JP3589696B2 - 多重拮抗逆転写酵素ポリメラ−ゼ連鎖反応を使用した 遺伝子の発現の定量的測定方法 - Google Patents
多重拮抗逆転写酵素ポリメラ−ゼ連鎖反応を使用した 遺伝子の発現の定量的測定方法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、逆転写並びにポリメラ−ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅の後の細胞のＲＮＡレベルを定量的に測定する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＰＣＲの技法は、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、及び第４，９６５，１８８号に一般的に記載されている。ＰＣＲの技法は、一般に、核酸分子内の核酸配列に含まれる任意所望の特定の核酸配列を増幅する過程を含む。ＰＣＲ法は、核酸の別々の相補的な系統（ｓｔｒａｉｎｓ）を、過剰量の２種のオリゴヌクレオチドプライマ−で処理する工程を含む。これらのプライマ−を伸長させて、相補的なプライマ−伸長生成物を形成し、このプライマ−伸長生成物を、所望の核酸配列を合成する際の鋳型として作用させる。
【０００３】
ＰＣＲの過程は、同時且つステップワイズに進行し、所望の回数だけ繰り返すことができるので、所望の核酸配列を高レベルまで増幅させることができる。ＰＣＲ法によれば、各ＤＮＡ系統上のプライマ−の間のＤＮＡ配列が、ＤＮＡ並びに選択されたサンプルの残りの部分の上で選択的に増幅される。ＰＣＲ法を用いることにより、ＤＮＡの所望の領域を特異的に増幅させることができる。
【０００４】
ＰＣＲによって得られる生成物の収量は、ある不特定数のサイクルに亘って指数的に増加するものの、理由は不明であるが、ある時点で反応が限定されるようになり、ＰＣＲ生成物が未知の割合で増加するようになる。その結果、同一のサンプルを同時に増幅した場合でも、増幅生成物の収量が６倍も異なることが報告されている（ギリランド（Ｇ．Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ）ら、米国科学アカデミ−紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ）８７：２７２５−２７２９、１９９０）。これらの刊行物を初めとする参考文献は、本発明の背景、そして場合によっては、本発明の実施方法を更に詳しく説明するために引用したものであり、本発明は、これらをすべて参考文献として包含するものである。
【０００５】
従って、ＰＣＲサイクルをある回数繰り返した後は、標的ＤＮＡの初期濃度を、外挿によって正確に決定することはできない。ＰＣＲを定量的に進行させる目的で、さまざまな研究者が、指数的増幅が進行することが分かっているサイクル数だけ増幅したサンプルの分析を行なってきた（ホリコシ（Ｔ．Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ）ら、癌研究（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）５２、１０８−１１６（１９９２）；ヌ−ナン（Ｋ．Ｅ．Ｎｏｏｎａｎ）ら、米国科学アカデミ−紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ）８７：７１６０−７１６４（１９９０）；マ−フィ−（Ｌ．Ｄ．Ｍｕｒｐｈｙ）ら、生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２９：１０３５１−１０３５６、１９９０；ケ−ル（Ｐ．Ｃ．Ｃａｒｒｅ）ら、臨床研究雑誌（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）８８、１８０２−１８１０（１９９１）；チェリ−（Ｊ．Ｃｈｅｌｌｙ）ら、欧州生化学雑誌（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）１８７：６９１−６９８（１９９０）；アブス（Ｓ．Ａｂｂｓ）ら、医学遺伝学雑誌（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ）２９：１９１−１９６（１９９２）；フェルドマン（Ａ．Ｍ．Ｆｅｌｄｍａｎ）ら、サ−キュレ−ション（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）８３：１８６６−１８７２（１９９１））。
【０００６】
こうした分析は一般に、ＰＣＲの早い段階、即ち、ＰＣＲ生成物の測定を、臭化エチディウムで染色したゲルを分光光度計やデンシトメ−タ−で分析することによってではなく、放射標識したプロ−ブ並びにオ−トラジオグラフィ−を使用することによって行なうことができる段階で行なわれたものである。放射能の使用は不便且つ高価であり、安全上の問題も生じる。また、指数的フェ−ズを各実験条件ごとに画定する必要があるので、更に時間や材料が必要となる。
【０００７】
拮抗（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ）ＰＣＲも開発されており、この方法では、ＰＣＲを単一塩基突然変異拮抗鋳型の存在下で行ない（ギリランド（Ｇ．Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ）ら、上掲；ベッカ−−アンドレ（Ｂｅｃｋｅｒ−Ａｎｄｒｅ）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）１７：９４３７−９４４６（１９８９））、既知量の拮抗鋳型を未知量の標的配列と共に増幅する。拮抗鋳型は、標的配列と同一である配列で（単一塩基突然変異、あるいは、配列の一部の欠失の場合を除く）、増幅に当たって標的ｃＤＮＡ（相補性ＤＮＡ）と同じプライマ−を使用し、標的ｃＤＮＡと同じ効率で増幅する。スタ−ト時の標的／標準の比は、全増幅の過程を通じて保持され、指数フェ−ズが終了した後についても、この比が保たれる。
【０００８】
拮抗ＰＣＲは、シ−バ−ト（Ｐ．Ｄ．Ｓｉｅｂｅｒｔ）ら、ネイチャ−（Ｎａｔｕｒｅ）３５９：５５７−５５８（１９９２）；シ−バ−ト（Ｐ．Ｄ．Ｓｉｅｂｅｒｔ）ら、バイオ技術（Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）１４：２４４−２４９（１９９３）；及び、クロンテック・ブロ−シャ−（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｂｒｏｃｈｕｒｅ）、１９９３、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）の中で一般に論じられている。しかし、拮抗ＰＣＲ単独では、スタ−ト時の鋳型の量のばらつきを適切に制御することができない。サンプルの劣化やピペット時の誤差によって、こうしたばらつきは容易に生じる。
【０００９】
ノ−ザン分析を使用して遺伝子の発現を測定する場合には、同一ブロットを、標的遺伝子と組織サンプル間でばらつきがあったり、刺激に応答して変化したりすることがないとされるハウスキ−ピング遺伝子の両方についてプロ−ブすることによって、こうした問題を解決することができる。ハウスキ−ピング遺伝子は、標的遺伝子の相対的な発現を測定する際の分母として作用するのである。
【００１０】
この考え方を応用する目的で、他の研究者は、ＰＣＲによる増幅を別々の試験管内で行なった。しかし、これらの２種の遺伝子を別々の試験管内で増幅すると、試験管ごとの増幅条件のばらつきやピペット時の誤差を避けることができない。上掲のヌ−ナン（Ｋ．Ｅ．Ｎｏｏｎａｎ）らには、標的遺伝子とハウスキ−ピング遺伝子を同一の試験管内で増幅する非拮抗多重ＰＣＲも記載されているが、この方法は、増幅物ごとの指数範囲を決定するのに標準曲線を作成する必要があるので好都合とは言い難い。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
従って、上述の欠点をいずれも有さず、標準的な訓練を受けた技術者が実施することのできる、遺伝子の発現の定量的な測定方法が必要とされている。本発明は、任意のＰＣＲ法と共に使用することができ、単純且つ簡単に実施することのできる技法を提供することによって、当業界のかかる必要性に答えることを課題とするものである。本発明は、ＤＮＡ分析やＰＣＲ技法に対するこれまでに発表されているアプロ−チを大幅に改善するものである。
【００１２】
即ち、本発明の目的は、遺伝子の発現を定量的に測定する優れた方法を提供することにある。
本発明の別の目的は、商業的に実施するのに適した、ＰＣＲに基づく遺伝子の発現の定量的な測定方法を提供することにある。
こうした目的を始めとする本発明の種々の目的、並びに、本発明の種々の特徴やそれに付随する利点は、以下の詳細な記載を添付図面と関連づけて読むことによって一層よく理解されるはずである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明に係る方法は、ＰＣＲによる増幅方法を改善したもので、「標的遺伝子」、「ハウスキ−ピング遺伝子」、並びに、これらの各遺伝子と拮抗する鋳型を同時に増幅させるものである。本発明における「標的ＤＮＡ配列」並びに「標的遺伝子」という用語は、その遺伝子あるいはＤＮＡ配列を選択的に増幅することを意図されている目標遺伝子のことを総称するものである。
【００１４】
「ハウスキ−ピング遺伝子」という用語は、ＰＣＲの反応一回当りのＲＮＡの量の内部標準として適当な遺伝子のことを意味する。総論として、本発明で最も重要なのは、標的遺伝子に対するプライマ−、ハウスキ−ピング遺伝子に対するプライマ−、そして標的遺伝子並びにハウスキ−ピング遺伝子の突然変異生成物から成る２種の内部標準突然変異拮抗鋳型に対するプライマ−を同時に使用することである。これらの突然変異拮抗鋳型における突然変異は、点突然変異、挿入、欠失などであってよい。
【００１５】
広義には、本発明は、ｃＤＮＡ分子の異種混合物中に存在する所定のｃＤＮＡ分子の特定の領域内の標的ＤＮＡ配列の量を定量する方法に関する。２種以上の標的遺伝子及び／又は２種以上のハウスキ−ピング遺伝子を使用することもできるが、こうした追加の標的遺伝子及び／又はハウスキ−ピング遺伝子を定量する場合には、この追加分の標的遺伝子及び／又はハウスキ−ピング遺伝子の突然変異生成物である内部標準突然変異拮抗鋳型を更に使用することが必要になると理解されたい。
【００１６】
また、突然変異拮抗鋳型は、標的配列に対応するヌクレオチドに対して突然変異を生じたヌクレオチドを少なくとも１個有するものであると理解されたい。なお、本発明を成功裡に実施する上で要求されることは、ハウスキ−ピング遺伝子の配列に対応するヌクレオチドと相補的なヌクレオチド１個のみが突然変異を生じていることである。しかし、もっと長い欠失、挿入、あるいは変異も本発明において有用であると考えられる。
【００１７】
標的遺伝子のプライマ−（標的遺伝子の天然型鋳型と突然変異拮抗鋳型の両方に対するプライマ−の役目を果たす）、ハウスキ−ピング遺伝子のプライマ−（ハウスキ−ピング遺伝子の天然型鋳型と突然変異拮抗鋳型の両方に対するプライマ−の役目を果たす）、標的遺伝子の突然変異拮抗鋳型、並びにハウスキ−ピング遺伝子の突然変異拮抗鋳型を、標的遺伝子並びにハウスキ−ピング遺伝子の双方のＤＮＡを含む天然ｃＤＮＡと共に、ＰＣＲで増幅する。
【００１８】
このＰＣＲの過程で、ｃＤＮＡ生成物として、１）標的遺伝子及びハウスキ−ピング遺伝子の天然型ｃＤＮＡ、並びに、２）標的遺伝子及びハウスキ−ピング遺伝子の突然変異型拮抗鋳型が得られる。このｃＤＮＡ生成物を、ｃＤＮＡ生成物の単離に適した方法を使用することによって単離する。標的遺伝子をコピ−する天然型ｃＤＮＡの量、並びに、標的遺伝子の突然変異拮抗鋳型をコ−ドする突然変異型ｃＤＮＡの量を、ハウスキ−ピング遺伝子をコ−ドする天然型ｃＤＮＡの量、並びに、ハウスキ−ピング遺伝子の突然変異拮抗鋳型をコ−ドする突然変異型ｃＤＮＡの量と比較して測定することによって、天然型ｃＤＮＡ生成物と突然変異型ｃＤＮＡ生成物の相対的な存在量を決定する。
【００１９】
本発明の別の観点は、標的ＤＮＡ配列の量を決定する際にＰＣＲ法で使用する新規な核酸プライマ−分子に関する。
本発明では、「サンプル」という用語は、植物、個体、あるいはイン・ビトロの細胞培養の成分から単離した組織、あるいは、液体のサンプルのことを一般に指称するものである。
【００２０】
プライマ−、核酸、及び、オリゴヌクレオチドという用語は、ポリリボヌクレオチド及びポリデオキシリボヌクレオチドのことを指称するものであり、これらの用語のいずれを使用するかによって配列の長さを区別する意図はなく、これらの用語は、分子の一次構造を説明するものであると理解されたい。これらの用語には、二本鎖及び一本鎖ＲＮＡ、並びに、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡが包含される。これらのオリゴヌクレオチドは、任意の現存の、即ち、天然の配列から誘導することができ、任意の方法で生成することができる。
【００２１】
また、オリゴヌクレオチドは化学合成、逆転写、ＤＮＡ複製、並びに、これらの生成法の組み合わせによって生成することもできると理解されたい。「プライマ−」という用語は、条件がプライマ−伸長生成物の合成に適している場合に、相補的な鎖に沿った合成の開始地点として作用し得るオリゴヌクレオチドのことを一般に指称するものである。合成条件としては、４種の各デオキシリボヌクレオチド３燐酸、並びに、少なくとも１種の重合誘導剤、例えば逆転写酵素、あるいは、ＤＮＡポリメラ−ゼが存在することが挙げられる。
【００２２】
これらの各反応物質は、適当な緩衝液中に存在させ、この緩衝液は、補因子である成分、あるいは、種々の適当な温度下でのｐＨ等の条件に影響を及ぼす成分を含有することもできる。プライマ−は一本鎖の配列として増幅効率を最適化するのが好ましいものの、本発明で二本鎖配列を用いることも可能であると理解されたい。
【００２３】
「標的遺伝子」、「配列」、あるいは「標的核酸配列」という用語は、オリゴヌクレオチド中の増幅、及び／又は、検出せんとする領域のことを意味する。標的配列は、増幅過程で使用されるプライマ−配列の間に位置していると理解されたい。
【００２４】
本発明の一実施態様では、遺伝子の定量的な発現を、ａ）少なくとも１種の目標とする標的遺伝子、及び、少なくとも１種のハウスキ−ピング遺伝子のｃＤＮＡ、並びに、ｂ）目標とする標的遺伝子及びハウスキ−ピング遺伝子のｃＤＮＡが、制限エンドヌクレア−ゼ認識部位の欠失、あるいは、創出を生じるような塩基突然変異を生じた生成物である内部標準突然変異拮抗鋳型を、多重拮抗ＰＣＲで増幅することによって測定する。
【００２５】
本発明の別の実施態様の方法は、ａ）少なくとも１種の目標とする標的遺伝子、及び、少なくとも１種のハウスキ−ピング遺伝子のｃＤＮＡ、並びに、ｂ）制限酵素で切断されるべき長さに予め人為的に短縮された目標とする標的遺伝子、及び、ハウスキ−ピング遺伝子の配列を有する突然変異拮抗鋳型を、ＰＣＲで増幅する工程から成る。これらの短縮された配列は、ＰＣＲによる増幅で使用する標的遺伝子、並びに、ハウスキ−ピング遺伝子のプライマ−の両方と相同な各配列を保持している。
【００２６】
サンプル細胞あるいは組織から抽出したＲＮＡを逆転写する。ｃＤＮＡの連続希釈液を、標的遺伝子、及び、ハウスキ−ピング遺伝子と相同な各オリゴヌクレオチド、並びに、定量済みの内部標準突然変異拮抗鋳型の存在下でＰＣＲによって増幅する。増幅したＤＮＡを、制限エンドヌクレア−ゼで消化し、エチジウムブロマイドで染色したアガロ−スゲル上で電気泳動を行ない、天然型生成物を突然変異型生成物から分離する。デンシトメトリ−を行なって、各バンドを定量する。
【００２７】
標的遺伝子のハウスキ−ピング遺伝子に対する相対的な発現を測定するこの技法は、同一の内部標準マスタ−混合物、並びに、希釈液を用いて実施した実験に関しては、正確で再現性がある。相対的な遺伝子の発現の比の平均値からの変異は、２５％以内である。この技法は、遺伝子の発現の変化を測定するのに有用である。この方法は、調べるサンプルの量が限られていたり、遺伝子の発現レベルが低かったりする場合に特に有用である。
【００２８】
【実施例】
以下本発明の好適な実施例につき説明する。
長年に亘って、遺伝子の発現は、ＲＮＡをノ−ザン法、あるいは、ドットブロット検定で定量することによって測定されてきた。こうした技法では、各測定について、ＲＮＡの量として１０５ 個以上の細胞から得られる量が必要とされる。生検では、組織学的診断に必要な数の細胞しか得られないことも多く、こうした場合、細胞の数は１０５ 個にはるかに満たない。最近開発されたＰＣＲ法では、細胞１００個程度のレベルのＲＮＡでも測定が可能である。しかし、今日までに発表されている技法では、定性的な測定しか行なうことができず、定量的な測定は行なうことができなかった。
【００２９】
本発明は、多重拮抗逆転写酵素ポリメラ−ゼ連鎖反応による増幅を使用して、遺伝子発現の定量的な測定を簡素化し、改善する方法に関するものである。サンプルから抽出したＤＮＡを逆転写し、次に、ハウスキ−ピング遺伝子と目的とする標的遺伝子の双方のプライマ−の存在下でＰＣＲによって増幅する。
【００３０】
遺伝子の発現は、一種以上の標的遺伝子の量を、ハウスキ−ピング遺伝子の量と比較することによって測定する。本発明で使用することのできるハウスキ−ピング遺伝子としては種々のものがあり、例えば、ノ−ザン法で遺伝子の発現を検定する際に内部標準として使用されてきたハウスキ−ピング遺伝子、例えばＧＡＰＤＨ、β−アクチン、２８Ｓ ＲＮＡ、及び、１８Ｓ ＲＮＡ、及び、リボ核タンパク質（デヴロ−（Ｄｅｖｅｒｅａｕｘ）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）１２：３８７（１９８４）；バルブ−（Ｂａｒｂｕ）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）１７：７１１５（１９８９））を使用することができる。
【００３１】
本発明の一実施態様では、ハウスキ−ピング遺伝子中に存在する、既知の制限エンドヌクレア−ゼ認識部位を含む任意の配列、又は既知の制限エンドヌクレア−ゼ認識部位に対して１ないし２塩基対のミスマッチ（相違）を含む任意の配列と相同な合成オリゴヌクレオチドを使用することができる。こうした制限エンドヌクレア−ゼ認識部位を用いるのは、天然に生じている部位を非認識部位に突然変異させるか、ミスマッチ部位をマッチ部位に突然変異させるかして、いずれにしても、内部標準突然変異拮抗鋳型に適した突然変異配列を生成させるためである。
【００３２】
特定の別の遺伝子を分析するのに使用するハウスキ−ピング遺伝子中の特定の部位は、この別の遺伝子中に存在するマッチ部位並びにミスマッチ部位に応じて決まる。一つの決定要因は、ハウスキ−ピング遺伝子及び標的遺伝子から生成するＤＮＡ断片のサイズである。これらの断片は、ゲル電気泳動の際に十分に分離することが望ましい。
