JP3561229B2 - CTp11遺伝子の検出方法及び腫瘍転移能の決定方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、診断、特にガンの診断のために、CTp11遺伝子(ガン/精巣関連11kDタンパク質)を使用する方法及びそれを使用することに関する。特に本発明は、転移能及び/又は進行能を有する悪性腫瘍におけるCTp11遺伝子の同定に関する。
【0002】
【従来の技術】
ガンが転移するためには、いくつかの課題、例えば細胞外マトリクス及び基底膜の分解、血管及びリンパ管への浸入及びそこからの浸出、免疫系による攻撃からの回避、並びに遠隔臓器への定着及びコロニー形成を克服する必要がある(Pardee,A.B.,Advances in Cancer Res.65(1994)213−227; Ponta,H.,et al.,Biochem.Biophys.Acta 1198(1994)1−10)。異なる型のガンは、その転移のために異なる分子機構を利用し、しかも異なる転移親和性を有することから、転移は更に複雑になる。
【0003】
転移性及び非転移性のヒトメラノーマ細胞株は、異なって発現される遺伝子を同定するために、そしてそれらの転移における役割を調べるために、重要な手段である(Weterman,M.A.J., et al., Cancer Res.52(1992)1291−1296; Weterman,M.A.J., et al., Int.J.Cancer 53(1993)278−284; Van Groningen,J.M., et al.,Cancer Res. 55(1995)6237−6243; Weterman,M.A.J., et al., Int.J.Cancer 60(1995)73−81; van Muijen, G.N.P., et al., Int.J.Cancer 48(1991)85−91; vanMuijen, G.N.P., et al., Clin.Exp.Metastasis 9(1991)259−272)。
【0004】
細胞接着分子は、腫瘍細胞の浸入、拡散、浸出及び定着において重要な役割を果たす。拡散した腫瘍細胞と内皮及び組織支質との相互作用は、腫瘍の進行及び転移形成における必須過程の1つであると考えられる(Ebnet,K.,et al., Annu.Rev.Immunol. 14(1996)155−177; Varner,J.A. and Cheresh,D.A., Curr.Opin.Cell Biol. 8(1996)724−730; Albelda,S.M., Lab.Invest. 68(1993)4−17)。
【0005】
CTp11は、EMBLデータベースに記載のポリペプチド配列AI962751, AA412605及びAA412270、並びにWO99/46374に記載の配列番号18及び配列番号75に相同なポリペプチドである。
【0006】
【発明の概要】
本発明では、驚くことに、タンパク質CTp11(ガン/精巣関連11kDタンパク質)が、転移性ガン細胞において、それの非転移性ガン細胞種に比べて増加調節されていることが見出された。CTp11は、転移カスケードのいくつかの過程の進行に関与し得る。CTp11は、転移性ガン細胞の特異的マーカーである。このことは、CTp11は、細胞障害性T細胞上にはMHCクラスI複合体を介して提示され得るが、CTp11が見出された非腫瘍細胞(精巣細胞)は、MHCクラスIを介して抗原を提示しないので、CTp11は自然には提示されていないという事実に依る。CTp11遺伝子は、配列番号2のポリペプチドをコードする。
【0007】
本発明は、少なくとも1つの特定の核酸又は核酸混合物の有無を検出する方法、すなわちその様な核酸を含むことが疑われる試料中で2つの異なる核酸配列を区別する方法を提供する。この方法は、下記の過程を順番で含んで成る:
(a)ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、前記試料を下記の群から選択される核酸プローブと共にインキュベーションすること:
(i)配列番号1及び3〜6の配列を有する核酸;
(ii)(i)の核酸配列に正確に相補的な配列を有する核酸;
(iii)ストリンジェントな条件下に(i)の核酸にハイブリダイズする核酸;及び
(iv)ストリンジェントな条件下に(ii)の核酸にハイブリダイズする核酸、
(b)前記ハイブリダイゼーションの形成を検出すること。
【0008】
更に本発明は、ガン細胞の検査試料が、腫瘍の進行能又は転移能を有するか否かを決定する方法を提供する。この方法は、検査試料と転移性のないガン細胞試料とを用い、この両試料は同一個体又は同一種の異なる個体から得たものであり、そして下記の過程を含んで成る:
(a)ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、各試料を下記の群から選択される核酸プローブと共にインキュベーションすること:
(i)配列番号1及び3〜6の配列を有する核酸;
(ii)(i)の核酸配列に正確に相補的な配列を有する核酸;
(iii)ストリンジェントな条件下に(i)の核酸にハイブリダイズする核酸;及び
(iv)ストリンジェントな条件下に(ii)の核酸にハイブリダイズする核酸;
(b)各試料における前記プローブとのハイブリダイゼーションの概量を決定すること;並びに
(c)検査試料のハイブリダイゼーションの概量を、転移性のない試料のハイブリダイゼーションの概量と比較することによって、検査試料中に、上記の特定の核酸又は核酸混合物が、転移性のない試料中よりも多く含まれるか否かを決定すること。
【0009】
【発明の実施の形態】
本発明は、診断、特にガンの診断のために、CTp11遺伝子(ガン/精巣関連11kDタンパク質)を使用する方法及びそれを使用することに関する。特に本発明は、転移能及び/又は進行能を有する悪性腫瘍におけるCTp11遺伝子の同定に関する。
【0010】
非転移性メラノーマ細胞株1F6及び、それに由来する転移性細胞株1F6mに対して差分表示法(Differential Display Technique)を用いた結果、転移性細胞株において少なくとも40倍増加調節されたCTp11が同定された(図1)。
【0011】
本発明に依れば、本核酸分子(CTp11)は、転移性細胞において、特に悪性メラノーマ細胞及び乳房カルシノーマ細胞において増加調節され、そしてその腫瘍の進行及び/又は転移を誘導することができる。本核酸(CTp11)は、配列番号1の配列を有するか、又は遺伝子コードの縮重のために配列番号1の配列とは異なるが、配列番号1の配列によってコードされるアミノ酸配列をコードする核酸を有する。
【0012】
単離されたCTp11ポリペプチドには、個体間で異なる天然の対立遺伝子に基づく変種が存在し得る。この様なアミノ酸配列の変種は、通常アミノ酸置換によるが、全配列中のアミノ酸の欠失、挿入又は付加による場合もあり得る。本発明のCTp11タンパク質は、程度及び種類の両方の点において発現に用いる細胞及び細胞の型に応じて、グリコシル化された又はされていない形に成り得る。転移活性を有するポリペプチドを、CTp11陰性の非転移性腫瘍細胞にCTp11発現ベクターをトランスフェクションし、安定な形質転換体を確立し、そしてマトリゲル浸入検査によるインビトロ浸入性及びヌードマウスへの異種移植による転移性の評価を行うことによって、同定することができる。
