JP3580158B2 - モノアルキルアミノ型ホスホルアミダイト化合物 - Google Patents
モノアルキルアミノ型ホスホルアミダイト化合物 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は新規なモノアルキルアミノ型ホスホルアミダイト化合物に関するものであり、本発明におけるモノアルキルアミノ型ホスホルアミダイト化合物は、例えば、ＤＮＡオリゴマーの中間原料として有機合成化学、生化学および医薬産業上において有用な化合物である。
【０００２】
【従来の技術】
これまで、ＤＮＡ合成試薬としては、前記式（１）においてＲ１およびＲ２のいずれも水素原子であり、Ｘがジアルキルアミノ基であるホスホルアミダイト化合物が知られている［エイチ・ケスター（Ｈ． Ｋｏｅｓｔｅｒ）ら、テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ）、５２，５８４３（１９８３）．および特許協力条約（ＰＣＴ） ＷＯ９７／４２２０２を参照されたい］。
前記ホスホルアミダイト化合物を、ＤＮＡオリゴマーの中間原料として用いる場合には、２−シアノエトキシジアルキルアミノホスフィン誘導体と５’−Ｏ，塩基保護−ヌクレオシドとを反応させ、ＤＮＡ合成試薬とするのが一般的である。
この方法によれば、ＤＮＡの化学合成の原料を安定的に得ることができるが、純度良く目的物を得るために、生成する副生物あるいは不純物を除去することが必要であり、そのため操作上の煩雑さが生じ、コストが嵩む等の問題がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ＤＮＡ合成試薬の製造において単離精製工程を必要とせずに、反応液をそのままＤＮＡオリゴマーの合成に用いることができるｉｎ ｓｉｔｕ ＤＮＡ合成試薬となる、モノアルキルアミノ型ホスホルアミダイド化合物を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、下記式（１）で表されるモノアルキルアミノ型ホスホルアミダイト化合物を用いた場合に、前記課題が解決されることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は下記式（１）で表されるモノアルキルアミノ型ホスホルアミダイト化合物である。
【０００５】
【化３】
【０００６】
｛式中、Ｂは必要に応じてヌクレオチド化学において通常の保護基で保護した塩基を示し、Ｒ１およびＲ２は水素原子、またはヘテロ原子を含んでいてもよいアルキル基、シクロアルキル基、アリール基もしくはアラルキル基を示し、Ｒ３は保護基、Ａは水素原子、水酸基、アルコキシ基またはトリアルキルシリルオキシ基を示し、ＸはＨＮＲ５で示されるモノアルキルアミノ基（Ｒ５はアルキル基またはシクロアルキル基）を示す。ただし、Ｒ１およびＲ２のいずれもが水素原子、メチル基またはエチル基である場合を除く。｝
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明におけるモノアルキルアミノ型ホスホルアミダイト化合物は、前記式（１）で表される化合物であり、式（１）におけるＢは周知の塩基であり、アデニン、グアニンおよびヒポキサンチンなどのプリン誘導体、ならびにシトシン、チミンおよびウラシルなどのピリミジン誘導体などが挙げられ、具体的には、１−チミニル基、１−（Ｎ−４−ベンゾイルシトシニル）基、９−（Ｎ−６−ベンゾイルアデニニル）基および９−（Ｎ−２−イソブチリルグアニニル）基などが挙げられる。
Ｒ１およびＲ２としては、水素原子、メチル基、エチル基、ノルマルプロピル基、イソプロピル基、イソブチル基、セカンダリーブチル基、ターシャリーブチル基、ノルマルペンチル基、１−メチルブチル基、１−エチルプロピル基、シクロヘキシル基、ノルマルノニル基、２−フェニルエチル基、２−（メチルチオ）エチル基、フェニル基、１，１−ジエチル−３−ブテニル基および１，１−ジメチル−２−フェニルエチル基などが挙げられる（ただし、Ｒ１およびＲ２のいずれもが水素原子、メチル基またはエチル基の場合を除く）。
また、Ｒ３としては、トリチル基、４−メトキシトリチル基および４，４’−ジメトキシトリチル基などが挙げられ、Ｘとしては、イソプロピルアミノ基、ノルマルブチルアミノ基、イソブチルアミノ基、ターシャリーブチルアミノ基、ネオペンチルアミノ基およびシクロヘキシルアミノ基などが挙げられる。
【０００８】
本発明におけるモノアルキルアミノ型ホスホルアミダイト化合物は、下記式（３）で表されるヌクレオチド誘導体と下記式（４）で表される第一アルキルアミンとの反応に容易に製造することができる｛下記式（５）｝。
【０００９】
【化４】
【００１０】
｛式中、Ａ、Ｂ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は前記式（１）と同じであり、Ｙはイミダゾリル基、２−メチルイミダゾリル基および４−メチルイミダゾリル基等のアゾリル基を示す。｝
【００１１】
【化５】
【００１２】
｛Ｘは前記式（１）と同じである。｝
【００１３】
【化６】
【００１４】
｛式中、Ａ、Ｂ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＸは前記式（１）と同じであり、Ｙは前記式（３）と同じである。｝
【００１５】
一方、前記式（３）で表されるヌクレオチド誘導体は、下記式（６）で表される５’−Ｏ，塩基保護−ヌクレオシドと下記式（７）で表されるオルガノオキシビスアゾリルホスフィンとの反応により容易に製造することができる｛下記式（８）｝。
