JP3578474B2 - 糖結合蛋白 - Google Patents
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Description
【産業上の利用分野】
本発明は、糖結合蛋白に関する。さらに詳しくは、本発明は、マンノースまたは少なくとも1のマンノースを含むオリゴ糖が蛋白に結合した糖結合蛋白に関するものである。本発明の糖結合蛋白を有効成分として含む医薬組成物は免疫抑制薬として有用である。
【従来の技術】
免疫抑制薬は、腎臓移植や骨髄移植等の臓器移植、およびリウマチや自己免疫疾患のような免疫亢進を伴う疾患の治療に有用であり、臨床において広く用いられる薬剤である。しかしながら、現在用いられている免疫抑制薬は、主作用である免疫抑制作用は十分に強いものの、標的臓器及び標的細胞に対する作用の特異性が十分ではなかった。このため、臨床に用いた場合には副作用として非特異的に肝臓、腎臓等に障害性を示すという問題があり、その使用に関しては十分な注意が必要であった。従って、より安全で使いやすい免疫抑制薬対する要望が高く、新たな免疫抑制薬の探索が試みられてきた。
【0002】
マンノースは、そのもの自体のみならず、二量体および三量体も免疫抑制作用を有することが知られている。例えば、マンノースは、単球の赤血球に対する貧食作用を抑制し(A. V. Muchmore and R. M. Blaese, In Macrophage Regulation of Immunity. E. R. Unanue, A. S. Rosenthal, editors. Academic Press, Inc., New York, 505−517, 1980 )、末梢血単核球の培養系において抗原刺激によるT細胞の増殖を抑制することが報告されている (A. J. Fischer 等、 J. Clin. Invest., 62, 1005−1013, 1978)。また、妊婦の尿中に認められる免疫抑制物質は、マンノ−スα(1−6)マンノースであることが確認されている(A.V. Muchmore等、J. Exp. Med., 160,1672−1685, 1984)。マンノースまたはマンノース多量体は上記のような免疫抑制作用を持つため、免疫抑制薬として臨床応用できる可能性が考えられていた。
しかしながら、生体に投与して免疫抑制を発現させるためには、マンノースまたはマンノース多量体では免疫抑制の強さが十分でないという問題があった。また、イン・ビトロ効果から換算すると、あまりにも多くの投与量を必要とするために、そのために生ずる副作用の面から実用化が不可能であった。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、マンノース又は少なくとも1のマンノースを含むオリゴ糖の有する抗原特異的な免疫抑制、特に抗原特異的な反応を増強し、逆に、抗原非特異的な免疫抑制を低減させることによって免疫抑制の選択性を増大させ、少投与量においても十分な効果が得られる免疫抑制薬を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記の問題を解決すべく鋭意検討した結果、蛋白にマンノースまたは少なくとも1のマンノースを含むオリゴ糖を結合させた糖結合蛋白を提供することによって上記の課題が解決できることを見いだし、本発明を完成させるに至った。すなわち本発明は、マンノースまたは少なくとも1のマンノースを含むオリゴ糖が蛋白に結合した糖結合蛋白に関するものである。
【0004】
本発明の好ましい態様によれば、
マンノースまたはオリゴ糖がリンカーを介して蛋白に結合した上記糖結合蛋白;
リンカーがカルボニルアルキレン基である上記糖結合蛋白;
二糖が蛋白に結合した上記糖結合蛋白;
マンノースα(1−4)マンノース又はマンノースα(1−6)マンノースが蛋白に結合した上記糖結合蛋白;
マンノースα(1−4)マンノース又はマンノースα(1−6)マンノースと蛋白の結合の比率が1:1から100:1である上記糖結合蛋白;
蛋白が血清蛋白である上記糖結合蛋白;および
蛋白が血清アルブミンまたはその化学修飾体、あるいはそれらの一部である上記糖結合蛋白が提供される。
