JP3581150B2 - 神経学的損傷からの保護のための薬物 - Google Patents

Description

発明の分野：
本発明は、フルクトース1,6−二リン酸（FDP）との組合せでジメチルスルホキシド（DMSO）を投与することにより、哺乳動物における神経学的損傷からの保護および処置の方法に関する。
発明の背景：
低酸素血症、虚血、および頭蓋内圧上昇は、重篤な頭部損傷、血栓症、および脳出血を含む脳に対する多くの攻撃に関与している。脳は、高エネルギーのアデニルヌクレオチドの蓄積を制限していることから、脳虚血または低酸素症を引き起こすいずれの条件も、好気的酸化的代謝および嫌気的解糖の発生を害し得る。頭部損傷または重篤な低酸素症はまた、有害な量の乳酸の産生を導き得る。さらに、ホスホフルクトキナーゼ（PFK）、フルクトース−６リン酸のフルクトース1,6−二リン酸（FDP）への変換を担う律速酵素であり、細胞性アシドーシスの発症に起因する嫌気的解糖の間阻害され得る。得られる条件は、細胞内アデノシン三リン酸（ATP）（細胞エネルギーの主な供給源）の急速な低下に関する条件である。脳エネルギー状態の悪化もまた、細胞内K⁺の欠乏を生じ、同時に神経細胞膜の脱分極中に細胞内遊離Ca²⁺を促進し得る。実験的証拠により、細胞内Ca²⁺蓄積が、不可逆的な神経細胞死に導く一連の生化学的事象に関連付けられている。これらの事象は、酸化的リン酸化の脱共役、細胞内酵素の活性化、および細胞損傷性水酸基または酸素のフリーラジカルの発生を含む。
先の実験的研究は、静脈内投与したFDPが、ウサギにおいて虚血性損傷後に、電気的な脳の活動量を改善し、そして脳神経細胞を損傷から保護する。多くの研究が、FDPは、虚血および低血糖性昏睡後に、見かけ上、細胞内ATPレベルを増加させ、そして細胞内Ca²⁺蓄積を予防することによって、脳代謝を改善するのに有用であることを示している。FDPは、心臓性ショック、腸虚血、心筋梗塞または心筋虚血、腎虚血、低血糖性昏睡、急性呼吸困難症候群、肝虚血および肝損傷、出血性ショック、腹膜炎、心筋症、不整脈、およびドキソルビシン誘発性心臓毒性に有用であると思われる。FDPは、
腸管液の損失を防止し、平均動脈圧を回復させ、そして尿排出量を保つことによって、エンドトキシンショックを抑制した。しかし、ある研究では、心筋虚血におけるFDPによる有益性の確認は成し得なかった。多くの研究において、FDPは、嫌気的解糖の間のエネルギー生産を増加させ、そして酸素ラジカルの形成を抑制するための理想的な薬剤であると思われるというのが一致した見解である。FDPはリン酸化糖であるが、血液脳関門を通過し、そして神経細胞に入る。理論的には、１モルのFDPは４モルのATPを生成するが、１モルのグルコースは２モルのATPしか生成しない。FDPから利用可能なエネルギーを生産するためには、大量の化合物を投与しなければならない。FDPはまた、脊髄の損傷、頚部、胸部、腹部における銃弾による負傷、頭部の損傷、および十二指腸ヘルニア後の外傷性ショックの患者において有益であることが示されている。
脳外傷または虚血後のジメチルスルホキシド（DMSO）の使用は、細胞膜を保護し、脳血流を増大させ、水酸基ラジカルの形成を抑制し、血小板凝集を阻害し、そして上昇した頭蓋内圧をかなり低下させるとの報告がなされている。サルにおいて、DMSOはまた、平均動脈圧、脳潅流圧、および脳の酸素代謝速度を改善することによって、飛翔体による高度の脳損傷後に効果的であることが示されている。さらにDMSOは、脳の乳酸塩代謝速度を減少させる。乳酸塩の代謝は、乳酸アシドーシスを導き、そして最終的にATP生産の減少を伴う酸化的リン酸化の障害を導き得る。これらの理由から、血管および身体的障害後に脳を保護するためにDMSOを使用することが示唆されている。
