JP2022553367A - 非アルコール性脂肪肝の治療 - Google Patents

Abstract

本出願人は、配列番号１のペプチド（WKDEAGKPLVK）がNASHに関連する主要バイオマーカー活性の変化を仲介すること（表１）、および該ペプチドが肝細胞透過アッセイにおいてHepG2肝細胞に浸透できること（図１）を発見した。さらに、本出願人は、pep_260（配列番号１）を44日間投与することにより、肥満糖尿病KKAyマウスの大滴性脂肪変性が有意に緩和されることを実証した（図2）。第1の態様において、本発明は、哺乳動物における非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）、特に非アルコール性脂肪肝炎（NASH）の治療または予防のための方法における、配列番号１、または配列番号1の機能的（または治療上有効な）変異体もしくは機能的断片からなるペプチドの使用に関する。

Description

本発明は、哺乳動物における非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、特に非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の治療に関する。

ＮＡＳＨは、肝硬変または癌につながる可能性がある、広範で深刻な「沈黙の」肝臓病であり、子供を含む世界中の何百万人もの人々に影響を及ぼす。生検で証明された研究では、米国の成人の１２％がＮＡＳＨを有し、２０３０年までに６３％の増加が予想されることが示された。ＮＡＦＬＤ率は、南米で３１％、中東で３２％、ヨーロッパで２３％、すでに小児で１０％の不安があることを警告している。有病率が上昇していること、および、糖尿病予備軍、２型糖尿病、肥満の流行に関連する現代のライフスタイルと密接に関連していることから、ＮＡＳＨは２０２０年までに米国の肝移植の主要な原因になると予想されている；

ＮＡＳＨは、肝臓移植の高額な費用（米国では患者１人あたり約８０万ドル）とそれに関連する合併症だけでなく、ＮＡＳＨがＮＡＳＨ患者の主要な死因である心血管イベントなどの非肝臓障害と密接に関連しているため、迫りくる公衆衛生上の脅威となっている。ＮＡＳＨは沈黙性の疾患であり、症状を示さないため、一般にはほとんど知られておらず、ＮＡＳＨ患者のほとんどが診断されていないのが現状である。ＮＡＳＨはまた、単純で正確で費用対効果の高い診断ソリューションがないため、検出が困難であり、診断が不十分な疾患である。ＮＡＳＨ患者は、病気に関連する偏見や誤解と戦わなければならない。また、ＮＡＳＨの性質と結果を理解するのが難しい親戚、友人、同僚に自分の状態を説明するための、わかりやすい情報へのアクセスも不足している；

一部の国際的な専門家を除いて、糖尿病専門医、内分泌専門医、肥満専門医、心臓専門医、産婦人科医、総合診療医、看護師を含む医療関係者は、ほとんど情報不足のままであり、この病気について学ぶ機会が限られ、関連する教育資源も限られている。

現在も承認された治療法はないが、いくつかの高度な開発プログラムが進行中であり、世界中の何百万人もの臨床医と患者に希望を提供している（患者の１０％のみが、挑戦的なライフスタイルの変化を通じて病気との戦いに成功することができる）。

本発明の目的は、上記の課題の少なくとも１つを克服することである。

本出願人は、配列番号１のペプチド（ＷＫＤＥＡＧＫＰＬＶＫ）が、ＮＡＳＨに関連する主要なバイオマーカー活性の変化を媒介することを発見し（表１）、肝細胞透過アッセイにおいて、ペプチドがHepG2肝細胞を透過できることを発見した（図１）。加えて、出願人は、配列番号１で４４日間処理することにより、肥満糖尿病KKAyマウスの大滴性脂肪変性が有意に緩和されることを実証する（図２）。

本出願人はまた、配列番号１と比較して５つの修飾残基（残基１、２、５、１０、１１はＤ－アミノ酸として提供される）を有する、配列番号１の変異体、{d}W{d}KDE{d}AGKPL{d}V{d}K（配列番号２）を提供する。配列番号２の変異体ペプチドは、インスリンと比較して骨格筋細胞へのグルコース取り込みを有意に増強し（図３）、リラグルチドと比較してHbA1c%（体の赤血球に付着したグルコースの量）を有意に減少させ（図４）、T ^1/2 ＝93分の最適化されたＰＫプロファイルを示す。

また、インビボでの安定性の向上を示し、インビトロでのヒト骨格筋細胞におけるグルコース取り込みを有意に増加させる、配列番号１の環化変異体－(1(clac)wKE(Me)EC1GK(Me)PLVk-OH)（配列番号３）も提供される（図５）。

生物活性ペプチドは、有利な安全性プロファイルを有し、多数の経路を減衰させることができる標的に関与する能力を有する。

第１の態様では、本発明は、哺乳動物における非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、特に非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の治療または予防方法における、配列番号１を含むペプチド、または配列番号１の機能的（または治療上有効な）変異体もしくは機能的断片（以下、「ペプチド活性剤」または「本発明のペプチド」という）の使用に関する。

別の態様では、本発明は、哺乳動物における非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）の治療または予防方法であって、哺乳動物に、治療有効量の配列番号１を含むペプチド、または配列番号１の機能的（または治療有効）変異体もしくは機能的断片（以下、「ペプチド活性剤」という。）を投与するステップを含む方法に関する。

前記ペプチド（または機能的変異体もしくは断片）は、単独で、または強化された治療効果を提供する他の共薬物と組み合わせて投与されてもよく、その共薬物には糖尿病もしくは肥満の治療において同定された効果を有する薬物が含まれるが、これらに限定されない。

一実施形態では、ペプチドは、最大４０、３５、３０、２５、２０、または１５個のアミノ酸を有する。一実施形態では、ペプチドは１１～１５個のアミノ酸を有する。一実施形態では、ペプチドは、配列番号１から本質的になる。

一実施形態では、ペプチドの変異体は、配列番号１と比較して１～６個の修飾を有し、各修飾は、典型的には、挿入付加、欠失、および置換（理想的には保存的置換）から独立して選択される。一実施形態において、１つ以上のアミノ酸(例えば、１～５個、１～４個、１～３個、または１～２個)は、Ｄ－アミノ酸で置き換えられる。一実施形態では、残基１、２、５、１０、１１のうちの１つ以上、例えば、２、３、４、または５個が、Ｄ－アミノ酸で置き換えられる。一実施形態では、１つ以上のアミノ酸は、保存的アミノ酸置換で置き換えられる。一実施形態では、機能的変異体は、配列{d}W{d}KDE{d}AGKPL{d}V{d}K（配列番号２）を有し、これは、アミノ酸１、２、５、１０、および１１がアミノ酸のＤ型で置き換えられることを除いて、配列番号１と同じである。

一実施形態では、ペプチドは修飾されている。一実施形態では、ペプチドは、組換えペプチドである。一実施形態では、ペプチドは環化されている。環化ペプチドの例は、(1(clac)wKE(Me)EC1GK(Me)PLVk-OH)－配列番号３である。この変異体では、残基「w」および「k」はＤ－アミノ酸であり、残基「E」および「P」はメチル化され、ペプチドは、Ｎ末端とシステイン残基との間のチオエーテル環化を含み、「1(clac)」および「C1」は、環の２つの末端を示す。

他の実施形態では、前記ペプチドは、単独で、または強化された治療効果を提供する他の共薬物と組み合わせて投与されてもよく、その共薬物には糖尿病もしくは肥満の治療において同定された効果を有する薬物が含まれるが、これらに限定されない。

他の実施形態において、本発明は、配列{d}W{d}KDE{d}AGKPL{d}V{d}K（配列番号２）を有するペプチドを提供する。他の実施形態において、本発明は、(1(clac)wKE(Me)EC1GK(Me)PLVk-OH)－配列番号３の環化ペプチドを提供する。

本発明のペプチドは、本発明のペプチドを含む組成物または医薬組成物であってよい。

別の態様において、本発明は、本発明のペプチドをコードする核酸を提供する。

別の態様では、本発明は、本発明のペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターを提供し、このベクターは、宿主細胞における本発明のペプチドの異種発現のために構成される（以下、「本発明の発現ベクター」という）。

別の態様では、本発明は、本発明のペプチドを異種発現するように操作された宿主細胞、特に細菌または哺乳動物プロデューサー細胞を提供する（以下、「本発明の形質転換細胞」という）。一実施形態では、形質転換された宿主細胞は、本発明の発現ベクターを含む。

本発明の他の態様および好ましい実施形態は、以下に記載される定義および他の特許請求の範囲で説明される。

図１は、肝細胞における細胞膜透過性を示す。HepG2肝臓細胞を、Cy5標識されたpep_260（配列番号１）またはCy5のみ（未処理）で６０分間処理した。 図２は、KKAyマウスにおける肝脂肪変性に対するpep_260（配列番号１）処理の効果を示す。NALFDスコアリングは、各処理群の肝臓組織に対して実施した。 図３は、インスリンおよび本発明のペプチド（pep_1E99R5＝配列番号１）と比較した、骨格筋細胞におけるグルコース更新に対する変異体ペプチド（pep_yxww2f＝配列番号２）の効果を示す。 図４は、（Ａ）リラグルチドと比較した、変異体ペプチド（pep_yxww2f ＝配列番号２）の、骨格筋細胞中のグリコシル化ヘモグロビン（HbA1c%）に及ぼす影響を示す。（Ｂ）特徴は、Sherwani SIら、Significance of HbA1c Test in Diagnosis and Prognosis of Diabetic Patients. Biomark Insights.2016; 11: 95 -104によって考案されたマウス肝臓スコアリングシステムに従ってスコアリングされた。データは、平均±SEM（各群ｎ＝６；ベースライン時１２週齢）であり、２つのペプチド処理群とビヒクル対照群とリラグルチド群との間の差を比較するために、ダネット試験によって分析された（*p<0.05 **p<0.01 ***p<0.001）。 図５は、対照および本発明のペプチド（pep_1E99R5＝配列番号１）と比較した、骨格筋細胞におけるグルコース更新に対する変異体環状ペプチド（pep_DJKTTM＝配列番号３）の効果を示す。 図６は、pep_1E99R5 （pep_1E99R5 ＝配列番号１）または10PANXで処理したHepG2細胞における、サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して測定されたＩＬ－８分泌の減少を示す。細胞を、ペプチド（５ｎｇ／ｍｌ）、10PANX（ｕｇ／ｍＬ）、またはＰＢＳのいずれかで２４時間処理した後、１００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳでさらに２４時間刺激した。データは、３つの独立した実験の平均±ＳＤとして提示される。***反復間のp≦0.001。 図７は、pep_1E99R5の、刺激された初代ヒト肝星細胞における抗線維化活性を示す。（Ａ）エラフィブラノール（10μM）またはpep_1E99R5(5nM)で処理する前に、α-SMAの発現を刺激するためにTGF-βで処理されたヒト星細胞の共焦点撮像である。（Ｂ）処理条件のためのピクセル単位の細胞サイズの定量化を示す。全ての条件は、３つの独立した複製からの細胞を含有する。未処理：ｘ細胞、未処理＋ＴＧＦβｘ細胞、エラフィブラノールｘ細胞。(A).*複製間でp≦0.05、複製間で**p≦0.01、複製間で***p≦0.001。 図８は、APAP急性肝損傷マウスモデル研究における肝臓酵素の変化を示す。APAPは、０時間においてＩＰ注射を介して投与された。Pep_1E99R5、10PANXまたは生理食塩水対照処理が１．５時間後にＩＶ投与された。５匹の動物を各群に含めた。全てのマウスにおけるＡＬＴおよびＡＳＴのレベルを、２．２５および６時間時点での生存および終末出血から測定した。２．２５時間で、pep_1E99R5の投与は、APAP／生理食塩水処理と比較してＡＬＴレベルを有意に低下させ（p<0.05）、10PANXを上回った。APAP/生理食塩水群は、生理食塩水群と比較して、ALTとASTの両方で増加した。データは平均±ＳＥＭであり、Ｔ検定によって分析され、必要に応じて複数の比較検定が行われる。

本明細書に記載のすべての刊行物、特許、特許出願および他の参考文献は、個々の刊行物、特許または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示され、その内容が完全に列挙されているかのように、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

定義と一般的な設定
本明細書で使用される場合、特に別段の指示がない限り、以下の用語は、その用語が当技術分野で享受する可能性のあるより広い（またはより狭い）意味に加えて、以下の意味を有することを意図する：

文脈上別段の必要がない限り、ここでの単数形の使用は複数形を含むように読まれ、その逆も同様である。物に関連して使用される「a」または「an」という用語は、その物の1つまたは複数を指すと解釈される。すなわち、「a」（または「an」）、「１つ以上」および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では同義的に使用される。

本明細書で使用される場合、「含む(comprise)」という用語、または「含む(comprises)」または「含む(comprising)」などのその変形は、列挙されたインテジャー（例えば、特徴、要素、特性、プロパティ、方法／プロセスステップまたは限定）またはインテジャーのグループ（例えば、特徴、要素、特性、プロパティ、方法/プロセスステップまたは限定）の包含を示すために読まれるべきである。ただし、他のインテジャーまたはインテジャーのグループを除外しない。したがって、本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、包括的またはオープンエンドであり、追加の、列挙されていないインテジャーまたは方法／プロセスステップを除外しない。

本明細書で使用される場合、「疾患」という用語は、生理学的機能を損ない、特定の症状に関連する異常な状態を定義するために使用される。この用語は、病因の性質（または実際に疾患の病因的根拠が確立されているかどうか）に関係なく、生理学的機能が損なわれている障害、病気、異常、病状、病気、状態または症候群を包含するように広く使用される。したがって、感染、外傷、傷害、手術、放射線焼灼、中毒、または栄養不足から生じる状態が含まれる。