また、本発明の別の態様によれば、上記の糖結合蛋白を有効成分として含む免疫抑制薬が提供され、その好ましい態様として、抗原刺激に起因するリンパ球増殖を抑制する上記免疫抑制薬が提供される。
【0005】
本発明の糖結合蛋白に含まれるマンノースは公知の物質であり、D−型およびL−型の存在が知られているが、それらのいずれを用いてもよい。また、例えば、リン酸化等の化学修飾されたマンノースを用いてもよい。本発明の糖結合蛋白に含まれるオリゴ糖は、少なくとも1のマンノースを含み、例えば、リンパ球の増殖抑制に基づく免疫抑制作用を有するものである。ここでリンパ球の増殖とは、T細胞が外来抗原を認識して増殖することをいい、その際、インターロイキン2、インターロイキン4などの増殖因子を産生して増殖するものである(その増殖はDNA 合成の際における標識チミジンの取込み等により測定することができる)。本明細書においてオリゴ糖とは、例えば、二糖類、三糖類、四糖類等の少糖類を意味しており、好ましくは、二糖類である。二糖ともがマンノースである場合の例として、マンノースα(1−4)マンノース及びマンノースα(1−6)マンノースを挙げることができる。
オリゴ糖を構成する糖としては、少なくとも1のマンノ−スの他に、公知のいかなる糖あるいはその化学修飾体を用いてもよく、このような糖はD−型およびL−型のいずれであってもよい。例えば、免疫抑制作用をもつ糖であるフコース、ガラクトース、マンノース、ソルビトール、ソルボース、キシロースを用いることが好ましい。オリゴ糖には、これらの糖を任意に組み合わせて用いることができる。
【0006】
本発明の糖結合蛋白は、上記のマンノースまたはオリゴ糖がペプチド又はポリペプチドである蛋白に結合したものである。2以上のマンノースまたは2以上のオリゴ糖がペプチド又はポリペプチドに結合していてもよく、1以上のマンノース及び1以上のオリゴ糖が共に蛋白に結合した糖結合蛋白も本発明の範囲に包含される。蛋白としては、抗原性が無いか、あるいは抗原性が低いという理由から、生体由来のものが好ましい。本発明の糖結合蛋白をヒトに投与する免疫抑制薬として使用する場合には、ヒト由来の蛋白を用いることが好ましく、ヒト以外の動物投与する場合には、同種の動物に由来する蛋白を用いることがが好ましい。また、該蛋白は水に対して可溶性であることが好ましい。
ヒトまたは哺乳類動物由来の蛋白としては、血清、ホルモン、酵素等を挙げることができるが、これらのうち血清蛋白が好ましい。血清蛋白の中では、入手容易性あるいは経済上の理由から、血清アルブミン(血清アルブミン蛋白)が最も好ましく用いられる。血清アルブミンは、ヒト又は、ウシ、ウマ、ヒツジ等など哺乳類由来の血清アルブミンを用いてもよい。また、血清アルブミンの化学修飾体や血清アルブミンの一部分を用いることもできる。蛋白として遺伝子工学的または化学合成的に製造した血清アルブミン又はその一部を用いた糖結合蛋白も本発明の範囲に包含される。もっとも、本発明の糖結合蛋白に用いることのできる蛋白としては、これらの血清蛋白に限定されるものではない。
【0007】
上記のマンノースまたはオリゴ糖とペプチド又はポリペプチドである蛋白との結合比率は、モル比で1:1から100:1の間であればよく、この範囲内で種々の比率をとることができる。本発明の糖結合蛋白を製造するにあたり、マンノースまたはオリゴ糖とペプチド又はポリペプチドである蛋白とを直接結合させてもよいが、両者はリンカーを介して結合していてもよい。このようなリンカーとしては当業者に公知のリンカ−を用いればよく、例えば、カルボニルアルキル基[−CO−(CH2)n − :n は整数を示す] を用いることができる。該カルボニルアルキル基のアルキレン基[−(CH2) n −]は特に限定されないが、例えばnが1から20の間のアルキレンを用いることができる。例えば、カルボニルアルキル基としてカルボニルオクチル基を挙げることができる。
【0008】