DMSOは、多くの実験的研究において、頭蓋内圧の上昇を抑制し、血小板凝集を阻害し、巣状の脳虚血（focal brain ischemia）後の浮腫を減少させ、脳卒中および頭部における銃弾による負傷後の生存を増加させる。さらに、音の障害（sonic damage）に対してグリア細胞を保護し、外傷または虚血後の脳および脊髄の血流を増加させ、放射線および低温誘導性損傷から組織を保護し、腎、腸、および脳に対する虚血性損傷を予防し、脊髄および頭部の外傷後の神経学的結果を改善し、そして閉塞された冠血管において血小板の凝集を阻害し得ることが報告されている。臨床的研究により、DMSOは末期の急性呼吸困難症候群を改善し、そして患者に静注した場合は、重篤な閉鎖性頭部損傷後の頭蓋内圧を減少させ、脳出血後の脳血流を増大させ、原発性アミロイド症患者のアミロイド沈着を減少させ、そしてフリーラジカル除去剤としてのDMSOの作用に一部起因するミトコンドリアの機能およびエネルギー代謝を改善し得ることが示されている。DMSOは、炎症反応の二次的な症状としての反射性交換神経性ジストロフィーの処置において有用であることが示されている。DMSOは、Ｃ−線維を介する疼痛刺激の伝導を抑制することにおいて重要な生物学的活性を有することが報告されており、抗発ガン性、抗ウイルス作用を有し得る。
フルクトース1,6−二リン酸と共にジメチルスルホキシドを使用することが有利であるという示唆は以前には見られない。DMSOおよびFDPが、神経細胞組織に対する損傷を予防することにおいて協同的に作用することは、以前には知られていなかった。
発明の要約：
本発明の目的は、ATP生成に必要とされる充分な量の基質を脳に送達し、そしてそのことによってエネルギー代謝障害に起因する有害な生化学的カスケードを予防するために、ジメチルスルホキシドとフルクトース1,6−二リン酸との組合せを投与することにより、低酸素症および／または虚血中の脳内ATPの涸渇を予防する手段を提供することである。
本発明のさらなる目的は、外傷から生じる低酸素症／虚血を含む低酸素症／虚血の処置に好都合に使用され得る物質の組成物を提供することである。
発明の詳細な説明：
現在では、ジメチルスルホキシド（DMSO）とフルクトース1,6−二リン酸（FDP）との組合せを用いることは、脳低酸素症／虚血を煩う患者に対する利益の予想外の増大をもたらすことが見出されている。これらの薬物を一緒に投与すること（２つの個別の組成物として、あるいは組合せで）の効果によって、脳に損傷を受けた動物（ヒトを含む）において、病的状態からの保護を大きく改善する協同的作用がもたらされる。低酸素症、虚血、または組織浮腫により促進されるエネルギー危機の間に、器官組織を保護し、そして神経組織に対するエネルギーの供給源を提供するためのDSMO:FDPの使用は、長期の疾病または死をもたらし得る長期の神経細胞損傷を防止する手段を提供する。
材料および方法：
無麻酔の雄性CD−１マウス（体重22〜29g）を拘束し、そして特別な外傷装置を用いて800または900g/cmの力による損傷に供した。外傷は、薄い鉛のパイプをガラス管を通して、定められた距離自由落下させることにより、注意深くガラス管下に置かれたマウスの頭部を打撃することによって引き起こされた。この損傷により直ちに意識を喪失し、続いて痙攣活動が１〜２分継続した。３つの終点（end−point）を測定した：
１） 感覚運動欠損から保護する化合物の能力；
２） 死亡率を減少させる化合物の能力；および
３） 頭部の外傷による神経細胞の損傷を抑制する化合物の能力。
第一の研究においては、マウスを無作為に、各グループ６匹の４グループに分けた。以下のうちの一つを（尾静脈に）投与した：
DMSOグループ:5％デキストロース（D5W）中28％溶液として1g/Kgのジメチルスルホキシド
FDPグループ:D5W中10％溶液として350mg/Kgのフルクトース1,6−二リン酸
D5Wグループ：コントロールとしてD5Wのみ
DMSO:FDPグループ:1g/Kgの28％DMSO溶液を添加されたD5W中の350mg/KgFDP。
損傷５分後、全化合物を静注し、そして0.08mlと0.07mlとの間の範囲の用量を、各動物の体重に従って変化させて注入した。800g/cmの力による損傷（800g/cm force injury）後、マウスを加温したケージ内に置き、体温を維持した。FDPの三ナトリウム塩（Simgaを使用し、406.1の分子量であるグレード98〜100％のFDP（式C₆H₁₁O₁₂P₂Na₃）を使用した。DMSOは、Pharma21から、発熱物質無し（pyrogen−free）、滅菌済み、分子量78.1を有する99.9％製薬グレード（式C₂H₆OS）として入手した。
FDPは、結晶形態（塩を含む）で、数カ月間、そして溶液にされると数日間室温で安定である。
本研究で使用されるマウスの頭部損傷モデルは、重篤な脳震盪性損傷において潜在的に有用な化合物の製剤薬剤（pharmaceutical drug）試験で標準的に使用される。
