JP3519106B2 - カルパイン活性中心ペプチド抗体、これを用いる活性型カルパインの測定方法およびその測定用試薬 - Google Patents
カルパイン活性中心ペプチド抗体、これを用いる活性型カルパインの測定方法およびその測定用試薬Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は活性型カルパインに対し
特異的に反応するカルパイン活性中心ペプチド抗体、こ
れを用いる活性型カルパインの測定方法およびその測定
用試薬に関する。
特異的に反応するカルパイン活性中心ペプチド抗体、こ
れを用いる活性型カルパインの測定方法およびその測定
用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】細胞質内にはカルシウムによって活性化
されるプロテアーゼとしてのカルパインが存在してい
る。このカルパインには２種類の分子種が存在し、活性
化に必要なカルシウム濃度の要求性によって、μ−カル
パイン（カルパインＩ）とｍ−カルパイン（カルパイン
II）のアイソザイムに区別されている。
されるプロテアーゼとしてのカルパインが存在してい
る。このカルパインには２種類の分子種が存在し、活性
化に必要なカルシウム濃度の要求性によって、μ−カル
パイン（カルパインＩ）とｍ−カルパイン（カルパイン
II）のアイソザイムに区別されている。
【０００３】このカルパインは通常不活性の前駆体であ
るが、細胞内のカルシウム濃度が上昇すると活性化さ
れ、各種基質となるミオシンなどの蛋白質の分解や構造
の崩壊を引き起こすことが報告されている。また、動物
実験において、心筋梗塞発症後６時間以内にカルパイン
活性が上昇することから、心筋の分解にカルパインが何
らかの関与があること（柴田ら：ジャーナル・オブ・モ
レキュラーセルカルジオロジィー、１５巻、２８頁、１
９８３年）、筋繊維の崩壊に活性化したカルパインが関
与していること（川崎ら：「代謝」、２５巻、１９８８
年および鈴木：「生化学」、６５巻、７号、５３７頁、
１９９３年）が考えられており、更に、カルパインが虚
血性心疾患の発症、進展に関与しているという報告があ
る（豊岡ら：バイオメディカ、７巻、１９９２年）。し
かし、このカルパインは生体内の各種組織に広く分布し
ており、上記２つの分子種の割合や局在性は多様に変化
するとされている。
るが、細胞内のカルシウム濃度が上昇すると活性化さ
れ、各種基質となるミオシンなどの蛋白質の分解や構造
の崩壊を引き起こすことが報告されている。また、動物
実験において、心筋梗塞発症後６時間以内にカルパイン
活性が上昇することから、心筋の分解にカルパインが何
らかの関与があること（柴田ら：ジャーナル・オブ・モ
レキュラーセルカルジオロジィー、１５巻、２８頁、１
９８３年）、筋繊維の崩壊に活性化したカルパインが関
与していること（川崎ら：「代謝」、２５巻、１９８８
年および鈴木：「生化学」、６５巻、７号、５３７頁、
１９９３年）が考えられており、更に、カルパインが虚
血性心疾患の発症、進展に関与しているという報告があ
る（豊岡ら：バイオメディカ、７巻、１９９２年）。し
かし、このカルパインは生体内の各種組織に広く分布し
ており、上記２つの分子種の割合や局在性は多様に変化
するとされている。
【０００４】従って、生体中のカルパインを測定するこ
とにより、筋の生理機能を把握し、病態を解明すること
が可能なことから、従来より、生体中のカルパインを定
量することが行われており、その定量法としては、
（イ）カゼインを基質としてプロテアーゼ活性を算出す
る酵素学的方法、および（ロ）カルパインＩ又はIIのア
ミノ酸配列の特定部位の合成ペプチドに対する抗体を用
いる方法が知られている。
とにより、筋の生理機能を把握し、病態を解明すること
が可能なことから、従来より、生体中のカルパインを定
量することが行われており、その定量法としては、
（イ）カゼインを基質としてプロテアーゼ活性を算出す
る酵素学的方法、および（ロ）カルパインＩ又はIIのア
ミノ酸配列の特定部位の合成ペプチドに対する抗体を用
いる方法が知られている。
【０００５】しかしながら、（イ）の方法は、カルパイ
ンの何れの分子種の酵素活性であるかわからないため、
これを区別するには別の手段を必要とすると共に、カル
シウムの存在条件などによる機能面での測定が困難であ
った。また（ロ）の方法は、抗体の作成に使用した抗原
がカルパインのドメインIII のアミノ酸配列部位の合成
ペプチドであるため、通常状態で存在するヒトカルパイ
ンを測定することはできるが、活性化カルパインを測定