本明細書で使用される場合、「治療(treatment)」または「治療(treating)」という用語は、疾患の症状を治癒、改善または軽減するか、またはその原因を除去（または影響を軽減）する介入（例えば、対象への薬剤の投与）を指す。この場合、この用語は「治療(therapy)」という用語と同義で使用される。

さらに、「治療(treatment)」または「治療(treating)」という用語は、疾患の発症または進行を予防または遅延させるか、または治療された集団内でのその発生率を低減（または根絶）する介入（例えば、対象への薬剤の投与）を指す。この場合、治療という用語は「予防」という用語と同義語として使用される。

本明細書で使用される場合、薬剤の有効量または治療有効量は、合理的な利益／リスクの比率に見合った、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題または合併症なしに対象に投与できる量であるが、所望の効果、例えば、対象の状態の永続的または一時的な改善によって現れる治療または予防を提供するのに十分な量、と定義される。その量は、対象の体格、年齢および個体の一般的な状態、投与方法および他の要因に応じて、対象ごとに異なる。したがって、正確な有効量を特定することは不可能であるが、当業者は、日常的な実験および背景となる一般知識を使用して、任意の個々の場合において適切な「有効」量を決定することができるであろう。この文脈での治療結果には、症状の根絶または軽減、痛みまたは不快感の軽減、生存期間の延長、可動性の改善、およびその他の臨床的改善のマーカーが含まれる。治療結果は完全な治療である必要はない。改善は、生物学的／分子マーカー、臨床的または観察的改善において観察され得る。好ましい実施形態では、本発明の方法は、ヒト、大型競走動物（ウマ、ラクダ、イヌ）、および家庭用コンパニオン動物（ネコおよびイヌ）に適用可能である。

上記で定義された治療および有効量の文脈において、対象という用語（文脈が許す場合、「個体」、「動物」、「患者」または「哺乳動物」を含むと読まれるべきである）は、治療が必要な任意の対象、特に哺乳動物対象、と定義される。哺乳類の対象には、ヒト、家畜、農場の動物、動物園の動物、スポーツ動物、ペット動物、例えば、犬、猫、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、馬、ラクダ、バイソン、牛(cattle)、牛(cow)；類人猿、サル、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類；犬やオオカミなどのイヌ科動物；猫、ライオン、トラなどのネコ科動物；馬、ロバ、シマウマなどの馬；牛、豚、羊などの食用動物；鹿やキリンなどの有蹄動物；マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどのげっ歯類；が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、対象はヒトである。本明細書で使用される場合、「ウマ」という用語は、ウマ、ロバdonkeys)、ロバ(asses)、キョン、およびシマウマを含む、ウマ科の哺乳類を指す。

「薬学的組成物」：本発明のさらなる態様は、ペプチド活性剤を含み、１つ以上の薬学的に許容される希釈剤、賦形剤もしくは担体と混合されるか、または治療効果を高める他の薬物と同時投与される、薬学的組成物に関する。ペプチド活性剤は単独で投与することができるが、特にヒト療法のために、それらは一般に、薬学的担体、賦形剤または希釈剤と混合して投与される。医薬組成物は、ヒトおよび獣医学におけるヒトまたは動物の使用のためのものであり得る。本明細書に記載の様々な異なる形態の医薬組成物に対するそのような適切な賦形剤の例は、A WadeおよびPJ Weller編集の「Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2nd Edition, (1994)」見出すことができる。特に、局所送達のための製剤は、David OsborneおよびAntonio Aman編集のTopical drug delivery formulations, Taylor＆Francisに記載されており、その完全な内容は参照により本明細書に組み込まれる。治療的使用のための許容可能な担体または希釈剤は、製薬分野でよく知られており、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.（A.R. Gennaro編集、1985）に記載されている。適切な担体の例には、ラクトース、デンプン、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、ソルビトールなどが含まれる。適切な希釈剤の例には、エタノール、グリセロール、および水が含まれる。医薬担体、賦形剤または希釈剤の選択は、意図される投与経路および標準的な医薬慣行を考慮して選択することができる。医薬組成物は、担体、賦形剤または希釈剤として、またはそれに加えて、任意の適切な結合剤、滑沢剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤を含み得る。適切な結合剤の例には、デンプン、ゼラチン、グルコースなどの天然糖、無水ラクトース、フリーフローラクトース、ベータラクトース、トウモロコシ甘味料、アカシア、トラガカントまたはアルギン酸ナトリウムなどの天然および合成ガム、カルボキシメチルセルロースおよびポリエチレングリコールが含まれる。適切な滑沢剤の例には、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが含まれる。防腐剤、安定剤、染料、さらには香味料さえも医薬組成物中に提供され得る。防腐剤の例には、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、およびpヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。酸化防止剤および懸濁剤も使用され得る。

本明細書で使用される場合、ペプチド活性剤の「有効量」または「治療有効量」は、妥当な利益／リスク比に見合った、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なしに対象に投与することができるが、所望の効果、例えば、対象の状態の永続的または一時的な改善によって示される治療または予防を提供するのに十分な量を定義する。その量は、個体の年齢および一般的な状態、投与方法および他の要因に応じて、対象ごとに異なる。したがって、正確な有効量を指定することは不可能であるが、当業者は、日常的な実験および背景となる一般知識を使用して、任意の個々の場合において適切な「有効」量を決定することができる。この文脈での治療結果には、症状の根絶または軽減、痛みまたは不快感の軽減、生存期間の延長、可動性の改善、およびその他の臨床的改善のマーカーが含まれる。治療結果は完全な治癒である必要はない。

本明細書で使用される「ペプチド」という用語は、最大５０個までのアミノ酸、例えば、典型的にはペプチド結合を介して連結された５～５０個のアミノ酸モノマーからなるポリマーを指す。本発明のおよび本発明で使用するためのペプチド（その断片および変異体を含む）は、化学合成によって、または核酸からの発現によって、全体的または部分的に生成され得る。例えば、本発明のおよび本発明で使用するためのペプチドは、十分に確立された標準的な液体、または好ましくは、当技術分野で知られている固相ペプチド合成法に従って容易に調製することができる（例えば、ＪＭスチュワートおよびＪＤヤング、固相ペプチド合成、第2版、ピアースケミカル社、イリノイ州ロックフォード（1984）、M ボダンツキーおよびA ボダンツキー、ペプチド合成の実践、スプリンガーベルラグ、ニューヨーク（1984）を参照）。必要に応じて、本発明で使用されるペプチドのいずれかを化学的に修飾して、それらの安定性を高めることができる。化学的に修飾されたペプチドまたはペプチド類似体は、本発明の実施に関してインビボまたはインビトロでのその増加した安定性および／または有効性を特徴とするペプチドの任意の機能的化学的同等物を含む。ペプチド類似体という用語はまた、本明細書に記載されるようなペプチドの任意のアミノ酸誘導体を指す。ペプチド類似体は、側鎖の修飾、ペプチド合成中の非天然アミノ酸および/またはそれらの誘導体の取り込み、および架橋剤の使用、およびペプチドまたはそれらの類似体上にコンフォメーションの制約を課す他の方法を含むがこれらに限定されない手順によって生成することができる。側鎖の修飾の例には、アルデヒドとの反応による還元的アルキル化とそれに続くNaBH4による還元；メチルアセトイミデートによるアミド化；無水酢酸によるアセチル化；シアネートによるアミノ基のカルバミル化； 2,4,6,トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）によるアミノ基のトリニトロベンジル化；無水コハク酸および無水テトラヒドロフタル酸によるアミノ基のアルキル化；ピリドキサ-5'-ホスフェートによるリジンのピリドキシル化とそれに続くNABH4による還元などによるアミノ基の修飾が含まれる。アルギニン残基のグアニジノ基は、2,3-ブタンジオン、フェニルグリオキサール、グリオキサールなどの試薬との複素環式縮合生成物の形成によって修飾される場合がある。カルボキシル基は、o-アシルイソ尿素形成を介したカルボジイミド活性化と、それに続く、例えば、対応するアミドへの誘導体化によって修飾することができる。スルフヒドリル基は、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化；システイン酸への過ギ酸酸化；他のチオール化合物との混合ジスルフィドの形成；マレイミド、無水マレイン酸または他の置換マレイミドとの反応； 4-クロロ水銀安息香酸、4-クロロ水銀フェニルスルホン酸、塩化フェニル水銀、2-クロロ水銀-4-ニトロフェノールおよび他の水銀を使用した水銀誘導体の形成；アルカリ性pHでのシアネートによるカルバミル化などの方法によって修飾することができる。トリプトファン残基は、例えば、Ｎ－ブロモスクシンイミドによる酸化または2-ヒドロキシ-5-ニトロベンジルブロミドまたはハロゲン化スルホニルによるインドール環のアルキル化などの方法によって修飾することができる。チロシン残基は、テトラニトロメタンによるニトロ化によって3-ニトロチロシン誘導体を形成するよう変換されてもよい。ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾は、ヨード酢酸誘導体によるアルキル化またはジエチルピロカルボナートによるＮ－カルベトキシル化によって達成することができる。ペプチド合成中に非天然アミノ酸および誘導体を組み込む例には、ノルロイシン、4-アミノ酪酸、4-アミノ-3-ヒドロキシ-5-フェニルペンタン酸、6-アミノヘキサン酸、t-ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、4-アミノ-3-ヒドロキシ-6-メチルヘプタン酸、2-チエニルアラニンおよび/またはアミノ酸のD-異性体の使用が含まれるが、これらに限定されない。ペプチド構造の修飾には、D-アミノ酸によってコードされる逆配列を含むレトロインベルソペプチドの生成が含まれる。変化は、タンパク質分解に対する感受性を低下させ、酸化に対する感受性を低下させ、変異体の配列の結合親和性を変化させ（典型的には望ましくは親和性を増加させ）、および／または関連する変異体／類似体ペプチドに他の物理化学的または機能的特性を付与または修飾するものであってよい。

参照ペプチドに適用される「治療的に有効な変異体」という用語は、以下に定義されるように治療的に有効であるような、参照ペプチドと実質的に同一であるアミノ酸配列を有するペプチドを意味する。したがって、例えば、この用語は、１つ以上のアミノ酸残基に関して変更された変異体を含むと解釈されるべきである。好ましくは、そのような変更は、６以下、より好ましくは５以下、４以下、さらにより好ましくは３以下、最も好ましくは１または２アミノ酸のみ、の挿入、付加、欠失および／または置換を含む。天然および修飾アミノ酸の挿入、付加および置換が想定されている。変異体は保存的なアミノ酸変化を有する可能性があり、導入されるアミノ酸は、構造的、化学的、または機能的に、置換されるものと類似している。一般に、変異体は、親配列と少なくとも５０％、６０％、７０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、および理想的には少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。任意の変異体は、疾患のインビトロまたはインビボモデルで試験したときに、基本的に同じ治療効果を有するか、または増強された効果を有する可能性があることに留意されたい。５つのアミノ酸がアミノ酸のＤ型で置き換えられた例示的な変異体は、配列番号２として提供される。

本発明のペプチドに適用される「治療上有効な」とは、本明細書に記載の肝細胞浸透アッセイにおいてHepG2肝細胞を浸透させることができ、後述の慢性糖尿病マウスモデルにおいて肥満糖尿病KKAyマウスにおける大滴性脂肪変性を有意に緩和することができるペプチドを意味する。一実施形態では、治療上有効なペプチドは、表１に列挙されるバイオマーカー活性の全てまたは大部分の変化を媒介することができる。

変異体という用語はまた、「断片」という用語を包含すると理解され、したがって、アミノ酸配列番号１のセグメントを意味する。典型的には、断片は、３～１３個の連続したアミノ酸長を有する。一般に、断片は－５から+３の電荷を有する。ペプチド、断片、または領域の電荷は、Cameselle,J.C.,Ribeiro,J.M., and Sillero,A. Biochem Educ. 14,131-136 (1986)、“Derivation and use of a formula to calculate the net charge of acid-base compounds. Its application to amino acids, proteins and nucleotides”、に記載の方法を使用して決定される。

本明細書では、「配列同一性」という用語は、配列同一性と類似性の両方を含むと理解されるべきである。すなわち、参照配列と７０％の配列同一性を共有する変異体（または相同体）は、配列の全長にわたって、変異体（または相同体）の整列した残基の任意の７０％が、参照配列の対応する残基の同一または保存的置換である変異体（または相同体）である。配列同一性は、２つの異なる配列間で正確に一致する文字の量である。ここで、ギャップはカウントされず、測定は２つの配列のうち短い方に関係する。

用語「配列相同性」に関して、この用語は、変異体（または相同体）の整列した残基のパーセンテージが参照配列の対応する残基と同一であるかまたはその保存的置換であり、かつ、変異体（または相同体）が参照配列と同じ機能を共有する場合に、参照配列と定義されたパーセント類似性または同一性を共有することを意味すると理解されるべきである。

この整列および相同性または配列同一性のパーセントは、当技術分野で知られているソフトウェアプログラムを使用して決定することができ、例えば、1つのアラインメントプログラムは、デフォルトパラメーターを使用するBLASTである。これらのプログラムの詳細は、次のインターネットアドレスで見つけることができる：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi.

