベルの169±5mg/dlから75±21mg/dlへの減少を示した。PA治療を中止した２週間後、TGレベルは回復し、185mg/dlに達した。同様の変化は、他の患者でも観察された（表17を参照）。
Figure 0003628694
このように、PAおよびPBは、PPARを刺激する（過酸化の増加およびDNA合成の減少）ようである。さらに、PA/PBはまた、タンパク質プレニル化（rasタンパク質、Ｇタンパク質、および核ラミンなど）を減少させるメバロン酸経路（上記参照）も阻害するため、PAは、DNA合成前にコレステロール合成を減少させるように作用する。減少したプレニル化rasは、増殖シグナルを活性化させない。従って、上記のように、HMG CoAリダクターゼインヒビター、例えば、ロバスタチンは、侵入性および転移によって測定されるように、PA/PBとの相乗的併用を提供する。
さらに、PAのTG減少活性は、実質的に有害作用がなく、クロフィブレートおよびその誘導体の活性と同様またはより良好に効果的である（Olssonら、Atherosclerosis 27:279−297,1977）。
セクションQ:悪性および非悪性細胞における、フェニル酢酸およびその誘導体によるHbFの誘導
HbFの産生を誘導する、NaPAおよびその誘導体の一般的な能力。ナトリウム４−フェニルブチレートの経口投与が胎児ヘモグロビン産生を増加する能力を調べた。このために、胎児ヘモグロビン（Ｆ細胞）を含有する赤血球の百分率を、ナトリウム４−フェニルブチレート療法を５〜65カ月間受けた、遺伝性尿素サイクル障害を煩う15名の患者（女性７名と男性８名）において、フローサイトメトリック単一細胞免疫蛍光アッセイによって測定した。貧血症でないヒトにおける低レベルの胎児ヘモグロビンの差を決定する際には、Ｆ細胞の百分率の測定は、従来の、全ヘモグロビンの百分率としての胎児ヘモグロビンの測定よりも正確である。Ｆ細胞の平均百分率は、正常な被検者よりも患者において有意に高かった：
Figure 0003628694
参考例6:NaPA/NaPBに対する鎌状細胞およびβサラセミアの応答のインビトロ研究
通常の評価のために国立衛生研究所（NIH）のクリニカルセンターへの収容が許可されたホモ接合鎌状細胞疾患またはβサラセミアを煩う患者、またはDepartment of Transfusion Medicine（NIH）からの正常な献血者由来の細胞についてインビトロ研究を行った。約20〜25mlの血液を赤血球系細胞培養物用に得た。SSまたはβ−thalの診断を、（１）アルカリセルロースアセテートおよび酸クエン酸糖におけるヘモグロビン電気泳動；（２）末梢血検査；および、場合によっては、（３）骨髄吸引液のDNAおよびRNA解析に基づいて行った。可能であるならば、診断は家族の研究によって確認した。通常の血液学的プロフィールをCoulter Model Sで行った。
フィコール−ハイパーク勾配における遠心分離によって末梢血単核細胞を単離し、10％胎児ウシ血清（FCS）（GIBCO、Grand Island、NYから入手した）、１μg/mlのシクロスポリンＡ（Sandoz、Basel、Switzerland）、および膀胱癌腫5637培養物から回収した10％のならし培地（Myers CD,Katz FE,Joshi G,Millar JL:CFU−GEMM培養物の細胞株分泌刺激因子。血液64:152,1984）を補充したα最少必須培地（GIBCO、Grand Island、NYから入手した）において７日間培養した（第Ｉ相）。第II相において、非接着性細胞を、30％のFCS、１％の脱イオン化ウシ血清アルブミン、１×105Mの２−メルカプトエタノール、1.5mMのグルタミン（他に記載がなければ）、１×106Mのデキサメタゾンおよび1U/mlのヒト組換えEpo（Ortho Pharmaceutical Co.、Raritan、NJ）を補充したα培地で再び培養した。これらの培養物は、血液１ミリリットル当たり106個までの赤血球系細胞を産生した。細胞の生存能をトリパンブルー排除によって測定した。フェニル酢酸、４−フェニル酪酸、ｐ−ヒドロキシフェニル酢酸（ｐ−hydroxyphenylcetic acid）、ｐ−クロロフェニル酢酸、および酪酸（Sigma、St.Louis、MO）を蒸留水に溶解し、NaOHを添加してpH7.0にした。５−アザシチジンおよびヒドロキシウレアーゼはSigmaから入手し、PAGは、S.Brusilow（Johns Hopkins、Baltimore、MD）から入手した。