本発明の好ましい態様の例として、例えば、二糖のオリゴ糖がリンカーであるカルボニルアルキル基を介して蛋白に結合した糖結合蛋白を挙げることができる。これらは、下記の一般式[I] および[II]〔式中、R1はアルキレン鎖[−(CH2) n − :n は整数を示す] を表し、Pは蛋白を表す〕で示される糖結合蛋白である。さらに、本発明の好ましい糖結合蛋白の代表例として、マンノースα(1−4)マンノースまたはマンノースα(1−6)マンノースが血清アルブミンに結合した糖結合蛋白を挙げることができる。これらは、それぞれ下記の一般式[III] および[IV]で表される糖結合蛋白であり(式中、R1はアルキレン鎖を表し、SAは血清アルブミンを表す)、非還元端末のD−マンノースをα結合で還元端末のD−マンノースのC−4位またはC−6位に結合し、還元端末のD−マンノースをα結合によりリンカーを介して血清アルブミン等の蛋白と結合したものである。
【0009】
【化1】
本発明の糖結合蛋白の製造方法の例として、上記の一般式[III] で表されるマンノースα(1−4)マンノース−血清アルブミンの製造方法を以下のスキームに示すが、本発明の糖結合蛋白は、この糖結合蛋白に限定されることはない。また、本発明の糖結合蛋白の製造方法は、下記方法に限定されることはない。
【0010】
【化2】
【0011】
【化3】
【0012】
以下、上記スキームを参照しつつ、マンノースα(1−4)マンノース−血清アルブミンの製造方法について説明する。なお、スキーム中、R1はアルキレン鎖を表し、SAは血清アルブミンを表し、R2はアルキル基を表す。
アルコキシカルボニルアルキル−α−D−マンノピラノシド[V] のベンジリデン化を行なうには、化合物[V] を無水ギ酸等の溶媒に溶解した後、R3CHO (R3は芳香族基を表す)で示される芳香族アルデヒドを加えて、冷却下で短時間、好ましくは0℃前後で数分間反応させればよい。反応終了後、炭酸カリウム等を用いて中和し、ジクロロメタン等の溶媒を用いて反応物を抽出し、得られたアセタール体をピリジン等の溶媒に溶解した後にアシル化剤を加え、室温で数時間〜数十時間反応させることにより、化合物[VI](R3は芳香族基を表し、Acはアシル基を表す)を得ることができる。アセチル化剤としては無水酢酸などを用いればよい。
化合物[VI]のベンジリデン基の還元的開裂を行って化合物[VII] を得るには、例えば、化合物[VI]を無水テトラヒドロフラン等の溶媒に溶解し、モレキュラーシーブ3A等の乾燥剤を加えた後、その溶液に還元剤と酸性化剤を加えて反応させればよい。還元剤としては、シアノ水素化ホウ素ナトリウム(NaBH3CN) 等を用いることができ、酸性化剤としては塩化水素ガスを飽和させたジエチルエーテル等を用いればよい。別法として、化合物[VI]を無水テトラヒドロフラン等に溶解した後、ボラン−トリメチルアミン−塩化アルミニウムを反応させることによっても化合物[VII] を得ることができる。
【0013】
上記の化合物[VII] に対して2、3、4、6−テトラ−O−アシル−α−D−マンノピラノシルブロミド[VIII]をケーニッヒス・クノール反応の条件下で縮合させることにより化合物[IX]を得ることができる(T.Sugawara等、Carbohydr. Res., 230, 117−149, 1992)。例えば、化合物[VII] をジクロロメタン等の溶媒に溶解し、トリフルオロメタンスルホン酸銀等の酸受容体とガンマコリジン等の中和剤を加えた後、この混合物を不活性ガスで置換して0℃以下に冷却する。その後、化合物[VIII]を加え、さらにその反応液を室温に戻して数時間〜数十時間反応させることにより化合物[IX]を得ることができる。別法として、マンノースのオルトエステル体を用い、酸触媒を用いて化合物[VII] に縮合させることによっても化合物[IX]を得ることができる(D.S. Tsui 等、Carbohydr. Res. 156, 1−8, 1986)。
【0014】
化合物[IX]の脱ベンジル化を行なには、例えば、アルコール類等の溶媒中で、化合物[IX]と触媒の混合物を室温で数時間〜数十時間、水素ガス気流下で撹拌して化合物[X] を得る。その際の触媒としてはパラジウムブラックなどを用いることができる。つづいて、化合物[X] の脱アセチル化を行なうことにより化合物[XI]を得ることができる。例えば、化合物[X] にアルコール類等の溶媒とエステル交換剤を加え、室温で数時間〜数十時間撹拌した後、中和剤で中和すればよい。エステル交換剤としてはナトリウムアルコラートなどを用いることができ、中和剤としては陽イオン交換樹脂などを用いればよい。化合物[XI]をヒドラジト化することにより化合物[XIII]を得ることができる。例えば、化合物[XI]をアルコール等の溶媒に溶解して、ヒドラジンヒドラート (H2NNH2・H2O, 化合物XII)を加え、室温で数時間〜数十時間撹拌すればよい。