【0013】
「CTp11活性を有するポリペプチド又はCTp11」とは、微小なアミノ酸変異を有するが、実質的に同一のCTp11活性を有するタンパク質を意味する。「実質的に同一」とは、その活性が、同一の生物学的特性を有し、且つそのポリペプチドのアミノ酸配列が、相同である(少なくとも90%、好ましくは95%超)、好ましくは同一であることを意味する。相同性は、BLASTアルゴリズム(Altschul,S.F. et al., Nucleic Acids Res. 25(1997) 3389−3402)によって決定し得る。
【0014】
「核酸分子又は核酸」とは、ポリヌクレオチド分子を意味し、例えばDNA、RNA、又はDNA若しくはRNAの活性誘導体である。DNA及び/又はRNA分子が好ましい。
【0015】
「ストリンジェントな条件下にハイブリダイズする」とは、標準的なハイブリダイゼーション条件下に、2つの核酸断片が互いにハイブリダイズすることを意味し、この条件は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USAに記載されている。詳しくは、「ストリンジェントな条件」とは、250mmol/lリン酸ナトリウム緩衝液pH7.2、7%(w/v) SDS、1%(w/v) BSA、1mmol/l EDTA及び0.1mg/mlの一本鎖化したサーモン精子DNAから成るハイブリダイゼーション緩衝液中で65℃でハイブリダイゼーションすることを指す。最終洗浄は、125mmol/lリン酸ナトリウム緩衝液pH7.2、1mmol/l EDTA及び1%(w/v) SDS中で65℃で行われる。
【0016】
「核酸又はポリペプチド」とは、CTp11活性を有する核酸又はポリペプチドであって、組換えDNA技術によって生産する場合には細胞性物質又は培地を、化学合成する場合には前駆体の化学物質又は他の化学物質を実質的に含まないものを意味する。この核酸は、当核酸が得られた生物体において天然に当核酸を挟んでいる配列(すなわち当核酸の5’及び3’端部に位置する配列)を含まないことが好ましい。
【0017】
宿主細胞において発現ベクターを用いる組換え技術により、又は合成により本発明のポリペプチドを生産できる。原核生物中で組換え技術によって生産した場合、非グリコシル化CTp11ポリペプチドが得られる。本発明の核酸配列を利用すると、任意の希望の細胞(例えばヒト細胞、及び他の哺乳動物細胞)のゲノムにおいてCTp11遺伝子又はその変異体を検索し、同定し、そしてCTp11タンパク質をコードする所望の遺伝子を単離することができる。このための方法及び適当なハイブリダイゼーション条件は、当業者に周知であり、例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA及びHames,B.D., Higgins,S.G., Nucleic Acid Hybridisation − A Practical Approach (1985), IRL Press, Oxford, Englandに記載されている。本発明の実験のために、通常は前記文献に記載された標準的な方法を用いる。
【0018】
本発明の核酸を利用すると、再現性のある方法によって、そして大容量でCTp11タンパク質を生産することができる。原核生物又は真核生物中で、例えば原核宿主細胞又は真核宿主細胞中で発現させるために、当業者に周知の方法に従って本核酸を適当な発現ベクターに組み込む。この発現ベクターは、調節性/誘導性プロモーターを有することが好ましい。その発現のために、これらの組換えベクターを適当な宿主細胞に、例えば原核宿主生物として大腸菌、あるいは真核宿主生物としてサッカロミセス・セレビシエ、テラトカルシノーマ細胞株PA−1 sc 9117(Buttner et al., Mol.Cell.Biol. 11(1991) 3573−3583)、昆虫細胞、CHO又はCOS細胞に導入し、そして形質転換又は形質導入された宿主細胞を、当異種遺伝子が発現する条件下で培養する。既知の方法に従って、この宿主細胞又は宿主細胞の培養上清から当タンパク質を単離することができる。この様な方法は、例えばAusubel I., Frederick M., Current Protocols in Mol.Biol. (1992), John Wiley and Sons, New Yorkに記載されている。また細胞培養において当タンパク質が可溶性でない場合、インビトロでのタンパク質再活性化が必要である。
【0019】
組換え技術によって生産した後、既知のタンパク質精製法、例えば、親和性クロマトグラフィー、免疫沈降、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、等電点電気泳動、選択沈殿、又は電気泳動などを利用して、CTp11を精製することができる。
【0020】
本発明は、CTp11遺伝子の核酸分子を検出する方法に関する。この方法は、試料(例えば血液などの体液、細胞溶解物)を、本遺伝子に特異的に結合する核酸分子とインキュベーションすること、そしてCTp11遺伝子である核酸分子の存在を決定するために、ストリンジェントな条件下に、前記の単離核酸分子と標的核酸分子とのハイブリダイゼーションを測定することを含んで成る。従って本発明は、腫瘍細胞の転移能及び/又は進行を同定する方法にも関する。
【0021】
ガン細胞の検査試料が、腫瘍進行性又は転移性を有するか否かを決定するために、当単離核酸と標的核酸とのハイブリダイゼーションの概量を決定する。このハイブリダイゼーションを定量的に決定する必要はないが、この定量方法も本発明に含まれる。典型的にはハイブリダイゼーションの概量を、例えばハイブリダイゼーションの検出時に視覚的に検査することによって定性的に決定する。例えばゲルを用いて、試料中の標的核酸にハイブリダイズした標識化された核酸を分離した場合、生じたバンドを視覚的に検査することができる。同一種の個体に由来する転移性のないガン試料において当単離核酸のハイブリダイゼーションを行う場合、同一の方法を用いる。検査試料におけるハイブリダイゼーションの概量と、転移性のない試料におけるハイブリダイゼーションの概量を比較することによって、検査試料中に標的核酸が、転移性のない試料中よりも多量に含まれるか否かを決定することができる。特に視覚による検査の場合、視覚的に明白な差異によって、検査試料中により多量の標的核酸が存在することを評価することが薦められる。
【0022】
本発明に従って示された通り、転移した腫瘍の試料中には、転移性のない試料に比べてより多量のCTp11核酸が存在する。腫瘍進行性又は転移性を有する検査試料中には、転移性のないガン細胞試料に比べてより多量のCTp11核酸が含まれるであろう。検査試料においてCTp11核酸が増加調節されていること、すなわちそのガン細胞が腫瘍進行性又は転移性を有することを決定するために、その検査試料中のCTp11核酸の概量が、非転移性試料中の概量よりも明白に多いことが好ましい。例えば、CTp11遺伝子が増加調節された検査試料中のCTp11遺伝子量は、非転移性試料に比べて約15〜60倍多くなり得る。