することは不可能であった。
ンの何れの分子種の酵素活性であるかわからないため、
これを区別するには別の手段を必要とすると共に、カル
シウムの存在条件などによる機能面での測定が困難であ
った。また（ロ）の方法は、抗体の作成に使用した抗原
がカルパインのドメインIII のアミノ酸配列部位の合成
ペプチドであるため、通常状態で存在するヒトカルパイ
ンを測定することはできるが、活性化カルパインを測定
することは不可能であった。
【０００６】しかるところ、活性化カルパインは心筋梗
塞等の発症によって出現するもので、これを定量するこ
とは生体の機能を知る上で極めて重要であるが、従来の
（イ）および（ロ）の方法ではこれを測定できないとい
う問題点があった。
塞等の発症によって出現するもので、これを定量するこ
とは生体の機能を知る上で極めて重要であるが、従来の
（イ）および（ロ）の方法ではこれを測定できないとい
う問題点があった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は、活
性化カルパインに特異的に反応してその存在を測定する
ことができ、かつその活性を抑制することのできる特異
抗体を得ることを目的とするものである。
性化カルパインに特異的に反応してその存在を測定する
ことができ、かつその活性を抑制することのできる特異
抗体を得ることを目的とするものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】このような実情におい
て、本発明者は鋭意研究を行った結果、カルパインのア
ミノ末端より２６０番目周辺の特定のアミノ酸配列のペ
プチドを抗原として得られる抗体が上記目的にかなって
いることを見出し、本発明を完成した。
て、本発明者は鋭意研究を行った結果、カルパインのア
ミノ末端より２６０番目周辺の特定のアミノ酸配列のペ
プチドを抗原として得られる抗体が上記目的にかなって
いることを見出し、本発明を完成した。
【０００９】すなわち、本発明は、Lys-Leu-Val-Lys-Gl
y-His-Ala-Tyr-Ser-Val からなるペプチドを動物に免疫
して得られるカルパイン活性中心ペプチド抗体を提供す
るものである。
y-His-Ala-Tyr-Ser-Val からなるペプチドを動物に免疫
して得られるカルパイン活性中心ペプチド抗体を提供す
るものである。
【００１０】また、本発明は、このカルパイン活性中心
ペプチド抗体を用いる活性型カルパインの免疫学的測定
法を提供するものである。
ペプチド抗体を用いる活性型カルパインの免疫学的測定
法を提供するものである。
【００１１】更にまた、本発明は、このカルパイン活性
中心ペプチド抗体を含有する活性型カルパイン測定用試
薬を提供するものである。以下、この発明について詳し
く説明する。
中心ペプチド抗体を含有する活性型カルパイン測定用試
薬を提供するものである。以下、この発明について詳し
く説明する。
【００１２】（１）抗原ペプチドの選定
カルパイン活性部位のペプチドのアミノ酸配列をコンピ
ュータ解析すると、いずれのカルパインにおいても、ア
ミノ末端より２６０番目周辺のアミノ酸配列Lys-Leu-Va
l-Lys-Gly-His-Ala-Tyr-Ser-Val （ＫＬＶＫＧＨＡＹＳ
Ｖ）がシステインプロテアーゼとしての活性中心の一つ
であり、しかもこのペプチドはホモロジー、抗原性およ
び親水性が高く、ペプチド抗原として適していることが
見出された。
ュータ解析すると、いずれのカルパインにおいても、ア
ミノ末端より２６０番目周辺のアミノ酸配列Lys-Leu-Va
l-Lys-Gly-His-Ala-Tyr-Ser-Val （ＫＬＶＫＧＨＡＹＳ
Ｖ）がシステインプロテアーゼとしての活性中心の一つ
であり、しかもこのペプチドはホモロジー、抗原性およ
び親水性が高く、ペプチド抗原として適していることが
見出された。
【００１３】（２）抗原の調製
このようにして選定したカルパイン活性中心ペプチド、
ＫＬＶＫＧＨＡＹＳＶを全自動ペプチド合成機で化学合
成した後、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフ
ィーにより精製する。合成ペプチドは、アミノ酸分析、
プロテインシークエンサーより目的のペプチドであるこ
とを確認した。
ＫＬＶＫＧＨＡＹＳＶを全自動ペプチド合成機で化学合
成した後、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフ
ィーにより精製する。合成ペプチドは、アミノ酸分析、