神経学的評価：
頭部損傷１および２時間後に、各マウスを、細いピンセットで前肢および後肢の足指をつまむことによって、感覚欠損について試験した。次に、各マウスは尾をつかまれ、そしてその前足または後足は、パッド付きのテーブル（padded table）上40cmで二本の金属スタンドの間に吊り下げられた張りつめた60cm長の糸に接触させられた。次に尾を放し、そしてマウスが糸をつかみ、そして90秒間糸にしがみつく能力を試験した。次に、各マウスが糸にしがみついていた時間の長さ（グリップ試験）を潜時（latency）として秒数で測定し、そして外傷１または２時間後の各時点の終わりにグループの平均を測定した。各マウスは、各試験期間に対して１回のみ糸上に置いた。
結果：
下記の表は、800g/cmの力による損傷１および２時間後に試験した４グループのそれぞれにおける各マウスに対する「グリップ試験」（マウスが糸にしがみついた秒単位の時間）を示す。数値を秒で表す。

別の試験を利用して、各マウスについて糸上での前足および後足の相対的強度を測定した。この試験は、糸の中心から、糸を保持している垂直な柱の一端に移動するマウスを扱った。この試験は、全四肢の相対的な運動強度を示す。何故なら、前足または後足のみが要求される、単に糸にしがみつくことに対し、マウスが糸の端へ30cm移動するためには、全ての足が要求されるからである。共に組合せDMSO:FDP溶液を投与された２匹のみにこの試験を行った。１匹のマウスが割り当ての90秒間以内に３回糸の端に達し得、そして第２のマウスは２回糸の端に達した。
さらに重篤な損傷である900g/cmの力による損傷後の死亡率を評価するために、別のマウスを用いて第２の研究を実施した。投与の用量および経路は上記を同一であった。いずれかのマウスがこの衝撃力で生存した場合は、感覚運動能力を測定するためにそれらにグリップ試験を行った。以下の結果が得られた：

最初の頭部損傷３時間後に断頭により全てのマウスを屠殺し、そしてパルムグレン（Palmgren）銀含浸染色のために脳を処置した。障害（lesion）の中心部から始めて、そして外傷の部位に対して前−後方向に進行しながら、100μｍごとに４ミクロンの切片を採取した。神経細胞の外傷を評価するために、形態測定用にCA1海馬領域および前頭頭頂皮質を用いた。海馬領域が外傷部位の真下でなかった場合でも、海馬領域を形態測定用に選択した。何故なら、この領域は外傷後に脳虚血および大脳腫脹に対し非常に傷つきやすく、そしてまた海馬は学習および記憶と関連付けられており、その機能は、重篤な脳外傷後にしばしば影響を受けるからである。前頭頭頂皮質の神経細胞を評価した。何故なら、これらは障害部位（lesion site）に近く、そしてこの領域に対する損傷が、実験グループおよび未処置グループ間で比較的一致したからである。前頭頭頂皮質およびCA1領域の神経細胞数は、代表的な５つの切片の海馬または頭頂皮質の各側からの損傷神経細胞数／総神経細胞数を平均することによって求めた。各処置についてグループの平均を求め、そしてこれらの値をビヒクル（未処置）コントロールと比較した。平均、合計、標準偏差、および標準誤差を計算するJandelプログラムに接続されたデジタイジングスクリーン（digitizing screen）を用いて形態的データを解析した。Bonferroni補正を伴う一元配置分散分析（ANOVA）を用い、FDP、DMSOまたは組合せFDP:DMSPの単回投与で処置した各実験グループに対してビヒクル（未処置）マウスの平均グリップ時間を比較することによって、各時点についてグループ試験のスコアの統計解析を行った。ｐ＜0.05値で有意とした。
組織学的所見は、非損傷コントロールマウスならびにフルクトース1,6−二リン酸およびDMSOで処置したマウスにおいて、CA1神経細胞および皮質神経細胞の正常な形状および配列を示した。対照的に、フルクトース1,6−二リン酸またはDMSOのいずれかを単独で投与された動物のCA1および皮質は、中度の神経細胞損傷が見られた。ビヒクル（未処置）で重篤な神経細胞損傷が観察された。ここで損傷はCA1の神経細胞の外側の列まで拡がり、そして皮質においては、多くの神経細胞周囲隙が萎縮した、核濃縮の神経細胞と関連した。