【００３３】
また、本発明では、ハウスキ−ピング遺伝子として用いる遺伝子に含まれる配列に対して相同な配列を含む全てのオリゴヌクレオチドを使用することができる。この種の相同な配列を使用して、セリ（Ｃｅｌｉ）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）２１：１０４７（１９９３）に記載された方法に従って、ハウスキ−ピング遺伝子に対する人為的に短縮した拮抗鋳型、即ち、予め人為的に、制限酵素で切断されるべき長さに短縮した突然変異拮抗鋳型を生成する
ことができる。
【００３４】
任意の既知の認識部位に対する１塩基対ないし２塩基対のミスマッチを有する配列を特定してマッチさせる際には、ジェネティクス・コンピュ−タ・グル−プ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）のソフトウェアパッケ−ジ内のマップ（Ｍａｐ）プログラムを使用することができる（デヴロ−（Ｄｅｖｅｒｅａｕｘ）ら、上掲）。各遺伝子についてのｃＤＮＡ配列が得られ、各遺伝子が、任意の既知の制限エンドヌクレア−ゼに対する１乃至２塩基のミスマッチを有する配列とのマッチの存在について評価される。本発明では、こうした認識配列のいずれか、あるいは、こうした認識配列と１ないし２塩基対のミスマッチを有する配列を含むすべての遺伝子を使用することが可能である。
【００３５】
本発明の多重拮抗ＰＣＲでは（突然変異標準の任意の所定のマスタ−混合物並びに希釈液について）、再現性のある標的遺伝子／ハウスキ−ピング遺伝子の比が得られる。ＲＮＡの量が増えると、「天然型生成物の量」対「出発ＲＮＡの合計量」の関係が線形のままで推移しなくなるので、増幅が反応を通じて指数的に推移していないことは明らかである（図３）。
【００３６】
しかし、各遺伝子に対する突然変異拮抗鋳型を使用すると、標準遺伝子／ハウスキ−ピング遺伝子の比は一定値に保たれる。この量的な結果は、各遺伝子について、「天然型／突然変異型鋳型の比」対「出発ＲＮＡの合計量」が線形の関係を有することによって示される（図４）。このことから突然変異拮抗鋳型の内部対照の有用性が示され、相対的な遺伝子発現量を増幅の指数フェ−ズ内のみで定量する必要がなくなる。
【００３７】
同一実験内の各サンプル間で比に再現性があるので、使用する希釈チュ−ブの数が少なくて済む。遺伝子の発現を測定するに当たっては、チュ−ブ１本のみ必要で、このチュ−ブ内ですべてのバンドを定量することができる。このことによって手順が簡素化され、一回に多くの異なったサンプルを評価することが可能となる。
【００３８】
本発明の一実施態様では、突然変異型生成物を天然型生成物から分離するのに使用する制限エンドヌクレア−ゼ認識部位を選択することができる。更に、制限エンドヌクレア−ゼで消化した後に生じるＰＣＲ生成物の最終的な長さも、考慮すべき要素である。特定の実施態様では、ポリアクリルアミドゲルよりはアガロ−スゲルを使用する方が好ましいものの、その際には、適切な分離を行なう上で、ＤＮＡ断片のサイズの差が大きいこと（約５０〜１００塩基対の差）が要求される。
【００３９】
本発明の方法は、標的遺伝子とハウスキ−ピング遺伝子の双方に対して同一の認識部位を使用することによって、更に簡素化が可能である。ＥｃｏＲＩ部位が適当であることが多い。本発明の特定の実施態様では、ＥｃｏＲＩ、あるいは、ＢａｍＨＩでの消化によって天然ＧＡＰＤＨから分離するＧＡＰＤＨ拮抗鋳型を作成した。しかし、もっと多くの遺伝子で用いることのできるＥｃｏＲＩ、あるいは、他の制限エンドヌクレア−ゼでの消化による分離もあり得ると理解されたい。
【００４０】
突然変異標準の相異なるマスタ−混合物、並びに、希釈液を使用して、ＢＥＰ２ＤのｃＤＮＡについて行なった研究では、標的／ハウスキ−ピング（ＧＳＨ−Ｐｘ／ＧＡＰＤＨ）遺伝子の発現の比に大きなばらつき（２００倍以下）が見られた。別々に逆転写を行なったサンプルでも同様の結果が得られたので、この工程で導入されたばらつきは小さいものである。
【００４１】
いずれの反応条件の差異も、突然変異拮抗鋳型の増幅と天然鋳型の増幅に同等に影響を及ぼすので、この両者の比は一定のまま保たれる。従って、このばらつきは、反応中の内部標準突然変異拮抗鋳型の量の差によって生じたものである可能性が高い。突然変異拮抗鋳型の濃度は極めて低く（フェンプトモル範囲）、反応中に存在する分子の数に何らかの変化があれば大きな誤差が生じてしまう。
【００４２】
本発明の方法は、内部標準突然変異拮抗鋳型の同一のマスタ−混合物を使用した各サンプル間で再現性があることによって示されるように、いずれの所定の研究でも正確である。従って、好適実施態様では、比較サンプルも、内部標準突然変異拮抗鋳型の同一のマスタ−混合物と同一の希釈液を使用して同時に調べるのが望ましい。
【００４３】
好適実施態様では、反応混合物は以下のものを含有する。ａ）ハウスキ−ピング遺伝子の突然変異拮抗鋳型、ｂ）目標とする標的遺伝子の突然変異拮抗鋳型、ｃ）ハウスキ−ピング遺伝子をＰＣＲで増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマ−、ｄ）目標とする標的遺伝子をＰＣＲで増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマ−、ｅ）反応緩衝液、及びｆ）試験サンプル由来のｃＤＮＡ。
【００４４】
また、各実験のＰＣＲ条件は、例えば、反応混合物１００μｌ当たり、１×ＰＣＲ緩衝液（例えば、５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣ１、１．５ｍＭＭｇＣｌ２）、標的遺伝子並びにハウスキ−ピング遺伝子をコ−ドするプライマ−（各２５ピコモル）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）、及び、一定量の各突然変異拮抗鋳型を含むマスタ−混合物を使用することによって標準化するのが好ましい。
【００４５】
増幅を行なう前に、反応液１００μｌ当たり、タック（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラ−ゼ（２．５単位）を加えておく。ＰＣＲによる増幅は、９４℃で１分、６０℃で１分、そして７２℃で１分、３５〜３８サイクルに亘って実施するか、あるいは、増幅する特定の領域に最適な条件で行なう。増幅の後、ＰＣＲ生成物を１０分加熱してから徐々に冷却して、なるべく多くのヘテロ二量体が形成されるようにするのが好適である。
【００４６】
ヒグチ（Ｈｉｇｕｃｈｉ）に従って突然変異を導入した拮抗鋳型を使用した反応に際しては、各ＰＣＲチュ−ブのサンプル（４０μｌ）を、制限エンドヌクレア−ゼで１２〜１６時間消化する。生成物をエチディウムブロマイドで染色した、３％ヌ−シ−ブ（Ｎｕｓｉｅｖｅ）、１％ＬＥアガロ−スのゲル上で、６０Ｖにて２〜３時間電気泳動にかける。ポラロイド（Ｐｏｌａｒｏｉｄ）６６５ポジ／ネガインスタントフィルムを使用して、ゲルのネガ写真を撮影する。
【００４７】
このネガ写真を、例えば、ザイネ−・ソフトレ−ザ−走査デンシトメ−タ−・モデルＳＬＲ２Ｄ／１Ｄ（Ｚｅｉｎｅｈ Ｓｏｆｔ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ Ｍｏｄｅｌ ＳＬＲ ２Ｄ／１Ｄ）で、ザイネ−１Ｄオ−トステップオ−バ−・ビデオフォレ−シス・プログラム・ソフトウェア（Ｚｅｉｎｅｈ １Ｄ Ａｕｔｏｓｔｅｐｏｖｅｒ Ｖｉｄｅｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（バイオメド・インストルメンツ（Ｂｉｏｍｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、米国カリフォルニア州フラ−トン（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ））を使用して、デンシトメトリ−に供する。
【００４８】
あるいは、染色ゲルを、デジタルカメラを使用して直接デンシトメトリ−で評価するか、自動配列決定用ゲル（例えばアプライド・バイオシステムス社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）より入手可能）で評価する。各曲線の下側の面積を計算し、定量に使用する。バンドの相対的なサイズ、並びにヘテロ二量体の形成に関して補正を行なう。結果を標的遺伝子対ハウスキ−ピング遺伝子の相対的な比として表す。
【００４９】
多重拮抗ＰＣＲを用いると、遺伝子の発現の優れた定量を簡便に行なうことができる。極めて少量の組織あるいは細胞のサンプルであっても、放射標識に頼ることなく、遺伝子の発現を定量することができる。その結果、多重逆転写ＰＣＲは費用が安くてすみ、放射標識より安全に使用することができる。結果は、突然変異内部標準拮抗鋳型の同一のマスタ−混合物、並びに、希釈液を使用した場合については再現性がある。
【００５０】
本発明の方法では、既知あるいは潜在的なハウスキ−ピング遺伝子（例えばＧＡＰＤＨ、β−アクチン、２８Ｓ ＲＮＡ、１８Ｓ ＲＮＡ、並びに、すべてのリボ核タンパク質遺伝子。但しこれらに限定されない。）のｃＤＮＡの核鎖と相同で、制限エンドヌクレア−ゼ認識部位配列を含むか、制限エンドヌクレア−ゼ認識配列に対して１ないし２塩基対のミスマッチを有する全てのオリゴヌクレオチドが、本発明を実施する上で有用であると理解されたい。このオリゴヌクレオチドは、定量的ＰＣＲで使用するハウスキ−ピング遺伝子の拮抗鋳型を調製する際に使用するものである。
【００５１】
また、本発明の方法では、既知あるいは潜在的なハウスキ−ピング遺伝子（例えばＧＡＰＤＨ、β−アクチン、２８Ｓ ＲＮＡ、１８Ｓ ＲＮＡ、並びにすべてのリボ核タンパク質遺伝子、但しこれらに限定されない）中の配列と相同な配列を含む全てのオリゴヌクレオチドが、人為的に短縮された拮抗鋳型を生成する上で有用であると理解されたい。このオリゴヌクレオチドは、本発明で使用するハウスキ−ピング遺伝子の拮抗鋳型を調製するのに使用するものである。
【００５２】
本発明の技法の用途としては、例えばａ）内視鏡による生検（ブラシあるいはピンセット）、針吸引、及び、骨髄生検によって得られた組織からの遺伝子の発現の評価、ｄ）遷移トランスフェクション分析におけるリポ−タ−遺伝子の発現の定量、並びに、ｃ）遺伝子治療後のトランスフェクトされた遺伝子の定量が考えられる。
【００５３】
モラレスら（Ｍ．Ｊ．Ｍｏｒａｌｅｓ及びＤ．Ｉ．Ｇｏｔｔｌｉｅｄ）（遷移トランスフェクション分析におけるレポ−タ−遺伝子の発現をポリメラ−ゼ連鎖反応に基づいて検出・定量する方法（Ａ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ
ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎａｓｓａｙｓ）、分析生化学（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２１０、１８８−１９４（１９９３）に記載された方法でもレポ−タ−遺伝子からの転写を測定することができるが、この方法では、分析で生じるＲＮＡの量の差に起因するばらつきを制御することはできない。
【００５４】
本発明の方法は、外在性のレポ−タ−遺伝子と内在性のハウスキ−ピング遺伝子、例えばトランスフェクトされた細胞由来のＧＡＰＤＨ ＲＮＡを同時に評価するのに更に有用である。
【００５５】
嚢胞性繊維症貫膜伝導調節遺伝子（ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ ｒｅｇｕｒａｔｏｒ ｇｅｎｅ ＣＦＴＲ）中の数多くの相異なる突然変異が疾患に付随していることが報告されているものの、疾患に付随する最も一般的な突然変異は、５０８の位置での３つの塩基の欠失である。最近述べられた方法（チャ−（Ｒ．Ｓ．Ｃｈａ、Ｈ．Ｚａｒｂｌ、Ｐ．Ｋｅｏｈａｖｏｎｇ、Ｗ．Ｇ．Ｔｈｉｌｌｙ）、マッチ増幅突然変異分析：ｃ−Ｈａｒａｓ遺伝子に対する適用（ｍａｔｃｈ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ（ＭＡＭＡ）：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｃ−Ｈａ ｒａｓ ｇｅｎｅ）、ＰＣＲの方法と応用（ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、２：１４−２０（１９９２））を使用すると、異常な５０８欠失遺伝子のみ、あるいは、正常なＣＦＴＲ遺伝子のみの増幅を生じるオリゴヌクレオチドプライマ−を調製することができる。
【００５６】
本発明の方法を使用すると、細胞１個当たりの外在性ＣＦＴＲ遺伝子の相対的な量を測定することができると考えられる。異常ＣＦＴＲの量を何等かの内部標準と比較することなしには、トランスフェクションの効率を定量することはできないはずである。サンプルはあまりに少量で、ＲＮＡをノ−ザン分析によって測定するのは無理である。
【００５７】
本発明の方法は、外在性の正常ジストロフィン遺伝子を、内在性の突然変異遺伝子の存在下で選択的に増幅するＰＣＲシステムを開発する上で有用である。ジストロフィンの場合、比較的大きな欠失の結果として疾患が生じる。数種の異なった欠失が報告されている。本発明の方法を用いると、トランスフェクトされた正常遺伝子を選択的に増幅する各種のＰＣＲシステムを開発することができ、そのいずれの場合についても、異常遺伝子と同様に構成的である。この増幅は、プライマ−を欠失領域に隣接して配置することによって行なうことができる。
また、本発明の方法では、２種以上の遺伝子の評価を同時に行なうこともできると理解されたい。
【００５８】
方法
ファルマシア（米国ニュ−ジャ−ジ−州、ピスキャッタウェ−（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ））から入手した精製デオキシリボヌクレオチドを希釈して、１０ｍＭの原液とした。組換えテルムス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）のＤＮＡポリメラ−ゼ（タックポリメラ−ゼ）、トリ骨髄芽球症ウィルス（ＡＭＶ）の逆転写酵素、及び、リボヌクレア−ゼ阻害剤（ＲＮａｓｉｎ）は、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（米国ウィスコンシン州、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ））から入手した。ＥｃｏＲＩ酵素は、ＵＳＢ（米国オハイオ州、クリ−ブランド）から入手した。
【００５９】
プライマ−は、アプライド・バイオ・システムズのモデル３９１ＰＣＲメ−トＥＰ ＴＭ合成装置（Ｍｏｄｅｌ ３９１ ＰＣＲ−Ｍａｔｅ ＥＰ ＴＭ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）で調製した。ＰＣＲは、パ−キンズ・エルマ−・セタス（Ｐｅｒｋｉｎｓ，Ｅｌｍｅｒ，Ｃｅｔｕｓ）のＤＮＡサ−マル・サイクラ−４８０（ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０）を用いて行なった。使用した他の緩衝液並びに溶液は、種々のソ−スから入手し、分子生物学用の等級のものを使用した。
【００６０】
研究は、ヒトパピロ−マウィルスで不死化したヒト気管支上皮細胞系（ＢＥＰ２Ｄ）（ウィリ−（Ｗｉｌｌｅｙ）ら、癌研究（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）５１：５３７０−５３７７、１９９０）を用いて行なった。
【００６１】
ＲＮＡの単離は以下のようにして実施した。ＲＮＡの単離はチョムクジンスキ−ら（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ及びＳａｃｃｈｉ）、分析生化学（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１６２、１５６−１５９、１９８７）に記載された方法によって行なった。ＢＥＰ２Ｄ細胞系の入ったフラスコから、培養液を取り出した。直ちに、ＧＩＴ（４．０Ｍチオシアン酸グアニジニウム、０．１ＭトリスＣ１（ｐＨ７．５）、１％β−メルカプトエタノ−ル）緩衝液を細胞上に注いだ（約５００μｌ／ＢＥＰ２Ｄ細胞５００〜１０００万個）。
【００６２】
次に、溶解した細胞の入った各５００μｌのＧＩＴ緩衝液を、１．５ｍｌの微量遠心分離管に移した。各微量遠心分離管に５０μｌの２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４、５００μｌ）の水で飽和させたフェノ−ル、そして１００ｍｌのクロロホルム−イソアミルアルコ−ル混合物（４９：１）を順次加えた。微量遠心分離管を十分に振とうし、氷上に１５分間載置し、１４，０００ＲＰＭにて２０分間４℃で微量遠心分離を行なった。各遠心分離管の水性層を、新たな微量遠心分離管に移し、上記抽出過程を繰り返した。
【００６３】
再度、各遠心分離管の水性層を、新たな微量遠心分離管にイソプロパノ−ル（５００μｌ）と共に移し、−７０℃に１５分間保った。次に、この微量遠心分離管を、１４，０００ＲＰＭにて２０分間４℃で微量遠心分離した。ＲＮＡを７０％エタノ−ルで２回洗浄し、減圧下で乾燥した。ＲＮＡを０．１％のジエチルピロカ−ボネ−ト（ＤＥＰＣ）で処理したＨ２ Ｏに吸収させ、分光光度計（ギルフォ−ド機器（Ｇｉｌｆｏｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）の分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）２６０）で定量した。
【００６４】
逆転写は、以下のようにして実施した。抽出したＲＮＡを、滅菌した微量遠心分離管に入れた。１μｇのＲＮＡのそれぞれに、０．２ｍｇのオリゴｄＴを加えた。このものを６５℃で５分間加熱し、氷の上に１分間載置し、２μｌの１ｍＭｄＮＴＰ、２μｌの逆転写酵素（ＲＴ）緩衝液（５００ｍＭトリス、４００ｍＭＫＣ１、および８０ｍＭ ＭｇＣ１２ ）、０．５μｌのＲＮａｓｉｎ、及び、１μｌのＡＭＶ逆転写酵素（９，５００単位／ミリリットル）を加えた。このものを４２℃にて１時間インキュベ−トし、８０℃に１０分間加熱して反応を停止させた。得られたｃＤＮＡを、−２０℃にて保存した。
【００６５】
プライマ−並びに突然変異内部標準拮抗鋳型の調製は、以下のようにして実施した。理想配列は、オリゴ−ＴＭプライマ−分析ソフトウェア（Ｏｌｉｇｏ−ＴＭ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（ナショナル・バイオサイエンシズ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、米国ミネソタ州ハメル（Ｈａｍｅｌ））を使用して同定した。プライマ−は、アプライド・バイオ・システムズのモデル３９１ＰＣＲメ−トＤＮＡ合成装置を使用して調製した。プライマ−の配列は以下の通りである。