プロテインシークエンサーより目的のペプチドであるこ
とを確認した。
【００１４】（３）抗体の調製
ペプチドは、キャリアーとしてＫＥＹＨＯＬＥ ＬＹＭ
ＰＥＴ ＨＥＭＯＣＹＡＭＩＮ（ＫＬＨ）を用い、グル
タールアルデヒド法により結合させ、免疫源とする。抗
血清の製造は公知の方法によって行えばよく、例えばポ
リクローナル抗体の場合は、このカルパイン活性中心ペ
プチド−ＫＬＨ溶液を完全フロイントアジュバントと１
対１で混合乳化し、ウサギ皮下に２週間に１回投与し、
２ケ月後静脈血を採取し、抗血清を得る。免疫に用いる
動物としては、一般によく使用されるウサギを初めとし
てヤギ、ラット、マウス、トリ、ウマなどが挙げられ
る。
ＰＥＴ ＨＥＭＯＣＹＡＭＩＮ（ＫＬＨ）を用い、グル
タールアルデヒド法により結合させ、免疫源とする。抗
血清の製造は公知の方法によって行えばよく、例えばポ
リクローナル抗体の場合は、このカルパイン活性中心ペ
プチド−ＫＬＨ溶液を完全フロイントアジュバントと１
対１で混合乳化し、ウサギ皮下に２週間に１回投与し、
２ケ月後静脈血を採取し、抗血清を得る。免疫に用いる
動物としては、一般によく使用されるウサギを初めとし
てヤギ、ラット、マウス、トリ、ウマなどが挙げられ
る。
【００１５】モノクローナル抗体の場合には、細胞融合
により抗体を得る。本法は既知の手段として、カルパイ
ン活性部位ペプチドの抗体を産生しているリンパ球を含
む細胞として、例えばマウス脾臓細胞と、ミエローマ細
胞とをポリエチレングリコール存在下にて融合し、ハイ
ブリドーマを得る。この中より、カルパイン活性部位ペ
プチドに対する抗体産生する細胞をスクリーニングし、
この細胞を培養することによって、カルパイン活性部位
ペプチドに対する抗体を採取する。
により抗体を得る。本法は既知の手段として、カルパイ
ン活性部位ペプチドの抗体を産生しているリンパ球を含
む細胞として、例えばマウス脾臓細胞と、ミエローマ細
胞とをポリエチレングリコール存在下にて融合し、ハイ
ブリドーマを得る。この中より、カルパイン活性部位ペ
プチドに対する抗体産生する細胞をスクリーニングし、
この細胞を培養することによって、カルパイン活性部位
ペプチドに対する抗体を採取する。
【００１６】（４）抗体価の検定
抗体価の検定はＥＬＩＳＡ法によって行われる。すなわ
ち、０．２μｇ／mlの上記ペプチドを含む０．１Ｍ炭酸
緩衝液（pH９．６）１００μｌを９６穴マイクロプレー
トに加え、室温にて一晩放置することによりペプチド抗
原をプレートに固相化する。これを一次抗体として希釈
した上記抗血清と反応させた後、０．０５％ツイーン２
０を含有するＰＢＳを加え、更に二次抗体として１％カ
ゼインを含むアルカリホスファターゼ標識抗ウサギＩｇ
Ｇ抗体（バイオラッド社）の３０００倍希釈液を反応さ
せた後、０．０５％ツイーン２０を含むＰＢＳおよび
０．１Ｍトリス緩衝液（pH８．０）でそれぞれ洗浄後、
パラニトロフェニールリン酸を基質として加えて発色さ
せる。更に２Ｎ水酸化ナトリウム溶液を各穴に加えて反
応を停止し、４０５nmの吸光度を９６穴マイクロプレー
トリーダーで測定し、抗体価の検定をすることができ
る。
ち、０．２μｇ／mlの上記ペプチドを含む０．１Ｍ炭酸
緩衝液（pH９．６）１００μｌを９６穴マイクロプレー
トに加え、室温にて一晩放置することによりペプチド抗
原をプレートに固相化する。これを一次抗体として希釈
した上記抗血清と反応させた後、０．０５％ツイーン２
０を含有するＰＢＳを加え、更に二次抗体として１％カ
ゼインを含むアルカリホスファターゼ標識抗ウサギＩｇ
Ｇ抗体（バイオラッド社）の３０００倍希釈液を反応さ
せた後、０．０５％ツイーン２０を含むＰＢＳおよび
０．１Ｍトリス緩衝液（pH８．０）でそれぞれ洗浄後、
パラニトロフェニールリン酸を基質として加えて発色さ
せる。更に２Ｎ水酸化ナトリウム溶液を各穴に加えて反
応を停止し、４０５nmの吸光度を９６穴マイクロプレー
トリーダーで測定し、抗体価の検定をすることができ
る。
【００１７】（５）抗体の精製
上記のようにして得られた抗血清は、必要に応じ精製し
て用いることができる。精製には、例えば、硫安分画、
イオン交換クロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフ
ィー等の一般的な精製法を用いてもよいし、更に好適に
は、セファロース４Ｂに抗原ペプチドを固定化したゲル
カラムを用いて、カルパイン活性中心ペプチド特異抗体
を高度に精製することができる。このようにして、カル
パイン活性部位特異ペプチドに対する抗体を容易に多量
に得ることができる。