アルカリベンジジンおよびギムザで染色した細胞遠心スライドを調整することによって分化を形態学的に評価した。Hb含有細胞の数を、ベンジジン−HCl手順（Orkin SH、Harosi FL、Leder P:赤白血細胞およびその体細胞ハイブリッドの分化。Proc Natl Acad.Sci USA 72:98,1975）を用いて測定した。Hbは、上記のように、細胞溶解産物の陽イオン交換高速液体クロマトグラフィー（HPLC）によって特徴づけ定量した（Huisman TH:高速液体クロマトグラフィーによるヘモグロビンおよびヘモグロビン鎖の分離。J Chromatography 418:277、1987）。既知の数のHbを含有する（ベンジジン陽性）細胞から調製した溶解産物中の全Hbを、テトラメチルベンジジン手順（Sigma kit、Catalog No.527）または陽イオン交換HPLC（クロマトグラム下の全面積を推定）のいずれかによって測定した。標準Hb溶液（Isolab、Inc.、Akron、OH）を参照用として用いた。平均細胞性Hb（MCH）を、溶解産物の全Hb含有量をベンジジン陽性細胞の数で除算することによって計算した。
細胞質RNAを１％アガロース−ホルムアルデヒドゲル上で分離した。RNA単離、ゲル電気泳動、Nytranメンブレンへの移動（Schleicher ＆ Schuell、Inc.、Keene、NH）、放射性標識されたDNAプローブを用いたハイブリダイゼーション、およびオートラジオグラフィー（Kodak X−線フィルムXARS）については記載された［SamidD,YehA,Presanna P:フェニルアセテートで処置したヒト白血病細胞中での赤血球系分化の誘導および胎児ヘモグロビンの産生。Blood、80:1576、1992］。ヒトグロビンcDNAグローブは、JW101（α）、JW102（β）、およびヒトＧ−γ−グロビン遺伝子の3'末端の0.6kb EcoR I/Hind IIIフラグメントを含んでいた。プローブは、ランダムプライムDNA標識キット（Boehringer、Mannheim、Germany）を用いて、［32P］dCTP（New England Nuclear、Boston、MA）で標識した。
結果。NaPAまたはNaPBを第II相の赤血球系培養物に添加したところ、細胞生存能に明らかな変化を伴うことなく、細胞増殖が減少した。細胞増殖抑制性は、培養物当たりの産生された全Hbの低下に関連した；しかしながら、治療により、細胞当たりのHb含有量（MCH）およびHbFの割合（％HbF）が共に増加した（図２）。観察された変化の程度は、用量依存的および時間依存的であった：すなわち、増殖の第２相の間に、薬物の添加が早ければ早いほど、％HbFの増加率は高くなった。しかしながら、細胞収率はそれに反比例して減少した。例えば、２日目に5mMのNaPAを正常な前駆体に添加したところ、細胞数は約90％減少した。それに伴い、13日目に測定した％HbFは12倍増加した。67日目に治療を開始した場合には、細胞数はコントロールと比較して60％減少し、％HbFは3.3倍増加した。さらなる分析に十分な細胞を得るために、それ以降の実験では６〜７日目に薬物の添加を行うこととし、13日目に細胞を回収した。このような条件の下に、鎌型赤血球貧血を患っている４名の患者およびβ−thalを患っている４名の患者と同様に、６名の正常なドナー由来の培養物において結果が再現された。NaPA（5mM）およびNaPB（2.5mM）は、MCH（38〜100％）および産生したHbFの割合の両方の大幅な増加を引き起こした。ホモ接合SS患者の場合、％HbFは、4mMのNaPAにより2.0〜4.1倍（平均3.0倍）、2.5mMのNaPBにより3.2〜5.6倍（平均4.0倍）上昇した。後者はHbSレベルの12±３％減少に関連し、HbA2の変化は伴わなかった（図３）。
K562細胞の場合と同様に、正常細胞またはSS細胞の初代培養物においてNaPAまたはNaPBによるHbF産生の増加は、γ−グロビン発現の翻訳前の調節のためのようである。ノーザンブロット分析により、γ−グロビンmRNAの定常状態のレベルの用量依存的増加（５倍まで）が示され、これにはβグロビン転写物の量のわずかな減少（２倍未満）を伴うことが示された。αグロビンの発現には変化は生じなかった。
PAGは、NaPBおよびNaPAの両方における最終代謝産物であって、グルタミンとのフェノールアセテート結合により形成され、後に尿中に排泄される。PAGは、赤血球系増殖およびHbF蓄積に対しては不活性であることがわかった。非悪性赤血球系細胞のグルタミン飢餓は、細胞増殖に対してもHbF産生に対しても効果を有さず、また、NaPAの効力も増強しなかった。
