JP3577323B2 - テトラサイクリンリプレッサーによる哺乳動物細胞における転写およびウイルス複製の調節 - Google Patents
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Description
発明の分野
本発明は、哺乳動物における転写を制御するためのテトラサイクリン耐性（tet）オペレーターおよびリプレッサーに依存した組成物および方法に関する。本発明は、かかる方法に使用する蛋白および宿主細胞の組み換え製造法を包含する。さらに、本発明は、tetオペレーター／リプレッサー系により複製が制御されるように組み換え法により処理されたウイルスにも指向される。これらのウイルスは、インビトロおよびインビボ両方における遺伝子導入のためのベクターとして、免疫のための作用剤として、ならびに細胞への核酸治療薬のデリバリー手段として役立ちうる。
発明の背景
導入遺伝子発現を特異的に調節する能力が多年にわたり分子生物学の主要関心事となっている。哺乳動物細胞の場合、重金属イオン（Brinster,et al.,Nature 296:39−42（1982））、熱ショック（Nover,in Heat Shock Response,pp.167−220,CRC,Fla.（1991））、およびホルモン（Klock,et al.,Nature 329:734−736（1987））のごとき要因に応答する誘導可能プロモーターを使用することにより、組み換え遺伝子のインビトロでの調節が最も頻繁に行われている。不幸なことに、一般的には、これらのプロモーターは、インデューサー存在下においてさえ比較的低レベルの発現を提供するにすぎず、インビトロで使用される大部分のインデューサーはインビボにおいて許容されない効果を有している。
誘導可能プロモーターの代替として、十分に特徴づけられた原核調節エレメントを用いて哺乳動物遺伝子発現の制御が試みられている。たいていの場合、調節系は、真核転写モジュレーターを宿主細胞ゲノム中の特定部位に指向するための手段（例えば、Labow,et al.,Mol.Cell.Biol.10:3343−3356（1990）参照）、あるいは原核リプレッサーを用いて遺伝子発現を直接阻害する試みにおける手段（例えば、Brown,et al.,Cell 49:603−612（1987）参照）としての原核オペレーターとリプレッサー蛋白との間の強力な相互作用に依存している。
テトラサイクリン（tet）オペロンに結合した原核エレメントの場合、哺乳動物細胞において転写を転調させることが知られているポリペプチドにtetリプレッサー蛋白が融合している系が開発されてきた。ついで、tetオペレーター配列を配置することにより融合蛋白が特定部位に指向される。例えば、tetリプレッサーがトランスアクチベーター（VP16）に融合され、選択遺伝子のプロモーターの上流に配置されたtetオペレーターに対して指向されている（Gussen,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547−5551（1992）;Kim,et al.,J.Virol.69:2565−2573（1995）;Hennighausen,et al.,J.Cell.Biochem.59:463−472（1995））。融合蛋白のtetリプレッサー部分はオペレーターに結合し、そのことにより、VP16アクチベータ−を転写誘導が望まれる特定部位に対して指向させる。別のアプローチはtetリプレッサーをKRABリプレッサードメインに融合させ、遺伝子の数百塩基対上流にあるオペレーターに対してこの蛋白を標的化することであった。この系を用いて、キメラ蛋白（tetリプレッサー単独ではない）がCMVにより調節された遺伝子発現を10〜15倍抑制しうることが見いだされた（Deuschule,et al.,Mol.Cell.Biol.15:1907−1914（1995））。これらのタイプの系に関する主な問題は、哺乳動物トランスアクチベーターまたはリプレッサーに対応する融合蛋白の部分は細胞の転写因子と相互作用し、多面発現的効果を引き起こす傾向があるということである。
理想的には、哺乳動物遺伝子発現調節系は選択遺伝子に対して非常に特異的であり、インビトロおよびインビボ両方における使用に適した因子による誘導に応じるものでなくてはならない。本発明はかかる系を開示し、それをいかにして使用して導入遺伝子の発現を調節するのかを説明する。さらに、本発明は、この系をいかにして適用してウイルスを処理し、ベクター、治療薬およびワクチンとして役立てるのかを説明する。
発明の概要
本発明は、tetオペレーター／リプレッサー系により調節される遺伝子発現を有するという共通した特徴を有する、多くの異なる組成物および方法に指向される。
A.組み換え蛋白製造のための組成物および方法
本発明はその第１の態様において、TATAエレメントを伴う哺乳動物プロモーター配列、少なくとも１つのtetオペレーター配列、およびプロモーターに作動可能に連結されオペレーターの下流に存在する遺伝子配列を含む組み換えDNA分子に指向される。TATAエレメントに対するオペレーター配列（複数も可）の正確な位置は本発明にとり重要である。転写制御において有効であるためには、オペレーターはTATAエレメントの最後のヌクレオチドよりも少なくとも６ヌクレオチド下流から開始しなければならず、蛋白をコードする遺伝子が発現される場合には、オペレーターは翻訳開始コドンの手前に存在すべきである。一般的には、オペレーターはTATAエレメントの、多くとも約100ヌクレオチド下流から開始すべきであり、６ないし24ヌクレオチド下流から開始すべきである。このように配置される場合、リプレッサー蛋白の結合は転写活性の本質的に完全なシャットダウンを引き起こす。このことは、ヒトCMV即時初期プロモーターのごとき非常に強力で乱雑なプロモーターに関してさえも真実である。
最も典型的には、tetリプレッサー蛋白を構成的に発現する哺乳動物細胞中に上記組み換えDNA分子が取り込まれるであろうと考えられる。細胞において活性なプロモーター（例えば、CMVプロモーター、HSV−１プロモーターまたはSV40プロモーター）に作動可能に連結されたtetリプレッサー蛋白遺伝子を含むベクターを用いて、哺乳動物細胞系、例えば、U2OS細胞またはVero細胞を形質転換することにより適当な細胞を得てもよい。別法として、DNA分子は上記エレメントのほかに、第２のプロモーター、好ましくは構成的でtetリプレッサー遺伝子配列に作動可能に連結されたものを含んでいてもよい。本発明はDNA分子のみならず、そのDNAにより形質転換された宿主細胞およびその細胞により生成される組み換え蛋白も包含する。
本発明は蛋白の組み換え製造方法にも指向され、該方法において、哺乳動物宿主細胞は、TATAエレメントを有するプロモーター配列、TATAエレメントの3'側から少なくとも６ヌクレオチドのところに位置する少なくとも１つのtetオペレーター配列、およびオペレーターの3'側に存在していてプロモーターに作動可能に連結している遺伝子を含むベクターを用いて形質転換されている。オペレーターの3'側の遺伝子は、選択遺伝子の発現を阻害するアンチセンス核酸、治療上活性のある作用剤（例えば、腫瘍リプレッサーまたは細胞性蛋白のトランスドミナントネガティブ変異体ペプチド）、実験目的の蛋白または単離目的の蛋白をコードするものであってもよい。遺伝子が蛋白をコードしているすべての場合において、オペレーター配列は当該遺伝子の翻訳開始コドンの手前に存在するであろう。形質転換細胞はリプレッサー蛋白を構成的に発現すべきであり、組み換え遺伝子の発現はテトラサイクリンを導入することにより細胞において誘導されるものであってもよい。典型的には、tetオペレーター配列はTATAエレメント中の最終ヌクレオチドから６ないし100ヌクレオチド（好ましくは、６ないし24ヌクレオチド）のところに存在するであろう。好ましいプロモーターはヒトCMV即時初期プロモーターである。この系が遺伝子発現を厳密に調節すること、すなわち、インデューサーであるテトラサイクリンが利用可能になるまで発現が本質的にシャットオフされることが見いだされている。
本発明方法を用いて、培養哺乳動物細胞またはトランスジャニックもしくは非ランスジェニック動物において組み換え蛋白を製造することができる。トランスジェニック動物を製造に使用する場合、最も典型的には、トランスジェニック動物はマウスであろうし、上記ベクターで形質転換された細胞は胚性幹細胞であることが必要である。tetプロモーターおよび組み換え遺伝子で形質転換する前に、プロモーターに作動可能に連結されたテトラサイクリンリプレッサー遺伝子を用いて形質転換することによりテトラサイクリンリプレッサーを発現するように幹細胞を処理してもよい。別法として、リプレッサー遺伝子をtetオペレーターと同じ遺伝子中に含ませて、組み換え蛋白をコードしている遺伝子と同じプロモーターの制御下、または別のプロモーターの制御下に置くことができる。形質転換された幹細胞を胚盤胞中に取り込ませてキメラ胚を作成し、それを偽妊娠動物中に移植する。このようにして移植された胚は生きた子孫を発生させることができ、それをスクリーニングして組み換え遺伝子を発現するヘテロ接合動物を同定する。ついで、ヘテロ接合動物を交雑させて、テトラサイクリン投与に応答して組み換え蛋白を生成するホモ接合動物を得る。
本発明は、この方法により作成されるトランスジェニック動物、ならびにTATAエレメントを有する哺乳動物プロモーター配列、TATAエレメントの3'側から少なくとも６ヌクレオチドのところに存在する少なくとも１つのtetオペレーター配列、およびオペレーターの3'側に存在していてプロモーターに作動可能に連結されている遺伝子を含む組み換えDNAをそのゲノム中に組み込まれたトランスジェニック動物を包含する。遺伝子が蛋白をコードする場合、オペレーター配列は遺伝子の翻訳開始コドンの手前に存在するであろう。典型的には、tetオペレーター配列はTATAエレメント中の最終ヌクレオチドから６ないし100ヌクレオチド（好ましくは、６ないし24ヌクレオチド）のところに存在するであろう。好ましいプロモーターはヒトCMV即時初期プロモーターである。トランスジェニック動物のほかに、本発明は、これらの動物により生成される組み換え蛋白を包含する。
B.加工されたウイルスおよびそれらの使用
tetオペレーター／リプレッサー系の１の特に重要な用途は、複製を制御できるウイルスの製造におけるものである。これらのウイルスの必須の特徴は、それらのゲノム中に少なくとも３つの関連エレメントを含んでいることである。３つの関連エレメントとは、TATAエレメントを有する組み換えプロモーター、TATAエレメントの3'側から少なくとも６ヌクレオチドのところに存在する少なくとも１つのtetオペレーター配列、およびプロモーターに作動可能に連結された遺伝子（オペレーターの下流に存在していて、発現された場合にウイルス複製を阻害する）である。典型的には、tetオペレーター配列、TATAエレメント中の最終ヌクレオチドから６ないし100ヌクレオチド（好ましくは、６ないし24ヌクレオチド）のところに存在するであろう。オペレーターの下流に存在する遺伝子は、ウイルス複製を阻害する蛋白をコードすることにより、あるいはアンチセンス機構によりウイルス複製を阻害する転写生成物を生成することにより作用するものであってもよい。遺伝子が蛋白をコードする場合、tetオペレーター配列は翻訳開始コドンの上流に存在するであろう。tetリプレッサー蛋白を構成的に発現する培養細胞中において、加工されたウイルスを生成させ増殖させてもよい。これらの条件下において、ウイルス複製を阻害する遺伝子がシャットオフされて、大量のウイルスが得られるであろう。ついで、ウイルスを集め、精製し、インビトロまたはインビボにおいて哺乳動物細胞に導入してもよい。通常は、哺乳動物細胞はtetリプレッサー蛋白を生成しないので、オペレーター配列は占領されないであろう。結果として、tetオペレーターの3'側に存在する遺伝子が発現され、ウイルス複製が防止される。
上記方法において加工されたウイルスは広範な用途がある。第１に、ウイルスは、哺乳動物細胞へのDNA（例えば、遺伝子）のデリバリーのためのビヒクルとして使用することができる。これらの状況下において、典型的には、第２の組み換えプロモーターがウイルスゲノム中に含められて、発現が望まれる遺伝子に作動可能に連結される。この第２のプロモーターには、TATAエレメントから６ないし100ヌクレオチド（好ましくは、６ないし24ヌクレオチド）下流にある１またはそれ以上のtetオペレーターが続いていてもよく、続いていなくてもよい。DNAが宿主細胞にデリバリーされた後、tetリプレッサー蛋白不存在のため、新たなウイルスの生成が阻害される。第２のプロモーターに結合した遺伝子は、細胞中での選択遺伝子発現を阻害するアンチセンス核酸をコードしていてもよく、治療上活性のある蛋白（例えば、腫瘍リプレッサーまたは細胞系蛋白のトランスドミナントネガテイブ変異体ポリペプチド）、または単離もしくは実験を目的とした蛋白をコードするものであってもよい。本発明は、ウイルスで細胞をトランスフェクションすることにより宿主細胞を形質転換する方法、形質転換宿主細胞それ自体、ならびにその宿主細胞により得られる組み換え蛋白を包含する。
上記ウイルスを用いて対象を免疫してもよい。加工されたウイルスを含有するワクチンの大きな利点は、免疫による活性ウイルス感染の危険性が大幅に低下していることである。なぜなら、加工されたウイルスは、対象中に注入された後複製しないからである。ウイルス複製が起こらないことをさらに確実にするために、さらなる変異をウイルスに導入してもよい。例えば、欠失変異を１またはそれ以上の必須ウイルス遺伝子に導入してもよい。一般的には、このようなさらなる変異を含むウイルスが好ましい。
加工されたウイルスは、ウイルス感染に対する患者の直接的治療においても有用である。この方法の最初の工程は、第２のウイルス（すなわち、患者に感染したのとおそらく同じ株であるが別のウイルス）のゲノムに下記DNAを組み込むことにより第２のウイルスを形質転換することを包含する。そのDNAとは、TATAエレメントを有するプロモーター配列、TATAエレメントの3'側から少なくとも６ヌクレオチドのところ（典型的には、６ないし100ヌクレオチドのところ）に位置する少なくとも１つのtetオペレーター配列、およびオペレーターの3'側に存在していてプロモーターに作動可能に連結している遺伝子を含むものである。この遺伝子が発現された場合に、第２のウイルスおよび患者に感染したウイルスの両方の複製をブロックしうるように、この遺伝子を選択すべきである。遺伝子が蛋白をコードする場合、tetオペレーター配列は遺伝子の翻訳開始コドンの手前に存在するであろう。形質転換された第２のウイルスを、tetリプレッサー蛋白を発現する宿主細胞中で増殖させ、そのことにより大量のウイルス子孫を生成させる。ウイルスを集め、精製し、ついで、患者に投与する。好ましい具体例において、tetオペレーターはTATAボックスの最後のヌクレオチドから６ないし24ヌクレオチド下流にあり、使用プロモーターはヒトCMV即時初期プロモーターである。
最後に、本発明は、核酸治療剤を細胞にデリバリーする方法に関する。核酸治療剤は、再応性蛋白の発現を阻害するアンチセンスフラグメント、あるいは治療作用をううする蛋白をコードする遺伝子を含んでいてもよい。ウイルスを加工してそのゲノム中に下記のｉ）、ii）およびiii）を含むようにする。それらは、ｉ）TATAエレメントを有する組み換え哺乳動物プロモーター、ii）TATAエレメントの3'側から少なくとも６ヌクレオチドのところ、かつ翻訳開始コドンの5'側に存在する少なくとも１つのtetオペレーター、およびiii）オペレーターの3'側に存在し、プロモーターに作動可能に連結されている遺伝子である。この遺伝子が発現される場合、ウイルス複製が阻害される。典型的には、tetオペレーター配列はTATAエレメントの最後のヌクレオチドの3'側から６ないし100ヌクレオチド（好ましくは、６ないし24ヌクレオチド）のところに存在する。好ましいプロモーターはヒトCMVの即時初期プロモーターである。さらに、ウイルスはそのゲノム中に、第２のプロモーターに作動可能に連結された、治療剤をコードする核酸を含んでいなければならない。この第２のプロモーターには、TATAエレメントから６ないし100ヌクレオチド（好ましくは、６ないし24ヌクレオチド）下流にある１またはそれ以上のtetオペレーターが続いていてもよく、続いていなくてもよい。
治療剤デリバリー用ウイルスベクターの製造後の、本発明方法の次の工程は、tetリプレッサー蛋白を発現する宿主細胞中において大量のウイルスを増殖させることである。このようにして増殖したウイルスを集め、精製し、ついで、患者に投与する。通常は、患者はtetリプレッサーを合成する細胞を有していないので、ウイルス複製はブロックされるが、核酸治療剤の転写は進行するであろう。
【図面の簡単な説明】
図１。hCMV主要即時初期エンハンサー−プロモーターのダイヤグラムおよびtetR−応答性転写スイッチの作成方法。パネルＡは、tetオペレーターを有するhCMV主要即時初期エンハンサー−プロモーターの作成に使用する２つのタンデムなtetオペレーターを示す。パネルＢは、細胞性転写因子と相互作用することが知られている、周辺のTATAエレメントおよびシス作用性配列を示す。tetオペレーターの挿入に使用するSac I制限部位に下線を付した。
図２。TATAエレメントのすぐ下流へのオペレーター配列の挿入により、hCMV主要即時初期エングァンサー−プロモーターをtetR−感受性転写スイッチに変化させる。60mmのディシュ１枚あたり3x105個のVero細胞を撒き、撒種から24時間後に、（１μg/mlのテトラサイクリン存在下または不存在下のいずれかにおいて）0.5μｇのpWRG1630またはpCMVtetOEGF単独で、あるいは１μｇ、２μｇおよび３μｇのtetリプレッサー発現プラスミドpcDNA−tetRの存在下で細胞をトランスフェクションした。pUC19ベクタープラスミドを用いてpCDNA3−tetRとバランスさせ、3.5μｇのプラスミドDNAをトランスフェクションアッセイに使用した。20〜24時間ごとに細胞外培地を取り、新鮮増殖培地（１μg/mlのテトラサイクリン含有または不含）を添加した。０〜20時間（パネルＡ）、20〜44時間（パネルＢ）、および44〜68時間（パネルＣ）において集めた細胞外培地中のhEGFを、抗−hEGF特異的モノクローナルおよびポリクローナル抗体を用いてELISAにより測定した。
図３。テトラサイクリンによる、tetRにより媒介される抑制の解放。テトラサイクリン不存在下において、pCMVtetOEGF（0.5μｇ）、またはpCMVtetOEGF（0.5μｇ）およびpcDNA3−tetR（２μｇ）でVero細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションから20時間後、細胞外培地を集め、新鮮増殖培地をトランスフェクション細胞に添加して、0.1μg/mlまたは１μg/mlのテトラサイクリンの存在下または不存在下において、さらに24時間培養した。０〜20時間（パネルＡ）、20〜44時間（パネルＢ）、および44〜68時間（パネルＣ）において集めた細胞外培地におけるhEGF発現をELISAにより調べた。各同時トランスフェクションアッセイにつき２つの独立した実験が示される。