【0023】
本発明の核酸に基づいて、転移性ヒト腫瘍細胞において発現が増加調節された核酸を検出するための検査法が提供され得る。この様な検査を、核酸診断法を利用して行うことができる。この場合、検査試料を、
(a)配列番号1及び3〜6の配列、又はこれらの配列のいずれかに相補的な配列を有する核酸、及び
(b)ストリンジェントな条件下で、(a)のいずれかの核酸とハイブリダイズする核酸、
から成る群から選択されるプローブと接触させる。この方法では、前記核酸プローブを試料中の核酸とインキュベーションし、そして生じたハイブリダイゼーションを、場合によって試料中の核酸及び/又は核酸プローブに対する別の結合体を利用して、検出する。(b)においてハイブリダイゼーションにより核酸を得るためには、配列番号3〜6の配列又はそれに相補的な配列を有するプローブとハイブリダイズすることが好ましい。前記核酸プローブと試料中の核酸とのハイブリダイゼーションは、当タンパク質をコードするRNAの存在を意味する。
【0024】
プローブと試料中の核酸とをハイブリダイズする方法は、当業者に周知であり、例えばWO89/06698, EP−A0200362, USP2915082, EP−A0063879, EP−A0173251, EP−A0128018に記載されている。
【0025】
好ましい態様では、前記検査の前に、例えば既存のPCR法によって、試料中のコード核酸を増幅する。一般的には核酸診断の範囲内で、誘導化(標識化)した核酸プローブを用いる。このプローブを、担体に結合した試料中の変性DNA又はRNAと接触させる。この時、標識DNA又はRNAが、相同なDNA又はRNAに結合する様に、温度、イオン強度、pH及びその他の緩衝液条件を、核酸プローブの長さと組成、更に予想されるハイブリッド体の融解温度に応じて選択する(Wahl,G.M. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA76(1979) 3683−3687)。適当な担体には、ニトロセルロースを基にした膜又は担体物質(例えばSchleicher and Schull, BA85; Amersham,Hybond C)、強化又は結合されたニトロセルロース粉末、あるいは種々の官能基(例えばニトロ基)によって誘導化されたナイロン膜(例えばSchleicher and Schull, Nytran; NEN, Gene Screen; Amersham, Hybond M; Pall Biodyne)がある。
【0026】
次に前記担体を十分に洗浄し、非特異的結合を抑えるためにその様な結合部位を飽和させた後に、それを抗体又は抗体断片とインキュベーションすることによって、ハイブリダイズしたDNA又はRNAを検出する。この抗体又は抗体断片は、ハイブリダイゼーションの際に核酸プローブに組み込んだ物質に対するものである。次にこの抗体を標識する。しかし直接に標識されたDNAを用いることもできる。抗体とインキュベーションした後、特異的に結合した抗体複合体だけを検出するために再度洗浄を行う。次に抗体又は抗体断片上の標識を利用して、既存の方法に従って測定を行う。
【0027】
発現の検出を、例えば以下の方法で行うことができる:
固定化細胞、固定化組織標本及び単離した中期染色体のin situハイブリダイゼーション;
コロニーハイブリダイゼーション(細胞の場合)及びプラークハイブリダイゼーション(ファージ及びウイルスの場合);
サザンハイブリダイゼーション(DNA検出);
ノーザンハイブリダイゼーション(RNA検出);
血清分析(例えばスロットブロット分析による血清中の細胞の種類分析);
事後増幅(例えばPCR法)。
【0028】
従って本発明は、メラノーマ及び乳房カルシノーマ細胞の転移能を検出する方法を含み、この方法は、
(a)ガン患者の体液、メラノーマガン細胞、乳房カルシノーマ細胞、又は前記ガン細胞の抽出物若しくは培養上清に由来する、核酸を有する試料を、
(i)配列番号1及び3〜6に示した核酸、又はそれらの核酸配列に相補的な配列の核酸、及び、
(ii)(i)のいずれかの核酸とハイブリダイズする核酸、
から成る群から選択した核酸プローブとインキュベーションすること、
並びに、
(b)試料中の核酸及び/又は核酸プローブに対する別の結合体を利用して、あるいはX線撮影法によって、ハイブリダイゼーションを検出すること、
を含んで成る。
【0029】
好ましくは、核酸プローブを試料中の核酸とインキュベーションし、そして、場合により試料中の核酸及び/又は核酸プローブに対する別の結合体を利用して、ハイブリダイゼーションを検出する。
従ってCTp11核酸は、患者の腫瘍細胞の転移能及び進行能の診断において、貴重な予測マーカーとなる。
【0030】
更に本発明は、その発現が腫瘍転移と相関するタンパク質を生産する方法を提供する。当方法は、原核又は真核宿主細胞中で外来性DNAを発現させ、そして希望のタンパク質を単離することに依るものであり、当タンパク質は、本発明の核酸分子、好ましくは配列番号1のDNA配列によってコードされる。
当タンパク質を、前記細胞又は細胞培養上清から単離し、そしてクロマトグラフィー法、好ましくはイオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー及び/又は逆相クロマトグラフィーによって精製し得る。
更に本発明は、本発明の核酸分子、好ましくは配列番号1のヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされた単離されたタンパク質を含む。
【0031】
CTp11は特に、腫瘍進行性遺伝子、及びメラノーマ細胞の転移能を示す増加調節性遺伝子として特徴づけられる。CTp11の機能は、腫瘍細胞における接触阻害及び足場依存性の損失を促進すること、並びに転移カスケードのその他の必須過程を促進することである。従ってCTp11遺伝子の発現は、腫瘍細胞のより攻撃的な性質に、そしてまた転移形成能に相関する。
【0032】
本発明では、腫瘍の進行/転移、好ましくは悪性メラノーマ及び乳房カルシノーマの進行/転移をインビボで、好ましくは体細胞遺伝子治療によって、抑制するために、CTp11の発現阻害剤、好ましくはアンチセンス核酸又は抗体を利用し得る。マウス又はラットを免疫化するために、前記通り精製したCTp11タンパク質を用いて、従来技術通りにCTp11タンパク質に対する抗体を作成し得る。
【0033】
総合的な特性から当遺伝子は、ガン/精巣抗原(CTAs)ファミリーに分類される。当ファミリーの最初の構成員は、MAGEs(メラノーマ抗原)であり、Boonのグループによって報告された(van der Bruggen et al., Science 254 (1991) 1643−1647)。
【0034】