断片に適用される「Ｃ末端ドメイン」は、断片のＣ末端における最初の３つのアミノ酸を意味する。

断片に適用される「Ｎ末端ドメイン」は、断片のＮ末端にある最後の３つのアミノ酸を意味する。

参照タンパク質の「ホモログ」は、参照タンパク質と少なくとも60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の配列相同性を有する異なる種の植物由来のタンパク質を意味すると理解されるべきである。

「薬学的組成物」：本発明のさらなる態様は、ペプチド活性剤を含み、１つ以上の薬学的に許容される希釈剤、賦形剤もしくは担体と混合されるか、または治療効果を高める他の薬物と共投与される、薬学的組成物に関する。本発明のペプチドおよび組成物は単独で投与することができるが、それらは一般に、特にヒトの治療のために、医薬担体、賦形剤または希釈剤と混合して投与されるであろう。医薬組成物は、ヒトおよび獣医学におけるヒトまたは動物の使用のためのものであり得る。本明細書に記載の様々な異なる形態の医薬組成物に対するそのような適切な賦形剤の例は、A WadeおよびPJ Weller編集の「Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2nd Edition (1994)」に見出すことができる。特に、局所送達のための製剤は、David OsborneおよびAntonio Aman編集のTopical drug delivery formulations, Taylor＆Francisに記載されており、その完全な内容は参照により本明細書に組み込まれる。治療的使用のための許容可能な担体または希釈剤は、製薬分野でよく知られており、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.に記載されている。（A.R.ジェンナーロ編集、1985）。適切な担体の例には、ラクトース、デンプン、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、ソルビトールなどが含まれる。適切な希釈剤の例には、エタノール、グリセロール、および水が含まれる。医薬担体、賦形剤または希釈剤の選択は、意図される投与経路および標準的な医薬慣行を考慮して選択することができる。医薬組成物は、担体、賦形剤または希釈剤として、またはそれに加えて、任意の適切な結合剤、滑沢剤、懸濁剤、コーティング剤、可溶化剤を含み得る。適切な結合剤の例には、デンプン、ゼラチン、グルコースなどの天然糖、無水ラクトース、フリーフローラクトース、ベータラクトース、トウモロコシ甘味料、アカシア、トラガカントまたはアルギン酸ナトリウムなどの天然および合成ガム、カルボキシメチルセルロースおよびポリエチレングリコールが含まれる。適切な滑沢剤の例には、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが含まれる。防腐剤、安定剤、染料、さらには香味料さえも医薬組成物中に提供され得る。防腐剤の例には、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、およびpヒドロキシ安息香酸エステルが含まれる。酸化防止剤および懸濁剤も使用され得る。

ペプチドまたは組成物は、局所、経口、直腸、非経口、筋肉内、腹腔内、動脈内、気管支内、皮下、皮内、静脈内、鼻、膣、頬または舌下の投与経路に適合させてもよく、それによって投与されてもよい。経口投与の場合、圧縮錠剤、丸薬、錠剤、ゲルル、ドロップ、およびカプセルが特に使用される。好ましくは、これらの組成物は、１回あたり１から２５０ｍｇ、より好ましくは１０～１００ｍｇの有効成分を含む。他の投与形態は、静脈内、動脈内、皮下、皮内、腹腔内または筋肉内に注射することができ、滅菌または滅菌可能な溶液から調製される溶液または乳濁液を含む。本発明の医薬組成物はまた、坐剤、膣リング、ペッサリー、懸濁液、乳濁液、ローション、軟膏、クリーム、ゲル、スプレー、溶液またはダスティングパウダーの形態であり得る。本発明の組成物は、局所送達のために処方することができる。局所送達は、一般に、皮膚への送達を意味するが、上皮細胞、例えば、肺または気道、胃腸管、頬腔で裏打ちされた体腔への送達を意味することもある。特に、局所送達のための製剤は、David OsborneおよびAntonio Aman編集のTopical drug delivery formulations, Taylor＆Francisに記載されており、その完全な内容は参照により本明細書に組み込まれる。気道に送達するための組成物または製剤は、O'Riordan らによるRespir Care、2002、Nov. 47、EP2050437、WO2005023290、US2010098660、およびUS20070053845に記載されている。回腸、特に近位回腸に活性成分を送達するための組成物および製剤は、活性剤が、耐酸性であるが、よりアルカリ性の回腸の環境で溶解しやすいポリマーまたは乳タンパク質で形成された保護マトリックス内にカプセル化される微粒子およびマイクロカプセル化物を含む。このような送達システムの例は、EP1072600.2およびEP13171757.1に記載されている。経皮投与の代替手段は、皮膚パッチの使用によるものである。例えば、有効成分は、ポリエチレングリコールまたは流動パラフィンの水性エマルジョンからなるクリームに組み込むことができる。有効成分はまた、必要に応じてそのような安定剤および防腐剤とともに、白色ワックスまたは白色軟パラフィンベースからなる軟膏に、１から１０重量％の濃度で組み込むことができる。

注射可能な形態は、1回あたり10～1000mg、好ましくは10～250mgの有効成分を含み得る。

組成物は、単位剤形、すなわち、単位用量を含む別個の部分の形態、または単位用量の複数またはサブユニットの形態で処方することができる。

当業者は、過度の実験なしに、対象に投与するための本組成物の１つの適切な用量を容易に決定することができる。通常、医師は個々の患者に最も適した実際の投与量を決定し、それは使用される特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性と作用の長さ、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食事、投与のモードと時間、排泄率、薬物の組み合わせ、特定の状態の重症度、および治療を受けている個人を含む種々の要因に依存するであろう。本明細書に開示される投薬量は、平均的な場合の例示である。もちろん、より高いまたはより低い投与量範囲がメリットとなる個々の例があり得、そのようなものは本発明の範囲内にある。必要に応じて、薬剤は、０．０１から３０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、０．１から１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１から１ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与され得る。例示的な実施形態では、１０から３００ｍｇ／日またはより好ましくは１０から１５０ｍｇ／日の１回または複数の用量が、炎症性障害の治療のために患者に投与される。

特に好ましい実施形態において、本発明の方法および使用は、ペプチドまたは組成物を、１つ以上の他の活性剤、例えば、市販されている既存のＮＡＦＬＤ薬物または薬理学的増強剤と組み合わせて投与することを含む。そのような場合、本発明の化合物は、１つ以上の他の活性剤と連続して、同時にまたは順次投与することができる。

本発明の一実施形態では、ペプチド活性剤は、ペプチド、リンカー、およびコンジュゲートの生体内半減期を増加させることを意図した抗体分子（または抗体断片）を含むコンジュゲートの形態で投与されてもよい。

「修飾ペプチド」：一実施形態では、本発明のペプチド（ペプチド変異体を含む）は、修飾ペプチドであり得る。「修飾ペプチド」という用語は、ペプチドの誘導体という用語と交換可能に使用される。一実施形態では、「修飾ペプチド」という用語は、非修飾ペプチドと比較して以下の特性の１つ以上を示すように修飾されたペプチドを意味する：血漿半減期の延長；ペプチドの親油性の増加；修飾ペプチドの腎クリアランスの増加；通常、rpS6リン酸化活性を保持しながら、タンパク質分解に対する修飾ペプチドの耐性の向上。これらの特性を示すように本発明のペプチドを修飾する様々な方法が本明細書に開示され、ペプチドと結合パートナー（例えば、アルブミン結合小分子、大型高分子、長寿命血漿タンパク質、または抗体または抗体フラグメント）との結合、環化、Ｎ末端またはＣ末端、または側鎖の付加、保護基、L-アミノ酸のD-異性体への置換、アミノ酸修飾、血漿タンパク質結合の増加、アルブミン結合の増加を含む。修飾ペプチドは、本明細書で定義される１つ以上の基で置換されているか、結合パートナーと結合しているか、または環化されているペプチドを含むが、これに限定されない。一般に、ペプチドは、動物の生体内での半減期を延長するように修飾される。さまざまな変更方法を以下に示す。

一実施形態では、修飾は、細胞に浸透する能力が増加した本発明のペプチドおよび／または組成物を提供する任意の修飾であり得る。一実施形態では、修飾は、本発明の組成物またはペプチドの半減期を増加させる任意の修飾であり得る。一実施形態では、修飾は、本発明の組成物またはペプチドの活性を増加させる任意の修飾であり得る。一実施形態では、修飾は、本発明の組成物またはペプチドの選択性を増加させる任意の修飾であり得る。

一実施形態では、基は保護基である。保護基は、Ｎ末端保護基、Ｃ末端保護基または側鎖保護基であり得る。ペプチドは、これらの保護基の１つ以上を有し得る。

当業者は、アミノ酸をこれらの保護基と反応させるための適切な技術を知っている。これらの基は、当技術分野で知られている調製方法、例えば、US2014120141の段落[0104]から[0107]に概説されている方法によって付加することができる。その基はペプチド上に残っていてもよいし、除去されていてもよい。保護基は、合成中に付加されてもよい。

本発明の実施形態において、ペプチドは、１から２９個の炭素原子を有する、１つ以上の直鎖または分枝鎖、長鎖または短鎖、飽和または不飽和、ヒドロキシル、アミノ、アミノアシル、硫酸塩または硫化物基で置換された、または、非置換のものから選択される基で置換されていてもよい。Ｎ－アシル誘導体には、酢酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、オクタン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、リノール酸、リノレン酸、リポ酸、オレイン酸、イソステリン酸、エライド酸、2-エチルヘキサン酸、ココナッツオイル脂肪酸、獣脂脂肪酸、硬化獣脂脂肪酸、パームカーネル脂肪酸、ラノリン脂肪酸または同様の酸に由来するアシル基が含まれる。これらは、置換または非置換であり得る。置換される場合、それらは、ヒドロキシル、またはＳＯ３Ｈ、ＳＨ、またはＳ－Ｓなどで置換されることが好ましいが、これらに限定されない。

本発明の一実施形態では、ペプチドはＲ１－Ｘ－Ｒ２である。
Ｒ１および／またはＲ２基は、ペプチド配列のアミノ末端（Ｎ末端）およびカルボキシル末端（Ｃ末端）にそれぞれ結合している。

一実施形態では、ペプチドはＲ１－Ｘである。あるいは、ペプチドはＸ－Ｒ２である。
好ましくは、Ｒ１は、Ｈ、Ｃ１～４アルキル、アセチル、ベンゾイルまたはトリフルオロアセチルである。

Ｘは本発明のペプチドである。

Ｒ２はＯＨまたはＮＨ２である。

一実施形態では、Ｒ１は、Ｈ、非環状の置換または非置換脂肪族基、置換または非置換アリシクリル、置換または非置換ヘテロシクリル、置換または非置換ヘテロアリールアルキル、置換または非置換アリール、置換または非置換アラルキル、tert－ブチルオキシカルボニル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）およびＲ５－ＣＯ－により形成される基から選択され、ここで、Ｒ５は、Ｈ、非環状の置換または非置換脂肪族基、置換または非置換アリシクリル、置換または非置換アリール、置換または非置換アラルキル、置換または非置換ヘテロシクリルおよび置換または非置換ヘテロアリールアルキルにより形成される基から選択され；

Ｒ２は、－ＮＲ３Ｒ４、－ＯＲ３および－ＳＲ３によって形成される群から選択され、ここで、Ｒ３およびＲ４は、Ｈ、非環式の置換または非置換脂肪族基、置換または非置換アリシクリル、置換または非置換ヘテロシクリル、置換または非置換ヘテロアリールアルキル、置換または非置換アリール、および置換または非置換アラルキルによって形成される群から独立して選択され；そして、Ｒ１とＲ２はα-アミノ酸ではない。

別の好ましい実施形態によれば、Ｒ２は、－ＮＲ３Ｒ４、－ＯＲ３または－ＳＲ３であり、Ｒ３およびＲ４は、Ｈ、置換または非置換Ｃ１－Ｃ２４アルキル、置換または非置換Ｃ２－Ｃ２４アルケニル、Tert-ブチルオキシカルボニル、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）、置換または非置換Ｃ２－Ｃ２４アルキニル、置換または非置換Ｃ３－Ｃ２４シクロアルキル、置換または非置換Ｃ５－Ｃ２４シクロアルケニル、置換または非置換Ｃ８－Ｃ２４シクロアルキニル、置換または非置換Ｃ６－Ｃ３０アリール、置換または非置換Ｃ７－Ｃ２４アラルキル、３～１０員の置換または非置換ヘテロシクリル環、および、２～２４個の炭素原子と１～３個の炭素以外の原子を有しアルキル鎖が１～６個の炭素原子である、置換または非置換のヘテロアリールアルキル、によって形成される群から独立して選択される。任意選択で、Ｒ３およびＲ４は、飽和または不飽和の炭素－炭素結合によって結合され、窒素原子と共に環を形成してもよい。より好ましくは、Ｒ２は、－ＮＲ３Ｒ４または－ＯＲ３であり、Ｒ３およびＲ４は、Ｈ、置換または非置換Ｃ１－Ｃ２４アルキル、置換または非置換Ｃ２－Ｃ２４アルケニル、置換または非置換Ｃ２－Ｃ２４アルキニル、置換または非置換Ｃ３－Ｃ１０シクロアルキル、置換または非置換Ｃ６－Ｃ１５アリールおよび３～１０員の置換または非置換ヘテロシクリル、３～１０員の環および１～６個の炭素原子のアルキル鎖を有する置換または非置換ヘテロアリールアルキル、により形成される群から独立して選択される。より好ましくは、Ｒ３およびＲ４は、Ｈ、メチル、エチル、ヘキシル、ドデシル、またはヘキサデシルによって形成される群から選択される。さらにより好ましくは、Ｒ３はＨであり、Ｒ４は、Ｈ、メチル、エチル、ヘキシル、ドデシル、またはヘキサデシルによって形成される群から選択される。さらにより好ましい実施形態によれば、Ｒ２は、－ＯＨおよび－ＮＨ２から選択される。

