JP3376591B2

JP3376591B2 - プロテインｃ活性化促進剤

Info

Publication number: JP3376591B2
Application number: JP24278491A
Authority: JP
Inventors: 秀美石井; 睦美風間; 修一堀江; 秀之原
Original assignee: Mitsubishi Pharma Corp
Current assignee: Mitsubishi Pharma Corp
Priority date: 1991-08-28
Filing date: 1991-08-28
Publication date: 2003-02-10
Anticipated expiration: 2018-02-10
Also published as: JPH0558899A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はプロテインＣ活性化促進
剤に関する。より詳細には、トロンボモジュリンによる
プロテインＣ活性化を促進し、血栓症などの治療、予防
等に有用な薬剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】トロンボモジュリンは血管内皮細胞など
の表面に結合した糖蛋白で、カルシウムイオン存在下
で、トロンビンと１：１の化学量論的なコンプレックス
を形成することにより、トロンビンの機能的な性質、即
ち凝固経路においてフィブリノーゲンを凝固させ、血小
板を活性化し、血液凝固第Ｖ因子及び第ＶＩＩＩ因子を
活性化された形態であるＶａ及びＶＩＩＩａに変換する
という性質を実質的に変化させ、凝固活性や血小板凝集
を阻害する。また、同時に、トロンボモジュリンとトロ
ンビンとのコンプレックスは、血中のプロテインＣを活
性化し、血液凝固第Ｖａ因子及び第ＶＩＩＩＩａ囚子を
不活性化する作用を有し、最近、活性型プロテインＣに
よる血液凝固抑制が注目されている。より詳細には、プ
ロテインＣは、カルシウムイオンと結合性を有するγ−
カルボキシグルタミン酸ドメインを含有する血漿糖蛋白
の一種であり、血中では不活性型の前駆酵素として存在
するが、トロンビンにより活性化されて活性型プロテイ
ンＣとなり、上記の効果を発現する。しかし、トロンビ
ン単独でのプロテインＣの活性化は、極めて遅く、非効
率なものであるにすぎない。それと対照的に、トロンボ
モジュリンとトロンビンの１：１のコンプレックスはプ
ロテインＣの活性化を促進し、その速度定数はトロンビ
ン単独のものと比較すると約２００００倍に達する。こ
のように活性型プロテインＣは血液凝固抑制作用を有
し、プロテインＣを活性化させるトロンボモジュリンは
汎発性血管内凝固症をはじめとする血栓症などの治療
薬、予防薬として期待されている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】上記のトロンボモジュ
リンとトロンビンの１：１のコンプレックスによるプロ
テインＣの活性化は、カルシウムイオンの存在下に進行
し、その際、カルシウムイオンと結合し得る陰イオン性
リン脂質が大きな影響を及ぼすことが明らかにされてい
る。即ち、Cazenaveらはヒト胎盤から精製したトロンボ
モジュリンを、陰イオン性リン脂質を含むリン脂質小胞
に組み込むと、プロテインＣの活性化を促進し、ホスフ
ァチジルコリン／ホスファチジルセリン含有小胞の場合
が最も強いことを見出している。そして、その作用・機
作は、陰イオン性リン脂質とプロテインＣがカルシウム
イオンを介して結合し、活性化反応の場が形成されるこ
とよると推察している［Biochem. J. (1986) 238. 151-
157参照］。

【０００４】本発明者等は、これらの知見に基づいてト
ロンボモジュリンのプロテインＣ活性化を促進するリン
脂質を鋭意研究した結果、非陰イオン性リン脂質である
ホスファチジルエタノールアミンが陰イオン性リン脂質
よりも優れた活性化能を有することを見出して、本発明
を完成した。即ち、本発明は、トロンボモジュリンによ
るプロテインＣの活性化を著しく促進でき、血栓症など
の治療、予防に有用な薬剤を提供することを目的とす
る。