図４。ルシフェラーゼを受容体として用いる、tetRにより媒介される導入遺伝子の積算調節効率の測定。テトラサイクリン不存在下または存在下、０〜20時間において0.5μｇのpCMVtetOGL2のみ、または0.5μｇのpCMVtetOGL2および２μｇのpCDN3−tetRを用いて、さらに20〜70時間において１μg/mlのテトラサイクリンの不存在下または存在下、60mmのディッシュ中のVero細胞をトランスフェクションした。トランスフェクション70時間後に、室温において、0.2mMのPMSF、100μg/mlのTPCKおよび1mMのロイペプチンが存在する0.5mlの1xルシフェラーゼ溶解バッファー中でVero細胞を15分間溶解させた。４℃において微量遠心分離を20分行うことにより不溶性細胞残渣を除去し、ついで、ルシフェラーゼ活性を、10μｇの蛋白あたりのmV数として測定した。
図５。tetリプレッサーによるhCV主要即時初期エンハンサー−プロモーターのインビボ調節。全部で18個の中間層創傷（15x15x15x1.2mm）をブタの背の皮膚に作成した。微粒子を用いる遺伝子導入により、９個の創傷に0.2μｇのpCMVtetOEGFおよび0.8μｇのpcDNA3ベクターDNAを投与し、残りの創傷には0.2μｇのpCMVtetOEGFおよび0.8μｇのpcDNA3−tetRを投与した。微粒子爆撃後、100ユニット/mlのペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシンが存在する1.2mlの等張セイラインを入れた密封ビニール製付着性チャンバー中にトランスフェクションされた各創傷を封じた。遺伝子導入から22、46および70時間後に傷の液体をチャンバーから集め、−70℃で保存した。各時点で傷の液体を集めた後、新たなチャンバーを用意した。遺伝子導入から46時間後に、静脈注射により各ブタに500mgのテトラサイクリンを与えた。傷の液体中のhEGF発現をELISAにより調べた。各棒グラフの縦線は標準偏差を示す。
図６。トランスドミナントネガテイブ形態のUL9ペプチドによるHSV−１複製の阻害ならびにtetリプレッサーを用いた場合の復帰可能性。60mmのディシュ１枚あたり5x105個のVero細胞を撒いた。撒種から20ないし24時間後、精製された感染性HSV−1 DNA（単独またはpCMVtetOUL9−C571もしくはpCMVtetOUL9−n10/C535のいずれかとともに）を用いて細胞をトランスフェクションした。1.5μｇのpCDNA3ベクターDNAまたはtetリプレッサー発現プラスミドpCDNA3−tetRの存在下でトランスフェクションを行った。トランスフェクションから14時間後、培地を除去し、ついで、ディッシュ１枚あたり10mlのメチルセルロースをトランスフェクション細胞に添加した。トランスフェクションから68ないし72時間後に細胞をニュートラルレッドで染色することによりウイルスプラークを可視化し、14時間後にプレートを計数した。
図７。テトラサイクリンを用いた場合のHSV−１複製阻害の復帰可能性。DNAベクターの３つの異なるセットを用いてVero細胞をトランスフェクションした。３つのセットとは、１）0.2μｇの感染性HSV−1 DNAおよび2.1μｇのpCDNA3、２）0.2μｇの感染性HSV−1 DNA、0.1μｇのpCMVtetOUL9−C571および２μｇのpCDNA3、３）0.2μｇの感染性HSV−1 DNA、0.1μｇのpCMVtetOUL9−C571および２μｇのpCDNA3−tetRである。１μg/mlのテトラサイクリン存在下または不存在下のいずいれかにおいてトランスフェクションを行った。トランスフェクションから16時間後、培地を細胞から除去し、5mlの新鮮培地（濃度５μg/mlのテトラサイクリン含有または不含）を各ディッシュに添加した。トランスフェクションから48時間後、細胞を集め、ウイルス収量を測定した。この測定結果を図に示す。
定義
以下の説明には、組み換えDNA法についての多くの用語を用いる。明細書および請求の範囲について明確かつ一貫した理解を得るために、かかる用語の範囲を含め、以下に定義する。
ウイルスベクター：本明細書の「ウイルスベクター」および均等な用語は、選択DNAまたはRNA配列を宿主細胞中に導入するための使用されるウイルスをいう。インビボまたはインビトロにおいて細胞中にDNAを導入する目的でベクターを使用してもよい。後者の目的に通常使用されているウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルスおよびヘルペスウイルスが含まれる。
発現ベクター：この用語およびこれに相当する用語は、宿主細胞中への形質転換後、宿主中でクローン化されたDNAの発現を誘導しうるベクターをいう。通常には、クローン化DNAは、プロモーターまたはエンハンサーのごとき特定の調節配列の制御下に置かれる（すなわち、作動可能に連結される）。おそらく、プロモーター配列は構成的なものであり、誘導可能または抑制可能なものである。
実質的に純粋または精製された：本明細書の「実質的に純粋」または「精製された」は、所望生成物は本質的に細胞性成分を含まないことを意味する。成分としては蛋白、炭水化物および脂質があるが、これらに限らない。蛋白または核酸の純度を調べる１の方法は、ポリアクリルアミドまたはアガロースのごときマトリックス中での電気泳動によるものである。染色後の単一バンド出現により純粋であることが明らかとなる。
宿主：ベクターを受容する原核細胞または真核細胞はそのベクターの宿主である。この用語は、ゲノム中に遺伝子を組み込むように処理された原核細胞または真核細胞を包含する。宿主として役立ちうる細胞は、細胞の形質転換法と同様に、当該分野においてよく知られている（例えば、Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor（1989）参照）。
プロモーター：遺伝子の転写を開始させるDNA配列である。典型的には、プロモーターは遺伝子の5'末端に見いだされ、スタートコドンに近い位置にある。プロモーターが誘導可能なタイプである場合、転写速度は誘導剤に応答して増加する。
発現：発現は、ポリペプチドがDNAから作られるプロセスである。このプロセスは、遺伝子のmRNAへの転写およびこのmRNAのポリペプチドへの翻訳を含む。文脈に応じて、「発現」とはRNA、蛋白、あるいはそれら両方の生成をいうこともある。
組み換え：本明細書の用語「組み換え」は、核酸配列および配列エレメントを実験的に組み換えることにより得られる核酸についていう。組み換え宿主は組み換え核酸を受容する宿主であり、用語「組み換え蛋白」はかかる宿主により生成される蛋白をいう。
作動可能に連結：用語「作動可能に連結」は、正常な機能を果たすことが可能なように連結された遺伝学的エレメントについていう。例えば、転写がプロモーターの制御下にある場合、遺伝子はプロモーターに作動可能に連結されており、かかる転写により通常には当該遺伝子によりコードされる蛋白が生成される。
核酸治療剤：この用語は、直接的あるいは間接的に治療剤として役立つ核酸配列をいう。典型的には、かかる作用剤は２つのカテゴリーに分類される。第１のカテゴリーは、宿主細胞中の相補的配列にアニールする（そのことにより発現を阻害する）ように設計されたアンチセンス核酸を包含する。あるいは、この用語は、治療蛋白をコードする核酸をいうこともある。
遺伝子：本明細書の「遺伝子」は、プロモーター活性の結果としての転写を受ける核酸配列をいう。遺伝子は特定の蛋白をコードしていてもよく、あるいはそれ自体興味あるRNA配列をコードするものであってもよい。なぜなら、例えば、それはアンチセンス阻害剤として作用するからである。
哺乳動物プロモーター：用語「哺乳動物プロモーター」は哺乳動物細胞中で活性のあるプロモーターをいう。同様に、「原核プロモーター」は原核細胞中で活性のあるプロモーターをいう。
必須ウイルス遺伝子：用語「必須ウイルス遺伝子」は、ウイルス複製に必要な遺伝子と定義される。
必須細胞性遺伝子：この用語は細胞の生存に必要な遺伝子をいう。
発明の詳細な説明
本発明は、tetオペレーターおよびリプレッサー蛋白を用いて哺乳動物遺伝子発現を調節できるという考えに基づくものである。発現を制御しているプロモーターのTATAエレメントの最後のヌクレオチドよりも少なくとも６ヌクレオチド下流にオペレーターが存在する場合には、他の哺乳動物転写モジュレーターにリプレッサー蛋白を融合させる必要なく調節が行われうる。
重要ではないが、細菌におけるテトラサイクリン耐性（tet）オペロンの基本的機能についての知識は、本発明の実施方法を理解するための助けとなるかもしれない。tetオペロンにおいて、テトラサイクリン耐性遺伝子（tetA）およびtetリプレッサー蛋白をコードする遺伝子（tetR）は両方とも同じプロモーターおよびオペレーターエレメントの制御下にある。テトラサイクリン不存在下においては、tetリプレッサー蛋白はオペレーターDNA配列に結合し、そのことにより隣のプロモーターがRNAポリメラーゼと相互作用することを立体的に妨げる。かくして、tetAおよびtetRの両方の転写がブロックされる。細菌中のテトラサイクリンレベルが上昇した場合、テトラサイクリンはリプレッサー蛋白に結合し、リプレッサー蛋白をオペレーター配列から引き離す。結果として、ポリメラーゼはプロモーター配列に結合可能となり、tetAおよびtetR遺伝子は両方とも転写される。
tetリプレッサー蛋白とtetオペレーターとの間の強力な相互作用により、細胞ゲノム中の特定部位に対して真核調節蛋白を指向させる機構が提供される。上記のごとく、以前説明されていた系は、tetリプレッサーおよび哺乳動物転写アクチベータ−またはリプレッサーを含む融合蛋白の標的として役立つ哺乳動物遺伝子の上流にtetオペレーターが存在するものであった。融合蛋白のtetリプレッサー部分がオペレーター配列に結合し、そのことにより、それが発現されるべき遺伝子上流に配置されることとなる。ついで、融合蛋白の残りの部分は、細胞性転写因子と相互作用することにより遺伝子発現を転調させるものとして役立つ。
これらのタイプの系に関する主な問題は、オペレーターから離れた部位にある転写因子と哺乳動物転写モジュレーターとの相互作用により多面的効果が生じることである。tetリプレッサー蛋白のみ（すなわち、融合蛋白以外のものとして）を用いて遺伝子発現を転調させようとする従前の試みは成功していない（例えば、Kim,et al.,J.Virol.69:2565−2573（1995）;Deuschule,et al.,Mol.Cell.Biol.15:1907−1914（1995）参照）。全DNAヘリックスターンに相当する約10塩基対の１個またはそれ以上のtetオペレーターをtetオペレーターの下流に挿入することにより、tetRのみを用いて遺伝子発現をうまく転調させることができることを見いだした。このアプローチを用いて、最も強力かつ乱雑な真核エレメントの１つであるhCMV主要即時初期エンハンサー−プロモーターにより制御されている転写を厳密に調節することができた。これをインビトロおよびインビボの両方において行うことができる。
I.転写スイッチとしてのtetオペレーター
本発明は、第１の態様において、TATAエレメントを伴う哺乳動物プロモーター配列を含む組み換えDNA分子に指向される。テトラサイクリンオペレーター配列はTATAエレメントの3'側から少なくとも６ヌクレオチドのところに置かれ、プロモーターにより転写が制御されるDNA配列がその後に続く。プロモーター、オペレーターおよび他のDNAを合成または精製する方法は当該分野においてよく知られており、分子生物学における標準的方法を用いて、適当に配置されたエレメントを有するDNA分子を構築することができる（例えば、Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor（1989）参照）。好ましい方法の例は、tetオペレーターの完全配列とともに「実施例」のセクションに記載されている。
どのようなタイプのプロモーターであっても本発明に使用することができ、誘導可能、抑制的または構成的なものが含まれる。好ましい哺乳動物プロモーターは、マウスメタロチオネインＩ遺伝子（Hamer,et al.J.Mol.Appl.Gen.1:273−288（1982））のプロモーター；ヘルペスウイルスの即時初期およびTKプロモーター（Yao et al.,J.Virol.69:6249−6258（1995））;SV40初期プロモーター（Benoist,et al.Nature 290:304−310（1981））；ならびに、特に、ヒトCMV即時初期プロモーター（Boshart,et al.Cell 41;521−530（1985））を包含する。全長または最小プロモーターを使用してもよく、他の調節エレメント（例えば、図１参照）を含めてもよい。「実施例」セクションで説明するように、全長ヒトCMV主要即時初期エンハンサー−プロモーターが本発明にうまく使用され、特記しないかぎり、「ヒトCMV即時初期プロモーター」という場合には、当該プロモーター自体ならびに図１の示す他のいずれかまたはすべての転写調節エレメントと組み合わされた当該プロモーターをいうものとする。
TATAエレメントの少なくとも６ヌクレオチド下流から開始するtetオペレーター配列による転写を受けている配列からプロモーターを分離する。典型的には、オペレーターはTATAエレメントの６ないし100ヌクレオチド（好ましくは、６ないし24ヌクレオチド）下流の位置から開始するであろう。これらのエレメントの配置は、下流配列の転写または遺伝子産物の翻訳を指令するプロモーターの能力を実質的に妨害するものであってはならない。
典型的には、他の転写または翻訳エレメントを含有するベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）中に上記DNA分子が含まれるであろう。所望ならば、大量のベクターDNAを得ることができる（例えば、リプレッサー蛋白を生成する細菌中にベクターを導入する）。ついで、好ましくは、tetリプレッサーを発現するように処理された哺乳動物宿主細胞中にベクターを導入する。哺乳動物細胞をtetリプレッサーを発現するように処理する１の方法は、リプレッサー遺伝子配列を別のプロモーターに連結し、これをtetオペレーター含有ベクター中に取り入れ、ついで、そのDNAを細胞中に導入することである。別法として、tetオペレーター含有構築物を導入する前に、tetリプレッサー配列を含む発現ベクターを用いて細胞を形質転換してもよい。tetリプレッサーを発現する細胞を得るために使用したプラスミドの一例はpcDNA3−tetR（「実施例」セクション参照）である。
本発明に使用されうる発現ベクターを細胞に導入する方法は、リン酸カルシウム沈降法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソームによる導入、ウイルスによる導入、または微粒子による遺伝子の導入を包含する。インビボにおいて宿主細胞への導入を行う場合、導入のための好ましい方法はウイルスベクターによるものである。当該分野でよく知られたハイブリダイゼーション法を用いて、あるいはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて特定の組み換え配列を増幅することにより、取り込んだ構築物を有する細胞を同定することができる。細胞中に導入した組み換えDNAが、例えば免疫学的または酵素によるアッセイによって検出されうる蛋白を生成する場合には、テトラサイクリンを細胞に導入し、ついで、細胞周囲の培地または細胞溶解物のいずれかをアッセイすることにより、組み換え蛋白の存在を確認することができる。
テトラサイクリン不存在下においては、構築物で形質転換された宿主細胞は実質的な量の組み換えDNAを発現するはずがない。宿主細胞中に取り込まれた組み換えDNA配列の発現は、テトラサイクリン自体またはテトラサイクリンアナログのいずれかを用いることにより誘導される。後者を、tetリプレッサーに特異的に結合する能力を維持しているという意味で、テトラサイクリンに関連した化合物であると定義する。かかるアナログの解離定数は少なくとも1x10-6Mでなくてはならず、好ましくは、1x10-9Mよりも大きい。使用可能なアナログの例は、Hlavka,et al.（″The Tetracyclines,″in Handbook of Experimental Pharmacology 78,Blackwood,et al.（eds.）,New York（1985））およびMitschef（″The Chemistry of Tatracycline Antibiotics,″Medicinal Res.9,New York（1978））により議論されたものを包含するが、これらに限らない。同様に、リプレッサーまたはオペレーターの配列における小規模な修飾は、かかる修飾がリプレッサー／オペレーター相互作用のアフィニティーまたは特異性を実質的に低下させない場合には、本発明に影響しないであろう。
II.インビトロおよびインビボにおける蛋白の組み換え製造方法
上記ベクターおよびDNA構築物を、インビトロまたはインビボにおける蛋白の組み換え製造方法の一部として使用することができる。インビトロにおいて蛋白を製造するには哺乳動物宿主細胞が好ましく、U20S細胞、Vero細胞、NIH−3T3細胞、CHO細胞、HeLa細胞、LM（tk−）細胞等がある。これらの種々の細胞タイプのそれぞれに適したベクターは当該分野においてよく知られている（例えば、Sambrookらの上記文献参照）。
DNA構築物を用い、トランスジェニックまたは非トランスジェニック動物を用いてインビボにおいて組み換え蛋白を製造することもできる。いずれのタイプのトランスジェニック動物における製造であっても本発明に適合するが、ほとんどの場合マウスが用いられると考えられる。典型的には、マウス胚性幹（ES）細胞をDNA構築物で形質転換し、ついで、発達中のマウス胚中に導入する。発達中の胚の生殖系の一部に組み込まれ、あるいはその一部となりうるES細胞系を用いることができ、例えば、ネズミ細胞系D3（ATCC,12301 Parklawn Drive,Rockville,Md.,カタログ番号CR 1934）がある。細胞を培養し、当該分野でよく知られた方法（例えば、Robertson,in Tetratocarcinomas and Embryonic Stem Cells;A Practical Approach,Robertson,ed.,I.R.L.Press Washington,D.C.（1987）;Bradley,et al.,Current Topics in Devel.Biol.20:357−371（1986）；およびHogan,et al.,Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.（1986））を用いるDNA挿入に備える。上記のごとくtetリプレッサー蛋白を発現するように幹細胞を処理することが必要であろうし、tetオペレーターを含む同じ構築物中にリプレッサー遺伝子を導入すること、あるいはリプレッサー遺伝子含有構築物で細胞を形質転換することのいずれかにより、かかる処理を行うことができる。