本発明の別の実施形態によれば、Ｒ１は、Ｈ、アセチル、ラウロイル、ミリストイルまたはパルミトイルによって形成される群から選択され、Ｒ２は、－ＮＲ３Ｒ４または－ＯＲ３であり、Ｒ３およびＲ４は、Ｈ、メチル、エチル、ヘキシル、ドデシルおよびヘキサデシルから独立して選択され、好ましくはＲ２は－ＯＨまたは－ＮＨ２である。より好ましくは、Ｒ１はアセチルまたはパルミトイルであり、Ｒ２は－ＮＨ２である。

好ましい実施形態において、アシル基は、ペプチドの少なくとも１つのアミノ酸のＮ末端に結合している。

本発明の一実施形態では、ペプチドは、側鎖保護基を含むように修飾されている。側鎖保護基は、ベンジルまたはベンジルベースの基、t-ブチルベースの基、ベンジルオキシ-カルボニル（Z）基、およびアリルオキシカルボニル（alloc）保護基を含む基の1つ以上であり得る。側鎖保護基は、アキラルグリシンなどのアキラルアミノ酸に由来し得る。アキラルなアミノ酸の使用は、得られたペプチドを安定化するのに役立ち、また、本発明の簡便な合成経路を促進する。好ましくは、ペプチドは、修飾されたＣ末端、好ましくはアミド化されたＣ末端をさらに含む。アキラル残基は、α-アミノイソ酪酸（メチルアラニン）であり得る。使用される特定の側鎖保護基は、ペプチドの配列および使用されるＮ末端保護基のタイプに依存することが理解されよう。

本発明の一実施形態において、ペプチドは、１つ以上のポリエチレングリコールポリマーまたは分子量増加化合物などの他の化合物にコンジュゲート、連結、または融合される。分子量増加化合物は、分子量を、典型的には、得られるコンジュゲートの１０％から９０％、または２０％から５０％増加させる任意の化合物であり、２００から２０，０００、好ましくは５００から１０，０００の間の分子量を有し得る。分子量増加化合物は、PEG、任意の水溶性（両親媒性または親水性）ポリマー部分、PEGのホモまたはコポリマー、PEGのモノメチル置換ポリマー（mPEG）およびポリオキシエチレングリセロール（POG）、ポリリジン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸などのポリアミノ酸、特にそれらのLコンフォメーションのもの、アルブミン、ゼラチンなどの薬理学的に不活性なタンパク質、脂肪酸、オリゴ糖、脂質アミノ酸およびデキストランであってもよい。ポリマー部分は、直鎖または分枝状であってよく、５００から４００００Ｄａ、５０００から１００００Ｄａ、１００００から５０００Ｄａの分子量を有し得る。化合物は、tatペプチド、ペネトラチン、pep-1などの任意の適切な細胞透過性化合物であり得る。化合物は抗体分子であり得る。化合物は、親油性部分またはポリマー部分であり得る。

親油性置換基および高分子置換基は当技術分野において公知である。親油性置換基には、アシル基、スルホニル基、エステル、スルホニルエステル、チオエステル、アミドまたはスルホンアミドの一部を形成するＮ原子、Ｏ原子、またはＳ原子が含まれる。親油性部分は、４から３０個のＣ原子、好ましくは８から１２個のＣ原子を有する炭化水素鎖を含み得る。それは、線状または分枝状、飽和または不飽和であり得る。炭化水素鎖はさらに置換されていてもよい。それはシクロアルカンまたはヘテロシクロアルカンであり得る。

ペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、またはその両方で修飾されていてもよい。ポリマーまたは化合物は、好ましくは、アミノ、カルボキシル、またはチオ基に連結されていることが好ましく、任意のアミノ酸残基の側鎖のＮ末端またはＣ末端によって連結されていてもよい。ポリマーまたは化合物は、任意の適切な残基の側鎖にコンジュゲートされていてよい。

ポリマーまたは化合物は、スペーサーを介してコンジュゲートすることができる。スペーサーは、天然または非天然アミノ酸、コハク酸、リシル、グルタミル、アスパラギル、グリシル、ベータ－アラニル、ガンマ－アミノブタノイルであり得る。ポリマーまたは化合物は、エステル、スルホニルエステル、チオエステル、アミド、カルバメート、尿素、スルホンアミドを介してコンジュゲートされ得る。当業者は、記載のコンジュゲートを調製するための適切な手段を認識している。

ペプチドは、例えば、ポリマーへの共有結合によって化学的に修飾して、循環半減期を延ばすことができる。例示的なポリマーおよびそのようなポリマーをペプチドに付着させる方法は、例えば、米国特許第4,766,106号;米国特許第4,179,337号;米国特許第4,495,285号;および米国特許第4,609,546号に示されている。追加の例示的なポリマーには、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリエチレングリコール（PEG）部分が含まれる。

本発明のペプチドは、貯蔵安定性、薬物動態、および／または例えば効力、選択性、および薬物相互作用などのペプチドの生物活性の任意の態様を操作するための１つ以上の修飾を受けることができる。ペプチドが受ける可能性のある化学修飾には、ポリエチレングリコール（PEG）、モノメトキシ-ポリエチレングリコール、デキストラン、ポリ-（Ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）およびポリビニルアルコール、コロミン酸または他の炭水化物ベースのポリマー、アミノ酸のポリマー、およびビオチン誘導体のうちの1つ以上のものの、ペプチドへのコンジュゲートが含まれるが、それに限定されない。Cys残基でのタンパク質のPEGコンジュゲーションは、例えば、Goodson、RJ＆Katre、NV（1990）Bio/Technology 8、343およびKogan、TP（1992）SyntheticCom. 22, 2417に開示される。

修飾ペプチドはまた、１つ以上の残基が修飾されている配列（すなわち、リン酸化、硫酸化、アシル化、PEG化などによる）、および親配列に関して１つ以上の修飾残基を含む変異体を含み得る。アミノ酸配列はまた、放射性同位元素、蛍光、および酵素標識を含むがこれらに限定されない、直接的または間接的に検出可能なシグナルを提供することができる標識で修飾され得る。蛍光標識には、例えば、Cy3、Cy5、Alexa、BODIPY、フルオレセイン（例えば、FluorX、DTAF、およびFITC）、ローダミン（例えば、TRITC）、オーラミン、テキサスレッド、AMCAブルー、およびルシファーイエローが含まれる。好ましい同位体標識には、3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I、および286Reが含まれる。好ましい酵素標識には、ペルオキシダーゼ、β-グルクロニダーゼ、β-D-グルコシダーゼ、β-D-ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼとペルオキシダーゼ、およびアルカリホスファターゼが含まれる（例えば、米国特許第3,654,090号;米国特許第3,850,752号および米国特許第4,016,043号号を参照）。酵素は、カルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒドなどの架橋分子との反応によってコンジュゲートすることができる。酵素標識は、視覚的に検出することもできるし、熱量測定、分光光度法、蛍光分光光度法、アンペロメトリー、またはガス測定法で測定することもできる。アビジン／ビオチン、チラミドシグナル増幅（TSA（商標））などの他の標識システムは当技術分野で知られており、市販されている（例えば、ABCキット、Vector Laboratories, Inc. カリフォルニア州バーリンゲーム; NEN（登録商標）Life Science Products, Inc. マサチューセッツ州ボストン、を参照）。

一実施形態では、ペプチド、変異体、および／または組成物は、薬物性能能力を高めるように修飾される。一実施形態では、ペプチド、変異体および／または組成物は、安定性、透過性を増加させ、効力を維持し、毒性を回避し、および／または半減期を増加させるように修飾される。修飾は上記のとおりであり得る。例えば、修飾は、ＮおよびＣ末端を保護することであってよく、それは、修飾されたアミノ酸、環化、アミノ酸の置換、および／または高分子または大きなポリマーまたは長寿命血漿タンパク質への結合であり得る。半減期を延長するための戦略は、Strohlら（BioDrugs、2015）、Schlapschyら（Protein Eng DesSel2013）、Podust、VNら（Protein Eng DesSel.2013）、Zhang, Lら（Curr MedChem. 2012）、Gaberc-Porekar, Vら（Curr Opin Drug DiscovDevel. 2008）に記載されたものであり得る。例としては、PEG化、脂質化（ペプチド側鎖への脂肪酸の共有結合）、Fcドメインおよびヒト血清アルブミンへの融合、親水性アミノ酸ポリマー（XTENまたはPASなど）との融合、および／または半減期延長タンパク質との融合が挙げられる。

ペプチドのインビボ半減期を延長するためのペプチドの修飾は、文献に記載されている、例えば：
Strategies to improve plasma half life time of peptide and protein drugs.（ペプチドおよびタンパク質薬物の血漿半減期を改善するための戦略） Werle M, Bernkop-Schnurch A. Amino Acids. 2006 Jun; 30(4): 351-67.

長時間作用型ペプチドおよびタンパク質薬物の明らかな利点のために、そのような化合物の血漿半減期を延長するための戦略が非常に求められている。血漿半減期が短いのは、一般に、腎クリアランスが速いことと、体循環中に起こる酵素分解が原因である。ペプチド／タンパク質の修飾は、血漿半減期の延長につながる可能性がある。ソマトスタチンの全体的なアミノ酸量を短縮し、L：-アナログアミノ酸をD：-アミノ酸に置き換えることにより、誘導体オクトレオチドの血漿半減期は、ソマトスタチンではわずか数分であるのに対して、1.5時間であった。INF-alpha-2bのPEG（2,40 K）コンジュゲートは、ネイティブタンパク質と比較して330倍延長された血漿半減期を示した。このレビューの目的は、Ｎ末端およびＣ末端の修飾やPEG化などの血漿半減期を延長するための可能な戦略の概要と、薬物修飾の有効性を評価する方法を提供することであった。さらに、体循環中のペプチドおよびタンパク質薬物の酵素的切断を予測するために、ヒトの血液、肝臓、および腎臓の最も重要なタンパク質分解酵素、ならびにそれらの切断特異性およびそれらの阻害剤に関する基本的なデータが提供される。

Strategic Approaches to Optimizing Peptide ADME Properties.（ペプチドADME特性を最適化するための戦略的アプローチ） Li Di AAPS J. 2015 Jan; 17（1）：134-143.

タンパク質分解からペプチドを安定化するための戦略
構造修飾を通じてペプチドの安定性を高めるために、多くのアプローチが利用可能である。いくつかのアプローチは、安定性を向上させるだけでなく、他のADME特性を強化する。たとえば、環化は安定性と透過性を高めることができ、高分子へのコンジュゲートは、安定性を改善し、腎クリアランスを低下させることができる。ペプチドの安定性とADME特性を改善しながら、効力を維持し、毒性を回避することが重要である。

・Ｎ末端とＣ末端の保護
血液/血漿、肝臓または腎臓の多くのタンパク質分解酵素は、エキソペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、およびカルボキシペプチダーゼであり、Ｎ末端およびＣ末端からペプチド配列を分解する。Ｎ末端または/およびＣ末端の修飾により、ペプチドの安定性が向上することがよくある。多くの例で、Ｎ－アセチル化とＣ－アミド化がタンパク質分解に対する耐性を高めることが報告されている。

・Ｌ－アミノ酸からＤ－アミノ酸への置換
天然のＬ－アミノ酸を非天然のＤ－アミノ酸で置換すると、タンパク質分解酵素の基質認識と結合親和性が低下し、安定性が向上する。一例として、バソプレッシンがある。これは、Ｌ－アルギニンを含み、ヒトでの半減期は10～35分である。D-Argアナログであるデスモプレッシンの半減期は健康なヒトのボランティアで3.7時間である。癌関連プロテアーゼウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター（uPA）の二環式ペプチド阻害剤の研究では、特定のグリシンをＤ－セリンに置き換えると、効力が1.8倍向上するだけでなく、マウス血漿での安定性も4倍向上する。

・アミノ酸の修飾
天然アミノ酸の修飾は、立体障害を導入したり、酵素認識を妨害したりすることにより、ペプチドの安定性を向上させることができる。たとえば、ゴナドトロピン放出ホルモンの半減期は非常に短い（数分）のに対し、１つのGlyがt-ブチル-D-Serに置き換えられ、別のGlyがエチルアミドに置き換えられたブセレリンのヒトでの半減期ははるかに長い。

・環化
本発明のペプチドは環化されてもよい。環化はコンフォメーションの制約をもたらし、ペプチドの柔軟性を低下させ、安定性と透過性を高める。官能基に応じて、ペプチドは頭から尾、頭／尾から側鎖、または側鎖から側鎖に環化することができる。環化は通常、ラクタム化、ラクトン化、および硫化物ベースのブリッジを介して行われる。ジスルフィド架橋は、折り畳みおよび立体配座の制約を形成し、効力、選択性、および安定性を向上させることができる。いくつかのジスルフィド結合リッチペプチドが市販されているか、または前臨床もしくは臨床開発中であり、例えば、リナクロチド、レピルジン、およびジコノチドである。一実施形態において、ペプチドは、ペプチドのアミノ末端とカルボキシ末端との間で環化される。一実施形態では、ペプチドは、アミノ末端と側鎖との間で環化される。一実施形態では、ペプチドは、カルボキシ末端と側鎖との間で環化される。一実施形態では、ペプチドは、側鎖間で環化される。一実施形態では、環状ペプチドは、ホモデティック環状ペプチド、環状イソペプチド、環状デプシペプチド、または単環式もしくは二環式ペプチドから選択される。ペプチドの環化方法は、以下に記載されている：
Jensen, Knud (2009-09-01). Peptide and Protein Design for Biopharmaceutical Applications（バイオ医薬品用途のためのペプチドおよびタンパク質設計）ジョン・ワイリー・アンド・サンズ.ISBN 9780470749715.
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・高分子へのコンジュゲート
高分子（例、ポリエチレングリコール（PEG）、アルブミン）へのコンジュゲートは、ペプチドの安定性を改善し、腎クリアランスを低下させるための効果的な戦略である。