【0015】
上記の化合物[XIII]をアジド体[XIV] に変換した後、蛋白とカップリングさせることにより、本発明の糖結合蛋白[III] を製造することができる。例えば、化合物[XIII]を蒸留水等に溶解して0℃前後に冷却し、酸性化剤、好ましくは塩酸を加えて酸性にした後、亜硝酸ナトリウム(NaNO2) を加えて数分〜数十分間室温で反応させる。反応終了後、未反応の亜硝酸を除去するためにスルファミン酸アンモニウム(H2NSO3NH4) を加えてさらに数分〜数十分間室温で放置し、続いて、その混合溶液に血清アルブミンを含む冷却したアルカリ性水溶液、好ましくはホウ酸緩衝溶液(pH10)を加えた後、直ちに塩基、好ましくは水酸化ナトリウム溶液を用いてpHを9.0前後に合わせて室温で1〜数時間撹拌する。反応終了後、酢酸等を用いて中和し、さらにイオン交換クロマトグラフィーなどで精製して化合物[III] を得ることができる。イオン交換クロマトグラフィーは、DEAE−セルロースなどを用いればよい。目的物の確認は、公知の方法、例えばフェノール硫酸法により血清アルブミンに結合している糖の含量を定量することにより行えばよい。
【0016】
本発明の糖結合蛋白の製造方法の例として、マンノースα(1−6)マンノース−血清アルブミン[IV]の製造方法を以下のスキームに示すが、本発明の糖結合蛋白は、この糖結合蛋白に限定されることはない。アルコキシカルボニルアルキル−6−O−α−D−マンノピラノシル−α−D−マンノピラノシド[XV]のヒドラジド化反応、およびアジド体[XVII]経由による化合物[XVI] と蛋白とのカップリング反応は、上記の方法に従って行うことができる。
【0017】
【化2】
【0018】
本発明の糖結合蛋白は免疫抑制を示すので、本発明の糖結合蛋白を有効成分として含む免疫抑制薬は、以下に示す各種の免疫疾患等の治療に有用である。すなわち、二糖の代表例であるマンノースα(1−4)マンノースおよびマンノースα(1−6)マンノースは抗原刺激によるリンパ球増殖抑制を示すが、その作用は弱く、抗原非特異的なリンパ球増殖抑制である。これに対して、本発明の糖結合蛋白は著しく強い免疫抑制を有しており、また、抗原特異的な免疫抑制を示すので、免疫抑制薬として極めて有用である。特定の理論に拘泥するわけではないが、免疫抑制剤の作用点を、(i) Tリンパ球が抗原を認識する抗原特異的反応の段階と(ii)抗原認識後に続いて起こる抗原非特異的な段階とに分けると、本発明の糖結合蛋白は、前者の過程、すなわちTリンパ球が抗原を認識することにより生ずる抗原特異的反応を抑制するものと考えられる。
【0019】
本発明の糖結合蛋白を含む免疫抑制薬は、免疫抑制薬として臓器移植時の拒絶反応、慢性関節リウマチ、アレルギー疾患、自己免疫疾患等の予防および治療に用いることができる。本発明の糖結合蛋白はそのまま免疫抑制薬として用いてもよいが、医薬組成物として製造するには、必要により製剤上許容される担体、賦形剤、希釈剤と混合し、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、注射剤、座剤、軟膏剤、徐放型製剤などの剤型とすればよく、これらの医薬組成物は経口的または非経口的に安全に投与することができる。非経口投与の例としては、静脈内投与、皮下注射、経鼻投与、および直腸内投与等を挙げることができる。上記の医薬組成物を調製するにあたっては、当業者に公知のいかなる方法を用いてもよいが、製造にあたって細菌や発熱物質が存在しないように注意すべきである。また、本発明の糖結合蛋白は安定であるため、生理食塩水の溶液として保存できるほか、マンニトール、ソルビトールを添加して凍結乾燥アンプルとし、使用時に溶解して患者に投与してもよい。本発明の糖結合蛋白の投与量は、治療の対象となる疾患や症状、投与経路または投与方法、あるいは患者の年齢等に応じて適宜選択されるが、一般に、体重1kgあたり1ng〜 100mg程度を1回投与量として、1日1回〜3回程度注射により投与するのが好適である。