【００１６】
【化７】
（式中、Ａ、ＢおよびＲ３は前記式（１）と同じである。）
【００１７】
【化８】
【００１８】
｛式中、Ｒ１およびＲ２は前記式（１）と同じであり、Ｙは前記式（３）と同じである。｝
【００１９】
【化９】
【００２０】
｛式中、Ａ、Ｂ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は前記式（１）と同じであり、Ｙは前記式（３）と同じである。｝
【００２１】
前記式（８）で表される反応は、５’−Ｏ，塩基保護−ヌクレオシドを減圧乾燥するか、あるいはピリジンもしくは１，４−ジオキサン等の有機溶媒に溶解してから共沸脱水した後、トルエン、ピリジン、テトラヒドロフラン、クロロホルムまたはアセトニトリル等の有機溶媒溶液中、５’−Ｏ，塩基保護−ヌクレオシドに対し０．９〜１．２当量のオルガノオキシビスアゾリルホスフィンを、−８０℃〜室温の条件で混合させて反応させることにより達成される。低温で反応させた方が、前記式（３）で表される化合物の収率が良い。なお、有機溶媒は乾燥剤で乾燥後、蒸留精製したものを用いることが好ましい。この反応溶液の３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルを測定して反応が完了したことを確認することができる。
一方、前記式（５）で表される反応は、前述のようにして製造した化合物（３）の反応溶液に、第一アルキルアミンを化合物（３）に対して０．９〜１．２当量加えることにより達成される。このようにして得られたモノアルキルアミノ型ホスホルアミダイド化合物は、単離精製することなく、反応溶液をそのままｉｎ ｓｉｔｕ ＤＮＡ合成試薬としてオリゴヌクレオチドの合成に用いることができる。前記式（７）で表されるオルガノオキシビスアゾリルホスフィンは、下記式（９）で表されるオルガノオキシジクロロホスフィンと下記式（１０）で表されるＮ−トリメチルシリルアゾール化合物との反応により容易に製造することができる｛下記式（１１）｝。
【００２２】
【化１０】
【００２３】
（式中、Ｒ１およびＲ２は前記式（１）と同じである。）
【００２４】
【化１１】
【００２５】
（式中、Ｙは前記式（３）と同じである。）
【００２６】
【化１２】
【００２７】
（式中、Ｒ１およびＲ２は前記式（１）と同じであり、Ｙは前記式（３）と同じである。）
【００２８】
前記式（１１）で表される反応は、トルエンまたはクロロホルム等のハロゲン系有機溶媒溶液中、室温の条件で、前記オルガノオキシジクロロホスフィンに、これに対し２〜３当量の前記Ｎ−トリメチルシリルアゾール化合物を混合させて行なう。この反応溶液の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定して反応が完了したことを確認した後、副生したクロロトリメチルシラン、反応溶媒および過剰のＮ−トリメチルシリルアゾール化合物などを減圧留去すれば、オルガノオキシビスアゾリルホスフィンが得られる。なお、有機溶媒は乾燥剤で乾燥後、蒸留精製したものを用いることが好ましい。
前記式（９）で表されるオルガノオキシジクロロホスフィンは、下記式（１２）で表されるオルガノオキシトリメチルシランと三塩化リンとの反応により容易に製造することができる｛下記式（１３）、畑辻明ら、ヌクレイック・アッシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅｒｃｈ）、１７，８５８１（１９８９）｝。
【００２９】
【化１３】
【００３０】
｛式中、Ｒ１およびＲ２は前記式（１）と同じである。｝
【００３１】
【化１４】
【００３２】
（式中、Ｒ１およびＲ２は前記式（１）と同じである。）
【００３３】
前記反応は、０℃の条件で、オルガノオキシトリメチルシランとこれに対し２〜５当量の三塩化リンとを混合し、室温で１時間〜１０日間静置することにより達成され、生成物を常法に従って減圧蒸留すれば、オルガノオキシジクロロホスフィンが得られる。
前記式（１２）で表されるオルガノオキシトリメチルシランは、下記式（１４）で表される２−シアノエタノール誘導体と１，１，１，３，３，３−ヘキサメチルジシラザンとの反応｛下記式（１５）｝、または下記式（１６）で表されるアルデヒドもしくはケトンとシアノメチルリチウムなどのシアノメチルアルカリ金属化合物との反応生成物に、クロロトリメチルシランを反応させることにより｛下記式（１７）｝、容易に製造することができる。
前記シアノメチルアルカリ金属化合物は、アセトニトリルのシアノ基に隣接した活性水素を、ノルマルブチルリチウムなどを用いてアルカリ金属化することにより容易に製造することができる｛（下記式（１８））。
【００３４】
【化１５】
【００３５】
（式中、Ｒ１およびＲ２は前記式（１）と同じである。）
【００３６】
【化１６】
【００３７】
（式中、Ｒ１およびＲ２は前記式（１）と同じである。）
【００３８】
前記式（１５）で表される反応は、２−シアノエタノール誘導体とこれに対し１〜２当量の１，１，１，３，３，３−ヘキサメチルジシラザンおよび０．００５〜０．１当量のイミダゾールを混合し、１〜５時間かきまぜながら加熱・還流させることにより達成され、生成物を常法に従って減圧蒸留すれば、目的のオルガノオキシトリメチルシランが得られる。
【００３９】
【化１７】
【００４０】
｛式中、Ｒ１およびＲ２は前記式（１）と同じである。｝
【００４１】
【化１８】
【００４２】