て用いることができる。精製には、例えば、硫安分画、
イオン交換クロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフ
ィー等の一般的な精製法を用いてもよいし、更に好適に
は、セファロース４Ｂに抗原ペプチドを固定化したゲル
カラムを用いて、カルパイン活性中心ペプチド特異抗体
を高度に精製することができる。このようにして、カル
パイン活性部位特異ペプチドに対する抗体を容易に多量
に得ることができる。
【００１８】以上のようにして製造したカルパイン活性
中心ペプチド抗体を用いて活性型カルパイン測定用試薬
を調製することができる。その試薬としては、組織化学
で用いられる代表的な酵素免疫分析用の試薬、例えば、
カルパイン活性中心ペプチド抗体、ビオチン化二次抗
体、アビジン−ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体、過
酸化水素、ジアミノベンチジンからなる測定用試薬が挙
げられる。
中心ペプチド抗体を用いて活性型カルパイン測定用試薬
を調製することができる。その試薬としては、組織化学
で用いられる代表的な酵素免疫分析用の試薬、例えば、
カルパイン活性中心ペプチド抗体、ビオチン化二次抗
体、アビジン−ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体、過
酸化水素、ジアミノベンチジンからなる測定用試薬が挙
げられる。
【００１９】また、カルパイン活性中心ペプチド抗体を
用いる活性型カルパインの測定は、例えば次のようにし
て行われる。被検試料としては、ヒト、ラット、マウ
ス、ウサギ等の動物の生検又は病理解剖で得られた心筋
組織、血液、血漿、血清、尿等を使用することができ
る。
用いる活性型カルパインの測定は、例えば次のようにし
て行われる。被検試料としては、ヒト、ラット、マウ
ス、ウサギ等の動物の生検又は病理解剖で得られた心筋
組織、血液、血漿、血清、尿等を使用することができ
る。
【００２０】被検試料、例えば組織切片を常法によって
固定し、キシロールで脱パラフィンし、無水エタノー
ル、９０％エタノール、７０％エタノール、ＰＢＳに順
次浸してよく水になじませ、０．３％過酸化水素含有エ
タノール水溶液で内在性ペルオキシダーゼ活性を阻止し
た後、ＰＢＳで洗浄する。これにカルパイン活性中心ペ
プチド抗体を４〜３７℃で、０．５〜２時間反応させ、
ＰＢＳで洗浄する。これを二次抗体としてのビオチン化
二次抗体、例えばビオチン化抗ウサギＩｇＧ抗体と４〜
３７℃で、０．５〜２時間反応させる。ＰＢＳで洗浄し
た後、同様に潤滑箱の中でアビジン・ビオチン化ペルオ
キシダーゼ複合体と４〜３７℃で、０．５〜２時間反応
させ、ＰＢＳで洗浄する。次いで、これに過酸化水素を
含むジアミノベンチジン溶液を添加し、４〜３７℃で、
１〜１０分間酵素反応により発色させる。更に流水で洗
浄した後、ヘマトキシリンで核染色を施し、エタノール
で脱水し、キシロールで透徹した後封入し、組織内にお
ける抗原の局在を顕微鏡で観察することにより活性型カ
ルパインの存在を測定することができる。
固定し、キシロールで脱パラフィンし、無水エタノー
ル、９０％エタノール、７０％エタノール、ＰＢＳに順
次浸してよく水になじませ、０．３％過酸化水素含有エ
タノール水溶液で内在性ペルオキシダーゼ活性を阻止し
た後、ＰＢＳで洗浄する。これにカルパイン活性中心ペ
プチド抗体を４〜３７℃で、０．５〜２時間反応させ、
ＰＢＳで洗浄する。これを二次抗体としてのビオチン化
二次抗体、例えばビオチン化抗ウサギＩｇＧ抗体と４〜
３７℃で、０．５〜２時間反応させる。ＰＢＳで洗浄し
た後、同様に潤滑箱の中でアビジン・ビオチン化ペルオ
キシダーゼ複合体と４〜３７℃で、０．５〜２時間反応
させ、ＰＢＳで洗浄する。次いで、これに過酸化水素を
含むジアミノベンチジン溶液を添加し、４〜３７℃で、
１〜１０分間酵素反応により発色させる。更に流水で洗
浄した後、ヘマトキシリンで核染色を施し、エタノール
で脱水し、キシロールで透徹した後封入し、組織内にお
ける抗原の局在を顕微鏡で観察することにより活性型カ
ルパインの存在を測定することができる。
【００２１】本発明の測定法においてサンドイッチ法に
よる場合には、当該一次抗体をビーズ、マイクロプレー
ト、ラテックス、繊維等の担体に固体化して用いること
もできる。また、一次抗体のカルパイン活性中心ペプチ
ド抗体としては、精製した抗血清、抗血清より得たＩｇ
Ｇ、Ｆ（ａｂ）’2等の何れをも使用することができ
る。酵素結合二次抗体としては、ＩｇＧでもよいが、Ｆ