腎クリアランス
多くのペプチドは、in vitroでは有望な薬理活性を示すが、in vivoでの半減期が非常に短い（数分）ため、in vivoでの有効性を示すことができない。ペプチドのクリアランスが速いことと半減期は短いことが、成功する薬剤への開発の妨げとなっている。体循環からペプチドが急速にクリアランスされる主な原因は、酵素によるタンパク質分解または／および腎クリアランスである。糸球体の孔径は約8nmでありMW<2-25kDaの親水性ペプチドは、腎臓の糸球体を介した急速なろ過の影響を受けやすくなっている。ペプチドは尿細管から容易に再吸収されないため、腎クリアランスが高く、半減期が短い場合が多い。ペプチドクリアランスの他のマイナーな経路は、エンドサイトーシスとプロテアソームおよび肝臓による分解である。動物モデルにおける全身クリアランスと腎クリアランスの比較は、腎クリアランスが主要な排泄経路である可能性が高いかどうかに関する有用な情報を提供する。

腎機能障害のある患者の場合、腎機能障害のある患者への不適切な投与は毒性または効果のない治療を引き起こす可能性があるため、ペプチド薬の投与量を調整して、薬物の蓄積と高濃度の薬剤への曝露を避けることが必要になる場合がある。ペプチド腎クリアランスを減らし、半減期を延長するために、いくつかの戦略が開発された。次にこれらについて概説する。

・血漿タンパク結合性の向上
ペプチドが膜タンパク質または血清タンパク質に結合すると、ペプチドの腎クリアランスが低下する。例として、内分泌腫瘍の治療薬である環状ペプチド薬オクトレオチドがある。これは、リポタンパク質に結合するため、ヒトでの半減期は約100分である（非結合画分0.65）。

・アルブミン結合小分子への共有結合
アルブミン結合小分子をペプチドに共有結合させると、高度に結合した小分子を介してアルブミンと間接的に相互作用することにより、糸球体濾過が低下し、タンパク質分解の安定性が向上し、半減期を延長できる。

・大きなポリマーへのコンジュゲート
ペプチドを大きな合成または天然のポリマーまたは炭水化物にコンジュゲートさせると、分子量と流体力学的体積が増加し、腎クリアランスが低下する可能性がある。ペプチドコンジュゲーションに使用される一般的なポリマーは、PEG、ポリシアル酸（PSA）、およびヒドロキシエチルスターチ（HES）である。

・長寿命血漿タンパク質への融合
アルブミンや免疫グロブリン（IgG）フラグメントなどの血漿タンパク質は、ヒトで19～21日の長い半減期を持つ。MWが高い（67～150 kDa）ため、これらのタンパク質は腎クリアランスが低く、新生児Fc受容体（FcRn）に結合すると、血管上皮による飲作用による排泄が減少する。ペプチドのアルブミンまたはIgGフラグメントへの共有結合させることで、腎クリアランスを低下させ、半減期を延長させることができる。

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PEG化
親水性ポリマーであるポリエチレングリコールの長鎖を目的の分子に結合させるPEG化は、元々、免疫系による外来タンパク質の認識を防ぎ、それによって治療薬としての有用性を可能にする修飾として考えられた。未修飾の薬物に対する抗体が一旦形成されると、タンパク質薬物は迅速に中和され、除去されてしまう。予期せぬことに、PEG化は抗薬物抗体がない場合でもタンパク質の薬物動態を改善した1。薬物分子を大きくするだけで、PEG化により、腎臓による薬物のろ過が遅くなった。サイズまたは流体力学的半径の増加が腎クリアランスの減少および半減期の増加につながるという経験的観察は、その後、タンパク質およびペプチド薬物のPEG化の主要な理論的根拠となった。PEG化は、タンパク質やペプチドをより水溶性にしたり、タンパク質分解酵素による分解から保護したりするなど、分子にさまざまな影響を与えることができる。PEG化は、治療用タンパク質の同族の細胞受容体への結合にも影響を及ぼし、通常は親和性を低下させる可能性がある。PEGポリマーのサイズ、構造、および結合様式の変化は、結合した薬物の生物活性に影響を与える可能性がある。

第一世代のPEG化法は課題に満ちていた。しかし、PEG化の化学は非常に単純である。このプロセスには、タンパク質またはペプチドの反応性側鎖へのポリエチレングリコール鎖の共有結合が含まれる。たとえば、PEGはタンパク質やペプチドの表面にあるリジンの-アミノ基に簡単に結合する2。反応はpHに依存する。高pH（8.0以上）では、リジン側鎖のアミノ基がＮ－ヒドロキシスクシンイミドを介してPEGに共有結合する。この方法では、通常、単一の個別の生成物ではなく、タンパク質のさまざまな部位にさまざまな数のPEG鎖が結合した生成物ファミリーが得られる3。最初に承認されたPEG化医薬品は、重症複合免疫不全症の酵素補充療法としてのPegademase bovine（PEG化ウシアデノシンデアミダーゼ）と急性リンパ芽球性白血病の治療のためのPegaspargase（PEG化アスパラギナーゼ）であった1。これらの薬剤は、さまざまなPEG化種の複雑な混合物であったが、血清半減期の延長やタンパク質の免疫原性の低下など、天然酵素よりも治療の特性が改善されていた。PEGの固有の多分散性のため、品質およびバッチ間の再現性は困難であった。この制限にもかかわらず、多数のモノPEG化位置異性体の不均一な集団である2つのPEG化インターフェロン（ペグインターフェロンアルファ-2bおよびペグインターフェロンアルファ-2a）は、C型肝炎の治療のためにFDA承認されている。これらの薬剤はそれぞれ2001年と2002年に上市された。

基本的なPEG化技術には、さまざまな改良とバリエーションが加えられてきた。第２世代のPEG化プロセスでは、分岐構造の使用と、PEG付着のための代替化学物質が導入された。特に、マレイミドやヨードアセトアミドなどのシステイン反応性基を持つPEGは、ペプチドまたはタンパク質内の単一残基へのPEG化のターゲティングを可能にし、最終生成物の不均一性を低減するが、PEG自体の多分散性による不均一性を排除することはない。

PEG化の当初の理論的根拠は免疫原性を低下させることであったが、それにもかかわらず、免疫原性のPEG化タンパク質の例がいくつかある。一例は、痛風患者の血漿尿酸レベルを低下させる酵素であるPEG化尿酸オキシダーゼである。臨床試験では、痛風の患者の比較的高い割合が治療に反応せず、PEGに特異的であるがウリカーゼタンパク質には特異的ではない抗体を開発した2。PEG化リポソームは、一般的に非免疫原性であると考えられているが、いくつかの研究で免疫原性であることがわかっている。PEG化リポソームは強力な抗PEG免疫グロブリンM（IgM）応答を誘発する。さらに、PEG-グルクロニダーゼを複数回注射すると、特定の抗PEG IgM抗体の生成が誘発され、体からのPEG修飾タンパク質のクリアランスが促進されることが示された。

修飾剤としてPEGを使用することの主な潜在的な欠点は、それが非生分解性であるということである。米国食品医薬品局（FDA）は、注射用、局所用、直腸用、および鼻用の製剤を含む医薬品のビヒクルとして使用するためのPEGを承認した。PEGはほとんど毒性を示さず、腎臓（PEG <30 kDaの場合）または糞便（PEG> 20 kDaの場合）のいずれかによってそのまま体から排泄される1。動物へのいくつかのPEG化タンパク質の反復投与は、腎尿細管細胞空胞化の観察をもたらした。最近、脈絡叢上皮細胞の空胞化が、大きな（≧40kDa）PEGとコンジュゲートしたタンパク質を用いた毒性研究でも観察された。脈絡叢上皮細胞は脳脊髄液を産生し、血液CSFバリアを形成している。細胞空胞化の長期的な悪影響は不明であるが、それはいくつかの潜在的な治療法にとって望ましくない結果であることは確かである。考えられる代替案の1つは、PEGの代わりに生分解性ポリマーを使用することである。ヒドロキシエチルスターチ（HES）などのポリマーが代替案として考えられる。HESは無毒で生分解性であり、代用血漿として使用される。HES化のプロセスは、ペプチドの流体力学的半径を増加させることによって腎クリアランスを減少させるという点でPEG化と同様に機能しますが、生分解性のために蓄積の傾向が低くなる可能性がある。しかし、HESおよびその他の提案されている生分解性ポリマーPEGの代替品は、PEGと同様に多分散であり、最終生成物および代謝物の特性評価が困難である。両方の懸念を軽減する1つの新しい解決策は、ポリマー成分として定義されたポリペプチドを使用することである。このアプローチについては後述する。

脂質化
ペプチドの半減期を延ばすための第２の主要な化学修飾法は、ペプチド側鎖への脂肪酸の共有結合を伴う脂質化である4。もともとインスリンの半減期を延長する方法として考案され、開発された脂質化は、PEG化と半減期延長の基本メカニズムは同じであり、つまり、流体力学的半径を大きくして腎濾過を減らすというものである。しかし、脂質部分自体は比較的小さく、その効果は、循環するアルブミンへの脂質部分の非共有結合を介して間接的に媒介される。アルブミンは、大きく（67 KDa）かつヒト血清中に非常に豊富に存在する（35-50g/L）タンパク質であり、脂質を含む分子を体全体に輸送する機能を自然に持っている。血漿タンパク質への結合はまた、PEG化で見られるものと同様に、立体障害によって、ペプチダーゼによる攻撃からペプチドを保護することができる。脂質化の結果、ペプチドの水溶性が低下するが、ペプチドと脂肪酸の間のリンカーの操作により、例えばリンカー内でグルタミン酸またはミニPEGを使用することにより、これを調整できる。リンカー操作と脂質部分の変化は自己凝集に影響を与え、アルブミンとは無関係に生体内分布を遅くすることで半減期の延長に寄与する可能性がある。

インスリンの先駆的な研究6に続いて、さまざまなペプチドの脂質化、特にヒトグルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）アナログ、グルコース依存性インスリン分泌性ポリペプチド、とりわけGLP-1R/グルカゴン受容体共アゴニストなどの糖尿病領域のペプチドの脂質化が研究されている。2つの脂質化ペプチド薬は現在、ヒトでの使用がFDAに承認されている。これらは両方とも長時間作用型の抗糖尿病薬であり、GLP-1アナログのリラグルチドとインスリンデテミルである。

PEG化と脂質化の薬理学的に関連する違いは、治療的に活性なペプチドがはるかに大きなPEGと共有結合しているのに対し、小さな脂肪アシルペプチドコンジュゲートは、大きなアルブミンと非共役結合し、結合型および非結合型が平衡状態で存在していると考えられている。これは、生体内分布の違いを生じ、異なる組織に局在する受容体へのアクセスが異なる効果を誘発する可能性があるため、異なる薬理学をもたらす可能性がある。場合によっては、より制限された生体内分布が望ましいが、他の場合には、より大きな組織浸透が重要である。この問題に対処するＰＥＧアプローチの興味深い変形は、Ｓａｎｔｉらによって開発され、予測可能な切断速度を有する放出性ＰＥＧコンジュゲートが利用されている７。

PEG化および脂質化は、立体障害を通じて遮蔽することにより、プロテアーゼおよびペプチダーゼに対する保護を付与するとともに、増大した流体力学半径を通じて、直接的または間接的に循環半減期を延長する。どちらの方法も、化学コンジュゲーションを利用し、生物学的または合成的に産生されるかに関わらず、それらが修飾されるペプチドを産生するために使用される手段に依存しないという点で柔軟である。合成ペプチドを使用する利点は、既知のタンパク質分解切断負荷による不安定性を含む、いくつかの特定の問題に対処するように設計された非天然アミノ酸を組み込むことができることである。これらはまた、活性または効力が遊離末端またはＣ末端アミド等の修飾残基に大きく依存する場合に重要となる結合部位の選択に関して、より柔軟であり得る。

古典的遺伝子融合： FcおよびHSA
長寿命血清タンパク質への古典的な遺伝子融合は、ＰＥＧまたは脂質への化学コンジュゲーションとは異なる半減期延長の代替方法を提供する。２つの主要なタンパク質：抗体Fcドメインおよびヒト血清アルブミン（HAS）は、伝統的に融合パートナーとして使用されてきた。Fc融合は、抗体のFc部分へのペプチド、タンパク質、または受容体エキソドメインの融合を伴う。Fc融合とアルブミン融合はどちらも、ペプチド薬物のサイズを増加させるだけでなく、新生児のFc受容体であるFcRnという身体の自然なリサイクルメカニズムを利用することによって、半減期の延長を達成する。これらのタンパク質のFcRnへのｐＨ依存的な結合は、エンドソーム内の融合タンパク質の分解を防止する。これらのタンパク質に基づく融合物は３～１６日の範囲の半減期を有することができ、これは典型的なＰＥＧ化または脂質化ペプチドよりもはるかに長い。抗体Fcへの融合は、ペプチドまたはタンパク質薬物の溶解性および安定性を向上させることができる。ペプチドFc融合の例は、現在後期臨床試験中のGLP-1受容体アゴニストであるデュラグルチドである。ヒト血清アルブミンは、脂肪アシル化ペプチドによって利用されるのと同じタンパク質であり、他の一般的な融合パートナーである。アルビグルチドは、このプラットフォームに基づくGLP -1受容体アゴニストである。Fcとアルブミンとの間の主な違いは、Fcが二量体性質であるのに対しHASが単量体構造であることであり、融合パートナーの選択に応じて、融合ペプチドは二量体または単量体として提示される。ペプチドFc融合物の二量体性質は、標的受容体が十分に密接に接近しているか、またはそれ自体が二量体である場合、アビディティ効果をもたらすことがある。これは、標的に応じて望ましい場合もあれば、望ましくない場合もある。