上記を考慮すると、DMSO:FDPを投与されたグループの感覚運動の予備（sparing）は、他のグループと比較すると、DMSOまたはFDPのいずれかのみを使用したいずれの場合よりも有意に大きいと結論される。また形態的データから、FDP:DMSOの組合せは、CA1海馬神経細胞および前頭頭頂皮質の神経細胞に対する保護効果を有し、ここで損傷の量はFDPまたはDMSO単独よりも、あるいはビヒクルで処置した動物よりも有意に低かった。統計解析は、分散分析（ANOVA）およびノンパラメトリックMann−Whitneyの２標本検定を用いて、これらの差が非常に有意（ｐ＜0.002）であることを示している。死亡率もまた、頭部に重篤な震盪性の力を与えたマウスにおいて非常に減少した。従って、この証拠は、DMSO単独またはFDP単独の使用と比較した場合、DMSO:FDPを用いた処置に対して予期しなかった協同効果があることを示す。
本発明の組成物の使用について試験したモデルは重篤な様式（mode）であったが、組成物は、虚血および低酸素症が原因で生じる他の疾患状態を処置するために用い得る。このような状態は、閉鎖性頭部損傷に加えて、脳卒中、くも膜嚢胞、新生物、水頭症、結核性髄膜炎、隨膜ヘルニア、偽脳腫瘍、鉛脳障害、銃弾による負傷、後天性免疫不全症候群（AIDS）、ライ症候群、および髄膜炎（細菌性、真菌性、およびウイルス性髄膜炎を含む）のような脳虚血／低酸素症を引き起こし、または頭蓋内圧を上昇させるいずれの状態もを含む。組成物はまた、虚血または低酸素症を引き起こす他の疾患状態を処置するために使用し得る。このような疾患状態は、心筋不全、脳水腫、腫瘍、血管形成異常、出血性ショック、心臓性ショック、外傷性脳昏睡、脊髄損傷、脊髄腫瘍、脊髄空洞症を含む。本発明の組成物はまた、脳エネルギー関連障害の処置に用いられ得る。このような障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、副腎脳白質ジフトロフィー、拳闘家痴呆、ハンチントン舞踏病、多発脳梗塞性痴呆、ピック病、肝性脳障害、および核黄疸のような神経変性障害を含む。
２例のヒト患者をフルクトース1,6−二リン酸およびDMSOで処置した。
患者♯１：
患者は、創傷部より脳組織の突出を伴う重篤な頭部損傷のために収容された。５％デキストロース水溶液による28％DMSOおよび10％FDPを含む溶液を、総用量で200mg/Kg/日となるように３分割された用量で、４日間投与した。４日目に、患者は眼を開き、そして指示に従い得た。次に、患者に損傷に対する手術を施した。
患者♯２：
３カ月間の左内包の脳梗塞（MRIスキャンにて確認）のため、上記の通り、10％FDPおよび28％DMSO溶液を用いて患者を処置した。処置前、患者は右手の指を動かし得ず、また部分的に麻痺した右腕を水平面より上には上げられ得なかった。処置３日目に患者は、右手の指を部分的に動かし得、そして頭部より上に右腕を上げ得た。
ジメチルスルホキシドおよびフルクトース1,6−二リン酸を含む組成物を非経口的（静脈内、筋肉内、髄腔内、および皮下を含む）、および局所的（粘膜または皮膚を含む、例えば、舌下または吸入）、または経口的に投与し得る。粘膜または皮膚との接触用（例えば直腸または舌下）に投与される組成物は、全身的効果をもたらす。DMSO:FDP組成物は停留浣腸としてまたは坐薬の剤型で投与し得る。
実施例1:活性薬剤を含む溶液の調製：
バイアル中の予め重量を測定したフルクトース1,6−二リン酸の三ナトリウム塩を、撹拌によりD5W（デキストロース５％水溶液）に溶解し、10％FDPの最終的な溶液を作成した。測定された容量の100％の滅菌した、発熱物質無しの製薬グレードのDMSOをD5W中のFDPに添加し、28％DMSOの最終的な溶液を作成した。D5W中のDMSO:FDP混合物は、室温では数日間、４℃では数週間安定である。DMSO:FDP溶液は調製後速やかに使用することが推奨される。
実施例2:パッチ剤の調製
非透過性裏材と保護被覆層との間に挟まれた接着性マトリクスの三層ラミネート（trilaminate）から成るパッチ剤を以下の様式で調製した：
