JP3492405B2 - ゲルおよびゲル電気泳動の方法 - Google Patents
ゲルおよびゲル電気泳動の方法Info
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Description
【０００１】
【発明の分野】この発明は分子の電気泳動分離のための
マトリックスとしての新規なゲルおよびこれらゲルの用
途に関する。
マトリックスとしての新規なゲルおよびこれらゲルの用
途に関する。
【０００２】
【発明の背景】電気泳動は電界における荷電された種の
異なる移動度に基づきこれら種の分離を行なう方法であ
る。移動度は電気泳動媒質、電界強度、ならびに実効表
面電荷、大きさおよび形状を含むイオン自体の特性に依
存する。金属イオン等の小さな種やウィルス等の大きな
種も電気泳動技術により分離されてきた。しかしなが
ら、電気泳動は現在ではほとんどがたんぱく質、核酸、
およびそれらの誘導体を含む生物学的巨大分子の分離に
利用されている。この方法は通常電気泳動媒質としての
水性ゲル中を分子を移動させることにより行なわれる。
ゲルは天然または合成ポリマーから構成され得る。アガ
ロースが最も広く利用される天然物質でありかつポリア
クリルアミドゲルが最も一般的な合成マトリックスであ
る。ゲルは本質的には垂直と水平の２つのタイプの電気
泳動装置において流される。水平装置では、電極とゲル
との接触は直接的にまたはウィック（Wicks ）により成
立し得る。代替的には、ゲルを、電極とゲルとの間の導
電性媒質として作用する緩衝液に浸漬してもよい。この
フォーマットは液中ゲル電気泳動として知られかつ最も
作業が簡単である。液中ゲル電気泳動は核酸の分析に広
く利用されかつアガロースゲルが最もよく使用されるマ
トリックスである。
異なる移動度に基づきこれら種の分離を行なう方法であ
る。移動度は電気泳動媒質、電界強度、ならびに実効表
面電荷、大きさおよび形状を含むイオン自体の特性に依
存する。金属イオン等の小さな種やウィルス等の大きな
種も電気泳動技術により分離されてきた。しかしなが
ら、電気泳動は現在ではほとんどがたんぱく質、核酸、
およびそれらの誘導体を含む生物学的巨大分子の分離に
利用されている。この方法は通常電気泳動媒質としての
水性ゲル中を分子を移動させることにより行なわれる。
ゲルは天然または合成ポリマーから構成され得る。アガ
ロースが最も広く利用される天然物質でありかつポリア
クリルアミドゲルが最も一般的な合成マトリックスであ
る。ゲルは本質的には垂直と水平の２つのタイプの電気
泳動装置において流される。水平装置では、電極とゲル
との接触は直接的にまたはウィック（Wicks ）により成
立し得る。代替的には、ゲルを、電極とゲルとの間の導
電性媒質として作用する緩衝液に浸漬してもよい。この
フォーマットは液中ゲル電気泳動として知られかつ最も
作業が簡単である。液中ゲル電気泳動は核酸の分析に広
く利用されかつアガロースゲルが最もよく使用されるマ
トリックスである。
【０００３】たんぱく質および核酸の分析に関して新し
い合成マトリックスが Kozulic他により導入されている
（米国特許出願第３２８，１２３号、分析生化学（Anal
ytical Biochemistry １６３（１９８７年）、５０６−
５１２、および分析生化学１７０（１９８８年），４７
８−４８４）。このマトリックスは、アクリルモノマー
である、Ｎ−アクリロイル−トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン（ＮＡＴ）系のものである。ポリ（Ｎ
ＡＴ）ゲルはポリアクリルアミドゲルに比べ多孔性が勝
るが、アガロースゲルよりは劣ることがわかっている。
ゲルは約５０から数千塩基対の範囲の大きさのＤＮＡ分
子の分離に特に適していた。しかしながら、 Kozulic
（ＰＣＴ／ＥＰ９２／００３６３）に記載されるとお
り、（同文献についてはここに引用により援用する）、
液中ゲル電気泳動モードで泳動を行なったポリ（ＮＡ
Ｔ）ゲルにおけるＤＮＡの分解能は垂直方式のものより
も劣っていた。次に、驚いたことには、液中ゲル中分離
されたＤＮＡのバンドは曲がっており、垂直軸から傾斜
していることが観察された。このような屈曲は分解能に
ついて良い影響を与えず、というのもゲル上に置かれた
カメラで作られるゲルの記録上では、分離されたバンド
は広くかつ拡散しているように見えるからである。この
屈曲の原因はほとんどがゲルのイオン組成と、電気泳動
緩衝液に関係していた。この屈曲は上述の文献に開示さ
れるようにゲルのイオン組成を調節することによりなく
なるかまたは多大に低減され得る。この調節は総モノマ
ー濃度、電気泳動緩衝液またはゲルの寸法をかなり変え
るたびごとに行なう必要がある。これら３つの変数はあ
る大きさの範囲にわたっての分解能を改善するために実
験研究においてはよく変更されるものなので、異なるゲ
ル濃度および寸法でＤＮＡのバンドの屈曲の悪影響を受
けずに、数千塩基対までの範囲で良好なＤＮＡ分解能を
出すことができるゲルがあれば、かなりの作業量が省か
れ得ることは明らかである。
い合成マトリックスが Kozulic他により導入されている
（米国特許出願第３２８，１２３号、分析生化学（Anal
ytical Biochemistry １６３（１９８７年）、５０６−
５１２、および分析生化学１７０（１９８８年），４７
８−４８４）。このマトリックスは、アクリルモノマー
である、Ｎ−アクリロイル−トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン（ＮＡＴ）系のものである。ポリ（Ｎ
ＡＴ）ゲルはポリアクリルアミドゲルに比べ多孔性が勝
るが、アガロースゲルよりは劣ることがわかっている。
ゲルは約５０から数千塩基対の範囲の大きさのＤＮＡ分
子の分離に特に適していた。しかしながら、 Kozulic
（ＰＣＴ／ＥＰ９２／００３６３）に記載されるとお
り、（同文献についてはここに引用により援用する）、
液中ゲル電気泳動モードで泳動を行なったポリ（ＮＡ
Ｔ）ゲルにおけるＤＮＡの分解能は垂直方式のものより
も劣っていた。次に、驚いたことには、液中ゲル中分離
されたＤＮＡのバンドは曲がっており、垂直軸から傾斜
していることが観察された。このような屈曲は分解能に
ついて良い影響を与えず、というのもゲル上に置かれた
カメラで作られるゲルの記録上では、分離されたバンド
は広くかつ拡散しているように見えるからである。この
屈曲の原因はほとんどがゲルのイオン組成と、電気泳動
緩衝液に関係していた。この屈曲は上述の文献に開示さ
れるようにゲルのイオン組成を調節することによりなく
なるかまたは多大に低減され得る。この調節は総モノマ
ー濃度、電気泳動緩衝液またはゲルの寸法をかなり変え
るたびごとに行なう必要がある。これら３つの変数はあ
る大きさの範囲にわたっての分解能を改善するために実
験研究においてはよく変更されるものなので、異なるゲ
ル濃度および寸法でＤＮＡのバンドの屈曲の悪影響を受
けずに、数千塩基対までの範囲で良好なＤＮＡ分解能を
出すことができるゲルがあれば、かなりの作業量が省か
れ得ることは明らかである。
【０００４】約０．６から１％のポリマーを含むアガロ
ースゲルが数千から数万の塩基対の範囲の大きさのＤＮ
Ａ分子の分離に適している。この大きさの範囲はプラス
の電界電気泳動により数百万塩基対まで延ばすことがで
きる（ Cantor 他の Ann. Rev. Biophys. Biophys. Che
m.）１７（１９８８年）２８７−３０４）。先行技術で
周知のとおり、より小さいＤＮＡ分子では良好な分解能
を得るのにより高いアガロース濃度が必要である。しか
しながら、より濃度の高いアガロースゲルはアガロース
溶液の粘性が高いために調製が難しい。さらに、ゲルが
不透明であるために分離されたバンドを見ることが難し
い。Guisely の米国特許第３，９５６，２７３号に開示
されるとおり、アガロースの水酸基を誘導することでア
ガロース溶液の粘性およびゲルの不透明性が低減され
る。このようにヒドロキシエチル化されたアガロース誘
導体は商標名シープラク（Sea-Plaque）およびヌシーブ
（NuSieve ）（ＦＭＣ社）で知られる商業的に入手可能
な製品である。ヌシーブアガロースは約２から８％の濃
度のポリマーで典型的に使用されかつこのアガロースに
おいて小さいＤＮＡの分解能が向上したことが報告され
ている（DumaisおよびNochumson 、BioTechniques 、５
（１９８７年）６２）。しかしながら、ポリ（ＮＡＴ）
ゲルの場合よりもその程度は下がるものの、ポリマーを
４％しか含まないヌシーブアガロースゲルにおいても分
離されたＤＮＡバンドは曲がっていた（Kozulic 、ＰＣ
Ｔ／ＥＰ９２／００３６８）。この屈曲はゲルのイオン
組成を調節することにより低減することができるが、上
に述べたとおり、そのような調節を必要としないゲルを
得ることが好ましいと考えられる。
ースゲルが数千から数万の塩基対の範囲の大きさのＤＮ
Ａ分子の分離に適している。この大きさの範囲はプラス
の電界電気泳動により数百万塩基対まで延ばすことがで
きる（ Cantor 他の Ann. Rev. Biophys. Biophys. Che
m.）１７（１９８８年）２８７−３０４）。先行技術で
周知のとおり、より小さいＤＮＡ分子では良好な分解能
を得るのにより高いアガロース濃度が必要である。しか
しながら、より濃度の高いアガロースゲルはアガロース
溶液の粘性が高いために調製が難しい。さらに、ゲルが
不透明であるために分離されたバンドを見ることが難し
い。Guisely の米国特許第３，９５６，２７３号に開示
されるとおり、アガロースの水酸基を誘導することでア
ガロース溶液の粘性およびゲルの不透明性が低減され
る。このようにヒドロキシエチル化されたアガロース誘
導体は商標名シープラク（Sea-Plaque）およびヌシーブ
（NuSieve ）（ＦＭＣ社）で知られる商業的に入手可能
な製品である。ヌシーブアガロースは約２から８％の濃
度のポリマーで典型的に使用されかつこのアガロースに
おいて小さいＤＮＡの分解能が向上したことが報告され
ている（DumaisおよびNochumson 、BioTechniques 、５
（１９８７年）６２）。しかしながら、ポリ（ＮＡＴ）
ゲルの場合よりもその程度は下がるものの、ポリマーを
４％しか含まないヌシーブアガロースゲルにおいても分
離されたＤＮＡバンドは曲がっていた（Kozulic 、ＰＣ
Ｔ／ＥＰ９２／００３６８）。この屈曲はゲルのイオン
組成を調節することにより低減することができるが、上
に述べたとおり、そのような調節を必要としないゲルを
得ることが好ましいと考えられる。
【０００５】上記の屈曲作用はいくつかの要素により影
響を受けるが、ほとんどが電気泳動緩衝液とその緩衝液
に浸漬されるゲルとの導電性の違いに関連していた。こ
のような導電性の違いは緩衝イオンの移動に対するゲル
ポリマーの抵抗により引起こされる。この抵抗およびひ
いては導電性における違いはおそらくはゲルのポリマー
濃度を下げることにより低減されるかもしれない。しか
しながら、先行技術においてはポリマーの濃度を下げる
ことでより小さい生体分子の分解能が犠牲になることを
示す多くの報告がある。たとえば、小さいＤＮＡ分子の
最適分解能を得るには８−９％のポリマー乾燥重量まで
の誘導アガロース濃度の増加が必要である（ Dumais お
よびNochumson ，BioTechniques 、５（１９８７年）６
２）。またたんぱく質の分解能の改善はまずアガロース
を部分的に脱重合させかつその後ポリマーの含有量がお
よそ５−６％のゲルを調製することで達成され得る点に
留意されたい（Nochumson 他、ＰＣＴ／ＵＳ９０／００
１８４）。
響を受けるが、ほとんどが電気泳動緩衝液とその緩衝液
に浸漬されるゲルとの導電性の違いに関連していた。こ
のような導電性の違いは緩衝イオンの移動に対するゲル
ポリマーの抵抗により引起こされる。この抵抗およびひ
いては導電性における違いはおそらくはゲルのポリマー
濃度を下げることにより低減されるかもしれない。しか
しながら、先行技術においてはポリマーの濃度を下げる
ことでより小さい生体分子の分解能が犠牲になることを
示す多くの報告がある。たとえば、小さいＤＮＡ分子の
最適分解能を得るには８−９％のポリマー乾燥重量まで
の誘導アガロース濃度の増加が必要である（ Dumais お
よびNochumson ，BioTechniques 、５（１９８７年）６
２）。またたんぱく質の分解能の改善はまずアガロース
を部分的に脱重合させかつその後ポリマーの含有量がお
よそ５−６％のゲルを調製することで達成され得る点に
留意されたい（Nochumson 他、ＰＣＴ／ＵＳ９０／００
１８４）。
【０００６】小さい生体分子の分解には高いポリマー濃
度のゲルが必要であるとする考え方はゲル電気泳動の拡
張オグストン（ Ogsten ）モデルに基づく理論により支
持されている。このモデルはゲルを繊維のでたらめな網
目ととらえて、巨大分子の電気泳動移動度がその巨大分
子が進入することができるゲルの孔の体積分率に比例す
ると述べている（Rodbard およびChrambach 、Proc. Na
tl. Acad. Sci.ＵＳＡ６５（１９７０年）９０７−９７
７および Tietz、 Adv. Electrophoresis ２（１９８８
年）１０９−１６９）。このモデルはまた移動する分子
とゲル繊維との間には接触がないと仮定する。測定され
た電気泳動移動度μは半径Ｒの移動する分子の溶液にお
ける自由移動度μo およびゲルパーセントＴ、ゲル繊維
の全長ｌ′、および繊維の半径ｒに関連し得る。
度のゲルが必要であるとする考え方はゲル電気泳動の拡
張オグストン（ Ogsten ）モデルに基づく理論により支
持されている。このモデルはゲルを繊維のでたらめな網
目ととらえて、巨大分子の電気泳動移動度がその巨大分
子が進入することができるゲルの孔の体積分率に比例す
ると述べている（Rodbard およびChrambach 、Proc. Na
tl. Acad. Sci.ＵＳＡ６５（１９７０年）９０７−９７
７および Tietz、 Adv. Electrophoresis ２（１９８８
年）１０９−１６９）。このモデルはまた移動する分子
とゲル繊維との間には接触がないと仮定する。測定され
た電気泳動移動度μは半径Ｒの移動する分子の溶液にお
ける自由移動度μo およびゲルパーセントＴ、ゲル繊維
の全長ｌ′、および繊維の半径ｒに関連し得る。
【０００７】
【数１】
【０００８】この式はRodbard とChrambach （Proc. Na
tl. Acad. Sci.６５（１９７０年）９７０−９７７）の
式２５に対応する。この式から、Ｋｒａが減少すると、
すなわちＤＮＡフラグメントａのサイズが小さくなる
と、フラグメントａおよびｂの分解に必要なゲル濃度Ｔ
が増大することがわかる。しかしながら、上記のとお
り、高いポリマー濃度のゲルが液中電気泳動モードで泳
動が行なわれると、分離されたバンドが曲がる。したが
って、先行技術からは、分離されたバンドの屈曲を制御
するため、ゲルイオン組成の必要な調節を行なわずに液
中ゲル電気泳動による最適分解能を達成することは不可
能のように思われた。
tl. Acad. Sci.６５（１９７０年）９７０−９７７）の
式２５に対応する。この式から、Ｋｒａが減少すると、
すなわちＤＮＡフラグメントａのサイズが小さくなる
と、フラグメントａおよびｂの分解に必要なゲル濃度Ｔ
が増大することがわかる。しかしながら、上記のとお
り、高いポリマー濃度のゲルが液中電気泳動モードで泳
動が行なわれると、分離されたバンドが曲がる。したが
って、先行技術からは、分離されたバンドの屈曲を制御
するため、ゲルイオン組成の必要な調節を行なわずに液
中ゲル電気泳動による最適分解能を達成することは不可
能のように思われた。
【０００９】拡張オグストンモデルは、イオンの半径Ｒ
が０でも、遅延係数は０より大きいので大変小さなイオ
ンもゲル内で遅延されることを教示する（式１）。しか
しながら、この式から、あるとしても、どの最小ゲル濃
度で緩衝液イオンの移動に対する抵抗が、ゲルと緩衝液
との導電性の違いがバンドの屈曲にあまり影響を与えな
い程度まで小さくなるかは予測できない。低いパーセン
テージのアガロースゲルにおける小さいサイズの巨大分
子の分解が劣ることが知られているので、合成ポリマー
を含むそのようなゲルがあるかどうかを見つけ出そうと
して実験が行なわれた。実際には、合成ゲルの最も低い
作用可能な濃度はその機械的安定性により決定され、こ
の安定性は低濃度の開始モノマー溶液の重合効率にほと
んど依存する。このことはアクリルアミドのみならず K
ozulicおよびHeimgartner の米国特許出願第２９３，８
４０号および第６９６，６９６号に開示される他の多く
の親水性および両親媒性のゲルに当てはまる。これらの
文献についてはここに引用により援用する。実際的に最
も低いゲルの濃度は多くの場合４％前後である。４％の
ゲル中でバンドの屈曲が依然としてわかるので（ Kozul
ic, ＰＣＴ／ＥＰ９２／００３６８）、これよりも低い
パーセンテージのゲルを調製する方法を見つけることが
重要であると思われた。先行技術の多くのゲルは２つの
ビニル二重結合を有する架橋剤の存在下に重合された
が、架橋剤が多数の二重結合を有するポリマーである場
合もあった。この架橋剤はアクリルエイド（Acryl Aid
e）（ＦＭＣ社の商標）として知られるアリルグリシジ
ルエーテル（Nochumson の米国特許第４，５０４，６４
１号）で置換したアガロースポリマーであった。機械的
により安定した低いパーセンテージのゲルが望ましいの
で、そのようなゲルを得る試みとしてアクリルエイド
（商標）アガロースポリマーを共重合化の前にその水酸
基を介して架橋した。単一の大きくて枝分かれした架橋
されたビニルアガロースポリマーが、重合化の際に重合
化するモノマーから形成される多くの鎖を架橋しかつし
たがってマトリックスの機械的な安定性と小さい生体分
子の分解を改善すると考えられた。最初の実験では、６
％のポリ（ＮＡＴ）ゲルが異なる量の架橋されたビニル
アガロースで重合された。結果として得られたゲルの透
明度と機械的強度は標準的なもののようであった。電気
泳動の際のブロモフェノールブルートラッキング染料の
移動速度は正常なものであった。しかしながら、全く予
想に反して、ＤＮＡ分子の分解は、架橋ビニルアガロー
スの量が増えるとともに次第に失われて、ある架橋剤濃
度では分解は全くなくなった。驚くべきことに、ＤＮＡ
フラグメントが対照ゲルにおけるものと本質的に同じ距
離を移動した際でさえ分解は失われた。より高い架橋剤
の濃度では分解の損失に加えて移動速度が減少した。分
解の損失は低い分子重量範囲でまず発生した。
が０でも、遅延係数は０より大きいので大変小さなイオ
ンもゲル内で遅延されることを教示する（式１）。しか
しながら、この式から、あるとしても、どの最小ゲル濃
度で緩衝液イオンの移動に対する抵抗が、ゲルと緩衝液
との導電性の違いがバンドの屈曲にあまり影響を与えな
い程度まで小さくなるかは予測できない。低いパーセン
テージのアガロースゲルにおける小さいサイズの巨大分
子の分解が劣ることが知られているので、合成ポリマー
を含むそのようなゲルがあるかどうかを見つけ出そうと
して実験が行なわれた。実際には、合成ゲルの最も低い
作用可能な濃度はその機械的安定性により決定され、こ
の安定性は低濃度の開始モノマー溶液の重合効率にほと
んど依存する。このことはアクリルアミドのみならず K
ozulicおよびHeimgartner の米国特許出願第２９３，８
４０号および第６９６，６９６号に開示される他の多く
の親水性および両親媒性のゲルに当てはまる。これらの
文献についてはここに引用により援用する。実際的に最
も低いゲルの濃度は多くの場合４％前後である。４％の
ゲル中でバンドの屈曲が依然としてわかるので（ Kozul
ic, ＰＣＴ／ＥＰ９２／００３６８）、これよりも低い
パーセンテージのゲルを調製する方法を見つけることが
重要であると思われた。先行技術の多くのゲルは２つの
ビニル二重結合を有する架橋剤の存在下に重合された
が、架橋剤が多数の二重結合を有するポリマーである場
合もあった。この架橋剤はアクリルエイド（Acryl Aid
e）（ＦＭＣ社の商標）として知られるアリルグリシジ
ルエーテル（Nochumson の米国特許第４，５０４，６４
１号）で置換したアガロースポリマーであった。機械的
により安定した低いパーセンテージのゲルが望ましいの
で、そのようなゲルを得る試みとしてアクリルエイド
（商標）アガロースポリマーを共重合化の前にその水酸
基を介して架橋した。単一の大きくて枝分かれした架橋
されたビニルアガロースポリマーが、重合化の際に重合
化するモノマーから形成される多くの鎖を架橋しかつし
たがってマトリックスの機械的な安定性と小さい生体分
子の分解を改善すると考えられた。最初の実験では、６
％のポリ（ＮＡＴ）ゲルが異なる量の架橋されたビニル
アガロースで重合された。結果として得られたゲルの透
明度と機械的強度は標準的なもののようであった。電気
泳動の際のブロモフェノールブルートラッキング染料の
移動速度は正常なものであった。しかしながら、全く予
想に反して、ＤＮＡ分子の分解は、架橋ビニルアガロー
スの量が増えるとともに次第に失われて、ある架橋剤濃
度では分解は全くなくなった。驚くべきことに、ＤＮＡ
フラグメントが対照ゲルにおけるものと本質的に同じ距
離を移動した際でさえ分解は失われた。より高い架橋剤
の濃度では分解の損失に加えて移動速度が減少した。分
解の損失は低い分子重量範囲でまず発生した。
【００１０】上記の実験データの重要性は実際的には限
られたもののように思われるが、ゲルにおける巨大分子
の電気泳動のための新たなモデルの開発への手掛りであ
った。そのモデルについて以下に記載する。ゲルはラン
ダムに分布したポリマー鎖および水を含むブロックとみ
なす。ポリマー鎖は長さに応じた異なる動きの自由度を
有している。動きの自由度が高い領域は低い動き自由度
の点により分離され、この点が合成ゲルにおける架橋点
に対応する。透明のゲル内には決まった形状または大き
さの孔はない。したがって、電界中を泳動し始める前に
巨大分子が入ることのできる規定された空間または容積
は存在しない。ひとたび移動を開始すると、巨大分子は
ポリマー鎖を押して占有する空間を作り出す。巨大分子
ははっきり分かれたステップで経路に沿って移動し各ス
テップごとに１つのゲル層を通過する。ゲルの層は移動
する分子の方向に直角をなすゲルの断面として定義す
