JP3546410B2 - 磁性粒子を使用する精製方法 - Google Patents
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Description
発明の背景
本発明は、混合物から物質を特異的に結合する磁性粒子を使用するの生物物質の精製に関する。本発明は例えば、核酸DNAまたはRNAを精製するために使用できる。
【0002】
磁性粒子は所望の生物物質と特異的に反応する分離試薬で被覆することができる。前記粒子および結合された物質は混合物から分離され、そしてその後該物質はさらに次の操作遂行のため前記粒子から離される。現今これは、実際には磁石により粒子を混合物を含む容器の壁に対して引き寄せ、そして液体は容器から流し出されるかまたは吸い出される。その後新しい液体を容器に分配することができる。このような分離技術に対する手動装置または自動装置はまた、商業的に入手可能である(例えば、セフェロテック社(Spherotec,Inc.)のオートマグプロセッサ(AutoMag Processor)(アメリカ合衆国)、メルクマグネティックラック(Merck Magnetic Rack)(ドイツ、ダルムシュタット)、パーセプティブバイオシステムズ96ウェルプレートセパレータ(PerSeptive Biosystems 96 well plate separator), マルチ−6セパレータ(Multi−6 Separator)、ソロ−セプ セパレータ(Solo−Sep Separator)(アメリカ合衆国),ダイナルマグネティックパーティクルズコンセントレーターズ(Dynal Magnetic Particles Concentrators))。
【0003】
旧式のDNA精製技術は濃厚な塩化セシウム勾配中における超遠心分離を必要とした。しかし、上述した磁性粒子技術もまた核酸の精製に使用されている。
【0004】、
WO94/18565(ラブシステムズ オイ(Labsystems OY))は、磁性粒子が、垂直穴中で移動可能でかつその下端部に磁石を備えたロッドを含むプローブによって混合物から分離可能な、磁性粒子特異結合アッセイ(magnetic particle specific binding assay)のための方法および装置を提案する。前記プローブは、低位置にあるロッドとともに混合物中に押し入れられ、そこで粒子はプローブ上に収集される。次いでプローブを他の容器に移動しそしてそのロッドはその高位置に引き上げられ、そこで粒子が離される。従って、アッセイの全ての段階は液体を移動することなく別の容器で行うことができる。最後の容器では測定が実施される。
【0005】、
WO96/12959(ラブシステムズ オイ)は、凹状に先細にされた先端部を有する細長い本体よりなる磁性粒子移動器具を提案する。前記本体は、該本体の先端に粒子を収集するための縦方向の磁場を備えるための手段をさらに含む。前記磁場は前記粒子を放出するため除去できる。この器具は特に、大容積から粒子を収集し、そして非常に少ない容積中にそれを放出するのに使用できる。
【0006】
発明の概括的説明
請求項1に記載された方法がいまや発明された。この発明の幾つかの好ましい態様は他の請求項において規定されている。
【0007】
本発明によれば、精製されるべき材料は、材料のための結合試薬で被覆された磁性粒子を含む第一の媒質に、分配される。結合反応が行われ、その後該粒子は磁気プローブにより分離され、そして第二の媒質に移動され、そこで精製のために必要な所望の他の反応を行うことができる。粒子は、精製方法のより先の段階を遂行するために他の媒質を介して同様に移動することができる。粒子が容器中に移される場合、全ての容器は必要な反応媒質を前もって含むことができる。好ましくは粒子はまた第二およびその次の媒質においてプローブから放出される。
【0008】
本発明によれば、媒質の少なくとも一つは表面張力除去剤(surface tension releasing agent)を含む。これは粒子の完全な収集を促進する。
【0009】