（式中、Ｒ１およびＲ２は前記式（１）と同じである。）
【００４３】
【化１９】
【００４４】
前記式（１７）および（１８）で表される反応は以下のように行なう。まず、−８０〜−６０℃の条件で、ノルマルブチルリチウムのノルマルヘキサン／テトラヒドロフラン（１／２）溶液にこれに対し１．０〜１．２当量のアセトニトリルをで加えて、０．５〜２時間かき混ぜて反応させてシアノメチルリチウムのノルマルヘキサン／テトラヒドロフラン溶液を得る。これに−８０〜−６０℃の条件で、１．０〜１．２当量の前記アルデヒドもしくはケトンを加え、反応温度を０．５〜１時間かけて室温に戻した後、１．２〜１．５当量のクロロトリメチルシランを加えてかき混ぜることにより反応は達成される。なお、有機溶媒は乾燥剤で乾燥後、蒸留精製したものを用いることが好ましい。生成物を常法に従って減圧蒸留すれば、オルガノオキシトリメチルシランが得られる。
前記式（１０）で表されるＮ−トリメチルシリルアゾール化合物は、
下記式 （１９）で表されるアゾール類と１，１，１，３，３，３−ヘキサメチルジシラザンとの反応により容易に製造することができる｛下記式（２０）｝。
【００４５】
【化２０】
【００４６】
（式中、Ｙは前記式（３）と同じである。）
【００４７】
【化２１】
【００４８】
（式中、Ｙは前記式（３）と同じである。）
【００４９】
前記反応は、前記式（１９）で表されるアゾール類と、これに対し１〜２当量の１，１，１，３，３，３−ヘキサメチルジシラザンとを混合し、３〜２４時間かきまぜながら加熱・還流させることにより達成され、このものを常法に従って減圧蒸留すれば、Ｎ−トリメチルシリルアゾール化合物が得られる。
【００５０】
上記の方法で製造されたモノアルキルアミノ型ホスホルアミダイト化合物は、オリゴヌクレオチドを化学合成する際の中間原料として有用である。例えば、２−シアノ−１−ターシャリーブチルエトキシビス（４−メチルイミダゾリル）ホスフィンを、５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジンと反応させると、同ヌクレオシドの３’−Ｏ−４−メチルイミダゾリルホスフィン誘導体を収率良く得る。この反応溶液に、イソプロピルアミンを加えると、同ヌクレオシドの３’−Ｏ−イソプロピルアミノ型ホスホルアミダイト誘導体を定量的に得る。さらに、触媒としてテトラゾールを用い、この反応溶液をそのままｉｎ ｓｉｔｕでＤＮＡ自動合成機上での固相合成に用いることにより、ＤＮＡオリゴマーを収率良く得ることができる。
【００５１】
なお、本発明におけるモノアルキルアミノ型ホスホルアミダイド化合物としては、ＤＮＡオリゴマーの収率の面から、下記条件で計算した、式（１）における置換基Ｒ１およびＲ２のファンデルワールス（ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ）体積の和が４９（オングストローム） ３ 以上である化合物が好ましい。例えば、Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２がノルマルプロピル基である場合のモノアルキルアミノ型ホスホルアミダイド化合物などが例示される。
ファンデルワールス（ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ）体積の計算方法
下記式（２）で表されるオルガノオキシビス（４−メチルイミダゾリル）ホ
スフィンにおいて、まず、ＳＰＡＲＴＡＮＴＭ Ｖｅｒｓｉｏｎ４．１．１（Ｗａｖｅｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．）により三次元分子構造を決定し、ＭＭ力場を使って立体的エネルギーの最適化を行った後、半経験的分子軌道法（ＡＭ１）により立体構造を確定した。次に、ＡＭ１により得られた立体構造に基づいて、ＴＳＡＲＴＭ３．０（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｇｒｏｕｐ）の分子体積計算プログラムにより置換基Ｒ１およびＲ２のファンデルワールス（ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ）体積を求めた。
【００５２】
【化２２】
【００５３】
｛式中、Ｒ１およびＲ２は前記式（１）と同じであり、Ｙは４−メチルイミダゾリル基を示す｝
【００５４】
【実施例】
以下、実施例により本発明について詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
前記式（１）においてＡが水素原子、Ｂが１−チミニル基、Ｒ１が水素原子、Ｒ２がターシャリーブチル基、Ｒ３が４，４’−ジメトキシトリチル基、Ｘがイソプロピルアミノ基である下記式（２１）で表されるモノアルキルアミノ型ホスホルアミダイト化合物の製造
【００５５】
【化２３】
【００５６】