当該分野で知られたいずれの方法を用いてもDNAを細胞に取り込ませることができるが、最も典型的には、エレクトロポレーションを用いてこの導入が行われるであろう。DNA構築物がプラスミドタイプのベクターに挿入されている場合、トランスフェクション前にDNAを直鎖状にすることが好ましい。発現されるべきDNA配列の外側を切断するように選択された適当な制限エンドヌクレアーゼでDNAベクターを消化することにより直鎖化を行うことができる。種々の方法のいずれを用いてもトランスフェクションされた幹細胞のスクリーニングを行うことができる。例えば、細胞中に導入したDNA中に存在する配列に特異的な標識プローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行ってもよい。別法として、選択配列に対するPCR増幅を行うこともできる。
胚性幹細胞が形質転換され、選択された後の次の工程は、細胞を胚に取り込ませることである。これを行うための好ましい方法は、発達における胚盤胞段階の胚に幹細胞をマイクロインジェクションすることによる。マウスにおいて、妊娠動物の子宮を潅流することにより発達の約3.5日目の胚盤胞を得てもよい。これを行うための適当な方法は当該分野においてよく知られている（Bradley,in Tetratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:A Pracrical Approach,（1987）参照）。好ましい胚盤胞は雄性であり、幹細胞遺伝子によりコードされるのとは異なる表現型マーカー（例えば、毛の色）の遺伝子を有するものである。このようにして、簡単に子孫をスクリーニングできる。
トランスジェニック動物を製造するプロセスの次の工程は、キメラ胚を偽妊娠動物の子宮中に移植することを包含する。典型的には、メスを同じ種の精管切除したオスと交配させることにより、かかる動物を得る。メスの偽妊娠段階は移植の成功にとり重要であり、種により異なるであろう。マウスについては、典型的には、偽妊娠２〜３日目のメスを用いるべきである。
キメラ胚を偽妊娠マウス中に移植した後、それらを最後まで発達させ、ついで、子孫をスクリーニングする。表現型選択法を用いる場合、モザイク状の毛の色または容易に明らかな他の表現型マーカーについて動物を簡単に検査することにより最初のスクリーニングを行ってもよい。さらに、あるいは別法として、子孫の組織、例えば、、マウスの尾の組織から染色体DNAを得て、サザンブロットおよび／またはPCR増幅を用いて組み換えDNAの存在につきスクリーニングしてもよい。ついで、ヘテロ接合のものを種間交配させることによりホモ接合トランスジェニックマウスを得て、ついで、これを用いて組み換えDNAを発現しうる動物を連続的に供給してもよい。組み換え体の合成が必要となるまで、動物をテトラサイクリン不存在下に維持することにより発現を制御することができる。これらの条件下において、tetリプレッサー蛋白がオペレーター配列に結合し、そのことにより組み換えプロモーターの活性が阻害されるであろう。テトラサイクリンまたはテトラサイクリンアナログを動物に投与すると、容易に細胞膜を通過し、その後、tetリプレッサー蛋白をオペレーター配列から解離させるであろう。かくして、組み換えプロモーターの下流の組み換え遺伝子が転写され始めるであろう。
このようにして作成された動物を、研究目的、例えば、種々の薬剤の効果を研究するために使用してもよく、あるいはまた、組み換え蛋白を製造する目的で使用してもよい。後者の場合、細胞で発現された組み換え遺伝子を、動物の血中に蛋白を分泌させるシグナル配列に連結することが好ましい。ついで、これを集めて、組み換え蛋白精製用の源として役立ててもよい。
III.組み換え的に処理されたウイルス
A.組み換えウイルス、ワクチンの製造および抗ウイルス治療
上記tetオペレーター／リプレッサー調節系を用いて、子孫の生成が厳密に調節されているウイルスを製造することもできる。プロモーター（好ましくは、ヒトCMV即時初期プロモーター）、TATAエレメントの3'側から少なくとも６ヌクレオチド下流のtetオペレーター配列およびオペレーターの3'側にありプロモーターに作動可能に連結された遺伝子を含む構築物をウイルスゲノムに導入することにより、これを行うことができる。この遺伝子は、発現され、ウイルス複製の必要な蛋白をコードするRNAに結合するアンチセンス配列の形態となることができる場合にウイルス複製を阻害するものである。あるいはまた、その遺伝子は、複製を阻害する蛋白をコードするものであってもよい。後者の場合、tetオペレーター配列は、遺伝子の翻訳開始コドンの前に置かれるであろう。ウイルス複製を阻害する蛋白の例は、HSV−１のUL9蛋白のトランスドミナントネガティブ形態であり、それはHSV−１複製開始点に結合し、過剰発現された場合、新たなウイルス形成をブロックする。類似蛋白が他のウイルスにも同様に存在することがわかっている。
tetリプレッサー蛋白を構成的に生成する細胞において上記ウイルスを得ることができる。これらの環境下において、リプレッサーはtetオペレーター配列に結合し、下流遺伝子の発現を阻害するであろう。よって、ウイルス阻害性DNA配列をウイルスゲノムに取り込ませることができ、大量のウイルスを得ることができる。例えば、リプレッサーはUL9蛋白の変異形態の合成をブロックする可能性があり、そのことによりHSV−１が生成される。所望ならば、テトラサイクリンまたはテトラサイクリンアナログを細胞に導入してもよい。テトラサイクリンはリプレッサー蛋白に結合し、そのことによりそれをオペレーター配列から解離させるであろう。ついで、組み換えプロモーターからの核酸の転写が進行し、ウイルス複製が阻害されるであろう。
上記の系をインビドロおよびインビボの両方において使用できることに注意すべきである。例えば、tetリプレッサー蛋白を生成する培養細胞に感染させることにより大量のウイルスを増殖させることができる。ついで、ウイルスを集め、精製し、対象に投与することができる。投与された場合、ウイルスはそのDNAを対象中の細胞にデリバリーするが、tetリプレッサー蛋白が存在しないので、ウイルスゲノム中の組み換えDNAの転写が進行し、ウイルス複製が阻害される。これらの特徴はそれ自体、処理されたウイルスを免疫方法およびウイルス性疾患の治療に特に使用されるようにする。
B.免疫方法における、処理されたウイルスの用途
実際には疾病を引き起こさずに免疫学的応答を刺激するように修飾された特定病原体に対象を曝露することにより大部分の免疫方法が行われている。例えば、死滅ウイルスまたは弱毒化ウイルスのいずれかを含有するワクチンを個体に与えてポリオに対して個体を免疫してもよい。tetオペレーター／リプレッサー系を用いて処理されたウイルスを、tetリプレッサーを生成する培養細胞中で大量に増殖させ、ついで、ワクチンの一部として患者に投与することができる。このようにして治療された患者は、ウイルス上に通常的に存在する蛋白に曝露されることになり、それゆえ、免疫学的応答を生じるであろう。しかしながら、通常、哺乳動物細胞はtetリプレッサーを生成しないので、ウイルスは複製できず、疾病に対する十分な曝露が妨げられるであろう。
ウイルスが生成されないことをさらに確認するために、さらなる変異を組み換えウイルスに導入することができる。例えば、欠失変異を必須ウイルス遺伝子中に導入してもよい。後者のウイルスを作成し、tetRおよび野生型の必須ウイルス遺伝子の両方を発現する細胞中で増殖させることができる。
単離された実質的にすべての感染性ウイルスに関して、免疫のためのこのアプローチを用いることができ、ヒトの免疫ならびに動物の免疫に適用することができる。
C.ウイルス性疾患の治療における、処理されたウイルスの用途
本発明のtetオペレーター／リプレッサー系を用いて処理されたウイルスを、ウイルス感染の治療に直接使用することができる。例えば、上記方法でHSV−１ウイルスを処理して、強力な哺乳動物プロモーター、tetオペレーター配列およびUL9のトランスドミナントネガティブ形態をコードする遺伝子を含有する構築物をそのゲノム中に含ませることができる。処理されたHSV−１を、tetリプレッサーを発現する細胞において大量に発現させることができ、ついで、HSV−１感染にかかっている患者に投与することができる。処理されたウイルスは患者の細胞に入り、トランスドミナントネガティブ変異UL9蛋白を発現するであろう。このことは、処理されたHSV−１のみならず元々患者に感染していたHSV−１の複製を阻害することに役立つ。要するに、処理されたウイルスは、インビボにおいて抗ウイルス剤をデリバリーするためのビヒクルとして役立つ。処理されたウイルスは感染ウイルスと同じ細胞特異性を有しているので、理想的に治療に適している。
処理されたウイルスがワクチンまたは治療薬として役立つ動物およびヒトのウイルスとしては、アルボウイルス、鳥類白血症ウイルス、CELOウイルス、Chagresウイルス、鼻炎ウイルス、コクサッキーウイルス、出血性ウイルス、ウマ脳脊髄炎ウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、感性性ブタ脳脊髄炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルス、乳頭腫ウイルス、パラインフルエンザウイルス、ポリオウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、デング熱ウイルス、センダイウイルス、および狂犬病ウイルスが挙げられるが、これらに限らない。
D.核酸治療薬デリバリー用ベクターとしての処理されたウイルス
少し修飾すれば、上記の処理されたウイルスを、いずれかのタイプの核酸治療薬を細胞にデリバリーするために使用することができる。これらの作用剤は、相補的配列に結合してそれらの蛋白としての発現を阻害するアンチセンス核酸の形態であってもよく、あるいは治療作用を有する蛋白をコードする遺伝子の形態であってもよい。
治療薬として使用される核酸は、治療を要する細胞において活性のあるプロモーターに作動可能に連結されなくてはならない。これは、ウイルス複製を制御する組み換え遺伝子を調節するのと同じプロモーターであってもよく、ウイルスゲノム中の別の異なるプロモーターであってもよい。患者の治療における基本的手順は、本質的には、ウイルス感染治療用に処理されたウイルスに関して上で説明したものと同じである。特別には、核酸治療薬を含むように処理されたウイルスは、tetリプレッサー蛋白を生成する細胞において増殖するであろう。このようにして作成されたウイルスを集め、精製し、ついで、治療を要する対象に投与する。ついで、処理されたウイルスは対象の細胞に感染し、内部に入ったならば、ウイルス複製を阻害する核酸および治療薬として役立つ核酸の両方を発現し始めるであろう。この系は遺伝子治療に理想的に適しているが、それをインビトロにおいて細胞に核酸をデリバリーする機構として、あるいはインビボにおいて細胞を処理する試みのための手段としても使用できる。例えば、欠損カウンターパートを置換するための、あるいは異常な遺伝子発現を防止するための相同組み換え用に設計されたDNA構築物を、このようにしてデリバリーしてもよい。
上記のように、さらなる変異を必須ウイルス遺伝子に導入して、ウイルスが複製しないことを確実ならしめてもよい。
実施例
実施例1:tetリプレッサーを用いる、ヒトCMV主要即時初期エンハンサー−プロモーターの調節スイッチへの変換
A.材料および方法
リポーターおよびtet発現プラスミド：プラスミドpWRG1630はヒトEGF発現プラスミドであり、その中で成熟hEGFをコードする配列がhCMV主要即時初期エンハンサー−プロモーターにより制御されている。pWRG1630中には２個のSac I部位があり、これらのSac I部位の１つはhCMV主要即時初期プロモーターのTATAエレメントの３塩基下流に存在する。pCMVtetOEGFを構築するために、オリゴヌクレオチド：
およびその相補的配列をアニールさせ、すでに記載されているように（Yao,et al.,J.Virol.68:8158−8168（1994））15％ポリアクリルアミドゲル電気永動により精製した。テトラサイクリン（tet）オペレーター配列を太字で示し（Heuer,et al.,L.Mol.Biol.202:407−415（1988））、クローニング分析に用いるSal I制限酵素部位に下線を付してある。ついで、Sac IでpWRG1630を部分消化することにより、精製２本鎖tetオペレーター含有フラグメントを、プラスミドpWRG1630中のhCMV即時初期プロモーターのSac I部位に挿入した。pWRG1630へのtetO配列の挿入により、ユニークなSal I部位ができ、hCMV即時初期プロモーターへのtetOの挿入により、701塩基対のEco R I−Bam H I hCMVプロモーター含有フラグメントができた。図１は、研究に用いたプラスミドpCMVtetOEGF中のtetO含有hCMV即時初期プロモーターをスキーム的に示す。
pCMVGL2およびpCMVtetOGL2はpGL2基本ベクター（Promega,Madison,W I）から導入されたプラスミドであり、その中においてホタルルシフェラーゼをコードするcDNAが野生型hCMVプロモーターまたはtetO担持hCMVプロモーターの制御下に置かれている。これら２つのプラスミドを得るために、pWGR1630由来のEco R I−Bam H I hCMVプロモーター含有フラグメントまたはpCMVtetOEGF由来のhCMV−tetOプロモーター含有フラグメントをpGL基本ベクターのSma IおよびBg1 I部位に挿入した。
先ずpSG5tetRのBg1 I−Sal I−tetR含有フラグメントをpGEM3ZのXba IおよびSal I部位に挿入してpGEM3Z−tetRを得ることにより、テトラサイクリンリプレッサー発現プラスミドpcDNA3−tetRを構築した。ついで、pGEM3Z−tetRのSal IおよびKpn I−tetRフラグメントをpcDNA3ベクターのEcoRV−Kpn I部位に挿入した。
細胞培養およびトランスフェクション
10％ウシ胎児血清を補足したDulbeccoの修飾Eagle培地（DMEM）中でアフリカミドリザル（African green monkey）腎臓（Vero）細胞を増殖させ、維持した。60mmのディッシュ１枚あたり２ないし3x105個の細胞をまいた。細胞をまいてから20ないし24時間後に、２μｇのpUC19ベクターDNAまたは２μｇのpcDNA3−tetRの存在下において、リポフェクチンにより媒介されるトランスフェクションにより、0.5μｇのpWRG1630または0.5μｇのpCMVtetOEGFのいずれかで細胞をトランスフェクションした。血清および抗生物質不含DMEM中で16〜20時間トランスフェクションを行った後、トランスフェクション培地を除去し、5mlの通常の増殖培地（テトラサイクリン含有または不含）を添加した。製造者（GIBCO BRL.Life Technologies）の手順に従って、2.5μｇのプラスミドDNAにつき10μｌのリポフェクチンとして、リポフェクチン−DNA複合体の調製を行った。
ルシフェラーゼアッセイには、２μｇのpUC19ベクターまたは２μｇのpcDNA3−tetRの存在下で0.5μｇのpCMVtetOGL2用いること以外は上と同様の方法で、Vero細胞をまいて、トランスフェクションした。トランスフェクションから20時間後、リポフェクチン−プラスミドDNA含有培地を除去し、１μg/mlのテトラサイクリン含有通常増殖培地を細胞に供給した。トランスフェクションから70〜72時間後に細胞を集め、製造者（Promega）により記載されたプロトコールに従って細胞抽出物を調製した。
微粒子により媒介される遺伝子導入
インビボ遺伝子導入に使用したブタは家畜用のメスのヨークシャー種で、生後３〜４カ月、体重40〜45kgのもであった。酸素／亜酸化窒素の3:5混合物中ハロタン（１〜1.5％）麻酔を用いて中間層創傷（15X15X1.2mm）をブタの背中の皮膚に作成した。
Accell（Agracetus/Geniva,Inc.）微粒子媒介遺伝子導入のための被覆DNA−金ビーズを用いるカートリッジの作成ならびにAccellヘリウム遺伝子銃の使用は、Geniva,Inc.（8520 University Green,Middleton,W I 53562）により提供されたプロトコールに従うものであった。0.2μｇのhEGF発現プラスミドおよび0.8μｇのpcDNA3または0.2μｇのhEGF発現プラスミドおよび0.8μｇのpcDNA3−tetRを各中間層創傷に与えた。使用ドライブ圧は800ポンド／インチ（psi）であった。DNA導入後、トランスフェクションされた創傷を、密封ビニールチャンバー（100ユニット/mlのペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシンを含有する等張セイライン1.2ml入り）で封じた。遺伝子導入22時間後、チャンバーから創傷の液体を抜き取り、トランスフェクション部位を新たなチャンバーで封じた。遺伝子導入から46時間後に創傷の液体を収集し、新たなチャンバーを適用した後、500mgのテトラサイクリンをブタに静脈注射した。テトラサイクリン投与24時間後、創傷の液体を集め、−70℃で保存した。創傷の液体中のEGFレベルを、抗HEGF特異的抗体を用いるELISAにより調べた。
ELISA
細胞外培地および創傷の液体におけるhEGFの発現を、抗hEGF特異的モノクローナル抗体（MAB236,R＆G systems）（ウェル１個あたり75ng）を１次コーティング抗体とし、抗hEGF特異的ポリクローナル抗体（sc275,Santa Cruz）（ウェル１個あたり100ng）を２次抗体として使用して、マイクロタイタープレート（96ウェル）で調べた。HRP−抱合ヤギ抗ウサギポリクローナル抗体（sc−2004,Santa Cruz）（ウェル１個あたり3.33ng）を３次抗体として使用した。TMBperoxidaseEIAsubstratekit（BIO−RAD）を用いてペルオキシダーゼアッセイを行い、Bmax Kinetic Microplate Reader（Molecular Devices Corporration,Sunnyvale,CA）で分析した。試料中のhEGF濃度をウェル１個あたり200μｌの体積中、倍々希釈して2pgから200pg/mlの濃度範囲として組み換えhEGF（234−EG,R＆G systems）を用いてSOFTmax 4−パラメーター標準曲線に適合させた。