【００６６】
グルタチオンペルオキシダ−ゼ（ＧＳＨ−Ｐｘ）（チャダ（Ｃｈａｄａ）ら、ジェノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）６：２６８−２７１、１９９０）
天然鋳型並びに突然変異鋳型の双方を増幅するに当たって使用した「外側」のプライマ−からは、長さが３５４塩基対の生成物が生じる。
【００６７】
「外側」の鋳型は、
配列番号１（チャダ（Ｃｈａｄａ）ら、ジェノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）６：２６８−２７１、１９９０）
Ｐｏｓ．２４１ ５’−ＧＧＧＣＣＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＴＣＧＧＣＴ−３’（コ−ド配列）（クロ−ニングされた配列の２４１−２６１の塩基に対応する）、並びに、
配列番号２（チャダ（Ｃｈａｄａ）ら、ジェノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）６：２６８−２７１、１９９０）
Ｐｏｓ．５７４ ５’−ＣＡＡＴＧＧＴＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＣＧＧＣ−３’（アンチコ−ドセンス）（５７４−５９４の塩基とアニ−リングする）
である。
【００６８】
突然変異内部標準を合成するのに使用する「内側」のプライマ−は、天然のｃＤＮＡ塩基対（下線を施したもの）を変化させることによって、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレア−ゼ認識部位（ＧＡＡＴＴＣ）を除去する。
【００６９】
この「内側」のプライマ−は、
配列番号３（チャダ（Ｃｈａｄａ）ら、ジェノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）６：２６８−２７１、１９９０）
Ｐｏｓ．３０９ ５’−ＡＴＴＣＴ ＧＡＴＴＴＣ ＣＣＴＣＡＡＧＴＡＣＧＴＣＣＧＧＣＣＴ−３’（コ−ドセンス）、並びに、
配列番号４（チャダ（Ｃｈａｄａ）ら、ジェノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）６：２６８−２７１、１９９０）
Ｐｏｓ．３０９ ３’−ＴＡＡＧＡ ＣＴＡＡＡＧ ＧＧＡＧＴＴＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＧＧＡ−５’（アンチコ−ドセンス）
である。
【００７０】
双方のプライマ−とも、クロ−ニングされた配列の３０９−３３８の塩基に対応する。突然変異は、センス鎖の３１６の位置に位置する天然のＡがＴによって置換されることによって生じるものである。天然ＧＳＨ−Ｐｘを制限エンドヌクレア−ゼで消化すると、２８０並びに７４塩基対の生成物が生じる。
【００７１】
グリセルアルデヒド３燐酸デヒドロゲナ−ゼ（ＧＡＰＤＨ）（ツォ−（Ｔｓｏ）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）１３：２４８５−２５０２、１９８５）
天然鋳型並びに突然変異鋳型の双方を増幅するに当たって使用した「外側」のプライマ−からは、長さが７８８あるいは７９０塩基対の生成物が生じる。
【００７２】
この「外側」の鋳型は、
配列番号５（ツォ−（Ｔｓｏ）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．）１３：２４８５−２５０２、１９８５）
Ｐｏｓ．４６ ５’−ＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣＧ−３’（コ−ドセンス）（クロ−ニングされた配列の９−３２の塩基に対応する）、並びに、
配列番号６（ツォ−（Ｔｓｏ）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．）１３：２４８５−２５０２、１９８５）
Ｐｏｓ．８１２ ５’−ＣＣＴＣＣＧＡＣＧＣＣＴＧＣＴＴＣＡＣＣＡＣ−３’（アンチコ−ドセンス）（７７７−７９８の塩基とアニ−リングする）
である。
【００７３】
突然変異拮抗鋳型を合成するのに使用する「内側」のプライマ−は、天然のｃＤＮＡ塩基対１つ（下線を施したもの）を変化させることによって、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレア−ゼ認識部位（ＧＡＡＴＴＣ）を創出する。
【００７４】
この「内側」のプライマ−は、
配列番号７（ツォ−（Ｔｓｏ）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．）１３：２４８５−２５０２、１９８５）
Ｐｏｓ．２３４ ５’−ＴＧＡＴＣＡＡＴＧ ＧＡＡＴＴＣ ＣＣＡＴＣＡＣＣＡ−３’（コ−ドセンス）、並びに
配列番号８（ツォ−（Ｔｓｏ）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．）１３：２４８５−２５０２、１９８５）
Ｐｏｓ．２３４ ３’−ＡＣＴＡＧＴＴＡＣ ＣＴＴＡＡＧ ＧＧＴＡＧＴＧＧＴ−５’（アンチコ−ドセンス）
である。
【００７５】
双方のプライマ−とも、クロ−ニングされた配列の１９９−２２２の塩基に対する。突然変異は、センス鎖の２１１の位置に位置する天然のＡがＴによって置換されることによって生じるものである。突然変異ＧＡＰＤＨを制限エンドヌクレア−ゼで消化すると、５８８並びに２００塩基対の生成物が生じる。
【００７６】
別の突然変異ＧＡＰＤＨ鋳型を使用して、いくつかの実験を行なった。この鋳型には、新規なＢａｍＨＩ制限部位が導入されている。
天然鋳型並びに突然変異拮抗鋳型の双方を増幅するに当たって使用した「外側」のプライマ−からは、長さが６３４塩基対の生成物が生じる。
【００７７】
この「外側」の鋳型は、
配列番号９（ツォ−（Ｔｓｏ）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．）１３：２４８５−２５０２、１９８５）
Ｐｏｓ．２００ ５’−ＣＡＴＧＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＣ−３’（コ−ドセンス）（クロ−ニングされた配列の１６５−１８８の塩基に対応する）、並びに、
配列番号１０（ツォ−（Ｔｓｏ）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．）１３：２４８５−２５０２、１９８５）
Ｐｏｓ．８１３ ５’−ＣＣＴＣＣＧＡＣＧＣＣＴＧＣＴＴＣＡＣＣＡＣ−３’（アンチコ−ドセンス）（７７７−７９８の塩基とアニ−リングする）
である。
【００７８】
突然変異拮抗鋳型を合成するのに使用する「内側」のプライマ−は、天然のｃＤＮＡ塩基対１つ（下線を施したもの）を変化させることによって、ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレア−ゼ認識部位（ＧＧＡＴＴＣ）を創出する。
【００７９】
この「内側」のプライマ−は、
配列番号１１（ツォ−（Ｔｓｏ）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．）１３：２４８５−２５０２、１９８５）
Ｐｏｓ．３６８ ５’−ＣＡＧＧＧＧ ＧＧＡＴＣＣ ＡＡＡＡＧＧＧＴＣＡＴＣＡＴ−３’（コ−ドセンス）、並びに、
配列番号１２（ツォ−（Ｔｓｏ）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．）１３：２４８５−２５０２、１９８５）
Ｐｏｓ．３６８ ３’−ＧＴＣＣＣＣ ＣＣＴＡＧＧ ＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＡＧＴＡ−５’（アンチコ−ドセンス）
である。
【００８０】
双方のプライマ−とも、クロ−ニングされた配列の３３３−３５８の塩基に対応する。突然変異は、センス鎖の３４２の位置に位置する天然のＧがＴによって置換されることによって生じるものである。突然変異ＧＡＰＤＨを制限エンドヌクレア−ゼで消化すると、４６０塩基対並びに１７４塩基対の生成物が生じる。
【００８１】
突然変異拮抗鋳型は、ヒグチ（Ｈｉｇｕｃｈｉ）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）１６：７３５１７３６７、１９８８に記載され、部位特異的突然変異誘発によって調製した。単一塩基が突然変異を生じた結果、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレア−ゼ認識部位が創出（ＧＡＰＤＨ）あるいは欠失（ＧＳＨ−Ｐｘ）した。（ＢａｍＨＩ部位を導入した突然変異ＧＡＰＤＨを使用した実験も行なった。）。突然変異生成物のそれぞれについて、「外側」のプライマ−と「内側」の単一塩基ミスマッチプライマ−を使用した２種の初期ポリメラ−ゼ連鎖反応を行なうと、２種の重複したＤＮＡ断片が生じる。（ＧＳＨ−Ｐｘについてはプライマ−１及び４、並びに、２及び３、そしてＧＡＰＤＨについてはプライマ−５及び８、並びに、６及び７。）
【００８２】
この重複ＤＮＡ断片を、臭化エチディウムで染色した３％ヌ−シ−ヴ（Ｎｕｓｉｅｖｅ）、１％ＬＥアガロ−スゲルで電気泳動にかけた。バンドを切り出し、ミリポア ウルトラフリ−−ＭＣ０．４５μＭフィルタ−（日本ミリポア工業株式会社、米沢）を使用して精製した。精製したＤＮＡをエタノ−ルで沈殿させ、洗浄し、減圧下で乾燥させて、１００μｌの滅菌Ｈ２ Ｏに吸収させた。２種の各重複ＤＮＡ断片１μｌを、外側のプライマ−のみを使用してＰＣＲで増幅した。最初のＰＣＲサイクルはプライマ−を用いずに実施し、ヘテロ二量体を形成させた。全突然変異生成物を、こうして形成し、増幅した。
【００８３】
突然変異ＰＣＲ生成物を、上記のようにしてゲルで精製し、再度増幅して、バルク生成物を形成した。そしてバルク生成物をゲルで精製して、分光光度計で測定した。突然変異生成物をアットモル範囲まで希釈して拮抗鋳型として使用した。１μｇ／ｍｌのニシン精子ＤＮＡ（ロフストランド（Ｌｏｆｔｓｔｒａｎｄ）、米国メリ−ランド州、ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ））を担体として使用した。各突然変異鋳型のサンプルを、制限エンドヌクレア−ゼで消化して、コンタミネ−ションを確実に防止した。
【００８４】
ＰＣＲの条件は以下の通りとした。ＰＣＲの条件は、各実験について、反応混合物１００μｌ当たり、１×ＰＣＲ緩衝液（５０ｍＭのＫＣ１、１０ｍＭのトリス−ＨＣ１（ｐＨ９．０）、１．５ｍＭのＭｇＣ１２ ）、２５ピコモルのＧＳＨ−Ｐｘ及びＧＡＰＤＨをコ−ドするプライマ−、０．２ｍＭのｄＮＴＰ（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）、並びに、一定量の双方の内部標準を含有するマスタ−混合物を使用することによって標準化した。増幅の前に、１００μｌの反応混合物について２．５単位のタックＤＮＡポリメラ−ゼを加えた。ＢＥＰ２Ｄ細胞系から得たｃＤＮＡを連続希釈し、サンプルＰＣＲの試験管に加えた。いずれの実験でも、鋳型を含まず、天然のｃＤＮＡのみ、あるいは突然変異型の標準のみを含む対照用の試験管を増幅して、コンタミネ−ションあるいは酵素の消化が完全に進行しているかどうかについてチェックした。
【００８５】
ＰＣＲによる増幅を、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間、３５サイクルに亘って実施した。増幅の後、ＰＣＲ生成物を１０分間加熱して、ヘテロ二量体の形成が最大となるようにした。
【００８６】
生成物の定量は以下のようにして実施した。各ＰＣＲ試験管のサンプル（４０μｌ）を、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレア−ゼで１２〜１６時間に亘って消化した。（新規なＢａｍＨＩ制限部位を有する突然変異ＧＡＰＤＨを使用して実施した実験も、ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレア−ゼで４〜５時間に亘って消化した。）。これらの生成物を、臭化エチディウムで染色した３％ヌ−シ−ヴ（Ｎｕｓｉｅｖｅ）、１％ＬＥアガロ−スゲルで、６０Ｖにて２〜３時間電気泳動を行なうことによって単離した。ポラロイド（Ｐｏｌａｒｏｉｄ）６６５ポジ／ネガインスタントフィルムを使用して、ゲルのネガ写真を撮影した。
【００８７】
ネガ写真をデンシトメトリ−で調べた（ザイネ−・ソフト・レ−ザ−・走査型デンシトメ−タ−・モデルＳＬＲ ２Ｄ／１Ｄ（Ｚｅｉｎｅｈ Ｓｏｆｔ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ Ｍｏｄｅｌ ＳＬＲ
２Ｄ／１Ｄ）でザイネ−１Ｄ・オ−トステップオ−バ−・ビデオフォレ−シス・プログラム・ソフトウェア−（Ｚｅｉｎｅｈ １Ｄ ＡｕｔｏｓｔｅｐｏｖｅｒＶｉｄｅｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用。米国カリフォルニア州フラ−トン（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ）、バイオメッド・インストルメンツ（Ｂｉｏｍｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））。各曲線の下側の面積を計算し、定量に使用した。相対的なバンドのサイズ、並びに、ヘテロ二量体の形成に関して、補正を行なった。デ−タは、ＧＳＨ−Ｐｘ対ＧＡＰＤＨの相対的な比として表した。
【００８８】
２つめの一連の実験では、セリ（Ｃｅｌｉ）の方法に従って調製した拮抗鋳型を用いた多重拮抗逆転写酵素ポリメラ−ゼ連鎖反応（ＭＣ ＲＴ−ＰＣＲ）を実施して、β−ナフトフラボンに暴露したＢＥＰ２Ｄ細胞中のシトクロムｐ４５０（ＣＹＰ）ＩＡＩ遺伝子を評価した。ＣＹＰＩＡＩ遺伝子の発現の誘導は、セリ（Ｃｅｌｉ）の拮抗鋳型を用いたＭＣＲＴ−ＰＣＲとノ−ザン分析の双方を使用して評価した。
【００８９】
拮抗鋳型は、ＣＹＰＩＡＩ遺伝子とＧＡＰＤＨ遺伝子の双方に対して調製したＧＡＰＤＨに対する拮抗鋳型を調製するのに使用したプライマ−は、 配列番号１３（トクナガ（Ｔｏｋｕｎａｇａ）ら、癌研究（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）４７：５６１６−５６１９、１９９０）
Ｐｏｓ．７５ ５’−ＧＧＴ ＣＧＧ ＡＧＴ ＣＡＡ ＣＧＧ ＡＴＴ ＴＧＧ ＴＣＧ−３’Ｐｏｓ．９４、並びに、
配列番号１４（トクナガ（Ｔｏｋｕｎａｇａ）ら、癌研究（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）４７：５６１６−５６１９、１９９０）
【化１】
であった。
【００９０】
拮抗鋳型と天然鋳型の双方を増幅するために、配列番号１３と共に使用した低位の外側プライマ−は、
配列番号１５（トクナガ（Ｔｏｋｕｎａｇａ）ら、癌研究（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）４７：５６１６−５６１９、１９９０）
Ｐｏｓ．８４２ ５’−ＣＣＴ ＣＣＧ ＡＣＧ ＣＣＴ ＧＣＴ ＴＣＡ
ＣＣ−３’Ｐｏｓ．８２２
であった。
【００９１】
ＣＹＰＩＡＩに対する拮抗鋳型を調製するのに使用したプライマ−は、
配列番号１６（ジェイスワル（Ｊａｉｓｗａｌ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２２８：８０−８３、１９８９）
Ｐｏｓ．１２４１ ５’−ＣＡＴ ＣＣＣ ＣＣＡ ＣＡＧ ＣＡＣ ＡＡＣ ＡＡＧ−３’Ｐｏｓ．１２６２、並びに、
配列番号１７（ジェイスワル（Ｊａｉｓｗａｌ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２２８：８０−８３、１９８９）
【化２】
であった。
【００９２】
拮抗鋳型と天然鋳型の双方を増幅するために、配列番号１６と共に使用した低位の外側プライマ−は、
配列番号１８（ジェイスワル（Ｊａｉｓｗａｌ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２２８：８０−８３、１９８９）
Ｐｏｓ．１５７５ ５’−ＡＣＡ ＧＣＡ ＧＧＣ ＡＴＧ ＣＴＴ ＣＡＴ
ＧＧ−３’Ｐｏｓ．１５５５
であった。
【００９３】
ＰＣＲによる増幅に際しての条件は、アニ−リング温度を５５℃とし、増幅を３８サイクルに亘って行なった以外は、ヒグチ（Ｈｉｇｕｃｈｉ）法によってＧＡＰＤＨ及びＧＳＨ−Ｐｘに対して調製した拮抗鋳型を使用した実験について記載したのと同一とした。
前もって制限エンドヌクレア−ゼで消化しておかなくても、天然鋳型と拮抗鋳型が分離するので、サンプルはＰＣＲ反応管から直接取り出して、臭化エチディウムで染色した３％ヌ−シ−ヴ（Ｎｕｓｉｅｖｅ）、１％ＬＥアガロ−スゲルに加えた。ポラロイド６６５ポジ／ネガインスタントフィルムを使用して、ゲルのネガ写真を撮影し、このネガ写真をデンシトメ−タ−で解析することによって、生成物を定量することができた。
【００９４】
β−ナフトフラボン（１０μＭ）と共に各種の時間に亘ってインキュベ−トしたＢＥＰ２Ｄ細胞から採取したＲＮＡは、１％ＬＥホルムアルデヒド変性用ゲルで電気泳動を行なってノ−ザン分析を行なうか、上述のようにＭＣ ＲＴ−ＰＣＲで増幅した。ノ−ザン分析に際しては、ＲＮＡをジ−ンスクリ−ン（Ｇｅｎｅ Ｓｃｒｅｅｎ）に移した後、フィルタ−を32ＰでラベルしたＣＹＰＩＡＩ ｃＤＮＡとハイブリダイズした。
【００９５】
結果
ＰＣＲによる定量に使用した手順を図１に図式的に示す。ＢＥＰ２ＤのｃＤＮＡの連続希釈液（ＲＮＡ合計量で０．２５μｇから０．０５μｇ）を、それぞれ一定量の単一塩基突然変異内部標準（各１０アットモル）と共に増幅してから、上述したようにして分析に供した。図２に示すゲルのネガ写真をデンシトメトリ−で分析して、各バンドを定量した。
【００９６】
各曲線の下側の面積を使用して、天然型生成物／突然変異型生成物の相対的な比を計算した。相対的なバンドのサイズに関して補正を行なった（即ち、突然変異型ＧＡＰＤＨは、天然型ＧＡＰＤＨと比較する際には７８８／５８８を乗じ、天然型ＧＳＨ−Ｐｘは、突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘと比較する際には３５４／２８０を乗じた）。ＰＣＲの後、生成物を１００℃に１０分間加熱してから徐々に冷却することによってヘテロ二量体の形成が最大となるようにした。
【００９７】
ヘテロ二量体の最大化の後、ヘテロ二量体の形成はこうした条件下では二項分布に従うので、デンシトメトリ−のデ−タを二次方程式を使って解析することによって、各生成物の量を決定した（ギリランド（Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ）ら、米国科学アカデミ−紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ）８７：２７２５−２７２９、１９９０、ベッカ−−アンドレ（Ｂｅｃｋｅｒ−Ａｎｄｒｅ）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）１７：９４３７−９４４６、１９８９）。