トルエン（５ｍｌ）溶液中、アルゴン雰囲気下、室温の条件で２−シアノ−１−ターシャリーブチルエトキシジクロロホスフィン０．３３２ｇ（１．４６ｍｍｏｌ）とトリメチルシリル−４−メチルイミダゾール０．４９５ｇ（３．２１ｍｍｏｌ）とを加え、５分間反応させた。副生したクロロトリメチルシランおよびトルエンを室温で１０分間減圧留去した後、残留トルエンおよび過剰のトリメチルシリル−４−メチルイミダゾールを４０℃の条件で２時間減圧留去し、無色透明、油状の２−シアノ−１−ターシャリーブチルエトキシビス（４−メチルイミダゾリル）ホスフィンを得た。さらに、アルゴン雰囲気下、室温の条件で、前記で得られた２−シアノ−１−ターシャリーブチルエトキシビス（４−メチルイミダゾリル）ホスフィンを重クロロホルム２．９ｍｌに溶解した溶液（０．５Ｍ）を、室温で２時間減圧乾燥した５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン０．７９４ｇ（１．４６ｍｍｏｌ）に加えた。均一にした後、そのまま一晩静置して反応させ、下記式（２２）で表されるヌクレオチド誘導体を得た。得られた生成物の３１ＰＮＭＲ（外部標準；（ＣＨ３Ｏ）３Ｐ ＝１４０ｐｐｍ， ＣＤＣｌ３）δは １２７．９，１２８．２，１２８．４，１３０．８ｐｐｍ．であった（ ３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルは１６１．７ＭＨｚＮＭＲ測定装置で測定した）。
【００５７】
【化２４】
【００５８】
上記で得られた反応溶液にイソプロピルアミン０．０８６ｇ（１．４６ｍｍｏｌ）を室温で加えて反応させ、目的物である前記式（２１）で表されるモノアルキルアミノ型ホスホルアミダイト誘導体を定量的に得た。得られた生成物の３１ＰＮＭＲ（外部標準；（ＣＨ３Ｏ）３Ｐ ＝１４０ｐｐｍ， ＣＤＣｌ３）δは１４１．８，１４２．４，１４４．５，１４５．８ｐｐｍ．であった（ ３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルは１６１．７ＭＨｚＮＭＲ測定装置で測定した）。
【００５９】
（応用例）
前記式（２１）で表されるモノアルキルアミノ型ホスホルアミダイト化合物を用いた、固相法によるＤＮＡ自動合成機上でのｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ）（チミジン２０量体）の合成
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジンを１，４−ジオキサンに溶解後、共沸脱水し、かつ２−シアノ−１−ターシャリーブチルエトキビス（４−メチルイミダゾリル）ホスフィンとの反応溶媒としてアセトニトリルを用いてその濃度を０．１Ｍとした以外は、実施例１と同様にしてモノアルキルアミノ型ホスホルアミダイト化合物を製造した。
得られた化合物の０．１Ｍアセトニトリル反応溶液をそのまま原料として用いて、触媒としてテトラゾールを用いて、ＤＮＡ自動合成機上でアミダイト法のプロトコールに従って固相法によりチミジンの２０量体を合成した。得られた反応生成混合物を逆相ＨＰＬＣ分析した結果、その平均縮合収率は９９．１％であった。
【００６０】
（実施例２〜７）
実施例１と同様の操作により、表１および２に示したＮｏ．２〜Ｎｏ．７のモノアルキルアミノ型ホスホルアミダイト化合物を製造した。各モノアルキルアミノ型ホスホルアミダイト化合物｛前記式（１）｝およびその前駆体であるヌクレオチド誘導体｛前記式（２）｝の３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルのケミカルシフト（δ）（外部標準；（ＣＨ３Ｏ）３Ｐ ＝１４０ｐｐｍ、１６１．９ＭＨｚＮＭＲ測定装置で測定）、置換基Ｒ１およびＲ２のファンデルワールス（ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ）体積の和（置換基体積（Ｒ１＋Ｒ２））を表１に示した。また、各モノアルキルアミノ型ホスホルアミダイト化合物の０．１Ｍアセトニトリル反応溶液をそのまま原料として用いて、触媒としてテトラゾールを用いて、固相法によりＤＮＡ自動合成機上でアミダイト法の標準的なプロトコールによりチミジン、シチジンまたはアデノシンの各２０量体を合成した際の平均縮合収率（固相合成縮合収率）をそれぞれ表１に示した。なお、表１における置換基Ｒ２、ＸおよびＹの構造は下記表２に示した。
Ｎｏ．２〜Ｎｏ．７に示したモノアルキルアミノ型ホスホルアミダイト化合物は、前記式（１）において、Ａが水素原子、Ｒ３が４，４’−ジメトキシトリチルである下記式（２３）で表される化合物である。
【００６１】
【化２５】
【００６２】
｛式中、ＤＭＴｒは４，４’−ジメトキシトリチル基を表し、Ｂ、Ｒ１、Ｒ２およびＸは前記式（１）と同じである。｝
【００６３】
【表１】
【００６４】
｛表１において、Ｂ欄のＴは１−チミニル基を、ＣＢｚは１−（Ｎ−４−ベンゾイルシトシニル）基を、およびＡＢｚは９−（Ｎ−６−ベンゾイルアデニニル）基をそれぞれ表す。｝
【００６５】
【表２】
【００６６】
表１から明らかなように、実施例１で得られた化合物（２０）は、これをｉｎ ｓｉｔｅ ＤＮＡ合成試薬として用いて場合、その平均縮合収率は９９．１％と極めて優れたものである。
【００６７】
【発明の効果】
本発明のモノアルキルアミノ型ホスホルアミダイト化合物は、オリゴヌクレオチドの中間原料として用いる場合、その製造工程において単離精製工程を省くことができるｉｎ ｓｉｔｕ ＤＮＡ合成試薬として有用であり、本発明のモノアルキルアミノ型ホスホルアミダイト化合物を利用することにより、極めて高い平均縮合収率でＤＮＡオリゴマーを合成できる。
【発明の属する技術分野】
本発明は新規なモノアルキルアミノ型ホスホルアミダイト化合物に関するものであり、本発明におけるモノアルキルアミノ型ホスホルアミダイト化合物は、例えば、ＤＮＡオリゴマーの中間原料として有機合成化学、生化学および医薬産業上において有用な化合物である。
【０００２】
【従来の技術】