B.結果
テトラサイクリンリプレッサーによるhCMV主要即時初期エンハンサー−プロモーターのインビトロでの調節
hCMV主要即時初期エンハンサー−プロモーターは哺乳動物細胞における導入遺伝子の発現を指令するための最も強力なcis−調節ユニットの１つである。TATAエレメントのほかに、種々の上流シス−作用性エレメントが同定されており（図１）、細胞またはウイルスのトランスアクチベーターと相互作用することにより、これらのエレメントはTATAエレメントにより指令される高効率転写を確実なものとする。転写開始には、協同的にTATAエレメントと相互作用して転写開始前複合体を形成する基礎転写因子が必要である。TATA結合蛋白（TBP）は、DNAと特異的に相互作用する最初かつ唯一の転写因子であり、TATAエレメントへのTBPの結合はプロモーター転写のシグナルを発する。今回の実験は、テトラサイクリンリプレッサーが、プラスミドpWRG1630中のhCMV TATAエレメントの約10塩基対下流にある２個のtetオペレーターと相互作用することにより、hCMV主要即時初期エンハンサー−プロモーターを調節スイッチに変化させるかどうかを試験するために設計された。tetリプレッサーとTATA結合蛋白とがDNAヘリックスの同じ側に結合するようにtetオペレーター配列を配置した。それらが非常に近い位置にあるので、tetオペレーターへのtetリプレッサーの結合は、TATAエレメントへのTBPの結合をブロックするか、あるいは開始前複合体のアッセンブリーを直接妨害すると仮定された。
1mlにつき１μｇのテトラサイクリン不含または含有培地中、１μｇ、２μｇ、および３μｇのtetリプレッサー発現プラスミドpcDNA3−tetRの不存在下または存在下において0.5μｇのpWRG1630またはpCMVtetOEGFでVero細胞をトランスフェクションした。24時間ごとにトランスフェクション細胞から細胞外培地を集め、ついで、１μｇのテトラサイクリン含有または不含の新鮮増殖培地を添加した。集めた細胞外培地中のhEGF濃度をELISAにより調べた。
図２に示す結果は、pWRG1630からのヒトEGFの発現はpcDNA3−tetRの存在によっては影響されず、hCMV主要即時初期エンハンサー−プロモーター近傍へのtet−オペレーター含有配列の挿入はtetR不存在下でのヒトEGF発現に影響しないことを示す。pCMVtetOEGFからのEGFの発現は、tetR存在下において、量および時間に依存して有意に減少した。３μｇのtetRリプレッサー発現プラスミド、すなわちpcDNA3−tetRの存在下、テトラサイクリン不存在下において、pCMVtetOEGFからのEGFはトランスフェクションから20時間後には約200倍抑制され、トランスフェクションから20〜24時間後には1000倍抑制され、トランスフェクションから44〜68時間後には3500倍抑制された。テトラサイクリン存在下においては抑制はほとんど観察されないかまたは観察されなかった。２μｇのpcDNA3−tetRの存在下において、トランスフェクションから０〜20時間後、20〜44時間後、および44〜48時間後において、約100倍、600倍、および2000倍の発現阻害が検出された。１μｇのpcDNA3−tetR存在下において、上記３時点において約60倍、100倍、および200倍のヒトEGF合成低下が観察された。疑似トランスフェクションされたVero細胞においてはヒトEGFは発現されなかった。
tetRにより媒介される抑制がテトラサイクリンにより効果的に逆転しうるかどうかを試験するために、０〜20時間目はテトラサイクリン不存在下で（図3A）、20〜44時間目はテトラサイクリン存在下または不存在下で（図3B）、pCMVtetOEGFのみ、またはpCMVtetOEGFおよびpcDNA3−tetRのいずれかでVero細胞をトランスフェクションした。結果は、トランスフェクションから０〜20時間後に観察された抑制は、１μg/mlのテトラサイクリンにより効果的に逆転させることができるが、試験条件下においては0.1μg/mlのテトラサイクリンではtetRにより媒介される抑制を逆転させるには不十分であることを示す。図２に示す実験と矛盾せずに、データは、２μｇのpcDNA3−tetR存在下において、pCMVtetOEGFの基底プロモーター活性が、トランスフェクションから０〜20時間において100〜200倍低下し、トランスフェクションから20〜44時間において約500倍低下したことを示す。
分泌性ペプチドであるヒトEGFに関してhCMV主要即時初期エンハンサー−プロモーターのtetRにより媒介される調節についての反応動力学が示されたので、非分泌性蛋白であるホタルルシフェラーゼの発現を調節するこの系の能力を試験した。図４は、Vero細胞が１μg/mlのテトラサイクリン存在下または不存在下において、0.5μｇのpCMVtetOGL2のみでトランスフェクションされた、あるいは0.5μｇのpCMVtetOGL2および２μｇのpcDNA3−tetRで同時トランスフェクションされた２つの独立した実験の結果を示す。tetR発現プラスミドpcDNA3−tetRの存在下においてpCMVtetOGL2からのルシフェラーゼ発現レベルは少なくとも100倍低下し、この抑制はテトラサイクリンにより効果的に解放されうることが見いだされた。野生型hCMV即時初期エンハンサー−プロモーターからのルシフェラーゼ発現レベルはpcDNA3−tetRの存在によっては影響されない。HeLa細胞について同様の実験を行った場合、トランスフェクション後68〜72時間目に40〜50倍の抑制が検出された。このことは、tetR−VP16による活性化系と同様に、tetRによる抑制の効率が細胞タイプに依存することを示す。
テトラサイクリンリプレッサーによるhCMV主要即時初期エンハンサー−プロモーターのインビボでの調節
上記データは、（１）tetリプレッサーは、培養哺乳動物細胞において強力な配列特異的トランスリプレッサーとして作用する能力があること；および（２）TATAエレメントの約10塩基対下流への２つのタンデムなオペレーターの挿入により、プロモーターが効果的なテトラサイクリン依存性転写スイッチに変化させられることを示す。このtetRオペレーター調節ユニットがインビボにおいて機能するかどうかを試験するために、中間層創傷をブタの背中の皮膚に作成し、９カ所の創傷に0.2μｇのpCMVtetOEGFおよび0.8μｇのpcDNA3ベクターDNAを与え（創傷１個あたり）、さらに９カ所の創傷に0.2μｇのpCMVtetOEGFおよび0.8μｇのpcDNA3−tetRを与えた（創傷１個あたり）。図５に示すように、pcDNA3−tetRとともに同時トランスフェクションされた中間層創傷におけるヒトEGF発現は、テトラサイクリン不存在下においてpcDNA3ベクターとともに同時トランスフェクションされた中間層創傷における発現よりも有意に低かった。遺伝子導入１日後に13倍の抑制が検出された。
明らかに、遺伝子導入から１日目から２日目にかけてpCMVtetOEGFでトランスフェクションされた創傷におけるヒトEGF発現は約３倍上昇したが、pcDNA3−tetRとともに同時トランスフェクションされた中間層創傷におけるヒトEGF収量は1.5倍低下した。要約すると、tetR存在下において、ヒトEGF発現レベルは、テトラサイクリン不存在下における遺伝子導入から２日目に約55倍抑制された。遺伝子導入後２ないし３日目にテトラサイクリンを静脈注射により投与すると、tetRにより媒介される抑制が解放されることは重要であり、そのことは、pCMVtetOEGFおよびpcDNA3−tetRの両方を与えられた創傷におけるヒトEGF発現が４倍増加したことにより明らかである。pcMVtetOEGFのみによりトランスフェクションされた創傷においては、遺伝子導入から２ないし３日後に４倍のEGF発現抑制がみられた。この観察結果は、遺伝子治療における導入遺伝子の発現制御におけるこの調節スイッチの利用可能性を証明するものである。
C.議論
標的細胞における導入遺伝子発現の調節は遺伝子治療の最も重要かつ困難な様相である。hCMV主要即時初期エンハンサー−プロモーターを哺乳動物細胞プロモーターのプロトタイプとして使用した場合、TATAエレメントから10塩基対のところにテトラサイクリンオペレーターを配置することにより、テトラサイクリンリプレッサーが哺乳動物細胞における遺伝子発現の強力なリプレッサーとして機能しうることが示された。
最近になって、ヒトKOX1ジンクフィンガー蛋白のKRABリプレッサードメインをtetリプレッサーと融合させ、転写開始部位から685塩基対上流に７個のtetオペレーターをコードするDNA配列を挿入することにより、tetR単独でなくtet−KRABキメラ蛋白がhCMV主要即時初期エンハンサー−プロモーターを10〜15倍抑制しうることが、HeLa細胞においてルシフェラーゼをリポーターとして用いる一時的発現アッセイにおいて示された（Deuschle,et al.,Mol.Cell.Biol.15:1907−1914（1995））。tetオペレーターがTATAエレメントの10塩基対（ヘリックスターン全体に相当）下流に配置される、別の方法を用いて、hCMV主要即時初期エンハンサー−プロモーターがtetRのみにより厳密に調節されうることが示された。HeuerおよびHillenの研究（J.Mol.Biol.202:407−415（1988））に基づいて、この特別な設計は、tetリプレッサーをDNAヘリックスのTBP結合側と同じ側に配置するものであり、tetオペレーターへのtetRの結合は直接TBPを立体的にブロックすると仮定された。hEGFを分泌可能プロモーターとして用いて、tetRにより媒介される抑制が利用された。トランスフェクションから３日後に4000倍近い抑制が観察された。ブタ創傷モデルを微粒子による遺伝子導入と結び付けて考えると、この研究は、遺伝子治療のための導入遺伝子発現の微調整において、このtetRにより媒介される調節スイッチがインビボにおいて直接確認されたことになる。
他のtetリプレッサー／オペレーター調節系、例えば、tetR−VP16に基づく活性化およびtetR−KRABリプレッサー系とは異なり、本明細書開示の調節スイッチは、効果を発揮するためにテトラサイクリンリプレッサー／哺乳動物細胞トランスアクチベーターまたはリプレッサー融合蛋白の使用を必要としない。よって、細胞性転写因子により引き起こされる細胞遺伝子発現に対する潜在的な多面的効果は最小であり、高レベルのレギュレーター（すなわち、テトラサイクリンリプレッサー）の発現が起こりうる。明らかに、tetRにより媒介される調節スイッチの有効性は、インビボと比較するとインビトロにおいて有意に変化することがわかった。この明らかな相違は、おそらく、１）遺伝子導入手段の相違により同時トランスフェクション効率が異なる可能性があること；および２）細胞タイプの相違、によって説明できよう。
実施例2:ウイルス複製スイッチ
上記のtetRにより調節される転写スイッチが新規ウイルス複製スイッチに変換されて、可逆的な様式でドゥノボウイルス生成を調節し、トランス破壊的組み換えウイルスを生成しうるかどうかを試験するために、Ｉ型単純ヘルペスウイルスをプロトタイプとして使用して以下の実験を行った。
A.トランスドミナントネガティブHSV−1 UL9変異ポリペプチドを発現するプラスミドの構築
UL9蛋白は、ウイルス複製に直接関与している７種のHSV−１必須遺伝子産物の１つである。UL9はHSV−１のDNA複製開始点に特異的に結合する。それは長さ851アミノ酸の核ホスホ蛋白である。研究により、UL9のＣ末端アミノ酸535〜851が蛋白DNA結合ドメインを有しており、過剰発現された場合には、ドミナントネガティブ様式でウイルスDNA複製をブロックしうることが示されている。
JL9のＣ末端の317個のアミノ酸をクローンし、それをtetオペレーター含有hCMV主要即時初期エンハンサー−プロモーターの制御下に置くために、プラスミドpCMVtetOEGF中のBamH I−Not I EGF含有フラグメントをプラスミドpSP6UL9由来のBamH I−EcoR V UL9含有フラグメントに置き換えた。得られたプラスミドをpCMVtetOUL9−C571と命名し、それはUL9のＣ末端アミノ酸571〜851を発現する。
プラスミドpCMVtetOUL9−n10/C535（UL9のアミノ酸１から10までおよびUL9のアミノ酸535から851までを含むUL9蛋白フラグメントを発現するプラスミド）を構築するために、アミノ酸Thr−Met−Glyが後に続くUL9蛋白の最初の10個のアミノ酸をコードする２本鎖オリゴをpCMVtetOUL9−C571のBamH I部位に挿入した。UL9のＣ末端アミノ酸535から851までを発現するプラスミドpCMVtetOUL9−C535Cを、BabH I−Kpn Iで消化したpCMVtetOUL9−n10/C535の再連結により構築した。
B.HSV−１複製の一時的阻害分析
pCMVtetOUL9−C571およびpCMVtetOUL9−n10/C535によりコードされる変異UL9ポリペプチドが、HSV−１複製を阻害するトランスドミナントネガティブ変異ポリペプチドとして機能しうるかどうかを試験するために、最も重要には、阻害効果がtetリプレッサーにより調節されうるかどうかを試験するために、Vero細胞を60mmディッシュ１枚あたり5x105個まいた。まいてから20〜24時間後に、1.5μｇのpcDNA3ベクターDNAまたはtetリプレッサー発現プラスミドpcDNA−tetRの存在下において、リポフェクチン法により、0.1μｇの精製感染性HSV−1DNAのみで、または0.1μｇのpCMVtetOUL9−C571またはpCMVtetOUL9−n10/C535とともに同時トランスフェクションした。トランスフェクションから14時間後にリポフェクチン−DNA含有トランスフェクション培地を除去し、ついで、ディッシュ１枚あたり10mlのメチルセルロースをトランスフェクション細胞に添加した。トランスフェクションから68〜72時間後に、トランスフェクションしたディシュをニュートラルレッドで染色することによりウイルスプラークを可視化し、14時間後に計数した。図１に示すように、感染性HSV−1 DNAとpCMVtetOUL9−C571との同時トランスフェクションにより、ウイルスプラーク形成効率は約30倍低下する。pCMVtetOUL9−n10/C535Cと同時トランスフェクションを行った場合、感染性HSV−1 DNAのプラーク形成効率は少なくとも100倍低下した。重要なことに、C571およびn10/C535Cの両方により媒介されるHSV−1 DNA複製の抑制は、tetリプレッサーにより効果的に沈静化しうる。pCMVtetOUL9−C535Cを用いて同様の実験を行ったところ、HSV−1 DNAのプラーク形成効率は少なくとも200倍低下し、さらに、このC535Cにより媒介される抑制はtetRにより効果的に逆転されうる。
トランス−ドミナントネガティブＣ末端UL9ポリペプチドのHSV−１複製に対する阻害効果はtetリプレッサーにより効果的に沈静化されうることが示されたので、このtetRに関連したウイルス複製スイッチの特異性をさらに調べた。Vero細胞を、１）0.2μｇの感染性HSV−1 DNAおよび2.1μｇのpcDNA3;2）0.2μｇの感染性HSV−1 DNA、0.1μｇのpCMVtetOUL9−571および２μｇの感染性pcDNA3;ならびに３）0.2μｇの感染性HSV−1 DNA、0.1μｇのpCMVtetOUL9−C571および２μｇのpcDNA3−tetRでトランスフェクションした。1mlあたり１μｇのテトラサイクリンの不存在下または存在下のいずれかでトランスフェクションを行った。トランスフェクションから16時間後、トランスフェクション培地を除去し、1mlあたり５μｇのテトラサイクリン不含または含有新鮮培地5mlを各ディッシュに添加した。トランスフェクションから48時間後、細胞を集め、ウイルス収量を測定した。図２に示すデータは、
１）C571により媒介されるHSV−１複製の発現はtetリプレッサーにより逆転されうること；および２）HSV−１プラーク形成ユニットに対するpCMVtetOUL9−571の効果がテトラサイクリン存在下において有意に減少したことにより明らかなように、このtetRにより調節されるHSV−１複製の逆転はテトラサイクリン特異的であること、を示す。
要するに、これらの観察結果は、トランスドミナントネガティブ変異ウイルスポリペプチドをtetRにより調節される強力な哺乳動物転写スイッチと組み合わせることにより、新規ウイルス複製スイッチが形成されうることを示すものである。理論上は、ウイルスの複製的感染を阻害しうるポリペプチドまたはアンチセンスRNAを、この新規ウイルス複製スイッチに導入することができる。このスイッチを用いると、トランス−阻害性ウイルスベクターは、インビボでの遺伝子導入用ビヒクルとして役立ちうるだけでなく、内在性および／または潜伏性のウイルス複製をも阻害しうる。また本発明を用いて、有効な宿主免疫応答を誘導しうるだけでなく、同じ細胞内で内在性ウイルス感染の除去を促進する治療薬としても機能しうるウイルスワクチンを得ることもできる。
本明細書で引用したすべての文献を、参照により本明細書に記載されているものとみなす。これまで十分に本発明を説明してきたが、本発明を実施でき、本発明またはその具体例の精神または範囲に影響しないかぎり、広範かつ均等な範囲の条件、パラメーター等を用いることができることを当業者は理解するであろう。
配列表
（１）一般的情報：
（ｉ）出願人:Brigham and Women's Hospital
（ii）発明の名称：テトラサイクリンリプレッサーにより調節される哺乳動物細胞転写スイッチおよびウイルス複製スイッチ
（iii）配列の数:1
（iv）連絡先：
（Ａ）Vinson ＆ Elkins L.L.P.
（Ｂ）通り名:1455 Pennsylvania Avenue,N.W.
（Ｃ）都市名:Washington
（Ｄ）州名:D.C.
（Ｅ）国名:U.S.
（Ｆ）ZIP:20004−1008
（ｖ）コンピューターリーダブルフォーム：
（Ａ）媒体タイプ：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター:IBM PCコンパンチブル
（Ｃ）オペレイティングシステム:PC−DOS/MS−DOS
（Ｄ）ソフトウェア:PatentIn Release ＃1.0,Version ＃1.30
（vi）現出願データ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（viii）代理人等の情報：
（Ａ）氏名:Sanzo,Michael A.