【０００５】

【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めになされた本発明のプロテインＣ活性促進剤は、ホス
ファチジルエタノールアミンを有効成分とするものであ
り、更にトロンボモジュリン、ホスファチジルセリン及
び／又はプロテインＣを含んでいてもよい。また、剤形
としてはリポソーム製剤又は脂肪乳剤製剤が好ましい。

【０００６】本発明は上記の構成からなり、本発明にお
いて用いられるホスファチジルエタノールアミン（以
下、ＰＥという）は、卵黄ＰＥ又は下記一般式：においてＲ^１及びＲ^２が不飽和高級脂肪酸残基であるＰ
Ｅである。ＰＥはリン脂質の一つであり、生物界に広く
分布しており、動植物細胞や細菌細胞等に含まれてい
る。本発明で使用されるＰＥは、これを医薬として使用
できる程度に精製されたものであれば特に制限されるも
のではない。動植物細胞や細菌細胞等から単離・精製さ
れたものでもよく、また化学的に合成されたものであっ
てもよい。

【０００７】上記一般式中、Ｒ^１及びＲ^２で示される不
飽和高級脂肪酸残基に対応する脂肪酸としては、例え
ば、オレイン酸、エライジン酸、エルカ酸、リノール
酸、リノレン酸、アラキドン酸等が例示され、より好ま
しくは不飽和度の高い高級脂肪酸を多く含有するＰＥが
好適である。

【０００８】本発明の薬剤において、有効成分であるＰ
Ｅはホスファチジルセリンと併用してもよい。ホスファ
チジルセリンは医薬として使用できる程度に精製された
ものであれば特に制限されるものではない。動植物細胞
や細菌細胞等から単離・精製されたものでもよく、また
化学的に合成されたものであってもよい。また、ホスフ
ァチジルセリンの構成脂肪酸は、上記ＰＥの構成脂肪酸
として例示した各種脂肪酸が用い得るが、好適には不飽
和高級脂肪酸を含有するホスファチジルセリンが用いら
れる。ホスファチジルセリンは、通常、ＰＥと同量乃至
それ以下の量で添加される。

【０００９】本発明の薬剤の好ましい態様として、トロ
ンボモジュリン（以下、ＴＭという）を含有する薬剤が
挙げられる。前述のようにＴＭは生体内に存在するが、
本発明の薬剤にＴＭを加えることにより、生体内のプロ
テインＣ（以下、ＰｒｏＣという）の活性化を著しく促
進することができる。また、本発明の薬剤にはＰｒｏＣ
を添加してもよく、より好ましくは上記ＴＭとともに添
加される。ＰｒｏＣを加えた薬剤は、ＰｒｏＣが生体内
で迅速に活性型ＰｒｏＣに変換されるので、血栓症の予
防・治療に高い効果を発現することができる。

【００１０】本発明の薬剤は種々の剤形とすることがで
きるが、好ましくはリポソーム製剤又は脂肪乳剤製剤と
される。リポソーム製剤は、常法に準じて調製すること
ができ、例えば、ＰＥ（及びホスファチジルセリン）を
クロロホルムなどの有機溶媒に溶解した後、溶媒を留去
して乾固し、次いで所望に応じてＴＭ及び／又はＰｒｏ
Ｃ並びに必要に応じて安定化剤などの慣用の添加剤とと
もに、精製水又は適当な緩衝液を加えて、超音波処理を
することにより調製される。また、脂肪乳剤製剤も常法
に準じて調製することができる。例えば、水に油脂及び
乳化剤を加えると共にＰＥ（及びホスファチジルセリ
ン）を添加し、更に所望に応じてＴＭ及び／又はＰｒｏ
Ｃ並びに必要に応じて安定化剤などの慣用の添加剤した
後、乳化することにより調製される。本発明の薬剤は、
通常、静脈内投与され、投与量は、患者の体重、年齢、
疾患の程度等に応じて、適宜調整することができるが、
通常、ＰＥとして、0.0005〜0.03ｇ／kg体重/日、特に
0.001〜0.01ｇ／kg体重/日を１日に１〜数回に分けて投
与される。