これらの薬剤の幾つかは、この分離されるべき物質の結合を促進することに関連して以前から使用されている。例えばWipat et al.,Microbiology (1994), 140, 2067を参照。これらの公知の方法では、粒子は容器から他の容器へ移されず、しかし、それらは外側にある磁石によって容器の壁に保持され、同時に媒質は容器から除去される。
【0010】
本発明は、一本鎖DNA(ssDNA)、二本鎖DNA(dsDNA)およびmRNAのような核酸を精製するために、特別に使用できる。
【0011】
[図面の簡単な説明]
添付された図面は記載された明細書の一部となる。
図1は磁性化された粒子の収集段階および放出段階におけるディタージェントの効果を示す。
図2は収集および放出緩衝液における塩およびサッカロースの効果を示す。
図3は収集および放出緩衝液におけるタンパク質の効果を示す。
図4は異なる供給元からの磁性粒子を使用した場合のディタージェントの効果を示す。
【0012】
発明の詳細な説明
本発明は例えば細胞、ウィルス、亜細胞性の細胞小器官、タンパク質および、特に核酸材料の精製のために使用できる。
【0013】
磁性粒子は好ましくは常磁性体である。粒子の大きさは通常50μmより小さく、好ましくは0.1ないし10μm、および最も好ましくは1ないし5μmである。粒子の濃度は例えば0.01ないし5mg/ml、好ましくは0.05ないし3mg/ml、そして最も好ましくは0.2ないし2mg/mlである。
【0014】
粒子は結合試薬、例えばシリコン、レクチンによりおよび/または、オリゴヌクレオチド、抗体、抗原、ストレプトアビジンまたはビオチンのような他の反応性官能性グループにより被覆されまたは処理されている。
【0015】
粒子はまた、好ましくは、垂直方向の穴中で移動可能で、かつその下端部に磁石を備えたロッドを含むプローブを使用することによって一つの容器から他の容器へ移される。プローブは低位置あるロッドとともに混合物中に押し込まれ、それにより粒子がプローブ上に収集される。次いでプローブは他の容器に移され、そして前記ロッドが該プローブの高位置に引き上げられた時に、前記粒子が放出される。
【0016】
様々な種類の表面張力除去化合物、特に水溶性化合物を、上記方法に使用できる。それらの例は以下のものである:
A.界面活性剤(tenside)、例えば
− セッケン
− ディタージェント;アニオン性、カチオン性、非イオン性および両性イオン性化合物
B.アルコール、例えば
− ポリエチレンおよびポリビニルアルコールおよびそれらのタンパク質等の誘導体。
C.タンパク質
D.高濃度の塩および炭化水素例えば
− NaCl
− サッカロース
化合物の混合物もまた使用できる。
【0017】
特にディタージェントような界面活性剤が好ましい。好ましいディタージェントはエトキシル化無水ソルビトールエステルである。該エステルは例えば約4ないし20個のエチレンオキシド基を含む。
【0018】
界面活性剤の濃度は例えば0.001ないし0.5%(w/v)、好ましくは0.005ないし0.1%(w/v)、および最も好ましくは0.01ないし0.05%(w/v)であってよい。
タンパク質の濃度は例えば0.1ないし10%(w/v)、好ましくは0.25ないし5%(w/v)、および最も好ましくは0.5ないし2%(w/v)であってよい。塩の濃度は例えば0.1ないし10M、好ましくは0.1ないし7Mであってよい。
【0019】
異なる供給源からのDNAまたはmRNA(例えば、PCR増幅からのDNA;血液、骨髄、培養細胞からのDNA;真核生物の全RNAからのまたは動物組織、細胞および植物の粗抽出物からのmRNA)の精製のために、核酸は磁性粒子を使用して固定化される。結合はストレプトアビジンおよびビオチンの相互作用により媒介でき、それによりストレプトアビジンで被覆された粒子およびビオチニル化された(biotinyled)DNAが使用できる。加えて、DNAは粒子の表面に吸着できる。mRNAの結合は粒子の表面と共有結合的に共役されるオリゴ(Oligo)(dT)25によって媒介することができる。