これまで、ＤＮＡ合成試薬としては、前記式（１）においてＲ１およびＲ２のいずれも水素原子であり、Ｘがジアルキルアミノ基であるホスホルアミダイト化合物が知られている［エイチ・ケスター（Ｈ． Ｋｏｅｓｔｅｒ）ら、テトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ）、５２，５８４３（１９８３）．および特許協力条約（ＰＣＴ） ＷＯ９７／４２２０２を参照されたい］。
前記ホスホルアミダイト化合物を、ＤＮＡオリゴマーの中間原料として用いる場合には、２−シアノエトキシジアルキルアミノホスフィン誘導体と５’−Ｏ，塩基保護−ヌクレオシドとを反応させ、ＤＮＡ合成試薬とするのが一般的である。
この方法によれば、ＤＮＡの化学合成の原料を安定的に得ることができるが、純度良く目的物を得るために、生成する副生物あるいは不純物を除去することが必要であり、そのため操作上の煩雑さが生じ、コストが嵩む等の問題がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、ＤＮＡ合成試薬の製造において単離精製工程を必要とせずに、反応液をそのままＤＮＡオリゴマーの合成に用いることができるｉｎ ｓｉｔｕ ＤＮＡ合成試薬となる、モノアルキルアミノ型ホスホルアミダイド化合物を提供することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を行った結果、下記式（１）で表されるモノアルキルアミノ型ホスホルアミダイト化合物を用いた場合に、前記課題が解決されることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は下記式（１）で表されるモノアルキルアミノ型ホスホルアミダイト化合物である。
【０００５】
【化３】
｛式中、Ｂは必要に応じてヌクレオチド化学において通常の保護基で保護した塩基を示し、Ｒ１およびＲ２は水素原子、またはヘテロ原子を含んでいてもよいアルキル基、シクロアルキル基、アリール基もしくはアラルキル基を示し、Ｒ３は保護基、Ａは水素原子、水酸基、アルコキシ基またはトリアルキルシリルオキシ基を示し、ＸはＨＮＲ５で示されるモノアルキルアミノ基（Ｒ５はアルキル基またはシクロアルキル基）を示す。ただし、Ｒ１およびＲ２のいずれもが水素原子、メチル基またはエチル基である場合を除く。｝
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明におけるモノアルキルアミノ型ホスホルアミダイト化合物は、前記式（１）で表される化合物であり、式（１）におけるＢは周知の塩基であり、アデニン、グアニンおよびヒポキサンチンなどのプリン誘導体、ならびにシトシン、チミンおよびウラシルなどのピリミジン誘導体などが挙げられ、具体的には、１−チミニル基、１−（Ｎ−４−ベンゾイルシトシニル）基、９−（Ｎ−６−ベンゾイルアデニニル）基および９−（Ｎ−２−イソブチリルグアニニル）基などが挙げられる。
Ｒ１およびＲ２としては、水素原子、メチル基、エチル基、ノルマルプロピル基、イソプロピル基、イソブチル基、セカンダリーブチル基、ターシャリーブチル基、ノルマルペンチル基、１−メチルブチル基、１−エチルプロピル基、シクロヘキシル基、ノルマルノニル基、２−フェニルエチル基、２−（メチルチオ）エチル基、フェニル基、１，１−ジエチル−３−ブテニル基および１，１−ジメチル−２−フェニルエチル基などが挙げられる（ただし、Ｒ１およびＲ２のいずれもが水素原子、メチル基またはエチル基の場合を除く）。
また、Ｒ３としては、トリチル基、４−メトキシトリチル基および４，４’−ジメトキシトリチル基などが挙げられ、Ｘとしては、イソプロピルアミノ基、ノルマルブチルアミノ基、イソブチルアミノ基、ターシャリーブチルアミノ基、ネオペンチルアミノ基およびシクロヘキシルアミノ基などが挙げられる。
【０００８】
本発明におけるモノアルキルアミノ型ホスホルアミダイト化合物は、下記式（３）で表されるヌクレオチド誘導体と下記式（４）で表される第一アルキルアミンとの反応に容易に製造することができる｛下記式（５）｝。
【０００９】
【化４】
｛式中、Ａ、Ｂ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は前記式（１）と同じであり、Ｙはイミダゾリル基、２−メチルイミダゾリル基および４−メチルイミダゾリル基等のアゾリル基を示す。｝
【００１１】
【化５】
｛Ｘは前記式（１）と同じである。｝
【００１３】
【化６】
｛式中、Ａ、Ｂ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＸは前記式（１）と同じであり、Ｙは前記式（３）と同じである。｝
【００１５】
一方、前記式（３）で表されるヌクレオチド誘導体は、下記式（６）で表される５’−Ｏ，塩基保護−ヌクレオシドと下記式（７）で表されるオルガノオキシビスアゾリルホスフィンとの反応により容易に製造することができる｛下記式（８）｝。
【００１６】
【化７】
【００１７】
【化８】
｛式中、Ｒ１およびＲ２は前記式（１）と同じであり、Ｙは前記式（３）と同じである。｝
【００１９】
【化９】
｛式中、Ａ、Ｂ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は前記式（１）と同じであり、Ｙは前記式（３）と同じである。｝
【００２１】