【００９８】
最終的な値は、天然型ＧＳＨ−Ｐｘ／突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘの天然型ＧＡＰＤＨ／突然変異型ＧＡＰＤＨに対する比率として表した。天然型生成物の量（任意のデンシトメトリ−の単位）を出発ＲＮＡ合計量に対してプロットしたグラフである図３は、ＧＳＨ−Ｐｘ（白抜きの四角）、並びに、ＧＡＰＤＨ（黒塗りの四角）のいずれについても線形に留まらなかったが、天然型ＧＳＨ−Ｐｘ／突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘの比を出発ＲＮＡ合計量に対してプロットしたグラフ、並びに、天然型ＧＡＰＤＨ／突然変異型ＧＡＰＤＨの比を出発ＲＮＡ合計量に対してプロットしたグラフは、いずれの遺伝子についても線形であった。
【００９９】
出発ＲＮＡが少量であると（ＧＳＨ−ＰｘとＧＡＰＤＨの双方の最初の３つの四角）、反応は全過程を通じて指数的に推移するものの、ＲＮＡの量が増加すると、反応は増幅のある時点で非指数的となり、生じる生成物の量は、非制限的な反応の場合に期待されるより少なくなる。各直線は、増幅の全過程を通じて増幅が指数的に推移した場合に形成されたはずの理論上のＰＣＲ生成物（ＧＳＨ−ＰｘあるいはＧＡＰＤＨ）の量を示したものである。
【０１００】
各サンプル管から得られた比（２．１７：１、２．１４：１，２．００：１、１．７６：１、２．４６：１、２．７１：１、及び、１．９２：１）を平均することによって、天然型ＧＳＨ−Ｐｘ／突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘの天然型ＧＡＰＤＨ／突然変異型ＧＡＰＤＨに対する比の平均値として２．１７：１を、標準偏差として０．３３を得た。標準偏差から２５％以上の変異を示す値はなかった。
【０１０１】
この技法のばらつきを検定するために、突然変異標準とマスタ−混合物の各種の希釈液を使用して、上記の実験を繰り返し実施した。各サンプル管から得られた比（１：９．０９、１：８．１３、１：９．４３、１：８．１３、１：６．６２、１：８．７７、１：７．６９、１：１０．００、１：７．５８及び１：７．０４）を平均したところ、天然型ＧＳＨ−Ｐｘ／突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘの天然型ＧＡＰＤＨ／突然変異型ＧＡＰＤＨに対する比の平均値として１：８．２５が、標準偏差として１．０７が得られた。標準偏差から２２％以上の変異を示す値はなかった。この結果から、この技法の精度が裏付けられ、また、突然変異標準の新たな希釈液を含有する新たなマスタ−混合物を使用した場合のばらつきが具体的に示される。
【０１０２】
同一のマスタ−混合物並びに突然変異標準の希釈液を使用した場合のサンプル間のばらつきを検定するために、ＢＥＰ２ＤのＲＮＡを３つの別々のフラスコから独立に抽出し、逆転写してｃＤＮＡとした。ｃＤＮＡの粗希釈（５倍）のみを行なった。各検定について、４本のＰＣＲ管を調べた。得られた天然型ＧＳＨ−Ｐｘ／突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘの天然型ＧＡＰＤＨ／突然変異型ＧＡＰＤＨに対する比は１５．０１：１、１７．６９：１、及び、２１．７６：１（平均＝１８．１５、標準偏差＝３．４０）であった。３つの値はいずれも平均値からの変異が２０％以内であった。この結果は、独立に逆転写される一方、同一のマスタ−混合物並びに内部標準希釈液を用いて増幅されるサンプルを比較する場合における、この技法の精度を裏付けるものである。
ＢＥＰ２ＤのＲＮＡをノ−ザン法で分析したところ、ＧＳＨ−Ｐｘ／ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの比は約１：８であった。
【０１０３】
実施例
ＢＥＰ２ＤのＲＮＡの連続希釈液を、一定量の単一塩基突然変異内部標準拮抗鋳型（各１０アットモル）と共に増幅してから評価した。ゲルのネガ写真（図２に示す）をデンシトメトリ−で分析して、各バンドを定量した。
【０１０４】
バンドをデンシトメトリ−で測定した際に得られた各曲線の下側の面積を用いて、天然型生成物／突然変異型生成物の比を以下のようにして計算した。デ−タは１回に１遺伝子宛から評価した。相対的なバンドのサイズに関して補正を行なった（突然変異型ＧＡＰＤＨは、天然型ＧＡＰＤＨと比較する際には７８８／５８８を乗じ、天然型ＧＳＨ−Ｐｘは、突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘと比較する際には３５４／２８０を乗じた）。ＰＣＲの間には、プライマ−が制限要素である条件下では、相同な配列を有する異種の一本鎖同士がアニ−ルしてヘテロ二量体を形成し得る（ギリランドら（Ｇ．Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ、Ｓ．Ｐｅｒｒｉｎ、Ｋ．Ｂｌａｎｃｈａｒｄ及びＨ．Ｆ．Ｂｕｎｎ）、米国科学アカデミ−紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ）８７：２７２５−２７２９、１９９０）。
【０１０５】
本発明の場合のように異種の鎖が１塩基対のみ異なっている場合には、この異種の鎖は、下記の枡目に示すようにランダムにアニ−リングする（ギリランド（Ｇ．Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ）ら、上掲；トムソンら（Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｉ．Ｂｒｏｄｓｋｙ、及び、Ｊ．Ｊ．Ｙｕｎｉｓ）、血液（Ｂｌｏｏｄ）７９：１６２９−１６３５、１９９２）。
【表１】
【０１０６】
ここで、Ｎ＝再アニ−リング前の一本鎖天然型生成物の割合、Ｍ＝再アニ−リング前の一本鎖突然変異型生成物の割合、ＮＮ（あるいはＮ２ ）＝再アニ−リング後の二本鎖天然型生成物の割合、２ＮＭ＝再アニ−リング後に生じたヘテロ二量体の割合、そしてＭＭ（あるいはＭ２ ）＝再アニ−リング後の二本鎖突然変異型生成物の割合である。
【０１０７】
ヘテロ二量体は制限酵素によって切断されず、電気泳動で未消化のホモ二量体と同じ移動を示したので、間接的に計数した。従って、デンシトメトリ−では、ヘテロ二量体は未消化のホモ二量体と一緒に読み取った。上記の枡目の分布に基づいて生成物を定量するため、ＰＣＲの後に、ヘテロ二量体が確実にランダムに形成されるように（上掲ギリランド（Ｇ．Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ）ら、及びトムソン（Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）ら、における方法による）、生成物を１００℃で１０分間加熱してから徐々に冷却した。
【０１０８】
ＧＡＰＤＨについては、天然型生成物（ＮＮ）もヘテロ二量体（ＮＭ）もＥｃｏＲＩで切断されなかった。従って、大型のバンドは天然型ＧＡＰＤＨホモ二量体（ＮＭ）とＮＭヘテロ二量体の両方を示すものであった。このバンドの割合は、算術的には上記の枡目に従ってＮ２＋２ＮＭであり、一方、ＥｃｏＲＩで切断されたバンドの割合はＭ２であった。従って、ＰＣＲ前に天然型（Ｎ）鋳型と突然変異型（Ｍ）鋳型の量が等しい（１：１）場合には、ヘテロ二量体をランダムに形成させた後の見かけの比は３：１〔（Ｎ２＋２ＮＭ）：Ｍ２〕となる筈である。このことを更に説明するために、第１サンプルレ−ン（図５）のデンシトメトリ−の生デ−タを表２に示す。このデ−タを数学的に処理したところ、最終的に下記の比が得られた。
【０１０９】
Ｍ２ の値は分かっており（２，２１４）、Ｎ２ ＋２ＮＭの値も分かっている（１０，０９５）。こうした情報からＭを計算し（４７．０５）、二次式（ａＸ２ ＋ｂＸ＋ｃ＝０）：Ｎ２ ＋２Ｎ（４７．０５）−１０，０９５＝０
でＮを求めた。
Ｎを求めるに当たっては、二次式（Ｎ＝−ｂ±√（ｂ２ −４ａｃ）／２ａ）を使用した。この場合、ａ＝１、ｂ＝９４．１、ｃ＝１０，０９５であるので、Ｎ＝６３．８９である。目的とする情報はＮ／Ｍであるので、６３．８９／４７．１０、即ち、１．３６／１である。（ＰＣＲ後に存在していた一本鎖ＤＮＡの割合を求めたが、これらはＰＣＲ前に存在していた対応する二本鎖ＤＮＡの割合と同一である。）
【０１１０】
デンシトメトリ−の値は相対的なものなので、二次式を使用する不都合を省くべく、各バンドに、加算すると１となる、即ち、（Ｎ２ ＋２ＮＭ）＋Ｍ２ ＝１となる比例したデンシトメトリ−値を割り当てて、
式：（Ｎ２ ＋２ＮＭ）＋Ｍ２ ＝（Ｎ＋Ｍ）２ ＝１、よって、Ｎ＋Ｍ＝１
を解くこともできる。この場合、各バンドに割り当てる１の各相対的部分は、それぞれのデンシトメトリ−値によって決定する（表２）。
【０１１１】
【表２】
【０１１２】
双方のバンドのデンシトメトリ−値の合計は１２，３０９（１０，０９５＋２，２１４）なので、大きい方のバンド（Ｎ２ ＋２ＮＭ）の相対的な割合は０．８２（１０，０９５／１２，３０９）となり、小さい方のバンド（Ｍ２ ）の相対的な割合は０．１８（２，２１４／１２，３０９）となる。従って、突然変異型ＧＡＰＤＨホモ二量体（Ｍ２ ）の割合は０．１８となり、一本鎖突然変異型ＧＡＰＤＨ（Ｍ）の割合は０．４２４となる。Ｎ＋Ｍ＝１であるので、一本鎖天然型ＧＡＰＤＨ（Ｎ）の割合は、１−０．４２４、即ち、０．５７６となり、天然型生成物の突然変異生成物型に対する比は、先に計算したように、０．５７６／０．４２４、即ち、１．３６／１となる。
【０１１３】
次に、上記表２のＧＡＰＤＨの値と同じレ−ンの天然、並びに、突然変異ＧＳＨ−Ｐｘのデンシトメトリ−値を使用して同じ計算を実施し、下記の結果を得た。
Ｎ２ ＝０．５５８、Ｎ＝０．７４７、そしてＭ＝１−０．７４７＝０．２５３天然型／突然変異型の比を計算し下記の結果を得た。
天然型ＧＳＨ−Ｐｘ／突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘ＝０．７４７／０．２５３＝２．９５／１
天然型ＧＡＰＤＨ／突然変異型ＧＡＰＤＨ＝０．５７６／０．４２４＝１．３６／１
そして、最終的な比率を計算し、下記の結果を得た。
天然型ＧＳＨ−Ｐｘ／突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘ：天然型ＧＡＰＤＨ／突然変異型ＧＡＰＤＨ＝２．９５／１．３６＝２．１７／１
【０１１４】
上述のように、最終的な値は、天然型ＧＳＨ−Ｐｘ／突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘ：天然型ＧＡＰＤＨ／突然変異型ＧＡＰＤＨの比率として表した。天然型生成物の量（デンシトメトリ−の単位は任意）と出発ＲＮＡの合計量との関係は、（図３に示したように）ＧＳＨ−ＰｘについてもＧＡＰＤＨについても線形のまま推移することはなかったにもかかわらず、天然型ＧＳＨ−Ｐｘ／突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘ：天然型ＧＡＰＤＨ／突然変異型ＧＡＰＤＨの比と出発ＲＮＡの合計量との関係は、（図４に示すように）いずれの遺伝子についても線形で推移した。各サンプル管で得られた天然型ＧＳＨ−Ｐｘ／突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘ：天然型ＧＡＰＤＨ／突然変異型ＧＡＰＤＨの比（２．１７：１、２．１４：１、２．００：１、１．７６：１、２．４６：１、２．７１：１、及び、１．９２：１）を平均することによって、平均値として２．１７：１を、標準偏差として０．３３を得た。平均値から２５％以上の変異を示す値はなかった。
【０１１５】
この技法のばらつきを検定するために、突然変異標準とマスタ−混合物の各種の希釈液を使用して、上記の実験を繰り返し実施した。各サンプル管で得られた天然型ＧＳＨ−Ｐｘ／突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘ：天然型ＧＡＰＤＨ／突然変異型ＧＡＰＤＨの比（１：９．０９、１：８．１３、１：９．４３、１：８．１３、１：６．６２、１：８．７７、１：７．６９、１：１０．００、１：７．５８、及び、１：７．０４）を平均したところ、平均値として１：８．２５が、標準偏差として１．０７が得られた。標準偏差から２２％以上の変異を示す値はなかった。
【０１１６】
同一のマスタ−混合物並びに突然変異標準の希釈液を使用した場合のサンプル間のばらつきを検定するために（新規なＢａｍＨＩ制限部位を有する突然変異型ＧＡＰＤＨを使用）、ＢＥＰ２ＤのＲＮＡを３つの別々のフラスコから独立に抽出し、逆転写してｃＤＮＡとした。ｃＤＮＡの５倍希釈を行なった。各検定について、４本のＰＣＲ管を調べた。得られた天然型ＧＳＨ−Ｐｘ／突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘの天然型ＧＡＰＤＨ／突然変異型ＧＡＰＤＨに対する比は１５．０１：１、１７．６９：１、及び、２１．７６：１（平均＝１８．１５、標準偏差＝３．４０）であった。３つの値はいずれも平均値からの変異が２０％以内であった。
【０１１７】
図５に示すように、ＣＹＰＩＡＩ遺伝子の発現は、ノ−ザン分析でもＭＣ ＲＴ−ＰＣＲ分析でも、ほぼ同程度であることが観察された。天然ｃＤＮＡ、並びに、拮抗鋳型ｃＤＮＡを表すＧＡＰＤＨハウスキ−ピング遺伝子の各バンドを比較すると、対象細胞由来のサンプル５μｌのレ−ンと、β−ナフトフラボンに暴露した細胞由来のサンプル３μｌのレ−ン上に、ほぼ同一量のｃＤＮＡが位置していることが明らかである。このように、どのレ−ン上に同一量のｃＤＮＡが位置しているかを測定すると、天然型のＣＹＰＩＡＩ遺伝子を表すバンドが、対象細胞由来のｃＤＮＡを含むレ−ンと比べて、β−ナフトフラボンに暴露した細胞由来のｃＤＮＡを含むレ−ンで遙かに強力に現れていることが明らかとなる。
【０１１８】
【０１１９】
【０１２０】
【０１２１】
【０１２２】
【０１２３】
【０１２４】
【０１２５】
【０１２６】
【０１２７】
【０１２８】
【０１２９】
【０１３０】
【０１３１】
【０１３２】
【０１３３】
【０１３４】
【０１３５】
【０１３６】
【０１３７】
【発明の効果】
本発明は上述した通りであって、任意のＰＣＲ法と共に実施することができ、しかも当業界において通常の知識を有する者であれば容易に実施をすることができ、以て遺伝子診断技術の発展、応用に寄与するところ極めて大なる効果がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】標的遺伝子の相対的な発現量をＰＣＲで定量する際の作業手順を図式的に示した図である。
【図２】ＢＥＰ２ＤのｃＤＮＡの連続希釈液（ＲＮＡ合計量は０．２５μｇ−０．０５μｇ）を、一定量の単一塩基突然変異内部標準（各１０アットモル）と共に増殖し、ＥｃｏＲ１制限エンドヌクレア−ゼで消化し、アガロ−スゲルで電気泳動を行なったものを示すものである。
【図３】天然型生成物（ＧＳＨ−Ｐｘ（白抜きの四角）及びＧＡＰＤＨ（黒塗りの四角））をＲＮＡ合計量に対して示したグラフである。
【図４】天然増幅生成物／突然変異増幅生成物（ＧＳＨ−Ｐｘ（白抜きの四角）及びＧＡＰＤＨ（黒塗りの四角））をＲＮＡ合計量に対して示したグラフである。
【図５】（ａ）はＢＥＰ２Ｄ細胞から得たＲＮＡを、対照である０．１％ＤＭＳＯで処理したもの、あるいは、β−ナフトフラボンで処理してシトクロムｐ４５０１Ａ１（ＣＹＰ１Ａ１）を誘導したもののノ−ザン分析の結果を示すものであり、（ｂ）は、（ａ）と同一の細胞から得たｃＤＮＡの連続希釈液からＰＣＲで増幅したＤＮＡを示すものである。
【産業上の利用分野】
本発明は、逆転写並びにポリメラ−ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅の後の細胞のＲＮＡレベルを定量的に測定する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ＰＣＲの技法は、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、及び第４，９６５，１８８号に一般的に記載されている。ＰＣＲの技法は、一般に、核酸分子内の核酸配列に含まれる任意所望の特定の核酸配列を増幅する過程を含む。ＰＣＲ法は、核酸の別々の相補的な系統（ｓｔｒａｉｎｓ）を、過剰量の２種のオリゴヌクレオチドプライマ−で処理する工程を含む。これらのプライマ−を伸長させて、相補的なプライマ−伸長生成物を形成し、このプライマ−伸長生成物を、所望の核酸配列を合成する際の鋳型として作用させる。
【０００３】
ＰＣＲの過程は、同時且つステップワイズに進行し、所望の回数だけ繰り返すことができるので、所望の核酸配列を高レベルまで増幅させることができる。ＰＣＲ法によれば、各ＤＮＡ系統上のプライマ−の間のＤＮＡ配列が、ＤＮＡ並びに選択されたサンプルの残りの部分の上で選択的に増幅される。ＰＣＲ法を用いることにより、ＤＮＡの所望の領域を特異的に増幅させることができる。
【０００４】
ＰＣＲによって得られる生成物の収量は、ある不特定数のサイクルに亘って指数的に増加するものの、理由は不明であるが、ある時点で反応が限定されるようになり、ＰＣＲ生成物が未知の割合で増加するようになる。その結果、同一のサンプルを同時に増幅した場合でも、増幅生成物の収量が６倍も異なることが報告されている（ギリランド（Ｇ．Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ）ら、米国科学アカデミ−紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ）８７：２７２５−２７２９、１９９０）。これらの刊行物を初めとする参考文献は、本発明の背景、そして場合によっては、本発明の実施方法を更に詳しく説明するために引用したものであり、本発明は、これらをすべて参考文献として包含するものである。
【０００５】