完全長cDNAによってコードされる当タンパク質は、97アミノ酸から成り、2部に分かれた核局在化シグナル(NLS)を含む。eGFPの前部に当ORFを融合させたところ、特異的な核局在が認められたことから、この2部性様の核局在化配列は実際に作用する。当2部性NLSの共通配列は、10アミノ酸から成る領域によって塩基性クラスターから分離された2つの塩基性アミノ酸(リシン(K)又はアルギニン(R))を含んで成り、そのクラスターでは、隣接する5残基中3残基が塩基性でなければならない(Dingwall and Laskey, Trends.Biochem.Sci. 16 (1991) 478−481)。10アミノ酸から成る間隙部が最適であることが示されたが、より長い間隙部を有する有効な2部性核局在化シグナルも見出された(Robbins,J., et al.,Cell 64 (1991) 615−623)。このことから、12残基から成る間隙部を有するCTp11の2部性配列(a.a.40〜57)が核内局在化の原因である可能性が示される。ガン/精巣抗原グループに属するSSXファミリーのいくつかの構成員にも、2部性NLS配列が見出されている(Dos Santos,N.R., et al., Hum.Mol.Genet. 6 (1997) 1549−1558)。
【0035】
グルタミン酸残基の含有量が高い酸性C末端領域は、GAL4ドメインに類似していて、DNA結合タンパク質又はドメインと相互作用又は融合した後、有効な転写活性を示すことが示された(Mitchell,P.J. and Tjian,R., Science 245 (1989) 371−378)。CTp11は、SSXタンパク質(Dos Santos,N.R., et al., Hum.Mol.Genet.6 (1997) 1549−1558)及びメラノサイト特異的遺伝子1(MSG1)(Shioda,T., et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93 (1996) 12298−12303)と同様に、DNA結合ドメインを欠失している。従ってこれは、推定上の転写調節を協調するために転写開始複合体と相互作用する。含有量の高い荷電アミノ酸が、その様なタンパク質複合体相互作用に寄与するであろう。
【0036】
正常組織、腫瘍細胞株及び腫瘍試料中のCTp11の発現様式から、当遺伝子はガン/精巣抗原グループに分類され、既に当グループには、MAGE(Lucas,S., et al., Cancer Res. 58 (1998) 743−752)、BAGE(Boel,P., et al., Immunity 2 (1995) 167−175)、GAGE(van den Eynde,B., et al., J.Exp.Med. 182 (1995) 689−698)、SSX(Gure,A.O., et al., Int.J.Cancer 72 (1997) 965−971)、NY−ESO−1(Chen,Y.T., et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94 (1997) 1914−1918)、LAGE−1(Lethe,B., et al., Int.J.Cancer 76 (1998) 903−908)、PAGE−1(Chen,M.E., et al., J.Biol.Chem. 273 (1998) 17618−17625; Brinkmann,U., et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95 (1998) 10757−10762)、及びSCP−1(Tureci,O., et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95 (1998) 5211−5216)がある。
【0037】
ガン/精巣抗原ファミリーの構成員と見なすために遺伝子が満たすべき判断基準が、文献(Chen,Y.T., et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94 (1997) 1914−1918; Chen,Y.T., et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95 (1998) 6919−6923)に定式化されている:(i)精巣において優勢に発現していて、そして他の正常組織には通常発現していないこと、(ii)広範囲のヒト腫瘍においてそのmRNAの発現が誘導/活性化されていること、(iii)系統に非特異的な様式で、悪性腫瘍において発現していること、(iv)しばしば多重遺伝子族として存在すること、及び(v)いくつかの例外はあるが、当遺伝子がX染色体上にマッピングされること。CTp11は、判断基準i, ii, iii及びvを満たすので、CTAファミリーの構成員として明らかに適格である。
【0038】
CTp11遺伝子は、X染色体(Xq26.3−Xq27.1)上に存在し、PCRによって確認された通り、約665bpのイントロンによって分離された2つのエキソンから成る。この位置は、MAGE−Cサブファミリー(Lucas,S., et al., Cancer Res. 58 (1998) 743−752)の直ぐ隣りであり(Xq26)、CTAG(NY−ESO−1遺伝子)及びMAGE−Aクラスター(Chen,Y.T., et al., Cell Genet. 79 (1997) 237−249)の近くである(両方Xq28) 。
【0039】
CTp11発現は、検査したメラノーマ及び膀胱腫瘍の細胞株の25〜30%で認められたが、他の種類の腫瘍から確立された細胞株では、散発的な陽性が示された。CTA発現に関して最も研究されているメラノーマ細胞株では、当陽性率は、NY−ESO−1(18%)(Chen,Y.T., et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94 (1997) 1914−1918; Lethe,B., et al., Int.J.Cancer 76 (1998) 903−908)、SSX−2(25%)(Tureci,O.,et al., Int.J.Cancer 77 (1998) 19−23)、並びにMAGE−B1及び−B2(22%及び33%)(Lurquin,C., et al., Genomics 46 (1997) 397−408; Muscatelli,F., et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92 (1995) 4987−4991)の陽性率に匹敵する。MAGE−A1(66%)(Kirkin,A.F., et al., Exp.Clin.Immunogenet. 15 (1998) 19−32; Wang,R.F., Mod.Med. 3 (1997) 716−731)は、メラノーマ細胞株で著しく高い発現を示し、そして他のヒト腫瘍細胞株では41%で発現している。
【0040】
正常組織においてRT−PCRによって観察された精巣特異的な発現から、CTp11がただ精巣由来のEST のみと相同であることが保証される。新鮮なヒト腫瘍試料では、メラノーマが、最も高いCTp11陽性率(70%; n=10)を示した。比較し得る程度の陽性率が、原発性メラノーマ(4個中3個)、そして転移性メラノーマ(6個中4個)で観察された。この陽性率は、メラノーマにおけるその他のCTAに比べて、最も高いものの1つであろう。SCP−1, GAGE, BAGE, MAGE−1, SSX−2, NY−ESO−1及びMAGE−3(Sahin,U., et al., Int.J.Cancer 78 (1998) 387−389)の陽性率は、各々8, 17, 22, 35, 44, 44及び52%であった。膀胱細胞株における比較的高いCTp11陽性率(30%)は、膀胱腫瘍試料では検出されなかった。この場合、11試料中1つだけが陽性であった。