【0020】
固定化の後、増幅または他の汚染物および例えばPCRインヒビターから生じる反応成分のすべてを除去するように、核酸は数回洗浄される。
洗浄は洗浄緩衝液中の複合体を放出しおよび収集することにより、および新らしい洗浄緩衝液を含む他のウェルに複合体を移動することにより行われる。
【0021】
一本鎖DNA精製のためには固定化された二本鎖DNAは、0.1M NaOHトとのインキュベーションにより一本鎖に変換できおよび磁性分離を使用できる。
【0022】
mRNAの単離には低濃度塩緩衝液を使用することにより粒子から溶出することができる。
【0023】
精製方法は、すべての媒質が別々の容器に用意される、磁性粒子プロッセッサによって行うことができる。表面張力除去化合物は好ましくは各々の媒質に使用される。必要な容器を含む適当な使い捨てのプレート、例えば微量滴定プレートを使用することができる。一つのプレートで、幾つかの並行精製を成し遂げることができる。
【0024】
一本鎖DNA精製のために使用される試薬例
1. 例えば、0.1%BSA、15mM NaN3ならびに、表面張力除去剤として例えば0.02%ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート(登録商標Tween20TM)を含むホスフェート、トリスまたはボレート緩衝性塩水、pH7.4中の粒子懸濁液。
2. 結合および洗浄緩衝液(TEN):10mMトリス−HCl、1mM EDTA、2M NaCl、例えば0.02%Tween20TM、15mM NaN3、pH7.5。
3. TE緩衝液:10mM トリス−HCl、1mM EDTA、例えば0.02%Tween20TM、15mM NaN3、pH7.5
4. 融解溶液:0.1M NaOH、例えば0.02%Tween20TM。
5. 例えば蒸留水中の0.02%Tween20TM、15mM NaN3。
【0025】
mRNA直接精製のために使用される試薬例
1. 例えば0.02%Tween20TMおよび15mM NaN3を含むPBS、pH7.4中のオリゴ(Oligo)(dT)25粒子懸濁液。
2. 溶菌/結合緩衝液:100mMトリス−HCl、pH8.0、500mM LiCl、10mM EDTA、1%LiDS、5mMジチオスレイトール(DTT)、15mM NaN3、(例えば0.02% Tween20TM)。
3. LiDS(SDS)を伴う洗浄緩衝液:10mM トリス−HCl、pH8.0、0.15M LiCl、1mM EDTA、0.1%LiDS、15mM NaN3、(例えば0.02% Tween20TM)。
4. 洗浄緩衝液:10mM トリス−HCl、pH8.0、0.15M LiCl、1mM EDTA、例えば0.02% Tween20TM、15mM NaN3。
5. 溶出溶液:2mM EDTA、pH8.0、15mM NaN3、例えば0.02% Tween20TM。
6. 回復溶液:0.1M NaOH、例えば0.02% Tween20TM
7. 貯蔵緩衝液オリゴ(dT)25:250mM トリス−HCl、pH8、20mM EDTA、0.1% Tween20TM、15mM NaN3。
【0026】
mRNA精製のために使用される試薬例
1. 結合緩衝液:20mM トリス−HCl、pH7.5、1.0M LiCl、2mM EDTA、15mM NaN3、例えば0.02% Tween20TM。
2. 洗浄緩衝液:10mM トリス−HCl、pH8.0、0.15mM LiCl、1mM EDTA、15mM NaN3、例えば0.02% Tween20TM。
5. 溶出溶液:2mM EDTA、pH8.0、15mM NaN3、例えば0.02% Tween20TM。
【0027】
mRNA単離のために使用される試薬例
1. 4Mグアニジンイソチオシアネート、25mMクエン酸ナトリウム、pH7.0、0.5%N−ラウリルサルコシン、0.01Mβ−メルカプトエタノール。
【0028】
DNA直接精製のために使用される試薬例