設計されたポリペプチド融合体： XTENおよびPAS
組換え融合コンセプトの興味深い変形は、PEGの機能的類似体である、基本的に非構造化親水性アミノ酸ポリマーの融合パートナーとして設計された低複雑性配列の開発である。ポリペプチドプラットフォームの固有の生分解性は、PEGの潜在的により良性の代替物として魅力的である。別の利点は、PEGの多分散性とは対照的に、組換え分子の正確な分子構造である。融合パートナーの三次元フォールディングを維持する必要があるHSAおよびFcペプチド融合とは異なり、非構造化パートナーへの組換え融合は、多くの場合、より高い温度またはＨＰＬＣ精製等の過酷な条件にさらすことが可能である。

このクラスのポリペプチドの中で最も進歩的なものは、XTEN （Amunix）と呼ばれ、８６４個のアミノ酸長であり、６個のアミノ酸（Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｐ、ＳおよびＴ）からなる。ポリマーの生分解性により、通常使用される４０ＫＤａのPEGよりもはるかに大きく、同時により大きな半減期の延長をもたらす。XTENとペプチド薬物との融合により、半減期が天然分子の６０～１３０倍延長する。完全に組み換えて作製された２つのXTEN化生成物、すなわちVRS-859 (Exenatide-XTEN) およびVRS- 317 (ヒト成長ホルモン-XTEN)が臨床に入った。第Ｉａ相試験では、VRS-859は、２型糖尿病患者において良好な忍容性および有効性であることが見出された。VRS -317は、以前に研究されたrhGH製品と比較して優れた薬物動態学的および薬力学的特性を報告しており、月1回投与の可能性がある。

同様のコンセプトの考察に基づく第２のポリマーは、PAS（XL-Protein GmbH）である。３つの小さな非荷電アミノ酸、プロリン、アラニン、およびセリンのみからなるさらに制限されたセットからなるランダムコイルポリマーである。PASの生物物理学的特性と、負電荷の高いXTENとの違いが、生体内分布および／またはインビボ活性の違いに寄与し得るかどうかは未知であるが、これらのポリペプチドがより多くの治療薬に組み込まれ、融合物の挙動が特徴付けられることによって、明らかになるであろう。

パートナーがFc、HSA、XTEN、またはPASであるかどうかに関わらず、すべてのペプチドタンパク質融合物は、遺伝的にコードされており、結果として同様の制約に悩まされる。１つの制限は、非天然アミノ酸を組み込んだ合成ペプチドの使用を可能にする化学コンジュゲーションを用いる方法とは異なり、天然に存在するアミノ酸のみが組み込まれることである。遺伝子コードを拡張することでこれを克服する方法は、AmbrxやSutroなどの企業によって開発されているが、まだ広く使用されていない。第２の制限は、ペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかが、パートナーに融合する必要があることである。多くの場合、ペプチド末端は受容体相互作用に関与し、一方または両方の末端への遺伝子融合は、活性を大きく損なう可能性がある。PEGまたは脂質コンジュゲーションの部位は、ペプチド上の任意の場所でよいので、得られる治療薬の生物学的活性を最大化するように最適化することができる。

合成ペプチドと半減期延長タンパク質を融合させるハイブリッド法
遺伝子融合は、これまで、より長い半減期の延長の可能性を提供してきたが、結合部位の柔軟性および非天然アミノ酸の組み込み、またはペプチド骨格への修飾の点で、化学的コンジュゲーション、ＰＥＧ化および脂質化を利用する方法によってもたらされる利点を欠いている。半減期延長のために、遺伝子融合と化学的コンジュゲーションの利点を融合させる最初の取り組みの1つは、ラホヤのScripps Research Instituteの研究者によって行われ、その技術は後にバイオテクノロジー企業CovXの基礎となった。これらの研究者は、触媒アルドラーゼ抗体を用いて、抗体の活性部位リジンが、ペプチドまたは小分子に組み込まれたベータ－ジケトンと可逆的共有エナミン結合を形成するプラットフォームを開発した。得られた複合体は、CovXBody（商標）と呼ばれる。このアプローチは、ペプチド薬物または小分子の機能的特性と抗体の長い血清半減期とを、遺伝子融合を介さず、むしろ化学結合を介して組み合わせるものである。この技術の最初のデモンストレーションに続いて、研究者は、ペプチド模倣ファーマコフォアを標的とするインテグリンに基づくCovX-Body （商標）プロトタイプの使用を拡大した。この構成に基づく少なくとも３つの分子が臨床開発に入っている： Glp-1RアゴニストであるCVX-096；アンジオポエチン－２結合ペプチドであるCVX-060；およびトロンボスポンジン模倣物であるCVX-04。

最近では、XTENポリペプチドも化学コンジュゲーションモードで使用されており、PEGにさらに直接的に類似している。この方法を用いて作製したXTEN化ペプチドの第１の例は、GLP2-2G-XTENであり、このペプチドは、マレイミド－チオール化学を用いてXTENタンパク質ポリマーに化学的にコンジュゲートされる。化学的にコンジュゲートされたGLP2-2GXTEN分子は、組換え融合GLP2-2GXTENに匹敵する、インビトロ活性、インビトロ血漿安定性、およびラットでの薬物動態を示した。

XTENまたはPASポリペプチドの完全に設計された配列におけるリジンまたはシステイン側鎖等の反応性基の数および間隔は、それらが構成される制限されたアミノ酸セットにより、部位特異的変化を通じて正確に制御することができる。これは、配列が自然に多くの反応性基を含んでいるFcまたはアルブミンを利用し得る方法に比べて、より高程度の柔軟性を提供するものであり、非常に特殊化した活性部位における反応性残基に依存するCovX技術とは対照的な立場にある。加えて、XTENまたはPASの三次構造の欠如は、カップリングおよびコンジュゲートの精製に使用される条件および化学物質に対してより柔軟性を提供するはずである。

要約すると、化学コンジュゲーションおよび遺伝子融合法の利点を組み合わせ、個々の限界を克服したハイブリッドペプチド半減期延長法が出現しつつあるということである。これらの方法は、より長い半減期を付与するが、治療用ペプチド部分を、天然のＬ－アミノ酸のみから構成されるか、またはＮ末端もしくはＣ末端のいずれかで融合した直鎖、一方向性ポリペプチドのみとして構成されるという制限から解放させる、組換えポリペプチドベースのパートナーに基づく分子の作製を可能にし、したがって、広範囲の長時間作用型ペプチドベース薬物への扉を開く。

本明細書で使用される場合、「本発明の発現ベクター」という用語は、細胞における本発明のペプチドの発現に好適な、染色体、非染色体、および合成核酸ベクター（発現制御要素の好適なセットを含む核酸配列）を含む任意の好適なベクターであってもよい。このようなベクターの例としては、SV40の誘導体、細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクター、ならびにウイルス核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）ベクターが挙げられる。一実施形態では、ペプチドをコードする核酸分子は、裸のDNAまたはRNAベクター中に含まれており、例えば、線状発現エレメント（例えば、Sykes and Johnston, Nat Biotech 12, 355-59 (1997)）に記載されているようなもの）、コンパクト化核酸ベクター（例えば、米国特許第第6,077,835号および／またはWO 00/70087号に記載されているようなもの）、またはpBR322、pUC19/18、もしくはpUC118/119等のプラスミドベクターを含む。このような核酸ベクターおよびその使用は、当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第5,589,466および米国特許第5,973,972号)。一実施形態では、ＤＮＡは、発現制御配列を含む。

一実施形態において、ベクターは、細菌細胞における本発明のポリアミノ酸配列の発現に好適である。このようなベクターの例としては、BlueScript (Stratagene)、pINベクター（Van Heeke & Schuster, 1989, J Biol Chem 264, 5503-5509 ）、pETベクター（Novagen, Madison, Wis.）等の発現ベクターが挙げられる。一実施形態では、発現ベクターはまた、または代替的に、酵母系での発現に好適なベクターであってもよい。酵母系での発現に好適な任意のベクターを用いることができる。好適なベクターとしては、例えば、酵母アルファ因子、アルコールオキシダーゼ、およびPGH（F. Ausubel et al., ed., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience New York;およびGrant et al., 1987, Methods in Enzymol 153, 516-544に概説されている）等の構成的または誘導性プロモーターを含むベクターが挙げられる。他の実施形態において、発現ベクターは、バキュロウイルス感染昆虫細胞における発現に好適である。(Kost, T; and Condreay, J P, 1999, Current Opinion in Biotechnology 10 (5): 428-33.)

発現制御配列は、目的の遺伝子の転写、および種々の細胞系におけるタンパク質のその後の発現を制御および駆動するように操作される。プラスミドは、目的の発現可能な遺伝子を、例えば、プロモーター、エンハンサー、選択可能なマーカー、オペレーター等の所望のエレメントを含む発現制御配列（すなわち、発現カセット）と組み合わせる。本発明の発現ベクターにおいて、ポリアミノ酸配列をコードする核酸分子は、任意の好適なプロモーター、エンハンサー、選択可能なマーカー、オペレーター、リプレッサータンパク質、ポリＡ終結配列、および他の発現促進要素を含んでもよく、またはそれらと関連付けられてもよい。

本明細書で使用される「プロモーター」は、それが作動可能に連結されている、すなわち適切なシグナルが存在するときに、ポリアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の転写を可能にするような方法で連結されている、ＤＮＡ配列の転写を指示するのに十分なＤＮＡ配列を示す。ポリアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の発現は、当該技術分野で既知の任意のプロモーターまたはエンハンサー要素の制御下に置かれ得る。このような要素の例としては、強力な発現プロモーター（例えば、ヒトCMV IEプロモーター／エンハンサーまたはCMV主要IE （CMV-MIE ）プロモーター、ならびにRSV、SV40後期プロモーター、SL3-3、MMTV、ユビキチン（Ubi）、ユビキチンＣ（Ubc）、およびHIV LTRプロモーター）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ベクターは、SV40、CMV、CMV-IE、CMV-MIE、RSV、SL3-3、MMTV、Ubi、UbC、およびHIV LTRからなる群から選択されるプロモーターを含む。

本発明の核酸分子はまた、効果的なポリ（Ａ）終結配列、大腸菌におけるプラスミド産物の複製起点、選択マーカーとしての抗生物質耐性遺伝子、および／または都合のよいクローニング部位（例えば、ポリリンカー）に作動可能に連結されてもよい。核酸はまた、CMV IE等の構成的プロモーターとは対照的に、調節可能な誘導性プロモーター（誘導性、抑制可能、発達的に調節可能）を含んでもよい（当業者は、そのような用語が、ある特定の条件下で遺伝子発現の程度の記述子であることを実際に認識するであろう）。

選択可能なマーカーは、当該技術分野において周知の要素である。選択条件下では、適切な選択可能なマーカーを発現する細胞のみが生存することができる。一般に、選択可能なマーカー遺伝子は、細胞培養において種々の抗生物質に対する耐性を付与するタンパク質、通常は酵素を発現する。他の選択的条件では、蛍光タンパク質マーカーを発現する細胞は可視化され、したがって選択可能である。実施形態は、ベータ－ラクタマーゼ（bla）（ベータ－ラクタム抗生物質耐性またはアンピシリン耐性遺伝子またはampR）、bls（ブラスチジン耐性アセチル転移酵素遺伝子）、bsd（ブラスチジン－Ｓデアミナーゼ耐性遺伝子）、bsr（ブラスチジン－Ｓ耐性遺伝子）、Sh ble（Zeocin（登録商標）耐性遺伝子）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（hpt）（ハイグロマイシン耐性遺伝子）、tetM（テトラサイクリン耐性遺伝子またはtetR）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（npt）（ネオマイシン耐性遺伝子またはneoR）、kanR（カナマイシン耐性遺伝子）、およびpac（ピュロマイシン耐性遺伝子）を含む。

ある特定の実施形態において、ベクターは、bla、bls、BSD、bsr、Sh ble、hpt、tetR、tetM、npt、kanRおよびpacからなる群から選択される１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含む。他の実施形態において、ベクターは、緑色蛍光タンパク質（GFP）、強化緑色蛍光タンパク質（eGFP）、シアノ蛍光タンパク質（CFP）、強化シアノ蛍光タンパク質（eCFP）、または黄色蛍光タンパク質（YFP）をコードする１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含む。