【0041】
興味深いことに、ネスト(nested)PCR後に17個の腫瘍病巣中10個だけが陽性であったことから、精巣腫瘍では、正常精巣組織に比べてCTp11発現が減少調節されていることが示された。最初のPCR後には、いずれの精巣腫瘍試料でも陽性が認められなかった。セミノーマ及び非セミノーマのいずれでも、当精巣病巣の陽性は、存在する少量の正常精巣組織によって誘導され得た。その他のCTAに関して、MAGE−1が、主に精巣中の生殖細胞に発現していることが知られていて(Takahashi,K., et al., Cancer Res. 55 (1995) 3478−3482)、この事実は、セミノーマでは、非セミノーマ腫瘍に比べてMAGE発現の陽性率が高いという事実に合致する(Hara,I., et al., Urology 53 (1999) 843−847)。
【0042】
相同性検索及び染色体位置の決定
全ての種類のデータベースを検討して、3つのヒトゲノムクローン(HS433M19,HS376H23, HSG164F24)に対して90%超の相同性が認められた。これらは全てX染色体上に位置した。HS433M19との相同性から、当遺伝子の位置がXq26.3〜Xq27.1に更に狭められた。一群のヒト染色体特異的な齧歯類動物/ヒトのハイブリッド細胞株に対するPCRから、当遺伝子がX染色体に位置することが確認された。ゲノムPCR産物の長さ、及び前記の3つのヒトゲノムクローンの配列に基づいて、当遺伝子は、塩基対112番の隣りに位置する約655bpのイントロンによって分離された2つのエキソンから成ることが推定された。
【0043】
cDNAレベルの相同性は、数個のヒトESTに限定され(zt95b09, qg57b01, qe04h11, EST95628/EST95629)、これらは全て精巣に由来するものであり、そして同一の推定上のタンパク質をコードした。相同性は、EMBLデータベースNo.AI962751,AA412605及びAA412270、並びにWO 99/46374の配列番号18及び75に対しても認められた。
【0044】
更に本発明は、CTp11のアンタゴニスト又はCTp11の発現阻害剤(例えばアンチセンスヌクレオチド)を同定及び単離する方法を提供する。この様なアンタゴニスト及び阻害剤を、腫瘍の進行又は転移を抑制するために、並びに腫瘍細胞の大量アポトーシスをインビボで誘導するために、利用することができる。
【0045】
本発明では、ガンを治療する際に、特に転移及び関連障害を抑制する際に利用できる化合物を同定及び単離する方法が提供される。当方法には、本発明のポリペプチドの発現を調節する方法、本発明のポリペプチドに選択的に結合する化合物を同定する方法、及び、当ポリペプチドの活性を調節する化合物を同定する方法が含まれる。更に当方法には、CTp11遺伝子のmRNAへの転写を調節する、好ましくは抑制する方法があり、この方法によって、好ましくは腫瘍細胞の転移能を減少調節する。当方法をインビトロ及びインビボで行うことができ、そして当方法では、本発明に関する細胞株及びトランスジェニック動物モデルを確立及び利用し得る。
【0046】
CTp11アンタゴニストは、CTp11ポリペプチドの生物活性を減少又は抑制する、及び/又はCTp11遺伝子の転写又は翻訳を阻害する物質又は化合物として定義される。一般的には、CTp11アンタゴニストをスクリーニングする方法は、CTp11活性を測定するために好ましい条件下で、CTp11の発現を介した侵襲性を呈する宿主細胞に候補物質を接触させることを含んで成る。
【0047】
いくつかの方法で、CTp11活性を測定し得る。典型的にはその活性化は、細胞の生理学的な変化、例えばインビトロでの運動性及び侵襲性の増加から、又は分化状態の変化から、又は増殖促進を誘導する細胞代謝の変化から明白である。
腫瘍細胞の増殖及び拡散を阻害する薬剤を同定及び設計するために、CTp11遺伝子及びタンパク質を利用し得る。
【0048】
本発明の理解のために、以下の実施例、参考文献、配列表及び図面を記載する。本発明の意図から逸脱することなく、本発明の修飾を行い得る。
配列番号1:CTp11のcDNA配列及びアミノ酸配列
配列番号2:CTp11のアミノ酸配列
配列番号3:センスプライマー
配列番号4:アンチセンスプライマー
配列番号5:ネストセンスプライマー
配列番号6:ネストアンチセンスプライマー
配列番号7:β2−ミクログロブリンのセンスプライマー
配列番号8:β2−ミクログロブリンのアンチセンスプライマー
【0049】
【実施例】
実施例1
材料及び方法
細胞株及び初代培養
検査群の8種類のヒトメラノーマ細胞株530, 1F6, MV1, M14, Mel57, BLM, MV3及び1F6mは、以前に報告されたものである(Westphal,J.R.,et al.,Br.J.Cancer76(1997)561−570)。この細胞株検査群では、530及び1F6は、転移性の乏しい細胞株であり、一方MV3, BLM及び1F6mは、転移性の高い細胞株である。MV1, M14及びMel57は、中間的な転移能を有する細胞株である。1F6mは、1F6の転移性亜株である。その他の大部分の使用した細胞株は、以前に報告されたものである(Zendman,A.J., et al., FEBS Lett. 446 (1999) 292−298)。細胞株RAMOS及びRAJIはATCCから入手される。BLMは、HLA−A1陰性のメラノーマ細胞株である。全ての細胞株を、以前の報告通り、ダルベッコ改変イーグル培地中で培養した(de Vries,T.J., et al., Cancer Res. 56 (1996) 1432−1439)。正常ヒト包皮メラノサイト及びヒト母斑細胞を、以前の報告通り培養した(Verbeek,M.M., Am.J.Pathol. 144 (1994) 372−382)。
【0050】
ヒト組織
オランダNijmegen大学病院で、メラノサイト腫瘍進行の全段階の病巣(一般母斑、異型母斑、原発性メラノーマ及び転移メラノーマ)、及びその他の腫瘍標本を患者から切り出した。正常ヒト組織として、外科的に切り出した組織に由来する、又は死後4時間未満の検死試料に由来する疾病を含まない試料を用いた。組織試料を液体窒素中でスナップ式に凍結し、そして使用まで −80℃で保存した。
【0051】
RNAの単離
RNeasyキット(Qiagen, Hilden, Germany)を用いて、その取扱説明書に従って培養細胞から総RNAを単離した。乳棒を用いて1mlのRNAzolBTM(Campro, Veenendaal, The Netherlands)中で、厚さ20μmの約25個の凍結切片を破砕することによって、組織試料から総RNAを単離した。RNAzolBTM工程に続いて、追加のRNeasyの洗浄工程を行った。