る。ゲルの層はポリマー鎖の半径よりも厚いが、移動す
る巨大分子の半径または長さよりは薄い。したがって、
移動する分子は第１の層を完全に通過する前に第２の層
に遭遇し得るが、その移動に対する抵抗は第２の層によ
ってのみ与えられる。このモデルには、巨大分子が層を
通過し得る２つの方法がある点が重要である。すなわ
ち、分子は途中にポリマーの動き自由度が高い領域に遭
遇するとポリマー鎖を押しのける。このようにして巨大
分子は層に「扉」をあけることになる。途中にポリマー
の動き自由度が低い領域に遭遇すると、巨大分子は層を
変形させて開口を形成する。この開口は１つまたは２つ
以上のポリマー鎖が終る場所またはポリマー鎖がより少
なく架橋されるか絡まっている場所に作られる。巨大分
子はこうして層の中に「廊下」を作り出す。１つの層に
「廊下」を作り出した後上下少なくとも１つの層のいく
つかのポリマー鎖の位置が変えられる。移動する巨大分
子が次の層で類似する場所に遭遇した場合、分子は再び
廊下をあける。これらの２つの「廊下」がつながれて１
つの廊下になりかつひいては同じ「廊下」がいくつかの
層にわたってつながることも可能である。
られたもののように思われるが、ゲルにおける巨大分子
の電気泳動のための新たなモデルの開発への手掛りであ
った。そのモデルについて以下に記載する。ゲルはラン
ダムに分布したポリマー鎖および水を含むブロックとみ
なす。ポリマー鎖は長さに応じた異なる動きの自由度を
有している。動きの自由度が高い領域は低い動き自由度
の点により分離され、この点が合成ゲルにおける架橋点
に対応する。透明のゲル内には決まった形状または大き
さの孔はない。したがって、電界中を泳動し始める前に
巨大分子が入ることのできる規定された空間または容積
は存在しない。ひとたび移動を開始すると、巨大分子は
ポリマー鎖を押して占有する空間を作り出す。巨大分子
ははっきり分かれたステップで経路に沿って移動し各ス
テップごとに１つのゲル層を通過する。ゲルの層は移動
する分子の方向に直角をなすゲルの断面として定義す
る。ゲルの層はポリマー鎖の半径よりも厚いが、移動す
る巨大分子の半径または長さよりは薄い。したがって、
移動する分子は第１の層を完全に通過する前に第２の層
に遭遇し得るが、その移動に対する抵抗は第２の層によ
ってのみ与えられる。このモデルには、巨大分子が層を
通過し得る２つの方法がある点が重要である。すなわ
ち、分子は途中にポリマーの動き自由度が高い領域に遭
遇するとポリマー鎖を押しのける。このようにして巨大
分子は層に「扉」をあけることになる。途中にポリマー
の動き自由度が低い領域に遭遇すると、巨大分子は層を
変形させて開口を形成する。この開口は１つまたは２つ
以上のポリマー鎖が終る場所またはポリマー鎖がより少
なく架橋されるか絡まっている場所に作られる。巨大分
子はこうして層の中に「廊下」を作り出す。１つの層に
「廊下」を作り出した後上下少なくとも１つの層のいく
つかのポリマー鎖の位置が変えられる。移動する巨大分
子が次の層で類似する場所に遭遇した場合、分子は再び
廊下をあける。これらの２つの「廊下」がつながれて１
つの廊下になりかつひいては同じ「廊下」がいくつかの
層にわたってつながることも可能である。
【００１１】巨大分子が層を通過する途中にもっぱら
「扉」をあけるかまたは「廊下」をあけるかは、完全に
２つの力のバランスに依存する。層に対し作用する第１
の力とは界面動力でありかつこれは電界中を移動するす
べてのマクロイオンにより出される。この力は層を含む
ポリマー鎖の抵抗により対抗される。ポリマー鎖はそれ
らの配列におけるいかなる変化に対しても抵抗を示し、
というのもゲル形成の間にそれらがエネルギ的に最も好
ましい位置を得ているからである。ポリマー鎖の抵抗に
対する界面動力が低い場合には「廊下」がもっぱら形成
されることになる。２つの力が類似する大きさである場
合には、開口の一部が扉となりかつ一部が「廊下」とな
る。界面動力と抵抗の比が大さい場合には、層における
開口はもっぱら「扉」となる。
「扉」をあけるかまたは「廊下」をあけるかは、完全に
２つの力のバランスに依存する。層に対し作用する第１
の力とは界面動力でありかつこれは電界中を移動するす
べてのマクロイオンにより出される。この力は層を含む
ポリマー鎖の抵抗により対抗される。ポリマー鎖はそれ
らの配列におけるいかなる変化に対しても抵抗を示し、
というのもゲル形成の間にそれらがエネルギ的に最も好
ましい位置を得ているからである。ポリマー鎖の抵抗に
対する界面動力が低い場合には「廊下」がもっぱら形成
されることになる。２つの力が類似する大きさである場
合には、開口の一部が扉となりかつ一部が「廊下」とな
る。界面動力と抵抗の比が大さい場合には、層における
開口はもっぱら「扉」となる。
【００１２】時間的に見ると、「扉」の形成は「廊下」
の形成よりも速い、というのも移動する巨大分子にとっ
ては多くのポリマー鎖からなるゲル層の一部を変形させ
ることよりも１つ以上のポリマー鎖を押しのけて開口を
形成する方が速いからである。一定の電荷対サイズ比を
有するＤＮＡフラグメントの場合には、フラグメントが
長いほど生じる力は強くなるが、移動の速度は遅くな
る、というのもこれらが作る開口はほとんどが「廊下」
になるからである。巨大分子が層を通過する途中に
「扉」と「廊下」の双方をあける場合には巨大分子の分
解は良好であると考えられる。分子が「扉」のみまたは
「廊下」のみをあける場合にはほとんど分解が起こらな
いかまたは分解が皆無であるが、ゲルの構造は、巨大分
子が「廊下」をあけることができるようにする必要があ
る。したがって、異なる層のポリマーが「廊下」をあけ
るのに十分に位置を変えられ得るような態様に接続され
る必要がある。異なる層のポリマー鎖が上に述べたもの
のような大きい枝分かれした架橋剤で接続される場合に
は「廊下」があけられ得ず分解も起こらない。
の形成よりも速い、というのも移動する巨大分子にとっ
ては多くのポリマー鎖からなるゲル層の一部を変形させ
ることよりも１つ以上のポリマー鎖を押しのけて開口を
形成する方が速いからである。一定の電荷対サイズ比を
有するＤＮＡフラグメントの場合には、フラグメントが
長いほど生じる力は強くなるが、移動の速度は遅くな
る、というのもこれらが作る開口はほとんどが「廊下」
になるからである。巨大分子が層を通過する途中に
「扉」と「廊下」の双方をあける場合には巨大分子の分
解は良好であると考えられる。分子が「扉」のみまたは
「廊下」のみをあける場合にはほとんど分解が起こらな
いかまたは分解が皆無であるが、ゲルの構造は、巨大分
子が「廊下」をあけることができるようにする必要があ
る。したがって、異なる層のポリマーが「廊下」をあけ
るのに十分に位置を変えられ得るような態様に接続され
る必要がある。異なる層のポリマー鎖が上に述べたもの
のような大きい枝分かれした架橋剤で接続される場合に
は「廊下」があけられ得ず分解も起こらない。
【００１３】新しいモデルでは、いくつかの分子がほと
んどの層に「廊下」をあけ、「扉」と「廊下」の双方を
あけるものよりも速く移動するであろうと予測する、と
いうのも１つの「廊下」はいくつかの層にわたることが
可能で、そのような分子は１つのステップでこれらの層
を通過し得るからである。言いかえれば、あるゲルにお
いては、低い電界強度でもより大きい分子がより小さい
分子よりも速く移動し得る。この予測を裏付ける例をこ
こに提示する。ビス（Bis ）で架橋された標準６％ポリ
（ＮＡＴ）ゲル中では７Ｖ／ｃｍで単向性電界において
２３ｋｂｐＤＮＡフラグメントが９．４ｋｂｐフラグメ
ントよりも速く移動したことがわかった。この結果は拡
張オグストンモデルでは説明がつかない、というのも式
１によれば大きな分子が常に高い遅延係数を有しており
かつしたがって、移動がより遅いからである。さらに、
上記の結果は、ある大きさを上回るＤＮＡ分子は均一な
電界中では同じ速度ですべて移動するのでこれら分子の
分解が失われると述べている、ＤＮＡゲル電気泳動の繰
り返しモデルに合致しない（Lumpkin 他のBiopolymers
２４（１９８５年）１５７３−１５９３）。先行技術に
おいて報告された、説明の難しいまたは説明の不可能だ
った多くの実験による発見は本明細書中に提示するモデ
ルにより説明がつくが、それは本筋から外れる。
んどの層に「廊下」をあけ、「扉」と「廊下」の双方を
あけるものよりも速く移動するであろうと予測する、と
いうのも１つの「廊下」はいくつかの層にわたることが
可能で、そのような分子は１つのステップでこれらの層
を通過し得るからである。言いかえれば、あるゲルにお
いては、低い電界強度でもより大きい分子がより小さい
分子よりも速く移動し得る。この予測を裏付ける例をこ
こに提示する。ビス（Bis ）で架橋された標準６％ポリ
（ＮＡＴ）ゲル中では７Ｖ／ｃｍで単向性電界において
２３ｋｂｐＤＮＡフラグメントが９．４ｋｂｐフラグメ
ントよりも速く移動したことがわかった。この結果は拡
張オグストンモデルでは説明がつかない、というのも式
１によれば大きな分子が常に高い遅延係数を有しており
かつしたがって、移動がより遅いからである。さらに、
上記の結果は、ある大きさを上回るＤＮＡ分子は均一な
電界中では同じ速度ですべて移動するのでこれら分子の
分解が失われると述べている、ＤＮＡゲル電気泳動の繰
り返しモデルに合致しない（Lumpkin 他のBiopolymers
２４（１９８５年）１５７３−１５９３）。先行技術に
おいて報告された、説明の難しいまたは説明の不可能だ
った多くの実験による発見は本明細書中に提示するモデ
ルにより説明がつくが、それは本筋から外れる。
【００１４】先行技術では、より速いまたはより遅い電
気泳動は一般により高いまたはより低いゲルの多孔性に
関連していた。本明細書中に提示するモデルは、孔が存
在していないので透明のゲル中では巨大分子が孔を通っ
て移動しないことを記載しているが、「多孔性」および
「有効多孔性」という用語を先行技術に報告される結果
との対比をより容易にするためにここで使用することに
する。もう１つの理由は、先行技術の多くの報告には使
用されたゲルの透明度ついての言及がないからである。
気泳動は一般により高いまたはより低いゲルの多孔性に
関連していた。本明細書中に提示するモデルは、孔が存
在していないので透明のゲル中では巨大分子が孔を通っ
て移動しないことを記載しているが、「多孔性」および
「有効多孔性」という用語を先行技術に報告される結果
との対比をより容易にするためにここで使用することに
する。もう１つの理由は、先行技術の多くの報告には使
用されたゲルの透明度ついての言及がないからである。
【００１５】上記のモデルは合成ポリマーを含むゲルで
得られた実験データに基づいていた。新しいモデルをよ
りよくするためには、天然ポリマーを含むゲルを使用し
た根拠となる結果を得ることが望ましかった。架橋され
たビニルアガロースポリマーを上記の重要な実験におい
てゲル成分として使用したので、架橋されたアガロース
ゲルが同じような行動すなわち架橋の後に分解が劣化す
ると考えることが妥当と思われた。アガロースポリマー
が高温で溶解しかつ冷却することで電気泳動に適したゲ
ルを形成することは広く知られている。架橋反応が、ア
ガロースポリマーが依然として完全に溶液状態にある温
度で行なわれた場合、ゲルが形成されると、結果として
形成されたゲル中に「廊下」があかないような態様で架
橋することが考えられた。この仮説を確証するために、
１％アガロース溶液中にエピクロロヒドリンと水酸化ナ
トリウムとを添加してその混合物を４５℃と６５℃でイ
ンキュベートした。架橋剤を加えない対照アガロース溶
液はこの２つの温度のいずれでも取扱い可能なゲルの状
態まで凝固しないことが観察されたが、エピクロロヒド
リンの存在下では、その双方の温度でゲルが形成され
た。驚くべきことに、標準１％アガロースゲルの特徴的
な不透明性とは対照的に、双方のゲルともに完全に透明
であった。ＤＮＡフラグメントの電気泳動は６５℃、特
に２００−６００ｂｐ範囲で架橋されたゲル中では劣っ
た分解しか示さなかった。しかしながら予想に反して４
５℃で架橋したゲル中では同じ条件下で電気泳動を行な
ったところ同じ２００−６００ｂｐ範囲において大変良
好なＤＮＡフラグメントの分解が見られた。この驚くべ
き結果がえられたので、他の架橋剤および架橋条件をテ
ストすることが妥当であった。上記の実験の一般的な特
徴は一定したままであった、すなわちゲルの形成と架橋
反応は溶解したアガロースの水溶液中で同時に進行し
た。ゲルは常に連続する吸着床の形であった。さらに、
架橋剤はポリマーの水酸基と反応して荷電基をゲル中に
取入れることなくエーテル結合を形成した。
得られた実験データに基づいていた。新しいモデルをよ
りよくするためには、天然ポリマーを含むゲルを使用し
た根拠となる結果を得ることが望ましかった。架橋され
たビニルアガロースポリマーを上記の重要な実験におい
てゲル成分として使用したので、架橋されたアガロース
ゲルが同じような行動すなわち架橋の後に分解が劣化す
ると考えることが妥当と思われた。アガロースポリマー
が高温で溶解しかつ冷却することで電気泳動に適したゲ
ルを形成することは広く知られている。架橋反応が、ア
ガロースポリマーが依然として完全に溶液状態にある温
度で行なわれた場合、ゲルが形成されると、結果として
形成されたゲル中に「廊下」があかないような態様で架
橋することが考えられた。この仮説を確証するために、
１％アガロース溶液中にエピクロロヒドリンと水酸化ナ
トリウムとを添加してその混合物を４５℃と６５℃でイ
ンキュベートした。架橋剤を加えない対照アガロース溶
液はこの２つの温度のいずれでも取扱い可能なゲルの状
態まで凝固しないことが観察されたが、エピクロロヒド
リンの存在下では、その双方の温度でゲルが形成され
た。驚くべきことに、標準１％アガロースゲルの特徴的
な不透明性とは対照的に、双方のゲルともに完全に透明
であった。ＤＮＡフラグメントの電気泳動は６５℃、特
に２００−６００ｂｐ範囲で架橋されたゲル中では劣っ
た分解しか示さなかった。しかしながら予想に反して４
５℃で架橋したゲル中では同じ条件下で電気泳動を行な
ったところ同じ２００−６００ｂｐ範囲において大変良
好なＤＮＡフラグメントの分解が見られた。この驚くべ
き結果がえられたので、他の架橋剤および架橋条件をテ
ストすることが妥当であった。上記の実験の一般的な特
徴は一定したままであった、すなわちゲルの形成と架橋
反応は溶解したアガロースの水溶液中で同時に進行し
た。ゲルは常に連続する吸着床の形であった。さらに、
架橋剤はポリマーの水酸基と反応して荷電基をゲル中に
取入れることなくエーテル結合を形成した。
【００１６】いくつかの異なる架橋されたアガロース誘
導体が先行技術において知られている。 Ghetie の米国
特許第３，５０７，８５１号はエピクロロヒドリンでア
ガロース粒子を架橋することを開示する。 Porath 他の
米国特許第３，９５９，２５１号および英国特許１，３
５２，６１３号は還元剤の存在下にいくつかの二価性試
薬で架橋することによりアガロースビーズを安定させる
ことを開示する。結果として得られるビーズはより剛性
で、クロマトグラフィーのためにカラムにパックされた
際にはより高い流量を示した。 Ghetie と Porath の方
法および生産物は本件に示されるものとは明らかに相違
する。すなわち、架橋反応はゲルが形成された後に行な
われてかつ結果として得られた生成物は粒子の形であ
る。
導体が先行技術において知られている。 Ghetie の米国
特許第３，５０７，８５１号はエピクロロヒドリンでア
ガロース粒子を架橋することを開示する。 Porath 他の
米国特許第３，９５９，２５１号および英国特許１，３
５２，６１３号は還元剤の存在下にいくつかの二価性試
薬で架橋することによりアガロースビーズを安定させる
ことを開示する。結果として得られるビーズはより剛性
で、クロマトグラフィーのためにカラムにパックされた
際にはより高い流量を示した。 Ghetie と Porath の方
法および生産物は本件に示されるものとは明らかに相違
する。すなわち、架橋反応はゲルが形成された後に行な
われてかつ結果として得られた生成物は粒子の形であ
る。
【００１７】プレート形状の架橋されたアガロースゲル
も知られている。すなわちHonkanenの米国特許第３，８
６０，５７３号は塩化アシル、塩化スルホニル、および
イソチオシアナトから選択された２つの等しい官能基を
含む二価性試薬で架橋したアガロースゲルを開示する。
架橋反応は懸濁されかつ溶解していないアガロースポリ
マーで有機溶媒中で行なわれた。上に述べた官能基を有
する化合物は水と素早く反応するので、この反応は水中
ではうまく行なわれなかった。二価性試薬で形成された
結合はエステル、スルホン酸またはチオカルバメートで
あった。さらに、１つの官能基を通してのみ反応した架
橋剤分子もあったはずで、他の官能基はゲルを水と接触
させた際に加水分解した。この副作用でカルボン酸基お
よびスルホン酸基といった荷電基がマトリックス中に取
込まれた。上記の違いにより、Honkanenの方法および生
成物はここに開示する本件のものとはかなり相違する。
も知られている。すなわちHonkanenの米国特許第３，８
６０，５７３号は塩化アシル、塩化スルホニル、および
イソチオシアナトから選択された２つの等しい官能基を
含む二価性試薬で架橋したアガロースゲルを開示する。
架橋反応は懸濁されかつ溶解していないアガロースポリ
マーで有機溶媒中で行なわれた。上に述べた官能基を有
する化合物は水と素早く反応するので、この反応は水中
ではうまく行なわれなかった。二価性試薬で形成された
結合はエステル、スルホン酸またはチオカルバメートで
あった。さらに、１つの官能基を通してのみ反応した架
橋剤分子もあったはずで、他の官能基はゲルを水と接触
させた際に加水分解した。この副作用でカルボン酸基お
よびスルホン酸基といった荷電基がマトリックス中に取
込まれた。上記の違いにより、Honkanenの方法および生
成物はここに開示する本件のものとはかなり相違する。
【００１８】多糖ゲルの処理のためのもう１つの方法は
Tixierの米国特許第３，９５６，２７２号に開示される
ような２，４，６−トリクロロ−１，３，５−トリアジ
ンの溶液中に多糖ゲルを懸濁または溶解させるステップ
を含む。結果として得られる強化されたゲルはプレート
の形状になり得る。 Tixier の方法に関しては、開始架
橋剤のトリアジン環がアガロースマトリックス中に取込
まれる点に留意されたい。さらに、３つの架橋剤塩素原
子の各々がアガロースの水酸基または水のいずれかと反
応する可能性があった。したがって、取込まれたトリア
ジン分子のいくつかがシアヌル酸誘導体すなわち最初に
塩素に結合される炭素原子で１つまたは２つの水酸基を
含む化合物に転換されることは避けられない。これらの
水酸基は低いｐＫ値を有していることが知られておりか
つこれらは高いｐＨで荷電される。さらに、各トリアジ
ン環は３つの窒素原子を含んでおりかつ第３アミンとし
てトリアジンは低いｐＨでプロトン化されることにな
る。したがって、 Tixier の架橋反応はゲル中に荷電さ
れた化学基を導入する。
Tixierの米国特許第３，９５６，２７２号に開示される
ような２，４，６−トリクロロ−１，３，５−トリアジ
ンの溶液中に多糖ゲルを懸濁または溶解させるステップ
を含む。結果として得られる強化されたゲルはプレート
の形状になり得る。 Tixier の方法に関しては、開始架
橋剤のトリアジン環がアガロースマトリックス中に取込
まれる点に留意されたい。さらに、３つの架橋剤塩素原
子の各々がアガロースの水酸基または水のいずれかと反
応する可能性があった。したがって、取込まれたトリア
ジン分子のいくつかがシアヌル酸誘導体すなわち最初に
塩素に結合される炭素原子で１つまたは２つの水酸基を
含む化合物に転換されることは避けられない。これらの
水酸基は低いｐＫ値を有していることが知られておりか
つこれらは高いｐＨで荷電される。さらに、各トリアジ
ン環は３つの窒素原子を含んでおりかつ第３アミンとし
てトリアジンは低いｐＨでプロトン化されることにな
る。したがって、 Tixier の架橋反応はゲル中に荷電さ
れた化学基を導入する。
【００１９】Honkanenと Tixier は、架橋されたアガロ
ースゲルが電気泳動のための媒質として使用され得る点
を報告している。これらのマトリックスの特性に関して
は、Honkanen は、大きい分子（たんぱく質）の動きは
架橋されたアガロース中でより急速であり、これが架橋
反応による有効多孔性の増大を示していると考えられる
点を教示する。 Tixier は処理されたゲルがふるい分け
および分解指数については処理されていないゲルと本質
的に同じ特徴を有していたことを開示する。 Tixier の
結果は Porath の報告に合致する（J. Chromatogr.１０
３（１９７５年）４９−６２）、 Porath は架橋された
アガロースビーズがその多孔性を変化させないことを発
見した。したがって、本明細書中に開示する架橋された
ゲルにおいて観察された大きいたんぱく質分子および中
くらいの大きさのＤＮＡの移動の減少と劇的に改善され
た分解とは全く予期されていない。さらに、本願のゲル
の透明度の改善は驚くべきほどで、というのも Honkane
n または Tixier のいずれもゲルの不透明性が架橋で変
化した点については述べていないからである。
ースゲルが電気泳動のための媒質として使用され得る点
を報告している。これらのマトリックスの特性に関して
は、Honkanen は、大きい分子（たんぱく質）の動きは
架橋されたアガロース中でより急速であり、これが架橋
反応による有効多孔性の増大を示していると考えられる
点を教示する。 Tixier は処理されたゲルがふるい分け
および分解指数については処理されていないゲルと本質
的に同じ特徴を有していたことを開示する。 Tixier の
結果は Porath の報告に合致する（J. Chromatogr.１０
３（１９７５年）４９−６２）、 Porath は架橋された
アガロースビーズがその多孔性を変化させないことを発
見した。したがって、本明細書中に開示する架橋された
ゲルにおいて観察された大きいたんぱく質分子および中
くらいの大きさのＤＮＡの移動の減少と劇的に改善され
た分解とは全く予期されていない。さらに、本願のゲル
の透明度の改善は驚くべきほどで、というのも Honkane
n または Tixier のいずれもゲルの不透明性が架橋で変
化した点については述べていないからである。
【００２０】先行技術ではまた誘導されたアガロースを
含む電気泳動ゲルも知られている。すなわちGuisely の