1.15mM NaN3を含む溶菌緩衝液中の粒子懸濁液(例えば50mMトリス−HCl、pH7.2、50mM EDTA、3%SDS、1% 2−メルカプトエタノール;50mM KCl、10−20mM トリス−HCl、2.5mM MgCl2、pH8.3、0.5 Tween20TM、100μg/mlプロティナーゼK;100mMトリス−HCl、pH8.5、5mM EDTA、1%SDS、500μg/mlプロティナーゼK)
2. 15mM NaN3および例えば0.02% Tween20TMを含む洗浄緩衝液
3. 15mM NaN3および例えば0.02% Tween20TMを含む再懸濁緩衝液
【0029】
室温における磁性粒子プロセッサによるPCR生成物の精製方法の例
試薬はプレートの次のウェルに分配される。
試薬構成の例
ウェル1 試料(ビオチニル化DNA、PCRアンプリコン)
ウェル2 洗浄緩衝液中のストレプトアビジンで被覆された磁性粒子
ウェル3ないし5 洗浄緩衝液
ウェル6 NaOH
ウェル7 TE緩衝液
ウェル8 蒸留水
【0030】
工程段階の例
ウェル2 粒子の混合、洗浄および収集、それらのウェル3中への移動
ウェル3 粒子の洗浄、それらのウェル4中への移動
ウェル4 粒子の洗浄、それらのウェル1中への移動
ウェル1 試料のインキュベーション10分、粒子のウェル4中への移動
ウェル4 粒子の洗浄、それらのウェル5中への移動
ウェル5 粒子の洗浄、それらのウェル6中への移動
ウェル6 融解溶液中でのインキュベーション5分、粒子のウェル4中への移動
ウェル4 粒子の洗浄、それらのウェル5中への移動
ウェル5 粒子の洗浄、それらのウェル7中への移動
ウェル7 粒子の濯ぎ、それらのウェル8中への移動
ウェル8 粒子の放出
【0031】
磁性化された粒子の収集および放出段階における表面張力除去剤(STRA)の効果
ストレプトアビジン被覆された磁性粒子(大きさ:サイゲン(Scigen)ストレプトアビジン3μm;サイゲン(Scigen)社;スフェロ(SPHEROTM)ストレプトアビジン4−4.5μm、スフェロテック(Spherotec)社、ダイナビーズ(Dynabeads) M−280ストレプトアビジン2.8μm、ダイナルDynal)社)を+37℃で1時間、ビオチニル化アルカリホスファターゼ(カルバイオケム社(Calbiochem),カリフォルニア州サンディエゴ)により飽和にする。飽和化された粒子は最初に結合されていないアルカリホスファターゼを除去するため洗浄され、次いで磁性粒子プロセッサの収集段階および放出段階におけるSTRAの効果を試験するのに使用した。これらの実施例の装置の設定は20μlから200μlまでに調節され、プロセッサの収容力範囲は一回の運転当り1−24試料であった。プロセッサはポリプロペンチューブ(外側幅4.5mm)中のロッド型磁石(長さ2mm、幅3mm、軸方向に磁性化された円筒状のNdFeB)を利用した。
【0032】
簡単にいえば、粒子は全ての工程が10段階からなるように、ウェルからウェルへそれらを放出および収集することにより加工された。収集後にウェル中に残っている粒子の量はアルカリホスフォターゼアッセイにて評価した。各ウェルからの試料(10μm)は空の微量滴定プレート(丸底ウェル、幅6.5mm)に移された。
【0033】
このアッセイでは、アルカリホスファターゼ飽和化粒子(0.016μgないし1μg粒子/10μl稀釈剤)を標準として使用した。10μlの試料および標準を含むウェル中へジエタノールアミン(DEA)緩衝液(ラブシステムズ(Labsystems)製)で稀釈された100μl pNPP基質を加えた。基質を+37℃で15分間ラブシステムスiEMSインキュベータ/シェーカー中で連続的に振とうした(900rpm)。反応は各々のウェルに100μlの1M NaOHを加えることによって停止され、そして405nmにおける吸光度を光度計にて測定した(ラブシステム マルティスカン(Labsystems Multiskan))。
【0034】
残存する粒子量を一次標準曲線から決定し、そして最終的な結果は粒子の初期量(0.2mg/ウェル)の百分率として表す。
【0035】