【実施例】
以下に示すスキームを参照しつつ、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されることはない。
【0020】
【化5】
【0021】
【化6】
【0022】
【化7】
【0023】
(実施例1)
[マンノースα(1−4)マンノース−B血清アルブミン[a]の合成]
8−メトキシカルボニルオクチル−α−D−マンノピラノシド[b]2gを99%無水ギ酸10mlに溶解して0℃に冷却した後、新しく蒸留したベンズアルデヒド10mlを加え、0℃で5分、室温で2分攪拌した。ただちにヘキサン160mlと30%炭酸カリウム溶液60mlの混合液を冷却した溶液に激しく攪拌しながら注意深く加えた。血清アルブミン蛋白としては、ウシ血清アルブミン(B血清アルブミンと略す。シグマ社製)を用いた。混合物にジクロロメタンを加えて有機層と水層を分離した後、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去してシロップ状物を得た。該シロップ状物をピリジン10mlに溶解し、無水酢酸10mlを加えて室温で一晩攪拌した。反応溶液を濃縮乾固し、シリカゲル・オープンカラムクロマトグラフィー(ベンゼン/ジエチルエーテル)で精製し、目的とする化合物[c]を収率56.7%で得た。同時に副産物として、ジベンジリデン体を収率17.3%で得た。
【0024】
化合物[c]0.75gを無水テトラヒドロフラン15mlに溶解し、シアノ水素化ホウ素ナトリウム1.14gとモレキュラーシーブ3A 4.5gを加えた。この懸濁液に、塩化水素ガスを飽和させたジエチルエーテルを一滴ずつガスの発生が止むまで加えた。反応液をジクロロメタンで希釈してろ過し、ろ液を水で1回、飽和炭酸ナトリウム溶液で2回、続いて水で2回洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥した。ろ液をエバポレーターで濃縮後、残渣をシリカゲル・オープンカラムクロマトグラフィー(ベンゼン/ジエチルエーテル)で精製し、化合物[d]を収率81.0%で得た。
化合物[d]0.60gをジクロロメタン3mlに溶解し、その溶液にトリフルオロメタンスルホン酸銀0.59gとガンマーコリジン0.33mlとを加えた。この混合物をアルゴンで置換した後、−20℃に冷却し、2、3、4、6−テトラ−O−アセチル−α−D−マンノピラノシルブロミド0.94gをジクロロメタン7mlに溶解した溶液を一滴ずつ滴下した。反応液を室温に戻して一晩撹拌した。反応液をジクロロメタンで希釈してろ過し、ろ液をエバポレーターで濃縮した。得られた残渣をシリカゲル・オープンカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/アセトン)で精製して化合物[e]を収率72.6%で得た。
【0025】
無水メタノール10ml中で塩化パラジウム0.20gを水素ガス気流下2時間撹拌し、パラジウムブラックとした。上記パラジウムブラック触媒、化合物[e]0.3g、及び蒸留メタノール10mlの混合物を室温で21時間にわたり水素ガス気流下で撹拌した。パラジウムブラックをろ別し、ろ液をエバポレーターで濃縮した後、得られた残渣をシリカゲル・オープンカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/アセトン)で精製し、化合物[f]を収率90.8%で得た。
化合物[f]171.5mgに無水メタノール2mlおよび0.5N ナトリウムメトキシド0.3mlを加え、密栓して室温で一晩撹拌した。イオン交換樹脂アンバーライトIR−120(H+ )で中和し、濃縮乾固して化合物[g]を収率85.3%で得た。化合物[g]20.5mgを無水メタノール2mlに溶解し、ヒドラジンヒドラート0.18mlを加え、室温で一晩撹拌した。反応液を濃縮し、残渣をシリカゲル・オープンカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール)で精製して化合物[h]を収率97.1%で得た。
【0026】