前記式（８）で表される反応は、５’−Ｏ，塩基保護−ヌクレオシドを減圧乾燥するか、あるいはピリジンもしくは１，４−ジオキサン等の有機溶媒に溶解してから共沸脱水した後、トルエン、ピリジン、テトラヒドロフラン、クロロホルムまたはアセトニトリル等の有機溶媒溶液中、５’−Ｏ，塩基保護−ヌクレオシドに対し０．９〜１．２当量のオルガノオキシビスアゾリルホスフィンを、−８０℃〜室温の条件で混合させて反応させることにより達成される。低温で反応させた方が、前記式（３）で表される化合物の収率が良い。なお、有機溶媒は乾燥剤で乾燥後、蒸留精製したものを用いることが好ましい。この反応溶液の３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルを測定して反応が完了したことを確認することができる。
一方、前記式（５）で表される反応は、前述のようにして製造した化合物（３）の反応溶液に、第一アルキルアミンを化合物（３）に対して０．９〜１．２当量加えることにより達成される。このようにして得られたモノアルキルアミノ型ホスホルアミダイド化合物は、単離精製することなく、反応溶液をそのままｉｎ ｓｉｔｕ ＤＮＡ合成試薬としてオリゴヌクレオチドの合成に用いることができる。前記式（７）で表されるオルガノオキシビスアゾリルホスフィンは、下記式（９）で表されるオルガノオキシジクロロホスフィンと下記式（１０）で表されるＮ−トリメチルシリルアゾール化合物との反応により容易に製造することができる｛下記式（１１）｝。
【００２２】
【化１０】
（式中、Ｒ１およびＲ２は前記式（１）と同じである。）
【００２４】
【化１１】
（式中、Ｙは前記式（３）と同じである。）
【００２６】
【化１２】
（式中、Ｒ１およびＲ２は前記式（１）と同じであり、Ｙは前記式（３）と同じである。）
【００２８】
前記式（１１）で表される反応は、トルエンまたはクロロホルム等のハロゲン系有機溶媒溶液中、室温の条件で、前記オルガノオキシジクロロホスフィンに、これに対し２〜３当量の前記Ｎ−トリメチルシリルアゾール化合物を混合させて行なう。この反応溶液の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを測定して反応が完了したことを確認した後、副生したクロロトリメチルシラン、反応溶媒および過剰のＮ−トリメチルシリルアゾール化合物などを減圧留去すれば、オルガノオキシビスアゾリルホスフィンが得られる。なお、有機溶媒は乾燥剤で乾燥後、蒸留精製したものを用いることが好ましい。
前記式（９）で表されるオルガノオキシジクロロホスフィンは、下記式（１２）で表されるオルガノオキシトリメチルシランと三塩化リンとの反応により容易に製造することができる｛下記式（１３）、畑辻明ら、ヌクレイック・アッシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅｒｃｈ）、１７，８５８１（１９８９）｝。
【００２９】
【化１３】
｛式中、Ｒ１およびＲ２は前記式（１）と同じである。｝
【００３１】
【化１４】
（式中、Ｒ１およびＲ２は前記式（１）と同じである。）
【００３３】
前記反応は、０℃の条件で、オルガノオキシトリメチルシランとこれに対し２〜５当量の三塩化リンとを混合し、室温で１時間〜１０日間静置することにより達成され、生成物を常法に従って減圧蒸留すれば、オルガノオキシジクロロホスフィンが得られる。
前記式（１２）で表されるオルガノオキシトリメチルシランは、下記式（１４）で表される２−シアノエタノール誘導体と１，１，１，３，３，３−ヘキサメチルジシラザンとの反応｛下記式（１５）｝、または下記式（１６）で表されるアルデヒドもしくはケトンとシアノメチルリチウムなどのシアノメチルアルカリ金属化合物との反応生成物に、クロロトリメチルシランを反応させることにより｛下記式（１７）｝、容易に製造することができる。
前記シアノメチルアルカリ金属化合物は、アセトニトリルのシアノ基に隣接した活性水素を、ノルマルブチルリチウムなどを用いてアルカリ金属化することにより容易に製造することができる｛（下記式（１８））。
【００３４】
【化１５】
（式中、Ｒ１およびＲ２は前記式（１）と同じである。）
【００３６】
【化１６】
（式中、Ｒ１およびＲ２は前記式（１）と同じである。）
【００３８】
前記式（１５）で表される反応は、２−シアノエタノール誘導体とこれに対し１〜２当量の１，１，１，３，３，３−ヘキサメチルジシラザンおよび０．００５〜０．１当量のイミダゾールを混合し、１〜５時間かきまぜながら加熱・還流させることにより達成され、生成物を常法に従って減圧蒸留すれば、目的のオルガノオキシトリメチルシランが得られる。
【００３９】
【化１７】
｛式中、Ｒ１およびＲ２は前記式（１）と同じである。｝
【００４１】
【化１８】
（式中、Ｒ１およびＲ２は前記式（１）と同じである。）
【００４３】
【化１９】
前記式（１７）および（１８）で表される反応は以下のように行なう。まず、−８０〜−６０℃の条件で、ノルマルブチルリチウムのノルマルヘキサン／テトラヒドロフラン（１／２）溶液にこれに対し１．０〜１．２当量のアセトニトリルをで加えて、０．５〜２時間かき混ぜて反応させてシアノメチルリチウムのノルマルヘキサン／テトラヒドロフラン溶液を得る。これに−８０〜−６０℃の条件で、１．０〜１．２当量の前記アルデヒドもしくはケトンを加え、反応温度を０．５〜１時間かけて室温に戻した後、１．２〜１．５当量のクロロトリメチルシランを加えてかき混ぜることにより反応は達成される。なお、有機溶媒は乾燥剤で乾燥後、蒸留精製したものを用いることが好ましい。生成物を常法に従って減圧蒸留すれば、オルガノオキシトリメチルシランが得られる。
前記式（１０）で表されるＮ−トリメチルシリルアゾール化合物は、