【0052】
mRNA差異表示(differential display)
差異表示PCRの開始前に、Message−CleanTMキット(GenHunter Corporation, Nashville, TN)によってRNA試料に対してDNアーゼI処理を行った。差異表示のために、いくつかの微小な変更を加えてRNAmapTMの方法を行った。元の方法とは異なり、[35S]−dATPの代わりに[32P]−dATPを用いた。このPCRのために、4つのT12MNプライマー及び6つの任意プライマーAP1,2,6,7,11,12(Bauer,D.,et al., Nucleic Acids Res. 21 (1993) 4272−4280)の組合せを用いた。
【0053】
ノーザンブロット分析
10μgの総RNAを、グリオキサール/DMSOで処理し(Sambrook et al., MolecularCloning: A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA)、1.2%アガロースゲル上で分離し、そしてHybond N+膜(Amersham, Aylesbury, UK)に転写した。ランダムプライマーによるDNA標識キット(Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Germany)を用いて、cDNAプローブを[32P]−dATPで放射性標識した。この膜を標識プローブによって、ハイブリダイゼーション混合液(0.25Mリン酸ナトリウム緩衝液 pH7.2, 7% SDS, 1% BSA, 1mM EDTA, 0.1mg/ml一本鎖のサーモン精子DNA)中で65℃で一晩ハイブリダイズした。その後この膜を、段階的に低下させた量の塩を含有する緩衝液(1% SDS, 1mM EDTA, 125mMリン酸ナトリウム pH7.2)によって65℃で洗浄し、そしてKodak Xomat−Sフィルムでオートラジオグラフィーを行った。
【0054】
cDNAライブラリーのスクリーニング、配列決定及び相同性検索
Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USAに記載の通り、cDNAプローブを標識し、そしてヒトメラノーマ細胞株(MV3)のλZAP cDNAライブラリーとハイブリダイズさせた。完全長のcDNAを単離した後、Dye Terminator Reaction Mix(Perkin Elmer, Norwalk, CT)によって、その両鎖の配列を決定した。BLAST (Altschul,S.F., et al., Nucleic Acids Res. 25 (1997) 3389−3402)によって、並びに以前に報告された通りに(Zendman,A.J., et al., FEBS Lett. 466 (1999) 292−298)、DNA及びタンパク質データベースに関する全ての公的サーバー上の他のプログラムによって、相同検索を行った。
【0055】
RT−PCR
AMV RTキット(Roche Diagnostics GmbH)を用いて、0.5−1.0μgの総RNAからcDNA合成を行った(25℃10分間後、42℃59分間)。当反応液に、0.04単位のランダムヘキサデオキシヌクレオチドプライマー、2μlの25mM MgCl2、1μlの10mM dNTPs、1μlのRT緩衝液(100mM Tris/HCl pH8.3, 500μM KCl)、25単位のRNasin、10単位のAMV逆転写酵素、及び、最終容量を10μlにするための水を添加した。増幅のために、合成されたcDNAの10分の1に、2.5μlのPCR緩衝液(200mM (NH4)2SO4, 750mM Tris/HCl pH9, 0.1% Tween), 5μlの1M dNTPs、10pmolesの各プライマー、2.5μlの15mM MgCl2、0.15単位のThermoperfectplusTM DNAポリメラーゼ(Integro, Zaandam, The Netherlands)、及び、最終容量を25μlにするための水を添加した。このPCRでは、94℃45秒間、59℃1分間及び72℃1分30秒間の反応のサイクルを30回行った。この反応前に94℃3分間の変性を行い、反応後に72℃5分間の伸長を行った。下記のプライマーの組合せを用いた。
センス:5’−CTGCCGCAGACATTGAAGAA−3’(配列番号3)
アンチセンス:5’−TCCATGAATTCCTCCTCCTC−3’(配列番号4)
【0056】
このPCR産物の長さは297bpであった。ネストPCRを行う場合、90℃30秒間、59℃45秒間及び72℃1分間のサイクルを30回行い、やはり最初のPCRと同様に、反応前に変性過程、及び反応後に伸長過程を行った。このネストPCRのために、最初のPCRの産物溶液の100倍希釈液2μlを、やはり最終容量25μl中で用いた。下記のネストプライマーを用いた。
センス:5’−TGTGAATCCAACGAGGTGAA−3’(配列番号5)
アンチセンス:5’−TTGATTCTGTTCTCTCGGGC−3’(配列番号6)
ネストPCRの産物の長さは188bpであった。
下記のβ2−ミクログロブリン用プライマーを用いた。
センス:5’−CTCGCGCTACTCTCTCTTTCT−3’(配列番号7)
アンチセンス:5’−TGTCGGATTGATGAAACCCAG−3’(配列番号8)
β2−ミクログロブリンのPCR産物の長さは136bpであった。
【0057】
染色体上の位置決定
当遺伝子の染色体上の位置を、検査群のハムスター/ヒト及びマウス/ヒトのハイブリッド細胞株(Kondoh,M., et al., Melanoma Res. 3 (1993) 241−245)に対するゲノムPCRによって決定した。このPCRのために、前記の最初のPCRにおけるイントロン部分を含むプライマーを用いて、1kbのPCR産物を増幅した。
【0058】
プラスミド作成及びトランスフェクション
局在化を調べるために、停止コドンを含まない完全長の当ORFを含む断片(1〜330bp)を、pEGFP−N3(Clontech, Palo Alto, CA)のSacI/KpnI部位にクローン化した。これによって、アミノ酸RSIATをコードするリンカーを介して前記断片をeGFPのC末端に融合させた。その配列を決定することにより、融合体の読み取り枠が連続であることを確認した。トランスフェクション試薬FuGENETM6(Roche Diagnostics GmbH)を用いてトランスフェクションを行った。要するに、BLM細胞を6ウエルプレートにまき、全面密集になる手前まで増殖させた。2mlの培地中で1μgのプラスミド構成体及び3μlのFuGENETM6によってトランスフェクションした。48時間以内に、当融合タンパク質の一過的な発現を確認した。ジェネティシン(Geneticin)(Roche Diagnostics GmbH)(500μg/μl)によって安定な形質転換体を選択した。
【0059】