化合物[h]19.9mgを0.5mlの水に溶かし、氷上で冷却した。この溶液に冷却した4N塩酸70μlと亜硝酸ナトリウム8.7mgとを加えた。室温で15分間放置した後、スルファミン酸アンモニウムを14.4mg加えて、さらに15分間室温で放置した。この混合溶液を、50mgのB血清アルブミンを含む冷却した0.4Nホウ酸緩衝液(pH10)1mlに加えた。直ちにpHを4N水酸化ナトリウム溶液で9.0〜9.5に合わせ、室温で一時間撹拌した。撹拌終了後、反応液を0.1N酢酸で中和して蒸留水に対して4日間透析した。透析後の反応液を凍結乾燥して得られた不定形の粉末をDE52イオン交換クロマトグラフィーで精製した(吸着緩衝液:0.02Nリン酸緩衝液pH6.0、溶出緩衝液:1N塩化ナトリウムを含む0.02Nリン酸緩衝液pH6.0)。溶出分画をフェノール−硫酸法および280nmにおける吸光度で検定し、陽性の分画を集めてアミコンを用いて脱イオン化し、溶出液を凍結乾燥して吸湿性のある不定形の粉末の化合物[a]41.6mgを得た。フェノール硫酸法により糖の含量を測定したところ、1分子のB血清アルブミンあたり8.2残基のマンノースα(1−4)マンノースが結合していることが示された
【0027】
(実施例2)
[マンノースα(1−6)マンノース−血清アルブミン[i]の合成]
8−メトキシカルボニルオクチル−6−O−α−D−マンノピラノシル−α−D−マンノピラノシド[j]98.4mgを無水メタノール10mlに溶解し、ヒドラジンヒドラート0.9mlを加えて室温で一晩撹拌した。反応液を濃縮し、シリカゲル・オープンカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール)で精製し、化合物[k]を収率93%で得た。
【0028】
化合物[k]102.9mgを2mlの水に溶解して氷上で冷却した。この溶液に冷却した4N塩酸280μlと亜硝酸ナトリウム34.8mgとを加えた。室温で15分間放置した後、スルファミン酸アンモニウム57.7mgを加えて、さらに15分間室温で放置した。その混合溶液を70mgの血清アルブミンを含む冷却した0.4Nホウ酸緩衝液(pH10)1mlに加えた。ただちに、4N水酸化ナトリウム溶液で溶液のpHを9.0〜9.5に合わせ、室温で一時間攪拌した。攪拌終了後、反応液を0.1N酢酸で中和し、蒸留水に対して4日間透析した。透析後の反応液を凍結乾燥して得られた不定形の粉末をDE52イオン交換クロマトグラフィーで精製した(吸着緩衝液:0.02Nリン酸緩衝液pH6.0、溶出緩衝液:1N塩化ナトリウムを含む0.02Nリン酸緩衝液pH6.0)。溶出分画をフェノール硫酸法および280nmにおける吸光度で検定し、その波長に吸収のある分画を集めた。その分画をアミコンを用いて脱イオン化し、溶出液を凍結乾燥して吸湿性のある不定形の粉末の化合物[i]70.4mgを得た。フェノール硫酸法により糖の含量を測定したところ、1分子のB血清アルブミンあたり9.7残基のマンノースα(1−6)マンノースが結合していることが示された
【0029】
(試験例1)
[抗原特異的リンパ球増殖抑制試験]
健常成人よりヘパリン加採血した血液を200×gで5分間遠心してバッフィーコート(白血球画分)を得た。フィコールハイパック(ファルマシア製)を用いてこの画分から単核球を分離し、ハンクス緩衝液(ニッスイ製)で2回洗浄した後、10%自己血清、100U/mlペニシリンG(萬有製薬製)、100μg/mlストレプトマイシン(明治製菓製)、15mMヘペス(ナカライテスコ製)を含むRPMI1640培地(シグマ社製)に懸濁した。このようにして得た細胞を96穴平底培養プレート(ファルコン製)に2×105 個/ウエルとなるようにまいた。各ウエルに50μlのマンノース2量体溶液又はマンノース2量体−B血清アルブミン結合物溶液、リンカーを結合したマンノース2量体溶液、およびB血清アルブミン溶液を糖濃度としての最終濃度が10−2Mから10−5Mになるように加えた。2量体の濃度は、結合体上に含まれている糖含量からを求めた。その後、50μlのPPD(三井製薬製)溶液を最終濃度50μg/mlになるように加えて、37℃の炭酸ガスインキュベーター中で6日間培養した。培養終了日に18.5kBqの[3H]チミジン(デュポン製)を加え、さらに4.5時間培養した後、細胞をフィルター上に回収して、取り込まれた放射活性を測定した。結果を表1及び表2に示す。