下記式 （１９）で表されるアゾール類と１，１，１，３，３，３−ヘキサメチルジシラザンとの反応により容易に製造することができる｛下記式（２０）｝。
【００４５】
【化２０】
（式中、Ｙは前記式（３）と同じである。）
【００４７】
【化２１】
（式中、Ｙは前記式（３）と同じである。）
【００４９】
前記反応は、前記式（１９）で表されるアゾール類と、これに対し１〜２当量の１，１，１，３，３，３−ヘキサメチルジシラザンとを混合し、３〜２４時間かきまぜながら加熱・還流させることにより達成され、このものを常法に従って減圧蒸留すれば、Ｎ−トリメチルシリルアゾール化合物が得られる。
【００５０】
上記の方法で製造されたモノアルキルアミノ型ホスホルアミダイト化合物は、オリゴヌクレオチドを化学合成する際の中間原料として有用である。例えば、２−シアノ−１−ターシャリーブチルエトキシビス（４−メチルイミダゾリル）ホスフィンを、５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジンと反応させると、同ヌクレオシドの３’−Ｏ−４−メチルイミダゾリルホスフィン誘導体を収率良く得る。この反応溶液に、イソプロピルアミンを加えると、同ヌクレオシドの３’−Ｏ−イソプロピルアミノ型ホスホルアミダイト誘導体を定量的に得る。さらに、触媒としてテトラゾールを用い、この反応溶液をそのままｉｎ ｓｉｔｕでＤＮＡ自動合成機上での固相合成に用いることにより、ＤＮＡオリゴマーを収率良く得ることができる。
【００５１】
なお、本発明におけるモノアルキルアミノ型ホスホルアミダイド化合物としては、ＤＮＡオリゴマーの収率の面から、下記条件で計算した、式（１）における置換基Ｒ１およびＲ２のファンデルワールス（ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ）体積の和が４９（オングストローム） ３ 以上である化合物が好ましい。例えば、Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２がノルマルプロピル基である場合のモノアルキルアミノ型ホスホルアミダイド化合物などが例示される。
ファンデルワールス（ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ）体積の計算方法
下記式（２）で表されるオルガノオキシビス（４−メチルイミダゾリル）ホ
スフィンにおいて、まず、ＳＰＡＲＴＡＮＴＭ Ｖｅｒｓｉｏｎ４．１．１（Ｗａｖｅｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．）により三次元分子構造を決定し、ＭＭ力場を使って立体的エネルギーの最適化を行った後、半経験的分子軌道法（ＡＭ１）により立体構造を確定した。次に、ＡＭ１により得られた立体構造に基づいて、ＴＳＡＲＴＭ３．０（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｇｒｏｕｐ）の分子体積計算プログラムにより置換基Ｒ１およびＲ２のファンデルワールス（ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ）体積を求めた。
【００５２】
【化２２】
｛式中、Ｒ１およびＲ２は前記式（１）と同じであり、Ｙは４−メチルイミダゾリル基を示す｝
【００５４】
【実施例】
以下、実施例により本発明について詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
前記式（１）においてＡが水素原子、Ｂが１−チミニル基、Ｒ１が水素原子、Ｒ２がターシャリーブチル基、Ｒ３が４，４’−ジメトキシトリチル基、Ｘがイソプロピルアミノ基である下記式（２１）で表されるモノアルキルアミノ型ホスホルアミダイト化合物の製造
【００５５】
【化２３】
トルエン（５ｍｌ）溶液中、アルゴン雰囲気下、室温の条件で２−シアノ−１−ターシャリーブチルエトキシジクロロホスフィン０．３３２ｇ（１．４６ｍｍｏｌ）とトリメチルシリル−４−メチルイミダゾール０．４９５ｇ（３．２１ｍｍｏｌ）とを加え、５分間反応させた。副生したクロロトリメチルシランおよびトルエンを室温で１０分間減圧留去した後、残留トルエンおよび過剰のトリメチルシリル−４−メチルイミダゾールを４０℃の条件で２時間減圧留去し、無色透明、油状の２−シアノ−１−ターシャリーブチルエトキシビス（４−メチルイミダゾリル）ホスフィンを得た。さらに、アルゴン雰囲気下、室温の条件で、前記で得られた２−シアノ−１−ターシャリーブチルエトキシビス（４−メチルイミダゾリル）ホスフィンを重クロロホルム２．９ｍｌに溶解した溶液（０．５Ｍ）を、室温で２時間減圧乾燥した５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジン０．７９４ｇ（１．４６ｍｍｏｌ）に加えた。均一にした後、そのまま一晩静置して反応させ、下記式（２２）で表されるヌクレオチド誘導体を得た。得られた生成物の３１ＰＮＭＲ（外部標準；（ＣＨ３Ｏ）３Ｐ ＝１４０ｐｐｍ， ＣＤＣｌ３）δは １２７．９，１２８．２，１２８．４，１３０．８ｐｐｍ．であった（ ３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルは１６１．７ＭＨｚＮＭＲ測定装置で測定した）。
【００５７】
【化２４】