当融合タンパク質の発現を視覚化するために、6ウエルプレート中でカバーグラス上で増殖させた細胞を、4%パラホルムアルデヒドによって室温で15分間固定し、次に−20℃でアセトン中に2分間浸けた。空気乾燥したカバーグラスをスライドグラスにのせ、1:4 Vectashield(Vector, Burlingame, CA)及び1:10,000 DAPI(Sigma, Zwijndrecht, The Netherlands)を含む10μlのグリセロール/Tris緩衝液(100mlあたり90mlグリセロール、2ml Tris/HCl pH8、8ml H2O)を添加した。その蛍光画像を、CCDカメラ付きの蛍光顕微鏡によって得た。
【0060】
ウエスタンブロット分析
培養細胞をSDS溶解緩衝液(1% SDS, 5mM EDTA, 10μg/mlロイペプチン(Sigma),200μg/ml AEBSF(Sigma)及び10μg/mlキモスタチン(Sigma)/PBS)中で溶解した。それを遠心した後、等量の上清タンパク質を、非還元性試料用緩衝液によって1:1に希釈し、そして沸騰水中で5分間熱処理した。これらの試料を、マーカータンパク質と共に10%ゲルのSDS−PAGEによってサイズ分画し、次にブロティング緩衝液(25mM Tris/HCl pH8.6, 192mMグリシン, 20%メタノール及び0.02% SDS)中でニトロセルロース膜に電気的に転写した。分子量の指標として、マーカーのレーンを切り離し、アミドブラック(0.1%アミドブラック/45:10:45のメタノール:酢酸:水)によって染色した。ブロット膜をPBST中で15分間洗浄してから、ブロッキング溶液中で室温で一晩インキュベーションした。その際、5%低脂肪粉乳及び0.01%消泡剤A(Sigma)を含むPBSTを用いた。このブロット膜を、1次抗体として抗eGFPポリクローナル抗体と、そして2次抗体としてペルオキシダーゼ結合ブタ抗ウサギ抗血清(Dako, Glostrup, Denmark)と各々1時間インキュベーションした。全てのインキュベーションはブロッキング溶液中で行われ、そして各工程の後にブロット膜をPBSTによって10分間3回洗浄した。ECL化学発光系(Roche Diagnostics GmbH)によって、取扱説明書通り検出を行った。次にブロット膜をKodak Xomat−Sフィルムに露光し、そして現像した。
【0061】
実施例2
CTp11の単離及びクローニング
プライマーT12MAとAP1(Bauer,D.,et al., Nucleic Acids Res. 21 (1993) 4272−4280)との組合せを用いた差異表示法によって、ヒトメラノーマ細胞株1F6と1F6mとの間でmRNA発現を比較した。その結果、発現差のある300bpのcDNAバンドが生じた。このバンドは、1F6mのレーンには多量に存在するが、1F6のレーンには存在しなかった。ヌードマウスに皮下接種した後の転移性が判明しているヒトメラノーマ細胞株の広範囲な検査群において発現を調べるために、前記の300bpのcDNAをプローブとしてノーザンブロット分析を行った。その結果、約0.5kbのmRNAが、転移性の高い細胞株MV3、BLM及び1F6mにおいて特異的に発現していることが判明した(図1)。転移性が中位の細胞株及び低い細胞株では、その様な発現は認められなかった。
【0062】
完全長のcDNAクローンを単離するために、前記の300bpのcDNA断片をプローブとして、メラノーマ細胞株MV3のλZAP cDNAライブラリーをスクリーニングした。408bpのcDNAが単離された(EMBL: AJ238277)。配列決定の結果、当cDNAは、3’側で前記プローブと完全に一致し、そして97アミノ酸から成るタンパク質をコードするORFを有することが判明した。この推定タンパク質は、潜在的な2部性の核局在化シグナル(NLS)(a.a. 40〜57)を有するが、このシグナルは完全な共通配列を有するものではない(Dingwall and Laskey, Trends.Biochem.Sci. 16 (1991) 478−481)。もう1つの著しい特徴は、グルタミン酸残基の含有量が高いこと(14%)であり、それらによって酸性のC末端クラスター(a.a. 83〜89)が形成されている。全残基の3分の1が荷電性(18残基陰性、14残基陽性)であり、推定分子量は11kDである。当タンパク質のpIは5.0と計算される。
【0063】
実施例3
CTp11の発現様式
転移性が判明しているヒトメラノーマ細胞株の検査群に対するノーザンブロット分析に加えて、それらの細胞株のRNAに対してRT−PCR分析も行った。このPCRの結果、ノーザンブロット分析で認められたメラノーマ細胞株の発現パターンが確認された(表1)。
【0064】
【0065】
特異的な産物を、転移性の高い細胞株である1F6m、MV3及びBLMにおいてのみ検出することができた。対応する異種移植物に対するRT−PCR分析から、培養細胞での発現様式に完全に一致する発現様式が示された。ヌードマウスモデルによって調べられていないより多様なヒトメラノーマ細胞株の一群の分析から、その15細胞株中3つ(BRO, E10及び518A2)で発現が認められた(表2)。
【0066】
a 表1に挙げたメラノーマ細胞株を含む。
【0067】
その他の種類の悪性腫瘍に由来する細胞株における発現に関して(表2)、膀胱カルシノーマ細胞株17個中5個で発現が認められ、一方腎臓カルシノーマ細胞株6個、及び前立腺カルシノーマ細胞株7個では、当遺伝子の発現は無かった。最後に、既に記載したもの以外の他の組織学的に異なる種類に由来する細胞株16個中、たった2個だけが陽性を示した(線維肉腫HT1080及び骨肉腫U2OS)。
正常ヒト組織における当遺伝子発現のRT−PCR分析を、図3に示す。検査した17種類の組織中、精巣のみが陽性であった。
【0068】
腫瘍進行の全段階を網羅する一連のメラノサイト病巣を、当遺伝子転写に関して検査した(図4)。ネストRT−PCR分析から、メラノサイト腫瘍進行度の高い段階でのみ、PCR産物が検出された。原発性メラノーマ(PM)4個中3個、及び転移メラノーマ(MM)6個中4個が陽性であった。正常皮膚(NS)、細胞増殖型一般母斑(NN)及び異型母斑(AN)では発現は認められなかった。正常包皮メラノサイトの初代培養及び母斑細胞の培養もまた陰性であった。
追加の新鮮な正常ヒト組織試料、及び同一種類の組織に由来する腫瘍病巣での発現も決定した。この結果を表3に要約する。
【0069】
a 正常皮膚;b 陽性は、混入した正常組織によるものであろう。
【0070】
正常組織のネストPCRでは、3個の精巣試料のみで発現が見られたが、これらは、最初のPCR(30サイクル)後に既に陽性であった。その他の正常組織では、PCR産物は全く無かった。腫瘍組織では、肺(5個中1)、乳房(4個中1)、結腸(9個中2)及び膀胱(11個中1)で、散発性に発現が見られただけであった。膵臓(n=5)及び食道(n=6)は陰性であった。検査した精巣病巣では、17個の腫瘍試料中10個が、ネストPCR後にのみ陽性を示したが、3個の正常精巣試料は、最初のPCR後に既に陽性を示した。
【0071】
実施例4
CTp11の分子量の決定及び細胞内局在