（Ｂ）登録番号:36912
（Ｃ）処理番号:BRI331/87001
（ix）テレコミュニケーションの情報：
（Ａ）電話番号：（202）639−6585
（Ｂ）ファックス番号：（202）639−6604
（２）配列番号:1に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:54塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:2本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（iii）ハイポセティカル：なし
（iv）アンチセンス：なし
（xi）配列の記載：配列番号:1:
本発明は、哺乳動物における転写を制御するためのテトラサイクリン耐性（tet）オペレーターおよびリプレッサーに依存した組成物および方法に関する。本発明は、かかる方法に使用する蛋白および宿主細胞の組み換え製造法を包含する。さらに、本発明は、tetオペレーター／リプレッサー系により複製が制御されるように組み換え法により処理されたウイルスにも指向される。これらのウイルスは、インビトロおよびインビボ両方における遺伝子導入のためのベクターとして、免疫のための作用剤として、ならびに細胞への核酸治療薬のデリバリー手段として役立ちうる。
発明の背景
導入遺伝子発現を特異的に調節する能力が多年にわたり分子生物学の主要関心事となっている。哺乳動物細胞の場合、重金属イオン（Brinster,et al.,Nature 296:39−42（1982））、熱ショック（Nover,in Heat Shock Response,pp.167−220,CRC,Fla.（1991））、およびホルモン（Klock,et al.,Nature 329:734−736（1987））のごとき要因に応答する誘導可能プロモーターを使用することにより、組み換え遺伝子のインビトロでの調節が最も頻繁に行われている。不幸なことに、一般的には、これらのプロモーターは、インデューサー存在下においてさえ比較的低レベルの発現を提供するにすぎず、インビトロで使用される大部分のインデューサーはインビボにおいて許容されない効果を有している。
誘導可能プロモーターの代替として、十分に特徴づけられた原核調節エレメントを用いて哺乳動物遺伝子発現の制御が試みられている。たいていの場合、調節系は、真核転写モジュレーターを宿主細胞ゲノム中の特定部位に指向するための手段（例えば、Labow,et al.,Mol.Cell.Biol.10:3343−3356（1990）参照）、あるいは原核リプレッサーを用いて遺伝子発現を直接阻害する試みにおける手段（例えば、Brown,et al.,Cell 49:603−612（1987）参照）としての原核オペレーターとリプレッサー蛋白との間の強力な相互作用に依存している。
テトラサイクリン（tet）オペロンに結合した原核エレメントの場合、哺乳動物細胞において転写を転調させることが知られているポリペプチドにtetリプレッサー蛋白が融合している系が開発されてきた。ついで、tetオペレーター配列を配置することにより融合蛋白が特定部位に指向される。例えば、tetリプレッサーがトランスアクチベーター（VP16）に融合され、選択遺伝子のプロモーターの上流に配置されたtetオペレーターに対して指向されている（Gussen,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547−5551（1992）;Kim,et al.,J.Virol.69:2565−2573（1995）;Hennighausen,et al.,J.Cell.Biochem.59:463−472（1995））。融合蛋白のtetリプレッサー部分はオペレーターに結合し、そのことにより、VP16アクチベータ−を転写誘導が望まれる特定部位に対して指向させる。別のアプローチはtetリプレッサーをKRABリプレッサードメインに融合させ、遺伝子の数百塩基対上流にあるオペレーターに対してこの蛋白を標的化することであった。この系を用いて、キメラ蛋白（tetリプレッサー単独ではない）がCMVにより調節された遺伝子発現を10〜15倍抑制しうることが見いだされた（Deuschule,et al.,Mol.Cell.Biol.15:1907−1914（1995））。これらのタイプの系に関する主な問題は、哺乳動物トランスアクチベーターまたはリプレッサーに対応する融合蛋白の部分は細胞の転写因子と相互作用し、多面発現的効果を引き起こす傾向があるということである。
理想的には、哺乳動物遺伝子発現調節系は選択遺伝子に対して非常に特異的であり、インビトロおよびインビボ両方における使用に適した因子による誘導に応じるものでなくてはならない。本発明はかかる系を開示し、それをいかにして使用して導入遺伝子の発現を調節するのかを説明する。さらに、本発明は、この系をいかにして適用してウイルスを処理し、ベクター、治療薬およびワクチンとして役立てるのかを説明する。
発明の概要
本発明は、tetオペレーター／リプレッサー系により調節される遺伝子発現を有するという共通した特徴を有する、多くの異なる組成物および方法に指向される。
A.組み換え蛋白製造のための組成物および方法
本発明はその第１の態様において、TATAエレメントを伴う哺乳動物プロモーター配列、少なくとも１つのtetオペレーター配列、およびプロモーターに作動可能に連結されオペレーターの下流に存在する遺伝子配列を含む組み換えDNA分子に指向される。TATAエレメントに対するオペレーター配列（複数も可）の正確な位置は本発明にとり重要である。転写制御において有効であるためには、オペレーターはTATAエレメントの最後のヌクレオチドよりも少なくとも６ヌクレオチド下流から開始しなければならず、蛋白をコードする遺伝子が発現される場合には、オペレーターは翻訳開始コドンの手前に存在すべきである。一般的には、オペレーターはTATAエレメントの、多くとも約100ヌクレオチド下流から開始すべきであり、６ないし24ヌクレオチド下流から開始すべきである。このように配置される場合、リプレッサー蛋白の結合は転写活性の本質的に完全なシャットダウンを引き起こす。このことは、ヒトCMV即時初期プロモーターのごとき非常に強力で乱雑なプロモーターに関してさえも真実である。
最も典型的には、tetリプレッサー蛋白を構成的に発現する哺乳動物細胞中に上記組み換えDNA分子が取り込まれるであろうと考えられる。細胞において活性なプロモーター（例えば、CMVプロモーター、HSV−１プロモーターまたはSV40プロモーター）に作動可能に連結されたtetリプレッサー蛋白遺伝子を含むベクターを用いて、哺乳動物細胞系、例えば、U2OS細胞またはVero細胞を形質転換することにより適当な細胞を得てもよい。別法として、DNA分子は上記エレメントのほかに、第２のプロモーター、好ましくは構成的でtetリプレッサー遺伝子配列に作動可能に連結されたものを含んでいてもよい。本発明はDNA分子のみならず、そのDNAにより形質転換された宿主細胞およびその細胞により生成される組み換え蛋白も包含する。
本発明は蛋白の組み換え製造方法にも指向され、該方法において、哺乳動物宿主細胞は、TATAエレメントを有するプロモーター配列、TATAエレメントの3'側から少なくとも６ヌクレオチドのところに位置する少なくとも１つのtetオペレーター配列、およびオペレーターの3'側に存在していてプロモーターに作動可能に連結している遺伝子を含むベクターを用いて形質転換されている。オペレーターの3'側の遺伝子は、選択遺伝子の発現を阻害するアンチセンス核酸、治療上活性のある作用剤（例えば、腫瘍リプレッサーまたは細胞性蛋白のトランスドミナントネガティブ変異体ペプチド）、実験目的の蛋白または単離目的の蛋白をコードするものであってもよい。遺伝子が蛋白をコードしているすべての場合において、オペレーター配列は当該遺伝子の翻訳開始コドンの手前に存在するであろう。形質転換細胞はリプレッサー蛋白を構成的に発現すべきであり、組み換え遺伝子の発現はテトラサイクリンを導入することにより細胞において誘導されるものであってもよい。典型的には、tetオペレーター配列はTATAエレメント中の最終ヌクレオチドから６ないし100ヌクレオチド（好ましくは、６ないし24ヌクレオチド）のところに存在するであろう。好ましいプロモーターはヒトCMV即時初期プロモーターである。この系が遺伝子発現を厳密に調節すること、すなわち、インデューサーであるテトラサイクリンが利用可能になるまで発現が本質的にシャットオフされることが見いだされている。
本発明方法を用いて、培養哺乳動物細胞またはトランスジャニックもしくは非ランスジェニック動物において組み換え蛋白を製造することができる。トランスジェニック動物を製造に使用する場合、最も典型的には、トランスジェニック動物はマウスであろうし、上記ベクターで形質転換された細胞は胚性幹細胞であることが必要である。tetプロモーターおよび組み換え遺伝子で形質転換する前に、プロモーターに作動可能に連結されたテトラサイクリンリプレッサー遺伝子を用いて形質転換することによりテトラサイクリンリプレッサーを発現するように幹細胞を処理してもよい。別法として、リプレッサー遺伝子をtetオペレーターと同じ遺伝子中に含ませて、組み換え蛋白をコードしている遺伝子と同じプロモーターの制御下、または別のプロモーターの制御下に置くことができる。形質転換された幹細胞を胚盤胞中に取り込ませてキメラ胚を作成し、それを偽妊娠動物中に移植する。このようにして移植された胚は生きた子孫を発生させることができ、それをスクリーニングして組み換え遺伝子を発現するヘテロ接合動物を同定する。ついで、ヘテロ接合動物を交雑させて、テトラサイクリン投与に応答して組み換え蛋白を生成するホモ接合動物を得る。
本発明は、この方法により作成されるトランスジェニック動物、ならびにTATAエレメントを有する哺乳動物プロモーター配列、TATAエレメントの3'側から少なくとも６ヌクレオチドのところに存在する少なくとも１つのtetオペレーター配列、およびオペレーターの3'側に存在していてプロモーターに作動可能に連結されている遺伝子を含む組み換えDNAをそのゲノム中に組み込まれたトランスジェニック動物を包含する。遺伝子が蛋白をコードする場合、オペレーター配列は遺伝子の翻訳開始コドンの手前に存在するであろう。典型的には、tetオペレーター配列はTATAエレメント中の最終ヌクレオチドから６ないし100ヌクレオチド（好ましくは、６ないし24ヌクレオチド）のところに存在するであろう。好ましいプロモーターはヒトCMV即時初期プロモーターである。トランスジェニック動物のほかに、本発明は、これらの動物により生成される組み換え蛋白を包含する。
B.加工されたウイルスおよびそれらの使用
tetオペレーター／リプレッサー系の１の特に重要な用途は、複製を制御できるウイルスの製造におけるものである。これらのウイルスの必須の特徴は、それらのゲノム中に少なくとも３つの関連エレメントを含んでいることである。３つの関連エレメントとは、TATAエレメントを有する組み換えプロモーター、TATAエレメントの3'側から少なくとも６ヌクレオチドのところに存在する少なくとも１つのtetオペレーター配列、およびプロモーターに作動可能に連結された遺伝子（オペレーターの下流に存在していて、発現された場合にウイルス複製を阻害する）である。典型的には、tetオペレーター配列、TATAエレメント中の最終ヌクレオチドから６ないし100ヌクレオチド（好ましくは、６ないし24ヌクレオチド）のところに存在するであろう。オペレーターの下流に存在する遺伝子は、ウイルス複製を阻害する蛋白をコードすることにより、あるいはアンチセンス機構によりウイルス複製を阻害する転写生成物を生成することにより作用するものであってもよい。遺伝子が蛋白をコードする場合、tetオペレーター配列は翻訳開始コドンの上流に存在するであろう。tetリプレッサー蛋白を構成的に発現する培養細胞中において、加工されたウイルスを生成させ増殖させてもよい。これらの条件下において、ウイルス複製を阻害する遺伝子がシャットオフされて、大量のウイルスが得られるであろう。ついで、ウイルスを集め、精製し、インビトロまたはインビボにおいて哺乳動物細胞に導入してもよい。通常は、哺乳動物細胞はtetリプレッサー蛋白を生成しないので、オペレーター配列は占領されないであろう。結果として、tetオペレーターの3'側に存在する遺伝子が発現され、ウイルス複製が防止される。
上記方法において加工されたウイルスは広範な用途がある。第１に、ウイルスは、哺乳動物細胞へのDNA（例えば、遺伝子）のデリバリーのためのビヒクルとして使用することができる。これらの状況下において、典型的には、第２の組み換えプロモーターがウイルスゲノム中に含められて、発現が望まれる遺伝子に作動可能に連結される。この第２のプロモーターには、TATAエレメントから６ないし100ヌクレオチド（好ましくは、６ないし24ヌクレオチド）下流にある１またはそれ以上のtetオペレーターが続いていてもよく、続いていなくてもよい。DNAが宿主細胞にデリバリーされた後、tetリプレッサー蛋白不存在のため、新たなウイルスの生成が阻害される。第２のプロモーターに結合した遺伝子は、細胞中での選択遺伝子発現を阻害するアンチセンス核酸をコードしていてもよく、治療上活性のある蛋白（例えば、腫瘍リプレッサーまたは細胞系蛋白のトランスドミナントネガテイブ変異体ポリペプチド）、または単離もしくは実験を目的とした蛋白をコードするものであってもよい。本発明は、ウイルスで細胞をトランスフェクションすることにより宿主細胞を形質転換する方法、形質転換宿主細胞それ自体、ならびにその宿主細胞により得られる組み換え蛋白を包含する。
上記ウイルスを用いて対象を免疫してもよい。加工されたウイルスを含有するワクチンの大きな利点は、免疫による活性ウイルス感染の危険性が大幅に低下していることである。なぜなら、加工されたウイルスは、対象中に注入された後複製しないからである。ウイルス複製が起こらないことをさらに確実にするために、さらなる変異をウイルスに導入してもよい。例えば、欠失変異を１またはそれ以上の必須ウイルス遺伝子に導入してもよい。一般的には、このようなさらなる変異を含むウイルスが好ましい。
加工されたウイルスは、ウイルス感染に対する患者の直接的治療においても有用である。この方法の最初の工程は、第２のウイルス（すなわち、患者に感染したのとおそらく同じ株であるが別のウイルス）のゲノムに下記DNAを組み込むことにより第２のウイルスを形質転換することを包含する。そのDNAとは、TATAエレメントを有するプロモーター配列、TATAエレメントの3'側から少なくとも６ヌクレオチドのところ（典型的には、６ないし100ヌクレオチドのところ）に位置する少なくとも１つのtetオペレーター配列、およびオペレーターの3'側に存在していてプロモーターに作動可能に連結している遺伝子を含むものである。この遺伝子が発現された場合に、第２のウイルスおよび患者に感染したウイルスの両方の複製をブロックしうるように、この遺伝子を選択すべきである。遺伝子が蛋白をコードする場合、tetオペレーター配列は遺伝子の翻訳開始コドンの手前に存在するであろう。形質転換された第２のウイルスを、tetリプレッサー蛋白を発現する宿主細胞中で増殖させ、そのことにより大量のウイルス子孫を生成させる。ウイルスを集め、精製し、ついで、患者に投与する。好ましい具体例において、tetオペレーターはTATAボックスの最後のヌクレオチドから６ないし24ヌクレオチド下流にあり、使用プロモーターはヒトCMV即時初期プロモーターである。
最後に、本発明は、核酸治療剤を細胞にデリバリーする方法に関する。核酸治療剤は、再応性蛋白の発現を阻害するアンチセンスフラグメント、あるいは治療作用をううする蛋白をコードする遺伝子を含んでいてもよい。ウイルスを加工してそのゲノム中に下記のｉ）、ii）およびiii）を含むようにする。それらは、ｉ）TATAエレメントを有する組み換え哺乳動物プロモーター、ii）TATAエレメントの3'側から少なくとも６ヌクレオチドのところ、かつ翻訳開始コドンの5'側に存在する少なくとも１つのtetオペレーター、およびiii）オペレーターの3'側に存在し、プロモーターに作動可能に連結されている遺伝子である。この遺伝子が発現される場合、ウイルス複製が阻害される。典型的には、tetオペレーター配列はTATAエレメントの最後のヌクレオチドの3'側から６ないし100ヌクレオチド（好ましくは、６ないし24ヌクレオチド）のところに存在する。好ましいプロモーターはヒトCMVの即時初期プロモーターである。さらに、ウイルスはそのゲノム中に、第２のプロモーターに作動可能に連結された、治療剤をコードする核酸を含んでいなければならない。この第２のプロモーターには、TATAエレメントから６ないし100ヌクレオチド（好ましくは、６ないし24ヌクレオチド）下流にある１またはそれ以上のtetオペレーターが続いていてもよく、続いていなくてもよい。
治療剤デリバリー用ウイルスベクターの製造後の、本発明方法の次の工程は、tetリプレッサー蛋白を発現する宿主細胞中において大量のウイルスを増殖させることである。このようにして増殖したウイルスを集め、精製し、ついで、患者に投与する。通常は、患者はtetリプレッサーを合成する細胞を有していないので、ウイルス複製はブロックされるが、核酸治療剤の転写は進行するであろう。
【図面の簡単な説明】
図１。hCMV主要即時初期エンハンサー−プロモーターのダイヤグラムおよびtetR−応答性転写スイッチの作成方法。パネルＡは、tetオペレーターを有するhCMV主要即時初期エンハンサー−プロモーターの作成に使用する２つのタンデムなtetオペレーターを示す。パネルＢは、細胞性転写因子と相互作用することが知られている、周辺のTATAエレメントおよびシス作用性配列を示す。tetオペレーターの挿入に使用するSac I制限部位に下線を付した。
図２。TATAエレメントのすぐ下流へのオペレーター配列の挿入により、hCMV主要即時初期エングァンサー−プロモーターをtetR−感受性転写スイッチに変化させる。60mmのディシュ１枚あたり3x105個のVero細胞を撒き、撒種から24時間後に、（１μg/mlのテトラサイクリン存在下または不存在下のいずれかにおいて）0.5μｇのpWRG1630またはpCMVtetOEGF単独で、あるいは１μｇ、２μｇおよび３μｇのtetリプレッサー発現プラスミドpcDNA−tetRの存在下で細胞をトランスフェクションした。pUC19ベクタープラスミドを用いてpCDNA3−tetRとバランスさせ、3.5μｇのプラスミドDNAをトランスフェクションアッセイに使用した。20〜24時間ごとに細胞外培地を取り、新鮮増殖培地（１μg/mlのテトラサイクリン含有または不含）を添加した。０〜20時間（パネルＡ）、20〜44時間（パネルＢ）、および44〜68時間（パネルＣ）において集めた細胞外培地中のhEGFを、抗−hEGF特異的モノクローナルおよびポリクローナル抗体を用いてELISAにより測定した。