米国特許第３，９５６，２７３号と Cook の第４，３１
９，９７５号は多くの誘導されたアガロースポリマーを
開示する。誘導反応の後、ポリマーは精製されかつ乾燥
される。電気泳動用のゲルを形成するため、乾燥粉末粒
子が熱湯に溶解されて、この溶液が冷却される。修飾試
薬のほとんどは単官能性であったが、二価性試薬を用い
ることもできる。しかしながら、Guisely は二価性試薬
のアガロースに対する比および誘導条件は、ポリマー鎖
が架橋されないようにする必要があると教示している、
その理由は、さもなければ結果として得られる生成物は
後の電気泳動ゲルの調製段階で必要な再溶解ができない
可能性があるからである。したがって、Guisely と本願
の方法は共通する架橋剤であるエピクロロヒドリンを使
用するが、本願の方法では架橋剤反応と電気泳動用ゲル
の形成が同時に行なわれかつ架橋剤のアガロースに対す
る比率がずっと高いので、これら２つの方法は相違して
いる。このような相違により異なる生成物が得られるの
で、本願の生成物はとりわけ水不溶性であるという特徴
を有し、一方Guisely と Cook のアガロースゲルは加熱
で再溶解し得るという特徴を有する。
含む電気泳動ゲルも知られている。すなわちGuisely の
米国特許第３，９５６，２７３号と Cook の第４，３１
９，９７５号は多くの誘導されたアガロースポリマーを
開示する。誘導反応の後、ポリマーは精製されかつ乾燥
される。電気泳動用のゲルを形成するため、乾燥粉末粒
子が熱湯に溶解されて、この溶液が冷却される。修飾試
薬のほとんどは単官能性であったが、二価性試薬を用い
ることもできる。しかしながら、Guisely は二価性試薬
のアガロースに対する比および誘導条件は、ポリマー鎖
が架橋されないようにする必要があると教示している、
その理由は、さもなければ結果として得られる生成物は
後の電気泳動ゲルの調製段階で必要な再溶解ができない
可能性があるからである。したがって、Guisely と本願
の方法は共通する架橋剤であるエピクロロヒドリンを使
用するが、本願の方法では架橋剤反応と電気泳動用ゲル
の形成が同時に行なわれかつ架橋剤のアガロースに対す
る比率がずっと高いので、これら２つの方法は相違して
いる。このような相違により異なる生成物が得られるの
で、本願の生成物はとりわけ水不溶性であるという特徴
を有し、一方Guisely と Cook のアガロースゲルは加熱
で再溶解し得るという特徴を有する。
【００２１】先行技術には、アガロースゲルの特性を変
えるほかの方法も知られている。たとえば、電気浸透は
アガロースを他の多糖と混合することによりなくすこと
ができ（米国特許第４，２９０，９１１号）、ＬＤＨイ
ソ酵素分解能は酸性多糖の添加により改善することが可
能で（米国特許第４，３２１，１２１号）、かつゲルの
多孔性はゲル化の際の塩勾配を利用して連続的に変化さ
せるこが可能である（米国特許第５，００９，７５９
号）。
えるほかの方法も知られている。たとえば、電気浸透は
アガロースを他の多糖と混合することによりなくすこと
ができ（米国特許第４，２９０，９１１号）、ＬＤＨイ
ソ酵素分解能は酸性多糖の添加により改善することが可
能で（米国特許第４，３２１，１２１号）、かつゲルの
多孔性はゲル化の際の塩勾配を利用して連続的に変化さ
せるこが可能である（米国特許第５，００９，７５９
号）。
【００２２】上述のゲルはアガロースポリマーを含んで
いた。これらのポリマーはアルファ１−４結合で結合さ
れかつしたがって線状ポリマーを形成するＤ−ガラクト
ースおよび３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースから
構成される。枝分かれした多糖ポリマーも広く知られて
おり、かつそのいくつかは電気泳動用のゲルの調製に使
用されている。すなわち、デンプンから作られるゲルが
電気泳動用の最も古い媒質の１つである。Soderberg の
米国特許第４，０９４，８３２号に開示されるとおり、
誘導されたデキストランポリマーも電気泳動用ゲルの成
分として使用され得る。デキストランポリマーは、グル
コースユニット中の水酸基が二重結合を含む官能基で置
換されるような態様で化学的に修飾されていた。これら
の二重結合が小さな分子重量のモノマーと重合または共
重合した際に遊離基重合によりゲルの形成が発生した。
Soderberg は電気泳動用ゲルを製作するためにデキスト
ラン鎖を小さな架橋剤と架橋する可能性について述べて
はいるが、拡散によって架橋反応の副産物を取除くのに
数ヵ月もかかることからこの可能性は非現実的であると
思われる。このことは垂直スラブまたはチューブゲルに
も当てはまるが、これらゲルの上側がオープンでかつ拡
散経路が短いために液中ゲル電気泳動のためのゲル中で
は副産物は素早く除去される。Soderberg から、副産物
の除去のための実際的な方法が見つかるとすれば、架橋
されたデキストランからなるゲルが電気泳動に適してい
ると思われる点が推論され得る。しかしながら、以下に
述べるとおり、この枝分かれした多糖からなるゲルは不
適当であることがわかった。
いた。これらのポリマーはアルファ１−４結合で結合さ
れかつしたがって線状ポリマーを形成するＤ−ガラクト
ースおよび３，６−アンヒドロ−Ｌ−ガラクトースから
構成される。枝分かれした多糖ポリマーも広く知られて
おり、かつそのいくつかは電気泳動用のゲルの調製に使
用されている。すなわち、デンプンから作られるゲルが
電気泳動用の最も古い媒質の１つである。Soderberg の
米国特許第４，０９４，８３２号に開示されるとおり、
誘導されたデキストランポリマーも電気泳動用ゲルの成
分として使用され得る。デキストランポリマーは、グル
コースユニット中の水酸基が二重結合を含む官能基で置
換されるような態様で化学的に修飾されていた。これら
の二重結合が小さな分子重量のモノマーと重合または共
重合した際に遊離基重合によりゲルの形成が発生した。
Soderberg は電気泳動用ゲルを製作するためにデキスト
ラン鎖を小さな架橋剤と架橋する可能性について述べて
はいるが、拡散によって架橋反応の副産物を取除くのに
数ヵ月もかかることからこの可能性は非現実的であると
思われる。このことは垂直スラブまたはチューブゲルに
も当てはまるが、これらゲルの上側がオープンでかつ拡
散経路が短いために液中ゲル電気泳動のためのゲル中で
は副産物は素早く除去される。Soderberg から、副産物
の除去のための実際的な方法が見つかるとすれば、架橋
されたデキストランからなるゲルが電気泳動に適してい
ると思われる点が推論され得る。しかしながら、以下に
述べるとおり、この枝分かれした多糖からなるゲルは不
適当であることがわかった。
【００２３】
【発明の目的】この発明の目的は小さい生体分子の分解
能を改善する電気泳動ゲルを提供することである。
能を改善する電気泳動ゲルを提供することである。
【００２４】この発明のもう１つの目的はゲル中で分離
したバンドが屈曲しない低ポリマー濃度の電気泳動ゲル
を提供することである。
したバンドが屈曲しない低ポリマー濃度の電気泳動ゲル
を提供することである。
【００２５】この発明のさらなる目的は光学特性が改善
した電気泳動ゲルを提供することである。
した電気泳動ゲルを提供することである。
【００２６】この発明のさらにもう１つの目的はこの発
明のゲルを電気泳動用媒質として使用する新規な方法を
提供することである。
明のゲルを電気泳動用媒質として使用する新規な方法を
提供することである。
【００２７】この発明の他の特徴および利点は添付の図
面とともに以下の記載を読むことにより、より明らかに
なることであろう。
面とともに以下の記載を読むことにより、より明らかに
なることであろう。
【００２８】
【発明の説明】高いポリマー濃度で泳動用緩衝液と同じ
緩衝液を含む液中電気泳動ゲル中では分離した種を表わ
すバンドが曲がる。この屈曲作用は電気泳動緩衝液とそ
の緩衝液中に浸漬されるゲルとの間の電流密度／導電率
の比における違いに関連する（Kozulic 、ＰＣＴ／ＥＰ
９２／００３６８）。この違いは、ポリマー鎖の緩衝
液イオンの移動に対する抵抗とおそらくはゲルと緩衝液
中のイオンの相対的移動速度の変化により存在する。抵
抗およびひいては導電性における違いはゲルのポリマー
濃度を下げることにより低減され得る。適当にポリマー
濃度の低い合成ゲルが存在するかどうかを見出すため、
新しい巨大分子の枝分かれした架橋剤を、この架橋剤
が、重合の際に重合するモノマーから形成される多くの
鎖を架橋結合することによりゲルの安定性と分解能を向
上させることを仮定して調製した。この架橋剤およびこ
れで架橋されるゲルの調製については例１に記載する。
図１は枝分かれした架橋剤の含まれる濃度を上げたゲル
中のＤＮＡ制限フラグメントの分離を示す。枝分かれし
た架橋剤に加えて、各ゲルは、そこから枝分かれしたも
のが調製される線状ポリマー架橋剤を含んでいた。２つ
の架橋剤の総重量はすべてのゲルにおいて一定であっ
た。図１からわかるとおり、既に少量の枝分かれした架
橋剤が低い分子重量の範囲では分解を妨げておりかつ分
解能の損失は枝分かれした架橋剤比が高いところではよ
り顕著である。より大きいフラグメントの間では分解は
徐々に悪化しかつ分解能は枝分かれした架橋剤のある量
で完全に失われる。枝分かれした架橋剤で架橋されたゲ
ルは本質的には線状架橋剤のみを含むゲルと同じくらい
透明であった。
緩衝液を含む液中電気泳動ゲル中では分離した種を表わ
すバンドが曲がる。この屈曲作用は電気泳動緩衝液とそ
の緩衝液中に浸漬されるゲルとの間の電流密度／導電率
の比における違いに関連する（Kozulic 、ＰＣＴ／ＥＰ
９２／００３６８）。この違いは、ポリマー鎖の緩衝
液イオンの移動に対する抵抗とおそらくはゲルと緩衝液
中のイオンの相対的移動速度の変化により存在する。抵
抗およびひいては導電性における違いはゲルのポリマー
濃度を下げることにより低減され得る。適当にポリマー
濃度の低い合成ゲルが存在するかどうかを見出すため、
新しい巨大分子の枝分かれした架橋剤を、この架橋剤
が、重合の際に重合するモノマーから形成される多くの
鎖を架橋結合することによりゲルの安定性と分解能を向
上させることを仮定して調製した。この架橋剤およびこ
れで架橋されるゲルの調製については例１に記載する。
図１は枝分かれした架橋剤の含まれる濃度を上げたゲル
中のＤＮＡ制限フラグメントの分離を示す。枝分かれし
た架橋剤に加えて、各ゲルは、そこから枝分かれしたも
のが調製される線状ポリマー架橋剤を含んでいた。２つ
の架橋剤の総重量はすべてのゲルにおいて一定であっ
た。図１からわかるとおり、既に少量の枝分かれした架
橋剤が低い分子重量の範囲では分解を妨げておりかつ分
解能の損失は枝分かれした架橋剤比が高いところではよ
り顕著である。より大きいフラグメントの間では分解は
徐々に悪化しかつ分解能は枝分かれした架橋剤のある量
で完全に失われる。枝分かれした架橋剤で架橋されたゲ
ルは本質的には線状架橋剤のみを含むゲルと同じくらい
透明であった。
【００２９】図１に示す結果は、巨大分子が移動してい
く際にゲルの層を変形させることを述べるゲル電気泳動
の新しいモデルにより説明することができる。枝分かれ
した架橋剤はゲル層の変形に干渉されるので分解能が失
われる。新しいモデルを裏付けるもう１つの結果が図２
に示される。図２は６％ポリ（ＮＡＴ）ゲル中での２．
０から２３ｋｂｐの範囲の様々な大きさのＤＮＡフラグ
メントの二次元電気泳動を示す写真である。第１の次元
では、ＤＮＡ分子は２Ｖ／ｃｍで３２時間流され、その
後ゲルは９０度回転させられて、電気泳動は７Ｖ／ｃｍ
で５時間続けられた。２Ｖ／ｃｍでＤＮＡフラグメント
の移動順序は予想されたとおりであった、すなわち最大
のフラグメントが最も短い距離を移動したのである。し
かしながら、７Ｖ／ｃｍでは最大のフラグメント（２３
ｋｂｐ）がその次に大きいフラグメント（９．４ｋｂ
ｐ）よりも速く移動した。この実験結果はゲル電気泳動
の拡張オグストンモデル改良型または反復モデルでは説
明ができない。
く際にゲルの層を変形させることを述べるゲル電気泳動
の新しいモデルにより説明することができる。枝分かれ
した架橋剤はゲル層の変形に干渉されるので分解能が失
われる。新しいモデルを裏付けるもう１つの結果が図２
に示される。図２は６％ポリ（ＮＡＴ）ゲル中での２．
０から２３ｋｂｐの範囲の様々な大きさのＤＮＡフラグ
メントの二次元電気泳動を示す写真である。第１の次元
では、ＤＮＡ分子は２Ｖ／ｃｍで３２時間流され、その
後ゲルは９０度回転させられて、電気泳動は７Ｖ／ｃｍ
で５時間続けられた。２Ｖ／ｃｍでＤＮＡフラグメント
の移動順序は予想されたとおりであった、すなわち最大
のフラグメントが最も短い距離を移動したのである。し
かしながら、７Ｖ／ｃｍでは最大のフラグメント（２３
ｋｂｐ）がその次に大きいフラグメント（９．４ｋｂ
ｐ）よりも速く移動した。この実験結果はゲル電気泳動
の拡張オグストンモデル改良型または反復モデルでは説
明ができない。
【００３０】例１で使用した枝分かれした架橋剤はアガ
ロースの誘導体であった。ゲル電気泳動のこの新しいモ
デルをより確実なものにするため、誘導されていないア
ガロースポリマーが、枝分かれしたビニル架橋剤の調製
に使用される同じ架橋剤エピクロロヒドリンで架橋され
た。架橋剤対アガロース比はビニル−アガロースポリマ
ーを架橋するのに使用したものと本質的に等しくした。
架橋反応は、アガロースポリマーが広い温度範囲でゲル
形態と平衡状態にあるため、様々な温度で行なった（Ｆ
ＭＣソースブック）。こうして、水酸化ナトリウムとエ
ピクロロヒドリンを１％アガロース溶液に添加した後、
この混合物を４５℃と６５℃でインキュベートした。対
照として、エピクロロヒドリンを含まずかつ水酸化ナト
リウムを加えたアガロース溶液を同じ温度でインキュベ
ートした。一晩インキュベートした後、対照アガロース
溶液を調べたところ２つの温度いずれのものも取扱い可
能なゲルには凝固していなかったが、エピクロロヒドリ
ンの存在下ではゲルは双方の温度で形成されていた。標
準１％アガロースゲルの特徴的な不透明性に比べて、架
橋されたゲルは完全に透明であった。ＤＮＡフラグメン
トの電気泳動の後、６５℃で架橋したゲル（図３）にお
いては、特に２００−６００ｂｐ範囲で分解能は劣って
いた。予想に反して、４５℃で架橋したゲル中で同じ条
件下で電気泳動を行なったところ同じ２００−６００ｂ
ｐ範囲（図４）でＤＮＡフラグメントの大変良好な分解
が得られた。このような驚くべき結果が得られたので、
図４に示されるゲルが例外的なものなのか、または高い
分解能の電気泳動に同じように適したゲルを生じる他の
架橋剤、ポリマーおよび架橋条件が存在するかについて
検証するため他の架橋剤および架橋条件をテストするこ
とが妥当であった。最初の架橋実験の一般的な特徴は一
定したままであった、すなわちゲルの形成と架橋反応は
溶解したポリマーの水溶液中で同時に進行した。ゲルは
常に連続するベッドの形態であった。さらに、架橋剤は
ポリマーの水酸基と反応して荷電基をゲル内に取込むこ
となくエーテル結合を形成した。
ロースの誘導体であった。ゲル電気泳動のこの新しいモ
デルをより確実なものにするため、誘導されていないア
ガロースポリマーが、枝分かれしたビニル架橋剤の調製
に使用される同じ架橋剤エピクロロヒドリンで架橋され
た。架橋剤対アガロース比はビニル−アガロースポリマ
ーを架橋するのに使用したものと本質的に等しくした。
架橋反応は、アガロースポリマーが広い温度範囲でゲル
形態と平衡状態にあるため、様々な温度で行なった（Ｆ
ＭＣソースブック）。こうして、水酸化ナトリウムとエ
ピクロロヒドリンを１％アガロース溶液に添加した後、
この混合物を４５℃と６５℃でインキュベートした。対
照として、エピクロロヒドリンを含まずかつ水酸化ナト
リウムを加えたアガロース溶液を同じ温度でインキュベ
ートした。一晩インキュベートした後、対照アガロース
溶液を調べたところ２つの温度いずれのものも取扱い可
能なゲルには凝固していなかったが、エピクロロヒドリ
ンの存在下ではゲルは双方の温度で形成されていた。標
準１％アガロースゲルの特徴的な不透明性に比べて、架
橋されたゲルは完全に透明であった。ＤＮＡフラグメン
トの電気泳動の後、６５℃で架橋したゲル（図３）にお
いては、特に２００−６００ｂｐ範囲で分解能は劣って
いた。予想に反して、４５℃で架橋したゲル中で同じ条
件下で電気泳動を行なったところ同じ２００−６００ｂ
ｐ範囲（図４）でＤＮＡフラグメントの大変良好な分解
が得られた。このような驚くべき結果が得られたので、
図４に示されるゲルが例外的なものなのか、または高い
分解能の電気泳動に同じように適したゲルを生じる他の
架橋剤、ポリマーおよび架橋条件が存在するかについて
検証するため他の架橋剤および架橋条件をテストするこ
とが妥当であった。最初の架橋実験の一般的な特徴は一
定したままであった、すなわちゲルの形成と架橋反応は
溶解したポリマーの水溶液中で同時に進行した。ゲルは
常に連続するベッドの形態であった。さらに、架橋剤は
ポリマーの水酸基と反応して荷電基をゲル内に取込むこ
となくエーテル結合を形成した。
【００３１】ポリマーを含む多くの水酸基およびこれら
水酸基と反応してエーテル結合を形成することができる
多くの架橋剤が存在する。ポリマーは合成または天然由
来のものでよく、かつ典型的なものにはポリビニル・ア
ルコール、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキ
シエチルセルロース、寒天、アガロース、ゲラン、プル
ラン、デンプンおよびデキストランが含まれる。ヒドロ
キシエチル・セルロースのようなポリマーは粘性水溶液
のままであるが、アガロースのように熱可逆性ゲルを形
成するものもある。適切な架橋剤は同じまたは異なる反
応性の官能基を有してよく、かつ典型的な例にはビス−
エポキシド、ハロ−エポキシド、ビス−ハロアルカン、
ビス−ハロアルコール、アルカンジオールビス−アルキ
ルまたはアリールスルホネートおよびジビニル−スルホ
ンが含まれる。架橋剤の反応基は異なるタイプでもよい
が、ポリマーからの水酸基との反応の後双方の基からエ
ーテル結合を形成する必要がある。ここで言及しなかっ
た他のポリマーおよび架橋剤についても使用できる。
水酸基と反応してエーテル結合を形成することができる
多くの架橋剤が存在する。ポリマーは合成または天然由
来のものでよく、かつ典型的なものにはポリビニル・ア
ルコール、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキ
シエチルセルロース、寒天、アガロース、ゲラン、プル
ラン、デンプンおよびデキストランが含まれる。ヒドロ
キシエチル・セルロースのようなポリマーは粘性水溶液
のままであるが、アガロースのように熱可逆性ゲルを形
成するものもある。適切な架橋剤は同じまたは異なる反
応性の官能基を有してよく、かつ典型的な例にはビス−
エポキシド、ハロ−エポキシド、ビス−ハロアルカン、
ビス−ハロアルコール、アルカンジオールビス−アルキ
ルまたはアリールスルホネートおよびジビニル−スルホ
ンが含まれる。架橋剤の反応基は異なるタイプでもよい
が、ポリマーからの水酸基との反応の後双方の基からエ
ーテル結合を形成する必要がある。ここで言及しなかっ
た他のポリマーおよび架橋剤についても使用できる。
【００３２】本願のゲルは、水酸基含有ポリマーを、エ
ーテル結合を介してポリマー鎖を結合することができる
架橋剤と反応させることにより形成される。このように
形成されるゲルの特性は特定のポリマーおよび架橋剤の
みに依存するのではなく架橋条件にも依存する。この事
実については既に示した（図３−４）が、以下にさらに
説明する。架橋条件を選択する際に考慮する必要がある
いくつかの重要な要素がある。すなわち反応の際にはポ
リマーは安定している必要があり、すなわち存在すれば
他の官能基が不特定に影響されないようにする必要があ
る。たとえばビスエポキシドは酸性および塩基性条件下
の双方で水酸基と反応するが、ポリマーが多糖の場合、
多糖におけるグリコシド結合は低いｐＨでは安定ではな
いので、塩基性ｐＨで架橋反応を行なう必要がある。さ
らに、架橋反応は、架橋剤の官能基との反応の後ゲル内
に荷電基を導入するような化合物なしで行なう必要があ
る。特に、アミンを避ける必要がある。この原則の例外
があるとすれば、開始ポリマーがわずかに荷電されてお
りかつマトリックスのプラスとマイナスの電荷の平衡を
とるためゲル中に少数の逆の電荷が導入される必要があ
る場合であり、この理由については米国特許第４，３１
２，７３９号に開示されている。架橋反応の際に所望で
あれば、水酸基を有する化合物または反応基を有してい
ない化合物が存在してもよい。
ーテル結合を介してポリマー鎖を結合することができる
架橋剤と反応させることにより形成される。このように
形成されるゲルの特性は特定のポリマーおよび架橋剤の
みに依存するのではなく架橋条件にも依存する。この事
実については既に示した（図３−４）が、以下にさらに
説明する。架橋条件を選択する際に考慮する必要がある
いくつかの重要な要素がある。すなわち反応の際にはポ
リマーは安定している必要があり、すなわち存在すれば
他の官能基が不特定に影響されないようにする必要があ
る。たとえばビスエポキシドは酸性および塩基性条件下
の双方で水酸基と反応するが、ポリマーが多糖の場合、
多糖におけるグリコシド結合は低いｐＨでは安定ではな
いので、塩基性ｐＨで架橋反応を行なう必要がある。さ
らに、架橋反応は、架橋剤の官能基との反応の後ゲル内
に荷電基を導入するような化合物なしで行なう必要があ
る。特に、アミンを避ける必要がある。この原則の例外
があるとすれば、開始ポリマーがわずかに荷電されてお
りかつマトリックスのプラスとマイナスの電荷の平衡を
とるためゲル中に少数の逆の電荷が導入される必要があ
る場合であり、この理由については米国特許第４，３１
２，７３９号に開示されている。架橋反応の際に所望で
あれば、水酸基を有する化合物または反応基を有してい
ない化合物が存在してもよい。
【００３３】本願の教示によれば、架橋反応は水中で行
なわれるので、架橋剤に存在する反応基の加水分解は避
けられない副作用である。この副作用については詳しく
考慮する必要がある。エピクロロヒドリンを架橋剤とし
て考えると、１つの水分子との反応で、塩化物が置換さ
れるかエポキシドが開かれるか否かに依存してグリシド
ールまたは３−クロロ−１，２−プロパンジオールが得
られる。双方ともに、もう１つの水分子との反応はグリ
セロールを生じることになる。グリセロールと３−クロ