従って、ＰＣＲサイクルをある回数繰り返した後は、標的ＤＮＡの初期濃度を、外挿によって正確に決定することはできない。ＰＣＲを定量的に進行させる目的で、さまざまな研究者が、指数的増幅が進行することが分かっているサイクル数だけ増幅したサンプルの分析を行なってきた（ホリコシ（Ｔ．Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ）ら、癌研究（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）５２、１０８−１１６（１９９２）；ヌ−ナン（Ｋ．Ｅ．Ｎｏｏｎａｎ）ら、米国科学アカデミ−紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ）８７：７１６０−７１６４（１９９０）；マ−フィ−（Ｌ．Ｄ．Ｍｕｒｐｈｙ）ら、生化学（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２９：１０３５１−１０３５６、１９９０；ケ−ル（Ｐ．Ｃ．Ｃａｒｒｅ）ら、臨床研究雑誌（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．）８８、１８０２−１８１０（１９９１）；チェリ−（Ｊ．Ｃｈｅｌｌｙ）ら、欧州生化学雑誌（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）１８７：６９１−６９８（１９９０）；アブス（Ｓ．Ａｂｂｓ）ら、医学遺伝学雑誌（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ）２９：１９１−１９６（１９９２）；フェルドマン（Ａ．Ｍ．Ｆｅｌｄｍａｎ）ら、サ−キュレ−ション（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）８３：１８６６−１８７２（１９９１））。
【０００６】
こうした分析は一般に、ＰＣＲの早い段階、即ち、ＰＣＲ生成物の測定を、臭化エチディウムで染色したゲルを分光光度計やデンシトメ−タ−で分析することによってではなく、放射標識したプロ−ブ並びにオ−トラジオグラフィ−を使用することによって行なうことができる段階で行なわれたものである。放射能の使用は不便且つ高価であり、安全上の問題も生じる。また、指数的フェ−ズを各実験条件ごとに画定する必要があるので、更に時間や材料が必要となる。
【０００７】
拮抗（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ）ＰＣＲも開発されており、この方法では、ＰＣＲを単一塩基突然変異拮抗鋳型の存在下で行ない（ギリランド（Ｇ．Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ）ら、上掲；ベッカ−−アンドレ（Ｂｅｃｋｅｒ−Ａｎｄｒｅ）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）１７：９４３７−９４４６（１９８９））、既知量の拮抗鋳型を未知量の標的配列と共に増幅する。拮抗鋳型は、標的配列と同一である配列で（単一塩基突然変異、あるいは、配列の一部の欠失の場合を除く）、増幅に当たって標的ｃＤＮＡ（相補性ＤＮＡ）と同じプライマ−を使用し、標的ｃＤＮＡと同じ効率で増幅する。スタ−ト時の標的／標準の比は、全増幅の過程を通じて保持され、指数フェ−ズが終了した後についても、この比が保たれる。
【０００８】
拮抗ＰＣＲは、シ−バ−ト（Ｐ．Ｄ．Ｓｉｅｂｅｒｔ）ら、ネイチャ−（Ｎａｔｕｒｅ）３５９：５５７−５５８（１９９２）；シ−バ−ト（Ｐ．Ｄ．Ｓｉｅｂｅｒｔ）ら、バイオ技術（Ｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）１４：２４４−２４９（１９９３）；及び、クロンテック・ブロ−シャ−（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｂｒｏｃｈｕｒｅ）、１９９３、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）の中で一般に論じられている。しかし、拮抗ＰＣＲ単独では、スタ−ト時の鋳型の量のばらつきを適切に制御することができない。サンプルの劣化やピペット時の誤差によって、こうしたばらつきは容易に生じる。
【０００９】
ノ−ザン分析を使用して遺伝子の発現を測定する場合には、同一ブロットを、標的遺伝子と組織サンプル間でばらつきがあったり、刺激に応答して変化したりすることがないとされるハウスキ−ピング遺伝子の両方についてプロ−ブすることによって、こうした問題を解決することができる。ハウスキ−ピング遺伝子は、標的遺伝子の相対的な発現を測定する際の分母として作用するのである。
【００１０】
この考え方を応用する目的で、他の研究者は、ＰＣＲによる増幅を別々の試験管内で行なった。しかし、これらの２種の遺伝子を別々の試験管内で増幅すると、試験管ごとの増幅条件のばらつきやピペット時の誤差を避けることができない。上掲のヌ−ナン（Ｋ．Ｅ．Ｎｏｏｎａｎ）らには、標的遺伝子とハウスキ−ピング遺伝子を同一の試験管内で増幅する非拮抗多重ＰＣＲも記載されているが、この方法は、増幅物ごとの指数範囲を決定するのに標準曲線を作成する必要があるので好都合とは言い難い。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
従って、上述の欠点をいずれも有さず、標準的な訓練を受けた技術者が実施することのできる、遺伝子の発現の定量的な測定方法が必要とされている。本発明は、任意のＰＣＲ法と共に使用することができ、単純且つ簡単に実施することのできる技法を提供することによって、当業界のかかる必要性に答えることを課題とするものである。本発明は、ＤＮＡ分析やＰＣＲ技法に対するこれまでに発表されているアプロ−チを大幅に改善するものである。
【００１２】
即ち、本発明の目的は、遺伝子の発現を定量的に測定する優れた方法を提供することにある。
本発明の別の目的は、商業的に実施するのに適した、ＰＣＲに基づく遺伝子の発現の定量的な測定方法を提供することにある。
こうした目的を始めとする本発明の種々の目的、並びに、本発明の種々の特徴やそれに付随する利点は、以下の詳細な記載を添付図面と関連づけて読むことによって一層よく理解されるはずである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明に係る方法は、ＰＣＲによる増幅方法を改善したもので、「標的遺伝子」、「ハウスキ−ピング遺伝子」、並びに、これらの各遺伝子と拮抗する鋳型を同時に増幅させるものである。本発明における「標的ＤＮＡ配列」並びに「標的遺伝子」という用語は、その遺伝子あるいはＤＮＡ配列を選択的に増幅することを意図されている目標遺伝子のことを総称するものである。
【００１４】
「ハウスキ−ピング遺伝子」という用語は、ＰＣＲの反応一回当りのＲＮＡの量の内部標準として適当な遺伝子のことを意味する。総論として、本発明で最も重要なのは、標的遺伝子に対するプライマ−、ハウスキ−ピング遺伝子に対するプライマ−、そして標的遺伝子並びにハウスキ−ピング遺伝子の突然変異生成物から成る２種の内部標準突然変異拮抗鋳型に対するプライマ−を同時に使用することである。これらの突然変異拮抗鋳型における突然変異は、点突然変異、挿入、欠失などであってよい。
【００１５】
広義には、本発明は、ｃＤＮＡ分子の異種混合物中に存在する所定のｃＤＮＡ分子の特定の領域内の標的ＤＮＡ配列の量を定量する方法に関する。２種以上の標的遺伝子及び／又は２種以上のハウスキ−ピング遺伝子を使用することもできるが、こうした追加の標的遺伝子及び／又はハウスキ−ピング遺伝子を定量する場合には、この追加分の標的遺伝子及び／又はハウスキ−ピング遺伝子の突然変異生成物である内部標準突然変異拮抗鋳型を更に使用することが必要になると理解されたい。
【００１６】
また、突然変異拮抗鋳型は、標的配列に対応するヌクレオチドに対して突然変異を生じたヌクレオチドを少なくとも１個有するものであると理解されたい。なお、本発明を成功裡に実施する上で要求されることは、ハウスキ−ピング遺伝子の配列に対応するヌクレオチドと相補的なヌクレオチド１個のみが突然変異を生じていることである。しかし、もっと長い欠失、挿入、あるいは変異も本発明において有用であると考えられる。
【００１７】
標的遺伝子のプライマ−（標的遺伝子の天然型鋳型と突然変異拮抗鋳型の両方に対するプライマ−の役目を果たす）、ハウスキ−ピング遺伝子のプライマ−（ハウスキ−ピング遺伝子の天然型鋳型と突然変異拮抗鋳型の両方に対するプライマ−の役目を果たす）、標的遺伝子の突然変異拮抗鋳型、並びにハウスキ−ピング遺伝子の突然変異拮抗鋳型を、標的遺伝子並びにハウスキ−ピング遺伝子の双方のＤＮＡを含む天然ｃＤＮＡと共に、ＰＣＲで増幅する。
【００１８】
このＰＣＲの過程で、ｃＤＮＡ生成物として、１）標的遺伝子及びハウスキ−ピング遺伝子の天然型ｃＤＮＡ、並びに、２）標的遺伝子及びハウスキ−ピング遺伝子の突然変異型拮抗鋳型が得られる。このｃＤＮＡ生成物を、ｃＤＮＡ生成物の単離に適した方法を使用することによって単離する。標的遺伝子をコピ−する天然型ｃＤＮＡの量、並びに、標的遺伝子の突然変異拮抗鋳型をコ−ドする突然変異型ｃＤＮＡの量を、ハウスキ−ピング遺伝子をコ−ドする天然型ｃＤＮＡの量、並びに、ハウスキ−ピング遺伝子の突然変異拮抗鋳型をコ−ドする突然変異型ｃＤＮＡの量と比較して測定することによって、天然型ｃＤＮＡ生成物と突然変異型ｃＤＮＡ生成物の相対的な存在量を決定する。
【００１９】
本発明の別の観点は、標的ＤＮＡ配列の量を決定する際にＰＣＲ法で使用する新規な核酸プライマ−分子に関する。
本発明では、「サンプル」という用語は、植物、個体、あるいはイン・ビトロの細胞培養の成分から単離した組織、あるいは、液体のサンプルのことを一般に指称するものである。
【００２０】
プライマ−、核酸、及び、オリゴヌクレオチドという用語は、ポリリボヌクレオチド及びポリデオキシリボヌクレオチドのことを指称するものであり、これらの用語のいずれを使用するかによって配列の長さを区別する意図はなく、これらの用語は、分子の一次構造を説明するものであると理解されたい。これらの用語には、二本鎖及び一本鎖ＲＮＡ、並びに、二本鎖及び一本鎖ＤＮＡが包含される。これらのオリゴヌクレオチドは、任意の現存の、即ち、天然の配列から誘導することができ、任意の方法で生成することができる。
【００２１】
また、オリゴヌクレオチドは化学合成、逆転写、ＤＮＡ複製、並びに、これらの生成法の組み合わせによって生成することもできると理解されたい。「プライマ−」という用語は、条件がプライマ−伸長生成物の合成に適している場合に、相補的な鎖に沿った合成の開始地点として作用し得るオリゴヌクレオチドのことを一般に指称するものである。合成条件としては、４種の各デオキシリボヌクレオチド３燐酸、並びに、少なくとも１種の重合誘導剤、例えば逆転写酵素、あるいは、ＤＮＡポリメラ−ゼが存在することが挙げられる。
【００２２】
これらの各反応物質は、適当な緩衝液中に存在させ、この緩衝液は、補因子である成分、あるいは、種々の適当な温度下でのｐＨ等の条件に影響を及ぼす成分を含有することもできる。プライマ−は一本鎖の配列として増幅効率を最適化するのが好ましいものの、本発明で二本鎖配列を用いることも可能であると理解されたい。
【００２３】
「標的遺伝子」、「配列」、あるいは「標的核酸配列」という用語は、オリゴヌクレオチド中の増幅、及び／又は、検出せんとする領域のことを意味する。標的配列は、増幅過程で使用されるプライマ−配列の間に位置していると理解されたい。
【００２４】
本発明の一実施態様では、遺伝子の定量的な発現を、ａ）少なくとも１種の目標とする標的遺伝子、及び、少なくとも１種のハウスキ−ピング遺伝子のｃＤＮＡ、並びに、ｂ）目標とする標的遺伝子及びハウスキ−ピング遺伝子のｃＤＮＡが、制限エンドヌクレア−ゼ認識部位の欠失、あるいは、創出を生じるような塩基突然変異を生じた生成物である内部標準突然変異拮抗鋳型を、多重拮抗ＰＣＲで増幅することによって測定する。
【００２５】
本発明の別の実施態様の方法は、ａ）少なくとも１種の目標とする標的遺伝子、及び、少なくとも１種のハウスキ−ピング遺伝子のｃＤＮＡ、並びに、ｂ）制限酵素で切断されるべき長さに予め人為的に短縮された目標とする標的遺伝子、及び、ハウスキ−ピング遺伝子の配列を有する突然変異拮抗鋳型を、ＰＣＲで増幅する工程から成る。これらの短縮された配列は、ＰＣＲによる増幅で使用する標的遺伝子、並びに、ハウスキ−ピング遺伝子のプライマ−の両方と相同な各配列を保持している。
【００２６】
サンプル細胞あるいは組織から抽出したＲＮＡを逆転写する。ｃＤＮＡの連続希釈液を、標的遺伝子、及び、ハウスキ−ピング遺伝子と相同な各オリゴヌクレオチド、並びに、定量済みの内部標準突然変異拮抗鋳型の存在下でＰＣＲによって増幅する。増幅したＤＮＡを、制限エンドヌクレア−ゼで消化し、エチジウムブロマイドで染色したアガロ−スゲル上で電気泳動を行ない、天然型生成物を突然変異型生成物から分離する。デンシトメトリ−を行なって、各バンドを定量する。
【００２７】
標的遺伝子のハウスキ−ピング遺伝子に対する相対的な発現を測定するこの技法は、同一の内部標準マスタ−混合物、並びに、希釈液を用いて実施した実験に関しては、正確で再現性がある。相対的な遺伝子の発現の比の平均値からの変異は、２５％以内である。この技法は、遺伝子の発現の変化を測定するのに有用である。この方法は、調べるサンプルの量が限られていたり、遺伝子の発現レベルが低かったりする場合に特に有用である。
【００２８】
【実施例】
以下本発明の好適な実施例につき説明する。
長年に亘って、遺伝子の発現は、ＲＮＡをノ−ザン法、あるいは、ドットブロット検定で定量することによって測定されてきた。こうした技法では、各測定について、ＲＮＡの量として１０５ 個以上の細胞から得られる量が必要とされる。生検では、組織学的診断に必要な数の細胞しか得られないことも多く、こうした場合、細胞の数は１０５ 個にはるかに満たない。最近開発されたＰＣＲ法では、細胞１００個程度のレベルのＲＮＡでも測定が可能である。しかし、今日までに発表されている技法では、定性的な測定しか行なうことができず、定量的な測定は行なうことができなかった。
【００２９】
本発明は、多重拮抗逆転写酵素ポリメラ−ゼ連鎖反応による増幅を使用して、遺伝子発現の定量的な測定を簡素化し、改善する方法に関するものである。サンプルから抽出したＤＮＡを逆転写し、次に、ハウスキ−ピング遺伝子と目的とする標的遺伝子の双方のプライマ−の存在下でＰＣＲによって増幅する。
【００３０】
遺伝子の発現は、一種以上の標的遺伝子の量を、ハウスキ−ピング遺伝子の量と比較することによって測定する。本発明で使用することのできるハウスキ−ピング遺伝子としては種々のものがあり、例えば、ノ−ザン法で遺伝子の発現を検定する際に内部標準として使用されてきたハウスキ−ピング遺伝子、例えばＧＡＰＤＨ、β−アクチン、２８Ｓ ＲＮＡ、及び、１８Ｓ ＲＮＡ、及び、リボ核タンパク質（デヴロ−（Ｄｅｖｅｒｅａｕｘ）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）１２：３８７（１９８４）；バルブ−（Ｂａｒｂｕ）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）１７：７１１５（１９８９））を使用することができる。
【００３１】
本発明の一実施態様では、ハウスキ−ピング遺伝子中に存在する、既知の制限エンドヌクレア−ゼ認識部位を含む任意の配列、又は既知の制限エンドヌクレア−ゼ認識部位に対して１ないし２塩基対のミスマッチ（相違）を含む任意の配列と相同な合成オリゴヌクレオチドを使用することができる。こうした制限エンドヌクレア−ゼ認識部位を用いるのは、天然に生じている部位を非認識部位に突然変異させるか、ミスマッチ部位をマッチ部位に突然変異させるかして、いずれにしても、内部標準突然変異拮抗鋳型に適した突然変異配列を生成させるためである。
【００３２】
特定の別の遺伝子を分析するのに使用するハウスキ−ピング遺伝子中の特定の部位は、この別の遺伝子中に存在するマッチ部位並びにミスマッチ部位に応じて決まる。一つの決定要因は、ハウスキ−ピング遺伝子及び標的遺伝子から生成するＤＮＡ断片のサイズである。これらの断片は、ゲル電気泳動の際に十分に分離することが望ましい。
【００３３】
また、本発明では、ハウスキ−ピング遺伝子として用いる遺伝子に含まれる配列に対して相同な配列を含む全てのオリゴヌクレオチドを使用することができる。この種の相同な配列を使用して、セリ（Ｃｅｌｉ）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）２１：１０４７（１９９３）に記載された方法に従って、ハウスキ−ピング遺伝子に対する人為的に短縮した拮抗鋳型、即ち、予め人為的に、制限酵素で切断されるべき長さに短縮した突然変異拮抗鋳型を生成する
ことができる。
【００３４】
任意の既知の認識部位に対する１塩基対ないし２塩基対のミスマッチを有する配列を特定してマッチさせる際には、ジェネティクス・コンピュ−タ・グル−プ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）のソフトウェアパッケ−ジ内のマップ（Ｍａｐ）プログラムを使用することができる（デヴロ−（Ｄｅｖｅｒｅａｕｘ）ら、上掲）。各遺伝子についてのｃＤＮＡ配列が得られ、各遺伝子が、任意の既知の制限エンドヌクレア−ゼに対する１乃至２塩基のミスマッチを有する配列とのマッチの存在について評価される。本発明では、こうした認識配列のいずれか、あるいは、こうした認識配列と１ないし２塩基対のミスマッチを有する配列を含むすべての遺伝子を使用することが可能である。
【００３５】
本発明の多重拮抗ＰＣＲでは（突然変異標準の任意の所定のマスタ−混合物並びに希釈液について）、再現性のある標的遺伝子／ハウスキ−ピング遺伝子の比が得られる。ＲＮＡの量が増えると、「天然型生成物の量」対「出発ＲＮＡの合計量」の関係が線形のままで推移しなくなるので、増幅が反応を通じて指数的に推移していないことは明らかである（図３）。
【００３６】
しかし、各遺伝子に対する突然変異拮抗鋳型を使用すると、標準遺伝子／ハウスキ−ピング遺伝子の比は一定値に保たれる。この量的な結果は、各遺伝子について、「天然型／突然変異型鋳型の比」対「出発ＲＮＡの合計量」が線形の関係を有することによって示される（図４）。このことから突然変異拮抗鋳型の内部対照の有用性が示され、相対的な遺伝子発現量を増幅の指数フェ−ズ内のみで定量する必要がなくなる。
【００３７】
同一実験内の各サンプル間で比に再現性があるので、使用する希釈チュ−ブの数が少なくて済む。遺伝子の発現を測定するに当たっては、チュ−ブ１本のみ必要で、このチュ−ブ内ですべてのバンドを定量することができる。このことによって手順が簡素化され、一回に多くの異なったサンプルを評価することが可能となる。
【００３８】
本発明の一実施態様では、突然変異型生成物を天然型生成物から分離するのに使用する制限エンドヌクレア−ゼ認識部位を選択することができる。更に、制限エンドヌクレア−ゼで消化した後に生じるＰＣＲ生成物の最終的な長さも、考慮すべき要素である。特定の実施態様では、ポリアクリルアミドゲルよりはアガロ−スゲルを使用する方が好ましいものの、その際には、適切な分離を行なう上で、ＤＮＡ断片のサイズの差が大きいこと（約５０〜１００塩基対の差）が要求される。
【００３９】
本発明の方法は、標的遺伝子とハウスキ−ピング遺伝子の双方に対して同一の認識部位を使用することによって、更に簡素化が可能である。ＥｃｏＲＩ部位が適当であることが多い。本発明の特定の実施態様では、ＥｃｏＲＩ、あるいは、ＢａｍＨＩでの消化によって天然ＧＡＰＤＨから分離するＧＡＰＤＨ拮抗鋳型を作成した。しかし、もっと多くの遺伝子で用いることのできるＥｃｏＲＩ、あるいは、他の制限エンドヌクレア−ゼでの消化による分離もあり得ると理解されたい。