図３。テトラサイクリンによる、tetRにより媒介される抑制の解放。テトラサイクリン不存在下において、pCMVtetOEGF（0.5μｇ）、またはpCMVtetOEGF（0.5μｇ）およびpcDNA3−tetR（２μｇ）でVero細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションから20時間後、細胞外培地を集め、新鮮増殖培地をトランスフェクション細胞に添加して、0.1μg/mlまたは１μg/mlのテトラサイクリンの存在下または不存在下において、さらに24時間培養した。０〜20時間（パネルＡ）、20〜44時間（パネルＢ）、および44〜68時間（パネルＣ）において集めた細胞外培地におけるhEGF発現をELISAにより調べた。各同時トランスフェクションアッセイにつき２つの独立した実験が示される。
図４。ルシフェラーゼを受容体として用いる、tetRにより媒介される導入遺伝子の積算調節効率の測定。テトラサイクリン不存在下または存在下、０〜20時間において0.5μｇのpCMVtetOGL2のみ、または0.5μｇのpCMVtetOGL2および２μｇのpCDN3−tetRを用いて、さらに20〜70時間において１μg/mlのテトラサイクリンの不存在下または存在下、60mmのディッシュ中のVero細胞をトランスフェクションした。トランスフェクション70時間後に、室温において、0.2mMのPMSF、100μg/mlのTPCKおよび1mMのロイペプチンが存在する0.5mlの1xルシフェラーゼ溶解バッファー中でVero細胞を15分間溶解させた。４℃において微量遠心分離を20分行うことにより不溶性細胞残渣を除去し、ついで、ルシフェラーゼ活性を、10μｇの蛋白あたりのmV数として測定した。
図５。tetリプレッサーによるhCV主要即時初期エンハンサー−プロモーターのインビボ調節。全部で18個の中間層創傷（15x15x15x1.2mm）をブタの背の皮膚に作成した。微粒子を用いる遺伝子導入により、９個の創傷に0.2μｇのpCMVtetOEGFおよび0.8μｇのpcDNA3ベクターDNAを投与し、残りの創傷には0.2μｇのpCMVtetOEGFおよび0.8μｇのpcDNA3−tetRを投与した。微粒子爆撃後、100ユニット/mlのペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシンが存在する1.2mlの等張セイラインを入れた密封ビニール製付着性チャンバー中にトランスフェクションされた各創傷を封じた。遺伝子導入から22、46および70時間後に傷の液体をチャンバーから集め、−70℃で保存した。各時点で傷の液体を集めた後、新たなチャンバーを用意した。遺伝子導入から46時間後に、静脈注射により各ブタに500mgのテトラサイクリンを与えた。傷の液体中のhEGF発現をELISAにより調べた。各棒グラフの縦線は標準偏差を示す。
図６。トランスドミナントネガテイブ形態のUL9ペプチドによるHSV−１複製の阻害ならびにtetリプレッサーを用いた場合の復帰可能性。60mmのディシュ１枚あたり5x105個のVero細胞を撒いた。撒種から20ないし24時間後、精製された感染性HSV−1 DNA（単独またはpCMVtetOUL9−C571もしくはpCMVtetOUL9−n10/C535のいずれかとともに）を用いて細胞をトランスフェクションした。1.5μｇのpCDNA3ベクターDNAまたはtetリプレッサー発現プラスミドpCDNA3−tetRの存在下でトランスフェクションを行った。トランスフェクションから14時間後、培地を除去し、ついで、ディッシュ１枚あたり10mlのメチルセルロースをトランスフェクション細胞に添加した。トランスフェクションから68ないし72時間後に細胞をニュートラルレッドで染色することによりウイルスプラークを可視化し、14時間後にプレートを計数した。
図７。テトラサイクリンを用いた場合のHSV−１複製阻害の復帰可能性。DNAベクターの３つの異なるセットを用いてVero細胞をトランスフェクションした。３つのセットとは、１）0.2μｇの感染性HSV−1 DNAおよび2.1μｇのpCDNA3、２）0.2μｇの感染性HSV−1 DNA、0.1μｇのpCMVtetOUL9−C571および２μｇのpCDNA3、３）0.2μｇの感染性HSV−1 DNA、0.1μｇのpCMVtetOUL9−C571および２μｇのpCDNA3−tetRである。１μg/mlのテトラサイクリン存在下または不存在下のいずいれかにおいてトランスフェクションを行った。トランスフェクションから16時間後、培地を細胞から除去し、5mlの新鮮培地（濃度５μg/mlのテトラサイクリン含有または不含）を各ディッシュに添加した。トランスフェクションから48時間後、細胞を集め、ウイルス収量を測定した。この測定結果を図に示す。
定義
以下の説明には、組み換えDNA法についての多くの用語を用いる。明細書および請求の範囲について明確かつ一貫した理解を得るために、かかる用語の範囲を含め、以下に定義する。
ウイルスベクター：本明細書の「ウイルスベクター」および均等な用語は、選択DNAまたはRNA配列を宿主細胞中に導入するための使用されるウイルスをいう。インビボまたはインビトロにおいて細胞中にDNAを導入する目的でベクターを使用してもよい。後者の目的に通常使用されているウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルスおよびヘルペスウイルスが含まれる。
発現ベクター：この用語およびこれに相当する用語は、宿主細胞中への形質転換後、宿主中でクローン化されたDNAの発現を誘導しうるベクターをいう。通常には、クローン化DNAは、プロモーターまたはエンハンサーのごとき特定の調節配列の制御下に置かれる（すなわち、作動可能に連結される）。おそらく、プロモーター配列は構成的なものであり、誘導可能または抑制可能なものである。
実質的に純粋または精製された：本明細書の「実質的に純粋」または「精製された」は、所望生成物は本質的に細胞性成分を含まないことを意味する。成分としては蛋白、炭水化物および脂質があるが、これらに限らない。蛋白または核酸の純度を調べる１の方法は、ポリアクリルアミドまたはアガロースのごときマトリックス中での電気泳動によるものである。染色後の単一バンド出現により純粋であることが明らかとなる。
宿主：ベクターを受容する原核細胞または真核細胞はそのベクターの宿主である。この用語は、ゲノム中に遺伝子を組み込むように処理された原核細胞または真核細胞を包含する。宿主として役立ちうる細胞は、細胞の形質転換法と同様に、当該分野においてよく知られている（例えば、Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor（1989）参照）。
プロモーター：遺伝子の転写を開始させるDNA配列である。典型的には、プロモーターは遺伝子の5'末端に見いだされ、スタートコドンに近い位置にある。プロモーターが誘導可能なタイプである場合、転写速度は誘導剤に応答して増加する。
発現：発現は、ポリペプチドがDNAから作られるプロセスである。このプロセスは、遺伝子のmRNAへの転写およびこのmRNAのポリペプチドへの翻訳を含む。文脈に応じて、「発現」とはRNA、蛋白、あるいはそれら両方の生成をいうこともある。
組み換え：本明細書の用語「組み換え」は、核酸配列および配列エレメントを実験的に組み換えることにより得られる核酸についていう。組み換え宿主は組み換え核酸を受容する宿主であり、用語「組み換え蛋白」はかかる宿主により生成される蛋白をいう。
作動可能に連結：用語「作動可能に連結」は、正常な機能を果たすことが可能なように連結された遺伝学的エレメントについていう。例えば、転写がプロモーターの制御下にある場合、遺伝子はプロモーターに作動可能に連結されており、かかる転写により通常には当該遺伝子によりコードされる蛋白が生成される。
核酸治療剤：この用語は、直接的あるいは間接的に治療剤として役立つ核酸配列をいう。典型的には、かかる作用剤は２つのカテゴリーに分類される。第１のカテゴリーは、宿主細胞中の相補的配列にアニールする（そのことにより発現を阻害する）ように設計されたアンチセンス核酸を包含する。あるいは、この用語は、治療蛋白をコードする核酸をいうこともある。
遺伝子：本明細書の「遺伝子」は、プロモーター活性の結果としての転写を受ける核酸配列をいう。遺伝子は特定の蛋白をコードしていてもよく、あるいはそれ自体興味あるRNA配列をコードするものであってもよい。なぜなら、例えば、それはアンチセンス阻害剤として作用するからである。
哺乳動物プロモーター：用語「哺乳動物プロモーター」は哺乳動物細胞中で活性のあるプロモーターをいう。同様に、「原核プロモーター」は原核細胞中で活性のあるプロモーターをいう。
必須ウイルス遺伝子：用語「必須ウイルス遺伝子」は、ウイルス複製に必要な遺伝子と定義される。
必須細胞性遺伝子：この用語は細胞の生存に必要な遺伝子をいう。
発明の詳細な説明
本発明は、tetオペレーターおよびリプレッサー蛋白を用いて哺乳動物遺伝子発現を調節できるという考えに基づくものである。発現を制御しているプロモーターのTATAエレメントの最後のヌクレオチドよりも少なくとも６ヌクレオチド下流にオペレーターが存在する場合には、他の哺乳動物転写モジュレーターにリプレッサー蛋白を融合させる必要なく調節が行われうる。
重要ではないが、細菌におけるテトラサイクリン耐性（tet）オペロンの基本的機能についての知識は、本発明の実施方法を理解するための助けとなるかもしれない。tetオペロンにおいて、テトラサイクリン耐性遺伝子（tetA）およびtetリプレッサー蛋白をコードする遺伝子（tetR）は両方とも同じプロモーターおよびオペレーターエレメントの制御下にある。テトラサイクリン不存在下においては、tetリプレッサー蛋白はオペレーターDNA配列に結合し、そのことにより隣のプロモーターがRNAポリメラーゼと相互作用することを立体的に妨げる。かくして、tetAおよびtetRの両方の転写がブロックされる。細菌中のテトラサイクリンレベルが上昇した場合、テトラサイクリンはリプレッサー蛋白に結合し、リプレッサー蛋白をオペレーター配列から引き離す。結果として、ポリメラーゼはプロモーター配列に結合可能となり、tetAおよびtetR遺伝子は両方とも転写される。
tetリプレッサー蛋白とtetオペレーターとの間の強力な相互作用により、細胞ゲノム中の特定部位に対して真核調節蛋白を指向させる機構が提供される。上記のごとく、以前説明されていた系は、tetリプレッサーおよび哺乳動物転写アクチベータ−またはリプレッサーを含む融合蛋白の標的として役立つ哺乳動物遺伝子の上流にtetオペレーターが存在するものであった。融合蛋白のtetリプレッサー部分がオペレーター配列に結合し、そのことにより、それが発現されるべき遺伝子上流に配置されることとなる。ついで、融合蛋白の残りの部分は、細胞性転写因子と相互作用することにより遺伝子発現を転調させるものとして役立つ。
これらのタイプの系に関する主な問題は、オペレーターから離れた部位にある転写因子と哺乳動物転写モジュレーターとの相互作用により多面的効果が生じることである。tetリプレッサー蛋白のみ（すなわち、融合蛋白以外のものとして）を用いて遺伝子発現を転調させようとする従前の試みは成功していない（例えば、Kim,et al.,J.Virol.69:2565−2573（1995）;Deuschule,et al.,Mol.Cell.Biol.15:1907−1914（1995）参照）。全DNAヘリックスターンに相当する約10塩基対の１個またはそれ以上のtetオペレーターをtetオペレーターの下流に挿入することにより、tetRのみを用いて遺伝子発現をうまく転調させることができることを見いだした。このアプローチを用いて、最も強力かつ乱雑な真核エレメントの１つであるhCMV主要即時初期エンハンサー−プロモーターにより制御されている転写を厳密に調節することができた。これをインビトロおよびインビボの両方において行うことができる。
I.転写スイッチとしてのtetオペレーター
本発明は、第１の態様において、TATAエレメントを伴う哺乳動物プロモーター配列を含む組み換えDNA分子に指向される。テトラサイクリンオペレーター配列はTATAエレメントの3'側から少なくとも６ヌクレオチドのところに置かれ、プロモーターにより転写が制御されるDNA配列がその後に続く。プロモーター、オペレーターおよび他のDNAを合成または精製する方法は当該分野においてよく知られており、分子生物学における標準的方法を用いて、適当に配置されたエレメントを有するDNA分子を構築することができる（例えば、Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor（1989）参照）。好ましい方法の例は、tetオペレーターの完全配列とともに「実施例」のセクションに記載されている。
どのようなタイプのプロモーターであっても本発明に使用することができ、誘導可能、抑制的または構成的なものが含まれる。好ましい哺乳動物プロモーターは、マウスメタロチオネインＩ遺伝子（Hamer,et al.J.Mol.Appl.Gen.1:273−288（1982））のプロモーター；ヘルペスウイルスの即時初期およびTKプロモーター（Yao et al.,J.Virol.69:6249−6258（1995））;SV40初期プロモーター（Benoist,et al.Nature 290:304−310（1981））；ならびに、特に、ヒトCMV即時初期プロモーター（Boshart,et al.Cell 41;521−530（1985））を包含する。全長または最小プロモーターを使用してもよく、他の調節エレメント（例えば、図１参照）を含めてもよい。「実施例」セクションで説明するように、全長ヒトCMV主要即時初期エンハンサー−プロモーターが本発明にうまく使用され、特記しないかぎり、「ヒトCMV即時初期プロモーター」という場合には、当該プロモーター自体ならびに図１の示す他のいずれかまたはすべての転写調節エレメントと組み合わされた当該プロモーターをいうものとする。
TATAエレメントの少なくとも６ヌクレオチド下流から開始するtetオペレーター配列による転写を受けている配列からプロモーターを分離する。典型的には、オペレーターはTATAエレメントの６ないし100ヌクレオチド（好ましくは、６ないし24ヌクレオチド）下流の位置から開始するであろう。これらのエレメントの配置は、下流配列の転写または遺伝子産物の翻訳を指令するプロモーターの能力を実質的に妨害するものであってはならない。
典型的には、他の転写または翻訳エレメントを含有するベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）中に上記DNA分子が含まれるであろう。所望ならば、大量のベクターDNAを得ることができる（例えば、リプレッサー蛋白を生成する細菌中にベクターを導入する）。ついで、好ましくは、tetリプレッサーを発現するように処理された哺乳動物宿主細胞中にベクターを導入する。哺乳動物細胞をtetリプレッサーを発現するように処理する１の方法は、リプレッサー遺伝子配列を別のプロモーターに連結し、これをtetオペレーター含有ベクター中に取り入れ、ついで、そのDNAを細胞中に導入することである。別法として、tetオペレーター含有構築物を導入する前に、tetリプレッサー配列を含む発現ベクターを用いて細胞を形質転換してもよい。tetリプレッサーを発現する細胞を得るために使用したプラスミドの一例はpcDNA3−tetR（「実施例」セクション参照）である。
本発明に使用されうる発現ベクターを細胞に導入する方法は、リン酸カルシウム沈降法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソームによる導入、ウイルスによる導入、または微粒子による遺伝子の導入を包含する。インビボにおいて宿主細胞への導入を行う場合、導入のための好ましい方法はウイルスベクターによるものである。当該分野でよく知られたハイブリダイゼーション法を用いて、あるいはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いて特定の組み換え配列を増幅することにより、取り込んだ構築物を有する細胞を同定することができる。細胞中に導入した組み換えDNAが、例えば免疫学的または酵素によるアッセイによって検出されうる蛋白を生成する場合には、テトラサイクリンを細胞に導入し、ついで、細胞周囲の培地または細胞溶解物のいずれかをアッセイすることにより、組み換え蛋白の存在を確認することができる。
テトラサイクリン不存在下においては、構築物で形質転換された宿主細胞は実質的な量の組み換えDNAを発現するはずがない。宿主細胞中に取り込まれた組み換えDNA配列の発現は、テトラサイクリン自体またはテトラサイクリンアナログのいずれかを用いることにより誘導される。後者を、tetリプレッサーに特異的に結合する能力を維持しているという意味で、テトラサイクリンに関連した化合物であると定義する。かかるアナログの解離定数は少なくとも1x10-6Mでなくてはならず、好ましくは、1x10-9Mよりも大きい。使用可能なアナログの例は、Hlavka,et al.（″The Tetracyclines,″in Handbook of Experimental Pharmacology 78,Blackwood,et al.（eds.）,New York（1985））およびMitschef（″The Chemistry of Tatracycline Antibiotics,″Medicinal Res.9,New York（1978））により議論されたものを包含するが、これらに限らない。同様に、リプレッサーまたはオペレーターの配列における小規模な修飾は、かかる修飾がリプレッサー／オペレーター相互作用のアフィニティーまたは特異性を実質的に低下させない場合には、本発明に影響しないであろう。
II.インビトロおよびインビボにおける蛋白の組み換え製造方法
上記ベクターおよびDNA構築物を、インビトロまたはインビボにおける蛋白の組み換え製造方法の一部として使用することができる。インビトロにおいて蛋白を製造するには哺乳動物宿主細胞が好ましく、U20S細胞、Vero細胞、NIH−3T3細胞、CHO細胞、HeLa細胞、LM（tk−）細胞等がある。これらの種々の細胞タイプのそれぞれに適したベクターは当該分野においてよく知られている（例えば、Sambrookらの上記文献参照）。
DNA構築物を用い、トランスジェニックまたは非トランスジェニック動物を用いてインビボにおいて組み換え蛋白を製造することもできる。いずれのタイプのトランスジェニック動物における製造であっても本発明に適合するが、ほとんどの場合マウスが用いられると考えられる。典型的には、マウス胚性幹（ES）細胞をDNA構築物で形質転換し、ついで、発達中のマウス胚中に導入する。発達中の胚の生殖系の一部に組み込まれ、あるいはその一部となりうるES細胞系を用いることができ、例えば、ネズミ細胞系D3（ATCC,12301 Parklawn Drive,Rockville,Md.,カタログ番号CR 1934）がある。細胞を培養し、当該分野でよく知られた方法（例えば、Robertson,in Tetratocarcinomas and Embryonic Stem Cells;A Practical Approach,Robertson,ed.,I.R.L.Press Washington,D.C.（1987）;Bradley,et al.,Current Topics in Devel.Biol.20:357−371（1986）；およびHogan,et al.,Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.（1986））を用いるDNA挿入に備える。上記のごとくtetリプレッサー蛋白を発現するように幹細胞を処理することが必要であろうし、tetオペレーターを含む同じ構築物中にリプレッサー遺伝子を導入すること、あるいはリプレッサー遺伝子含有構築物で細胞を形質転換することのいずれかにより、かかる処理を行うことができる。