ロ−１，２−プロパンジオールもポリマー水酸基と反応
し得る。そのような反応の後はポリマー鎖の架橋は起こ
らず、代わりにポリマーがグリセロール（プロパン−
２，３−ジオール）部分で置換されることになる。ポリ
マー上のこのグリセロール部分がエピクロロヒドリンと
反応可能でかつひいてはポリマー鎖の架橋に加わる。代
替的には、ポリマーグリセロール部分がもう１つのグリ
シドールまたは３−クロロ−１，２−プロパンジオール
分子と反応して、それにより置換基の長さを伸ばし得
る。さらに、グリシドールまたは３−クロロ−１，２プ
ロパンジオールがエピクロロヒドリン分子と反応して新
たな架橋剤を形成する可能性がある。この新たな架橋剤
中の官能基は間隔が離れておりかつしたがって新たな架
橋剤は単一のエピクロロヒドリン分子で架橋するには離
れすぎているポリマー上の２つの水酸基と反応すること
ができる。さらに、形成されたグリセロールが、３つの
官能基で新規な架橋剤を形成する３つのエピクロロヒド
リン分子と反応し得る。他の多官能性架橋剤の形成につ
ながる類似する反応は処方が容易である。このような化
合物の形成については既に示唆したが、ポリマー水酸基
がエピクロロヒドリン由来のこれら二次的な架橋剤を介
してもっぱら反応することが指摘されている（ＥＰ０
２０３ ０４９Ｂ１）。
なわれるので、架橋剤に存在する反応基の加水分解は避
けられない副作用である。この副作用については詳しく
考慮する必要がある。エピクロロヒドリンを架橋剤とし
て考えると、１つの水分子との反応で、塩化物が置換さ
れるかエポキシドが開かれるか否かに依存してグリシド
ールまたは３−クロロ−１，２−プロパンジオールが得
られる。双方ともに、もう１つの水分子との反応はグリ
セロールを生じることになる。グリセロールと３−クロ
ロ−１，２−プロパンジオールもポリマー水酸基と反応
し得る。そのような反応の後はポリマー鎖の架橋は起こ
らず、代わりにポリマーがグリセロール（プロパン−
２，３−ジオール）部分で置換されることになる。ポリ
マー上のこのグリセロール部分がエピクロロヒドリンと
反応可能でかつひいてはポリマー鎖の架橋に加わる。代
替的には、ポリマーグリセロール部分がもう１つのグリ
シドールまたは３−クロロ−１，２−プロパンジオール
分子と反応して、それにより置換基の長さを伸ばし得
る。さらに、グリシドールまたは３−クロロ−１，２プ
ロパンジオールがエピクロロヒドリン分子と反応して新
たな架橋剤を形成する可能性がある。この新たな架橋剤
中の官能基は間隔が離れておりかつしたがって新たな架
橋剤は単一のエピクロロヒドリン分子で架橋するには離
れすぎているポリマー上の２つの水酸基と反応すること
ができる。さらに、形成されたグリセロールが、３つの
官能基で新規な架橋剤を形成する３つのエピクロロヒド
リン分子と反応し得る。他の多官能性架橋剤の形成につ
ながる類似する反応は処方が容易である。このような化
合物の形成については既に示唆したが、ポリマー水酸基
がエピクロロヒドリン由来のこれら二次的な架橋剤を介
してもっぱら反応することが指摘されている（ＥＰ０
２０３ ０４９Ｂ１）。
【００３４】上記の反応にはいくつかの重要な結果が生
じる。すなわち架橋の長さは分子間であれ分子内であ
れ、一定ではなくかなり変化する。さらに、開始架橋剤
が二価性のものであった場合でもそれが２つのポリマー
水酸基のみがすべての架橋に加わることを意味していな
いことは明らかである。単一の新たに形成された多官能
性架橋剤が２つだけではなく３つ以上の水酸基すなわち
２つ以上のポリマー鎖を架橋するかもしれない。先行技
術においては、三官能および四官能架橋剤が知られてお
り（ＥＰ ０ １３２ ２４４ Ｂ１）、かつ所望であ
ればこれらを開始架橋剤として使用してもよい。
じる。すなわち架橋の長さは分子間であれ分子内であ
れ、一定ではなくかなり変化する。さらに、開始架橋剤
が二価性のものであった場合でもそれが２つのポリマー
水酸基のみがすべての架橋に加わることを意味していな
いことは明らかである。単一の新たに形成された多官能
性架橋剤が２つだけではなく３つ以上の水酸基すなわち
２つ以上のポリマー鎖を架橋するかもしれない。先行技
術においては、三官能および四官能架橋剤が知られてお
り（ＥＰ ０ １３２ ２４４ Ｂ１）、かつ所望であ
ればこれらを開始架橋剤として使用してもよい。
【００３５】上記の考察より、ゲル構造がポリマーおよ
び架橋剤由来のユニットを含んでいることは明らかであ
る。架橋剤由来のユニットはヘテロジニアスであり、す
なわちサイズおよび構造が様々である。これらのユニッ
トは長いものも短いものもありかつ枝分かれしていたり
または線状のものである可能性もある。ゲルの特性は架
橋点の数にのみ依存するのてはなく架橋の大きさおよび
構造にも依存する。ポリマー鎖上では架橋ではない置換
基が存在することは避けられない。架橋および置換基な
らびにその大きさおよび構造の相対比率は開始ポリマー
／架橋剤比、架橋のタイプならびに温度、ｐＨおよび反
応時間を含むいくつかの変数に依存する。架橋反応およ
びこれに伴うゲルの形成の複雑さゆえ好ましい特性のゲ
ルを生じる正確な実験条件を予測することは難しい。こ
のようなゲルは反応パラメータを系統的に変化させるこ
とによってのみ得られ得る。
び架橋剤由来のユニットを含んでいることは明らかであ
る。架橋剤由来のユニットはヘテロジニアスであり、す
なわちサイズおよび構造が様々である。これらのユニッ
トは長いものも短いものもありかつ枝分かれしていたり
または線状のものである可能性もある。ゲルの特性は架
橋点の数にのみ依存するのてはなく架橋の大きさおよび
構造にも依存する。ポリマー鎖上では架橋ではない置換
基が存在することは避けられない。架橋および置換基な
らびにその大きさおよび構造の相対比率は開始ポリマー
／架橋剤比、架橋のタイプならびに温度、ｐＨおよび反
応時間を含むいくつかの変数に依存する。架橋反応およ
びこれに伴うゲルの形成の複雑さゆえ好ましい特性のゲ
ルを生じる正確な実験条件を予測することは難しい。こ
のようなゲルは反応パラメータを系統的に変化させるこ
とによってのみ得られ得る。
【００３６】本願を実施する際には、ゲルの特性に大き
な影響を及ぼすいくつかの重要なパラメータがある。す
なわち、開始ポリマーの選択は大変重要である。水酸基
を有する合成または天然ポリマーを使用することが可能
である。合成ポリマーは通常より化学的に安定しており
かつ微生物の攻撃により抵抗があり、この特徴がゲルを
長い期間保管する場合には重要かもしれない。一方、合
成ポリマーは天然のものよりも疎水性が高い傾向にある
ので、生体分子の電気泳動分離が電荷と大きさにのみ基
づいている場合には、天然ポリマーが好ましい。ポリマ
ーの選択はまた水溶性と大きさに依存する。ポリマーを
少なくとも１％（ｗ／ｖ）、好ましくは約１０％まて溶
解することが有利である。ポリマーの分子量は約１０，
０００Ｄａを下回るべきではなく、数百万ダルトン程度
でもよく、好ましくは５０，０００から５００，０００
Ｄａの範囲にすべきである。ポリマーの水溶液は、ｐＨ
または温度を変えることでゲルが形成するようものでよ
い。代替的には、ポリマーは全温度（０−１００℃）お
よび全ｐＨ（０−１４）範囲にわたって水溶液のままで
もよい。所望であれば、上記のポリマーの２つ以上を使
用して単一のゲルが異なるポリマー由来のユニットを含
むようにしてもよい。
な影響を及ぼすいくつかの重要なパラメータがある。す
なわち、開始ポリマーの選択は大変重要である。水酸基
を有する合成または天然ポリマーを使用することが可能
である。合成ポリマーは通常より化学的に安定しており
かつ微生物の攻撃により抵抗があり、この特徴がゲルを
長い期間保管する場合には重要かもしれない。一方、合
成ポリマーは天然のものよりも疎水性が高い傾向にある
ので、生体分子の電気泳動分離が電荷と大きさにのみ基
づいている場合には、天然ポリマーが好ましい。ポリマ
ーの選択はまた水溶性と大きさに依存する。ポリマーを
少なくとも１％（ｗ／ｖ）、好ましくは約１０％まて溶
解することが有利である。ポリマーの分子量は約１０，
０００Ｄａを下回るべきではなく、数百万ダルトン程度
でもよく、好ましくは５０，０００から５００，０００
Ｄａの範囲にすべきである。ポリマーの水溶液は、ｐＨ
または温度を変えることでゲルが形成するようものでよ
い。代替的には、ポリマーは全温度（０−１００℃）お
よび全ｐＨ（０−１４）範囲にわたって水溶液のままで
もよい。所望であれば、上記のポリマーの２つ以上を使
用して単一のゲルが異なるポリマー由来のユニットを含
むようにしてもよい。
【００３７】ポリマー鎖を架橋する試薬の選択も非常に
重要である。架橋はポリマーの安定性と両立する条件下
で水溶液中のポリマーからの水酸基と容易に反応する化
学基を有している必要がある。架橋剤自体は変化しては
ならずかつマトリックス中に組込まれ得る荷電化合物を
生じさせる副作用の原因となってはならない。架橋剤も
親水性である必要がある。水とその反応基との反応はア
ルコールを形成するはずである。架橋剤分子中の反応基
は化学的に等価かまたは異なる化学反応性のものでもよ
い。ポリマーからの水酸基と架橋剤の反応基との間の反
応は、付加、置換、または開環等の異なるタイプのもの
でもよい。反応は酸または塩基による触媒反応でもよ
く、かつ１つまたは２つ以上の塩基等価物が反応の間に
消費され得る。塩が副産物として生成される場合もあ
る。もちろん、マトリックスが２つ以上の架橋剤由来の
ユニットを含むように少なくとも２つの架橋剤の混合物
を使用することが可能である。架橋剤はポリマーの水溶
液中に添加される前に溶媒で希釈され得る。
重要である。架橋はポリマーの安定性と両立する条件下
で水溶液中のポリマーからの水酸基と容易に反応する化
学基を有している必要がある。架橋剤自体は変化しては
ならずかつマトリックス中に組込まれ得る荷電化合物を
生じさせる副作用の原因となってはならない。架橋剤も
親水性である必要がある。水とその反応基との反応はア
ルコールを形成するはずである。架橋剤分子中の反応基
は化学的に等価かまたは異なる化学反応性のものでもよ
い。ポリマーからの水酸基と架橋剤の反応基との間の反
応は、付加、置換、または開環等の異なるタイプのもの
でもよい。反応は酸または塩基による触媒反応でもよ
く、かつ１つまたは２つ以上の塩基等価物が反応の間に
消費され得る。塩が副産物として生成される場合もあ
る。もちろん、マトリックスが２つ以上の架橋剤由来の
ユニットを含むように少なくとも２つの架橋剤の混合物
を使用することが可能である。架橋剤はポリマーの水溶
液中に添加される前に溶媒で希釈され得る。
【００３８】上記のとおり、本願の実施においては合成
および天然双方のポリマーを使用することができる。天
然ポリマーが好ましいのは、その顕著な親水性による。
天然由来の親水性ポリマーは多く存在するが、電気泳動
の用途に適したものは本質的に電荷のないまたはほんの
わずかな数の電荷しか有していないものだけである。こ
のようなポリマーのうち最も一般的なものはアガロー
ス、誘導されたセルロース、デンプンおよびデキストラ
ンである。可能な架橋剤のための要件を満たす多くの化
合物のうち好ましいのは分子重量が５００を下回る比較
的小さい分子である。オキシラン基を有する化合物はオ
キシランおよびハロ基を有するものとともに特に適切で
ある。他の適切な架橋剤は２つ以上のハロ基またはハロ
ゲン以外の良好な脱離基を有するものである。その反応
性二重結合が水酸基と反応する化合物も適している。オ
キシラン基を有する架橋剤の例としては、エピクロロヒ
ドリン、ブタンジオールジグリシジルエーテル、および
エチレングリコールジグリシジルエーテルがある。ハロ
基を有する架橋剤には、１，２−ジブロモ−プロパノー
ルおよび１，３−ジクロロプロパノールが含まれ、かつ
ジビニルスルホンは活性二重結合を有する適切な架橋剤
の一例である。
および天然双方のポリマーを使用することができる。天
然ポリマーが好ましいのは、その顕著な親水性による。
天然由来の親水性ポリマーは多く存在するが、電気泳動
の用途に適したものは本質的に電荷のないまたはほんの
わずかな数の電荷しか有していないものだけである。こ
のようなポリマーのうち最も一般的なものはアガロー
ス、誘導されたセルロース、デンプンおよびデキストラ
ンである。可能な架橋剤のための要件を満たす多くの化
合物のうち好ましいのは分子重量が５００を下回る比較
的小さい分子である。オキシラン基を有する化合物はオ
キシランおよびハロ基を有するものとともに特に適切で
ある。他の適切な架橋剤は２つ以上のハロ基またはハロ
ゲン以外の良好な脱離基を有するものである。その反応
性二重結合が水酸基と反応する化合物も適している。オ
キシラン基を有する架橋剤の例としては、エピクロロヒ
ドリン、ブタンジオールジグリシジルエーテル、および
エチレングリコールジグリシジルエーテルがある。ハロ
基を有する架橋剤には、１，２−ジブロモ−プロパノー
ルおよび１，３−ジクロロプロパノールが含まれ、かつ
ジビニルスルホンは活性二重結合を有する適切な架橋剤
の一例である。
【００３９】より高いｐＨの好ましい多糖ポリマーのよ
り良好な安定性により、架橋反応は塩基性の条件下で行
なわれた。異なる塩基を使用してもよいが、無機水酸化
物が好ましく、かつ最も好ましいのは水酸化ナトリウム
およびカリウムである。架橋剤のタイプに応じて、塩基
は反応の触媒として作用するかまたは反応中に消費され
得る。すなわちジビニルスルホンまたはブタンジオール
ジグリシジルエーテルを使用する場合には塩基の消費は
ないが、塩基の１モルが各エピクロロヒドリン分子につ
いて消費される。たとえば１，３−ジクロロプロパノー
ルでの架橋反応には２つの塩基等価物が必要である。架
橋反応の間の塩基の消費は反応の開始にかなりの量のア
ルカリ水酸化物の添加を必要とする。ゲル形成の妨げに
なり得るため周期的に添加を行なうことは不可能であ
る。このことは、少なくとも最初、反応条件はこのよう
な架橋剤が使用されるときにより厳しいことを意味す
る。さらに、塩が副産物として生成される。ゲル化の間
に塩が存在することでゲルの構造が影響を受けるかもし
れない場合もあり、アガロースゲルについてのそのよう
なケースが報告された（米国特許第５，００９，７５９
号）。さらに、電気泳動分離の前には塩を取除く必要が
あるので、ゲル内部の塩の濃度が高い場合には、ゲルの
平衡を行なうのにより長い時間および／またはより長い
洗浄が必要である。
り良好な安定性により、架橋反応は塩基性の条件下で行
なわれた。異なる塩基を使用してもよいが、無機水酸化
物が好ましく、かつ最も好ましいのは水酸化ナトリウム
およびカリウムである。架橋剤のタイプに応じて、塩基
は反応の触媒として作用するかまたは反応中に消費され
得る。すなわちジビニルスルホンまたはブタンジオール
ジグリシジルエーテルを使用する場合には塩基の消費は
ないが、塩基の１モルが各エピクロロヒドリン分子につ
いて消費される。たとえば１，３−ジクロロプロパノー
ルでの架橋反応には２つの塩基等価物が必要である。架
橋反応の間の塩基の消費は反応の開始にかなりの量のア
ルカリ水酸化物の添加を必要とする。ゲル形成の妨げに
なり得るため周期的に添加を行なうことは不可能であ
る。このことは、少なくとも最初、反応条件はこのよう
な架橋剤が使用されるときにより厳しいことを意味す
る。さらに、塩が副産物として生成される。ゲル化の間
に塩が存在することでゲルの構造が影響を受けるかもし
れない場合もあり、アガロースゲルについてのそのよう
なケースが報告された（米国特許第５，００９，７５９
号）。さらに、電気泳動分離の前には塩を取除く必要が
あるので、ゲル内部の塩の濃度が高い場合には、ゲルの
平衡を行なうのにより長い時間および／またはより長い
洗浄が必要である。
【００４０】ゲルの特性はポリマーの濃度にも依存す
る。ポリマーの濃度の選択はその水溶性と機械的安定性
および分離範囲等の望ましいゲル特性に依存する。良好
な構造的安定性および最適分離は、ゲルが異なる開始ポ
リマーを含んでいる場合には異なるポリマー濃度で達成
された。たとえば、標準的な商業ベースのアガロース調
製物での好ましい多糖ポリマー濃度は約０．５から２％
であった。取扱い可能なポリマー溶液と適切なゲルを生
じるヒドロキシエチルセルロースポリマーの濃度は約３
から約６％であった。デキストランポリマーは、ポリマ
ー濃度が約５から１０％である場合に良好な機械的安定
性のゲルを形成した。上記のゲルにおける生体分子の分
離はポリマーのタイプと濃度の双方に依存した。すなわ
ち、分離の質はデキストランゲルよりもアガロースおよ
びヒドロキシエチルセルロースの場合の方が良好であっ
た。さらに、テギストランゲルはサンプルウェルが変形
するような強い膨張傾向を示し、分離されたバンドのシ
ャープさをさらに混乱させた。もう１つの枝分かれした
多糖であるデキストランに架橋を試みたところテストし
た実験条件下では取扱い可能なゲルは生じなかった。し
たがって、開始ポリマーがすべて多糖であっても、それ
らを架橋することによって形成されるゲルは異なってい
た。線状多糖類を含むゲルが電気泳動用途に優れている
ことは本明細書に示されたゲル電気泳動のモデルと合致
する。
る。ポリマーの濃度の選択はその水溶性と機械的安定性
および分離範囲等の望ましいゲル特性に依存する。良好
な構造的安定性および最適分離は、ゲルが異なる開始ポ
リマーを含んでいる場合には異なるポリマー濃度で達成
された。たとえば、標準的な商業ベースのアガロース調
製物での好ましい多糖ポリマー濃度は約０．５から２％
であった。取扱い可能なポリマー溶液と適切なゲルを生
じるヒドロキシエチルセルロースポリマーの濃度は約３
から約６％であった。デキストランポリマーは、ポリマ
ー濃度が約５から１０％である場合に良好な機械的安定
性のゲルを形成した。上記のゲルにおける生体分子の分
離はポリマーのタイプと濃度の双方に依存した。すなわ
ち、分離の質はデキストランゲルよりもアガロースおよ
びヒドロキシエチルセルロースの場合の方が良好であっ
た。さらに、テギストランゲルはサンプルウェルが変形
するような強い膨張傾向を示し、分離されたバンドのシ
ャープさをさらに混乱させた。もう１つの枝分かれした
多糖であるデキストランに架橋を試みたところテストし
た実験条件下では取扱い可能なゲルは生じなかった。し
たがって、開始ポリマーがすべて多糖であっても、それ
らを架橋することによって形成されるゲルは異なってい
た。線状多糖類を含むゲルが電気泳動用途に優れている
ことは本明細書に示されたゲル電気泳動のモデルと合致
する。
【００４１】架橋剤のタイプおよび濃度もゲルの特性を
決定する。適切な架橋剤の濃度は架橋剤のタイプに強く
依存していたが、このことは架橋剤の化学基のかなり異
なる反応性を考えれば驚くにはあたらない。すなわちジ
ビニルスルホンはテストされたすべての架橋剤のうち最
も低い濃度（０．１−０．５％、ｖ／ｖ）でゲルを生成
し、一方他の架橋剤の濃度は典型的には約１％、ｖ／ｖ
であった。架橋剤の反応基はポリマー中の水酸基よりも
１モル余剰であった。架橋剤が余分に必要であること
は、水との反応がポリマー水酸基との反応よりも速いこ
とを示している。ジビニルスルホンはポリマー水酸基に
関して最も良好な選択性を有しているように思われる
が、その毒性が心配である。
決定する。適切な架橋剤の濃度は架橋剤のタイプに強く
依存していたが、このことは架橋剤の化学基のかなり異
なる反応性を考えれば驚くにはあたらない。すなわちジ
ビニルスルホンはテストされたすべての架橋剤のうち最
も低い濃度（０．１−０．５％、ｖ／ｖ）でゲルを生成
し、一方他の架橋剤の濃度は典型的には約１％、ｖ／ｖ
であった。架橋剤の反応基はポリマー中の水酸基よりも
１モル余剰であった。架橋剤が余分に必要であること
は、水との反応がポリマー水酸基との反応よりも速いこ
とを示している。ジビニルスルホンはポリマー水酸基に
関して最も良好な選択性を有しているように思われる
が、その毒性が心配である。
【００４２】架橋反応は異なる時間期間にわたって進め
られた。一般に反応速度は温度とともに増大するので、
化学反応の反応時間と温度は相互に関係していることが
知られている。本願の教示に従うゲルの調製では、反応
時間は約１５分から５日の範囲にわたる。ジビニルスル
ホンで最も短い時間期間が可能であったが、ジビニルス
ルホンはある条件下で反応溶液がモールドに注がれ得る
前にゲルが形成されるほど速く反応した。一方、ビス−
オキシラン架橋剤は、ＤＮＡフラグメントの電気泳動パ
ターンに変化がなかったことが数日間のインキュベーシ
ョンを経た後にやっと示され得るほどにゆっくり反応し
た。
られた。一般に反応速度は温度とともに増大するので、
化学反応の反応時間と温度は相互に関係していることが
知られている。本願の教示に従うゲルの調製では、反応
時間は約１５分から５日の範囲にわたる。ジビニルスル
ホンで最も短い時間期間が可能であったが、ジビニルス
ルホンはある条件下で反応溶液がモールドに注がれ得る
前にゲルが形成されるほど速く反応した。一方、ビス−
オキシラン架橋剤は、ＤＮＡフラグメントの電気泳動パ
ターンに変化がなかったことが数日間のインキュベーシ
ョンを経た後にやっと示され得るほどにゆっくり反応し
た。
【００４３】ゲル形成の間に副産物が形成される。それ
らには、非イオンおよびイオン種が含まれる。イオン種
は脱離基を有する架橋剤から生じる。形成されたゲルは
触媒および／または反応物として使用される塩基も含ん
でいた。ゲルは反応条件が最適でない場合にはいくらか
の未反応の架橋剤を含んでいるかもしれない。電気泳動
に適用する場合には、ゲルのイオン組成がよく明らかに
されていることが重要である。このゴールを達成する最
も簡単なやり方はゲルを水中で洗浄した後所望の電気泳
動緩衝液中でインキュベーすることである。ゲルが液中
ゲル電気泳動における使用を意図されている場合には、
少なくともゲルの５つの側面がオープンなので拡散経路
が短くなるため平衡化は容易である。簡単に取扱うため
には、ゲルをその形成中にゲルボンド（ＦＭＣ社）等の
プラスチック支持部に固定することが便利である。本願
のゲルは２つのプレート間の垂直モードにもかたどるこ
とができる。このようなゲルは電気泳動的に平衡させる
ことが可能で、つまり電圧勾配を与えると、すべてのイ
オン種がゲルから出ていくからである。しかしながら、
架橋剤のすべての反応基が反応したとすると、依然とし
て非イオン副産物が残り、これらの副産物はアルコール
のみが考えられかつその存在は生体分子の電気泳動と両
立するものである。
らには、非イオンおよびイオン種が含まれる。イオン種
は脱離基を有する架橋剤から生じる。形成されたゲルは