（ａｂ）’2であれば更に好適であり、それらにペルオ
キシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等を公知の方法
にて結合させたものが使用できる。ペルオキシダーゼを
結合させた場合、ｏ−フェニレンジアミンと過酸化水素
とを作用させ、波長４９２nmにて吸光度を測定すること
ができる。
よる場合には、当該一次抗体をビーズ、マイクロプレー
ト、ラテックス、繊維等の担体に固体化して用いること
もできる。また、一次抗体のカルパイン活性中心ペプチ
ド抗体としては、精製した抗血清、抗血清より得たＩｇ
Ｇ、Ｆ（ａｂ）’2等の何れをも使用することができ
る。酵素結合二次抗体としては、ＩｇＧでもよいが、Ｆ
（ａｂ）’2であれば更に好適であり、それらにペルオ
キシダーゼ、アルカリフォスファターゼ等を公知の方法
にて結合させたものが使用できる。ペルオキシダーゼを
結合させた場合、ｏ−フェニレンジアミンと過酸化水素
とを作用させ、波長４９２nmにて吸光度を測定すること
ができる。
【００２２】
【発明の効果】本発明のカルパイン活性中心ペプチド抗
体は心筋梗塞巣に存在する活性型カルパインと特異的に
反応するので、これを使用して、生体中の活性型カルパ
インの存在を測定して心疾患等の診断を行うことができ
ると共に、心筋梗塞巣中のカルパイン活性を抑制するこ
とができる。
体は心筋梗塞巣に存在する活性型カルパインと特異的に
反応するので、これを使用して、生体中の活性型カルパ
インの存在を測定して心疾患等の診断を行うことができ
ると共に、心筋梗塞巣中のカルパイン活性を抑制するこ
とができる。
【００２３】
【実施例】次に実施例を挙げて説明する。
【００２４】実施例１（抗体の調製）
カルパイン活性中心ペプチド、ＫＬＶＫＧＨＡＹＳＶを
全自動ペプチド合成機（ミリジェン社製）で化学合成
し、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー
（ウォーターズ社製）により精製した。合成ペプチド
は、アミノ酸分析、プロテインシークエンサーより目的
のペプチドであることを確認した。ペプチドはキャリア
ーとしてＫＬＨを用い、グルタールアルデヒド法により
結合させ、免疫源とした。このカルパイン活性中心ペプ
チド−ＫＬＨ溶液を完全フロイントアジュバントと１対
１で混合乳化し、ウサギ皮下に２週間に１回投与し、２
カ月後静脈血を採取し、抗血清を得た。こうして得られ
たウサギ抗血清を、１０mlの臭化シアン活性化セファロ
ース４Ｂと（ファルマシア社製）と混合し、室温にて一
晩放置することによりペプチド抗原をゲルに固定化し
た。このゲルをカラムに充填し、１Ｍ塩化ナトリウム溶
液、０．１７Ｍグリシン−塩酸緩衝液pH７．３および１
０mMリン酸緩衝液−生理食塩水pH７．３（ＰＢＳ）のそ
れぞれ５００mlにて洗浄後、上記ウサギ抗血清５０mlと
室温で２時間反応させた。次いで、１Ｍ塩化ナトリウム
溶液並びにＰＢＳにて未反応の成分を洗浄し除去した。
２８０nmにて蛋白の溶出位置をモニターしながら、０．
１７Ｍグリシン−塩酸緩衝液pH２．５にてカルパイン活
性中心部位ペプチド抗体を溶出した。吸光度のピーク分
画をプールし、炭酸水素ナトリウム粉末を添加し中和し
た。直ちに硫酸アンモニウムを加えて５０％飽和とし
た。４℃に２時間放置して得られた抗体を含む沈渣を一
万回転で遠心分離した後、一晩ＰＢＳに透析し、アフィ
ニティー精製抗体２．６mgを得た。
全自動ペプチド合成機（ミリジェン社製）で化学合成
し、逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー
（ウォーターズ社製）により精製した。合成ペプチド
は、アミノ酸分析、プロテインシークエンサーより目的
のペプチドであることを確認した。ペプチドはキャリア
ーとしてＫＬＨを用い、グルタールアルデヒド法により
結合させ、免疫源とした。このカルパイン活性中心ペプ
チド−ＫＬＨ溶液を完全フロイントアジュバントと１対
１で混合乳化し、ウサギ皮下に２週間に１回投与し、２
カ月後静脈血を採取し、抗血清を得た。こうして得られ
たウサギ抗血清を、１０mlの臭化シアン活性化セファロ
ース４Ｂと（ファルマシア社製）と混合し、室温にて一
晩放置することによりペプチド抗原をゲルに固定化し
た。このゲルをカラムに充填し、１Ｍ塩化ナトリウム溶
液、０．１７Ｍグリシン−塩酸緩衝液pH７．３および１
０mMリン酸緩衝液−生理食塩水pH７．３（ＰＢＳ）のそ
れぞれ５００mlにて洗浄後、上記ウサギ抗血清５０mlと
室温で２時間反応させた。次いで、１Ｍ塩化ナトリウム