その他の薬物を用いるNaPAの影響もアッセイした。正常なドナー由来の培養物（HbFのベースレベルは0.8〜2.0％）中で単独で用いる場合、NaPA（5mM）およびヒドロキシウレアーゼ（0.05mM）は、％HbFをそれぞれ3.5倍および2.0倍増加させた。これら２つの併用は、HbFの4.7倍増加を生じた。NaPAはまた、ブチレート（0.5mM）（3.1倍から7.15倍に）および５−アザシチジン（２μＭ）（2.5倍から6.6倍に）によるHbF刺激を増強した。これらの結果は、NaPAを最適より下の非毒性用量のその他の薬物に添加する場合には、NaPAは顕著な細胞増殖抑制性を伴い、かつ細胞生存能の顕著な変化を伴わずにHbF産生を強化することを示している。
以下の表18に例示しているように、ヘミン、すなわち公知のHbF産生刺激物質と同時にNaPA（またはフェニル酢酸の薬学的に受容可能な誘導体）の投与を含む併用処置は、ベンジジン陽性細胞の数の増加により示されるような、赤血球系分化の誘導、およびHbF産生を相乗的に増大させる。K562細胞において、この併用治療によるHbF産生の増大の範囲は、10mMのPA単独の処置により産生されるHbFの1.5〜５倍変化した。さらに、ヘミンと併用してのNaPBでの処置もまた、古典的な相乗作用に至った。非悪性赤血球系始原初代細胞にPBを用いた場合にも同様の結果が得られた。あらゆる場合において、これら両薬物を用いた処置は、HbFの測定前に４〜６日間続けた。
Figure 0003628694
セクションR:薬物投与の態様
NaPA（またはPAA誘導体）は、局所的または全身的に投与し得る。全身投与とは、有効レベルの活性成分が、血液中またはこの活性成分の投与部位から離れた部位に現れることを生じる、あらゆる投与態様または投与経路を意味する。
本発明による全身投与のための薬学的処方物は、静脈内投与、筋内投与、皮下投与、経口投与、経鼻投与、腸内投与、非経口投与、嚢内投与、または局所的投与のために処方され得る。ある場合には、いくつかのタイプの処方物の組み合わせを同時に用いて活性成分の全身投与を達成し得る。
経口投与に適した処方物は、硬性または軟性のゼラチンカプセル、糖剤、丸剤、錠剤（コートされた錠剤を含む）、エリキシル剤、懸濁剤、およびシロップ剤または吸入薬を含む。
固形剤形は、経口投与用に処方された処方物に加えて、直腸用坐剤を含む。
本発明の化合物はまた、移植物の形態で投与し得る。
局所投与に適した処方物は、クリーム、ジェル、ゼリー、漿剤、ペーストおよび軟膏を含む。
適切な注射溶液は、静脈注射溶液、皮下注射溶液、および筋内注射溶液を含む。本発明の化合物は、注入溶液の形態で、あるいは、鼻孔吸入薬またはスプレーとして投与され得る。
本発明の化合物はまた、上述したように抗腫瘍剤および造血細胞増殖因子と同様に、選択された生物学的応答改変剤（例えばインターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子、グルタミンアンタゴニスト、ホルモン、ビタミンなど）に付随して、または併用して使用し得る。
NaPAはいくらか悪臭があることが観察された。したがって、この化合物は、薬学的に受容可能な何らかの臭いをマスクする賦形剤の存在下で、または不快な臭いを有さないその前駆体であるフェニルブチレート（またはその誘導体あるいはアナログ）として投与するのが好ましくあり得る。
抗腫瘍剤として用いられるPAAおよびその薬学的に受容可能な誘導体は、それ自身が当該分野で入手可能である薬学的物質を用いて容易に調製し得、そして既に確立された手順により調製し得る。以下の調製物は、本発明の剤形の調製物を示すが、これは本発明を制限するものではない。
参考例7:嚢内治療
PA/PBまたはその誘導体／アナログの、粘膜表面などの体表面、または膀胱、腎臓、子宮、膣などの体腔内への局所的適用を使用して、その表面または腔を含む病的状態を予防または治療し得る。この様式においては、特定の表面または腔に対してPAを選択的に標的して、体の他の部分と比べて比較的高い濃度のPAをその部位において維持し得る。