触媒および／または反応物として使用される塩基も含ん
でいた。ゲルは反応条件が最適でない場合にはいくらか
の未反応の架橋剤を含んでいるかもしれない。電気泳動
に適用する場合には、ゲルのイオン組成がよく明らかに
されていることが重要である。このゴールを達成する最
も簡単なやり方はゲルを水中で洗浄した後所望の電気泳
動緩衝液中でインキュベーすることである。ゲルが液中
ゲル電気泳動における使用を意図されている場合には、
少なくともゲルの５つの側面がオープンなので拡散経路
が短くなるため平衡化は容易である。簡単に取扱うため
には、ゲルをその形成中にゲルボンド（ＦＭＣ社）等の
プラスチック支持部に固定することが便利である。本願
のゲルは２つのプレート間の垂直モードにもかたどるこ
とができる。このようなゲルは電気泳動的に平衡させる
ことが可能で、つまり電圧勾配を与えると、すべてのイ
オン種がゲルから出ていくからである。しかしながら、
架橋剤のすべての反応基が反応したとすると、依然とし
て非イオン副産物が残り、これらの副産物はアルコール
のみが考えられかつその存在は生体分子の電気泳動と両
立するものである。
【００４４】様々な架橋条件下で多くの異なるポリマー
架橋剤の組合わせを反応させることにより形成されたゲ
ルについて例を挙げて説明する。ＤＮＡとたんぱく質の
電気泳動分離を含むこれらのゲルの特性は特定の例にお
いて報告されるが、報告された結果に基づいていくつか
の一般的な結論が導き出され得る。すなわち、特定のポ
リマー／架橋剤については、良好な条件下で、ある大き
さの範囲の生体分子の電気泳動分離に関して最適な特性
を有するゲルを与えるポリマーと架橋剤の濃度がある。
同じ条件下で同じポリマーを他の架橋剤と架橋させる
と、異なる分離特性を有するゲルが形成される。たとえ
ば、ＤＮＡフラグメントはブタンジオールジグリシジル
エーテルで架橋した１％ゲルよりもエピクロロヒドリン
で架橋した１％アガロースポリマーを含むゲルにおいて
より移動した（例４および６）。１を超えるポリマーを
含むゲルも良好な分離を示した。これらのゲルにおける
移動距離はポリマー濃度のみならずポリマーの相対比に
も依存した（例１６）。ゲル化多糖であるアガロースが
使用された場合には単に温度により誘起されるゲル化に
よって見られる標準的ゲルのものに比べ新規なゲルのい
くつかの特性には顕著な変化が見られた。すなわち、本
願のゲルは加熱することによっては再溶解されない。ま
た、アガロース溶液を冷却することにより得られるゲル
は堅くて脆く、この発明により形成されるゲルは軟らか
くて弾性に富んでいた。J. Chromatogr. １０３（１９
７５年）４９−６２および米国特許第３，９５９，２５
１号に記載されるように、クロマトグラフィーでは本願
のアガロースゲルの改善された弾性は架橋されたアガロ
ースゲルの増大した剛性とは対照的である。さらに、ポ
リマー濃度が一定で架橋剤濃度を増大させた溶液から調
製されたアガロースゲル中にはある架橋剤の濃度までの
み生体分子の移動速度の緩やかな減少を示すものもあっ
た。架橋剤濃度をその値より上に上げると、驚くべきこ
とにより架橋剤が少ないゲルの場合よりも長い距離を生
体分子が移動した（例７）。
架橋剤の組合わせを反応させることにより形成されたゲ
ルについて例を挙げて説明する。ＤＮＡとたんぱく質の
電気泳動分離を含むこれらのゲルの特性は特定の例にお
いて報告されるが、報告された結果に基づいていくつか
の一般的な結論が導き出され得る。すなわち、特定のポ
リマー／架橋剤については、良好な条件下で、ある大き
さの範囲の生体分子の電気泳動分離に関して最適な特性
を有するゲルを与えるポリマーと架橋剤の濃度がある。
同じ条件下で同じポリマーを他の架橋剤と架橋させる
と、異なる分離特性を有するゲルが形成される。たとえ
ば、ＤＮＡフラグメントはブタンジオールジグリシジル
エーテルで架橋した１％ゲルよりもエピクロロヒドリン
で架橋した１％アガロースポリマーを含むゲルにおいて
より移動した（例４および６）。１を超えるポリマーを
含むゲルも良好な分離を示した。これらのゲルにおける
移動距離はポリマー濃度のみならずポリマーの相対比に
も依存した（例１６）。ゲル化多糖であるアガロースが
使用された場合には単に温度により誘起されるゲル化に
よって見られる標準的ゲルのものに比べ新規なゲルのい
くつかの特性には顕著な変化が見られた。すなわち、本
願のゲルは加熱することによっては再溶解されない。ま
た、アガロース溶液を冷却することにより得られるゲル
は堅くて脆く、この発明により形成されるゲルは軟らか
くて弾性に富んでいた。J. Chromatogr. １０３（１９
７５年）４９−６２および米国特許第３，９５９，２５
１号に記載されるように、クロマトグラフィーでは本願
のアガロースゲルの改善された弾性は架橋されたアガロ
ースゲルの増大した剛性とは対照的である。さらに、ポ
リマー濃度が一定で架橋剤濃度を増大させた溶液から調
製されたアガロースゲル中にはある架橋剤の濃度までの
み生体分子の移動速度の緩やかな減少を示すものもあっ
た。架橋剤濃度をその値より上に上げると、驚くべきこ
とにより架橋剤が少ないゲルの場合よりも長い距離を生
体分子が移動した（例７）。
【００４５】アガロースゲルを含みかつ本願に従い調製
されたゲルは先行技術で知られるアガロースゲルとはか
なり異なる光学特性を有している。図５は標準的なアガ
ロースゲルのスペクトル（４００−８００ｎｍ）を示
し、かつ図６は同じ濃度の同じアガロースポリマーを含
む新規なゲルのスペクトルを示す。可視スペクトル全体
を通して、新規なゲルは標準アガロースゲルの吸収のほ
んのわずかな部分しか吸収がないことがわかる。誘導さ
れたアガロースポリマーを使用することで光学的透明度
が改善されたゲルが生じることが報告されている（米国
特許第３，９５６，２７３号および第４，３１９，９７
５号）。商業ベースのヒドロキシエチル化アガロースポ
リマーから調製されるこのようなゲルのスペクトルを図
７に示す。可視領域では、ゲルの吸収値は実に同じ濃度
の標準アガロースゲルのものの約半分であるが（図
５）、それでもこれは本願により調製されたゲルの吸収
（図６）よりもかなり高い。ヒドロキシエチル化したア
ガロースポリマーを本件のゲルの調製に使用し、そのよ
うなゲルの１つのスペクトルを図８に示す。明らかに、
このゲルのバックグラウンド吸収はほとんど存在してい
ないに等しい。それは大きさでいえば同じだが架橋され
ていないヒドロキシエチル化アガロースポリマーからな
る対応のゲルのものよりも１桁以上小さい（図７）。ゲ
ルのバックグラウンド吸収が低いことは分離されたバン
ドの高品質記録にとっては重要なことである。特に、分
離された分子が米国特許第４，９３０，８９３号に開示
するような光学装置により染色を伴わずに検出される場
合には特にそうである。
されたゲルは先行技術で知られるアガロースゲルとはか
なり異なる光学特性を有している。図５は標準的なアガ
ロースゲルのスペクトル（４００−８００ｎｍ）を示
し、かつ図６は同じ濃度の同じアガロースポリマーを含
む新規なゲルのスペクトルを示す。可視スペクトル全体
を通して、新規なゲルは標準アガロースゲルの吸収のほ
んのわずかな部分しか吸収がないことがわかる。誘導さ
れたアガロースポリマーを使用することで光学的透明度
が改善されたゲルが生じることが報告されている（米国
特許第３，９５６，２７３号および第４，３１９，９７
５号）。商業ベースのヒドロキシエチル化アガロースポ
リマーから調製されるこのようなゲルのスペクトルを図
７に示す。可視領域では、ゲルの吸収値は実に同じ濃度
の標準アガロースゲルのものの約半分であるが（図
５）、それでもこれは本願により調製されたゲルの吸収
（図６）よりもかなり高い。ヒドロキシエチル化したア
ガロースポリマーを本件のゲルの調製に使用し、そのよ
うなゲルの１つのスペクトルを図８に示す。明らかに、
このゲルのバックグラウンド吸収はほとんど存在してい
ないに等しい。それは大きさでいえば同じだが架橋され
ていないヒドロキシエチル化アガロースポリマーからな
る対応のゲルのものよりも１桁以上小さい（図７）。ゲ
ルのバックグラウンド吸収が低いことは分離されたバン
ドの高品質記録にとっては重要なことである。特に、分
離された分子が米国特許第４，９３０，８９３号に開示
するような光学装置により染色を伴わずに検出される場
合には特にそうである。
【００４６】上記の光学特性は標準アガロースゲルより
も合成ゲルにより類似している。二次元電気泳動（図
９）は１．５％アガロースポリマーと１．３−ジクロロ
プロパノール由来のユニットを含むゲル中では、２３ｋ
ｂｐＤＮＡフラグメントが９．４ＤＮＡフラグメントよ
りも遠くまで移動したことを示す。同じ結果が同じ電気
泳動条件下で流した６％ポリ（ＮＡＴ）ゲル中の二次元
電気泳動の後にも得られた（図２）ので、これらのデー
タによりこれら２つのゲルの構造は、その化学組成が全
く異なるにもかかわらず類似していることが示される。
すなわち光学特性における変化は単に量的なものではな
く、ゲルの構造に大きな変化をもたらす。
も合成ゲルにより類似している。二次元電気泳動（図
９）は１．５％アガロースポリマーと１．３−ジクロロ
プロパノール由来のユニットを含むゲル中では、２３ｋ
ｂｐＤＮＡフラグメントが９．４ＤＮＡフラグメントよ
りも遠くまで移動したことを示す。同じ結果が同じ電気
泳動条件下で流した６％ポリ（ＮＡＴ）ゲル中の二次元
電気泳動の後にも得られた（図２）ので、これらのデー
タによりこれら２つのゲルの構造は、その化学組成が全
く異なるにもかかわらず類似していることが示される。
すなわち光学特性における変化は単に量的なものではな
く、ゲルの構造に大きな変化をもたらす。
【００４７】この新しいゲルの分離範囲はポリマーのタ
イプ、その濃度、架橋剤のタイプ、架橋剤の濃度に依存
しかつ架橋条件に依存する。たとえば、アガロースポリ
マーを使用した場合、ブタンジオールジグリシジルエー
テル（２０ｍｌ中に０．５ｍｌ）で架橋した１％ポリマ
ーを含むゲルが、７Ｖ／ｃｍで１時間５５分の電気泳動
を行なったところ、約１５０から３０００ｂｐの範囲の
大きさのＤＮＡフラグメントについてかなり良い分離を
与えた。同じ成分（２０ｍｌ中に１ｍｌ）を含みかつ同
じ条件下で流した１．５％ゲルは約５０から７００ｂｐ
の範囲の大きさで良好な分解を与えた。もう１つの架橋
剤である１，３−ジクロロプロパノールが使用された場
合（１０ｍｌ中に１ｍｍｏｌ）、１％ゲルに関しては分
離範囲は約２００から４０００ｂｐであった。この分離
範囲は、当業者に知られる公開されたデータから予想さ
れるとおり、電気泳動条件、主に電界と実行時間にも依
存する。すなわち１％アガロースポリマーとブタンジオ
ールジグリシジルエーテル（２０ｍｌ中に０．５ｍｌ）
を含むゲルで低い電圧（２Ｖ／ｃｍ）で１６時間泳動が
行なわれた場合、分離範囲は約８００から２００００ｂ
ｐの範囲であった。
イプ、その濃度、架橋剤のタイプ、架橋剤の濃度に依存
しかつ架橋条件に依存する。たとえば、アガロースポリ
マーを使用した場合、ブタンジオールジグリシジルエー
テル（２０ｍｌ中に０．５ｍｌ）で架橋した１％ポリマ
ーを含むゲルが、７Ｖ／ｃｍで１時間５５分の電気泳動
を行なったところ、約１５０から３０００ｂｐの範囲の
大きさのＤＮＡフラグメントについてかなり良い分離を
与えた。同じ成分（２０ｍｌ中に１ｍｌ）を含みかつ同
じ条件下で流した１．５％ゲルは約５０から７００ｂｐ
の範囲の大きさで良好な分解を与えた。もう１つの架橋
剤である１，３−ジクロロプロパノールが使用された場
合（１０ｍｌ中に１ｍｍｏｌ）、１％ゲルに関しては分
離範囲は約２００から４０００ｂｐであった。この分離
範囲は、当業者に知られる公開されたデータから予想さ
れるとおり、電気泳動条件、主に電界と実行時間にも依
存する。すなわち１％アガロースポリマーとブタンジオ
ールジグリシジルエーテル（２０ｍｌ中に０．５ｍｌ）
を含むゲルで低い電圧（２Ｖ／ｃｍ）で１６時間泳動が
行なわれた場合、分離範囲は約８００から２００００ｂ
ｐの範囲であった。
【００４８】調製のやり方から、本願のゲルが線状多糖
ポリマーおよび架橋剤由来の繰り返し単位を含んでいる
ことは明らかであろう。上記のとおり、同じポリマーで
異なる架橋剤を使用すると生体分子の電気泳動分離に関
して異なる特性を示すゲルが生じた。したがって、本願
のゲルを通して電界中を移動する生体分子の選択的遅延
にポリマーおよび架橋剤双方由来の繰り返し単位が加わ
っているようである。約１％のアガロースポリマーを含
む本件のゲルにおける小さな（２００−６００ｂｐ）Ｄ
ＮＡフラグメントの大変良好な分解は先行技術に照らし
て驚くべきものであるが、ゲル構造がゲルポリマー濃度
よりもより重要である本件のモデルと一致するものであ
る。すなわち、ゲル構造は、あるタイプの架橋されたポ
リマーの低濃度が他のタイプの架橋されたポリマーのよ
り高い濃度と同じような移動巨大分子に対する抵抗を生
じさせるようなものであればよい。「扉」および「廊
下」をあけるためにはポリマー鎖の構成における異なる
大きさの変化が必要でありかつこれらの変化に対しそれ
らが与える抵抗は明らかにポリマーのタイプとポリマー
鎖が架橋される態様に依存する。
ポリマーおよび架橋剤由来の繰り返し単位を含んでいる
ことは明らかであろう。上記のとおり、同じポリマーで
異なる架橋剤を使用すると生体分子の電気泳動分離に関
して異なる特性を示すゲルが生じた。したがって、本願
のゲルを通して電界中を移動する生体分子の選択的遅延
にポリマーおよび架橋剤双方由来の繰り返し単位が加わ
っているようである。約１％のアガロースポリマーを含
む本件のゲルにおける小さな（２００−６００ｂｐ）Ｄ
ＮＡフラグメントの大変良好な分解は先行技術に照らし
て驚くべきものであるが、ゲル構造がゲルポリマー濃度
よりもより重要である本件のモデルと一致するものであ
る。すなわち、ゲル構造は、あるタイプの架橋されたポ
リマーの低濃度が他のタイプの架橋されたポリマーのよ
り高い濃度と同じような移動巨大分子に対する抵抗を生
じさせるようなものであればよい。「扉」および「廊
下」をあけるためにはポリマー鎖の構成における異なる
大きさの変化が必要でありかつこれらの変化に対しそれ
らが与える抵抗は明らかにポリマーのタイプとポリマー
鎖が架橋される態様に依存する。
【００４９】上記のとおり、液中電気泳動モードにおい
て泳動が行なわれる多くのゲルでは、分離されたバンド
が曲がっていた。本願のゲルにおけるＤＮＡフラグメン
トの分離の後は、いくらかのゲルをカットしてＤＮＡバ
ンドの形状を、その側面からゲルの断片を観察すること
により調べた。約２％以上の多糖ポリマーを含むすべて
のゲルにおいて本質的にバンドが曲がっているのが見ら
れた。屈曲はゲルの厚みと実行条件にも依存しており、
一般により高い電界強度でより大きな屈曲が生じた。１
％前後のアガロースポリマーを含むゲルにおいては、こ
の屈曲は無視できる程度でありかつ約１．５％の濃度で
は大変小さいものであった。これらの２つの濃度のゲル
はＤＮＡフラグメントを大変よく分離し（図１０および
図１１）かつしたがって本件のゲルはバンドの屈曲とい
う妨げなしに小さな生体分子を分離することができる電
気泳動マトリックスに対する需要を満たす。
て泳動が行なわれる多くのゲルでは、分離されたバンド
が曲がっていた。本願のゲルにおけるＤＮＡフラグメン
トの分離の後は、いくらかのゲルをカットしてＤＮＡバ
ンドの形状を、その側面からゲルの断片を観察すること
により調べた。約２％以上の多糖ポリマーを含むすべて
のゲルにおいて本質的にバンドが曲がっているのが見ら
れた。屈曲はゲルの厚みと実行条件にも依存しており、
一般により高い電界強度でより大きな屈曲が生じた。１
％前後のアガロースポリマーを含むゲルにおいては、こ
の屈曲は無視できる程度でありかつ約１．５％の濃度で
は大変小さいものであった。これらの２つの濃度のゲル
はＤＮＡフラグメントを大変よく分離し（図１０および
図１１）かつしたがって本件のゲルはバンドの屈曲とい
う妨げなしに小さな生体分子を分離することができる電
気泳動マトリックスに対する需要を満たす。
【００５０】この発明について以下に例を挙げてさらに
説明するが、これらは明細書中に特に示す場合を除いて
は限定として意図されていない。
説明するが、これらは明細書中に特に示す場合を除いて
は限定として意図されていない。
【００５１】例１
分枝ビニル架橋剤の調製。アリルグリシジルエーテル
（アクリル・エイド（Acryl Aide）、ＦＭＣ社（FMC Co
rporation ））で誘導された２％水性アガロースポリマ
ーは、ポリマーを完全に溶解するようにゆっくりと暖め
られた。その後、１２グラムの溶液は１２グラムの蒸留
水を含むフラスコに移された。マグネチックスターラー
により、０．２２０ｍｌの１０Ｎ水酸化ナトリウム溶液
が加えられ、その後０．１５６ｍｌのエピクロルヒドリ
ンが加えられた。フラスコは栓をされ、溶液は室温で４
時間激しく撹拌された。その後、２４ｍｌの蒸留水が反
応混合物に加えられ、撹拌は室温で４日間続けられた。
結果として生じた粘性ポリマー溶液は、まず水に対し
て、それから３０ｍＭのトリス−アセタート−ＥＤＴＡ
緩衝液ｐＨ８．０（ＴＡＥ緩衝液）に対して広範に透析
された。透析された溶液は回復され、室温で濃い色のビ
ン中で保存された。透析のステップの間の希釈は無視で
きるほどであるため、架橋されたポリマー溶液のポリマ
ー濃度は０．５％であった。
（アクリル・エイド（Acryl Aide）、ＦＭＣ社（FMC Co
rporation ））で誘導された２％水性アガロースポリマ
ーは、ポリマーを完全に溶解するようにゆっくりと暖め
られた。その後、１２グラムの溶液は１２グラムの蒸留
水を含むフラスコに移された。マグネチックスターラー
により、０．２２０ｍｌの１０Ｎ水酸化ナトリウム溶液
が加えられ、その後０．１５６ｍｌのエピクロルヒドリ
ンが加えられた。フラスコは栓をされ、溶液は室温で４
時間激しく撹拌された。その後、２４ｍｌの蒸留水が反
応混合物に加えられ、撹拌は室温で４日間続けられた。
結果として生じた粘性ポリマー溶液は、まず水に対し
て、それから３０ｍＭのトリス−アセタート−ＥＤＴＡ
緩衝液ｐＨ８．０（ＴＡＥ緩衝液）に対して広範に透析
された。透析された溶液は回復され、室温で濃い色のビ
ン中で保存された。透析のステップの間の希釈は無視で
きるほどであるため、架橋されたポリマー溶液のポリマ
ー濃度は０．５％であった。
【００５２】ゲルの調製。一連のポリ（ＮＡＴ）ゲルが
調製された。すべてのゲルは全部で６％のモノマー
（Ｔ）と３％の架橋剤（Ｃ）とを含んでいた。架橋剤は
もとのアクリル・エイドポリマーか、またはこの線状ポ
リマーと上述のそのポリマーの架橋誘導体との混合物の
どちらかであった。２つの架橋剤の重量和は常に３％で
あった。ゲル（２０ｍｌ）はＴＥＭＥＤ（０．０４５ｍ
ｌ）および過硫酸ナトリウム（０．３００ｍｌの２２ｍ
ｇ／ｍｌ溶液）で１８ｍＭ ＴＡＥ緩衝液中で重合化さ
れた。ゲルは重合化の間ゲル・ボンド（Gel Bond）（Ｆ
ＭＣ）に固定された。すべてのゲルの透明性は同じであ
った。２セットの商業用ＤＮＡ標品、１ｋｂｐラダー
（ＢＲＬ）およびｐＢＲ３２２／Ｈａｅ ＩＩＩ（Boeh
ringer）が、各ゲル中で泳動された。ゲルはＳＥＡ−２
０００電気泳動装置（Elchrom ）において、３０ｍＭ
ＴＡＥ緩衝液中で１９℃で２時間２０分の間、７Ｖ／ｃ
ｍで泳動した。この装置は、Kozulic とHeimgartner の
「分析生化学」（Analytical Biochemistry ）１９８
（１９９１）２５６−２６２に詳細に説明される。分離
したＤＮＡフラグメントはエチジウムブロミドで染色さ
れた。図１は分枝架橋剤の濃度が増大している８つの異
なるゲル（ａ−ｈ）におけるＤＮＡパターンを示す。ゲ
ルａは分枝架橋剤を含まず、ゲルｂにおいては、分枝架
橋剤対線状架橋剤の比は０．１：２．９であり、ゲルｃ
においてはこの比は０．２：２．８であり、ゲルｄにお
いてはこの比は０．４：２．６であり、ゲルｅにおいて
はこの比は０．６：２．４であり、ゲルｆにおいては
０．８：２．２であり、ゲルｇにおいては１．０：２．
０であり、かつゲルｈにおいては１．２：１．８であ
る。理解されるように、分解能は分枝架橋剤の濃度が増
大するに伴って徐々に悪化する。この悪化はまず低分子
量の範囲（ゲルｄ−ｆ）において発生する。分枝架橋剤
のより高い濃度においては、分解能は全サイズ範囲にわ
たって（ゲルｇおよびｈ）失われ、すべてのＤＮＡフラ
グメントの移動は非常に少ない。特筆すべきは、他の分
枝された高分子架橋剤も同じ効果を示すことである。し
たがって、エチレングリコールに溶解した線状ポリアク
リルアミドポリマー（ＭＷ５，０００，０００ポリサイ
エンス（Polysciences））をエチレンジアミンと反応さ
せ、それに続いて透析およびアクリロイル化を行なうこ
とによって調製された架橋剤は、６％のポリ（ＮＡＴ）
ゲルにおいて一層強い遅延および分解能の喪失を引起こ
した。これらのゲルのいくつかにおいては、ＤＮＡ分子
は全く泳動することができなかった。
調製された。すべてのゲルは全部で６％のモノマー
（Ｔ）と３％の架橋剤（Ｃ）とを含んでいた。架橋剤は
もとのアクリル・エイドポリマーか、またはこの線状ポ
リマーと上述のそのポリマーの架橋誘導体との混合物の
どちらかであった。２つの架橋剤の重量和は常に３％で
あった。ゲル（２０ｍｌ）はＴＥＭＥＤ（０．０４５ｍ
ｌ）および過硫酸ナトリウム（０．３００ｍｌの２２ｍ
ｇ／ｍｌ溶液）で１８ｍＭ ＴＡＥ緩衝液中で重合化さ
れた。ゲルは重合化の間ゲル・ボンド（Gel Bond）（Ｆ
ＭＣ）に固定された。すべてのゲルの透明性は同じであ
った。２セットの商業用ＤＮＡ標品、１ｋｂｐラダー
（ＢＲＬ）およびｐＢＲ３２２／Ｈａｅ ＩＩＩ（Boeh
ringer）が、各ゲル中で泳動された。ゲルはＳＥＡ−２
０００電気泳動装置（Elchrom ）において、３０ｍＭ
ＴＡＥ緩衝液中で１９℃で２時間２０分の間、７Ｖ／ｃ
ｍで泳動した。この装置は、Kozulic とHeimgartner の
「分析生化学」（Analytical Biochemistry ）１９８
（１９９１）２５６−２６２に詳細に説明される。分離
したＤＮＡフラグメントはエチジウムブロミドで染色さ
れた。図１は分枝架橋剤の濃度が増大している８つの異
なるゲル（ａ−ｈ）におけるＤＮＡパターンを示す。ゲ
ルａは分枝架橋剤を含まず、ゲルｂにおいては、分枝架
橋剤対線状架橋剤の比は０．１：２．９であり、ゲルｃ
においてはこの比は０．２：２．８であり、ゲルｄにお
いてはこの比は０．４：２．６であり、ゲルｅにおいて
はこの比は０．６：２．４であり、ゲルｆにおいては