【００４０】
突然変異標準の相異なるマスタ−混合物、並びに、希釈液を使用して、ＢＥＰ２ＤのｃＤＮＡについて行なった研究では、標的／ハウスキ−ピング（ＧＳＨ−Ｐｘ／ＧＡＰＤＨ）遺伝子の発現の比に大きなばらつき（２００倍以下）が見られた。別々に逆転写を行なったサンプルでも同様の結果が得られたので、この工程で導入されたばらつきは小さいものである。
【００４１】
いずれの反応条件の差異も、突然変異拮抗鋳型の増幅と天然鋳型の増幅に同等に影響を及ぼすので、この両者の比は一定のまま保たれる。従って、このばらつきは、反応中の内部標準突然変異拮抗鋳型の量の差によって生じたものである可能性が高い。突然変異拮抗鋳型の濃度は極めて低く（フェンプトモル範囲）、反応中に存在する分子の数に何らかの変化があれば大きな誤差が生じてしまう。
【００４２】
本発明の方法は、内部標準突然変異拮抗鋳型の同一のマスタ−混合物を使用した各サンプル間で再現性があることによって示されるように、いずれの所定の研究でも正確である。従って、好適実施態様では、比較サンプルも、内部標準突然変異拮抗鋳型の同一のマスタ−混合物と同一の希釈液を使用して同時に調べるのが望ましい。
【００４３】
好適実施態様では、反応混合物は以下のものを含有する。ａ）ハウスキ−ピング遺伝子の突然変異拮抗鋳型、ｂ）目標とする標的遺伝子の突然変異拮抗鋳型、ｃ）ハウスキ−ピング遺伝子をＰＣＲで増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマ−、ｄ）目標とする標的遺伝子をＰＣＲで増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマ−、ｅ）反応緩衝液、及びｆ）試験サンプル由来のｃＤＮＡ。
【００４４】
また、各実験のＰＣＲ条件は、例えば、反応混合物１００μｌ当たり、１×ＰＣＲ緩衝液（例えば、５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣ１、１．５ｍＭＭｇＣｌ２）、標的遺伝子並びにハウスキ−ピング遺伝子をコ−ドするプライマ−（各２５ピコモル）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）、及び、一定量の各突然変異拮抗鋳型を含むマスタ−混合物を使用することによって標準化するのが好ましい。
【００４５】
増幅を行なう前に、反応液１００μｌ当たり、タック（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラ−ゼ（２．５単位）を加えておく。ＰＣＲによる増幅は、９４℃で１分、６０℃で１分、そして７２℃で１分、３５〜３８サイクルに亘って実施するか、あるいは、増幅する特定の領域に最適な条件で行なう。増幅の後、ＰＣＲ生成物を１０分加熱してから徐々に冷却して、なるべく多くのヘテロ二量体が形成されるようにするのが好適である。
【００４６】
ヒグチ（Ｈｉｇｕｃｈｉ）に従って突然変異を導入した拮抗鋳型を使用した反応に際しては、各ＰＣＲチュ−ブのサンプル（４０μｌ）を、制限エンドヌクレア−ゼで１２〜１６時間消化する。生成物をエチディウムブロマイドで染色した、３％ヌ−シ−ブ（Ｎｕｓｉｅｖｅ）、１％ＬＥアガロ−スのゲル上で、６０Ｖにて２〜３時間電気泳動にかける。ポラロイド（Ｐｏｌａｒｏｉｄ）６６５ポジ／ネガインスタントフィルムを使用して、ゲルのネガ写真を撮影する。
【００４７】
このネガ写真を、例えば、ザイネ−・ソフトレ−ザ−走査デンシトメ−タ−・モデルＳＬＲ２Ｄ／１Ｄ（Ｚｅｉｎｅｈ Ｓｏｆｔ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ Ｍｏｄｅｌ ＳＬＲ ２Ｄ／１Ｄ）で、ザイネ−１Ｄオ−トステップオ−バ−・ビデオフォレ−シス・プログラム・ソフトウェア（Ｚｅｉｎｅｈ １Ｄ Ａｕｔｏｓｔｅｐｏｖｅｒ Ｖｉｄｅｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（バイオメド・インストルメンツ（Ｂｉｏｍｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、米国カリフォルニア州フラ−トン（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ））を使用して、デンシトメトリ−に供する。
【００４８】
あるいは、染色ゲルを、デジタルカメラを使用して直接デンシトメトリ−で評価するか、自動配列決定用ゲル（例えばアプライド・バイオシステムス社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）より入手可能）で評価する。各曲線の下側の面積を計算し、定量に使用する。バンドの相対的なサイズ、並びにヘテロ二量体の形成に関して補正を行なう。結果を標的遺伝子対ハウスキ−ピング遺伝子の相対的な比として表す。
【００４９】
多重拮抗ＰＣＲを用いると、遺伝子の発現の優れた定量を簡便に行なうことができる。極めて少量の組織あるいは細胞のサンプルであっても、放射標識に頼ることなく、遺伝子の発現を定量することができる。その結果、多重逆転写ＰＣＲは費用が安くてすみ、放射標識より安全に使用することができる。結果は、突然変異内部標準拮抗鋳型の同一のマスタ−混合物、並びに、希釈液を使用した場合については再現性がある。
【００５０】
本発明の方法では、既知あるいは潜在的なハウスキ−ピング遺伝子（例えばＧＡＰＤＨ、β−アクチン、２８Ｓ ＲＮＡ、１８Ｓ ＲＮＡ、並びに、すべてのリボ核タンパク質遺伝子。但しこれらに限定されない。）のｃＤＮＡの核鎖と相同で、制限エンドヌクレア−ゼ認識部位配列を含むか、制限エンドヌクレア−ゼ認識配列に対して１ないし２塩基対のミスマッチを有する全てのオリゴヌクレオチドが、本発明を実施する上で有用であると理解されたい。このオリゴヌクレオチドは、定量的ＰＣＲで使用するハウスキ−ピング遺伝子の拮抗鋳型を調製する際に使用するものである。
【００５１】
また、本発明の方法では、既知あるいは潜在的なハウスキ−ピング遺伝子（例えばＧＡＰＤＨ、β−アクチン、２８Ｓ ＲＮＡ、１８Ｓ ＲＮＡ、並びにすべてのリボ核タンパク質遺伝子、但しこれらに限定されない）中の配列と相同な配列を含む全てのオリゴヌクレオチドが、人為的に短縮された拮抗鋳型を生成する上で有用であると理解されたい。このオリゴヌクレオチドは、本発明で使用するハウスキ−ピング遺伝子の拮抗鋳型を調製するのに使用するものである。
【００５２】
本発明の技法の用途としては、例えばａ）内視鏡による生検（ブラシあるいはピンセット）、針吸引、及び、骨髄生検によって得られた組織からの遺伝子の発現の評価、ｄ）遷移トランスフェクション分析におけるリポ−タ−遺伝子の発現の定量、並びに、ｃ）遺伝子治療後のトランスフェクトされた遺伝子の定量が考えられる。
【００５３】
モラレスら（Ｍ．Ｊ．Ｍｏｒａｌｅｓ及びＤ．Ｉ．Ｇｏｔｔｌｉｅｄ）（遷移トランスフェクション分析におけるレポ−タ−遺伝子の発現をポリメラ−ゼ連鎖反応に基づいて検出・定量する方法（Ａ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ
ｒｅａｃｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎａｓｓａｙｓ）、分析生化学（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２１０、１８８−１９４（１９９３）に記載された方法でもレポ−タ−遺伝子からの転写を測定することができるが、この方法では、分析で生じるＲＮＡの量の差に起因するばらつきを制御することはできない。
【００５４】
本発明の方法は、外在性のレポ−タ−遺伝子と内在性のハウスキ−ピング遺伝子、例えばトランスフェクトされた細胞由来のＧＡＰＤＨ ＲＮＡを同時に評価するのに更に有用である。
【００５５】
嚢胞性繊維症貫膜伝導調節遺伝子（ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ ｒｅｇｕｒａｔｏｒ ｇｅｎｅ ＣＦＴＲ）中の数多くの相異なる突然変異が疾患に付随していることが報告されているものの、疾患に付随する最も一般的な突然変異は、５０８の位置での３つの塩基の欠失である。最近述べられた方法（チャ−（Ｒ．Ｓ．Ｃｈａ、Ｈ．Ｚａｒｂｌ、Ｐ．Ｋｅｏｈａｖｏｎｇ、Ｗ．Ｇ．Ｔｈｉｌｌｙ）、マッチ増幅突然変異分析：ｃ−Ｈａｒａｓ遺伝子に対する適用（ｍａｔｃｈ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ（ＭＡＭＡ）：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｃ−Ｈａ ｒａｓ ｇｅｎｅ）、ＰＣＲの方法と応用（ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、２：１４−２０（１９９２））を使用すると、異常な５０８欠失遺伝子のみ、あるいは、正常なＣＦＴＲ遺伝子のみの増幅を生じるオリゴヌクレオチドプライマ−を調製することができる。
【００５６】
本発明の方法を使用すると、細胞１個当たりの外在性ＣＦＴＲ遺伝子の相対的な量を測定することができると考えられる。異常ＣＦＴＲの量を何等かの内部標準と比較することなしには、トランスフェクションの効率を定量することはできないはずである。サンプルはあまりに少量で、ＲＮＡをノ−ザン分析によって測定するのは無理である。
【００５７】
本発明の方法は、外在性の正常ジストロフィン遺伝子を、内在性の突然変異遺伝子の存在下で選択的に増幅するＰＣＲシステムを開発する上で有用である。ジストロフィンの場合、比較的大きな欠失の結果として疾患が生じる。数種の異なった欠失が報告されている。本発明の方法を用いると、トランスフェクトされた正常遺伝子を選択的に増幅する各種のＰＣＲシステムを開発することができ、そのいずれの場合についても、異常遺伝子と同様に構成的である。この増幅は、プライマ−を欠失領域に隣接して配置することによって行なうことができる。
また、本発明の方法では、２種以上の遺伝子の評価を同時に行なうこともできると理解されたい。
【００５８】
方法
ファルマシア（米国ニュ−ジャ−ジ−州、ピスキャッタウェ−（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ））から入手した精製デオキシリボヌクレオチドを希釈して、１０ｍＭの原液とした。組換えテルムス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）のＤＮＡポリメラ−ゼ（タックポリメラ−ゼ）、トリ骨髄芽球症ウィルス（ＡＭＶ）の逆転写酵素、及び、リボヌクレア−ゼ阻害剤（ＲＮａｓｉｎ）は、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（米国ウィスコンシン州、マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ））から入手した。ＥｃｏＲＩ酵素は、ＵＳＢ（米国オハイオ州、クリ−ブランド）から入手した。
【００５９】
プライマ−は、アプライド・バイオ・システムズのモデル３９１ＰＣＲメ−トＥＰ ＴＭ合成装置（Ｍｏｄｅｌ ３９１ ＰＣＲ−Ｍａｔｅ ＥＰ ＴＭ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）で調製した。ＰＣＲは、パ−キンズ・エルマ−・セタス（Ｐｅｒｋｉｎｓ，Ｅｌｍｅｒ，Ｃｅｔｕｓ）のＤＮＡサ−マル・サイクラ−４８０（ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０）を用いて行なった。使用した他の緩衝液並びに溶液は、種々のソ−スから入手し、分子生物学用の等級のものを使用した。
【００６０】
研究は、ヒトパピロ−マウィルスで不死化したヒト気管支上皮細胞系（ＢＥＰ２Ｄ）（ウィリ−（Ｗｉｌｌｅｙ）ら、癌研究（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）５１：５３７０−５３７７、１９９０）を用いて行なった。
【００６１】
ＲＮＡの単離は以下のようにして実施した。ＲＮＡの単離はチョムクジンスキ−ら（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ及びＳａｃｃｈｉ）、分析生化学（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１６２、１５６−１５９、１９８７）に記載された方法によって行なった。ＢＥＰ２Ｄ細胞系の入ったフラスコから、培養液を取り出した。直ちに、ＧＩＴ（４．０Ｍチオシアン酸グアニジニウム、０．１ＭトリスＣ１（ｐＨ７．５）、１％β−メルカプトエタノ−ル）緩衝液を細胞上に注いだ（約５００μｌ／ＢＥＰ２Ｄ細胞５００〜１０００万個）。
【００６２】
次に、溶解した細胞の入った各５００μｌのＧＩＴ緩衝液を、１．５ｍｌの微量遠心分離管に移した。各微量遠心分離管に５０μｌの２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４、５００μｌ）の水で飽和させたフェノ−ル、そして１００ｍｌのクロロホルム−イソアミルアルコ−ル混合物（４９：１）を順次加えた。微量遠心分離管を十分に振とうし、氷上に１５分間載置し、１４，０００ＲＰＭにて２０分間４℃で微量遠心分離を行なった。各遠心分離管の水性層を、新たな微量遠心分離管に移し、上記抽出過程を繰り返した。
【００６３】
再度、各遠心分離管の水性層を、新たな微量遠心分離管にイソプロパノ−ル（５００μｌ）と共に移し、−７０℃に１５分間保った。次に、この微量遠心分離管を、１４，０００ＲＰＭにて２０分間４℃で微量遠心分離した。ＲＮＡを７０％エタノ−ルで２回洗浄し、減圧下で乾燥した。ＲＮＡを０．１％のジエチルピロカ−ボネ−ト（ＤＥＰＣ）で処理したＨ２ Ｏに吸収させ、分光光度計（ギルフォ−ド機器（Ｇｉｌｆｏｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）の分光光度計（Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）２６０）で定量した。
【００６４】
逆転写は、以下のようにして実施した。抽出したＲＮＡを、滅菌した微量遠心分離管に入れた。１μｇのＲＮＡのそれぞれに、０．２ｍｇのオリゴｄＴを加えた。このものを６５℃で５分間加熱し、氷の上に１分間載置し、２μｌの１ｍＭｄＮＴＰ、２μｌの逆転写酵素（ＲＴ）緩衝液（５００ｍＭトリス、４００ｍＭＫＣ１、および８０ｍＭ ＭｇＣ１２ ）、０．５μｌのＲＮａｓｉｎ、及び、１μｌのＡＭＶ逆転写酵素（９，５００単位／ミリリットル）を加えた。このものを４２℃にて１時間インキュベ−トし、８０℃に１０分間加熱して反応を停止させた。得られたｃＤＮＡを、−２０℃にて保存した。
【００６５】
プライマ−並びに突然変異内部標準拮抗鋳型の調製は、以下のようにして実施した。理想配列は、オリゴ−ＴＭプライマ−分析ソフトウェア（Ｏｌｉｇｏ−ＴＭ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）（ナショナル・バイオサイエンシズ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、米国ミネソタ州ハメル（Ｈａｍｅｌ））を使用して同定した。プライマ−は、アプライド・バイオ・システムズのモデル３９１ＰＣＲメ−トＤＮＡ合成装置を使用して調製した。プライマ−の配列は以下の通りである。
【００６６】
グルタチオンペルオキシダ−ゼ（ＧＳＨ−Ｐｘ）（チャダ（Ｃｈａｄａ）ら、ジェノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）６：２６８−２７１、１９９０）
天然鋳型並びに突然変異鋳型の双方を増幅するに当たって使用した「外側」のプライマ−からは、長さが３５４塩基対の生成物が生じる。
【００６７】
「外側」の鋳型は、
配列番号１（チャダ（Ｃｈａｄａ）ら、ジェノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）６：２６８−２７１、１９９０）
Ｐｏｓ．２４１ ５’−ＧＧＧＣＣＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＴＣＧＧＣＴ−３’（コ−ド配列）（クロ−ニングされた配列の２４１−２６１の塩基に対応する）、並びに、
配列番号２（チャダ（Ｃｈａｄａ）ら、ジェノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）６：２６８−２７１、１９９０）
Ｐｏｓ．５７４ ５’−ＣＡＡＴＧＧＴＣＴＧＧＡＡＧＣＧＧＣＧＧＣ−３’（アンチコ−ドセンス）（５７４−５９４の塩基とアニ−リングする）
である。
【００６８】
突然変異内部標準を合成するのに使用する「内側」のプライマ−は、天然のｃＤＮＡ塩基対（下線を施したもの）を変化させることによって、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレア−ゼ認識部位（ＧＡＡＴＴＣ）を除去する。
【００６９】
この「内側」のプライマ−は、
配列番号３（チャダ（Ｃｈａｄａ）ら、ジェノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）６：２６８−２７１、１９９０）
Ｐｏｓ．３０９ ５’−ＡＴＴＣＴ ＧＡＴＴＴＣ ＣＣＴＣＡＡＧＴＡＣＧＴＣＣＧＧＣＣＴ−３’（コ−ドセンス）、並びに、
配列番号４（チャダ（Ｃｈａｄａ）ら、ジェノミクス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）６：２６８−２７１、１９９０）
Ｐｏｓ．３０９ ３’−ＴＡＡＧＡ ＣＴＡＡＡＧ ＧＧＡＧＴＴＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＧＧＡ−５’（アンチコ−ドセンス）
である。
【００７０】
双方のプライマ−とも、クロ−ニングされた配列の３０９−３３８の塩基に対応する。突然変異は、センス鎖の３１６の位置に位置する天然のＡがＴによって置換されることによって生じるものである。天然ＧＳＨ−Ｐｘを制限エンドヌクレア−ゼで消化すると、２８０並びに７４塩基対の生成物が生じる。
【００７１】
グリセルアルデヒド３燐酸デヒドロゲナ−ゼ（ＧＡＰＤＨ）（ツォ−（Ｔｓｏ）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）１３：２４８５−２５０２、１９８５）
天然鋳型並びに突然変異鋳型の双方を増幅するに当たって使用した「外側」のプライマ−からは、長さが７８８あるいは７９０塩基対の生成物が生じる。
【００７２】
この「外側」の鋳型は、
配列番号５（ツォ−（Ｔｓｏ）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．）１３：２４８５−２５０２、１９８５）