【００１１】

【実施例】以下、実施例及び製剤例に基づいて本発明を
より詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定され
るものではない。なお、以下の実施例において、活性型
ＰｒｏＣ産生量の測定は下記の方法にて行った。活性型ＰｒｏＣ産生量の測定方法リン脂質は、有機溶媒溶液から溶媒を留去した後、窒素
ガスで十分に乾固させ、次いで下記緩衝液を加えて超音
波処理して懸濁させた。測定は、ＴＭ、ＰｒｏＣ、カル
シウムイオン、トロンビン等を含む下記の基本反応溶液
(100μl)を10分間、37℃でインキュベートし、活性型Ｐ
ｒｏＣを産生させた後、下記アンチトロンビンIII溶液
(150μl)を添加し、37℃で10分間インキュベートして反
応を停止させた。次いで、活性型ＰｒｏＣの産生量を測
定するため、合成基質であるBoc-Leu-Ser-Thr-Arg-MCA
(100μM)を250μl添加して37℃で10分間インキュベート
した。600μlの20%酢酸を添加することにより反応を停
止し、生成した7-アミノ-4-メチルクマリン(AMC)量を蛍
光光度計(励起波長380nm、蛍光波長460nm)により定量し
た。ＴＭのコファクター活性は、標準AMCの蛍光強度か
ら求めた値を、pmol/min/mlで表示し、又は対照の値に
対する相対値で表示した。なお、ＴＭは、ヒト胎盤又は
ウサギ肺から前記文献に記載の方法に準じて精製したも
のを用いた。

【００１２】緩衝液 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) 0.15 M NaCl 5 mg/ml ウシ血清アルブミン基本反応溶液 0〜2 mg/ml リン脂質 20 mM Tris-HCl (pH 7.5) 0.15 M NaCl 5 mg/ml ウシ血清アルブミン 2 mM CaCl₂ 1 U/ml トロンビン 4.0 U/ml ＰｒｏＣ 10 ng/ml ウサギ肺ＴＭ又は 25 ng/ml ヒト胎盤ＴＭアンチトロンビンIII溶液 3.3 U/ml アンチトロンビンIII 13.3 U/ml ヘパリン 50 mM Tris-HCl (pH 8.5) 0.1 M NaCl 1 mM CaCl₂

【００１３】実施例１ＴＭによるＰｒｏＣの活性化に及ぼす各種リン脂質の影
響リン脂質として卵黄ＰＥ、卵黄ホスファチジルコリン
（以下、ＰＣという）、ウシ大脳由来ホスファチジルセ
リン（以下、ＰＳという）及びウシ肝臓由来ホスファチ
ジルイノシトール（以下、ＰＩという）を使用し、リン
脂質濃度1 mg/ml及びヒト胎盤ＴＭ 25 ng/mlの基本反応
溶液を用いて、ＴＭによるＰｒｏＣの活性化に及ぼす各
種リン脂質の影響を調べた。その結果を図１に示す。図
１から明らかなように、ＰＥ又はＰＳの添加により、Ｔ
Ｍ活性が上昇し、活性型ＰｒｏＣの産生が促進されるこ
とが判明した。

【００１４】実施例２ＴＭによるＰｒｏＣの活性化に及ぼすＰＥ濃度の影響ヒト胎盤ＴＭ 25 ng/ml又はウサギ肺ＴＭ 10 ng/mlの基
本反応溶液のＰＥ濃度を変化させ、ＴＭによるＰｒｏＣ
の活性化に及ぼすＰＥ濃度の影響を調べた。その結果を
図２に示す。なお、図２中、○はヒト胎盤ＴＭを、□は
ウサギ肺ＴＭを示す。図２に示されるように、活性型Ｐ
ｒｏＣの産生量はＰＥ濃度に依存し、約１mg/mlで最大
となった。