０．８：２．２であり、ゲルｇにおいては１．０：２．
０であり、かつゲルｈにおいては１．２：１．８であ
る。理解されるように、分解能は分枝架橋剤の濃度が増
大するに伴って徐々に悪化する。この悪化はまず低分子
量の範囲（ゲルｄ−ｆ）において発生する。分枝架橋剤
のより高い濃度においては、分解能は全サイズ範囲にわ
たって（ゲルｇおよびｈ）失われ、すべてのＤＮＡフラ
グメントの移動は非常に少ない。特筆すべきは、他の分
枝された高分子架橋剤も同じ効果を示すことである。し
たがって、エチレングリコールに溶解した線状ポリアク
リルアミドポリマー（ＭＷ５，０００，０００ポリサイ
エンス（Polysciences））をエチレンジアミンと反応さ
せ、それに続いて透析およびアクリロイル化を行なうこ
とによって調製された架橋剤は、６％のポリ（ＮＡＴ）
ゲルにおいて一層強い遅延および分解能の喪失を引起こ
した。これらのゲルのいくつかにおいては、ＤＮＡ分子
は全く泳動することができなかった。
【００５３】例２
６％ポリ（ＮＡＴ）ゲル中のＤＮＡフラグメントの２次
元電気移動。２３，１３０、９，４１６、６，５５７、
４，３６１、２，３２２および２，０２７ｂｐのフラグ
メントを含む、Lambda/HIND III 消化物からのＤＮＡフ
ラグメントは、２Ｖ／ｃｍで３２時間、第１の次元で分
離された。泳動緩衝液は例１で説明したのと同じ液中ゲ
ル装置において３０ｍＭ ＴＡＥであった。３２時間
後、ゲルは９０度回転された。同じフラグメントを含む
サンプルが他のゲル側面に沿って位置決めされる別のサ
ンプルウェルに与えられ、電気泳動は７Ｖ／ｃｍで５時
間継続された。ゲルはエチジウムブロミドで染色され、
図２はこうして得られたパターンを示す。電気泳動は２
Ｖ／ｃｍで上から下へ向かっており、かつ７Ｖ／ｃｍで
左から右へ向かっていた。最大のものである２３，１３
０ｂｐフラグメントは２Ｖ／ｃｍで移動の距離が最も短
かったが、７Ｖ／ｃｍでは９，４１６ｂｐフラグメント
（上２つのバンド）よりも多く移動した。底部のレーン
を見ると一層よくわかるように、実際には６，５５７フ
ラグメントよりわずか向こうに移動した。より大きなＤ
ＮＡフラグメントは常に相対的に弱い均一の電界の中で
よりゆっくりと泳動するという一般的見解とは反対に、
この場合には当てはまらないということを図２に示す。
この予期しない結果なしには、７Ｖ／ｃｍで移動するレ
ーン中のバンドの識別は不正確だったであろうというこ
とが理解されるべきである。２，０２７、２，２３２お
よび４，３６１ＤＮＡフラグメントは予想される順序で
移動し、かつ両方の電界の強さでうまく分解された。
元電気移動。２３，１３０、９，４１６、６，５５７、
４，３６１、２，３２２および２，０２７ｂｐのフラグ
メントを含む、Lambda/HIND III 消化物からのＤＮＡフ
ラグメントは、２Ｖ／ｃｍで３２時間、第１の次元で分
離された。泳動緩衝液は例１で説明したのと同じ液中ゲ
ル装置において３０ｍＭ ＴＡＥであった。３２時間
後、ゲルは９０度回転された。同じフラグメントを含む
サンプルが他のゲル側面に沿って位置決めされる別のサ
ンプルウェルに与えられ、電気泳動は７Ｖ／ｃｍで５時
間継続された。ゲルはエチジウムブロミドで染色され、
図２はこうして得られたパターンを示す。電気泳動は２
Ｖ／ｃｍで上から下へ向かっており、かつ７Ｖ／ｃｍで
左から右へ向かっていた。最大のものである２３，１３
０ｂｐフラグメントは２Ｖ／ｃｍで移動の距離が最も短
かったが、７Ｖ／ｃｍでは９，４１６ｂｐフラグメント
（上２つのバンド）よりも多く移動した。底部のレーン
を見ると一層よくわかるように、実際には６，５５７フ
ラグメントよりわずか向こうに移動した。より大きなＤ
ＮＡフラグメントは常に相対的に弱い均一の電界の中で
よりゆっくりと泳動するという一般的見解とは反対に、
この場合には当てはまらないということを図２に示す。
この予期しない結果なしには、７Ｖ／ｃｍで移動するレ
ーン中のバンドの識別は不正確だったであろうというこ
とが理解されるべきである。２，０２７、２，２３２お
よび４，３６１ＤＮＡフラグメントは予想される順序で
移動し、かつ両方の電界の強さでうまく分解された。
【００５４】例３
架橋されたアガロースゲルの調製。特に示されなけれ
ば、サーバ（Serba ）（Cat.No.11401）からのエレクト
ロエンドオスモシスなしのアガロースが、以下のすべて
の実験に用いられた。調製は架橋剤の有害な性質のため
に排気装置内で実行された。選ばれた濃度のアガロース
ポリマーの溶液は次の方法で調製された。撹拌棒付のビ
ーカーが計量され、所望される水量のうちの約８０％が
それに加えられた。その後、計算された量のアガロース
ポリマーがビーカー中に移され、このビーカーはそれか
ら一片のサラン（Saran ）でカバーされてヒーター／ス
ターラー上に置かれた。懸濁液は沸騰するまで加熱さ
れ、すべてのポリマーが溶解するまで沸騰したままにさ
れた。撹拌の間、溶液は６５−７５℃に冷却され、その
後再び計量された。所望される濃度を得るために残りの
量の水が加えられ、その後架橋反応剤が加えられた。こ
れらの反応剤の容積がアガロース溶液の容積の約５％を
超えると、それに対応して加える水の量は少なくされ
た。
ば、サーバ（Serba ）（Cat.No.11401）からのエレクト
ロエンドオスモシスなしのアガロースが、以下のすべて
の実験に用いられた。調製は架橋剤の有害な性質のため
に排気装置内で実行された。選ばれた濃度のアガロース
ポリマーの溶液は次の方法で調製された。撹拌棒付のビ
ーカーが計量され、所望される水量のうちの約８０％が
それに加えられた。その後、計算された量のアガロース
ポリマーがビーカー中に移され、このビーカーはそれか
ら一片のサラン（Saran ）でカバーされてヒーター／ス
ターラー上に置かれた。懸濁液は沸騰するまで加熱さ
れ、すべてのポリマーが溶解するまで沸騰したままにさ
れた。撹拌の間、溶液は６５−７５℃に冷却され、その
後再び計量された。所望される濃度を得るために残りの
量の水が加えられ、その後架橋反応剤が加えられた。こ
れらの反応剤の容積がアガロース溶液の容積の約５％を
超えると、それに対応して加える水の量は少なくされ
た。
【００５５】１％のアガロース溶液（７２ｍｌ）が上述
のように調製され、０．６６０ｍｌの１０Ｎ ＮａＯＨ
が撹拌しながら加えられた。この溶液の１２グラムのア
リコート３つが取上げられてゲル型中に流し込まれた。
残りの溶液には０．２３４ｍｌのエピクロルヒドリンが
加えられ、この溶液は約２−３分間激しく撹拌された。
その後、溶液は他の３つのゲル型に移された。一方はエ
ピクロルヒドリンを有し、他方は有さない各ゲル型のう
ちの２つが、水蒸気で雰囲気を飽和状態に保つのに十分
な水の入った密閉したポリプロピレンの箱中に置かれ
た。これらの箱は４５℃、５５℃および６５℃でインキ
ュベータ中に置かれた。ゲル型はポリメタクリル酸メチ
ルからなり、かつサンプルウェルフォーマーを含んだ。
ゲルの寸法は９２×６２ｍｍであり、厚さは１．５ｍｍ
であった。ゲルは、ゲル形成の間、一片のゲル・ボンド
（アガロースゲルのため、ＦＭＣ）上に固定された。
のように調製され、０．６６０ｍｌの１０Ｎ ＮａＯＨ
が撹拌しながら加えられた。この溶液の１２グラムのア
リコート３つが取上げられてゲル型中に流し込まれた。
残りの溶液には０．２３４ｍｌのエピクロルヒドリンが
加えられ、この溶液は約２−３分間激しく撹拌された。
その後、溶液は他の３つのゲル型に移された。一方はエ
ピクロルヒドリンを有し、他方は有さない各ゲル型のう
ちの２つが、水蒸気で雰囲気を飽和状態に保つのに十分
な水の入った密閉したポリプロピレンの箱中に置かれ
た。これらの箱は４５℃、５５℃および６５℃でインキ
ュベータ中に置かれた。ゲル型はポリメタクリル酸メチ
ルからなり、かつサンプルウェルフォーマーを含んだ。
ゲルの寸法は９２×６２ｍｍであり、厚さは１．５ｍｍ
であった。ゲルは、ゲル形成の間、一片のゲル・ボンド
（アガロースゲルのため、ＦＭＣ）上に固定された。
【００５６】上に特定した温度で一晩インキュベーショ
ンした後、ゲルは検査された。３つの温度のいずれにお
いてもエピクロルヒドリンを含まない溶液からは取扱い
可能なゲルは形成されなかった。対照的に、エピクロル
ヒドリンを含む溶液からは３つすべての温度においてプ
ラスチック支持体に強力に固着したゲルが形成された。
３つのゲルすべては十分に透明性があった。ゲルは蒸留
水中に浸され、８時間内に３回１リットル変えられ、そ
の後３０ｍＭ ＴＡＥ緩衝液中に一晩浸された。２つの
異なるＤＮＡ標品が各ゲル内で電気泳動した。ＤＮＡフ
ラグメントは、１ｋｂラダー（ＢＲＬ）からの次のサイ
ズ：１２２１６，１１１９８，１０１８０，９１６２，
８１４４，７１２６，６１０８，５０９０，４０７２，
３０５４，２０３６，１６３６，１０１８，５１６，５
０６，３９６，３４４，２９８，２２０，２０１，１５
４，１３４および７５の塩基対のものであった。他のサ
ンプルは、サイズ５８７，５４０，５０４，４５８，２
６７，２３４，２１３，１９２，１８４，１２４，１２
３，１０４，８９，８０，６４，５７および５１ｂｐの
ｐＢＲ３２２／Hae III （Boehringer）からのフラグメ
ントを含むものであった。ゲルは７ｖ／ｃｍで１時間５
０分間泳動され、その後エチジウムブロミドで染色され
た。
ンした後、ゲルは検査された。３つの温度のいずれにお
いてもエピクロルヒドリンを含まない溶液からは取扱い
可能なゲルは形成されなかった。対照的に、エピクロル
ヒドリンを含む溶液からは３つすべての温度においてプ
ラスチック支持体に強力に固着したゲルが形成された。
３つのゲルすべては十分に透明性があった。ゲルは蒸留
水中に浸され、８時間内に３回１リットル変えられ、そ
の後３０ｍＭ ＴＡＥ緩衝液中に一晩浸された。２つの
異なるＤＮＡ標品が各ゲル内で電気泳動した。ＤＮＡフ
ラグメントは、１ｋｂラダー（ＢＲＬ）からの次のサイ
ズ：１２２１６，１１１９８，１０１８０，９１６２，
８１４４，７１２６，６１０８，５０９０，４０７２，
３０５４，２０３６，１６３６，１０１８，５１６，５
０６，３９６，３４４，２９８，２２０，２０１，１５
４，１３４および７５の塩基対のものであった。他のサ
ンプルは、サイズ５８７，５４０，５０４，４５８，２
６７，２３４，２１３，１９２，１８４，１２４，１２
３，１０４，８９，８０，６４，５７および５１ｂｐの
ｐＢＲ３２２／Hae III （Boehringer）からのフラグメ
ントを含むものであった。ゲルは７ｖ／ｃｍで１時間５
０分間泳動され、その後エチジウムブロミドで染色され
た。
【００５７】図３は６５℃でインキュベートされたゲル
中のＤＮＡパターンを示す。全サイズ範囲中の分解能は
不良である。５５℃でインキュベートされたゲルは幾分
良好な分解能を示す（図示せず）。全サイズの範囲にわ
たっての分解能は４５℃でインキュベートされたゲルの
方がはるかに優れている（図４）。
中のＤＮＡパターンを示す。全サイズ範囲中の分解能は
不良である。５５℃でインキュベートされたゲルは幾分
良好な分解能を示す（図示せず）。全サイズの範囲にわ
たっての分解能は４５℃でインキュベートされたゲルの
方がはるかに優れている（図４）。
【００５８】例４
アガロースポリマーを異なる濃度のエピクロルヒドリン
で架橋することによって調製されるゲル。エレクトロエ
ンドオスモシス（シーケム（SeaKem）ＧＴグレード、Ｆ
ＭＣ）を用いたアガロースが使用された。１％のアガロ
ース溶液（４０ｍｌ）中へ、エピクロルヒドリンおよび
水酸化ナトリウム（１０Ｎ溶液）が、常に水酸化ナトリ
ウムが１．１モルだけ超過するような比率で加えられ
た。エピクロルヒドリンの最終量は０、１、２、４、
４、６および１０ｍモルであった。ゲルの厚さは３ｍｍ
であり、かつ室温で一晩放置された。ゲルの透明性は架
橋剤の濃度が増大するとともに向上した。水で洗浄し、
かつＴＡＥ緩衝液に対して平衡させた後、例３に説明し
たように、ＤＮＡフラグメントはこれらのゲル中で分析
された。いかなる架橋剤も含まないゲルにおいては、１
ｋｂｐラダーからの５１７と５０６、２２０と２０１お
よび１５４と１３４ｂｐフラグメント間は分解されなか
った。１、２および４ｍモルの架橋剤で架橋されたゲル
中のバンドパターンにはわずかな差しかなかった。しか
しながら、６ｍモルで架橋されたゲルにおいては、上記
の３つの二重線は部分的に分離され、かつ１０ｍモルの
エピクロルヒドリンで架橋されたゲルにおいてはそれら
は完全に分離された。泳動の距離もまた最後の２つのゲ
ルにおいてははるかに短く、そのため７５ｂｐフラグメ
ントはこれらのゲルから外には泳動しなかった。これら
の結果が示すことは、分解能の質はポリマー／架橋剤比
に依存するということである。約２％より少ないポリマ
ーを含む上記のゲルおよび他のゲルは、外気中でプラス
チック支持体を曲げることなく薄いフィルムに乾燥させ
ることができる。乾燥したゲルは水に入れられると再水
和され、かつ再水和度はポリマーと架橋剤のタイプおよ
び質に依存する。
で架橋することによって調製されるゲル。エレクトロエ
ンドオスモシス（シーケム（SeaKem）ＧＴグレード、Ｆ
ＭＣ）を用いたアガロースが使用された。１％のアガロ
ース溶液（４０ｍｌ）中へ、エピクロルヒドリンおよび
水酸化ナトリウム（１０Ｎ溶液）が、常に水酸化ナトリ
ウムが１．１モルだけ超過するような比率で加えられ
た。エピクロルヒドリンの最終量は０、１、２、４、
４、６および１０ｍモルであった。ゲルの厚さは３ｍｍ
であり、かつ室温で一晩放置された。ゲルの透明性は架
橋剤の濃度が増大するとともに向上した。水で洗浄し、
かつＴＡＥ緩衝液に対して平衡させた後、例３に説明し
たように、ＤＮＡフラグメントはこれらのゲル中で分析
された。いかなる架橋剤も含まないゲルにおいては、１
ｋｂｐラダーからの５１７と５０６、２２０と２０１お
よび１５４と１３４ｂｐフラグメント間は分解されなか
った。１、２および４ｍモルの架橋剤で架橋されたゲル
中のバンドパターンにはわずかな差しかなかった。しか
しながら、６ｍモルで架橋されたゲルにおいては、上記
の３つの二重線は部分的に分離され、かつ１０ｍモルの
エピクロルヒドリンで架橋されたゲルにおいてはそれら
は完全に分離された。泳動の距離もまた最後の２つのゲ
ルにおいてははるかに短く、そのため７５ｂｐフラグメ
ントはこれらのゲルから外には泳動しなかった。これら
の結果が示すことは、分解能の質はポリマー／架橋剤比
に依存するということである。約２％より少ないポリマ
ーを含む上記のゲルおよび他のゲルは、外気中でプラス
チック支持体を曲げることなく薄いフィルムに乾燥させ
ることができる。乾燥したゲルは水に入れられると再水
和され、かつ再水和度はポリマーと架橋剤のタイプおよ
び質に依存する。
【００５９】例５
反応混合物を異なる温度で異なる時間にわたってインキ
ュベートすることによって調製される、アガロースおよ
びエピクロルヒドリンを含むゲル。これらのゲルは４０
ｍｌ中に０．６グラムのアガロース（ＦＭＣ、ＧＴグレ
ード）、０．７８０ｍｌのエピクロルヒドリンおよび１
ｍｌの１０Ｎ ＮａＯＨを含んでいた。溶液をゲル型中
に注いだ後、第１のゲルは室温で一晩、第２のゲルは３
５℃で３日間、第３のゲルは４５℃で一晩、および第４
のゲルは最初４℃で一晩それから室温で２日間インキュ
ベートされた。これらのゲルは上述のように洗浄されか
つ平衡された。様々なＤＮＡフラグメントが１時間４５
分の間７Ｖ／ｃｍでこれらのゲル中で電気泳動された。
エチジウムブロミドで染色した後、第１の３つのゲル中
には非常に鮮明なバンドが観察されたが、これらのバン
ドは第４のゲルにおいてはあまり鮮明ではなかった。pB
R 322/Hae III からの５８７ｂｐフラグメントの移動の
距離は第４のゲルにおいて最も短く、これは本質的には
第１および第２のゲル中の距離と同じである。１２３／
１２４ｂｐフラグメントはすべてのゲルにおいて本質的
に同じ距離を移動した。１８４および１９２ｂｐフラグ
メントはすべてのゲルにおいて解像されたが、分解能は
第２のゲルが最良であった。
ュベートすることによって調製される、アガロースおよ
びエピクロルヒドリンを含むゲル。これらのゲルは４０
ｍｌ中に０．６グラムのアガロース（ＦＭＣ、ＧＴグレ
ード）、０．７８０ｍｌのエピクロルヒドリンおよび１
ｍｌの１０Ｎ ＮａＯＨを含んでいた。溶液をゲル型中
に注いだ後、第１のゲルは室温で一晩、第２のゲルは３
５℃で３日間、第３のゲルは４５℃で一晩、および第４
のゲルは最初４℃で一晩それから室温で２日間インキュ
ベートされた。これらのゲルは上述のように洗浄されか
つ平衡された。様々なＤＮＡフラグメントが１時間４５
分の間７Ｖ／ｃｍでこれらのゲル中で電気泳動された。
エチジウムブロミドで染色した後、第１の３つのゲル中
には非常に鮮明なバンドが観察されたが、これらのバン
ドは第４のゲルにおいてはあまり鮮明ではなかった。pB
R 322/Hae III からの５８７ｂｐフラグメントの移動の
距離は第４のゲルにおいて最も短く、これは本質的には
第１および第２のゲル中の距離と同じである。１２３／
１２４ｂｐフラグメントはすべてのゲルにおいて本質的
に同じ距離を移動した。１８４および１９２ｂｐフラグ
メントはすべてのゲルにおいて解像されたが、分解能は
第２のゲルが最良であった。
【００６０】同じ組成の別の２つのゲルが調製されかつ
室温で一晩インキュベートされたが、１つのゲルはさら
に４５℃で２日間インキュベートされた。電気泳動は７
Ｖ／ｃｍで２時間３０分にわたって行なわれた。双方の
ゲルにおいて鮮明なバンドが観察された。すべてのＤＮ
Ａバンドの移動は４５℃でさらにインキュベートされた
ゲルにおいては少なかった。これらの結果が示すこと
は、分解能の質はゲル形成の温度および時間を変化させ
ることにより制御可能であるということである。一片
（約１×１ｃｍ）の第２のゲルが沸騰した湯の中で加熱
された。ゲルは溶解しなかった。
室温で一晩インキュベートされたが、１つのゲルはさら
に４５℃で２日間インキュベートされた。電気泳動は７
Ｖ／ｃｍで２時間３０分にわたって行なわれた。双方の
ゲルにおいて鮮明なバンドが観察された。すべてのＤＮ
Ａバンドの移動は４５℃でさらにインキュベートされた
ゲルにおいては少なかった。これらの結果が示すこと
は、分解能の質はゲル形成の温度および時間を変化させ
ることにより制御可能であるということである。一片
（約１×１ｃｍ）の第２のゲルが沸騰した湯の中で加熱
された。ゲルは溶解しなかった。
【００６１】例６
異なるポリマー／架橋剤比で調製されかつ異なる時間期
間にわたって様々な温度でインキュベートされたアガロ
ースおよびブタンジオールジグリシジルエーテルを含む
ゲル。ゲル（厚さ１．５ｍｍ）は、ＮａＯＨ中で０．１
Ｍにされかつ０．０５、０．１、０．２、０．４、０．
６ｍｌのブタンジオールジグリシジルエーテルを含む１
％のアガロース溶液１０ｍｌから調製された。上記の反
応混合物を含んだ型は室温で４日間インキュベートされ
た。電気泳動（７Ｖ／ｃｍ、１時間５０分）の後、ＤＮ
Ａフラグメントの泳動距離はブタンジオールジグリシジ
ルエーテルの濃度が増大するにつれて減少することが観
察された。より濃度の高い架橋試薬において分解能はよ
り優れていた。次の実験においては、２０ｍｌ中に０．
１Ｍ ＮａＯＨおよび０．５ｍｌのブタンジオールジグ
リシジルエーテルを含む、一連の１％のアガロースゲル
が、室温で１６時間、２４時間、２日、４日および５日
間インキュベートされた。ＤＮＡフラグメントの電気泳
動の分解能は１６時間インキュベートされたゲルにおい
ては不良であった。インキュベーションが長くなると、
泳動距離は短くなりかつ分解能が向上した。４日間イン
キュベートされたゲルと５日間インキュベートされたゲ
ルとの間には本質的に差はなかった。たんぱく質（フェ
リチンおよびチログロブリン）がこれらのゲルのいくつ
かのサンプルウェル中に与えられ、同時にＤＮＡととも
に電気泳動された。泳動の最後に、ゲルは切断されかつ
たんぱく質を含む部分はクーマシー・ブルー（Coomassi
e Blue）で染色された。チログロブリンは１日よりも４
日間および５日間インキュベートされたゲルにおいて
は、フェリチンに比べて泳動が少ない。
間にわたって様々な温度でインキュベートされたアガロ
ースおよびブタンジオールジグリシジルエーテルを含む
ゲル。ゲル（厚さ１．５ｍｍ）は、ＮａＯＨ中で０．１
Ｍにされかつ０．０５、０．１、０．２、０．４、０．
６ｍｌのブタンジオールジグリシジルエーテルを含む１
％のアガロース溶液１０ｍｌから調製された。上記の反
応混合物を含んだ型は室温で４日間インキュベートされ
た。電気泳動（７Ｖ／ｃｍ、１時間５０分）の後、ＤＮ
Ａフラグメントの泳動距離はブタンジオールジグリシジ
ルエーテルの濃度が増大するにつれて減少することが観
察された。より濃度の高い架橋試薬において分解能はよ
り優れていた。次の実験においては、２０ｍｌ中に０．
１Ｍ ＮａＯＨおよび０．５ｍｌのブタンジオールジグ
リシジルエーテルを含む、一連の１％のアガロースゲル
が、室温で１６時間、２４時間、２日、４日および５日
間インキュベートされた。ＤＮＡフラグメントの電気泳
動の分解能は１６時間インキュベートされたゲルにおい
ては不良であった。インキュベーションが長くなると、
泳動距離は短くなりかつ分解能が向上した。４日間イン
キュベートされたゲルと５日間インキュベートされたゲ
ルとの間には本質的に差はなかった。たんぱく質（フェ
リチンおよびチログロブリン）がこれらのゲルのいくつ
かのサンプルウェル中に与えられ、同時にＤＮＡととも
に電気泳動された。泳動の最後に、ゲルは切断されかつ
たんぱく質を含む部分はクーマシー・ブルー（Coomassi
e Blue）で染色された。チログロブリンは１日よりも４
日間および５日間インキュベートされたゲルにおいて
は、フェリチンに比べて泳動が少ない。
【００６２】２０ｍｌ中に０．１Ｍ ＮａＯＨおよび
０．５ｍｌのブタンジオールジグリシジルエーテルを含
む１％のアガロース溶液を含む３つのゲルは、３５℃、
５５℃または６５℃で２日間インキュベートすることよ
って形成された。ＤＮＡフラグメント、特に小さいもの
の分解能は６５℃でインキュベートされたゲルにおいて
は不良であったが、３５℃でインキュベートされたゲル
においては優れていた（図１０）。分解能は、１．５％
のアガロースを含みかつ０．１Ｍ ＮａＯＨ中の２０ｍ
ｌのアガロース溶液を３５℃で２日間、１ｍｌの架橋剤
でインキュベートすることによって形成された他のゲル
においてもまた優れていたが、分解の範囲は異なってい
た（図１１）。したがって、１２３ｂｐフラグメントは