当該分野で知られたいずれの方法を用いてもDNAを細胞に取り込ませることができるが、最も典型的には、エレクトロポレーションを用いてこの導入が行われるであろう。DNA構築物がプラスミドタイプのベクターに挿入されている場合、トランスフェクション前にDNAを直鎖状にすることが好ましい。発現されるべきDNA配列の外側を切断するように選択された適当な制限エンドヌクレアーゼでDNAベクターを消化することにより直鎖化を行うことができる。種々の方法のいずれを用いてもトランスフェクションされた幹細胞のスクリーニングを行うことができる。例えば、細胞中に導入したDNA中に存在する配列に特異的な標識プローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行ってもよい。別法として、選択配列に対するPCR増幅を行うこともできる。
胚性幹細胞が形質転換され、選択された後の次の工程は、細胞を胚に取り込ませることである。これを行うための好ましい方法は、発達における胚盤胞段階の胚に幹細胞をマイクロインジェクションすることによる。マウスにおいて、妊娠動物の子宮を潅流することにより発達の約3.5日目の胚盤胞を得てもよい。これを行うための適当な方法は当該分野においてよく知られている（Bradley,in Tetratocarcinomas and Embryonic Stem Cells:A Pracrical Approach,（1987）参照）。好ましい胚盤胞は雄性であり、幹細胞遺伝子によりコードされるのとは異なる表現型マーカー（例えば、毛の色）の遺伝子を有するものである。このようにして、簡単に子孫をスクリーニングできる。
トランスジェニック動物を製造するプロセスの次の工程は、キメラ胚を偽妊娠動物の子宮中に移植することを包含する。典型的には、メスを同じ種の精管切除したオスと交配させることにより、かかる動物を得る。メスの偽妊娠段階は移植の成功にとり重要であり、種により異なるであろう。マウスについては、典型的には、偽妊娠２〜３日目のメスを用いるべきである。
キメラ胚を偽妊娠マウス中に移植した後、それらを最後まで発達させ、ついで、子孫をスクリーニングする。表現型選択法を用いる場合、モザイク状の毛の色または容易に明らかな他の表現型マーカーについて動物を簡単に検査することにより最初のスクリーニングを行ってもよい。さらに、あるいは別法として、子孫の組織、例えば、、マウスの尾の組織から染色体DNAを得て、サザンブロットおよび／またはPCR増幅を用いて組み換えDNAの存在につきスクリーニングしてもよい。ついで、ヘテロ接合のものを種間交配させることによりホモ接合トランスジェニックマウスを得て、ついで、これを用いて組み換えDNAを発現しうる動物を連続的に供給してもよい。組み換え体の合成が必要となるまで、動物をテトラサイクリン不存在下に維持することにより発現を制御することができる。これらの条件下において、tetリプレッサー蛋白がオペレーター配列に結合し、そのことにより組み換えプロモーターの活性が阻害されるであろう。テトラサイクリンまたはテトラサイクリンアナログを動物に投与すると、容易に細胞膜を通過し、その後、tetリプレッサー蛋白をオペレーター配列から解離させるであろう。かくして、組み換えプロモーターの下流の組み換え遺伝子が転写され始めるであろう。
このようにして作成された動物を、研究目的、例えば、種々の薬剤の効果を研究するために使用してもよく、あるいはまた、組み換え蛋白を製造する目的で使用してもよい。後者の場合、細胞で発現された組み換え遺伝子を、動物の血中に蛋白を分泌させるシグナル配列に連結することが好ましい。ついで、これを集めて、組み換え蛋白精製用の源として役立ててもよい。
III.組み換え的に処理されたウイルス
A.組み換えウイルス、ワクチンの製造および抗ウイルス治療
上記tetオペレーター／リプレッサー調節系を用いて、子孫の生成が厳密に調節されているウイルスを製造することもできる。プロモーター（好ましくは、ヒトCMV即時初期プロモーター）、TATAエレメントの3'側から少なくとも６ヌクレオチド下流のtetオペレーター配列およびオペレーターの3'側にありプロモーターに作動可能に連結された遺伝子を含む構築物をウイルスゲノムに導入することにより、これを行うことができる。この遺伝子は、発現され、ウイルス複製の必要な蛋白をコードするRNAに結合するアンチセンス配列の形態となることができる場合にウイルス複製を阻害するものである。あるいはまた、その遺伝子は、複製を阻害する蛋白をコードするものであってもよい。後者の場合、tetオペレーター配列は、遺伝子の翻訳開始コドンの前に置かれるであろう。ウイルス複製を阻害する蛋白の例は、HSV−１のUL9蛋白のトランスドミナントネガティブ形態であり、それはHSV−１複製開始点に結合し、過剰発現された場合、新たなウイルス形成をブロックする。類似蛋白が他のウイルスにも同様に存在することがわかっている。
tetリプレッサー蛋白を構成的に生成する細胞において上記ウイルスを得ることができる。これらの環境下において、リプレッサーはtetオペレーター配列に結合し、下流遺伝子の発現を阻害するであろう。よって、ウイルス阻害性DNA配列をウイルスゲノムに取り込ませることができ、大量のウイルスを得ることができる。例えば、リプレッサーはUL9蛋白の変異形態の合成をブロックする可能性があり、そのことによりHSV−１が生成される。所望ならば、テトラサイクリンまたはテトラサイクリンアナログを細胞に導入してもよい。テトラサイクリンはリプレッサー蛋白に結合し、そのことによりそれをオペレーター配列から解離させるであろう。ついで、組み換えプロモーターからの核酸の転写が進行し、ウイルス複製が阻害されるであろう。
上記の系をインビドロおよびインビボの両方において使用できることに注意すべきである。例えば、tetリプレッサー蛋白を生成する培養細胞に感染させることにより大量のウイルスを増殖させることができる。ついで、ウイルスを集め、精製し、対象に投与することができる。投与された場合、ウイルスはそのDNAを対象中の細胞にデリバリーするが、tetリプレッサー蛋白が存在しないので、ウイルスゲノム中の組み換えDNAの転写が進行し、ウイルス複製が阻害される。これらの特徴はそれ自体、処理されたウイルスを免疫方法およびウイルス性疾患の治療に特に使用されるようにする。
B.免疫方法における、処理されたウイルスの用途
実際には疾病を引き起こさずに免疫学的応答を刺激するように修飾された特定病原体に対象を曝露することにより大部分の免疫方法が行われている。例えば、死滅ウイルスまたは弱毒化ウイルスのいずれかを含有するワクチンを個体に与えてポリオに対して個体を免疫してもよい。tetオペレーター／リプレッサー系を用いて処理されたウイルスを、tetリプレッサーを生成する培養細胞中で大量に増殖させ、ついで、ワクチンの一部として患者に投与することができる。このようにして治療された患者は、ウイルス上に通常的に存在する蛋白に曝露されることになり、それゆえ、免疫学的応答を生じるであろう。しかしながら、通常、哺乳動物細胞はtetリプレッサーを生成しないので、ウイルスは複製できず、疾病に対する十分な曝露が妨げられるであろう。
ウイルスが生成されないことをさらに確認するために、さらなる変異を組み換えウイルスに導入することができる。例えば、欠失変異を必須ウイルス遺伝子中に導入してもよい。後者のウイルスを作成し、tetRおよび野生型の必須ウイルス遺伝子の両方を発現する細胞中で増殖させることができる。
単離された実質的にすべての感染性ウイルスに関して、免疫のためのこのアプローチを用いることができ、ヒトの免疫ならびに動物の免疫に適用することができる。
C.ウイルス性疾患の治療における、処理されたウイルスの用途
本発明のtetオペレーター／リプレッサー系を用いて処理されたウイルスを、ウイルス感染の治療に直接使用することができる。例えば、上記方法でHSV−１ウイルスを処理して、強力な哺乳動物プロモーター、tetオペレーター配列およびUL9のトランスドミナントネガティブ形態をコードする遺伝子を含有する構築物をそのゲノム中に含ませることができる。処理されたHSV−１を、tetリプレッサーを発現する細胞において大量に発現させることができ、ついで、HSV−１感染にかかっている患者に投与することができる。処理されたウイルスは患者の細胞に入り、トランスドミナントネガティブ変異UL9蛋白を発現するであろう。このことは、処理されたHSV−１のみならず元々患者に感染していたHSV−１の複製を阻害することに役立つ。要するに、処理されたウイルスは、インビボにおいて抗ウイルス剤をデリバリーするためのビヒクルとして役立つ。処理されたウイルスは感染ウイルスと同じ細胞特異性を有しているので、理想的に治療に適している。
処理されたウイルスがワクチンまたは治療薬として役立つ動物およびヒトのウイルスとしては、アルボウイルス、鳥類白血症ウイルス、CELOウイルス、Chagresウイルス、鼻炎ウイルス、コクサッキーウイルス、出血性ウイルス、ウマ脳脊髄炎ウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、感性性ブタ脳脊髄炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルス、乳頭腫ウイルス、パラインフルエンザウイルス、ポリオウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、デング熱ウイルス、センダイウイルス、および狂犬病ウイルスが挙げられるが、これらに限らない。
D.核酸治療薬デリバリー用ベクターとしての処理されたウイルス
少し修飾すれば、上記の処理されたウイルスを、いずれかのタイプの核酸治療薬を細胞にデリバリーするために使用することができる。これらの作用剤は、相補的配列に結合してそれらの蛋白としての発現を阻害するアンチセンス核酸の形態であってもよく、あるいは治療作用を有する蛋白をコードする遺伝子の形態であってもよい。
治療薬として使用される核酸は、治療を要する細胞において活性のあるプロモーターに作動可能に連結されなくてはならない。これは、ウイルス複製を制御する組み換え遺伝子を調節するのと同じプロモーターであってもよく、ウイルスゲノム中の別の異なるプロモーターであってもよい。患者の治療における基本的手順は、本質的には、ウイルス感染治療用に処理されたウイルスに関して上で説明したものと同じである。特別には、核酸治療薬を含むように処理されたウイルスは、tetリプレッサー蛋白を生成する細胞において増殖するであろう。このようにして作成されたウイルスを集め、精製し、ついで、治療を要する対象に投与する。ついで、処理されたウイルスは対象の細胞に感染し、内部に入ったならば、ウイルス複製を阻害する核酸および治療薬として役立つ核酸の両方を発現し始めるであろう。この系は遺伝子治療に理想的に適しているが、それをインビトロにおいて細胞に核酸をデリバリーする機構として、あるいはインビボにおいて細胞を処理する試みのための手段としても使用できる。例えば、欠損カウンターパートを置換するための、あるいは異常な遺伝子発現を防止するための相同組み換え用に設計されたDNA構築物を、このようにしてデリバリーしてもよい。
上記のように、さらなる変異を必須ウイルス遺伝子に導入して、ウイルスが複製しないことを確実ならしめてもよい。
実施例
実施例1:tetリプレッサーを用いる、ヒトCMV主要即時初期エンハンサー−プロモーターの調節スイッチへの変換
A.材料および方法
リポーターおよびtet発現プラスミド：プラスミドpWRG1630はヒトEGF発現プラスミドであり、その中で成熟hEGFをコードする配列がhCMV主要即時初期エンハンサー−プロモーターにより制御されている。pWRG1630中には２個のSac I部位があり、これらのSac I部位の１つはhCMV主要即時初期プロモーターのTATAエレメントの３塩基下流に存在する。pCMVtetOEGFを構築するために、オリゴヌクレオチド：
pCMVGL2およびpCMVtetOGL2はpGL2基本ベクター（Promega,Madison,W I）から導入されたプラスミドであり、その中においてホタルルシフェラーゼをコードするcDNAが野生型hCMVプロモーターまたはtetO担持hCMVプロモーターの制御下に置かれている。これら２つのプラスミドを得るために、pWGR1630由来のEco R I−Bam H I hCMVプロモーター含有フラグメントまたはpCMVtetOEGF由来のhCMV−tetOプロモーター含有フラグメントをpGL基本ベクターのSma IおよびBg1 I部位に挿入した。
先ずpSG5tetRのBg1 I−Sal I−tetR含有フラグメントをpGEM3ZのXba IおよびSal I部位に挿入してpGEM3Z−tetRを得ることにより、テトラサイクリンリプレッサー発現プラスミドpcDNA3−tetRを構築した。ついで、pGEM3Z−tetRのSal IおよびKpn I−tetRフラグメントをpcDNA3ベクターのEcoRV−Kpn I部位に挿入した。
細胞培養およびトランスフェクション
10％ウシ胎児血清を補足したDulbeccoの修飾Eagle培地（DMEM）中でアフリカミドリザル（African green monkey）腎臓（Vero）細胞を増殖させ、維持した。60mmのディッシュ１枚あたり２ないし3x105個の細胞をまいた。細胞をまいてから20ないし24時間後に、２μｇのpUC19ベクターDNAまたは２μｇのpcDNA3−tetRの存在下において、リポフェクチンにより媒介されるトランスフェクションにより、0.5μｇのpWRG1630または0.5μｇのpCMVtetOEGFのいずれかで細胞をトランスフェクションした。血清および抗生物質不含DMEM中で16〜20時間トランスフェクションを行った後、トランスフェクション培地を除去し、5mlの通常の増殖培地（テトラサイクリン含有または不含）を添加した。製造者（GIBCO BRL.Life Technologies）の手順に従って、2.5μｇのプラスミドDNAにつき10μｌのリポフェクチンとして、リポフェクチン−DNA複合体の調製を行った。
ルシフェラーゼアッセイには、２μｇのpUC19ベクターまたは２μｇのpcDNA3−tetRの存在下で0.5μｇのpCMVtetOGL2用いること以外は上と同様の方法で、Vero細胞をまいて、トランスフェクションした。トランスフェクションから20時間後、リポフェクチン−プラスミドDNA含有培地を除去し、１μg/mlのテトラサイクリン含有通常増殖培地を細胞に供給した。トランスフェクションから70〜72時間後に細胞を集め、製造者（Promega）により記載されたプロトコールに従って細胞抽出物を調製した。
微粒子により媒介される遺伝子導入
インビボ遺伝子導入に使用したブタは家畜用のメスのヨークシャー種で、生後３〜４カ月、体重40〜45kgのもであった。酸素／亜酸化窒素の3:5混合物中ハロタン（１〜1.5％）麻酔を用いて中間層創傷（15X15X1.2mm）をブタの背中の皮膚に作成した。
Accell（Agracetus/Geniva,Inc.）微粒子媒介遺伝子導入のための被覆DNA−金ビーズを用いるカートリッジの作成ならびにAccellヘリウム遺伝子銃の使用は、Geniva,Inc.（8520 University Green,Middleton,W I 53562）により提供されたプロトコールに従うものであった。0.2μｇのhEGF発現プラスミドおよび0.8μｇのpcDNA3または0.2μｇのhEGF発現プラスミドおよび0.8μｇのpcDNA3−tetRを各中間層創傷に与えた。使用ドライブ圧は800ポンド／インチ（psi）であった。DNA導入後、トランスフェクションされた創傷を、密封ビニールチャンバー（100ユニット/mlのペニシリンおよび100μg/mlのストレプトマイシンを含有する等張セイライン1.2ml入り）で封じた。遺伝子導入22時間後、チャンバーから創傷の液体を抜き取り、トランスフェクション部位を新たなチャンバーで封じた。遺伝子導入から46時間後に創傷の液体を収集し、新たなチャンバーを適用した後、500mgのテトラサイクリンをブタに静脈注射した。テトラサイクリン投与24時間後、創傷の液体を集め、−70℃で保存した。創傷の液体中のEGFレベルを、抗HEGF特異的抗体を用いるELISAにより調べた。
ELISA
細胞外培地および創傷の液体におけるhEGFの発現を、抗hEGF特異的モノクローナル抗体（MAB236,R＆G systems）（ウェル１個あたり75ng）を１次コーティング抗体とし、抗hEGF特異的ポリクローナル抗体（sc275,Santa Cruz）（ウェル１個あたり100ng）を２次抗体として使用して、マイクロタイタープレート（96ウェル）で調べた。HRP−抱合ヤギ抗ウサギポリクローナル抗体（sc−2004,Santa Cruz）（ウェル１個あたり3.33ng）を３次抗体として使用した。TMBperoxidaseEIAsubstratekit（BIO−RAD）を用いてペルオキシダーゼアッセイを行い、Bmax Kinetic Microplate Reader（Molecular Devices Corporration,Sunnyvale,CA）で分析した。試料中のhEGF濃度をウェル１個あたり200μｌの体積中、倍々希釈して2pgから200pg/mlの濃度範囲として組み換えhEGF（234−EG,R＆G systems）を用いてSOFTmax 4−パラメーター標準曲線に適合させた。
B.結果
テトラサイクリンリプレッサーによるhCMV主要即時初期エンハンサー−プロモーターのインビトロでの調節
hCMV主要即時初期エンハンサー−プロモーターは哺乳動物細胞における導入遺伝子の発現を指令するための最も強力なcis−調節ユニットの１つである。TATAエレメントのほかに、種々の上流シス−作用性エレメントが同定されており（図１）、細胞またはウイルスのトランスアクチベーターと相互作用することにより、これらのエレメントはTATAエレメントにより指令される高効率転写を確実なものとする。転写開始には、協同的にTATAエレメントと相互作用して転写開始前複合体を形成する基礎転写因子が必要である。TATA結合蛋白（TBP）は、DNAと特異的に相互作用する最初かつ唯一の転写因子であり、TATAエレメントへのTBPの結合はプロモーター転写のシグナルを発する。今回の実験は、テトラサイクリンリプレッサーが、プラスミドpWRG1630中のhCMV TATAエレメントの約10塩基対下流にある２個のtetオペレーターと相互作用することにより、hCMV主要即時初期エンハンサー−プロモーターを調節スイッチに変化させるかどうかを試験するために設計された。tetリプレッサーとTATA結合蛋白とがDNAヘリックスの同じ側に結合するようにtetオペレーター配列を配置した。それらが非常に近い位置にあるので、tetオペレーターへのtetリプレッサーの結合は、TATAエレメントへのTBPの結合をブロックするか、あるいは開始前複合体のアッセンブリーを直接妨害すると仮定された。