本発明の目的のために、真核細胞における遺伝子発現は、組み換え「調節融合タンパク質」（RFP）であり得る調節タンパク質によって順番に調節されるオペレーターによって制御される強力なプロモーターを使用して厳密に調節されてもよい。RFPは、本質的に、転写ブロックドメインと、その活性を調節するリガンド結合ドメインとからなる。かかる発現系の例は、US20090162901 A1に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用される場合、「オペレーター」は、遺伝子内またはその付近に導入されるＤＮＡ配列を示し、その結果、遺伝子は、RFPのオペレーターへの結合によって調節され得、その結果、目的の遺伝子、すなわち、本発明のペプチドをコードするヌクレオチドの転写を防止または可能にする。原核細胞およびバクテリオファージにおける多数のオペレーターは、十分に特徴付けられている(Neidhardt, ed. Escherichia, coli and Salmonella; Cellular and Molecular Biology 2d.Vol 2 ASM Press, Washington D.C. 1996)。これらには、LexAペプチドに結合する大腸菌のLexA遺伝子のオペレーター領域、ならびに大腸菌のLadおよびtrpR遺伝子によってコードされるリプレッサータンパク質に結合するラクトースおよびトリプトファンオペレーターが含まれるが、これらに限定されない。これらには、ラムダcIおよびP22 arcによってコードされるリプレッサータンパク質に結合する、ラムダPRおよびファージP22 ant/mnt遺伝子由来のバクテリオファージオペレーターも含まれる。いくつかの実施形態では、RFPの転写遮断ドメインが、NotI等の制限酵素である場合、オペレーターは、その酵素の認識配列である。当業者は、プロモーターによる転写を制御することができるように、オペレーターがプロモーターに隣接して、またはプロモーターに対して3'側に位置しなければならないことを認識するであろう。例えば、米国特許第参照により本明細書に組み込まれる第５，９７２，６５０号は、tetO配列がTATAボックスから特定の距離内にあることを指定する。特定の実施形態では、オペレーターは、好ましくは、プロモーターのすぐ下流に配置される。他の実施形態において、オペレーターは、プロモーターの１０塩基対内に配置される。

例示的な細胞発現系では、細胞は、テトラサイクリンリプレッサータンパク質（TetR）を発現するように操作され、目的のタンパク質は、TetRによって活性が調節されるプロモーターの転写制御下に置かれる。２つのタンデムTetRオペレーター（tetO）は、ベクター内のCMV-MIEプロモーター／エンハンサーのすぐ下流に配置される。そのようなベクター内のCMV-MIEプロモーターによって指向される目的のタンパク質をコードする遺伝子の転写は、テトラサイクリンまたはいくつかの他の好適な誘導因子（例えば、ドキシサイクリン）の不存在下でTetRによってブロックされ得る。誘導因子の存在下では、TetRタンパク質はtetOに結合することができないため、目的のタンパク質の転写、次いで翻訳（発現）が生じる。（例えば、米国特許第７，４３５，５５３号参照。その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。）

本発明のベクターはまた、目的の遺伝子の宿主ゲノムへの組み込みを促進するためにCre-lox組換えツールを用いてもよい。Cre-lox戦略には、少なくとも２つの構成要素が必要である： １ ）２つのloxP部位間の組換えを触媒する酵素であるCreリコンビナーゼ；および２ ）loxP部位（例えば、組換えが行われる8-bpコア配列と、２つの隣接する13-bp反転反復とからなる配列による特異的な３４塩基対）または変異型lox部位、である。（例えば、Araki et al., 1995, PNAS 92:160-4; Nagy, A. et al., 2000, Genesis 26:99-109; Araki et al., 2002, Nuc Acids Res 30(19):e103;および US20100291626A1を参照されたい。これらは全て、参照により本明細書に組み込まれる）。別の組換え戦略において、酵母由来FLPリコンビナーゼは、コンセンサス配列FRTと共に利用され得る(例えば、Dymecki, S.M., 1996, PNAS 93 (12): 6191 -6196も参照されたい)。

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、組換え核酸配列を発現するのに好適な任意の細胞を含む。細胞には、原核生物および真核生物（単細胞または多細胞）、細菌細胞（例えば、大腸菌の株、バチルス属、ストレプトマイセス属等）、マイコバクテリア細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えばＳ ．セレビシア、Ｓ ．ポンベ、Ｐ ．パートリス、Ｐ ．メタノリカ等）、植物細胞、昆虫細胞（例えばSF-9、SF-21、バキュロウイルス感染昆虫細胞、イラクサギンウワバ（Tricoplusia ni）等）、非ヒト動物細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞、または細胞融合物（例えばハイブリドーマまたはクアドローマ等の細胞が含まれる。ある特定の実施形態において、細胞は、ヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラット、またはマウス細胞である。他の実施形態では、細胞は真核生物であり、以下の細胞から選択される： CHO (例えば、CHO K1、DXB -11 CHO、Veggie - CHO)、COS (例えば、COS -7)、網膜細胞、Vero、CV1、腎臓（例えば、HEK 293、293 EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK 21）、HeLa、HepG2、WI 38、MRC 5、Colo 25、HB 8065、HL-60、Jurkat、Daudi、A431 (表皮)、CV-1、U937、3T3、L細胞、C127細胞、SP2/0、NS-0、MMT細胞、腫瘍細胞、および前述の細胞に由来する細胞株。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上のウイルス遺伝子、例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、PER.C6（登録商標）細胞）を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、CHO細胞である。他の実施形態では、細胞は、CHO K1細胞である。

本明細書で使用される場合、「本発明の形質転換細胞」という用語は、本発明のペプチドの発現をコードするヌクレオチド配列を含む細胞ゲノムに安定的に組み込まれた核酸を含む宿主細胞を指す。別の実施形態において、本発明は、本発明のペプチドの発現をコードする配列を含む、プラスミド、コスミド、ファージミド、または直鎖発現エレメントなどの非組み込み（すなわち、エピソーマル）核酸を含む細胞を提供する。他の実施形態において、本発明は、宿主細胞を、本発明の発現ベクターを含むプラスミドで安定的にトランスフェクトすることによって産生される細胞株を提供する。

本明細書で使用される場合、細胞に適用される「操作された」という用語は、組換えＤＮＡ技術を使用して遺伝子操作されることを意味し、概して、好適な発現ベクターの合成（上記を参照）、次いで、発現ベクターを宿主細胞にトランスフェクトするステップ（概して安定したトランスフェクション）を含む。

本明細書で使用される場合、「異種発現」という用語は、核酸を天然に有しない宿主細胞における核酸の発現を指す。核酸の異種宿主への挿入は、組換えＤＮＡ技術によって行われる。

次に、本発明を特定の実施例を参照して説明する。これらは単なる例示であり、説明のみを目的としている。これらは、主張されている独占権の範囲または記載されている発明に限定することをなんら意図するものではない。これらの例は、本発明を実施するために現在考えられている最良の態様を構成するものである。

肝細胞透過
方法
HepG2（３×１０⁴ウェル^-1）細胞を１８ｍｍのガラスカバースリップ（Paul Marienfeld GmbH&Co.KG, Lauda-Koenigshofen, Germany)を２４ウェルプレートに入れ、培養物中で一晩付着させた。細胞を０．５μｇ／ｍＬのＣＹ５タグ付きpep_260で１時間処理し、その後、室温で４ ％パラホルムアルデヒド（Sigma, Arklow, Ireland）中で２ ０分間固定した。続いて、カバースリップを１×ＰＢＳ（Sigma, Arklow, Ireland）中で洗浄し、室温で０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（Sigma, Arklow, Ireland）中で３０分間インキュベートした。次いで、カバースリップを１×ＰＢＳ中で５分間３回洗浄し、次いで、抗ヒト早期エンドソーム抗原１（EEA1）ウサギモノクローナル抗体（Cell Signalling Technology, Danvers, Massachusetts, USA）で１：５００希釈のＰＢＳ中で４℃で一晩処理した。次いで、カバースリップを１×ＰＢＳ中で５分間３回洗浄した。１×ＰＢＳを吸引し、カバースリップをAlexaFluor 546ヤギ抗ウサギIgG(Life Technologies, Eugene, USA)で１：１００希釈のＰＢＳ中で２時間室温にて処理した。次いで、カバースリップを１×ＰＢＳ中で５分間３回洗浄し、Hoechst 33342溶液(Thermo Scientific, Waltham, USA)で処理した。次いで、カバースリップをＰＢＳ中で３回洗浄し、ピンセットを用いて２４ウェルプレートから除去し、１８ｍＬの０．２Ｍ Tris-buffer （pH8.5）（Sigma Aldrich）に溶解させた５μＬのモウィオール装着培地［６ｇグリセロール（Sigma Aldrich）、２．４ｇモウィオール４－８８（Sigma Aldrich）、および０．０２６ｇ １，４－ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン（DABCO）（Sigma Aldrich）を用いて、スーパーフロストプラス顕微鏡スライド(Thermo Scientific, Waltham, USA）に装着した。

６０×油浸物質を用いたOlympus Fluoview FV 1000共焦点レーザースキャニングバイオロジカル顕微鏡（日本、東京、新宿）で共焦点画像を撮影した。ヘキスト核染色を405nmレーザーダイオードで検出し、AlexaFlour 546フルオロフォアをダイオードポンプ固体状態レーザーで検出し、Cy5タグ付きpep_260を固体状態赤色ダイオードレーザーで検出した。

結果
共焦点イメージングは、pep_260（配列番号１）（赤色染色）がHepG2肝臓細胞を透過できることを実証する。この効果は、５分間のpep_260処置後に観察され、６０分間に見られるHepG2細胞内のより多くの局在化が見られる（図１を参照されたい）。

初代ヒト初代細胞系システムにおけるインビトロ試験
方法
細胞培養条件への適応を最小限に抑え、生理学的シグナル伝達応答を保存するために、ヒト初代細胞を早期継代（継代４またはそれ以前）で使用した。すべての細胞は、複数のドナー（ｎ＝２～６）のプールに由来し、商業的に購入され、製造業者の推奨に従って取り扱われる。ヒト血液由来のＣＤ１４＋単球は、ｌＭｐｈｇ系に添加される前に、インビトロでマクロファージに分化される。略称として、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）、末梢血単核細胞（PBMC）、ヒト新生児皮膚線維芽細胞（HDFn）、Ｂ細胞受容体（BCR）、Ｔ細胞受容体（TCR）およびＴｏｌｌ様受容体（TLR）が使用される。

各系で使用される細胞の種類および刺激は以下のとおりである：３Ｃ系［HUVEC+(IL-1β,TNFαおよびIFNγ)］、４Ｈ系［HUVEC+(IL-4およびヒスタミン）］、ＬＰＳ系［PBMCおよびHUVEC+LPS(TLR4リガンド）］、ＳＡｇ系［PBMCおよびHUVEC+TCRリガンド］、ＢＴ系［CD19+Ｂ細胞およびPBMC+(α-IgMおよびTCRリガンド］、ＢＦ４Ｔ系［気管支上皮細胞およびHDFn＋（TNFαおよびIL-4）］、ＢＥ３Ｃ系［気管支上皮細胞+(IL-1β,TNFαおよびIFNγ)］、ＣＡＳＭ３Ｃ系［冠動脈平滑筋細胞+(IL-1β,TNFαおよび IFNγ)］、ＨＤＦ３ＣＧ系［HDFn+(IL-1β,TNFα,IFNγ, EGF, bFGF およびPDGF-BB)］、ＫＦ３ＣＴ系［ケラチノサイトおよびHDFn + (IL 1β, TNFα, IFNγおよびTGFβ)］、ＭｙｏＦ系［分化した肺筋線維芽細胞＋(TNFαおよびTGFβ)］、ＩＭｐｈｇ系［HUVECおよびM1マクロファージ+ザイモサン(TLR2リガンド)］。

系は、単一細胞型または共培養システムのいずれかに由来する。接着細胞型を、コンフルエンスするまで９６または３８４ウェルプレートで培養し、続いてＰＢＭＣ（ＳＡｇおよびＬＰＳ系）を添加する。ＢＴ系は、ＰＢＭＣと共培養し、ＢＣＲ活性化剤および低レベルのＴＣＲ刺激で刺激したＣＤ１９＋ Ｂ細胞からなる。ＤＭＳＯ（小分子；最終濃度≦０．１％）またはＰＢＳ（生物学的製剤）のいずれかで調製された試験薬は、刺激の１時間前に示された濃度で添加され、２４時間または他の指示どおりに（４８時間、ＭｙｏＦ系；７２時間、ＢＴ系（可溶性読み出し）；１６８時間、ＢＴ系（分泌型ＩｇＧ））培養を維持する。各プレートは、各システムに適切な薬物対照（例えば、１．１μＭの従来の対照試験薬コルヒチン）、陰性対照（例えば、非刺激条件）、およびビヒクル対照（例えば、０．１％ＤＭＳＯ）を含有する。直接ＥＬＩＳＡは、細胞関連標的および細胞膜標的のバイオマーカーレベルを測定するために使用される。上清からの可溶性因子は、ＨＴＲＦ（登録商標）検出、ビーズベースの多重イムノアッセイ、または捕捉ＥＬＩＳＡのいずれかを使用して定量化される。細胞増殖および生存率（細胞毒性）に対する試験薬の明らかな有害作用は、接着細胞についてはスルホダミンＢ（ＳＲＢ）染色、浮遊細胞についてはアラマーブルー（登録商標）還元によって検出される。増殖アッセイのために、個々の細胞タイプをサブコンフルエンスで培養し、各システムに対して最適化された時点で測定する（４８時間：３ＣおよびＣＡＳＭ３Ｃ系；７２時間：ＢＴおよびＨＤＦ３ＣＧＦ系；９６時間：ＳＡｇ系）。接着細胞の細胞毒性は、ＳＲＢ（２４時間：３Ｃ、４Ｈ、ＬＰＳ、ＳＡｇ、ＢＦ４Ｔ、ＢＥ３Ｃ、ＣＡＳＭ３Ｃ、ＨＤＦ３ＣＧＦ、ＫＦ３ＣＴ、およびｌＭｐｈｇ系；４８時間：ＭｙｏＦ系）、および懸濁液中の細胞のアラマーブルー染色（２４時間：ＳＡｇ系；４２時間：ＢＴ系）によって、示された時点で測定される。

結果
主要なバイオマーカー活性におけるpep_260 （配列番号１）媒介性変化を、生物学的および疾患分類によって列挙する（表１を参照）。pep_260は、この研究で試験した濃度では細胞傷害性はない。pep_260は、ヒト初代内皮細胞に対して抗増殖性である。