１％のゲルから泳動したが、これは１．５％のゲルの底
部から１．５ｃｍ以上離れていた。約５００ｂｐよりも
上のＤＮＡフラグメントの分解能は１％ゲルにおいてよ
り優れており、かつより小さなフラグメントの分解能は
１．５％のゲルにおいて優れていた。
０．５ｍｌのブタンジオールジグリシジルエーテルを含
む１％のアガロース溶液を含む３つのゲルは、３５℃、
５５℃または６５℃で２日間インキュベートすることよ
って形成された。ＤＮＡフラグメント、特に小さいもの
の分解能は６５℃でインキュベートされたゲルにおいて
は不良であったが、３５℃でインキュベートされたゲル
においては優れていた（図１０）。分解能は、１．５％
のアガロースを含みかつ０．１Ｍ ＮａＯＨ中の２０ｍ
ｌのアガロース溶液を３５℃で２日間、１ｍｌの架橋剤
でインキュベートすることによって形成された他のゲル
においてもまた優れていたが、分解の範囲は異なってい
た（図１１）。したがって、１２３ｂｐフラグメントは
１％のゲルから泳動したが、これは１．５％のゲルの底
部から１．５ｃｍ以上離れていた。約５００ｂｐよりも
上のＤＮＡフラグメントの分解能は１％ゲルにおいてよ
り優れており、かつより小さなフラグメントの分解能は
１．５％のゲルにおいて優れていた。
【００６３】例７
異なるポリマー／架橋剤比で調製され、かつ異なる時間
期間にわたってインキュベートされたアガロースおよび
１，３−ジクロロプロパノールを含むゲル。一連のゲル
は、１％アガロースポリマー１０ｍｌに０．２５、０．
５、１．０、１．５、２．０および２．５ｍモルの１，
３−ジクロロプロパノール（ＤＣＰ）、ならびに０．５
５、１．１、２．２、３．３、４．４および５．５ｍモ
ルの水酸化ナトリウムをそれぞれ溶解したものから調製
された。このように、水酸化物のモルは塩化物に対して
常に超過していた（１０％）。この溶液はゲル型中に注
がれ、かつ３５℃で２日間インキュベートされた。７Ｖ
／ｃｍでの１時間５０分のＤＮＡの電気泳動により、Ｄ
ＮＡフラグメントの泳動距離および分解能が異なること
が示された。すなわち、２６７ｂｐフラグメント（pBR3
22/Hae III）は、０．２５ｍモルＤＣＰで架橋されたゲ
ルにおいてちょうどボトムであったが、これは２．５ｍ
モルＤＣＰで架橋されたゲルにおけるボトムから１ｃｍ
以上離れていた。
期間にわたってインキュベートされたアガロースおよび
１，３−ジクロロプロパノールを含むゲル。一連のゲル
は、１％アガロースポリマー１０ｍｌに０．２５、０．
５、１．０、１．５、２．０および２．５ｍモルの１，
３−ジクロロプロパノール（ＤＣＰ）、ならびに０．５
５、１．１、２．２、３．３、４．４および５．５ｍモ
ルの水酸化ナトリウムをそれぞれ溶解したものから調製
された。このように、水酸化物のモルは塩化物に対して
常に超過していた（１０％）。この溶液はゲル型中に注
がれ、かつ３５℃で２日間インキュベートされた。７Ｖ
／ｃｍでの１時間５０分のＤＮＡの電気泳動により、Ｄ
ＮＡフラグメントの泳動距離および分解能が異なること
が示された。すなわち、２６７ｂｐフラグメント（pBR3
22/Hae III）は、０．２５ｍモルＤＣＰで架橋されたゲ
ルにおいてちょうどボトムであったが、これは２．５ｍ
モルＤＣＰで架橋されたゲルにおけるボトムから１ｃｍ
以上離れていた。
【００６４】１．５％のアガロース水溶液を調製し、か
つ１，３−ジクロロプロパノール（１、２、３および４
ｍモル）ならびに１０Ｎ ＮａＯＨ（２．２、４．４、
６．６および８．８ｍモル）を１０ｍｌの温いアガロー
ス溶液に加えることによって、別の一連のゲルが作られ
た。ゲル化は４日間にわたって３５℃で行なわれた。Ｄ
ＮＡフラグメントの電気泳動により、１ｍモルの１，３
−ジクロロプロパノールを有するゲルにおいてよりも２
および３ｍモルを有するゲルにおける方がより鮮明なバ
ンドが得られた。注目すべきことは、５００ｂｐを上回
るより大きなＤＮＡフラグメントは３ｍモルの架橋剤を
有するゲルにおいてよりも４ｍモルの架橋剤を有するゲ
ルにおいての方がはるかに泳動が大きかったことであ
る。フェリチンに比べてチログロブリンは４ｍモルの架
橋剤を有するゲルにおいてより多く泳動した。さらに、
そのゲルはまた架橋剤の少ないゲルよりも軟らかであっ
た。したがって、最良の架橋剤の濃度が存在し、それを
超えると分解能だけではなく機械的な安定性をも悪化さ
せ得る。
つ１，３−ジクロロプロパノール（１、２、３および４
ｍモル）ならびに１０Ｎ ＮａＯＨ（２．２、４．４、
６．６および８．８ｍモル）を１０ｍｌの温いアガロー
ス溶液に加えることによって、別の一連のゲルが作られ
た。ゲル化は４日間にわたって３５℃で行なわれた。Ｄ
ＮＡフラグメントの電気泳動により、１ｍモルの１，３
−ジクロロプロパノールを有するゲルにおいてよりも２
および３ｍモルを有するゲルにおける方がより鮮明なバ
ンドが得られた。注目すべきことは、５００ｂｐを上回
るより大きなＤＮＡフラグメントは３ｍモルの架橋剤を
有するゲルにおいてよりも４ｍモルの架橋剤を有するゲ
ルにおいての方がはるかに泳動が大きかったことであ
る。フェリチンに比べてチログロブリンは４ｍモルの架
橋剤を有するゲルにおいてより多く泳動した。さらに、
そのゲルはまた架橋剤の少ないゲルよりも軟らかであっ
た。したがって、最良の架橋剤の濃度が存在し、それを
超えると分解能だけではなく機械的な安定性をも悪化さ
せ得る。
【００６５】１０ｍｌ中に２％のアガロースポリマー、
０、０．１、０．２、０．４、０．６、１．０、２．０
および４．０ｍモルの１，３−ジクロロプロパノール、
ならびに塩素に対してモルが１０％多いＮａＯＨを含む
一連のゲルが、３５℃で４日間インキュベーションする
ことによって調製された。各ゲル溶液の約１．５ｍｌの
部分（３連）が、パラフィン油をかぶせられたポリスチ
レンキュベット中に置かれ、同じ条件でインキュベート
された。ＤＮＡフラグメントの電気泳動（７Ｖ／ｃｍ、
１時間５０分）は、架橋剤濃度が約１ｍモルまで増大す
るにつれ１０００ｂｐより下のＤＮＡフラグメントの分
解能が向上し、かつ架橋濃度４．０ｍモルまでは良好な
ままであったことを示した。ゲルの透明度は５００ｎｍ
での吸光度を測定し（表１参照）、かつ室温で一晩平衡
されたゲルの可視スペクトル（４００−８００ｎｍ）を
記録することにより決定された。
０、０．１、０．２、０．４、０．６、１．０、２．０
および４．０ｍモルの１，３−ジクロロプロパノール、
ならびに塩素に対してモルが１０％多いＮａＯＨを含む
一連のゲルが、３５℃で４日間インキュベーションする
ことによって調製された。各ゲル溶液の約１．５ｍｌの
部分（３連）が、パラフィン油をかぶせられたポリスチ
レンキュベット中に置かれ、同じ条件でインキュベート
された。ＤＮＡフラグメントの電気泳動（７Ｖ／ｃｍ、
１時間５０分）は、架橋剤濃度が約１ｍモルまで増大す
るにつれ１０００ｂｐより下のＤＮＡフラグメントの分
解能が向上し、かつ架橋濃度４．０ｍモルまでは良好な
ままであったことを示した。ゲルの透明度は５００ｎｍ
での吸光度を測定し（表１参照）、かつ室温で一晩平衡
されたゲルの可視スペクトル（４００−８００ｎｍ）を
記録することにより決定された。
【００６６】
【表１】
【００６７】架橋剤を含まないアガロースゲルのスペク
トルが図５に示される。架橋剤濃度が増大するとすべて
の波長での吸光度の値は減少し、かつ濃度が１ｍモルを
超えると本質的に一定となった。１０ｍｌ中の２ｍモル
の１，３−ジクロロプロパノールで調製されたゲルの可
視スペクトルが図６に示される。このゲルの５００ｎｍ
での吸光度は、標準的なアガロースゲルのものよりも１
桁以上低い（表１参照）。ゲルを水晶キュベット中に移
した後に記録されたＵＶスペクトルは、３００−４００
ｎｍ領域では吸光度が低く、２６０ｎｍあたりが肩部分
で、かつ約２３０ｎｍを下回ると急激に上昇することを
示した。
トルが図５に示される。架橋剤濃度が増大するとすべて
の波長での吸光度の値は減少し、かつ濃度が１ｍモルを
超えると本質的に一定となった。１０ｍｌ中の２ｍモル
の１，３−ジクロロプロパノールで調製されたゲルの可
視スペクトルが図６に示される。このゲルの５００ｎｍ
での吸光度は、標準的なアガロースゲルのものよりも１
桁以上低い（表１参照）。ゲルを水晶キュベット中に移
した後に記録されたＵＶスペクトルは、３００−４００
ｎｍ領域では吸光度が低く、２６０ｎｍあたりが肩部分
で、かつ約２３０ｎｍを下回ると急激に上昇することを
示した。
【００６８】lambda/Hind III フラグメントの二次元電
気泳動は、１０ｍｌ当り１．５ｍモルの１，３−ジクロ
ロプロパノールで架橋された１．５％のアガロースポリ
マーを含むゲル中で実行された。第１次元において、ゲ
ルは２Ｖ／ｃｍで１６時間にわたって泳動された。ゲル
を９０度回転させた後、第二次元の電気泳動が７Ｖ／ｃ
ｍで４時間の間行なわれた。図９では、７Ｖ／ｃｍで２
３ｋｂｐフラグメントが９．４ｋｂｐフラグメントより
も多く泳動したことが示される。この結果は図２に示し
たものと同じであるため、両方のゲルにおけるＤＮＡ泳
動のメカニズムは同じであることが示される。
気泳動は、１０ｍｌ当り１．５ｍモルの１，３−ジクロ
ロプロパノールで架橋された１．５％のアガロースポリ
マーを含むゲル中で実行された。第１次元において、ゲ
ルは２Ｖ／ｃｍで１６時間にわたって泳動された。ゲル
を９０度回転させた後、第二次元の電気泳動が７Ｖ／ｃ
ｍで４時間の間行なわれた。図９では、７Ｖ／ｃｍで２
３ｋｂｐフラグメントが９．４ｋｂｐフラグメントより
も多く泳動したことが示される。この結果は図２に示し
たものと同じであるため、両方のゲルにおけるＤＮＡ泳
動のメカニズムは同じであることが示される。
【００６９】例８
ヒドロキシエチル化されたアガロースおよび１，３−ジ
クロロプロパノールを異なるポリマー／架橋剤比で含む
ゲル。２％のヒドロキシル化されたアガロースポリマー
（シー・プラク（SeaPlaque ）、ＦＭＣ）および架橋剤
を含む一連のゲルが例７で説明した方法で調製された。
ＤＮＡフラグメントの電気泳動の分解能は向上し、標準
的なゲルに比べて最低の架橋剤の濃度においても既には
っきりと認識できた。５００ｎｍでの吸光度を測定する
と１０ｍｌ中に約０．６ｍモルを上回る架橋剤の濃度で
は本質的に変化はないことが示された。標準的シー・プ
ラクゲルの可視スペクトルが図７に示される。図８はヒ
ドロキシル化されたアガロースポリマーおよび１０ｍｌ
中に１．０ｍモルの１，３−ジクロロプロパノールを含
むゲルのスペクトルを示す。ヒドロキシル化されたアガ
ロースを含むゲルの吸光度は可視領域において非誘導ア
ガロースの吸光度の約半分を示す（図５と図７とを比較
されたい）。一方、同じポリマーに加えて架橋剤を含む
このゲルの吸光度は、架橋剤を含まないゲルの吸光度の
１０分の１以下であることを示した。実際に、ヒドロキ
シル化されたアガロースとより多量の架橋剤とを含むこ
のゲルの吸光度は可視領域中ではほとんど存在しない
（図８）。
クロロプロパノールを異なるポリマー／架橋剤比で含む
ゲル。２％のヒドロキシル化されたアガロースポリマー
（シー・プラク（SeaPlaque ）、ＦＭＣ）および架橋剤
を含む一連のゲルが例７で説明した方法で調製された。
ＤＮＡフラグメントの電気泳動の分解能は向上し、標準
的なゲルに比べて最低の架橋剤の濃度においても既には
っきりと認識できた。５００ｎｍでの吸光度を測定する
と１０ｍｌ中に約０．６ｍモルを上回る架橋剤の濃度で
は本質的に変化はないことが示された。標準的シー・プ
ラクゲルの可視スペクトルが図７に示される。図８はヒ
ドロキシル化されたアガロースポリマーおよび１０ｍｌ
中に１．０ｍモルの１，３−ジクロロプロパノールを含
むゲルのスペクトルを示す。ヒドロキシル化されたアガ
ロースを含むゲルの吸光度は可視領域において非誘導ア
ガロースの吸光度の約半分を示す（図５と図７とを比較
されたい）。一方、同じポリマーに加えて架橋剤を含む
このゲルの吸光度は、架橋剤を含まないゲルの吸光度の
１０分の１以下であることを示した。実際に、ヒドロキ
シル化されたアガロースとより多量の架橋剤とを含むこ
のゲルの吸光度は可視領域中ではほとんど存在しない
（図８）。
【００７０】例９
異なるポリマー／架橋剤比で調製されたアガロースおよ
び２，３−ジブロモプロパノールを含むゲル。１０ｍｌ
中に１％のアガロースポリマー、および０．２５、０．
５、１．０、１．５、２．０および２．５ｍモルの２，
３−ジブロモプロパノールを含む一連のゲルが調製され
た。このゲル溶液はまた臭化物に対してモルが１０％多
い水酸化ナトリウムを含んでいた。これらのゲルは３５
℃で２日間インキュベートされた。ＤＮＡフラグメント
の電気泳動の分解能は分子量の小さい範囲、特に架橋剤
１−２ｍモルにおいて向上することを示した。分解能
は、１，３−ジクロロプロパノールで架橋されたゲルで
達成されたものよりも幾分劣っていた。場合により、ゲ
ル中に小さな泡が認められ得る。
び２，３−ジブロモプロパノールを含むゲル。１０ｍｌ
中に１％のアガロースポリマー、および０．２５、０．
５、１．０、１．５、２．０および２．５ｍモルの２，
３−ジブロモプロパノールを含む一連のゲルが調製され
た。このゲル溶液はまた臭化物に対してモルが１０％多
い水酸化ナトリウムを含んでいた。これらのゲルは３５
℃で２日間インキュベートされた。ＤＮＡフラグメント
の電気泳動の分解能は分子量の小さい範囲、特に架橋剤
１−２ｍモルにおいて向上することを示した。分解能
は、１，３−ジクロロプロパノールで架橋されたゲルで
達成されたものよりも幾分劣っていた。場合により、ゲ
ル中に小さな泡が認められ得る。
【００７１】例１０
異なるポリマー／架橋剤比で調製されたアガロースおよ
びエチレングリコールジグリシジルエーテルを含むゲ
ル。１０ｍｌ中に０．１Ｍ ＮａＯＨにおいて、１％の
アガロースポリマーと、０．０５、０．１、０．２、
０．４および０．６ｍｌのエチレングリコールジグリシ
ジルエーテルを含む一連のゲルが、室温で４日間インキ
ュベーションすることによって調製された。電気泳動に
よる移動距離は架橋剤の濃度が増大するに従い減少し
た。分解能はブタンジオールジグリシジルエーテルを用
いて得られたものよりも劣っていた。
びエチレングリコールジグリシジルエーテルを含むゲ
ル。１０ｍｌ中に０．１Ｍ ＮａＯＨにおいて、１％の
アガロースポリマーと、０．０５、０．１、０．２、
０．４および０．６ｍｌのエチレングリコールジグリシ
ジルエーテルを含む一連のゲルが、室温で４日間インキ
ュベーションすることによって調製された。電気泳動に
よる移動距離は架橋剤の濃度が増大するに従い減少し
た。分解能はブタンジオールジグリシジルエーテルを用
いて得られたものよりも劣っていた。
【００７２】例１１
異なるポリマー／架橋剤比、様々なｐＨ値で異なる時間
にわたって調製されたアガロースおよびジビニルスルホ
ンを含むゲル。０．１Ｍ ＮａＯＨ中１％の温かいアガ
ロース溶液中に、０．０１０ｍｌのジビニルスルホンが
急激に撹拌しながら加えられた。溶液はすぐにゲル型中
に移された。ゲルは数分で固った。この凝固は、かかる
ゲルを再現可能に調製することを実質的に不可能にする
より高い架橋剤濃度においてより速かった。電気泳動の
移動距離は標準的なゲルのものと比べて著しく減少を示
した。
にわたって調製されたアガロースおよびジビニルスルホ
ンを含むゲル。０．１Ｍ ＮａＯＨ中１％の温かいアガ
ロース溶液中に、０．０１０ｍｌのジビニルスルホンが
急激に撹拌しながら加えられた。溶液はすぐにゲル型中
に移された。ゲルは数分で固った。この凝固は、かかる
ゲルを再現可能に調製することを実質的に不可能にする
より高い架橋剤濃度においてより速かった。電気泳動の
移動距離は標準的なゲルのものと比べて著しく減少を示
した。
【００７３】アガロース溶液（１％）は、ｐＨ８、９．
５および１１．０で０．２Ｍの重炭酸−炭酸緩衝液中で
調製された。これらの溶液各々２０ｍｌ中に、０．１ｍ
ｌのジビニルスホンが加えられ、かつゲル溶液は３５℃
で２日間インキュベートされた。ＤＮＡフラグメントの
移動は少なく、ｐＨ９．５よりもｐＨ８で形成されたゲ
ルにおいての方がバンドはより鮮明に見えた。ｐＨ１１
で形成されたゲルにおいては、フラグメントの移動は２
つのゲルのうちのいずれよりも少なかった。ＤＮＡの小
さなフラグメントに対応するバンドはこのゲルにおいて
は最も鮮明であった。
５および１１．０で０．２Ｍの重炭酸−炭酸緩衝液中で
調製された。これらの溶液各々２０ｍｌ中に、０．１ｍ
ｌのジビニルスホンが加えられ、かつゲル溶液は３５℃
で２日間インキュベートされた。ＤＮＡフラグメントの
移動は少なく、ｐＨ９．５よりもｐＨ８で形成されたゲ
ルにおいての方がバンドはより鮮明に見えた。ｐＨ１１
で形成されたゲルにおいては、フラグメントの移動は２
つのゲルのうちのいずれよりも少なかった。ＤＮＡの小
さなフラグメントに対応するバンドはこのゲルにおいて
は最も鮮明であった。
【００７４】２０ｍｌにつき１０ｍＭのＮａＯＨ中１％
のアガロースと、０．０２０、０．０４０、０．０６
０、０．０８０および０．１００ｍｌのジビニルスルホ
ンとを含んだ一連のゲルが調製された。架橋剤を加えた
後、各ゲルは即座にゲル型中に流し込まれ、１５分間放
置された。０．１００ｍｌの架橋剤を含むゲルは引続き
取扱うには脆すぎた。他のゲルは水で洗浄され、かつＴ
ＡＥ緩衝液中で平衡された。電気泳動の移動距離は架橋
剤の濃度が増大するにつれて減少を示した。４つすべて
のゲル中のＤＮＡバンドは、ｐＨ１１で２日間架橋され
た上記のゲルにおいてよりももっと拡散していた。
のアガロースと、０．０２０、０．０４０、０．０６
０、０．０８０および０．１００ｍｌのジビニルスルホ
ンとを含んだ一連のゲルが調製された。架橋剤を加えた
後、各ゲルは即座にゲル型中に流し込まれ、１５分間放
置された。０．１００ｍｌの架橋剤を含むゲルは引続き
取扱うには脆すぎた。他のゲルは水で洗浄され、かつＴ
ＡＥ緩衝液中で平衡された。電気泳動の移動距離は架橋
剤の濃度が増大するにつれて減少を示した。４つすべて
のゲル中のＤＮＡバンドは、ｐＨ１１で２日間架橋され
た上記のゲルにおいてよりももっと拡散していた。
【００７５】例１２
架橋剤試薬を異なる温度でポリマー溶液に加えることに
よるアガロースおよびブタンジオールジグリシジルエー
テルを含むゲル。０．１Ｍ ＮａＯＨ中１％アガロース
溶液に、架橋剤を５０℃および７０℃で激しく撹拌しな
がら加えた（２０ｍｌ当り０．５ｍｌ）。このゲル溶液
はすぐにゲル型中に注がれ、３５℃で３日間インキュベ
ートされた。３つのゲルにおけるＤＮＡフラグメントの
電気泳動は本質的に同じ結果を示し、つまりゲルを７Ｖ
／ｃｍで１時間５０分の間泳動した後に移動距離は１−
２ｍｍ以上は相違しなかった。１，３−ジクロロプロパ
ノールを架橋剤として用いた場合にも同様の結果が得ら
れた。
よるアガロースおよびブタンジオールジグリシジルエー
テルを含むゲル。０．１Ｍ ＮａＯＨ中１％アガロース
溶液に、架橋剤を５０℃および７０℃で激しく撹拌しな
がら加えた（２０ｍｌ当り０．５ｍｌ）。このゲル溶液
はすぐにゲル型中に注がれ、３５℃で３日間インキュベ
ートされた。３つのゲルにおけるＤＮＡフラグメントの
電気泳動は本質的に同じ結果を示し、つまりゲルを７Ｖ
／ｃｍで１時間５０分の間泳動した後に移動距離は１−
２ｍｍ以上は相違しなかった。１，３−ジクロロプロパ
ノールを架橋剤として用いた場合にも同様の結果が得ら
れた。
【００７６】例１３
ヒドロキシエチルセルロースおよびブタンジオールジグ
リシジルエーテルを含むゲル。ヒドロキシエチルセルロ
ース（Fluka 、Cat. No.54290 ）の５％溶液は、撹拌を
続けることにより（１−２日間）０．１Ｍ ＮａＯＨ中
で調製された。この溶液１０ｍｌ中へ０．５ｍｌのブタ
ンジオールジグリシジルエーテルが撹拌しながら加えら
れ、かつ溶液は室温で３日間インキュベートされた。ポ
リマー溶液を０．１Ｍ ＮａＯＨで４％に希釈し、かつ
同量の架橋剤を加えることによって別のゲルが調製され
た。機械的に安定性の優れた完全に透明なゲルが両方の
溶液から形成された。洗浄および平衡に続いて、ＤＮＡ
フラグメントの電気泳動は、４％のゲル中で７５から２
０００ｂｐのサイズの範囲でのＤＮＡフラグメントの非
常に鮮明なバンドと良好な分解能とを示した。５％のゲ
ルにおいてはすべてのフラグメントの泳動はそれよりも
非常に少なく、かつ分解能は４％のゲルにおいてほど良
好ではなかった。３５℃でインキュベートされたいくつ
かの同様のゲルにおいて、おそらくゲルの収縮によって
引起こされる小さな泡が時々観察された。
リシジルエーテルを含むゲル。ヒドロキシエチルセルロ
ース（Fluka 、Cat. No.54290 ）の５％溶液は、撹拌を
続けることにより（１−２日間）０．１Ｍ ＮａＯＨ中
で調製された。この溶液１０ｍｌ中へ０．５ｍｌのブタ
ンジオールジグリシジルエーテルが撹拌しながら加えら
れ、かつ溶液は室温で３日間インキュベートされた。ポ
リマー溶液を０．１Ｍ ＮａＯＨで４％に希釈し、かつ
同量の架橋剤を加えることによって別のゲルが調製され
た。機械的に安定性の優れた完全に透明なゲルが両方の
溶液から形成された。洗浄および平衡に続いて、ＤＮＡ
フラグメントの電気泳動は、４％のゲル中で７５から２
０００ｂｐのサイズの範囲でのＤＮＡフラグメントの非
常に鮮明なバンドと良好な分解能とを示した。５％のゲ
ルにおいてはすべてのフラグメントの泳動はそれよりも
非常に少なく、かつ分解能は４％のゲルにおいてほど良
好ではなかった。３５℃でインキュベートされたいくつ
かの同様のゲルにおいて、おそらくゲルの収縮によって
引起こされる小さな泡が時々観察された。
【００７７】例１４
デキストランおよびブタンジオールジグリシジルエーテ
ルを含むゲル。０．１Ｍ ＮａＯＨ中のデキストラン
（Fluka 、Cat. No31392）の溶液（６．８％および１０
％）が調製され、これらの溶液の各々２０ｍｌ中に０．
５ｍｌの架橋剤が加えられた。溶液は室温で３日間イン
キュベートされた。水での洗浄中およびＴＡＥ緩衝液中
での平衡の間、すべてのゲルが膨張したことが観察され
た。この膨張はほとんど閉じられたサンプルウェルの歪
みを伴い、これによりサンプルアプリケーションが困難
となる。ＤＮＡフラグメントの電気泳動の分解能は６％
ゲルにおいて普通であり、８％および１０％ゲルにおい
ては非常にまずいことを示した。すべてのゲルにおいて
ＤＮＡバンドの形状は三日月形状であった。
ルを含むゲル。０．１Ｍ ＮａＯＨ中のデキストラン
（Fluka 、Cat. No31392）の溶液（６．８％および１０
％）が調製され、これらの溶液の各々２０ｍｌ中に０．