上記で得られた反応溶液にイソプロピルアミン０．０８６ｇ（１．４６ｍｍｏｌ）を室温で加えて反応させ、目的物である前記式（２１）で表されるモノアルキルアミノ型ホスホルアミダイト誘導体を定量的に得た。得られた生成物の３１ＰＮＭＲ（外部標準；（ＣＨ３Ｏ）３Ｐ ＝１４０ｐｐｍ， ＣＤＣｌ３）δは１４１．８，１４２．４，１４４．５，１４５．８ｐｐｍ．であった（ ３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルは１６１．７ＭＨｚＮＭＲ測定装置で測定した）。
【００５９】
（応用例）
前記式（２１）で表されるモノアルキルアミノ型ホスホルアミダイト化合物を用いた、固相法によるＤＮＡ自動合成機上でのｄ（ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ）（チミジン２０量体）の合成
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）チミジンを１，４−ジオキサンに溶解後、共沸脱水し、かつ２−シアノ−１−ターシャリーブチルエトキビス（４−メチルイミダゾリル）ホスフィンとの反応溶媒としてアセトニトリルを用いてその濃度を０．１Ｍとした以外は、実施例１と同様にしてモノアルキルアミノ型ホスホルアミダイト化合物を製造した。
得られた化合物の０．１Ｍアセトニトリル反応溶液をそのまま原料として用いて、触媒としてテトラゾールを用いて、ＤＮＡ自動合成機上でアミダイト法のプロトコールに従って固相法によりチミジンの２０量体を合成した。得られた反応生成混合物を逆相ＨＰＬＣ分析した結果、その平均縮合収率は９９．１％であった。
【００６０】
（実施例２〜７）
実施例１と同様の操作により、表１および２に示したＮｏ．２〜Ｎｏ．７のモノアルキルアミノ型ホスホルアミダイト化合物を製造した。各モノアルキルアミノ型ホスホルアミダイト化合物｛前記式（１）｝およびその前駆体であるヌクレオチド誘導体｛前記式（２）｝の３１Ｐ−ＮＭＲスペクトルのケミカルシフト（δ）（外部標準；（ＣＨ３Ｏ）３Ｐ ＝１４０ｐｐｍ、１６１．９ＭＨｚＮＭＲ測定装置で測定）、置換基Ｒ１およびＲ２のファンデルワールス（ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ）体積の和（置換基体積（Ｒ１＋Ｒ２））を表１に示した。また、各モノアルキルアミノ型ホスホルアミダイト化合物の０．１Ｍアセトニトリル反応溶液をそのまま原料として用いて、触媒としてテトラゾールを用いて、固相法によりＤＮＡ自動合成機上でアミダイト法の標準的なプロトコールによりチミジン、シチジンまたはアデノシンの各２０量体を合成した際の平均縮合収率（固相合成縮合収率）をそれぞれ表１に示した。なお、表１における置換基Ｒ２、ＸおよびＹの構造は下記表２に示した。
Ｎｏ．２〜Ｎｏ．７に示したモノアルキルアミノ型ホスホルアミダイト化合物は、前記式（１）において、Ａが水素原子、Ｒ３が４，４’−ジメトキシトリチルである下記式（２３）で表される化合物である。
【００６１】
【化２５】
｛式中、ＤＭＴｒは４，４’−ジメトキシトリチル基を表し、Ｂ、Ｒ１、Ｒ２およびＸは前記式（１）と同じである。｝
【００６３】
【表１】
｛表１において、Ｂ欄のＴは１−チミニル基を、ＣＢｚは１−（Ｎ−４−ベンゾイルシトシニル）基を、およびＡＢｚは９−（Ｎ−６−ベンゾイルアデニニル）基をそれぞれ表す。｝
【００６５】
【表２】
表１から明らかなように、実施例１で得られた化合物（２０）は、これをｉｎ ｓｉｔｅ ＤＮＡ合成試薬として用いて場合、その平均縮合収率は９９．１％と極めて優れたものである。
【００６７】
【発明の効果】
本発明のモノアルキルアミノ型ホスホルアミダイト化合物は、オリゴヌクレオチドの中間原料として用いる場合、その製造工程において単離精製工程を省くことができるｉｎ ｓｉｔｕ ＤＮＡ合成試薬として有用であり、本発明のモノアルキルアミノ型ホスホルアミダイト化合物を利用することにより、極めて高い平均縮合収率でＤＮＡオリゴマーを合成できる。
Claims (2)
- 下記式（１）で表されるモノアルキルアミノ型ホスホルアミダイト化合物。
- 下記条件で計算した、前記式（１）におけるＲ１およびＲ２のファンデルワールス（ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ）体積の和が４９（オングストローム） ３ 以上であるモノアルキルアミノ型ホスホルアミダイト化合物。
ファンデルワールス（ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ）体積の計算方法
下記式（２）で表されるオルガノオキシビス（４−メチルイミダゾリル）ホスフィンにおいて、まず、ＳＰＡＲＴＡＮＴＭ Ｖｅｒｓｉｏｎ４．１．１（Ｗａｖｅｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．）により三次元分子構造を決定し、ＭＭ力場を使って立体的エネルギーの最適化を行った後、半経験的分子軌道法（ＡＭ１）により立体構造を確定した。次に、ＡＭ１により得られた立体構造に基づいて、ＴＳＡＲＴＭ３．０（Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｒｏｕｐ）の分子体積計算プログラムにより、置換基Ｒ１およびＲ２のファンデルワールス（ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ）体積を求めた。
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