溶液並びにＰＢＳにて未反応の成分を洗浄し除去した。
２８０nmにて蛋白の溶出位置をモニターしながら、０．
１７Ｍグリシン−塩酸緩衝液pH２．５にてカルパイン活
性中心部位ペプチド抗体を溶出した。吸光度のピーク分
画をプールし、炭酸水素ナトリウム粉末を添加し中和し
た。直ちに硫酸アンモニウムを加えて５０％飽和とし
た。４℃に２時間放置して得られた抗体を含む沈渣を一
万回転で遠心分離した後、一晩ＰＢＳに透析し、アフィ
ニティー精製抗体２．６mgを得た。
【００２５】実施例２（抗体のカルパイン活性の阻害）
ヒト赤血球から精製したμ−カルパインを用い、カルシ
ウムにて活性化した後のカゼイン分解活性を測定したと
ころ、実施例１で得たアフィニティー精製抗体は、いず
れの活性型カルパインに対してもカゼイン分解活性を阻
害した。このことから本発明のカルパイン活性中心ペプ
チド抗体は、抗原の活性部位のペプチドに特異的に反応
し、プロテアーゼ活性を阻害する性質をもつことが明ら
かとなった（図１）。
ウムにて活性化した後のカゼイン分解活性を測定したと
ころ、実施例１で得たアフィニティー精製抗体は、いず
れの活性型カルパインに対してもカゼイン分解活性を阻
害した。このことから本発明のカルパイン活性中心ペプ
チド抗体は、抗原の活性部位のペプチドに特異的に反応
し、プロテアーゼ活性を阻害する性質をもつことが明ら
かとなった（図１）。
【００２６】実施例３（抗体の特異性）
実施例１で得た抗体がヒト活性型のμ−カルパインに特
異的に反応するかどうかを検討した。すなわち、２μｇ
／mlのカルパイン、１mMのＥＧＴＡを含む０．１Ｍ炭酸
緩衝液（pH９．６）１００μｌを９６穴マイクロプレー
ト（ヌンク社）に加え、室温にて一晩放置することによ
り抗原をプレートに固相化した。一次抗体としてこの抗
体の希釈液を加え、実施例２と同様にしてＥＬＩＳＡ法
を行った。その結果精製ヒトμ−カルパインに対しては
本抗体の反応性はなかった。しかし、一方あらかじめμ
−カルパインをカルシウムの存在下で活性化させた試料
では反応を認めた。このことはヒトμ−カルパインはカ
ルシウムの存在下で活性化し、アミノ末端ペプチドを遊
離すること（国松ら：ＢＢＲＣ，１６４，８７５−８８
２，１９８９）によって、酵素の活性化に伴い活性中心
部位が出現し、活性中心ペプチド抗体と反応したことが
示された。すなわち本抗体は活性型カルパインに対して
強く反応することが証明された。
異的に反応するかどうかを検討した。すなわち、２μｇ
／mlのカルパイン、１mMのＥＧＴＡを含む０．１Ｍ炭酸
緩衝液（pH９．６）１００μｌを９６穴マイクロプレー
ト（ヌンク社）に加え、室温にて一晩放置することによ
り抗原をプレートに固相化した。一次抗体としてこの抗
体の希釈液を加え、実施例２と同様にしてＥＬＩＳＡ法
を行った。その結果精製ヒトμ−カルパインに対しては
本抗体の反応性はなかった。しかし、一方あらかじめμ
−カルパインをカルシウムの存在下で活性化させた試料
では反応を認めた。このことはヒトμ−カルパインはカ
ルシウムの存在下で活性化し、アミノ末端ペプチドを遊
離すること（国松ら：ＢＢＲＣ，１６４，８７５−８８
２，１９８９）によって、酵素の活性化に伴い活性中心
部位が出現し、活性中心ペプチド抗体と反応したことが
示された。すなわち本抗体は活性型カルパインに対して
強く反応することが証明された。
【００２７】実施例４（ウエスタンブロット法による抗
体解析） 実施例１で得た抗体の性質をウエスタンブロット法によ
り解析した。すなわちヒトや動物のμ−カルパイン、ｍ
−カルパインをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動（バイオラッド社）にかけ、ＰＶＤＦ膜（バイオラッ
ド社）に電気的に転写し、一次抗体として抗血清やアフ
ィニティー精製抗体の希釈液を用い、二次抗体として１
％カゼインを含むアルカリホスファターゼ標識抗ウサギ
ＩｇＧ抗体（バイオラッド社）の３０００倍希釈液と反
応させた後、ＰＢＳと０．１Ｍトリス緩衝液（pH８．
０）でそれぞれ洗浄後、ＢＣＩＰ、ＮＢＴ（バイオラッ
ド社）を基質として加え発色させた。その結果μ−カル
パインの８０Ｋサブユニットには反応は弱く、活性型カ
ルパインに強い反応が見られた。このことは上記ＥＬＩ
ＳＡ法の結果と一致し、本発明のカルパイン活性中心ペ
プチド抗体は活性型カルパインを認識する特異抗体であ
ることが判明した（図２）。
体解析） 実施例１で得た抗体の性質をウエスタンブロット法によ
り解析した。すなわちヒトや動物のμ−カルパイン、ｍ
−カルパインをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動（バイオラッド社）にかけ、ＰＶＤＦ膜（バイオラッ
ド社）に電気的に転写し、一次抗体として抗血清やアフ
ィニティー精製抗体の希釈液を用い、二次抗体として１
％カゼインを含むアルカリホスファターゼ標識抗ウサギ
ＩｇＧ抗体（バイオラッド社）の３０００倍希釈液と反
応させた後、ＰＢＳと０．１Ｍトリス緩衝液（pH８．
０）でそれぞれ洗浄後、ＢＣＩＰ、ＮＢＴ（バイオラッ
ド社）を基質として加え発色させた。その結果μ−カル
パインの８０Ｋサブユニットには反応は弱く、活性型カ
ルパインに強い反応が見られた。このことは上記ＥＬＩ
ＳＡ法の結果と一致し、本発明のカルパイン活性中心ペ
プチド抗体は活性型カルパインを認識する特異抗体であ
ることが判明した（図２）。
【００２８】実施例５（免疫組織化学的組織染色による
抗体の特異性） 生検あるいは病理解剖で得られた組織を冷アセトン（４
℃）にて３日間浸漬固定した。固定された組織をキシロ
ールで透徹した後、パラフィンに包埋し、ミクロトーム
で厚さ３μｍに薄切した。薄切された組織をスライドガ
ラスに付着せしめ、免疫組織化学的染色を以下の手順で
実施した。すなわち薄切組織をキシロールで脱パラフィ
ンし、無水エタノール、９０％エタノール、７０％エタ
ノール、ＰＢＳに順次浸してよく水になじませた。０．
３％過酸化水素含有メタノール水溶液で内在性ペルオキ
シダーゼ活性を阻止した後、ＰＢＳで洗浄した。次に湿
潤箱の中で一次抗体（実施例１におけるウサギ抗血清３
００倍希釈液、又はアフィニティー精製抗体２μｇ／m
l）と室温で１時間反応させ、ＰＢＳで洗浄し、ビオチ
ン化二次抗体（ビオチン化抗ウサギＩｇＧ抗体）と室温
３０分間反応させた。ＰＢＳで洗浄した後、同様に湿潤
箱の中でアビジン・ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体
と室温で３０分間反応させ、ＰＢＳで洗浄した。過酸化
水素含有ジアミノベンチジン溶液で室温４分間発色させ
た。更に流水で洗浄した後、ヘマトキシリンで核染色を
施し、エタノールで脱水し、キシロールで透徹した後、
封入し組織内における抗原の局在を顕微鏡で観察した。
その結果、カルパイン活性中心ペプチド抗体は心筋の正
常部位は染色せず、梗塞巣のみが染色された。
抗体の特異性） 生検あるいは病理解剖で得られた組織を冷アセトン（４
℃）にて３日間浸漬固定した。固定された組織をキシロ
ールで透徹した後、パラフィンに包埋し、ミクロトーム
で厚さ３μｍに薄切した。薄切された組織をスライドガ
ラスに付着せしめ、免疫組織化学的染色を以下の手順で
実施した。すなわち薄切組織をキシロールで脱パラフィ
ンし、無水エタノール、９０％エタノール、７０％エタ
ノール、ＰＢＳに順次浸してよく水になじませた。０．
３％過酸化水素含有メタノール水溶液で内在性ペルオキ
シダーゼ活性を阻止した後、ＰＢＳで洗浄した。次に湿
潤箱の中で一次抗体（実施例１におけるウサギ抗血清３
００倍希釈液、又はアフィニティー精製抗体２μｇ／m
l）と室温で１時間反応させ、ＰＢＳで洗浄し、ビオチ
ン化二次抗体（ビオチン化抗ウサギＩｇＧ抗体）と室温
３０分間反応させた。ＰＢＳで洗浄した後、同様に湿潤
箱の中でアビジン・ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体
と室温で３０分間反応させ、ＰＢＳで洗浄した。過酸化
水素含有ジアミノベンチジン溶液で室温４分間発色させ
た。更に流水で洗浄した後、ヘマトキシリンで核染色を
施し、エタノールで脱水し、キシロールで透徹した後、
封入し組織内における抗原の局在を顕微鏡で観察した。
その結果、カルパイン活性中心ペプチド抗体は心筋の正
常部位は染色せず、梗塞巣のみが染色された。
【００２９】実施例６（抗原ペプチドによる抗体吸収実
験） 実施例５の反応において、一次抗体を予め１μＭのカル
パイン活性中心ペプチド（ＫＬＶＫＧＨＡＹＳＶ）と室
温で１時間反応させた後に、同様に実験を行ったとこ
ろ、いずれの部位も染色されなかった。このことからカ
ルパイン活性中心ペプチド抗体は心筋梗塞巣を特異的に
染色する抗体であることが明らかである。
験） 実施例５の反応において、一次抗体を予め１μＭのカル
パイン活性中心ペプチド（ＫＬＶＫＧＨＡＹＳＶ）と室
温で１時間反応させた後に、同様に実験を行ったとこ
ろ、いずれの部位も染色されなかった。このことからカ
ルパイン活性中心ペプチド抗体は心筋梗塞巣を特異的に
染色する抗体であることが明らかである。