５ｍｌの架橋剤が加えられた。溶液は室温で３日間イン
キュベートされた。水での洗浄中およびＴＡＥ緩衝液中
での平衡の間、すべてのゲルが膨張したことが観察され
た。この膨張はほとんど閉じられたサンプルウェルの歪
みを伴い、これによりサンプルアプリケーションが困難
となる。ＤＮＡフラグメントの電気泳動の分解能は６％
ゲルにおいて普通であり、８％および１０％ゲルにおい
ては非常にまずいことを示した。すべてのゲルにおいて
ＤＮＡバンドの形状は三日月形状であった。
【００７８】例１５
デンプンおよびブタンジオールジグリシジルエーテルを
含むゲルの調製を試みた。デンプンの２％溶液（Fluka,
Cat.No.85645 ）が０．１Ｍ ＮａＯＨ中で調製され、
かつ０．５、１．０および１．５ｍｌの架橋剤がポリマ
ー溶液２０ｍｌごとに加えられた。３５℃で２日間イン
キュベーションした後、操作可能なゲルは形成されなか
った。
含むゲルの調製を試みた。デンプンの２％溶液（Fluka,
Cat.No.85645 ）が０．１Ｍ ＮａＯＨ中で調製され、
かつ０．５、１．０および１．５ｍｌの架橋剤がポリマ
ー溶液２０ｍｌごとに加えられた。３５℃で２日間イン
キュベーションした後、操作可能なゲルは形成されなか
った。
【００７９】例１６
アガロース、ブタンジオールジグリシジルエーテルまた
は１，３−ジクロロプロパノール、ならびにヒドロキシ
エチルセルロース、ポリビニルアルコール、デンプン、
およびデキストランを含むその他のポリマーを含むゲ
ル。１％のアガロースポリマーおよび０．５％のデンプ
ンの溶液が０．１Ｍ ＮａＯＨ中で調製され、この溶液
２０ｍｌに対して０．５ｍｌのブタンジオールジグリシ
ジルエーテルが加えられた。３５℃で２日間インキュベ
ーションした後に形成されたゲルは、１００−２０００
ｂｐの範囲におけるＤＮＡフラグメントの分解能が非常
に優れていた。別のゲルが同じ条件下で調製されたが、
これはデンプンの代わりに０．５％のデキストランを含
んでいた。分解範囲は同じであったが、ＤＮＡバンドは
デンプンを含むゲルにおいてほど鮮明ではなかった。
０．５％のヒドロキシエチルセルロースおよび１％のア
ガロースポリマーを含むゲルもまた３５℃で１日間イン
キュベーションすることによって調製された。ＤＮＡフ
ラグメントの分解能は非常に良好であり、かつ１０４ｂ
ｐフラグメントはデンプンを含むゲルにおいてよりも約
０．５ｃｍだけ泳動が少なかった。１％のアガロースポ
リマーに加えて０．５％および１％のポリビニルアルコ
ールを含む２つのゲルが同じ方法で調製された。０．５
％のポリビニルアルコールを含むゲルではバンドはより
鮮明であり、１２０から３０００ｂｐのサイズ範囲での
分解能は非常に優れていた。
は１，３−ジクロロプロパノール、ならびにヒドロキシ
エチルセルロース、ポリビニルアルコール、デンプン、
およびデキストランを含むその他のポリマーを含むゲ
ル。１％のアガロースポリマーおよび０．５％のデンプ
ンの溶液が０．１Ｍ ＮａＯＨ中で調製され、この溶液
２０ｍｌに対して０．５ｍｌのブタンジオールジグリシ
ジルエーテルが加えられた。３５℃で２日間インキュベ
ーションした後に形成されたゲルは、１００−２０００
ｂｐの範囲におけるＤＮＡフラグメントの分解能が非常
に優れていた。別のゲルが同じ条件下で調製されたが、
これはデンプンの代わりに０．５％のデキストランを含
んでいた。分解範囲は同じであったが、ＤＮＡバンドは
デンプンを含むゲルにおいてほど鮮明ではなかった。
０．５％のヒドロキシエチルセルロースおよび１％のア
ガロースポリマーを含むゲルもまた３５℃で１日間イン
キュベーションすることによって調製された。ＤＮＡフ
ラグメントの分解能は非常に良好であり、かつ１０４ｂ
ｐフラグメントはデンプンを含むゲルにおいてよりも約
０．５ｃｍだけ泳動が少なかった。１％のアガロースポ
リマーに加えて０．５％および１％のポリビニルアルコ
ールを含む２つのゲルが同じ方法で調製された。０．５
％のポリビニルアルコールを含むゲルではバンドはより
鮮明であり、１２０から３０００ｂｐのサイズ範囲での
分解能は非常に優れていた。
【００８０】試薬の添加の順序が変えられたゲルもまた
調製された。すなわち、あるゲルは２．５ｍモルの１，
３−ジクロロプロパノールをアガロースとヒドロキシエ
チルセルロース（１０ｍｌ、両方とも１％のポリマー）
の溶液に加えることによって調製され、かつ他方のゲル
は２．５ｍモルの１，３−ジクロロプロパノールをアガ
ロースの溶液に加え、さらにヒドロキシエチルセルロー
スを加えることによって調製された。各ポリマーの最終
濃度は１％であった。これらの溶液は架橋剤を加える前
は５ｍモルのＮａＯＨを含んでいた。３５℃で２日間イ
ンキュベーションを行なった後、ＤＮＡフラグメントの
電気泳動の移動距離は、２つのゲル中で移動した同じＤ
ＮＡフラグメント間で本質的に差はないことを示した。
調製された。すなわち、あるゲルは２．５ｍモルの１，
３−ジクロロプロパノールをアガロースとヒドロキシエ
チルセルロース（１０ｍｌ、両方とも１％のポリマー）
の溶液に加えることによって調製され、かつ他方のゲル
は２．５ｍモルの１，３−ジクロロプロパノールをアガ
ロースの溶液に加え、さらにヒドロキシエチルセルロー
スを加えることによって調製された。各ポリマーの最終
濃度は１％であった。これらの溶液は架橋剤を加える前
は５ｍモルのＮａＯＨを含んでいた。３５℃で２日間イ
ンキュベーションを行なった後、ＤＮＡフラグメントの
電気泳動の移動距離は、２つのゲル中で移動した同じＤ
ＮＡフラグメント間で本質的に差はないことを示した。
【００８１】例１７
架橋剤をポリマー溶液に加える前に希釈することによっ
て調製されたアガロースおよびエピクロルヒドリンを含
むゲル。１．１ｍモルのＮａＯＨを含む９ｍｌの１．１
％アガロース溶液に架橋剤が加えられる前に、ジオキサ
ン（１ｍｌ）が架橋剤（１ｍモル）を希釈するために用
いられた。このゲル溶液は３５℃で２日間インキュベー
トされた。洗浄および平衡の後、電気泳動によるＤＮＡ
フラグメントの分解能は非常に優れていた。
て調製されたアガロースおよびエピクロルヒドリンを含
むゲル。１．１ｍモルのＮａＯＨを含む９ｍｌの１．１
％アガロース溶液に架橋剤が加えられる前に、ジオキサ
ン（１ｍｌ）が架橋剤（１ｍモル）を希釈するために用
いられた。このゲル溶液は３５℃で２日間インキュベー
トされた。洗浄および平衡の後、電気泳動によるＤＮＡ
フラグメントの分解能は非常に優れていた。
【００８２】本発明は特定の図面および例によって例示
されかつ説明されてきたが、前掲の特許請求の範囲に説
明される本発明の範囲から逸脱することなく変形および
変化がなされ得るということが理解される。
されかつ説明されてきたが、前掲の特許請求の範囲に説
明される本発明の範囲から逸脱することなく変形および
変化がなされ得るということが理解される。
【図１】例１で説明されるように、モノマーおよび架橋
剤濃度は同じだが（Ｔ＝６およびＣ＝３％）、線状ポリ
マー架橋剤と分枝ポリマー架橋剤との比が異なる、８つ
の異なるポリ（ＮＡＴ）ゲル（ａ−ｈ）における電気泳
動写真である。分枝架橋剤の比はａからｈへ増大する。
剤濃度は同じだが（Ｔ＝６およびＣ＝３％）、線状ポリ
マー架橋剤と分枝ポリマー架橋剤との比が異なる、８つ
の異なるポリ（ＮＡＴ）ゲル（ａ−ｈ）における電気泳
動写真である。分枝架橋剤の比はａからｈへ増大する。
【図２】２Ｖ／ｃｍ（第一次元、上から下へ）および７
Ｖ／ｃｍ（第二次元左から右へ）で６％のポリ（ＮＡ
Ｔ）ゲル中で泳動されたＤＮＡフラグメント（lambda/H
ind III ）の二次元電気泳動を示す写真である。
Ｖ／ｃｍ（第二次元左から右へ）で６％のポリ（ＮＡ
Ｔ）ゲル中で泳動されたＤＮＡフラグメント（lambda/H
ind III ）の二次元電気泳動を示す写真である。
【図３】６５℃でエピクロルヒドリンで架橋された１％
のアガロースゲル中で分解したＤＮＡフラグメント（１
ｋｂｐラダーおよびpBR322/Hae III）の分解能を示す電
気泳動写真である。
のアガロースゲル中で分解したＤＮＡフラグメント（１
ｋｂｐラダーおよびpBR322/Hae III）の分解能を示す電
気泳動写真である。
【図４】図３と同様のＤＮＡフラグメントであるが４５
℃で架橋されたゲル中で分解されたものを示す電気泳動
写真である。
℃で架橋されたゲル中で分解されたものを示す電気泳動
写真である。
【図５】標準的な２％アガロースゲルの可視スペクトル
を示すグラフである。
を示すグラフである。
【図６】１０ｍｌのゲル化溶液中に２％のアガロースポ
リマーと２ｍモルの１，３−ジクロロプロパノールとを
含むゲルの可視スペクトルを示すグラフである。
リマーと２ｍモルの１，３−ジクロロプロパノールとを
含むゲルの可視スペクトルを示すグラフである。
【図７】ヒドロキシエチル化されたアガロース（シー・
プラク）から調製された２％のゲルの可視スペクトルを
示すグラフである。
プラク）から調製された２％のゲルの可視スペクトルを
示すグラフである。
【図８】１０ｍｌのゲル化溶液中に２％のヒドロキシル
化されたアガロースポリマー（シー・プラク）と１．０
ｍモルの１，３−ジクロロプロパノールとを含むゲルの
可視スペクトルを示すグラフである。
化されたアガロースポリマー（シー・プラク）と１．０
ｍモルの１，３−ジクロロプロパノールとを含むゲルの
可視スペクトルを示すグラフである。
【図９】２Ｖ／ｃｍ（第一次元、上から下へ）および７
Ｖ／ｃｍ（第二次元、右から左へ）で泳動された１．５
％のアガロースポリマーと１，３−ジクロロプロパノー
ルから誘導されたユニットとを含むゲルにおけるＤＮＡ
フラグメント（lambda/Hind III ）の二次元電気泳動を
示す写真である。
Ｖ／ｃｍ（第二次元、右から左へ）で泳動された１．５
％のアガロースポリマーと１，３−ジクロロプロパノー
ルから誘導されたユニットとを含むゲルにおけるＤＮＡ
フラグメント（lambda/Hind III ）の二次元電気泳動を
示す写真である。
【図１０】２０ｍｌのゲル化溶液中に１％アガロースポ
リマーと０．５ｍｌのブタンジオールジグリシジルエー
テルとを含むゲルにおける様々なＤＮＡフラグメントの
分離を示す電気泳動写真である。
リマーと０．５ｍｌのブタンジオールジグリシジルエー
テルとを含むゲルにおける様々なＤＮＡフラグメントの
分離を示す電気泳動写真である。
【図１１】２０ｍｌのゲル化溶液中に１．５％のアガロ
ースポリマーと１ｍｌのブタンジオールジグリシジルエ
ーテルとを含むゲルにおける様々なＤＮＡフラグメント
の分離を示す電気泳動写真である。
ースポリマーと１ｍｌのブタンジオールジグリシジルエ
ーテルとを含むゲルにおける様々なＤＮＡフラグメント
の分離を示す電気泳動写真である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｇ０１Ｎ 27/447 Ｇ０１Ｎ 27/26 ３１５Ｆ
Claims (43)
- 【請求項１】 線状多糖および架橋剤から誘導されたユ
ニットを含む連続ベッド形状の水不溶性の実質的に透明
なゲルであって、架橋剤反応およびゲル形成は同時に発
生しており、かつ架橋剤は、ジハロアルキルアルコー
ル、ハロヒドリン、ビスエポキシド、ジビニルスルホン
もしくはアルカンジオールジアルキルまたはジアリール
スルホネートを含む化合物のグループから選択される、
ゲル。 - 【請求項２】 多糖はアガロースである、請求項１に記
載のゲル。 - 【請求項３】 多糖はヒドロキシエチルセルロースであ
る、請求項１に記載のゲル。 - 【請求項４】 多糖はヒドロキシエチルアガロースであ
る、請求項１に記載のゲル。 - 【請求項５】 線状多糖および分枝多糖を含む、請求項
１に記載のゲル。 - 【請求項６】 線状多糖はアガロースであり、分枝多糖
はデキストランである、請求項５に記載のゲル。 - 【請求項７】 線状多糖はアガロースであり、分枝多糖
はデンプンである、請求項５に記載のゲル。 - 【請求項８】 １つ以上の線状多糖を含む、請求項１に
記載のゲル。 - 【請求項９】 アガロースおよびヒドロキシエチルセル
ロースを含む、請求項８に記載のゲル。 - 【請求項１０】 １つ以上の線状多糖および分枝多糖を
含む、請求項１に記載のゲル。 - 【請求項１１】 アガロース、ヒドロキシエチルセルロ
ース、およびデキストランを含む、請求項１０に記載の
ゲル。 - 【請求項１２】 アガロース、ヒドロキシエチルセルロ
ース、およびデンプンを含む、請求項１０に記載のゲ
ル。 - 【請求項１３】 水酸基を有する合成ポリマーを含む、
請求項２ないし１２のいずれかに記載のゲル。 - 【請求項１４】 合成ポリマーはポリビニルアルコール
である、請求項１３に記載のゲル。 - 【請求項１５】 架橋剤反応およびゲル形成はｐＨ値８
−１４で行なわれる、請求項２ないし１４のいずれかに
記載のゲル。 - 【請求項１６】 架橋剤反応およびゲル形成は４℃−６
５℃の温度で行なわれる、請求項２ないし１４のいずれ
かに記載のゲル。 - 【請求項１７】 架橋剤反応およびゲル形成は１５分か
ら５日間にわたって行なわれる、請求項２ないし１４の
いずれかに記載のゲル。 - 【請求項１８】 架橋剤反応およびゲル形成は溶媒とし
ての水中で行なわれる、請求項１４ないし１７のいずれ
かに記載のゲル。 - 【請求項１９】 架橋剤反応およびゲル形成は水−有機
溶媒混合物中で行なわれる、請求項１４ないし１７のい
ずれかに記載のゲル。 - 【請求項２０】 ゲルは支持体に固定される、請求項１
ないし２９のいずれかに記載のゲル。 - 【請求項２１】 電気泳動マトリックスとして請求項１
ないし２０のいずれかに記載のゲルを用いることを含む
電気泳動の方法。 - 【請求項２２】 高分子は低分子よりも速く泳動するよ
うにされるゲル電気泳動の方法であって、電界の強さは
１０Ｖ／ｃｍより小さく、電界は一方向であり、かつ複
数のゲル層にわたって開口を作ることによりゲル中で高
分子が移動する、請求項２１に記載の方法。 - 【請求項２３】 巨大分子の分枝架橋剤を含むゲルを用
いる電気泳動の方法であって、高分子量イオンの泳動は
前記ゲル中で阻止されるかまたは大幅に低減されること
を特徴とする、請求項２１に記載の方法。 - 【請求項２４】 線状多糖および架橋剤から誘導された
ユニットを含む、水不溶性の実質的に透明なゲルの連続
ベッドを調製する方法であって、線状多糖を溶媒中に溶
解するステップと、架橋剤を加えかつ架橋剤反応とゲル
形成とを同時に発生させるステップとを含み、架橋剤
は、ジハロアルキルアルコール、ハロヒドリン、ビスエ
ポキシド、ジビニルスルホンもしくはアルカンジオール
ジアルキルまたはジアリールスルホネートを含む化合物
のグループから選択される、方法。 - 【請求項２５】 多糖はアガロースである、請求項２４
に記載の方法。 - 【請求項２６】 多糖はヒドロキシエチルセルロースで
ある、請求項２４に記載の方法。 - 【請求項２７】 多糖はヒドロキシエチルアガロースで
ある、請求項２４に記載の方法。 - 【請求項２８】 線状多糖および分枝多糖を含む、請求
項２４に記載の方法。 - 【請求項２９】 線状多糖はアガロースであり、分枝多
糖はデキストランである、請求項２８に記載の方法。 - 【請求項３０】 線状多糖はアガロースであり、分枝多
糖はデンプンである、請求項２８に記載の方法。 - 【請求項３１】 １つ以上の線状多糖を含む、請求項２
４に記載の方法。 - 【請求項３２】 アガロースおよびヒドロキシエチルセ
ルロースを含む、請求項３１に記載の方法。 - 【請求項３３】 １つ以上の線状多糖および分枝多糖を
含む、請求項２４に記載の方法。 - 【請求項３４】 アガロース、ヒドロキシエチルセルロ
ース、およびデキストランを含む、請求項３３に記載の
方法。 - 【請求項３５】 アガロース、ヒドロキシエチルセルロ
ース、およびデンプンを含む、請求項３３に記載の方
法。 - 【請求項３６】 水酸基を有する合成ポリマーを含む、
請求項２５ないし３５のいずれかに記載の方法。 - 【請求項３７】 合成ポリマーはポリビニルアルコール
である、請求項３６に記載の方法。 - 【請求項３８】 架橋剤反応およびゲル形成はｐＨ値８
−１４で行なわれる、請求項２５ないし３７のいずれか
に記載の方法。 - 【請求項３９】 架橋剤反応およびゲル形成は４℃−６
５℃の温度で行なわれる請求項２５ないし３７のいずれ
かに記載の方法。 - 【請求項４０】 架橋剤反応およびゲル形成は１５分か
ら５日間にわたって行なわれる、請求項２５ないし３７
のいずれかに記載の方法。 - 【請求項４１】 架橋剤反応およびゲル形成は溶媒とし
ての水中で行なわれる、請求項３５ないし４０のいずれ
かに記載の方法。 - 【請求項４２】 架橋剤反応およびゲル形成は水−有機
溶媒混合物中で行なわれる、請求項３５ないし４０のい
ずれかに記載の方法。 - 【請求項４３】 ゲルは支持体に固定される、請求項２
４ないし４２のいずれかに記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/998,299 US5371208A (en) | 1992-12-30 | 1992-12-30 | Preparation of cross-linked linear polysaccharide polymers as gels for electrophoresis |
| US998299 | 1992-12-30 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06316592A JPH06316592A (ja) | 1994-11-15 |
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Family
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP33216393A Expired - Fee Related JP3492405B2 (ja) | 1992-12-30 | 1993-12-27 | ゲルおよびゲル電気泳動の方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5371208A (ja) |
| EP (1) | EP0604862B1 (ja) |
| JP (1) | JP3492405B2 (ja) |
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| CA (1) | CA2112450C (ja) |
| DE (1) | DE69326422T2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US5679572A (en) * | 1993-09-22 | 1997-10-21 | Daicel Chemical Industries, Ltd. | Separation of chiral compounds on polysaccharide supports |
| SE9600171D0 (sv) * | 1996-01-18 | 1996-01-18 | Pharmacia Biotech Ab | Användning av tidigare känt material för separation och nya former av materialet |
| SE9601368D0 (sv) * | 1996-04-11 | 1996-04-11 | Pharmacia Biotech Ab | Process for the production of a porous cross-linked polysaccharide gel |
| US5840877A (en) * | 1996-09-05 | 1998-11-24 | Guest Elchrom Scientific | Electrophoresis gels of enhanced selectivity |
| US6203680B1 (en) | 1998-02-05 | 2001-03-20 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Commerce | Electrophoresis gels |
| US6765042B1 (en) * | 1998-12-16 | 2004-07-20 | Sca Hygiene Products Zeist B.V. | Acidic superabsorbent polysaccharides |
| AU2002255699A1 (en) * | 2001-03-09 | 2002-09-24 | Apollo Biotechnology, Inc. | Conjugate probes and optical detection of analytes |
| US6632340B2 (en) | 2001-03-23 | 2003-10-14 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Precast gel and tray combination for submerged gel electrophoresis |
| US6500947B1 (en) * | 2001-08-24 | 2002-12-31 | Weyerhaeuser Company | Superabsorbent polymer |
| US20030219487A1 (en) * | 2002-02-28 | 2003-11-27 | Liu Xiang Yang | Process for the preparation of a small molecule gel via the addition of a branching additive |
| US20030024663A1 (en) * | 2002-07-19 | 2003-02-06 | Neogi Amar N. | Superabsorbent cellulosic fiber |
| US20030034137A1 (en) * | 2002-07-19 | 2003-02-20 | Neogi Amar N. | Superabsorbent cellulosic fiber |
| US20030034136A1 (en) * | 2002-07-19 | 2003-02-20 | Neogi Amar N. | Superabsorbent cellulosic fiber |
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