【００１５】実施例３ＰＥによるＴＭ活性上昇に及ぼす抗ＴＭポリクローナル
抗体の影響ＰＥによるＴＭ活性上昇に及ぼす抗ＴＭポリクローナル
抗体の影響を検討するために、ヒト胎盤ＴＭ 25 ng/ml
又はウサギ肺ＴＭ 10 ng/mlを、それぞれ、ＴＭに対し
て100倍量の抗ヒト胎盤ＴＭポリクローナル抗体又は抗
ウサギ肺ＴＭポリクローナル抗体と室温で30分間インキ
ュベートしたものを試料とし、ＴＭに代えてこの試料を
含む基本反応溶液（ＰＥ 0又は1 mg/ml含有）を用いて
活性型ＰｒｏＣ産生量を調べた。その結果を図３に示す
（図３中、黒塗のグラフ）。一方、対照には、プレイム
ノ血清から調製した免疫グロブリンを用いた（図３中、
白抜きのグラフ）。図３の横軸において、−ＰＥはＰＥ
非存在下を、＋ＰＥはＰＥ存在下を意味する（以下同
様）。図３に示されるように、ＰＥの存在下に両ＴＭ活
性は上昇したが、それぞれポリクローナル抗体で前処理
した試料を用いると、その活性上昇は完全に抑制され
た。このことから、本発明の効果は、反応系に存在する
ＰｒｏＣの活性化や活性型に変換されたＰｒｏＣの合成
基質水解速度にＰＥが直接影響した結果でないことが示
された。

【００１６】実施例４ＴＭによるＰｒｏＣの活性化に及ぼすリン脂質の脂肪酸
組成の影響前記ＰＥの一般式において、Ｒ¹及びＲ²がステアリン酸
残基（以下、18:0という)、オレイン酸残基（以下、18:
1という）、リノール酸残基(以下、18:2という)及びリ
ノレン酸残基(以下、18:3という)であるＰＥを用い、Ｔ
ＭによるＰｒｏＣの活性化に及ぼすリン脂質の脂肪酸組
成の影響を調べた。即ち、構成脂肪酸として上記の不飽
和脂肪酸を含有するＰＥを1 mg/ml含む基本反応溶液
（ウサギ肺ＴＭ 10 ng/ml含有）を用い、活性型Ｐｒｏ
Ｃの産生量を調べた。また、比較として、構成脂肪酸と
して不飽和脂肪酸を含有するＰＣについても同様な試験
を行った。その結果を図４に示す。図中、横軸のリン脂
質において、上段はＲ¹の脂肪酸残基を、下段はＲ²の脂
肪酸残基を示す。図４から明らかなように、ＰＥ中の構
成脂肪酸の不飽和度の増加につれ、ＴＭ活性は上昇し、
活性型ＰｒｏＣの産生量が増加した。また、ＰＣの場合
でも、ジリノール酸含有ＰＣではＴＭ活性の上昇が認め
られたが、同じ組成のＰＥと比較するとその程度は低い
ものであった。なお、不飽和脂肪酸単独では、ＴＭ活性
の上昇は認められないことを確認してある。

【００１７】実施例５ＰＥによるウサギ肺ＴＭ活性上昇に及ぼすカルシウムイ
オン（２＋）の影響基本反応溶液（ウサギ肺ＴＭ 10 ng/ml、ＰＥ 0又は1 m
g/ml含有）中のカルシウムイオン（２＋）濃度を変化さ
せて、ＰＥによるウサギ肺ＴＭ活性上昇に及ぼすカルシ
ウムイオン（２＋）の影響を調べた。その結果を図５に
示す。図５に示されるように、ＰＥ存在下ではカルシウ
ムイオン濃度の上昇につれて活性が上昇し、血液中の生
理的濃度に近い約2 mMのカルシウムイオン濃度までＴＭ
活性は上昇した。

【００１８】製剤例１ホスファチジルエタノールアミン1.5g、オレイン酸565m
g及びＤＬ−α−トコフェロール15mgに0.1Mトリス緩衝
液を7ml加え、氷水で冷却しながら超音波処理を行うこ
とによって、平均粒子径が50nm以下のリポソーム製剤を
調製した。リポソーム製剤のｐＨは0.1Mトリス緩衝液又
は1N塩酸を添加することによってpH8.0に調整した。