例えば、膀胱ガンは、嚢内法により治療し得る。膀胱ガンの患者に対して、治療前の相当な時間、例えば８〜12時間の間、食物および水を絶たせ得る。その絶食後、患者にカテーテルを挿入し得る。約2.0〜200.0mM、好ましくは２〜20mMのナトリウムフェニルアセテート、または1.0〜100mM、好ましくは１〜10mMのナトリウムフェニルブチレートあるいはその他の等量のPAアナログの濃度を有する約50〜150mlの溶液を、膀胱内に直接点滴注入する。その後、点滴注入された流体をできるだけ長く保持することを患者に対して要請する。この治療を、例えば、１日１回２〜４週間、その後に２週間の投薬中断で繰り返す。このようなサイクルを、例えば６カ月までの間繰り返し得る。同様に、腎臓ガンも同様に治療し得る。

Claims (19)

  1. 以下の式のフェニル酢酸誘導体、それらの塩、それらの立体異性体、およびそれらの混合物の治療量と併用してバスタチンの治療量を含む、被験体の神経膠腫を治療するための薬学的組成物：
    Figure 0003628694
    ここで、
    R0＝アリール、フェノキシ、置換アリールまたは置換フェノキシであり；
    R1およびR2は、独立して、Ｈ、低級アルコキシ、ヒドロキシ、低級直鎖および分枝鎖アルキルまたはハロゲンであり；
    R3およびR4は、独立して、Ｈ、低級アルコキシ、低級直鎖および分枝鎖アルキルまたはハロゲンであり；そして
    ｎ＝０〜２の整数である。
  2. 前記バスタチンが、ロバスタチンである、請求項１に記載の薬学的組成物。
  3. 前記神経膠腫が、悪性神経膠腫である、請求項１に記載の薬学的組成物。
  4. 前記フェニル酢酸誘導体が、フェニル酢酸ナトリウムである、請求項１に記載の薬学的組成物。
  5. 前記フェニル酢酸誘導体が、フェニル酪酸ナトリウムである、請求項１に記載の薬学的組成物。
  6. 前記神経膠腫が、非悪性神経膠腫である、請求項１に記載の薬学的組成物。
  7. 請求項１に記載の組成物で処置される被験体において検出される横紋筋融解症誘導性ミオパシーを治療するための、ユビキノンを含む薬学的組成物。
  8. 請求項１に記載の組成物および請求項７に記載の組成物を含む、キット。
  9. 以下の式のフェニル酢酸誘導体、それらの塩、それらの立体異性体、およびそれらの混合物の治療量と併用してバスタチンの治療量を含む、神経膠腫を有する被験体のHMG−CoAリダクターゼおよびMVA−PPデカルボキシラーゼを阻害するための薬学的組成物：
    Figure 0003628694
    ここで、
    R0＝アリール、フェノキシ、置換アリールまたは置換フェノキシであり；
    R1およびR2は、独立して、Ｈ、低級アルコキシ、ヒドロキシ、低級直鎖および分枝鎖アルキルまたはハロゲンであり；
    R3およびR4は、独立して、Ｈ、低級アルコキシ、低級直鎖および分枝鎖アルキルまたはハロゲンであり；そして
    ｎ＝０〜２の整数である。
  10. 前記バスタチンが、ロバスタチンである、請求項９に記載の薬学的組成物。
  11. 前記神経膠腫が、悪性神経膠腫である、請求項９に記載の薬学的組成物。
  12. 前記フェニル酢酸誘導体が、フェニル酢酸ナトリウムである、請求項９に記載の薬学的組成物。
  13. 前記フェニル酢酸誘導体が、フェニル酪酸ナトリウムである、請求項９に記載の薬学的組成物。
  14. 請求項９に記載の組成物で処置される被験体において検出される横紋筋融解症誘導性ミオパシーを治療するための、ユビキノンを含む薬学的組成物。
  15. 請求項９に記載の組成物および請求項14に記載の組成物を含む、キット。
  16. 別々に調製した、バスタチンの治療量および以下の式のフェニル酢酸誘導体、それらの塩、それらの立体異性体、およびそれらの混合物の治療量を含む、被験体の神経膠腫の治療における、同時の、個々の、または継続使用のための組成物：
    Figure 0003628694
    ここで、
    R0＝アリール、フェノキシ、置換アリールまたは置換フェノキシであり；
    R1およびR2は、独立して、Ｈ、低級アルコキシ、ヒドロキシ、低級直鎖および分枝鎖アルキルまたはハロゲンであり；
    R3およびR4は、独立して、Ｈ、低級アルコキシ、低級直鎖および分枝鎖アルキルまたはハロゲンであり；そして
    ｎ＝０〜２の整数である。
  17. さらにユビキノンの治療量を含む、請求項16に記載の組成物。
  18. 前記フェニル酢酸誘導体が、フェニル酢酸ナトリウムである、請求項16に記載の組成物。
  19. 前記フェニル酢酸誘導体が、フェニル酪酸ナトリウムである、請求項16に記載の組成物。
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