Ｐｏｓ．４６ ５’−ＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣＧ−３’（コ−ドセンス）（クロ−ニングされた配列の９−３２の塩基に対応する）、並びに、
配列番号６（ツォ−（Ｔｓｏ）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．）１３：２４８５−２５０２、１９８５）
Ｐｏｓ．８１２ ５’−ＣＣＴＣＣＧＡＣＧＣＣＴＧＣＴＴＣＡＣＣＡＣ−３’（アンチコ−ドセンス）（７７７−７９８の塩基とアニ−リングする）
である。
【００７３】
突然変異拮抗鋳型を合成するのに使用する「内側」のプライマ−は、天然のｃＤＮＡ塩基対１つ（下線を施したもの）を変化させることによって、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレア−ゼ認識部位（ＧＡＡＴＴＣ）を創出する。
【００７４】
この「内側」のプライマ−は、
配列番号７（ツォ−（Ｔｓｏ）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．）１３：２４８５−２５０２、１９８５）
Ｐｏｓ．２３４ ５’−ＴＧＡＴＣＡＡＴＧ ＧＡＡＴＴＣ ＣＣＡＴＣＡＣＣＡ−３’（コ−ドセンス）、並びに
配列番号８（ツォ−（Ｔｓｏ）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．）１３：２４８５−２５０２、１９８５）
Ｐｏｓ．２３４ ３’−ＡＣＴＡＧＴＴＡＣ ＣＴＴＡＡＧ ＧＧＴＡＧＴＧＧＴ−５’（アンチコ−ドセンス）
である。
【００７５】
双方のプライマ−とも、クロ−ニングされた配列の１９９−２２２の塩基に対する。突然変異は、センス鎖の２１１の位置に位置する天然のＡがＴによって置換されることによって生じるものである。突然変異ＧＡＰＤＨを制限エンドヌクレア−ゼで消化すると、５８８並びに２００塩基対の生成物が生じる。
【００７６】
別の突然変異ＧＡＰＤＨ鋳型を使用して、いくつかの実験を行なった。この鋳型には、新規なＢａｍＨＩ制限部位が導入されている。
天然鋳型並びに突然変異拮抗鋳型の双方を増幅するに当たって使用した「外側」のプライマ−からは、長さが６３４塩基対の生成物が生じる。
【００７７】
この「外側」の鋳型は、
配列番号９（ツォ−（Ｔｓｏ）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．）１３：２４８５−２５０２、１９８５）
Ｐｏｓ．２００ ５’−ＣＡＴＧＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＡＡＣ−３’（コ−ドセンス）（クロ−ニングされた配列の１６５−１８８の塩基に対応する）、並びに、
配列番号１０（ツォ−（Ｔｓｏ）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．）１３：２４８５−２５０２、１９８５）
Ｐｏｓ．８１３ ５’−ＣＣＴＣＣＧＡＣＧＣＣＴＧＣＴＴＣＡＣＣＡＣ−３’（アンチコ−ドセンス）（７７７−７９８の塩基とアニ−リングする）
である。
【００７８】
突然変異拮抗鋳型を合成するのに使用する「内側」のプライマ−は、天然のｃＤＮＡ塩基対１つ（下線を施したもの）を変化させることによって、ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレア−ゼ認識部位（ＧＧＡＴＴＣ）を創出する。
【００７９】
この「内側」のプライマ−は、
配列番号１１（ツォ−（Ｔｓｏ）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．）１３：２４８５−２５０２、１９８５）
Ｐｏｓ．３６８ ５’−ＣＡＧＧＧＧ ＧＧＡＴＣＣ ＡＡＡＡＧＧＧＴＣＡＴＣＡＴ−３’（コ−ドセンス）、並びに、
配列番号１２（ツォ−（Ｔｓｏ）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．）１３：２４８５−２５０２、１９８５）
Ｐｏｓ．３６８ ３’−ＧＴＣＣＣＣ ＣＣＴＡＧＧ ＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＡＧＴＡ−５’（アンチコ−ドセンス）
である。
【００８０】
双方のプライマ−とも、クロ−ニングされた配列の３３３−３５８の塩基に対応する。突然変異は、センス鎖の３４２の位置に位置する天然のＧがＴによって置換されることによって生じるものである。突然変異ＧＡＰＤＨを制限エンドヌクレア−ゼで消化すると、４６０塩基対並びに１７４塩基対の生成物が生じる。
【００８１】
突然変異拮抗鋳型は、ヒグチ（Ｈｉｇｕｃｈｉ）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）１６：７３５１７３６７、１９８８に記載され、部位特異的突然変異誘発によって調製した。単一塩基が突然変異を生じた結果、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレア−ゼ認識部位が創出（ＧＡＰＤＨ）あるいは欠失（ＧＳＨ−Ｐｘ）した。（ＢａｍＨＩ部位を導入した突然変異ＧＡＰＤＨを使用した実験も行なった。）。突然変異生成物のそれぞれについて、「外側」のプライマ−と「内側」の単一塩基ミスマッチプライマ−を使用した２種の初期ポリメラ−ゼ連鎖反応を行なうと、２種の重複したＤＮＡ断片が生じる。（ＧＳＨ−Ｐｘについてはプライマ−１及び４、並びに、２及び３、そしてＧＡＰＤＨについてはプライマ−５及び８、並びに、６及び７。）
【００８２】
この重複ＤＮＡ断片を、臭化エチディウムで染色した３％ヌ−シ−ヴ（Ｎｕｓｉｅｖｅ）、１％ＬＥアガロ−スゲルで電気泳動にかけた。バンドを切り出し、ミリポア ウルトラフリ−−ＭＣ０．４５μＭフィルタ−（日本ミリポア工業株式会社、米沢）を使用して精製した。精製したＤＮＡをエタノ−ルで沈殿させ、洗浄し、減圧下で乾燥させて、１００μｌの滅菌Ｈ２ Ｏに吸収させた。２種の各重複ＤＮＡ断片１μｌを、外側のプライマ−のみを使用してＰＣＲで増幅した。最初のＰＣＲサイクルはプライマ−を用いずに実施し、ヘテロ二量体を形成させた。全突然変異生成物を、こうして形成し、増幅した。
【００８３】
突然変異ＰＣＲ生成物を、上記のようにしてゲルで精製し、再度増幅して、バルク生成物を形成した。そしてバルク生成物をゲルで精製して、分光光度計で測定した。突然変異生成物をアットモル範囲まで希釈して拮抗鋳型として使用した。１μｇ／ｍｌのニシン精子ＤＮＡ（ロフストランド（Ｌｏｆｔｓｔｒａｎｄ）、米国メリ−ランド州、ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ））を担体として使用した。各突然変異鋳型のサンプルを、制限エンドヌクレア−ゼで消化して、コンタミネ−ションを確実に防止した。
【００８４】
ＰＣＲの条件は以下の通りとした。ＰＣＲの条件は、各実験について、反応混合物１００μｌ当たり、１×ＰＣＲ緩衝液（５０ｍＭのＫＣ１、１０ｍＭのトリス−ＨＣ１（ｐＨ９．０）、１．５ｍＭのＭｇＣ１２ ）、２５ピコモルのＧＳＨ−Ｐｘ及びＧＡＰＤＨをコ−ドするプライマ−、０．２ｍＭのｄＮＴＰ（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）、並びに、一定量の双方の内部標準を含有するマスタ−混合物を使用することによって標準化した。増幅の前に、１００μｌの反応混合物について２．５単位のタックＤＮＡポリメラ−ゼを加えた。ＢＥＰ２Ｄ細胞系から得たｃＤＮＡを連続希釈し、サンプルＰＣＲの試験管に加えた。いずれの実験でも、鋳型を含まず、天然のｃＤＮＡのみ、あるいは突然変異型の標準のみを含む対照用の試験管を増幅して、コンタミネ−ションあるいは酵素の消化が完全に進行しているかどうかについてチェックした。
【００８５】
ＰＣＲによる増幅を、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間、３５サイクルに亘って実施した。増幅の後、ＰＣＲ生成物を１０分間加熱して、ヘテロ二量体の形成が最大となるようにした。
【００８６】
生成物の定量は以下のようにして実施した。各ＰＣＲ試験管のサンプル（４０μｌ）を、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレア−ゼで１２〜１６時間に亘って消化した。（新規なＢａｍＨＩ制限部位を有する突然変異ＧＡＰＤＨを使用して実施した実験も、ＢａｍＨＩ制限エンドヌクレア−ゼで４〜５時間に亘って消化した。）。これらの生成物を、臭化エチディウムで染色した３％ヌ−シ−ヴ（Ｎｕｓｉｅｖｅ）、１％ＬＥアガロ−スゲルで、６０Ｖにて２〜３時間電気泳動を行なうことによって単離した。ポラロイド（Ｐｏｌａｒｏｉｄ）６６５ポジ／ネガインスタントフィルムを使用して、ゲルのネガ写真を撮影した。
【００８７】
ネガ写真をデンシトメトリ−で調べた（ザイネ−・ソフト・レ−ザ−・走査型デンシトメ−タ−・モデルＳＬＲ ２Ｄ／１Ｄ（Ｚｅｉｎｅｈ Ｓｏｆｔ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ Ｍｏｄｅｌ ＳＬＲ
２Ｄ／１Ｄ）でザイネ−１Ｄ・オ−トステップオ−バ−・ビデオフォレ−シス・プログラム・ソフトウェア−（Ｚｅｉｎｅｈ １Ｄ ＡｕｔｏｓｔｅｐｏｖｅｒＶｉｄｅｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用。米国カリフォルニア州フラ−トン（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ）、バイオメッド・インストルメンツ（Ｂｉｏｍｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））。各曲線の下側の面積を計算し、定量に使用した。相対的なバンドのサイズ、並びに、ヘテロ二量体の形成に関して、補正を行なった。デ−タは、ＧＳＨ−Ｐｘ対ＧＡＰＤＨの相対的な比として表した。
【００８８】
２つめの一連の実験では、セリ（Ｃｅｌｉ）の方法に従って調製した拮抗鋳型を用いた多重拮抗逆転写酵素ポリメラ−ゼ連鎖反応（ＭＣ ＲＴ−ＰＣＲ）を実施して、β−ナフトフラボンに暴露したＢＥＰ２Ｄ細胞中のシトクロムｐ４５０（ＣＹＰ）ＩＡＩ遺伝子を評価した。ＣＹＰＩＡＩ遺伝子の発現の誘導は、セリ（Ｃｅｌｉ）の拮抗鋳型を用いたＭＣＲＴ−ＰＣＲとノ−ザン分析の双方を使用して評価した。
【００８９】
拮抗鋳型は、ＣＹＰＩＡＩ遺伝子とＧＡＰＤＨ遺伝子の双方に対して調製したＧＡＰＤＨに対する拮抗鋳型を調製するのに使用したプライマ−は、 配列番号１３（トクナガ（Ｔｏｋｕｎａｇａ）ら、癌研究（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）４７：５６１６−５６１９、１９９０）
Ｐｏｓ．７５ ５’−ＧＧＴ ＣＧＧ ＡＧＴ ＣＡＡ ＣＧＧ ＡＴＴ ＴＧＧ ＴＣＧ−３’Ｐｏｓ．９４、並びに、
配列番号１４（トクナガ（Ｔｏｋｕｎａｇａ）ら、癌研究（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）４７：５６１６−５６１９、１９９０）
【化１】
であった。
【００９０】
拮抗鋳型と天然鋳型の双方を増幅するために、配列番号１３と共に使用した低位の外側プライマ−は、
配列番号１５（トクナガ（Ｔｏｋｕｎａｇａ）ら、癌研究（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）４７：５６１６−５６１９、１９９０）
Ｐｏｓ．８４２ ５’−ＣＣＴ ＣＣＧ ＡＣＧ ＣＣＴ ＧＣＴ ＴＣＡ
ＣＣ−３’Ｐｏｓ．８２２
であった。
【００９１】
ＣＹＰＩＡＩに対する拮抗鋳型を調製するのに使用したプライマ−は、
配列番号１６（ジェイスワル（Ｊａｉｓｗａｌ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２２８：８０−８３、１９８９）
Ｐｏｓ．１２４１ ５’−ＣＡＴ ＣＣＣ ＣＣＡ ＣＡＧ ＣＡＣ ＡＡＣ ＡＡＧ−３’Ｐｏｓ．１２６２、並びに、
配列番号１７（ジェイスワル（Ｊａｉｓｗａｌ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２２８：８０−８３、１９８９）
【化２】
であった。
【００９２】
拮抗鋳型と天然鋳型の双方を増幅するために、配列番号１６と共に使用した低位の外側プライマ−は、
配列番号１８（ジェイスワル（Ｊａｉｓｗａｌ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２２８：８０−８３、１９８９）
Ｐｏｓ．１５７５ ５’−ＡＣＡ ＧＣＡ ＧＧＣ ＡＴＧ ＣＴＴ ＣＡＴ
ＧＧ−３’Ｐｏｓ．１５５５
であった。
【００９３】
ＰＣＲによる増幅に際しての条件は、アニ−リング温度を５５℃とし、増幅を３８サイクルに亘って行なった以外は、ヒグチ（Ｈｉｇｕｃｈｉ）法によってＧＡＰＤＨ及びＧＳＨ−Ｐｘに対して調製した拮抗鋳型を使用した実験について記載したのと同一とした。
前もって制限エンドヌクレア−ゼで消化しておかなくても、天然鋳型と拮抗鋳型が分離するので、サンプルはＰＣＲ反応管から直接取り出して、臭化エチディウムで染色した３％ヌ−シ−ヴ（Ｎｕｓｉｅｖｅ）、１％ＬＥアガロ−スゲルに加えた。ポラロイド６６５ポジ／ネガインスタントフィルムを使用して、ゲルのネガ写真を撮影し、このネガ写真をデンシトメ−タ−で解析することによって、生成物を定量することができた。
【００９４】
β−ナフトフラボン（１０μＭ）と共に各種の時間に亘ってインキュベ−トしたＢＥＰ２Ｄ細胞から採取したＲＮＡは、１％ＬＥホルムアルデヒド変性用ゲルで電気泳動を行なってノ−ザン分析を行なうか、上述のようにＭＣ ＲＴ−ＰＣＲで増幅した。ノ−ザン分析に際しては、ＲＮＡをジ−ンスクリ−ン（Ｇｅｎｅ Ｓｃｒｅｅｎ）に移した後、フィルタ−を32ＰでラベルしたＣＹＰＩＡＩ ｃＤＮＡとハイブリダイズした。
【００９５】
結果
ＰＣＲによる定量に使用した手順を図１に図式的に示す。ＢＥＰ２ＤのｃＤＮＡの連続希釈液（ＲＮＡ合計量で０．２５μｇから０．０５μｇ）を、それぞれ一定量の単一塩基突然変異内部標準（各１０アットモル）と共に増幅してから、上述したようにして分析に供した。図２に示すゲルのネガ写真をデンシトメトリ−で分析して、各バンドを定量した。
【００９６】
各曲線の下側の面積を使用して、天然型生成物／突然変異型生成物の相対的な比を計算した。相対的なバンドのサイズに関して補正を行なった（即ち、突然変異型ＧＡＰＤＨは、天然型ＧＡＰＤＨと比較する際には７８８／５８８を乗じ、天然型ＧＳＨ−Ｐｘは、突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘと比較する際には３５４／２８０を乗じた）。ＰＣＲの後、生成物を１００℃に１０分間加熱してから徐々に冷却することによってヘテロ二量体の形成が最大となるようにした。
【００９７】
ヘテロ二量体の最大化の後、ヘテロ二量体の形成はこうした条件下では二項分布に従うので、デンシトメトリ−のデ−タを二次方程式を使って解析することによって、各生成物の量を決定した（ギリランド（Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ）ら、米国科学アカデミ−紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ）８７：２７２５−２７２９、１９９０、ベッカ−−アンドレ（Ｂｅｃｋｅｒ−Ａｎｄｒｅ）ら、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）１７：９４３７−９４４６、１９８９）。
【００９８】
最終的な値は、天然型ＧＳＨ−Ｐｘ／突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘの天然型ＧＡＰＤＨ／突然変異型ＧＡＰＤＨに対する比率として表した。天然型生成物の量（任意のデンシトメトリ−の単位）を出発ＲＮＡ合計量に対してプロットしたグラフである図３は、ＧＳＨ−Ｐｘ（白抜きの四角）、並びに、ＧＡＰＤＨ（黒塗りの四角）のいずれについても線形に留まらなかったが、天然型ＧＳＨ−Ｐｘ／突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘの比を出発ＲＮＡ合計量に対してプロットしたグラフ、並びに、天然型ＧＡＰＤＨ／突然変異型ＧＡＰＤＨの比を出発ＲＮＡ合計量に対してプロットしたグラフは、いずれの遺伝子についても線形であった。
【００９９】
出発ＲＮＡが少量であると（ＧＳＨ−ＰｘとＧＡＰＤＨの双方の最初の３つの四角）、反応は全過程を通じて指数的に推移するものの、ＲＮＡの量が増加すると、反応は増幅のある時点で非指数的となり、生じる生成物の量は、非制限的な反応の場合に期待されるより少なくなる。各直線は、増幅の全過程を通じて増幅が指数的に推移した場合に形成されたはずの理論上のＰＣＲ生成物（ＧＳＨ−ＰｘあるいはＧＡＰＤＨ）の量を示したものである。
【０１００】
各サンプル管から得られた比（２．１７：１、２．１４：１，２．００：１、１．７６：１、２．４６：１、２．７１：１、及び、１．９２：１）を平均することによって、天然型ＧＳＨ−Ｐｘ／突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘの天然型ＧＡＰＤＨ／突然変異型ＧＡＰＤＨに対する比の平均値として２．１７：１を、標準偏差として０．３３を得た。標準偏差から２５％以上の変異を示す値はなかった。
【０１０１】
この技法のばらつきを検定するために、突然変異標準とマスタ−混合物の各種の希釈液を使用して、上記の実験を繰り返し実施した。各サンプル管から得られた比（１：９．０９、１：８．１３、１：９．４３、１：８．１３、１：６．６２、１：８．７７、１：７．６９、１：１０．００、１：７．５８及び１：７．０４）を平均したところ、天然型ＧＳＨ−Ｐｘ／突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘの天然型ＧＡＰＤＨ／突然変異型ＧＡＰＤＨに対する比の平均値として１：８．２５が、標準偏差として１．０７が得られた。標準偏差から２２％以上の変異を示す値はなかった。この結果から、この技法の精度が裏付けられ、また、突然変異標準の新たな希釈液を含有する新たなマスタ−混合物を使用した場合のばらつきが具体的に示される。
【０１０２】
同一のマスタ−混合物並びに突然変異標準の希釈液を使用した場合のサンプル間のばらつきを検定するために、ＢＥＰ２ＤのＲＮＡを３つの別々のフラスコから独立に抽出し、逆転写してｃＤＮＡとした。ｃＤＮＡの粗希釈（５倍）のみを行なった。各検定について、４本のＰＣＲ管を調べた。得られた天然型ＧＳＨ−Ｐｘ／突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘの天然型ＧＡＰＤＨ／突然変異型ＧＡＰＤＨに対する比は１５．０１：１、１７．６９：１、及び、２１．７６：１（平均＝１８．１５、標準偏差＝３．４０）であった。３つの値はいずれも平均値からの変異が２０％以内であった。この結果は、独立に逆転写される一方、同一のマスタ−混合物並びに内部標準希釈液を用いて増幅されるサンプルを比較する場合における、この技法の精度を裏付けるものである。