【００１９】

【発明の効果】以上のように、本発明のＰｒｏＣ活性化
促進剤においては、有効成分としてＰＥが用いられてお
り、ＰＥはＴＭを活性化するので、ＰｒｏＣの活性型Ｐ
ｒｏＣへの変換が促進される。特に、ＴＭ、ＰｒｏＣ及
び／又はホスファチジルセリンを含有する本発明の薬剤
は一層顕著な活性型ＰｒｏＣ産生効果を有する。従っ
て、本発明によれば、抗血栓作用を有する活性型Ｐｒｏ
Ｃの産生が促進されるので、本発明の薬剤は血栓症の予
防・治療等に極めて有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＴＭによるＰｒｏＣの活性化に及ぼす各種リン
脂質の影響を示す図である。

【図２】ＴＭによるＰｒｏＣの活性化に及ぼすＰＥ濃度
の影響を示す図である。

【図３】ＰＥによるＴＭ活性上昇に及ぼす抗ＴＭポリク
ローナル抗体の影響を示す図である。

【図４】ＴＭによるＰｒｏＣの活性化に及ぼすリン脂質
の脂肪酸組成の影響を示す図である。

【図５】ＰＥによるウサギ肺ＴＭ活性上昇に及ぼすカル
シウムイオン（２＋）の影響を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 38/55 Ａ６１Ｐ 43/00 １１１Ａ６１Ｐ 7/02 Ａ６１Ｋ 37/465 43/00 １１１ 37/64 (56)参考文献Ｊｅａｎ−ＭａｒｉｅＦｒｅｙｓｓｉｎｅｔｅｔａｌ．，ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓｏｎｔｈｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎＣｂｙｔｈｅｈｕｍａｎｔｈｒｏｍｂｉｎ−ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ．．．，ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．238，Ｎｏ. １，ｐｐ151−157，（1986) ＳａｎｄｒａＲ．Ｂａｔｅｓｅｔａｌ．，Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓｃｏ−ｉｓｏｌａｔｅｄｗｉｔｈｒａｔｓｕｒｆａｃｔａｎｔｐｒｏｔｅｉｎＣａｃｃｏｕｎｔｆｏｒｔｈｅａｐｐａｒｅｎｔ．．．, ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＬｕｎｇＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．15，ｐｐ 695−708，（1989) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 31/33 - 33/44 A61K 9/107 A61K 9/127 A61P 7/02 A61P 43/00 111 ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】卵黄ホスファチジルエタノールアミン
又は下記一般式：においてＲ^１及びＲ^２が不飽和高級脂肪酸残基であるホ
スファチジルエタノールアミンを有効成分とするプロテ
インＣ活性化促進剤。
【請求項２】追加的にトロンボモジュリンを含有す
る請求項１記載のプロテインＣ活性化促進剤。
【請求項３】追加的にプロテインＣを含有する請求
項１又は２記載のプロテインＣ活性化促進剤。
【請求項４】追加的にホスファチジルセリンを含有
する請求項１から３のいずれかに記載のプロテインＣ活
性化促進剤。
【請求項５】ホスファチジルセリンの脂肪酸残基の
少なくとも一つが不飽和高級脂肪酸である請求項４記載
のプロテインＣ活性化促進剤。
【請求項６】剤形がリポソーム製剤である請求項１
から５のいずれかに記載のプロテインＣ活性化促進剤。
【請求項７】剤形が脂肪乳剤製剤である請求項１か
ら５のいずれかに記載のプロテインＣ活性化促進剤。
【請求項８】請求項１に示される一般式において、
Ｒ^１及びＲ^２で示される不飽和高級脂肪酸残基が、同一
又は異なって、オレイン酸残基、リノール酸残基又はリ
ノレン酸残基である請求項１記載のプロテイＣ活性化促
進剤。