【図１】カルパイン活性中心ペプチド抗体によるカルパ
イン活性の阻害を示す図である。
イン活性の阻害を示す図である。
【図２】ウエスタンプロットによるカルパイン活性中心
ペプチド抗体の特異性を示す図である。
ペプチド抗体の特異性を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，1992年，Ｖｏ
ｌ．111，Ｎｏ．１，ｐ．81−86
Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｃｈｙｓ．Ａ
ｃｔａ，1992年，Ｖｏｌ．1121，Ｎｏ.
１／２，ｐ．47−53
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C07K 16/40
ＪＩＣＳＴＰＬＵＳ
ＰＵＢＭＥＤ
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ)
ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ
ｅｑ
Claims (3)
- 【請求項１】 Lys-Leu-Val-Lys-Gly-His-Ala-Tyr-Ser-
Val からなるペプチドを動物に免疫して得られるカルパ
イン活性中心ペプチド抗体。 - 【請求項２】 被検試料に請求項１記載のカルパイン活
性中心ペプチド抗体を加えて免疫反応を行うことを特徴
とする活性型カルパインの測定方法。 - 【請求項３】 請求項１記載のカルパイン活性中心ペプ
チド抗体を含有する活性型カルパイン測定用試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22422893A JP3519106B2 (ja) | 1993-09-09 | 1993-09-09 | カルパイン活性中心ペプチド抗体、これを用いる活性型カルパインの測定方法およびその測定用試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22422893A JP3519106B2 (ja) | 1993-09-09 | 1993-09-09 | カルパイン活性中心ペプチド抗体、これを用いる活性型カルパインの測定方法およびその測定用試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0782173A JPH0782173A (ja) | 1995-03-28 |
| JP3519106B2 true JP3519106B2 (ja) | 2004-04-12 |
Family
ID=16810514
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22422893A Expired - Fee Related JP3519106B2 (ja) | 1993-09-09 | 1993-09-09 | カルパイン活性中心ペプチド抗体、これを用いる活性型カルパインの測定方法およびその測定用試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3519106B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006036711A (ja) * | 2004-07-28 | 2006-02-09 | Science Univ Of Tokyo | ＤＮａｓｅγのＤＮａｓｅ活性を阻害する阻害方法、ＤＮａｓｅγのＤＮａｓｅ活性を阻害する阻害物質のスクリーニング方法、及びＤＮａｓｅγ阻害剤 |
-
1993
- 1993-09-09 JP JP22422893A patent/JP3519106B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｃｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９２年，Ｖｏｌ．１１２１，Ｎｏ．１／２，ｐ．４７−５３ |
| Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９２年，Ｖｏｌ．１１１，Ｎｏ．１，ｐ．８１−８６ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0782173A (ja) | 1995-03-28 |
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