ＢＥＰ２ＤのＲＮＡをノ−ザン法で分析したところ、ＧＳＨ−Ｐｘ／ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの比は約１：８であった。
【０１０３】
実施例
ＢＥＰ２ＤのＲＮＡの連続希釈液を、一定量の単一塩基突然変異内部標準拮抗鋳型（各１０アットモル）と共に増幅してから評価した。ゲルのネガ写真（図２に示す）をデンシトメトリ−で分析して、各バンドを定量した。
【０１０４】
バンドをデンシトメトリ−で測定した際に得られた各曲線の下側の面積を用いて、天然型生成物／突然変異型生成物の比を以下のようにして計算した。デ−タは１回に１遺伝子宛から評価した。相対的なバンドのサイズに関して補正を行なった（突然変異型ＧＡＰＤＨは、天然型ＧＡＰＤＨと比較する際には７８８／５８８を乗じ、天然型ＧＳＨ−Ｐｘは、突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘと比較する際には３５４／２８０を乗じた）。ＰＣＲの間には、プライマ−が制限要素である条件下では、相同な配列を有する異種の一本鎖同士がアニ−ルしてヘテロ二量体を形成し得る（ギリランドら（Ｇ．Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ、Ｓ．Ｐｅｒｒｉｎ、Ｋ．Ｂｌａｎｃｈａｒｄ及びＨ．Ｆ．Ｂｕｎｎ）、米国科学アカデミ−紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ）８７：２７２５−２７２９、１９９０）。
【０１０５】
本発明の場合のように異種の鎖が１塩基対のみ異なっている場合には、この異種の鎖は、下記の枡目に示すようにランダムにアニ−リングする（ギリランド（Ｇ．Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ）ら、上掲；トムソンら（Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｉ．Ｂｒｏｄｓｋｙ、及び、Ｊ．Ｊ．Ｙｕｎｉｓ）、血液（Ｂｌｏｏｄ）７９：１６２９−１６３５、１９９２）。
【表１】
ここで、Ｎ＝再アニ−リング前の一本鎖天然型生成物の割合、Ｍ＝再アニ−リング前の一本鎖突然変異型生成物の割合、ＮＮ（あるいはＮ２ ）＝再アニ−リング後の二本鎖天然型生成物の割合、２ＮＭ＝再アニ−リング後に生じたヘテロ二量体の割合、そしてＭＭ（あるいはＭ２ ）＝再アニ−リング後の二本鎖突然変異型生成物の割合である。
【０１０７】
ヘテロ二量体は制限酵素によって切断されず、電気泳動で未消化のホモ二量体と同じ移動を示したので、間接的に計数した。従って、デンシトメトリ−では、ヘテロ二量体は未消化のホモ二量体と一緒に読み取った。上記の枡目の分布に基づいて生成物を定量するため、ＰＣＲの後に、ヘテロ二量体が確実にランダムに形成されるように（上掲ギリランド（Ｇ．Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ）ら、及びトムソン（Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）ら、における方法による）、生成物を１００℃で１０分間加熱してから徐々に冷却した。
【０１０８】
ＧＡＰＤＨについては、天然型生成物（ＮＮ）もヘテロ二量体（ＮＭ）もＥｃｏＲＩで切断されなかった。従って、大型のバンドは天然型ＧＡＰＤＨホモ二量体（ＮＭ）とＮＭヘテロ二量体の両方を示すものであった。このバンドの割合は、算術的には上記の枡目に従ってＮ２＋２ＮＭであり、一方、ＥｃｏＲＩで切断されたバンドの割合はＭ２であった。従って、ＰＣＲ前に天然型（Ｎ）鋳型と突然変異型（Ｍ）鋳型の量が等しい（１：１）場合には、ヘテロ二量体をランダムに形成させた後の見かけの比は３：１〔（Ｎ２＋２ＮＭ）：Ｍ２〕となる筈である。このことを更に説明するために、第１サンプルレ−ン（図５）のデンシトメトリ−の生デ−タを表２に示す。このデ−タを数学的に処理したところ、最終的に下記の比が得られた。
【０１０９】
Ｍ２ の値は分かっており（２，２１４）、Ｎ２ ＋２ＮＭの値も分かっている（１０，０９５）。こうした情報からＭを計算し（４７．０５）、二次式（ａＸ２ ＋ｂＸ＋ｃ＝０）：Ｎ２ ＋２Ｎ（４７．０５）−１０，０９５＝０
でＮを求めた。
Ｎを求めるに当たっては、二次式（Ｎ＝−ｂ±√（ｂ２ −４ａｃ）／２ａ）を使用した。この場合、ａ＝１、ｂ＝９４．１、ｃ＝１０，０９５であるので、Ｎ＝６３．８９である。目的とする情報はＮ／Ｍであるので、６３．８９／４７．１０、即ち、１．３６／１である。（ＰＣＲ後に存在していた一本鎖ＤＮＡの割合を求めたが、これらはＰＣＲ前に存在していた対応する二本鎖ＤＮＡの割合と同一である。）
【０１１０】
デンシトメトリ−の値は相対的なものなので、二次式を使用する不都合を省くべく、各バンドに、加算すると１となる、即ち、（Ｎ２ ＋２ＮＭ）＋Ｍ２ ＝１となる比例したデンシトメトリ−値を割り当てて、
式：（Ｎ２ ＋２ＮＭ）＋Ｍ２ ＝（Ｎ＋Ｍ）２ ＝１、よって、Ｎ＋Ｍ＝１
を解くこともできる。この場合、各バンドに割り当てる１の各相対的部分は、それぞれのデンシトメトリ−値によって決定する（表２）。
【０１１１】
【表２】
双方のバンドのデンシトメトリ−値の合計は１２，３０９（１０，０９５＋２，２１４）なので、大きい方のバンド（Ｎ２ ＋２ＮＭ）の相対的な割合は０．８２（１０，０９５／１２，３０９）となり、小さい方のバンド（Ｍ２ ）の相対的な割合は０．１８（２，２１４／１２，３０９）となる。従って、突然変異型ＧＡＰＤＨホモ二量体（Ｍ２ ）の割合は０．１８となり、一本鎖突然変異型ＧＡＰＤＨ（Ｍ）の割合は０．４２４となる。Ｎ＋Ｍ＝１であるので、一本鎖天然型ＧＡＰＤＨ（Ｎ）の割合は、１−０．４２４、即ち、０．５７６となり、天然型生成物の突然変異生成物型に対する比は、先に計算したように、０．５７６／０．４２４、即ち、１．３６／１となる。
【０１１３】
次に、上記表２のＧＡＰＤＨの値と同じレ−ンの天然、並びに、突然変異ＧＳＨ−Ｐｘのデンシトメトリ−値を使用して同じ計算を実施し、下記の結果を得た。
Ｎ２ ＝０．５５８、Ｎ＝０．７４７、そしてＭ＝１−０．７４７＝０．２５３天然型／突然変異型の比を計算し下記の結果を得た。
天然型ＧＳＨ−Ｐｘ／突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘ＝０．７４７／０．２５３＝２．９５／１
天然型ＧＡＰＤＨ／突然変異型ＧＡＰＤＨ＝０．５７６／０．４２４＝１．３６／１
そして、最終的な比率を計算し、下記の結果を得た。
天然型ＧＳＨ−Ｐｘ／突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘ：天然型ＧＡＰＤＨ／突然変異型ＧＡＰＤＨ＝２．９５／１．３６＝２．１７／１
【０１１４】
上述のように、最終的な値は、天然型ＧＳＨ−Ｐｘ／突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘ：天然型ＧＡＰＤＨ／突然変異型ＧＡＰＤＨの比率として表した。天然型生成物の量（デンシトメトリ−の単位は任意）と出発ＲＮＡの合計量との関係は、（図３に示したように）ＧＳＨ−ＰｘについてもＧＡＰＤＨについても線形のまま推移することはなかったにもかかわらず、天然型ＧＳＨ−Ｐｘ／突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘ：天然型ＧＡＰＤＨ／突然変異型ＧＡＰＤＨの比と出発ＲＮＡの合計量との関係は、（図４に示すように）いずれの遺伝子についても線形で推移した。各サンプル管で得られた天然型ＧＳＨ−Ｐｘ／突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘ：天然型ＧＡＰＤＨ／突然変異型ＧＡＰＤＨの比（２．１７：１、２．１４：１、２．００：１、１．７６：１、２．４６：１、２．７１：１、及び、１．９２：１）を平均することによって、平均値として２．１７：１を、標準偏差として０．３３を得た。平均値から２５％以上の変異を示す値はなかった。
【０１１５】
この技法のばらつきを検定するために、突然変異標準とマスタ−混合物の各種の希釈液を使用して、上記の実験を繰り返し実施した。各サンプル管で得られた天然型ＧＳＨ−Ｐｘ／突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘ：天然型ＧＡＰＤＨ／突然変異型ＧＡＰＤＨの比（１：９．０９、１：８．１３、１：９．４３、１：８．１３、１：６．６２、１：８．７７、１：７．６９、１：１０．００、１：７．５８、及び、１：７．０４）を平均したところ、平均値として１：８．２５が、標準偏差として１．０７が得られた。標準偏差から２２％以上の変異を示す値はなかった。
【０１１６】
同一のマスタ−混合物並びに突然変異標準の希釈液を使用した場合のサンプル間のばらつきを検定するために（新規なＢａｍＨＩ制限部位を有する突然変異型ＧＡＰＤＨを使用）、ＢＥＰ２ＤのＲＮＡを３つの別々のフラスコから独立に抽出し、逆転写してｃＤＮＡとした。ｃＤＮＡの５倍希釈を行なった。各検定について、４本のＰＣＲ管を調べた。得られた天然型ＧＳＨ−Ｐｘ／突然変異型ＧＳＨ−Ｐｘの天然型ＧＡＰＤＨ／突然変異型ＧＡＰＤＨに対する比は１５．０１：１、１７．６９：１、及び、２１．７６：１（平均＝１８．１５、標準偏差＝３．４０）であった。３つの値はいずれも平均値からの変異が２０％以内であった。
【０１１７】
図５に示すように、ＣＹＰＩＡＩ遺伝子の発現は、ノ−ザン分析でもＭＣ ＲＴ−ＰＣＲ分析でも、ほぼ同程度であることが観察された。天然ｃＤＮＡ、並びに、拮抗鋳型ｃＤＮＡを表すＧＡＰＤＨハウスキ−ピング遺伝子の各バンドを比較すると、対象細胞由来のサンプル５μｌのレ−ンと、β−ナフトフラボンに暴露した細胞由来のサンプル３μｌのレ−ン上に、ほぼ同一量のｃＤＮＡが位置していることが明らかである。このように、どのレ−ン上に同一量のｃＤＮＡが位置しているかを測定すると、天然型のＣＹＰＩＡＩ遺伝子を表すバンドが、対象細胞由来のｃＤＮＡを含むレ−ンと比べて、β−ナフトフラボンに暴露した細胞由来のｃＤＮＡを含むレ−ンで遙かに強力に現れていることが明らかとなる。
【０１１８】
【発明の効果】
本発明は上述した通りであって、任意のＰＣＲ法と共に実施することができ、しかも当業界において通常の知識を有する者であれば容易に実施をすることができ、以て遺伝子診断技術の発展、応用に寄与するところ極めて大なる効果がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】標的遺伝子の相対的な発現量をＰＣＲで定量する際の作業手順を図式的に示した図である。
【図２】ＢＥＰ２ＤのｃＤＮＡの連続希釈液（ＲＮＡ合計量は０．２５μｇ−０．０５μｇ）を、一定量の単一塩基突然変異内部標準（各１０アットモル）と共に増殖し、ＥｃｏＲ１制限エンドヌクレア−ゼで消化し、アガロ−スゲルで電気泳動を行なったものを示すものである。
【図３】天然型生成物（ＧＳＨ−Ｐｘ（白抜きの四角）及びＧＡＰＤＨ（黒塗りの四角））をＲＮＡ合計量に対して示したグラフである。
【図４】天然増幅生成物／突然変異増幅生成物（ＧＳＨ−Ｐｘ（白抜きの四角）及びＧＡＰＤＨ（黒塗りの四角））をＲＮＡ合計量に対して示したグラフである。
【図５】（ａ）はＢＥＰ２Ｄ細胞から得たＲＮＡを、対照である０．１％ＤＭＳＯで処理したもの、あるいは、β−ナフトフラボンで処理してシトクロムｐ４５０１Ａ１（ＣＹＰ１Ａ１）を誘導したもののノ−ザン分析の結果を示すものであり、（ｂ）は、（ａ）と同一の細胞から得たｃＤＮＡの連続希釈液からＰＣＲで増幅したＤＮＡを示すものである。
Claims (14)
- 遺伝子の発現を定量的に測定するに当たり、
１）少なくとも１種の標的遺伝子の、少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマ−、
２）少なくとも１種のハウスキ−ピング遺伝子の、少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマ−、
３）前記標的遺伝子の標的配列に対応するヌクレオチドに対して突然変異を生じたヌクレオチドを少なくとも１個有する前記標的遺伝子の少なくとも１種の突然変異拮抗鋳型、
４）前記ハウスキ−ピング遺伝子の標的配列に対応するヌクレオチドに対して突然変異を生じたヌクレオチドを少なくとも１個有する前記ハウスキーピング遺伝子の少なくとも１種の突然変異拮抗鋳型、及び、
５）前記標的遺伝子と前記ハウスキ−ピング遺伝子の双方のＤＮＡをコ−ドする天然型ｃＤＮＡ
の混合物をポリメラ−ゼ連鎖反応によって同時に増幅して、前記標的遺伝子及びハウスキ−ピング遺伝子の天然型ｃＤＮＡと、前記標的遺伝子及びハウスキ−ピング遺伝子の突然変異型ｃＤＮＡとから成るポリメラ−ゼ連鎖反応ｃＤＮＡ生成物を形成する工程と、
前記ｃＤＮＡ生成物を単離する工程と、
前記標的遺伝子をコ−ドする天然型ｃＤＮＡの量、並びに、前記標的遺伝子の突然変異拮抗鋳型をコ−ドする突然変異型ｃＤＮＡの量を、前記ハウスキ−ピング遺伝子をコ−ドする天然型ｃＤＮＡの量、並びに、前記ハウスキ−ピング遺伝子の突然変異拮抗鋳型をコ−ドする突然変異型ｃＤＮＡの量と比較することによって、前記天然型ｃＤＮＡ生成物と前記突然変異型ｃＤＮＡ生成物の相対的存在量を検出する工程とから成ることを特徴とする多重拮抗逆転写酵素ポリメラ−ゼ連鎖反応を使用した遺伝子の発現の定量的測定方法。 - 前記標的遺伝子並びに前記ハウスキ−ピング遺伝子の各突然変異拮抗鋳型が、
１）前記標的遺伝子、あるいは、ハウスキ−ピング遺伝子のそれぞれと相同な配列を含む少なくとも１種のオリゴヌクレオチドから成り、そして、
２）少なくとも一つの既知の制限エンドヌクレア−ゼ認識部位配列、あるいは、制限エンドヌクレア−ゼ認識配列の点突然変異を含むものであることを特徴とする請求項１に記載の多重拮抗逆転写酵素ポリメラ−ゼ連鎖反応を使用した遺伝子の発現の定量的測定方法。 - 前記点突然変異が、天然型鋳型と拮抗鋳型の間における１あるいは２塩基対の違いを含むことを特徴とする請求項２に記載の多重拮抗逆転写酵素ポリメラ−ゼ連鎖反応を使用した遺伝子の発現の定量的測定方法。
- 前記点突然変異によって、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレア−ゼ認識部位が増加又は減少することを特徴とする請求項３に記載の多重拮抗逆転写酵素ポリメラ−ゼ連鎖反応を使用した遺伝子の発現の定量的測定方法。
- 前記標的遺伝子とハウスキ−ピング遺伝子が、同じ制限酵素に対し共通の認識部位を有するものであることを特徴とする請求項１に記載の多重拮抗逆転写酵素ポリメラ−ゼ連鎖反応を使用した遺伝子の発現の定量的測定方法。
- 前記ｃＤＮＡ生成物の単離を、前記ｃＤＮＡ生成物を制限酵素で消化し、その後、消化したｃＤＮＡ生成物を電気泳動にかけて、天然型ｃＤＮＡ生成物を突然変異型ｃＤＮＡ生成物から分離することによって行なうことを特徴とする請求項１に記載の多重拮抗逆転写酵素ポリメラ−ゼ連鎖反応を使用した遺伝子の発現の定量的測定方法。
- 前記標的遺伝子の突然変異拮抗鋳型によってＥｃｏＲＩ制限部位の欠失が生じ、前記ハウスキ−ピング遺伝子の突然変異拮抗鋳型によってＥｃｏＲＩ制限部位の創出が生じることを特徴とする請求項１に記載の多重拮抗逆転写酵素ポリメラ−ゼ連鎖反応を使用した遺伝子の発現の定量的測定方法。
- 前記ｃＤＮＡ生成物の消化を、ＥｃｏＲＩを用いて行なうことを特徴とする請求項６に記載の多重拮抗逆転写酵素ポリメラ−ゼ連鎖反応を使用した遺伝子の発現の定量的測定方法。
- 前記標的遺伝子並びにハウスキ−ピング遺伝子の突然変異拮抗鋳型が、制限酵素で切断されるべき長さに予め人為的に短縮された拮抗鋳型であることを特徴とする請求項１に記載の多重拮抗逆転写酵素ポリメラ−ゼ連鎖反応を使用した遺伝子の発現の定量的測定方法。
- ポリメラ−ゼ連鎖反応による増幅を、天然型鋳型の１本鎖と拮抗鋳型の異種起源の１本鎖を含む二種らせん分子で形成されたヘテロ二量体の形成が最大となる点まで進行させることを特徴とする請求項１に記載の多重拮抗逆転写酵素ポリメラ−ゼ連鎖反応を使用した遺伝子の発現の定量的測定方法。
- 前記少なくとも１種のハウスキ−ピング遺伝子が、グリセルアルデヒド燐酸デヒドロゲナ−ゼ（ＧＡＰＤＨ）、β−アクチン又はリボソ−ムＲＮＡ、あるいは、リボソ−ムタンパク質ＲＮＡより成る群から選ばれるものであることを特徴とする請求項１に記載の多重拮抗逆転写酵素ポリメラ−ゼ連鎖反応を使用した遺伝子の発現の定量的測定方法。
- 前記突然変異拮抗鋳型を、部位特異的突然変異誘発によって生成することを特徴とする請求項１に記載の多重拮抗逆転写酵素ポリメラ−ゼ連鎖反応を使用した遺伝子の発現の定量的測定方法。
- 遺伝子の発現を定量的に測定するに当たって、
ａ）少なくとも１種のハウスキ−ピング遺伝子の、少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマ−を合成し、
ｂ）少なくとも１種の標的遺伝子の、少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマ−を合成し、
ｃ）前記ハウスキ−ピング遺伝子の少なくとも１種の突然変異拮抗鋳型を合成し、
ｄ）前記標的遺伝子の少なくとも１種の突然変異拮抗鋳型を合成し、
ｅ）サンプル細胞あるいはウィリオンから、ＲＮＡ配列の少なくとも一部を単離し、
ｆ）前記ＲＮＡ配列を逆転写して少なくとも１種の天然型ｃＤＮＡを得、
ｇ）前記天然型ｃＤＮＡのポリメラ−ゼ連鎖反応による増幅を、前記標的遺伝子のオリゴヌクレオチドプライマ−、前記ハウスキ−ピング遺伝子のオリゴヌクレオチドプライマ−、並びに、所定量のハウスキ−ピング遺伝子の突然変異拮抗鋳型及び標的遺伝子の突然変異拮抗鋳型の存在下で行ない、
ｈ）上記工程ｇ）で得られた増幅ｃＤＮＡ生成物を、少なくとも１種の制限酵素で消化し、
ｉ）消化したｃＤＮＡを電気泳動にかけ、エチジウムブロマイドで染色し、そして増幅した標的遺伝子及び増幅したハウスキ−ピング遺伝子を、増幅した標的遺伝子の突然変異拮抗鋳型及び増幅したハウスキ−ピング遺伝子の突然変異拮抗鋳型から分離し、そして、
ｊ）前記標的遺伝子並びに標的遺伝子の突然変異拮抗鋳型の量を、前記ハウスキ−ピング遺伝子、並びに、ハウスキ−ピング遺伝子の突然変異拮抗鋳型の量に対して比較することによって、前記標的遺伝子の前記ハウスキ−ピング遺伝子に対する相対的な発現量を測定することを特徴とする多重拮抗逆転写酵素ポリメラ−ゼ連鎖反応を使用した遺伝子の発現の定量的測定方法。 - 予め人為的に、制限酵素で消化されるべき長さに短縮した鋳型を前記突然変異拮抗鋳型として用いて、増幅したｃＤＮＡを制限酵素で消化しなくて済むようにしたことを特徴とする請求項１４に記載の多重拮抗逆転写酵素ポリメラ−ゼ連鎖反応を使用した遺伝子の発現の定量的測定方法。
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