【0030】
【表1】
【0031】
【表2】
2糖及び2糖にリンカ−を結合したものは、10−2で抗原特異的リンパ球増殖を抑制した。2糖と血清アルブミンとの結合体である本発明の糖結合蛋白は、抗原特異的リンパ球増殖を1.4×10−5Mで抑制した。
【0032】
(試験例2)
[インタ−ロイキン2依存性細胞増殖抑制試験]
インタ−ロイキン2依存性細胞のNK3をハンクス緩衝液で2回洗浄した後、10%牛胎児血清(ボックネック製)、100U/mlペニシリンG(萬有製薬)、100μg/mlストレプトマイシン(明治製菓製)、15mMヘペス(ナカライテスコ製)、および100U/mlインターロイキン2(塩野義製薬製)を含むRPMI1640培地(シグマ製)に懸濁した。細胞を96穴平底培養プレート(ファルコン製)に104 個/ウエルとなるようにまいた。ウエルに50μlのマンノース2量体溶液またはマンノース2量体−B血清アルブミン結合物溶液、リンカーを付けたマンノース2量体溶液、およびB血清アルブミン溶液を最終濃度が10−2Mから10−5Mとなるように加え、37℃の炭酸ガスインキュベーター中で3日間培養した。培養終了日、MTT法(T. Mossman, J. Immunol. Method., 65, 55−63, 1983)によって細胞の増殖を測定した。結果を表3及び表4に示す。
【0033】
【表3】
【0034】
【表4】
【0035】
二糖及び二糖にリンカーを結合したものは、10−2Mで抑制を示した。2糖を血清アルブミンに結合させた本発明の糖結合蛋白は、抑制を示さなかった。
【発明の効果】
本発明の糖結合蛋白は、抗原特異的な強い免疫抑制を示し、かつ抗原非特異的な免疫抑制が低減されているので、免疫抑制の選択性が高く、低投与量においても十分な効果が得られる免疫抑制薬として有用である。本発明の糖結合蛋白を有効成分として含む免疫抑制薬は、免疫抑制薬として臓器移植時の拒絶反応、慢性関節リウマチ、アレルギー疾患、自己免疫疾患等の予防および治療に有用である。
【化4】
Claims (10)
- マンノースα(1−4)マンノース又はマンノースα(1−6)マンノースがカルボニルオクチル基を介して血清アルブミンに結合した糖結合蛋白。
- マンノースα(1−4)マンノースがカルボニルオクチル基を介して血清アルブミンに結合した糖結合蛋白であって、マンノースα(1−4)マンノースと血清アルブミンとの結合の比率が8.2:1である糖結合蛋白。
- マンノースα(1−6)マンノースがカルボニルオクチル基を介して血清アルブミンに結合した糖結合蛋白であって、マンノースα(1−6)マンノースと血清アルブミンとの結合の比率が9.7:1である糖結合蛋白。
- 請求項1ないし3のいずれか一項に記載の糖結合蛋白を有効成分として含む免疫抑制薬。
- 抗原刺激に特異的に起因するリンパ球増殖を抑制する請求項4に記載の免疫抑制薬。
- マンノースα(1−4)マンノース又はマンノースα(1−6)マンノースがカルボニルオクチル基を介して血清アルブミンに結合した糖結合蛋白であって、免疫抑制を示す糖結合蛋白。
- マンノースα(1−4)マンノース又はマンノースα(1−6)マンノースがカルボニルオクチル基を介して血清アルブミンに結合した糖結合蛋白であって、抗原刺激に特異的に起因するリンパ球増殖を抑制する糖結合蛋白。
- マンノースα(1−4)マンノースがカルボニルオクチル基を介して血清アルブミンに結合した糖結合蛋白であって、抗原刺激に特異的に起因するリンパ球増殖を抑制し、マンノースα(1−4)マンノースと血清アルブミンとの結合の比率が8.2:1である糖結合蛋白。
- マンノースα(1−6)マンノースがカルボニルオクチル基を介して血清アルブミンに結合した糖結合蛋白であって、抗原刺激に特異的に起因するリンパ球増殖を抑制し、マンノースα(1−6)マンノースと血清アルブミンとの結合の比率が9.7:1である糖結合蛋白。
- 請求項6ないし9のいずれか1項に記載の糖結合蛋白を有効成分として含む免疫抑制剤。
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