1mlにつき１μｇのテトラサイクリン不含または含有培地中、１μｇ、２μｇ、および３μｇのtetリプレッサー発現プラスミドpcDNA3−tetRの不存在下または存在下において0.5μｇのpWRG1630またはpCMVtetOEGFでVero細胞をトランスフェクションした。24時間ごとにトランスフェクション細胞から細胞外培地を集め、ついで、１μｇのテトラサイクリン含有または不含の新鮮増殖培地を添加した。集めた細胞外培地中のhEGF濃度をELISAにより調べた。
図２に示す結果は、pWRG1630からのヒトEGFの発現はpcDNA3−tetRの存在によっては影響されず、hCMV主要即時初期エンハンサー−プロモーター近傍へのtet−オペレーター含有配列の挿入はtetR不存在下でのヒトEGF発現に影響しないことを示す。pCMVtetOEGFからのEGFの発現は、tetR存在下において、量および時間に依存して有意に減少した。３μｇのtetRリプレッサー発現プラスミド、すなわちpcDNA3−tetRの存在下、テトラサイクリン不存在下において、pCMVtetOEGFからのEGFはトランスフェクションから20時間後には約200倍抑制され、トランスフェクションから20〜24時間後には1000倍抑制され、トランスフェクションから44〜68時間後には3500倍抑制された。テトラサイクリン存在下においては抑制はほとんど観察されないかまたは観察されなかった。２μｇのpcDNA3−tetRの存在下において、トランスフェクションから０〜20時間後、20〜44時間後、および44〜48時間後において、約100倍、600倍、および2000倍の発現阻害が検出された。１μｇのpcDNA3−tetR存在下において、上記３時点において約60倍、100倍、および200倍のヒトEGF合成低下が観察された。疑似トランスフェクションされたVero細胞においてはヒトEGFは発現されなかった。
tetRにより媒介される抑制がテトラサイクリンにより効果的に逆転しうるかどうかを試験するために、０〜20時間目はテトラサイクリン不存在下で（図3A）、20〜44時間目はテトラサイクリン存在下または不存在下で（図3B）、pCMVtetOEGFのみ、またはpCMVtetOEGFおよびpcDNA3−tetRのいずれかでVero細胞をトランスフェクションした。結果は、トランスフェクションから０〜20時間後に観察された抑制は、１μg/mlのテトラサイクリンにより効果的に逆転させることができるが、試験条件下においては0.1μg/mlのテトラサイクリンではtetRにより媒介される抑制を逆転させるには不十分であることを示す。図２に示す実験と矛盾せずに、データは、２μｇのpcDNA3−tetR存在下において、pCMVtetOEGFの基底プロモーター活性が、トランスフェクションから０〜20時間において100〜200倍低下し、トランスフェクションから20〜44時間において約500倍低下したことを示す。
分泌性ペプチドであるヒトEGFに関してhCMV主要即時初期エンハンサー−プロモーターのtetRにより媒介される調節についての反応動力学が示されたので、非分泌性蛋白であるホタルルシフェラーゼの発現を調節するこの系の能力を試験した。図４は、Vero細胞が１μg/mlのテトラサイクリン存在下または不存在下において、0.5μｇのpCMVtetOGL2のみでトランスフェクションされた、あるいは0.5μｇのpCMVtetOGL2および２μｇのpcDNA3−tetRで同時トランスフェクションされた２つの独立した実験の結果を示す。tetR発現プラスミドpcDNA3−tetRの存在下においてpCMVtetOGL2からのルシフェラーゼ発現レベルは少なくとも100倍低下し、この抑制はテトラサイクリンにより効果的に解放されうることが見いだされた。野生型hCMV即時初期エンハンサー−プロモーターからのルシフェラーゼ発現レベルはpcDNA3−tetRの存在によっては影響されない。HeLa細胞について同様の実験を行った場合、トランスフェクション後68〜72時間目に40〜50倍の抑制が検出された。このことは、tetR−VP16による活性化系と同様に、tetRによる抑制の効率が細胞タイプに依存することを示す。
テトラサイクリンリプレッサーによるhCMV主要即時初期エンハンサー−プロモーターのインビボでの調節
上記データは、（１）tetリプレッサーは、培養哺乳動物細胞において強力な配列特異的トランスリプレッサーとして作用する能力があること；および（２）TATAエレメントの約10塩基対下流への２つのタンデムなオペレーターの挿入により、プロモーターが効果的なテトラサイクリン依存性転写スイッチに変化させられることを示す。このtetRオペレーター調節ユニットがインビボにおいて機能するかどうかを試験するために、中間層創傷をブタの背中の皮膚に作成し、９カ所の創傷に0.2μｇのpCMVtetOEGFおよび0.8μｇのpcDNA3ベクターDNAを与え（創傷１個あたり）、さらに９カ所の創傷に0.2μｇのpCMVtetOEGFおよび0.8μｇのpcDNA3−tetRを与えた（創傷１個あたり）。図５に示すように、pcDNA3−tetRとともに同時トランスフェクションされた中間層創傷におけるヒトEGF発現は、テトラサイクリン不存在下においてpcDNA3ベクターとともに同時トランスフェクションされた中間層創傷における発現よりも有意に低かった。遺伝子導入１日後に13倍の抑制が検出された。
明らかに、遺伝子導入から１日目から２日目にかけてpCMVtetOEGFでトランスフェクションされた創傷におけるヒトEGF発現は約３倍上昇したが、pcDNA3−tetRとともに同時トランスフェクションされた中間層創傷におけるヒトEGF収量は1.5倍低下した。要約すると、tetR存在下において、ヒトEGF発現レベルは、テトラサイクリン不存在下における遺伝子導入から２日目に約55倍抑制された。遺伝子導入後２ないし３日目にテトラサイクリンを静脈注射により投与すると、tetRにより媒介される抑制が解放されることは重要であり、そのことは、pCMVtetOEGFおよびpcDNA3−tetRの両方を与えられた創傷におけるヒトEGF発現が４倍増加したことにより明らかである。pcMVtetOEGFのみによりトランスフェクションされた創傷においては、遺伝子導入から２ないし３日後に４倍のEGF発現抑制がみられた。この観察結果は、遺伝子治療における導入遺伝子の発現制御におけるこの調節スイッチの利用可能性を証明するものである。
C.議論
標的細胞における導入遺伝子発現の調節は遺伝子治療の最も重要かつ困難な様相である。hCMV主要即時初期エンハンサー−プロモーターを哺乳動物細胞プロモーターのプロトタイプとして使用した場合、TATAエレメントから10塩基対のところにテトラサイクリンオペレーターを配置することにより、テトラサイクリンリプレッサーが哺乳動物細胞における遺伝子発現の強力なリプレッサーとして機能しうることが示された。
最近になって、ヒトKOX1ジンクフィンガー蛋白のKRABリプレッサードメインをtetリプレッサーと融合させ、転写開始部位から685塩基対上流に７個のtetオペレーターをコードするDNA配列を挿入することにより、tetR単独でなくtet−KRABキメラ蛋白がhCMV主要即時初期エンハンサー−プロモーターを10〜15倍抑制しうることが、HeLa細胞においてルシフェラーゼをリポーターとして用いる一時的発現アッセイにおいて示された（Deuschle,et al.,Mol.Cell.Biol.15:1907−1914（1995））。tetオペレーターがTATAエレメントの10塩基対（ヘリックスターン全体に相当）下流に配置される、別の方法を用いて、hCMV主要即時初期エンハンサー−プロモーターがtetRのみにより厳密に調節されうることが示された。HeuerおよびHillenの研究（J.Mol.Biol.202:407−415（1988））に基づいて、この特別な設計は、tetリプレッサーをDNAヘリックスのTBP結合側と同じ側に配置するものであり、tetオペレーターへのtetRの結合は直接TBPを立体的にブロックすると仮定された。hEGFを分泌可能プロモーターとして用いて、tetRにより媒介される抑制が利用された。トランスフェクションから３日後に4000倍近い抑制が観察された。ブタ創傷モデルを微粒子による遺伝子導入と結び付けて考えると、この研究は、遺伝子治療のための導入遺伝子発現の微調整において、このtetRにより媒介される調節スイッチがインビボにおいて直接確認されたことになる。
他のtetリプレッサー／オペレーター調節系、例えば、tetR−VP16に基づく活性化およびtetR−KRABリプレッサー系とは異なり、本明細書開示の調節スイッチは、効果を発揮するためにテトラサイクリンリプレッサー／哺乳動物細胞トランスアクチベーターまたはリプレッサー融合蛋白の使用を必要としない。よって、細胞性転写因子により引き起こされる細胞遺伝子発現に対する潜在的な多面的効果は最小であり、高レベルのレギュレーター（すなわち、テトラサイクリンリプレッサー）の発現が起こりうる。明らかに、tetRにより媒介される調節スイッチの有効性は、インビボと比較するとインビトロにおいて有意に変化することがわかった。この明らかな相違は、おそらく、１）遺伝子導入手段の相違により同時トランスフェクション効率が異なる可能性があること；および２）細胞タイプの相違、によって説明できよう。
実施例2:ウイルス複製スイッチ
上記のtetRにより調節される転写スイッチが新規ウイルス複製スイッチに変換されて、可逆的な様式でドゥノボウイルス生成を調節し、トランス破壊的組み換えウイルスを生成しうるかどうかを試験するために、Ｉ型単純ヘルペスウイルスをプロトタイプとして使用して以下の実験を行った。
A.トランスドミナントネガティブHSV−1 UL9変異ポリペプチドを発現するプラスミドの構築
UL9蛋白は、ウイルス複製に直接関与している７種のHSV−１必須遺伝子産物の１つである。UL9はHSV−１のDNA複製開始点に特異的に結合する。それは長さ851アミノ酸の核ホスホ蛋白である。研究により、UL9のＣ末端アミノ酸535〜851が蛋白DNA結合ドメインを有しており、過剰発現された場合には、ドミナントネガティブ様式でウイルスDNA複製をブロックしうることが示されている。
JL9のＣ末端の317個のアミノ酸をクローンし、それをtetオペレーター含有hCMV主要即時初期エンハンサー−プロモーターの制御下に置くために、プラスミドpCMVtetOEGF中のBamH I−Not I EGF含有フラグメントをプラスミドpSP6UL9由来のBamH I−EcoR V UL9含有フラグメントに置き換えた。得られたプラスミドをpCMVtetOUL9−C571と命名し、それはUL9のＣ末端アミノ酸571〜851を発現する。
プラスミドpCMVtetOUL9−n10/C535（UL9のアミノ酸１から10までおよびUL9のアミノ酸535から851までを含むUL9蛋白フラグメントを発現するプラスミド）を構築するために、アミノ酸Thr−Met−Glyが後に続くUL9蛋白の最初の10個のアミノ酸をコードする２本鎖オリゴをpCMVtetOUL9−C571のBamH I部位に挿入した。UL9のＣ末端アミノ酸535から851までを発現するプラスミドpCMVtetOUL9−C535Cを、BabH I−Kpn Iで消化したpCMVtetOUL9−n10/C535の再連結により構築した。
B.HSV−１複製の一時的阻害分析
pCMVtetOUL9−C571およびpCMVtetOUL9−n10/C535によりコードされる変異UL9ポリペプチドが、HSV−１複製を阻害するトランスドミナントネガティブ変異ポリペプチドとして機能しうるかどうかを試験するために、最も重要には、阻害効果がtetリプレッサーにより調節されうるかどうかを試験するために、Vero細胞を60mmディッシュ１枚あたり5x105個まいた。まいてから20〜24時間後に、1.5μｇのpcDNA3ベクターDNAまたはtetリプレッサー発現プラスミドpcDNA−tetRの存在下において、リポフェクチン法により、0.1μｇの精製感染性HSV−1DNAのみで、または0.1μｇのpCMVtetOUL9−C571またはpCMVtetOUL9−n10/C535とともに同時トランスフェクションした。トランスフェクションから14時間後にリポフェクチン−DNA含有トランスフェクション培地を除去し、ついで、ディッシュ１枚あたり10mlのメチルセルロースをトランスフェクション細胞に添加した。トランスフェクションから68〜72時間後に、トランスフェクションしたディシュをニュートラルレッドで染色することによりウイルスプラークを可視化し、14時間後に計数した。図１に示すように、感染性HSV−1 DNAとpCMVtetOUL9−C571との同時トランスフェクションにより、ウイルスプラーク形成効率は約30倍低下する。pCMVtetOUL9−n10/C535Cと同時トランスフェクションを行った場合、感染性HSV−1 DNAのプラーク形成効率は少なくとも100倍低下した。重要なことに、C571およびn10/C535Cの両方により媒介されるHSV−1 DNA複製の抑制は、tetリプレッサーにより効果的に沈静化しうる。pCMVtetOUL9−C535Cを用いて同様の実験を行ったところ、HSV−1 DNAのプラーク形成効率は少なくとも200倍低下し、さらに、このC535Cにより媒介される抑制はtetRにより効果的に逆転されうる。
トランス−ドミナントネガティブＣ末端UL9ポリペプチドのHSV−１複製に対する阻害効果はtetリプレッサーにより効果的に沈静化されうることが示されたので、このtetRに関連したウイルス複製スイッチの特異性をさらに調べた。Vero細胞を、１）0.2μｇの感染性HSV−1 DNAおよび2.1μｇのpcDNA3;2）0.2μｇの感染性HSV−1 DNA、0.1μｇのpCMVtetOUL9−571および２μｇの感染性pcDNA3;ならびに３）0.2μｇの感染性HSV−1 DNA、0.1μｇのpCMVtetOUL9−C571および２μｇのpcDNA3−tetRでトランスフェクションした。1mlあたり１μｇのテトラサイクリンの不存在下または存在下のいずれかでトランスフェクションを行った。トランスフェクションから16時間後、トランスフェクション培地を除去し、1mlあたり５μｇのテトラサイクリン不含または含有新鮮培地5mlを各ディッシュに添加した。トランスフェクションから48時間後、細胞を集め、ウイルス収量を測定した。図２に示すデータは、
１）C571により媒介されるHSV−１複製の発現はtetリプレッサーにより逆転されうること；および２）HSV−１プラーク形成ユニットに対するpCMVtetOUL9−571の効果がテトラサイクリン存在下において有意に減少したことにより明らかなように、このtetRにより調節されるHSV−１複製の逆転はテトラサイクリン特異的であること、を示す。
要するに、これらの観察結果は、トランスドミナントネガティブ変異ウイルスポリペプチドをtetRにより調節される強力な哺乳動物転写スイッチと組み合わせることにより、新規ウイルス複製スイッチが形成されうることを示すものである。理論上は、ウイルスの複製的感染を阻害しうるポリペプチドまたはアンチセンスRNAを、この新規ウイルス複製スイッチに導入することができる。このスイッチを用いると、トランス−阻害性ウイルスベクターは、インビボでの遺伝子導入用ビヒクルとして役立ちうるだけでなく、内在性および／または潜伏性のウイルス複製をも阻害しうる。また本発明を用いて、有効な宿主免疫応答を誘導しうるだけでなく、同じ細胞内で内在性ウイルス感染の除去を促進する治療薬としても機能しうるウイルスワクチンを得ることもできる。
本明細書で引用したすべての文献を、参照により本明細書に記載されているものとみなす。これまで十分に本発明を説明してきたが、本発明を実施でき、本発明またはその具体例の精神または範囲に影響しないかぎり、広範かつ均等な範囲の条件、パラメーター等を用いることができることを当業者は理解するであろう。
配列表
（１）一般的情報：
（ｉ）出願人:Brigham and Women's Hospital
（ii）発明の名称：テトラサイクリンリプレッサーにより調節される哺乳動物細胞転写スイッチおよびウイルス複製スイッチ
（iii）配列の数:1
（iv）連絡先：
（Ａ）Vinson ＆ Elkins L.L.P.
（Ｂ）通り名:1455 Pennsylvania Avenue,N.W.
（Ｃ）都市名:Washington
（Ｄ）州名:D.C.
（Ｅ）国名:U.S.
（Ｆ）ZIP:20004−1008
（ｖ）コンピューターリーダブルフォーム：
（Ａ）媒体タイプ：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピューター:IBM PCコンパンチブル
（Ｃ）オペレイティングシステム:PC−DOS/MS−DOS
（Ｄ）ソフトウェア:PatentIn Release ＃1.0,Version ＃1.30
（vi）現出願データ：
（Ａ）出願番号：
（Ｂ）出願日：
（Ｃ）分類：
（viii）代理人等の情報：
（Ａ）氏名:Sanzo,Michael A.
（Ｂ）登録番号:36912
（Ｃ）処理番号:BRI331/87001
（ix）テレコミュニケーションの情報：
（Ａ）電話番号：（202）639−6585
（Ｂ）ファックス番号：（202）639−6604
（２）配列番号:1に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）配列の長さ:54塩基対
（Ｂ）配列の型：核酸
（Ｃ）鎖の数:2本
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）配列の種類：他の核酸
（iii）ハイポセティカル：なし
（iv）アンチセンス：なし
（xi）配列の記載：配列番号:1:
Claims (8)
- ａ）TATAエレメントを有する組み換えプロモーター；
ｂ）TATAエレメントの最後のヌクレオチドから６ヌクレオチドまたはそれよりも下流において開始する少なくとも１個のtetオペレーター配列；および
ｃ）該オペレーターの3'側にあり、該プロモーターに作動可能に連結されている遺伝子であって、発現された場合に該ウイルスの複製を阻害する遺伝子
をゲノム中に含む、組み換え的に処理されたウイルス。 - 少なくとも１つの必須ウイルス遺伝子中に１またはそれ以上の変異をさらに含んでいる請求項１のウイルス。
- 該TATAエレメントの最後のヌクレオチドから６ないし24ヌクレオチド下流において該tetオペレーターエレメントが開始するものである請求項１のウイルス。
- 該プロモーターがヒトCMV即時初期プロモーターである請求項１のウイルス。
- ａ）ウイルスゲノム中に存在する第２の組み換えプロモーター；および
ｂ）該第２の組み換えプロモーターに作動可能に連結された第２の組み換え遺伝子をさらに含む請求項１のウイルス。 - 必須ウイルス遺伝子中に１またはそれ以上の変異をさらに含む請求項５のウイルス。
- 該第２の組み換えプロモーター中のTATAエレメントの最後のヌクレオチドから６ヌクレオチドまたはそれよりも下流であって該第２の組み換え遺伝子の5'側に存在する少なくとも１個のtetオペレーター配列をさらに含む請求項５のウイルス。
- 請求項１のウイルスで細胞をトランスフェクションすることにより得られる宿主細胞。
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