当タンパク質の分子量を決定するために、BLM形質転換体の細胞溶解物に対して、融合タンパク質を検出する抗eGFPポリクローナル抗体を用いて、ウエスタンブロット分析を行った。図5から、トランスフェクションした細胞が、当融合タンパク質を発現することが明白である。トランスフェクションしていないBLM細胞の溶解物のレーンには、特異的なバンドは見られない。eGFP(27kD)と当融合タンパク質(38kD)との分子量の差から、当タンパク質の大きさが約11kDであると推定された。mRNAの発現様式及び分子量に基づいて、当タンパク質をCTp11:ガン/精巣関連11kDタンパク質と名付けた。
【0072】
CTp11の細胞内局在を調べるために、完全長の当ORFをeGFPの前に融合して、それをCOS−1細胞にトランスフェクションした。コントロールとして、eGFPのみをコードする構成体をCOS−1細胞にトランスフェクションした。eGFPのみをトランスフェクションしたCOS−1細胞を蛍光顕微鏡で観察したところ、eGFPタンパク質は、予想通り細胞質及び核の両方に存在することが判明した(図6A〜C)。一方融合タンパク質を発現するCOS−1細胞では、この発現タンパク質は特異的に核に局在した(図6D〜F)が、核小体には明らかに検出されなかった。ヒトメラノーマ細胞株BLMにトランスフェクションした場合にも、同様の核局在を示す匹敵する結果が示された。
【0073】
実施例5
本発明のタンパク質の活性調節因子を同定する方法
実施例1に記載した発現ベクターを、当分野の標準的な方法(Sambrook et al.)によってNIH3T3にトランスフェクションする。当ベクターを取り込んだ細胞を、選択条件下、すなわちジェネティシン存在下での増殖能によって同定する。CTp11をコードするDNAを発現する細胞は、そのRNAを生産するので、それを実施例1に記載の通りノーザンブロット分析によって検出する。あるいは当タンパク質を発現する細胞は、特異的抗体を用いたウエスタンブロット分析によるタンパク質の同定を介して同定される。当発現ベクターから当タンパク質を発現する細胞は、実施例3に従って測定される通り、転移能を発揮するだろう。
【0074】
当タンパク質を発現する細胞を、推定調節因子の存在下又は非存在下で培養する。細胞増殖を調べるための高処理量の細胞検査を行って、化学薬品及び天然物のライブラリーをスクリーニングすることによって、前記化合物を同定し得る。前記検査には、発色性基質としてテトラゾリウム塩WST−1, MTT又はXTTを用いた細胞増殖検査、あるいはブロモデオキシウリジン(BrdU)を用いた細胞死検出用ELISAがある(Boehringer Mannheim GmbH, Apoptosis and Cell Proliferation, 2nd edition, 1988, pp.70−84参照)。
【0075】
当調節因子化合物は、CTp11タンパク質活性を介する細胞応答を低下させるであろうから、CTp11機能の抑制因子となるであろう。
あるいは、抑制因子候補を培養腫瘍細胞に添加すると、その細胞の転移能が低下変動する。推定調節因子を、CTp11タンパク質を有する又は有さない細胞に加え、その細胞応答を、その細胞の増殖特性から検査する。
【0076】
実施例7
抗CTp11抗体
組換え生産したCTp11ポリペプチドをBSAに結合する。初回免疫のために、この免疫原を別々に皮間に免疫接種し(500μg免疫原+フロイントアジュバント)、更に免疫増幅のために静脈内に免疫接種する(500μg免疫原+フロイントアジュバント)。各免疫増幅の1週間後に血液を試験採取し、抗原としての当免疫原及び完全長のCTp11タンパク質に対する結合を検査した。
【0077】
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WO 99/46374
Zendman, A.J., et al., FEBS Lett. 446 (1999) 292−298
【0078】
【表1】
【表2】
【表3】
【0079】
【配列表】
【0080】
【0081】
【0082】
【0083】
【0084】
【図面の簡単な説明】
【図1】ヌードマウスへ皮下注射した後に異なる転移能を示す検査群のヒトメラノーマ細胞株のノーザンブロット分析。当ブロットは、差分表示法による300bpのcDNAによりハイブリダイズする。矢印は、転移性の高い細胞株にのみ存在する0.5kbのバンドを示す。レーン1:530;レーン2:1F6;レーン3:M14;レーン4:Mel57;レーン5:MV3;レーン6:BLM;レーン1:1F6m。
【図2】CTp11のcDNA配列及び推定したアミノ酸配列。PCRに用いたプライマーを矢印で示す(最初のPCR:太矢印;ネストPCR:細矢印)。ポリアデニル化シグナルを下線で、推定した核局在化シグナルを箱枠で、そしてポリE酸性ドメインを二重下線で示す。停止コドンを星印で示す。
【図3】(A)17種類の新鮮な正常ヒト組織から単離されたRNAに対するRT−PCR。精巣のみが陽性である(297bpのcDNAバンド)。数種の試料で、弱いゲノムDNAバンドが視認される(1kb)。(B)コントロールとしてのβ2−ミクログロブリンのRT−PCR(136bp)。
【図4】(A)正常ヒト皮膚の試料から単離されたRNA、及びメラノサイト腫瘍進行の種々の段階の病巣を含む組織試料から単離されたRNAに対するRT−PCR(188bp)。NS=正常皮膚;NN=細胞増殖型一般母斑(common naevus naevocellularis);AN=異型母斑;PM=原発性メラノーマ;MM=転移性メラノーマ。(B)コントロールとしてのβ2−ミクログロブリンのRT−PCR(136bp)。
【図5】BLM(レーン1)、eGFPのみを有する構成体をトランスフェクションしたBLM(レーン2)、及び当該完全長cDNA/eGFP融合体を有する構成体をトランスフェクションしたBLM(レーン3)から調製した細胞抽出物のウエスタンブロット分析。eGFPに対するポリクローナル抗体によってバンドを検出した。27及び38kDのバンドは特異的であり、50kDのバンドは非特異的である。
Claims (1)
- ガン細胞を含む検査試料が、腫瘍の進行能又は転移能を有するか否かを決定する方法であって、同一個体又は同一種の異なる個体から得た前記検査試料及び転移性のないガン細胞を含む試料を用いて、下記の過程を含んで成る前記方法:
(a)ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、各試料を下記から成る群から選択される核酸プローブと共にインキュベーションすること:
(i)配列番号1及び3〜6のいずれかの配列を有する核酸;
(ii)上記(i)のいずれかの核酸配列に正確に相補的な配列を有する核酸;
(iii)ストリンジェントな条件下に上記(i)の核酸にハイブリダイズする核酸;及び
(iv)ストリンジェントな条件下に上記(ii)の核酸にハイブリダイズする核酸、
(b)各試料における前記プローブによるハイブリダイゼーションの概量を決定すること;並びに
(c)検査試料中に、上記の特定の核酸又は核酸混合物が、転移性のない試料中よりも多く含まれるか否かを決定するために、検査試料のハイブリダイゼーションの概量を、転移性のない試料のハイブリダイゼーションの概量と比較すること。
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