DMSO（50％W/V）中のBIOPSA^TM Q7−2920（DOW Corning Corp.,Midland,Michigan,U.S.A.）のような感圧シリコーン接着性組成物に、1mlあたり10mgフルクトース1,6−二リン酸を供給するのに充分飽和した、フルクトース1,6−二リン酸のD5W溶液に添加した。約5mgのFDP cm²を供給するように、連続層中のポリエステルフィルムにこの接着物を塗布する。次いで、この接着物を含むフィルムを10cm²のパッチ剤にした。パッチ剤の適用前に取り去られる保護層でパッチ剤を覆う。（DMSOは浸透増強剤であることから、パッチ剤の作成において他の浸透増強剤を供給する必要はない。）
本発明の組成物はドナー器官の保存にも使用され得る。酸素の非存在下で急速にATPが分解することは周知である。24時間後、肝、腎、および心臓組織からのATP損失は約90％である。ATP損失の結果として、酵素系の活性の変化が生じると考えられている。このような変化により、結果的に不可逆的な器官の損傷が生じる。DMSOは、移植前のドナー器官を保護する。FDPは、内因性ATPの組織レベルを上昇させる。組合せられたこれらの薬剤は、ドナー器官のより良好な生存能および保存状態を生じる。
実施例3:ドナー器官の保護のための溶液
フルクトース1,6−二リン酸（FDP）を溶解して半通常生理食塩水（half normal saline）中10％W/Vの最終的な溶液を作成する。DMSOを添加して、10％DMSOを含む組成物を作成する。（FDPの最終濃度は約９％）
FDPおよびDMSOの両濃度は、提供された量が損傷から器官を保護し、そして細胞機能を維持するためにATPの充分なレベルの維持をもたらすのに充分である限り、かなり変化し得る。
フルクトース1,6−二リン酸の塩は、本発明の組成物の調製に使用され得る。動物に対するDMSOの用量は、約10mg/Kgから1500mg/Kgまで変化するが、一方、FDPの用量は約1mg/Kg〜600mg/Kgである。活性薬剤は、任意の適切な薬学的に許容可能なキャリアー中で投与され得る。このようなキャリアーの例としては、５％デキストロース、リンゲル乳酸塩溶液、または通常生理食塩水がある。
坐薬での送達のために、FDPは、DMSOとの併用投与のための坐薬形態の飽和溶液として供給され得る。

Claims (18)

1. 薬学的に許容可能なキャリアー中に、神経細胞保護量のジメチルスルホキシドおよびフルクトース1,6−二リン酸あるいは薬学的に許容可能なその塩を含有する、神経細胞保護のための組成物。
2. 前記神経細胞保護量のフルクトース1,6−二リン酸が、塩として前記組成物中に存在する、請求項１に記載の組成物。
3. 50mgから1500mgまでの神経細胞保護量のジメチルスルホキシドおよび1mgから600mgまでの神経細胞保護量のフルクトース1,6−二リン酸を含有する、請求項１に記載の組成物。
4. 前記薬学的に許容可能なキャリアー溶液中にデキストロースを含有する、請求項１に記載の組成物。
5. 前記薬学的に許容可能なキャリアーが等張溶液である、請求項１に記載の組成物。
6. パッチ剤として処方された、請求項１に記載の組成物。
7. 直腸投与のために処方された、請求項１に記載の組成物。
8. 滅菌され、かつ静脈内投与に特異的であるように処方された、請求項１に記載の組成物。
9. 経口投与のために処方された、請求項１に記載の組成物。
10. 薬学的に許容可能なキャリアー中に神経 細胞保護量のジメチルスルホキシドを含む組成物、およ び薬学的に許容可能なキャリアー中に神経細胞保護量の フルクトース1,6−二リン酸あるいは薬学的に許容可能 なその塩を含む組成物を備える、神経学的損傷からの保 護のための投薬キット。
11. 前記神経細胞保護量のフルクトース1,6 −二リン酸が、塩として前記組成物中に存在する、請求 項10に記載のキット。
12. 50mgから1500mgまでの神経細胞保護量の ジメチルスルホキシドおよび1mgから600mgまでの神経細 胞保護量のフルクトース1,6−二リン酸を含有する、請 求項10に記載のキット。
13. 前記薬学的に許容可能なキャリアー溶液 中にデキストロースを含有する、請求項10に記載のキッ ト。
14. 前記薬学的に許容可能なキャリアーが等 張溶液である、請求項10に記載のキット。
15. パッチ剤として処方されている、請求項 10に記載のキット。
16. 直腸投与のために処方されている、請求 項10に記載のキット。
17. 滅菌され、かつ静脈内投与に特異的であ るように処方されている、請求項10に記載のキット。
18. 経口投与のために処方されている、請求 項10に記載のキット。