図1は異なる濃度におけるディタージェント(Tween20TM)の効果を示す。
表面張力除去剤が収集および放出緩衝液中に添加されなかった場合、残存する粒子(サイゲン ストレプトアビジン)の程度は3%/ウェルを超えた。ディタージェント濃度が≧0.00125%の場合、粒子は効果的に収集された。
図2は収集および放出緩衝液中の塩およびサッカロースの効果を示す。これらの成分を緩衝液に添加することによって、粒子(サイゲン ストレプトアビジン)の収集はさらに効果的である。
図3はある程度粒子(スフェロ ストレプトアビジン)の収集段階を向上させているタンパク質(カゼイン)の効果を示す。
図4は異なる供給元の磁性粒子が使用された場合のディタージェント(Tween20TM)の効果を示す。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は磁性化された粒子の収集段階および放出段階におけるディタージェントの効果を示すグラフである。
【図2】図2は収集および放出緩衝液における塩およびサッカロースの効果を示すグラフである。
【図3】図3は収集および放出緩衝液におけるタンパク質の効果を示すグラフである。
【図4】図4は異なる供給元からの磁性粒子を使用した場合のディタージェントの効果を示すグラフである。
Claims (14)
- 物質の精製方法であって、
− 前記物質を含む材料、および磁性粒子であって該粒子を前記物質と結合させる試薬で被覆されたまたは処理された磁性粒子を第一の媒質に分配し、
− 結合反応を行わせ、該反応においては前記物質が前記粒子に結合され、そして
− 磁気プローブを前記媒質中に押し入れ、それにより前記粒子を該プローブに付着させ、そして前記プローブを前記粒子および該粒子に結合された前記物質と一緒に第二の媒質に移し、ならびに所望により、第二の媒質から分離しそして第三の媒質に移す方法であり、
− 前記プローブおよび前記粒子が媒質から移される前に、表面張力除去剤が前記媒質の少なくとも1つに、好ましくは少なくとも第一の媒質に、および最も好ましくは全ての媒質に分配されることを特徴とする方法。 - 前記表面張力除去剤が界面活性剤、アルコール、タンパク質または、塩または炭化水素である請求項1記載の方法。
- 前記表面張力除去剤が、ディタージェントのような界面活性剤である請求項1または2記載の方法。
- 前記界面活性剤の濃度が0.001ないし0.5%(w/v)、好ましくは0.005ないし0.1%(w/v)および最も好ましくは0.01ないし0.05%(w/v)である請求項3記載の方法。
- 前記表面張力除去剤がタンパク質である請求項1または2記載の方法。
- 前記タンパク質の濃度が0.1ないし10%(w/v)、好ましくは0.25ないし5%(w/v)および最も好ましくは0.5ないし2%(w/v)である請求項5記載の方法。
- 前記表面張力除去剤が塩である請求項1または2記載の方法。
- 前記塩の濃度が0.1ないし10M、好ましくは0.1ないし7Mである請求項7記載の方法。
- 細胞、ウィルス、亜細胞性の細胞小器官、タンパク質または核酸材料の精製のための請求項1ないし8のいずれか一項記載の方法。
- 核酸材料の精製のための請求項9記載の方法。
- 前記磁性粒子の大きさが50μmより小さい、好ましくは0.1ないし10μm、および最も好ましくは1ないし5μmである請求項1ないし10のいずれか一項記載の方法。
- 前記磁性粒子の濃度が0.01ないし5mg/ml、好ましくは0.05ないし3mg/mlおよび最も好ましくは0.2ないし2mg/mlである請求項1ないし11のいずれか一項記載の方法。
- 媒質から磁気プローブによって磁性粒子を分離する方法であって、前記粒子を分離する前に、表面張力除去剤を媒質に分配することを特徴とする方法。
- 液体媒質からの磁性粒子の、前記媒質中に押し入れられた磁気プローブへの付着性を向上させる方法であって、前記粒子が前記プローブに付着する前に表面張力除去剤を前記媒質中に分配することを特徴とする方法。
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