KKAyマウスにおけるpep_260（配列番号１）の肝臓作用
方法
KKAy肥満糖尿病マウスモデルにおいて、pep_260（配列番号１）およびリラグルチドの肝臓への作用を評価した。１２週齢の雄マウス（ｎ＝１１／群）を、pep_260（１２．７および６３．５ｍｇ／ｋｇ）、リラグルチド（２５０μｇ／ｍｌ）またはビヒクルで４４日間毎日皮下投与した。４４日目に、処置投与の１時間後に頸部脱臼により動物を犠牲にした。すべての動物について、全肝臓を収集し、ホルマリン中に固定した。肝臓組織を切片化し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。組織学的脂肪症は、ＮＡＦＬＤスコアリングシステムに従って、研究グループに盲検化された専門の組織病理学者によって評価された。肝臓における遺伝子発現プロファイリングを追加的に行った。

結果
専門家によるグレーディングは、４４日間にわたるpep_260（配列番号１）での処理が、肥満糖尿病マウスにおける大滴性脂肪変性を有意に緩和することを実証する。肝臓組織の遺伝子発現の分析は、pep_260（配列番号１）での処理が、ＳＲＥＢＦ１、ＦＡＳＮおよびカスパーゼ－３遺伝子の減少を誘導することを示す。これらの結果は、pep_260（配列番号１）が肝臓コレステロール産生を阻害し、肝臓脂質生成を阻害し、肝細胞生存を促進することを示す。

ビヒクル対照およびリラグルチド処置マウスは、ＮＡＦＬＤの徴候を示したが、これらは、５０μＭのpep_1E99R5において有意に減少し、１０μＭのpep_1E99R5処置において減少する傾向にあり、用量依存的効果を示唆した（図２Ｂ）。

LPSおよびTGFβで刺激された不死肝細胞HepG2細胞および初代肺線維芽細胞WI-38細胞におけるIL-8分泌
方法
IL-8酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）：
HepG2肝細胞（密度１×１０ ⁴ 細胞／ｍＬ）を、５ｎｇ／ｍＬのPep_1E99R5、10PANX（PANX１模倣物）またはＰＢＳで２４時間処理した後、ＬＰＳ刺激（１００ｎｇ／ｍＬ）を行い、更に２４時間、ＩＬ－８の発現を増加させた。リポ多糖（ＬＰＳ）は、インビトロでＩＬ－８の発現を増加させる既知の炎症促進シグナルである。培養上清中のＩＬ－８レベルを、ヒトＩＬ－８特異的サンドイッチＥＬＩＳＡ （Perkin Elmar, Waltham, Ma, USA）を使用して、製造業者の指示に従って決定した。

結果
結果から、pep_1E99R5で前処理した細胞において炎症促進性サイトカインＩＬ－８の発現が有意に低下したことが明らかとなった（ｐ＜０．００１）。このデータは、炎症、例えば、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨにおける炎症態様に関する有益な効果のためのさらなる立証を提供した。炎症促進性サイトカインIL-8はＮＡＳＨで強く活性化され、肝臓炎症および線維症に寄与する（図６）。

TGF-β刺激初代肝星細胞におけるpep_1E99R5の抗線維化効果
肝星細胞における線維症の開始（肝線維症およびＮＡＳＨ/ＮＡＦＬＤにおける線維症誘導の主要な炎症性駆動因子）は、様々な濃度の形質転換成長因子β(TGF-β)を有する初代ヒト星細胞のインキュベーションを使用して確実にモデル化することができる。

方法
この手順は、HSkMCsにおけるCy5標識ペプチドイメージングについていくつかのわずかな修正を加えて上述のように実施した。初代肝星細胞は、急性および慢性肝疾患で動作する最も関連性の高い線維化促進性細胞であると考えられるため、調査を行った。星細胞を、５，０００個の細胞／ｍＬの密度でガラスカバースリップに直接播種した。飢餓後、細胞をpep_1E99R5（５ｎｇ／ｍＬ）またはエラフィブラノール（１０μＭ）で６時間処理した。細胞を洗浄し、続いて５ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ-β(Bio Techne, Minneapolis, MN, United States)で２４時間処理して、線維症を誘発した。細胞を固定し、線維芽細胞活性化マーカーであるACTA2抗体(Assay Genie, Dublin, Ireland)で染色した。

共焦点画像は、scikit-imageライブラリバージョン0.15を使用して、カスタムPythonスクリプトで分析した。画像の平均値を使用して計算した単純な閾値を使用して、細胞および核をセグメント化した。核を種として、分水嶺セグメンテーションを用いて細胞マスク内の細胞を分離した。次いで、細胞サイズをピクセル単位で定量化した。[Stefan van der Walt, Johannes L. Schoenberger, Juan Nunez - Iglesias, Fransois Boulogne, Joshua D. Warner, Neil Yager, Emmanuelle Gouillart, Tony Yu and the scikit - image contributors. scikit-image: Image processing in Python.PeerJ 2: e 453 (2014)]

結果
刺激した初代肝星細胞を急性肝障害のモデルとして使用した。未処理の初代星細胞、ＴＧＦβ刺激細胞（５ｎＭ）、エラフィブラノール処理細胞（１０μＭ）、およびpep_1E99R5（５ｎＭ）処理細胞の蛍光画像を図４Ａに示す。ＴＧＦ-β刺激は、細胞内の線維化を誘導するのに有効であった(p < 0.05)。対照細胞では観察されなかったACTA2発現、線維形成、増殖、および形態変化の増加が、刺激細胞で観察された。Pep_1E99R5とのプレインキュベーションは、画像中の黄色繊維として表される、星細胞におけるACTA2の発現を劇的に減少させた(図７Ａ)。線維症マーカーの発現を画像解析を用いてピクセル単位で定量化したところ、この低減は有意であり（ｐ＜０．０１）、１０μＭのエラフィブラノールの抗線維症効果と同等であることが示された（図７Ｂ）。

興味深いことに、５ｎＭでのpep_1E99R5で観察された変化は、１０μＭでのエラフィブラノール（インビトロおよびインビボでの星細胞への作用効果を有するリード臨床候補）によって誘発された変化と同等であり、有意に低い濃度で同じ効果が見られたことから、pep_1E99R5は、潜在的により良い治療プロファイルを示している。

独自のタンパク質標的およびバイオマーカーフィンガープリントと結合したこの証拠は、ＮＡＳＨ/ＮＡＦＬＤに対する前臨床開発プログラムにおいて展開されるこのペプチド実体の可能性を強調するものである。

APAPモデル
方法
アセトアミノフェン（ＡＰＡＰ）誘発急性肝障害マウスモデル：すべての動物処置は、ＡＡＡＬＡＣが認定した施設における施設動物飼育および使用（ＩＡＣＵＣ）ガイドラインに従って、Melior Discovery (Exton, PA, USA)によって実施した。追跡肝損傷試験のための最適なＡＰＡＰ用量を確立するために、ＡＰＡＰ誘発性肝毒性トレイルの前にパイロット試験を実施した（補足図２）。研究は、チャールズリバー研究所から入手した８週齢の雄性C57BL/6マウスを用いて実施し、体重に基づいて処置群に無作為に割り当てた。マウスを７日間馴化させ、１２時間の明暗サイクルで、ケージあたり４匹を収容し、標準的なげっ歯類の餌および水へ自由にアクセスできるようにした。パイロット試験のために、マウスを、腹腔内投与の前に一晩絶食させ、２００ｍｐｋのＡＰＡＰ、３００ｍｐｋのＡＰＡＰ、または対照群としての生理食塩水のいずれかを単回投与した。合計１８匹のマウスを、６匹の動物の３群に分けてパイロット研究に含めた。マウスのストレスを軽減し、生存能力を向上させるために、マウスに最初の採血時点で尾出血を行った。６時間の時点からの血液試料を使用して、ＡＬＴおよびＡＳＴ分析のための血清試料を得た。ＡＰＡＰ誘発性急性肝障害マウスモデルにおけるペプチドの有効性の評価では、ＡＰＡＰ （２００ｍｐｋ）をＩＰ投与し、Pep_1E99R5および10PANXを１０ｍｇ／ｋｇで静脈内投与した。５匹の動物を、ＡＰＡＰ注射の１．５時間後に投与したビヒクルまたはペプチドを各群に含めた。ＡＬＴ／ＡＳＴ分析のために、生存出血を２．２５および６時間で実施した。終末血液サンプルは、心臓穿刺を介して、イソフルラン麻酔下で収集し、フルパネル臨床化学分析のための血清サンプルを得るために使用した（データは示されていない）。

結果
DiscoverX BioMapおよびRetrogenixスクリーニング結果と、Hep-G2および肝星細胞におけるインビトロ試験から、pep_1E99R5の抗炎症作用および抗線維化作用について強く示唆されたため、インビボ肝損傷モデルにおけるペプチドの効果を評価するために、Ｎ－アセチル－パラ－アミノフェノール（ＡＰＡＰ）モデルが用いられた。パイロット研究は、２００ｍｐｋのＡＰＡＰが、生理食塩水対照と比較して、マウスにおけるＡＰＡＰ誘発性肝損傷の生化学的特徴であるアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の両方のレベルを有意に増加させたことを示した。したがって、この濃度は肝損傷試験での使用に最適な濃度と考えられた。最初のＡＰＡＰ投薬の１．５時間後、ペプチドpep_1E99R5および10PANXを静脈内（ＩＶ）投与し、同じ肝臓酵素のレベルを２．２５および６時間で測定した（図８）。より早い時点で、pep_1E99R5は、ALTのレベルを、APAP/生理食塩水対照と比較して80%有意に低下させ(p<0.05)、ALTの41%の低下を誘導した10 PANXを大幅に上回った。同様の傾向は、２．２５時間でＡＳＴレベルで観察されたが、研究に含まれる動物の数が少ないためか、有意な差は認められなかった。ＡＰＡＰ／生理食塩水群におけるＡＬＴおよびＡＳＴのレベルは、６時間までに、それぞれ４および２倍増加した。１０ＰＡＮＸの活性は、この時点でほぼ安定したままであり、４５％～５２％の間の両方の肝臓酵素の非有意な低下を誘導した。pep_1E99R5処置マウスで測定したＡＳＴおよびＡＬＴのレベルは、ＡＰＡＰ対照動物と同様に６時間後に増加した。これは、最初の２時間強力な機能性を示すように見えるが、その後、マウスにおいて少なくとも３倍長く持続する10PANXとは異なり、代謝される可能性が高いという、pep_1E99R5の薬物動態プロファイルを示している。

等価物
前述の説明は、本発明の現在好ましい実施形態を詳述している。これらの説明を考慮すると、当業者には、その実際における多数の修正および変形が生じることが予想される。これらの修正および変形は、本明細書に添付された特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。

Claims (15)

1. 哺乳動物における非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）の治療または予防のための方法において使用するための、最大５０個までのアミノ酸を有し、配列番号１を含むペプチド。
2. 請求項１に記載の使用における、前記非アルコール性脂肪肝疾患が、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）である、請求項１に記載の使用のための、請求項１に記載のペプチド。
3. 前記ペプチドが配列番号１からなる、請求項１または２に記載の使用のための、請求項１に記載のペプチド。
4. 前記ペプチドが、糖尿病治療薬または肥満治療薬と併用投与される、請求項１または２に記載の使用のための、請求項１から３のいずれか一項に記載のペプチド。
5. 哺乳動物における非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）の治療または予防のための方法において使用するための配列番号１の治療上有効な変異体であって、前記治療上有効な変異体が、配列番号１と比較して１～５個の修飾を含み、各修飾がアミノ酸の挿入、付加、削除および保存的置換から独立して選択される、配列番号１の治療上有効な変異体。
6. 前記非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）が非アルコール性脂肪肝炎（NASH）である、請求項５の使用のための、請求項５に記載の治療上有効な変異体。
7. 前記治療上有効な変異体が、配列番号１と比較して１～５個の修飾を含んでいる、請求項５または６に記載の使用のための、請求項５に記載の治療上有効な変異体。
8. 前記治療上有効な変異体が、配列番号１と比較して１～５個の修飾を含む、請求項５または６に記載の使用のための、請求項４から７のいずれか一項に記載の治療上有効な変異体。
9. 前記修飾が、配列番号１のアミノ酸の1つ以上をアミノ酸のD型で置換することを含む、請求項５または６に記載の使用のための、請求項４から８のいずれか一項に記載の治療上有効な変異体。
10. 前記修飾が、配列番号１の残基１、２、５、１０および１１から選択される少なくとも２つの残基をアミノ酸のＤ型で置換することを含む、請求項５または６に記載の使用のための、請求項９に記載の治療上有効な変異体。
11. 前記修飾が、配列番号１の残基１、２、５、１０および１１から選択される少なくとも３または４個の残基をアミノ酸のＤ型で置換することを含む、請求項５または６に記載の使用のための、請求項９に記載の治療上有効な変異体。
12. 前記治療上有効な変異体が、配列番号２で示される修飾ペプチドである、請求項５または６に記載の使用のための、請求項１１に記載の治療上有効な変異体。
13. 前記ペプチドが環化されている、請求項１または２に記載の使用のための、請求項１または３のいずれかに記載のペプチド。
14. 前記ペプチドが環化されている、請求項５または６に記載の使用のための、請求項５から１３のいずれか一項に記載の治療上有効な変異体。
15. 前記環化されたペプチドが配列番号３のペプチドである、請求項５または６に記載の使用のための、請求項１４に記載の治療上有効な変異体。

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